DE69736331T2 - Immunstimulierende nukleinsaeuremolekuele - Google Patents

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Description

  • Die Arbeiten, die zu dieser Erfindung führten, wurden teilweise durch das National Institute of Health mit Beihilfe Nr. R29-AR42556-01 unterstützt. Die Regierung der Vereinigten Staaten hat möglicherweise Anspruch auf bestimmte Rechte an dieser Erfindung.
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Oligonukleotide und spezieller solche Oligonukleotide, deren Sequenz mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid enthält, und die immunstimulierend sind.
  • Hintergrund der Erfindung
  • In den 1970er Jahren berichteten mehrere Forscher, dass DNA-Moleküle mit hohem Molekulargewicht an Zellmembrane binden (Lerner, R.A., et al. 1971. „Membrane-associated DNA in the cytoplasm of diploid human lymphocytes". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68:1212; Agrawal, S.K., R.W. Wagner, P.K. McAllister und B. Rosenberg. 1975. „Cell-surfaceassociated nucleic acid in tumorigenic cells made visible with platinum-pyrimidine complexes by electron microscopy". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:928). 1985 legten Bennett et al. den ersten Beleg dafür vor, dass die DNA-Bindung an Lymphozyten einer Liganden-Rezeptor-Wechselwirkung ähnlich ist: sie ist saturierbar, kompetitiv und führt zu DNA-Endozytose und zum Abbau zu Oligonukleotiden (Bennett, R.M., G.T. Gabor und M.M. Merritt. 1985. „DNA binding to human leukocytes. Evidence for a receptor-mediated association, internalization, and degradation of DNA". J. Clin. Invest. 76:2182). Wie DNA können Oligodesoxyribonkleotide (ODNs), aber in Zellen in einer saturierbaren, sequenzunabhängigen und temperatur- und energieabhängigen Weise eindringen (im Überblick dargstellt von Jaroszewski, J.W., und J. S. Cohen. 1991. „Cellular uptake of antisense Oligodesoxynucleotides". Advanced Drug Delivery Reviews 6.235; Akhtar, S., Y. Shoji, und R.L. Juliano. 1992. "Pharmaceutical aspects of the biological stability and membrane transport characteristics of antisense oligonucleotides". In: Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA. R.P. Erickson und J.G. Izant, Herausgeber Raven Press, Ltd. New York, S. 133; und Zhao, Q., T. Waldschmidt, E. Fisher, C.J. Herrera und A.M. Krieg., 1994. „Stage specific oligonucleotide uptake in murine bone marrow B cell precursors". Blood, 84:3660). Bisher ist noch kein Rezeptor für die Aufnahme von DNA oder ODNs kloniert worden und man weiß noch nicht, ob die Bindung von ODN und ihre Aufnahme durch Zellen durch den gleichen oder einen anderen Mechanismus erfolgt wie bei DNA mit hohem Molekulargewicht.
  • Es konnte gezeigt werden, dass die Aufnahme von ODN durch Lymphozyten durch Zellaktivierung gesteuert wird. Milzzellen, die mit dem B-Zell-Mitogen LPS stimuliert wurden, zeigten in der B-Zell-Population eine dramatisch erhöhte Aufnahme von ODN, wohingegen Milzzellen, die mit dem T-Zell-Mitogen Con A behandelt waren, eine erhöhte ODN-Aufnahme durch T-Zellen, nicht aber durch B-Zellen, zeigten (Krieg, A.M., F. Gmelig-Meyling, M.F. Gourley, W.J. Kisch, L.A. Chrisey und A.D. Steinberg. 1991. „Uptake of Oligodesoxyribonucleotides by lymphoid cells is heterogenous and inducible". Antisense Research and Development 1:161).
  • Mehrere Polynukleotide wurden ausführlich als Modifikatoren biologischer Reaktionen evaluiert. Das vielleicht beste Beispiel ist Poly (I,C), das ein wirksamer Induktor der IFN-Produktion, aber auch ein Makrophagenaktivator und Induktor von NK-Aktivität ist (Talmadge, J.E., J. Adams, H. Phillips, M. Collins, B. Lenz, M. Schneider, E. Schlick, R. Ruffmann, R. H. Wiltrout und M.A. Chirigos. 1985. „Immunomodulatory effects in mice of polyinosinic-polycytidylic acid complexed with poly-L-lysine and carboxymethylcellulose". Cancer Res. 45:1058; Wiltrout, R.H., R.R. Salup, T.A. Twilley und J.E. Talmadge. 1985. "Immunomodulation of natural killer activity by polyribonucleotides". J. Biol. Resp. Mod. 4:512; Krown, S.E. 1986. "Interferons and interferon inducers in cancer treatment". Sem. Oncol. 13:207; und Ewel, C.H., S.J. Urba, W.C. Kopp, J.W. Smith II, R.G. Steis, J.L. Rossio, D.L. Longo, M.J. Jones, W.G. Alvord, C.M. Pinsky, J.M. Beveridge, K.L. McNitt und S.P. Creekmore. 1992. "Polyinosinic-polycytidylic acid complexed with poly-L-lysine and carboxymethylcellulose in combination with interleukin-2 in patients with cancer: clinical and immunological effects". Canc. Res. 52:3005). Es scheint, als ob diese murine NK-Aktivierung möglicherweise ausschließlich auf die Induktion der IFN-β-Sekretion zurückzuführen ist (Ishikawa, R. und C.A. Biron. 1993. "IFN induction and associated changes in splenic leukocyte distribution". J. Immunol. 150:3713). Diese Aktivierung war für den Ribosezucker spezifisch, da Desoxyribose keine Wirkung zeigte. Seine starke in vitro Antitumor-Aktivität führte zu verschiedenen klinischen Studien mit Poly (I,C) komplexiert mit Poly-L-Lysin und Carboxymethylcellulose (um den Abbau durch RNAse zu reduzieren) (Talmadge, J.E., et al., 1985, oben zitiert; Wiltrout, R.H. et al., 1985. oben zitiert); Krown, S.E., 1986. oben zitiert); und Ewel, C.H. et al., 1992. oben zitiert). Leider haben toxische Nebenwirkungen bisher verhindert, dass Poly (I,C) ein nützliches therapeutisches Agens werden konnte.
  • Guaninribonukleotide, die an der C8-Position entweder mit einer Brom- oder einer Thiolgruppe substituiert sind, sind B-Zell-Mitogene und können B-Zell-Differenzierungsfaktoren ersetzen (Feldbush, T.L. und Z.K. Ballas. 1985. „Lymphokine-like activity of 8-mercaptoguanosine: induction of T and B cell differentiation". J. Immunol. 134:3204; und Goodman, M.G. 1986. "Mechanism of synergy between T cell signals and C8-substituted guanine nucleosides in humoral immunity: B lymphotropic cytokines induce responsiveness to 8-mercaptoguanosine". J. Immunol. 136:3335). 8-Mercaptoguanosin und 8-Bromguanosin können auch die für die Erzeugung von MHC-beschränkten CTL notwendigen Zytokine ersetzen (Feldbush, T.L., 1985, oben zitiert), die murine NK-Aktivität erhöhen (Koo, G.C., M.E. Jewell, C.L. Manyak, N.H. Sigal und L.S. Wicker. 1988. „Activation of murine natural killer cells and macrophages by 8-bromoguanosine". J. Immunol. 140:3249), und bei der Induktion von muriner LAK-Erzeugung synergistisch mit IL-2 wirken (Thompson, R.A. und Z.K. Ballas 1990. „Lymphokine-activated killer (LAK) cells. V. 8-Mercaptoguanosine as an IL-2-sparing agent in LAK generation". J. Immunol. 145: 3524). Die NK- und LAK-vermehrende Aktivität dieser C8-substituierten Guanosine scheint durch ihre Induktion von IFN bewirkt zu werden (Thompson, R.A., et al. 1990. oben zitiert). Vor kurzem konnte gezeigt werden, dass ein durch ein Mycobakterium produziertes 5'-triphosphoryliertes Thymidin bei einer Untergruppe der humanen γδ-T-Zellen mitogen ist (Constant, P., F. Davodeau, M.-A. Peyrat, Y. Poquet, G. Puzo, M. Bonneville und J.-J. Fournie. 1994. „Stimulation of human γδ T cells by nonpeptidic mycobacterial ligands" Science 264:267). Diese Veröffentlichung zeigte die Möglichkeit, dass das Immunsystem im Verlauf der Evolution möglicherweise Wege entwickelt hat, bevorzugt auf mikrobielle Nukleinsäuren zu reagieren.
  • Mehrere Beobachtungen legen die Vermutung nahe, dass bestimmte DNA-Strukturen ebenfalls das Potential aufweisen, Lymphozyten zu aktivieren. Zum Beispiel haben Bell et al. berichtet, dass nukleosomale Protein-DNA-Komplexe (nicht aber nackte DNA) in Milzzellüberständen eine B-Zell-Proliferation und Immunglobulin-Sekretion verursachten (Bell, D.A., B. Morrison und P. VandenBygaart. 1990. „Immunogenic DNA-related factors". J. Clin. Invest. 85:1487). In anderen Fällen wurde berichtet, dass nackte DNA Wirkungen auf das Immunsystem hat. Zum Beispiel haben Messina et al. kürzlich berichtet, dass 260 bis 800 by lange Fragmente von Poly (dG)·(dC) und Poly (dG)·(dC) für B-Zellen mitogen waren (Messina, J.P., G.S. Gilkeson und D.S. Pisetsky. 1993. „The influence of DNA structure on the in vitro stimulation of murine lymphocytes by natural and synthetic polynucleotide antigens". Cell. Imunol. 147:148). Tokunaga et al. haben berichtet, dass dG·dC γ-IFN- und NK-Aktivität induziert (Tokunaga, S. Yamamoto und K. Namba. 1988. „A synhetic singlestranded DNA, poly(dG, dC), induces interferon-α/b and -g, augments natural killer activity, and suppresses tumor growth" Jpn. J. Cancer Res. 79:682). Neben derartigen künstlichen Homopolymer-Sequenzen berichteten Pisetsky et al., dass reine Säugetier-DNA keine nachweisbaren Wirkungen auf das Immunsystem hatte, aber dass die DNA von bestimmten Bakterien eine B-Zell-Aktivierung und Immunglobulinsekretion induziert (Messina, J.P., G.S. Gilkeson und D.S. Pisetsky. 1991. "Stimulation of in vitro murine lymphocyte proliferation by bacterial DNA". J. Immunol. 147:1759). Wenn man annimmt, dass diese Ergebnisse nicht die Folge einer ungewöhnlichen Kontamination sind, dann legen diese Studien nahe, dass eine besondere Struktur oder sonstige Eigenschaft von bakterieller DNA sie dazu befähigt, eine B-Zell-Aktivierung auszulösen. Untersuchungen an mycobakteriellen DNA-Sequenzen haben gezeigt, dass ODN, die bestimmte palindromische Sequenzen enthalten, NK-Zellen aktivieren können (Yamamoto, S., T. Yamamoto, T. Kataoka, E. Kuramoto, O. Yano und T. Tokunaga. 1992. "Unique palindromic sequences in synthetic oligonucleotides are required to induce INF and augment INF-mediated natural killer activity". J. Immunol. 148:4072; Kuramoto, E., O. Yano, Y. Kimura, M. Baba, T. Makino, S. Yamamoto, T. Yamamoto, T. Yamamoto, T. Kataoka und T. Tokunaga. 1992. "Oligonucleotide sequences required for natural killer cell activation". Jpn. J. Cancer Res. 83:1128).
  • Von mehreren Phosphothioat-modifizierten ODN wurde berichtet, dass sie in der Lage sind, in vitro oder in vivo eine B-Zell-Stimulierung zu induzieren (Tanaka, T., C.C. Chu und W.E. Paul. 1992 "An antisense oligonucleotide complementary to a sequence in Ig2b increases g2b germline transcripts, stimulates B cell DNA synthesis, and inhibits immunoglobulin secretion". J. Exp. Med. 175:597; Branda, R.F., A.L. Moore, L. Mathews, J.J. McCormack und G. Zon. 1993. "Immune stimulation by an antisense oligomer complementary to the rev gene of HIV-1". Biochem. Pharmacol. 45:2037; McIntyre, K.W., K. Lombard-Gillooly, J.R. Perez, C. Kunsch, U.M. Sarmiento, J.D. Larigan, K.T. Landreth und R. Narayanan. 1993. "A sense phosphothioate oligonucleotide directed to the initiation codon of transcription factor NF-κB T65 causes sequence-specific immune stimulation". Antisense Res. Develop. 3:309; und Pisetsky, D.S., und C. F. Reich. 1993. „Stimulation of murine lymphocyte proliferation by a phosphothioate oligonucleotide with antisense activity for herpes simplex virus". Life Sciences 54:101). Diese Berichte legen kein gemeinsames Strukturmotiv oder Sequenzelement in diesen ODN nahe, das ihre Wirkungen erklären könnte.
  • Das das cAMP response element-bindende Protein (CREB) und der aktivierende Transkriptionsfaktor (ATF) oder die CREB/ATF-Familie von Transkriptionsfaktoren sind eine Klasse ubiquitär exprimierter Transkriptionsfaktoren, von denen bisher 11 Mitglieder kloniert worden sind (siehe Überblick von de Groot, R.P. und P. Sassone-Corsi: „Hormonal control of gene expression: Multiplicity and versatility of cyclic adenosine 3',5'-monophosphate-responsive nuclear regulators". Mol. Endocrin. 7:145, 1993; Lee, K.A.W. und N. Masson: "Transcriptional regulation by CREB and its relatives". Biochim. Biophys. Acta 1174:221, 1993). Sie gehören alle zu der basische Region/Leucin-Zipper (bZip)-Klasse von Proteinen. Alle Zellen scheinen ein oder mehrere CREB/ATF-Proteine zu exprimieren, aber die exprimierten Mitglieder und die Regulation des mRNA-Splicings scheinen gewebespezifisch zu sein. Das differenzielle Splicen von Aktivierungsdomänen kann bestimmen, ob ein bestimmtes CREB/ATF-Protein ein Transkriptionsinhibitor oder -aktivator sein wird. Viele CREB/ATF-Proteine aktivieren die virale Transkription, aber einige Splice-Varianten, denen die Aktivierungsdomäne fehlt, sind inhibierend. CREB/ATF-Proteine können DNA als Homo- oder Heterodimere durch das cAMP-responsive element, das CRE, binden, dessen Konsensform die unmethylierte Sequenz TGACGTC ist (die Bindung wird aufgehoben, wenn das CpG methyliert ist) (Iguchi-Ariga, S.M.M. und W. Schaffner: "CpG methylation of the cAMP-responsive enhancer/promoter sequence TGACGTCA abolishes specific factor binding as well as transcriptional activation". Genes & Develop. 3:612, 1989).
  • Die Transkriptionsaktivität des CRE ist während der B-Zell-Aktivierung erhöht (Xie, H. T.C. Chiles und T.L. Rothstein: "Induction of CREB activity via the surface Ig receptor of B cells". J. Immunol. 151:880, 1993). CREB/ATF-Proteine scheinen die Expression zahlreicher Gene durch CRE zu regulieren, einschliesslich immunologisch wichtiger Gene wie fos, jun B, Rb-1, IL-6, IL-1 (Tsukada, J., K. Saito, W.R. Waterman, A.C. Webb und P.E. Auron: "Transcription factors NF-IL6 and CREB recognize a common essential site in the human prointerleukin 1 gene". Mol. Cell. Biol. 14:7285, 1994; Gray, G.D., O.M. Hernandez, D. Hebel, M. Root, J.M. Pow-Sang und E. Wickstrom: "Antisense DNA inhibition of tumor growth induced by c-Ha-ras oncogene in nude mice". Cancer Res. 53:577, 1993), IFN- (Du, W. und T. Maniatis: "An ATF/CREB binding site protein is required for virus induction of the human interferon B gene". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2150, 1992), TGF-1 (Asiedu, C.K., L. Scott, R.K. Assoian, M. Ehrlich: Binding of AP-1/CREB proteins and of MDBP to contiguous sites downstream of the human TGF-B1 gene". Biochim. Biophys. Acta 1219:55, 1994), TGF-2, Klasse II MHC (Cox, P.M. und C.R. Goding: "AnATF/CREB binding motif is required for aberrant constitutive expression of the MHC class II DRa promoter and activation by SV40 T-antigen". Nucl. Acids. Res. 20:4881, 1992), E-Selektin, GM-CSF, CD-8, das Gen der Keimbahn für die konstante Region von Ig, das TCR V-Gen und das nukleäre Antigen proliferierender Zellen (Huang, D., P.M. Shipman-Appasamy, D.J. Orten, S.H. Hinrichs und M.B. Prystowsky: "Promoter activity of the proliferating-cell nuclear antigen gene is associated with inducible CRE-binding proteins in interleukin 2-stimulated T lymphocytes". Mol. Cell. Biol. 14:4233, 1994). Zusätzlich zur Aktivierung durch den cAMP-Signalweg kann CREB auch transkriptionelle Antworten auf Änderungen der intrazellulären Ca-Konzentration vermitteln (Sheng, M., G. McFadden und M.E. Greenberg: "Membrane depolarization and calcium induce c-fos transcription via phosphorylation of transcription factor CREB". Neuron 4.571, 1990).
  • Die Rolle der Protein-Protein-Wechselwirkungen bei der Transkriptionsaktivierung durch CREB/ATF-Proteine scheint außerordentlich wichtig zu sein. Es gibt mehrere veröffentlichte Arbeiten, in denen von direkten oder indirekten Wechselwirkungen zwischen NFKB-Proteinen und CREB/ATF-Proteinen berichtet wird (Whitley, et al., (1994) Mol. & Cell. Biol. 14:6464; Cogswell, et al. (1994) J. Immun. 153:712; Hines, et al., (1993) Oncogene 8:3189; und Du, et al., (1993) Cell 74:887. Die Aktivierung von CREB durch den zyklischen AMP-Signalweg erfordert die Proteinkinase A (PKA), die ser133 auf CREB341 phosphoryliert und ihm erlaubt, an CBP, ein kürzlich kloniertes Protein, zu binden (Kwok, R.P.S., J.R. Lundblad, J.C. Chrivia, J.P. Richards, H.P. Bachinger, R.G. Brennan, S.G.E. Roberts, M.R. Green und R.H. Goodman: „Nuclear protein CBP is a coactivator for the transcription factor CREB". Nature 370:223, 1994; Arias, J., A.S. Alberts, P. Brindle, F.X. Claret, T. Smea, M. Karin, J. Feramisco und M. Montminy: "Activation of cAMP and mitogen responsive genes relies on a common nuclear factor". Nature 370:226, 1994). CBP wiederum interagiert mit dem basalen Transkriptionsfaktor TFIIB, was zu erhöhter Transkription führt. Es wurde auch berichtet, dass CREB auch mit dTAFII 110 interagiert, einem TATA-bindenden Protein-assoziierten Faktor, dessen Bindung möglicherweise die Transkription reguliert (Ferreri, K., G. Gill und M. Montminy: „The cAMP-regulated transcription factor CREB interacts with a component of the TFIID complex". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1210, 1994). Zusätzlich zu diesen Wechselwirkungen können CREB/ATF-Proteine spezifisch zahlreiche andere nukleäre Faktoren binden (Hoeffler, J.P., J.W. Lustbader und C.-Y. Chen: „Identification of multiple nuclear factors that interact with cyclic adenosine 3',5'-monophosphate response elementbinding protein and activating transcription factor-2 by protein-protein interactions". Mol. Endocrinol. 5:256, 1991), die biologische Bedeutung der meisten dieser Wechselwirkungen ist aber unbekannt. Nach allgemeiner Auffassung bindet CREB DNA entweder als ein Homodimer oder als ein Heterodimer mit mehreren anderen Proteinen. Überraschenderweise aktivieren CREB-Monomere die Transkription konstitutiv (Krajewski, W. und K.A.. W. Lee: "A monomeric derivative of the cellular transcription factor CREB functions as a constitutive activator". Mol. Cell. Biol. 14:7204, 1994).
  • Es konnte kürzlich gezeigt werden, dass CREB/ATF-Proteine neben ihrer entscheidenden Rolle bei der Regulierung der zellulären Transkription von einigen infektiösen Viren und Retroviren vereinnahmt werden, die sie für die virale Replikation benötigen. Beispielsweise enthält der immediate early Promoter des Cytomegalievirus, einer der stärksten bekannten Säugetierpromotoren, elf Kopien von CRE, die für die Promotorfunktion notwendig sind (Chang, Y.-N., S. Crawford, J. Stall, D.R. Rawlins, K.-T. Jeang und G.S. Hayward: „The palindromic series I repeats in the simian cytomegalovirus major immediate-early promoter behave as both strong basal enhancers and cyclic AMP response elements". J. Virol. 64:264, 1990). Mindestens einige der Transkriptions-aktivierenden Wirkungen des adenoviralen E1A-Proteins, das zahlreiche Promotoren induziert, sind auf seine Bindung an die DNA-bindende Domäne des CREB/ATF-Proteins, ATF-2, zurückzuführen, das die E1A-induzierbare Transkriptionsaktivierung vermittelt (Liu, F. und M.R. Green: „Promoter targeting by adenovirus E1a through interaction with different cellular DNA-binding domains". Nature 368:520, 1994). Es wurde auch vorgeschlagen, dass E1A an das CREB-bindende Protein, CBP, bindet (Arany, Z., W.R. Sellers, D.M. Livingston und R. Eckner: „E1A-associated p300 and CREB-associated CBP belong to a conserved family of coactivators". Cell 77:799, 1994). Das humane T-lymphotrope Virus-I (HTLV-1), das Retrovirus, das die menschliche T-Zell-Leukämie und die tropische spastische Parese verursacht, benötigt ebenfalls CREB/ATF- Proteine für die Replikation. In diesem Fall produziert das Retrovirus ein Protein, Tax, das an CREB/ATF-Proteine bindet und sie von ihren normalen zellulären Bindungsstellen zu anderen DNA-Sequenzen (von G- und C-reichen-Sequenzen flankierten) umlenkt, die sich innerhalb des HTLV transcriptional enhancer befinden (Paca-Uccaralertkun, S., L.-J. Zhao, N. Adya, J.V. Cross, B.R. Cullen, I.M. Boros und C.-Z. Giam: „In vitro selection of DNA elements highly responsive to the human T-cell lymphotropic virus type I transcriptional activator, Tax". Mol. Cell. Biol. 14:456, 1994; Adya, N., L.-J. Zhao, W. Huang, I. Boros und C.-Z. Giam: "Expansion of CREB's DNA recognition specificity by Tax results from interaction with Ala-Ala-Arg at positions 282–284 near the conserved DNA-binding domain of CREB". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5642, 1994).
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, dass bestimmte Nukleinsäuren, die unmethylierte Cytosin-Guanin-(CpG)-Dinukleotide enthalten, in einem LebewesenLymphozyten aktivieren und die Immunantwort dieses Lebewesens von Th2 nach Th1 umlenken (z.B. dadurch, dass monozytische Zellen und andere Zellen induziert werden, Th1-Zytokine, darunter IL-12, IFN-y und GM-CSF, zu produzieren). Ausgehend von diesem Ergebnis stellt die Erfindung neuartige Verwendungen von immunstimulierenden Oligonukleotide bereit.
  • In einem Aspekt sieht die Erfindung eine Verwendung eines immunstimulierenden Oligonukleotids, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid enthält, für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder die Vorbeugung von Asthma vor, wobei das immunstimulierende Oligonukleotid nicht in Verbindung mit einem verabreichten Allergen verabreicht wird.
  • In einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung eine Verwendung eines immunstimulierendes Oligonukleotid, das mindestens ein unmethylieres CpG-Dinukleotid enthält, für die Herstellung eines oral zu verabreichenden Medikamentes zur Behandlung oder Vorbeugung von Asthma vor.
  • In einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung eine Verwendung eines immunstimulierenden Oligonukleotids, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid enthält, für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Verhinderung von Allergien vor, wobei das immunstimulierende Oligonukleotid nicht in Verbindung mit einem verabreichten Allergen verabreicht wird.
  • In einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung eine Verwendung eines immunstimulierenden Oligonukleotids, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid enthält, für die Herstellung eines Medikaments für die orale Einnahme zur Behandlung oder Vorbeugung von Allergien vor.
  • In einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung die Verwendung eines immunstimulierenden Oligonukleotids, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid enthält, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Vorbeugung von Ekzemen, allergischer Rhinitis, Nasenkatarrh, Heuschnupfen, Nesselausschlag oder Lebensmittelallergien vor.
  • In einer Ausführungsform ist das immunstimulierende Oligonukleotid eine isolierte immunstimulierende Nukleinsäuresequenz, die ein CpG-Motiv umfasst, das durch die Formel: 5'N1X1CGX2N23' dargestellt ist, wobei mindestens ein Nukleotid aufeinanderfolgende CpGs trennt; X1 Adenin, Guanin oder Thymin ist; X2 Cytosin oder Thymin ist; N irgendein Nukleotid ist und N1 + N2 etwa 0–26 Basen betragen, unter der Voraussetzung, dass N1 und N2 kein CCGG-Quadmer oder nicht mehr als ein CCG- oder CGG-Trimer enthalten; und dass die Nukleinsäuresequenz etwa 8–30 Basen lang ist.
  • In einer anderen Ausführungsform ist das immunstimulierende Oligonukleotid eine isolierte immunstimulierende Nukleinsäuresequenz, die ein CpG-Motiv enthält, das durch die folgende Formel: 5'N1X1X2CGX3X4N23' dargestellt ist, wobei mindestens ein Nukleotid aufeinanderfolgende CpG trennt; X1X2 aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus GpT, GpG, GpA, ApT und ApA; X3X4 aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus TpT oder CpT; N irgendein Nukleotid ist und N1 + N2 etwa 0–26 Basen betragen, unter der Voraussetzung, dass N1 und N2 kein CCGG-Quadmer oder nicht mehr als ein CCG- oder CGG-Trimer enthalten; und dass die Nukleinsäuresequenz etwa 8–30 Basen lang ist.
  • Die immunstimulierenden Oligonukleotide dieser Erfindung sind bei der Stimulierung der Immunaktivierung in einem Lebewesen, insbesondere einem Menschen, nützlich. Die Immunaktivierung kann vorwiegend ein Th1-Muster der Immunaktivierung bewirken.
  • Die immunstimulierenden Oligonukleotide der Erfindung können ebenfalls dazu benutzt werden, andere Störungen (z.B. einen Tumor oder Krebs oder eine virale, Pilz-, bakterielle oder Parasiten-Infektion) zu behandeln, vorzubeugen, oder sie zu lindern. Zusätzlich können die immunstimulierenden Oligonukleotide verabreicht werden, um die Antwort eines Lebewesens auf einen Impfstoff zu stimulieren. Weiterhin können die immunstimulierenden Oligonukleotide der Erfindung dadurch, dass sie die Immunantwort eines Lebewesens von Th2 nach Th1 umlenken, einem Lebewesen in Verbindung mit einem bestimmten Allergen als eine Art Desensibilisierungstherapie verabreicht werden, um das Auftreten einer allergischen Reaktion, die mit einer asthmatischen Störung zusammenhängt, zu behandeln oder zu verhindern.
  • Weiterhin unterstützt die Fähigkeit der Nukleinsäuresequenzen der hierin beschriebenen Erfindung, Leukämiezellen dazu zu veranlassen, in den Zellzyklus einzutreten, ihre Verwendung bei der Behandlung von Leukämie durch Erhöhung der Empfindlichkeit von chronischen Leukämiezellen gefolgt von einer konventionellen ablativen Chemotherapie oder durch die Kombination der Nukleinsäuresequenzen mit anderen Therapien des Immunsystems.
  • Andere Merkmale und Vorteile dieser Erfindung werden aus der folgenden genauen Beschreibung und den Ansprüchen deutlicher werden.
  • Kurzbeschreibung der Figuren
  • 1A–C sind Kurven, die die dosisabhängige IL-6-Produktion als Reaktion auf verschiedene DNA-Sequenzen in Milzzellkulturen mit vermindertem T-Zell-Gehalt graphisch darstellen.
  • 1A. E. coli-DNA (1) und Kalbsthymus-DNA (n) Sequenzen und LPS (10 × höher konzentriert als E. coli- und Kalbsthymus-DNA (u).
  • 1B. Kontroll-Phosphodiester-Oligodesoxynukleotide (ODN) 5'ATGGAAGGTCCAGTGTTCTC3' (SEQ ID No: 1) (n) und zwei Phosphodiester-CpG-ODN 5'ATCGACCTACGTGCGTTCTC3' (SEQ ID No: 2) (u) und 5'TCCATAACGTTCCTGATGCT3' (SEQ ID No: 3) (1).
  • 1C. Kontroll-Phosphothioat-ODN 5'GCTAGATGTTAGCGT3' (SEQ ID No: 4) (n) und zwei Phosphothioat-CpG-ODN 5'GAGAACGTCGACCTTCGAT3' (SQ ID No: 5) (u) und 5'GCATGACGTTGAGCT3' (SEQ ID No: 6) (1). Die Ergebnisse zeigen den Mittelwert einer Dreifachbestimmung + Standardabweichung.
  • 2 ist eine Kurve, die die durch CpG-DNA in vivo induzierte IL-6-Produktion darstellt, wie sie 1–8 Std. nach der Injektion bestimmt wurde. Die Ergebnisse zeigen den Mittelwert einer Zweifachbestimmung von Seren von zwei Mäusen. BALB/c-Mäuse (zwei Mäuse/Gruppe) erhielten eine i.v. Injektion von 100 μl PBS (o) oder 200 μg CpG-Phosphothioat-ODN 5'TCCATGACGTTCCTGATGCT3' (SEQ ID No: 7) (n) oder nicht-CpG-Phosphothioat-ODN 5'TCCATGAGCTTCCTGAGTCT3' (SEQ ID No: 8) (u).
  • 3 ist ein Autoradiogramm, das die durch reverse transcription polymerase chain reaction bestimmte IL-6 mRNA-Expression in Leber, Milz und Thymus nach verschiedenen Zeitspannen nach in vivo-Stimulierung von BALB/c-Mäusen (zwei Mäuse/Gruppe) zeigt, denen i.v. 100 μl PBS, 200 μg CpG-Phosphothioat-ODN 5'TCCATGACGTTCCTGATGCT3' (SEQ ID No: 7) oder nicht-CpG-Phosphothioat-ODN 5'TCCATGAGCTTCCTGAGTCT3' (SEQ ID No: 8) injiziert wurden.
  • 4A ist eine Kurve, die die dosisabhängige Inhibierung von CpG-induzierter IgM-Produktion durch anti-IL-6 darstellt. B-Zellen der Milz von DBA/2-Mäusen wurden mit CpG ODN 5'TCCAAGACGTTCCTGATGCT3' (SEQ ID No: 9) in Anwesenheit der angegebenen Konzentrationen von neutralisierendem anti-IL-6 (u) oder Isotyp-Kontrolle Ab (1) stimuliert und die IgM-Titer in Kultwüberständen durch ELISA bestimmt. In Abwesenheit von CpG ODN zeigte der anti-IL-6 Ab keine Wirkung auf die IgM-Sekretion (n).
  • 4B ist eine Kurve, die den Stimulierungsindex von CpG-induzierten B-Zellen der Milz darstellt, die mit anti-IL-6 und CpG-S-ODN 5'TCCATGACGTTCCTGATGCT3' (SEQ ID No: 7) (u) oder nur mit anti-IL-6-Antikörper (n) inkubiert wurden. Die Daten zeigen den Mittelwert von Dreifachmessungen + Standardabweichung.
  • 5 ist ein Balkendiagramm, das die Chloramphenicolacetyltransferase (CAT)-Aktivität von WEHI-231-Zellen zeigt, die mit einem CAT-Konstrukt ohne Promotor (pCAT), einem positiven Kontrollplasmid (RSV) oder einem IL-6 Promotor-CAT-Konstrukt alleine transfiziert oder mit CpG 5'TCCATGACGTTCCTGATGCT3'- (SEQ ID No: 7) oder nicht-CpG 5'TCCATGAGCTTCCTGAGTCT3' (SEQ ID No: 8)-Phosphothioat-ODN bei der angegebenen Konzentrationen inkubiert wurden. Die Daten zeigen den Mittelwert von Dreifachmessungen.
  • 6 ist ein schematischer Überblick über die Immunwirkungen der immunstimulierenden, unmethylierten, CpG enthaltenden Nukleinsäwen, die wie abgebildet sowohl direkt B-Zellen als auch monozytische Zellen (einschliesslich Makrophagen und dendritische Zellen) direkt aktivieren können. Die immunstimulierenden Oligonukleotide aktivieren gereinigte NK-Zellen nicht direkt, aber verleihen ihnen die Fähigkeit, auf IL-12 mit einem deutlichen Anstieg ihrer IFN-γ-Produktion zu reagieren. Durch die Induktion der IL-12-Produktion und die nachfolgend erhöhte IFN-γ-Sekretion durch NK-Zellen fördern die immunstimulierenden Nukleinsäwen eine Immunantwort des Th1-Typs. Es konnte keine direkte Aktivierung der Vermehrung der Zytokinsekretion durch hochgereinigte T-Zellen festgestellt werden. Allerdings fördert die Induktion der Th1-Zytokinsekretion durch die immunstimulierenden Oligonukleotide die Entwicklung einer zytotoxischen Lymphozyten-Reaktion.
  • 7 ist ein Autoradiogramm, das die NFkB-mRNA-Induktion bei Monozyten, die mit E. coli (EC)-DNA (die unmethylierte CpG-Motive enthält), Kontroll-(CT)-DNA (enthält keine unmethylierten CpG-Motive) und Lipopolysaccharid (LPS) behandelt wurden, zu verschiedenen gemessenen Zeiten, 15 und 30 Minuten nach dem Kontakt, zeigt.
  • 8A zeigt die Ergebnisse einer Durchflusszytometrie-Studie unter Verwendung von Maus-B-Zellen mit dem Farbstoff Dihydrorhodamin 123, um die Konzentrationen an reaktiven Sauerstoffspezies zu bestimmen. Die Probe in Feld A der Figur, die nur den Farbstoff enthält, zeigt, dass die Hintergrundkonzentration an Zellen, die positiv auf den Farbstoff reagieren, bei 28,6% liegt. Bei Zellen, die 20 Minuten mit PMA und Ionomycin, einer Positiv-Kontrolle (Feld B), behandelt wurden, war diese Konzentration an reaktiven Sauerstoffspezies stark auf 80% erhöht. Die Zellen, die mit dem CpG-Oligo (TCCATGACGTTCCTGACGTT SEQ ID No. 10) behandelt wurden, zeigten auch eine Erhöhung der Konzentration an reaktiven Sauerstoffspezies, so dass mehr als 50% der Zellen positiv wurden (Feld D). Hingegen zeigten Zellen, die mit einem Oligonukleotid mit – abgesehen davon, dass die CpGs umgedreht waren – identischer Sequenz behandelt wurden, (TCCATGAGCTTCCTGAGTGCT SEQ ID NO. 11), diese erhebliche Zunahme der Konzentration reaktive Sauerstoffspezies nicht (Feld E).
  • 8B zeigt die Ergebnisse einer Durchflusszytometrie-Studie unter Verwendung von Maus-B-Zellen mit dem Farbstoff Dihydrorhodamin 123 zur Bestimmung der Konzentrationen an reaktiven Sauerstoffspezies in Anwesenheit von Chloroquin. Chloroquin erniedrigt die Hintergrundkonzentration an reaktiven Sauerstoffspezies in den Zellen leicht, so dass von den unbehandelten Zellen in Feld A nur 4,3% positiv sind. Chloroquin hebt die Induktion von reaktiven Sauerstoffspezies in den mit CpG-DNA behandelten Zellen völlig auf (Feld B), reduziert aber nicht die Konzentration an reaktiven Sauerstoffspezies in Zellen, die mit PMA und Ionomycin behandelt wurden (Feld E).
  • 9 stellt eine Auftragung der bei Lungenspülung erhaltenen Zellzahlen gegen die Zeit dar. Die Kurve zeigt, dass viele Entzündungszellen in den Lungen vorhanden sind, wenn den Mäusen zunächst Schistosoma mansoni-Eier „Ei" injiziert werden, was eine Th2-Immunreaktion induziert, und sie anschließend Schistosoma mansoni-Ei-Antigen „SEA" inhalieren (offene Kreise). Wenn den Mäusen jedoch zusammen mit dem Ei zunächst CpG-Oligo (SEQ ID No: 10) gegeben wird, nimmt die Zahl der Entzündungszellen in der Lunge durch die anschließende Inhalation von SEA nicht zu (offene Dreiecke).
  • 10 stellt eine Auftragung der bei Lungenspülung erhaltenen Eosinophilenzahlen gegen die Zeit dar. Die Kurve zeigt erneut, dass viele Eosinophile in den Lungen vorhanden sind, wenn den Mäusen zunächst Ei eingespritzt wird und sie anschließend SEA inhalieren (offener Kreis). Wenn den Mäusen jedoch zunächst zusammen mit dem Ei auch CpG-Oligo (SEQ ID NO. 10) verabreicht wird, wird die Zahl der Entzündungszellen durch die nachfolgende Inhalation von SEA nicht erhöht (offene Dreiecke).
  • 11 zeigt ein Balkendiagramm, das die durch die Einwirkung von Salzlösung ohne weitere Zugaben; Ei, dann SEA; Ei und SEQ ID No. 11, dann SEA; und Ei und Kontroll-Oligo (SEQ ID No. 11), dann SEA, induzierte Wirkung auf den Prozentanteil von Makrophagen, Lymphozyten, Neutrophilen und Eosinophilen zeigt. Wenn die Mäuse zur Zeit der ersten Einwirkung des Eis mit dem Kontroll-Oligo behandelt werden, kann man nach der Inhalation von SEA kaum eine Wirkung auf den nachfolgenden Einstrom von Eosinophilen in die Lungen feststellen. Demnach entwickeln die Mäuse eine akute Entzündungsreaktion in den Lungen, wenn sie die Eier an den Tagen 14 oder 21 inhalieren. Jedoch hebt die Gabe eines CpG-Oligos zusammen mit den Eiern zur Zeit der ersten Antigeneinwirkung an den Tagen 0 und 7 die Zunahme an Eosinophilen fast komplett auf, wenn die Mäuse das Ei-Antigen am 14. Tag inhalieren.
  • 12 zeigt ein Balkendiagramm, das die Eosinophilenzahlen als Reaktion auf die Injektion verschiedener Mengen des Schutz-Oligos SEQ ID No. 10 zeigt.
  • 13 stellt eine Auftragung der Interleukin 4 (IL-4)-Produktion (pg/ml) von Mäusen gegen die Zeit als Reaktion auf die Injektion von Ei, dann SEA (offene Raute); Ei und SEQ ID No. 10, dann SEA (offener Kreis); oder Salzlösung, dann Salzlösung (offenes Quadrat) dar. Die Kurve zeigt, dass die resultierende Entzündungsreaktion mit den Konzentrationen des Th2-Zytokins IL-4 in der Lunge korreliert.
  • 14 ist ein Balkendiagramm, das die Interleukin 12 (IL-12)-Produktion (pg/ml) in Mäusen über die Zeit als Reaktion auf die Einspritzung von Salzlösung; Ei, dann SEA; oder SEQ ID No. 10 und Ei, dann SEA, zeigt. Die Kurve zeigt, dass die Verabreichung eines Oligonukleotids, das ein unmethyliertes CpG-Motiv enthält, tatsächlich die Zytokinantwort der Lunge auf die Produktion von IL-12 umlenkt, was eine Th1-Typ Immunantwort anzeigt.
  • 15 ist ein Balkendiagramm, das die Interferon gamma (IFN-γ)-Produktion (pg/ml) in Mäusen über der Zeit als Reaktion auf die Injektion von Salzlösung; Ei, dann Salzlösung; oder SEQ ID No. 10 und Ei, dann SEA, zeigt. Die Kurve zeigt, dass die Verabreichung eines Oligonukleotids, das ein unmethyliertes CpG-Motiv enthält, ebenfalls die Zytokinreaktion der Lunge zur Produktion von IFN-g umlenkt, was eine Th1-Typ-Immunantwort anzeigt.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Definitionen
  • Hierin sollen die folgenden Begriffe und Formulierungen die folgenden Bedeutungen haben:
    Als „Allergen" wird eine Substanz bezeichnet, die in einem empfindlichen Lebewesen eine allergische oder asthmatische Reaktion hervorrufen kann. Die Liste von Allergenen ist enorm und kann Pollen, Insektengifte, Tierstaub und -schuppen, Pilzsporen und Medikamente (z.B. Penicillin) umfassen. Beispiele für natürliche, tierische und pflanzliche Allergene umfassen Proteine, die für die folgenden Gattungen spezifisch sind: Canine (Canis familiaris); Dermatophagoides (z.B. Dermatophagoides farinae); Felis (Felis domesticus); Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia) Lolium (z.B. Lolium perenne oder Lolium multiflorum); Cryptomeria (Cryptomeria japonica); Alternaria (Alternaria alternata); Alder; Alnus (Alnus gultinosa); Betula (Betula verrucosa); Quercus (Quercus alba); Olea (Olea europa); Artermisia (Artermisia vulgaris); Plantago (z.B. Plantago lanceolata); Parietaria (z.B. Parietaria officinalis oder Parietaria judaica); Blattella (z.B. Blattella germanica); Apis (z.B. Apis multiflorum); Cupressus (Cupressus sempervirens, Cupressus arzonica und Cupressus macrocarpa); Juniperus (z.B. Juniperus sabinoides, Juniperus virginia, Juniperus communis und Juniperus ashei); Thuya (z.B. Thuya orientalis); Chamaecyparis (z.B. Chamaecyparis obtusa); Periplaneta (z.B. Periplaneta americana); Agropyron (z.B. Agropyron repens); Secale (z.B. Secale cereale); Triticum (z.B. Triticum aestivum); Dactylis (z.B. Dactylis glomerata); Festuca (z.B. Festuca elatior); Poa (Poa pratensis oder Poa compressa); Avena (z.B. Agena sativa); Holcus (z.B. Holcus lanatus); Antoxanthum (z.B. Anthxanthum odoratum); Arrhenatherum (z.B. Arrhenatherum elatius); Agrostis (z.B. Agrostis alba); Phleum (z.B. Phleum pratense); Phalaris (z.B. Phalaris arundinacea); Paspalum (z.B. Paspalum notatum); Sorghum (z.B. Sorghum halepensis); und Bromus (z.B. Bromus inermis).
  • Als „Allergie" wird eine erworbene Überempfindlichkeit gegen eine Substanz (Allergen) bezeichnet. Allergischen Zuständen umfassen Ekzeme, allergische Rhinitis oder Nasenkatarrh, Heuschnupfen, bronchiale Asthma, Uritcaria (Nesselsucht) und Lebensmittelallergien und andere atopische Zustände.
  • Als „Asthma" bezeichnet man eine Störung des Atmungssystems, die durch Entzündung, Verengung der Luftwege und eine erhöhte Reaktivität der Luftwege auf inhalierte Substanzen gekennzeichnet ist. Asthma ist häufig, aber nicht ausschließlich mit atopischen oder allergischen Symptomen verbunden.
  • Eine „Defizienz des Immunsystems" soll eine Krankheit oder Störung bezeichnen, bei der das Immunsystem des Lebewesens nicht in im normalen Ausmass funktioniert, oder bei der es nützlich wäre, die Immunreaktion des Lebewesens zu stärken, um beispielsweise ein Tumor- oder Krebsgeschwür zu beseitigen (z.B. Tumore des Gehirns, der Lunge (z.B. kleinzellig oder nicht-kleinzellig), der Eierstöcke, der Brust, der Prostata, des Dickdarms, genauso wie andere Karzinome und Sarkome) oder um eine Infektion des Lebewesens zu beseitigen.
  • Beispiele von infektiösen Viren umfassen: Retroviridae (z.B. menschliche Immundefizienzviren, wie HIV-1 (auch bezeichnet als HTLV-III, LAV oder HTLV-III/LAV oder HIV-III; und andere Isolate, wie HIV-LP); Picornaviridae (z.B. Polioviren, Hepatitis A-Virus; Enteroviren, menschliche Coxsackie-Viren, Rhinoviren, Echoviren); Calciviridae (z.B. Stämme, die Gastroenteritis verursachen); Togaviridae (z.B. Pferdeenzephalitisviren, Rubellaviren); Flaviridae (z.B. Dengue-Viren, Enzephalitisviren, Gelbfieberviren); Coronaviridae (z.B. Coronaviren); Rhabdoviridae (z.B. vesikuläre Stomatitisviren, Tollwut-Viren); Filoviridae (z.B. Ebolaviren); Paramyxoviridae (z.B. Parainfluenzaviren, Mumpsvirus, Masernvirus, Atmungs-syncytial-Virus); Orthomyxoviridae (z.B. Grippeviren); Bungaviridae (z.B. Hantaan-Viren, Bungaviren, Phleboviren und Nairo-Viren); Arenaviridae (hämorrhagische Fieberviren); Reoviridae (z.B. Reoviren, Orbiviren und Rotaviren); Birnaviridae; Hepadnaviridae (Hepatitis B-Virus); Parvoviridae (Parvoviren); Papovaviridae (Papillomaviren, Polyomaviren); Adenoviridae (die meisten Adenoviren); Herpesviridae (Herpes simplex-Virus (HSV) 1 und 2, Varizella Zoster-Virus, Cytomegalievirus (CMV), Herpesviren); Poxviridae (Variolaviren, Impfpockenviren, Pockenviren); und Iridoviridae (z.B. Afrikanischer Schweinefiebervirus); und unklassifizierte Viren (z.B. die ätiologischen Agentien der spongiformen Enzephalopathien, das Agens der Delta-Hepatitis-Krankheiten (man glaubt, dass es sich um einen defekten Satellit des Hepatitis B-Virus handelt), die Agentien der nicht-A-, nicht-B-Hepatitis (Klasse 1 = innerlich übertragen; Klasse 2 = parenteral übertragen (d. h. Hepatitis C); Norwalk- und verwandte Viren und Astroviren).
  • Beispiele für infektiöse Bakterien umfassen: Heliobacter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps. (z.B. M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Gruppe A-Streptococcen), Streptococcus agalacidae (Gruppe B-Streptococcen), Streptococcus (viridans-Gruppe), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (anaerobe sps.), Streptococcus pneumoniae, pathogene Campylobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus antracis, Corynebacterium diphterheriae, Corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacer aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira und Actinomyces israelli.
  • Beispiele für infektiöse Pilze umfassen: Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans. Andere infektiöse Organismen (d. h. Protisten) umfassen: Plasmodium falciparum und Toxoplasma gondii.
  • Als „immunstimulierendes Nukleinsäuremolekül" bezeichnet man ein Nukleinsäuremolekül, das eine unmethylierte Cytosin, Guanin-Dinukleotidsequenz enthält (d. h. „CpG-DNA" oder DNA, die ein Cytosin enthält, dem ein Guanosin folgt, und das durch eine Phosphatbindung verbunden ist) und einen Wirbeltier-Lymphozyten stimuliert (z.B. eine mitogene Wirkung aufweist oder durch dessen Zytokin-Expression induziert oder erhöht). Ein immunstimulierendes Nukleinsäuremolekül kann doppel- oder einzelsträngig sein. Im Allgemeinen sind doppelsträngige Moleküle in vivo stabiler, wohingegen einzelsträngige Moleküle eine erhöhte Immunaktivität aufweisen.
  • Bevorzugterweise enthält das immunstimulierende Oligonukleotid dieser Erfindung X1X2, das aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus GpT, GpG, GpA und ApA, und X3X4, das aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus TpT, CpT und GpT (siehe z.B. Tabelle 5). Um die Aufnahme in die Zellen zu erleichtern, sind die CpG enthaltenden immunstimulierenden Oligonukleotide vorzugsweise ungefähr 8 bis 30 Basen lang. Allerdings sind Nukleinsäuren jeder Größe (selbst viele kb lang) immunstimulierend, wenn genügend immunstimulierende Motive vorhanden sind, da solche größeren Nukleinsäuren im Inneren der Zelle zu Oligonukleotiden abgebaut werden. Bevorzugte synthetische Oligonukleotide enthalten kein CCGG-Quadmer oder nicht mehr als ein CCG- oder CGG-Trimer am oder nahe des 5'- und/oder des 3'-Endes, und/oder das mitogene Konsens-CpG-Motiv ist kein Palindrom. Eine verlängerte Immunstimulierung kann erreicht werden, wenn man stabilisierte Oligonukleotide benutzt, wobei in das Oligonukleotid eine Phosphatrückgratmodifikation eingebaut ist. Diese Modifikation ist zum Beispiel eine Phosphothioat- oder Phosphodithioat-Modifikation. Insbesondere tritt die Phosphatrückgrat-Modifikation am 5'-Ende der Nukleinsäure auf, zum Beispiel an den ersten beiden Nukleotiden des 5'-Endes der Nukleinsäure. Weiterhin kann die Phosphatrückgratmodifikation am 3'-Ende der Nukleinsäure auftreten, zum Beispiel an den letzten fünf Nukleotiden des 3'-Endes der Nukleinsäure.
  • Bevorzugterweise bewegt sich die Größe der immunstimulierenden CpG-DNA im Bereich von 8 bis 30 Basen, wenn es sich um ein Oligonukleotid handelt. Alternativ können CpG-Dinukleotide in großem Maßstab in Plasmiden produziert werden, die nach Verabreichung an ein Lebewesen zu Oligonukleotiden abgebaut werden. Bevorzugte immunstimulierende Oligonukleotide (z.B. zur Verwendung für die Erhöhung der Wirksamkeit einer Impfung oder für die Behandlung einer Defizienz des Immunsystems, indem die Antikörper (d. h. die humorale) -Reaktion in einem Lebewesen stimuliert wird) haben einen hohen Stimulierungsindex bezüglich der Reaktionen von B-Zellen, Monozyten und/oder natürlichen Killerzellen (z.B. Zytokine, proliferative, lytische oder andere Reaktionen).
  • Die immunstimulierenden Oligonukleotide der Erfindung stimulieren zum Beispiel die Zytokinproduktion in einem Lebewesen. Diese Zytokinen umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, IL-6, IL-12, IFN-γ, TNF-α und GM-CSF. Beispielhafte Sequenzen umfassen:
    Figure 00180001
  • Die immunstimulierenden Oligonukleotide dieser Erfindung sind auch nützlich bei der Stimulierung der lytischen Aktivität von natürlichen Killerzellen (NK) in einem Lebewesen wie einem Menschen. Spezifische, aber nicht beschränkende Beispiele solcher Sequenzen sind:
    Figure 00190001
  • Die immunstimulierenden Oligonukleotide dieser Erfindung sind auch nützlich bei der Stimulierung der B-Zell-Proliferation in einem Lebewesen wie einem Menschen. Spezifische, aber nicht beschränkende Beispiele solcher Sequenzen umfassen:
    Figure 00190002
  • Die immunstimulierenden Oligonukleotide dieser Erfindung sind als Adjuvans zur Verwendung während der Antikörperproduktion in einem Säugetier nützlich. Spezifische, aber nicht erschöpfende Beispiele solcher Sequenzen umfassen: TCCATGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID NO. 10), GTCG(T/C)T und TGTCG(T/C)T. Weiterhin können die immunstimulierenden Oligonukleotide verabreicht werden, um Symptome einer asthmatischen Fehlfunktion zu behandeln oder verhindern, indem sie die Immunantwort des Lebewesens von Th2 nach Th1 umlenken. Eine beispielhafte Sequenz umfasst
    TCCATGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID NO: 10).
  • Der Stimulierungsindex einer bestimmten immunstimulierenden CpG-DNA kann in verschiedenen Immunzelltests getestet werden. Bevorzugterweise beträgt der Stimulierungsindex der immunstimulierenden CpG-DNA bezüglich der B-Zell-Proliferation mindestens ungefähr 5, bevorzugter mindestens ungefähr 10, bevorzugterer mindestens ungefähr 15 und am bevorzugtesten mindestens ungefähr 20, wie durch Einbau von 3H-Uridin in einer murinen B-Zellkultur, die 20 Stunden lang bei 37 °C mit 20 μM ODN in Kontakt war, mit 1 μCi 3H-Uridin gepulst wurde und 4 Std. später geerntet und gezählt wurde, bestimmt wurde, wie es im Detail in Beispiel 1 beschrieben ist. Für die Verwendung in vivo, beispielsweise um eine Immunsystem-Defizienz zu behandeln, indem eine Zell-vermittelte (lokale) Immunantwort in einem Lebewesen stimuliert wird, ist es wichtig, dass die immunstimulierende CpG-DNA in der Lage ist, die Zytokinsekretion durch monozytische Zellen und/oder die Zell-lytische Aktivität natürlicher Killer (NK)-Zellen wirksam zu induzieren.
  • Bevorzugte immunstimulierende CpG-Nukleinsäuren sollten abhängig von der therapeutischen Indikation und nach Bestimmung durch die Tests, die in Beispiel 12 beschrieben sind, eine Wirkung von mindestens ungefähr 500 pg/ml TNF-α, 15 pg/ml IFN-γ, 70 pg/ml GM-CSF, 275 pg/ml IL-6, 200 pg/ml IL-12 haben. Andere bevorzugte immunstimulierende CpG-DNAs sollten, wie durch den Test bestimmt, der im Detail in Beispiel 4 beschrieben wird, die Wirkung einer mindestens 10 %igen, bevorzugt mindestens 15 %igen und am bevorzugtesten mindestens 20 %igen YAC-1-Zell-spezifischen Lyse haben, oder die einer mindestens ungefähr 30, bevorzugt mindestens ungefähr 35 und am bevorzugtesten mindestens ungefähr 40 %igen 2C11-Zell-spezifischen Lyse haben.
  • Eine „Nukleinsäure" oder „DNA" bedeutet mehrere Nukleotide (d. h. Moleküle, die einen Zucker (z.B. Ribose oder Desoxyribose) enthalten, der an eine Phosphatgruppe und an eine austauschbare organische Base, die entweder ein substituiertes Pyrimidin (z.B. Cytosin (C), Thymin (T) oder Uracil (U)) oder ein substituiertes Purin (z.B. Adenin (A) oder Guanin (G)) ist, gebunden ist. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff genau so auf Ribonukleotide wie auf Oligodesoxyribonukleotide. Der Begriff soll außerdem Polynukleoside (d. h. ein Polynukleotid minus der Phosphatgruppe) und ein jedes andere Polymer umfassen, das organische Basen enthält. Nukleinsäure-Moleküle können von existierenden Nukleinsäurequellen (z.B. genomischer oder cDNA) erhalten werden, sind aber vorzugsweise synthetisch (z.B. durch Oligonukleotid-Synthese produziert).
  • Ein „Nukleinsäure-Abgabekomplex" soll ein Nukleinsäuremolekül bedeuten, das mit einem Mittel zum Zielen (z.B. ein Molekül, das zu einer höheren Bindungsaffinität an Zielzellen (z.B. B-Zellen und natürliche Killerzellen (NK)) -Oberflächen und/oder erhöhte zelluläre Aufnahme durch die Zielzellen führt) verbunden ist (z.B. durch ionische oder kovalente Bindung; oder darin verkapselt). Beispiele für Nukleinsäure-Abgabekomplexe umfassen Nukleinsäuren, die verbunden sind mit: einem Sterol (z.B. Cholesterin), einem Lipid (z.B. ein kationisches Lipid, Virosom oder Liposom) oder einer Substanz, die Zielzellen spezifisch bindet (z.B. ein Ligand, der von einem für die Zielzelle spezifischen Rezeptor erkannt wird). Bevorzugte Komplexe müssen in vivo ausreichend stabil sein, um einen erheblichen Zerfall vor der Aufnahme durch die Zielzelle zu verhindern. Der Komplex sollte jedoch unter geeigneten Bedingungen in der Zelle spaltbar sein, so dass die Nukleinsäure in einer funktionellen Form freigesetzt wird.
  • Eine „palindromische Sequenz" soll eine seitenverkehrte Wiederholung bedeuten (d. h. eine Sequenz wie ABCDEE'D'C'B'A', bei der A und A' Basen sind, die gewöhnliche Watson-Crick-Basenpaare zu bilden in der Lage sind). Solche Sequenzen können in vivo möglicherweise doppelsträngige Strukturen bilden.
  • Ein „stabilisiertes Nukleinsäuremolekül" soll ein Nukleinsäuremolekül bedeuten, das relativ resistent gegen den Abbau in vivo ist (z.B. durch eine Exo- oder Endonuklease). Die Stabilisierung kann eine Funktion der Länge oder der Sekundärstruktur sein. Nukleinsäuremoleküle, die unmethyliertes CpG enthalten, und die mehrere zehn bis hundert kb lang sind, sind relativ resistent gegen in vivo-Abbau. Bei kürzeren immunstimulierenden Nukleinsäuremolekülen kann die Sekundärstruktur stabilisieren und ihre Wirkung erhöhen. Wenn zum Beispiel das 3'-Ende eines Nukleinsäuremoleküls selbst-komplementär zu einer stromaufwärtigen Region des gleichen Moleküls ist, so dass es rückfalten und eine Art Stem-Loop-Struktur bilden kann, dann ist das Nukleinsäuremolekül stabilisiert und zeigt deshalb mehr Aktivität.
  • Bevorzugte stabilisierte Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung haben ein modifiziertes Rückgrat. Zur Verwendung für die Immunstimulierung sind besonders bevorzugt stabilisierte Nukleinsäuremoleküle Phosphothioat- (d. h. mindestens eines der Phosphat-Sauerstoffatome der Nukleinsäuremoleküle ist durch ein Schwefelatom ersetzt) oder Phosphodithioat-modifizierte Nukleinsäuremoleküle. Insbesondere tritt die Phosphat-Rückgrat-Modifikation zum Beispiel am 5'-Ende der Nukleinsäuren auf, an den ersten beiden Nukleotiden des 5'-Endes der Nukleinsäure. Weiterhin kann die Phosphat-Rückgrat-Modifikation zum Beispiel am 3'-Ende der Nukleinsäure auftreten, an den letzten fünf Nukleotiden des 3'-Endes der Nukleinsäure. Zusätzlich zur im Folgenden hierin beschriebenen Stabilisierung des Nukleinsäuremoleküls können Phosphothioat-modifizierte Nukleinsäuremoleküle (darunter Phosphodithioat-modifizierte) das Ausmass der Immunstimulierung durch das Nukleinsäuremolekül, das wie hierin gezeigt ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid enthält, erhöhen. In der internationalen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 95/26204 und dem Titel „Immunstimulierung durch Phosphothioatoligonukleotid-Analoga" wird auch über die nicht-sequenzspezifische immunstimulierende Wirkung von Phosphothioat-modifizierten Oligonukleotiden berichtet. Wie hierin berichtet wird, wurde festgestellt, dass Nukleinsäuremoleküle, die unmethylierte CpGs und ein Phosphothioat-Rückgrat enthalten, bevorzugterweise die B-Zell-Aktivität erhöhen, wohingegen festgestellt wurde, dass Nukleinsäuremoleküle, die unmethyliertes CpG enthalten und ein Phosphodiester-Rückgrat enthalten, vorzugsweise Monozyten (Makrophagen, dendritische Zellen und Monozyten) und NK-Zellen aktivieren. Phosphothioat-CpG-Oligonukleotide mit bevorzugten menschlichen Motiven sind ebenfalls starke Aktivatoren von Monozyten und NK-Zellen.
  • Andere stabilisierte Nukleinsäuremolekülen umfassen: nicht-ionische DNA-Analoga, wie Alkyl- und Arylphosphonate (bei denen der geladene Phosphonat-Sauerstoff durch eine Alkyl- oder Arylgruppe ersetzt wurde), Phosphodiester und Alkylphosphotriester, bei denen der geladene Sauerstoffrest alkyliert ist. Es wurde auch gezeigt, dass Nukleinsäuremoleküle mit einem Diol wie Tetraethylenglykol oder Hexaethylenglykol besonders resistent gegen den Abbau durch Nukleasen sind.
  • Ein „Lebewesen" soll ein Mensch oder Wirbeltier sein einschließlich eines Hundes, einer Katze, eines Pferdes, einer Kuh, eines Schweines, eines Schafes, einer Ziege, eines Huhns, eines Affen, einer Ratte oder einer Maus.
  • Hierin bezieht sich der Begriff „Vektor" auf ein Nukleinsäuremolekül, das in der Lage ist, eine andere Nukleinsäure, an die es gekoppelt worden ist, zu transportieren. Bevorzugte Vektoren sind solche, die zur autonomen Replikation und zur Expression von an sie gekoppelten Nukleinsäuren in der Lage sind (z.B. ein Episom). Vektoren, die in der Lage sind, die Expression von funktionsfähig mit ihnen verbundenen Genen zu steuern, werden hierin als „Expressionsvektoren" bezeichnet. Im Allgemeinen liegen Expressionsvektoren, die für rekombinante DNA-Methoden nützlich sind, oft in der Form von „Plasmiden" vor, womit man im Allgemeinen ringförmige, doppelsträngige DNA-Ringe bezeichnet, die, in ihrer Vektorform, nicht an das Chromosom gebunden sind. In der vorliegenden Beschreibung werden „Plasmid" und „Vektor" in austauschbarer Weise benutzt, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Form des Vektors ist. Es ist jedoch beabsichtigt, dass Erfindung auch andere Formen von Expressionsvektoren umfasst, die gleiche Aufgaben erfüllen und auf diesem Gebiet nachträglich bekannt werden.
  • Bestimmte Nukleinsäuren, die unmethyliertes CpG enthalten, haben B-Zell-stimulierende Aktivität, wie in vitro und in vivo gezeigt
  • Im Verlauf von Untersuchungen der Lymphozyten-stimulierenden Wirkungen von zwei Antisense-Oligonukleotiden, die für endogene retrovirale Sequenzen spezifisch sind, bei denen in den beigefügten Beispielen 1 und 2 beschriebene Protokolle verwendet wurden, wurde überraschend herausgefunden, dass zwei von vierundzwanzig „Kontrollen" (unter ihnen verschiedene durcheinandergemischte, Sinn- und Mismatch-Kontrollen für einen Satz von „Antisense"-ODNs) ebenfalls die B-Zellen-Aktivierung und IgM-Sekretion vermittelten, wohingegen die anderen „Kontrollen" keine Wirkung zeigten.
  • Zwei Beobachtungen legten die Annahme nahe, dass Antisense-Effekte an dem Mechanismus dieser B-Zell-Aktivierung durch die „Kontroll"-ODN möglicherweise nicht beteiligt sind: 1) Ein Vergleich mit in Genbank augelisteten Wirbeltier-DNA-Sequenzen zeigte keine größere Homologie als die mit nicht-stimulierenden ODNs gefundene und 2) die beiden Kontrollen zeigten keine Hybridisierung bei Northern blots mit 10 μg Poly A + RNA aus Milz. Die Neusynthese dieser ODNs mit einem anderen Synthesizer oder die ausführliche Reinigung durch Polyacrylamidgelelektrophorese oder Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie ergaben eine identische Stimulierung, was die Möglichkeit einer Unreinheit ausschließt. Eine ähnliche Stimulierung wurde beobachtet, wenn B-Zellen von C3H/HeJ-Mäusen benutzt wurden, was die Möglichkeit ausschließt, dass eine Lipopolysaccharid (LPS)-Kontamination für diese Ergebnisse verantwortlich ist.
  • Aufgrund der Tatsache, dass zwei „Kontroll"-ODNs eine B-Zell-Aktivierung verursachten, die der durch zwei „Antisense"-ODN verursachten ähnlich war, bestand die Möglichkeit, dass alle vier ODNs B-Zellen durch einen Nicht-Antisense-Mechanismus stimulierten, an dem ein Sequenzmotiv beteiligt war, das in allen anderen nicht-stimulierenden Kontroll-ODNs fehlte. Bei einem Vergleich dieser Sequenzen wurde entdeckt, dass alle vier stimulierenden ODNs CpG-Dinukleotide enthielten, deren Sequenzkontext sich von dem der nicht-stimulierenden Kontrolle unterschied.
  • Um zu bestimmen, ob das in den stimulierenden ODNs vorhandene CpG-Motiv für die beobachtete Stimulierung verantwortlich war, wurden über 300 ODNs synthetisiert, deren Länge von 5 bis 42 Basen reichte, und die methylierte, unmethylierte oder keine CpG-Dinukleotide in zahlreichen Sequenz-Zusammenhängen enthielten. Diese ODNs, unter ihnen die beiden ersten „Kontrollen" (ODN 1 und 2) und zwei ursprünglich als „Antisense" synthetisierte ODNs (ODN 3D und 3M; Krieg, A.M. J. Immunol. 143:2448 (1989)) wurden anschließend auf in vitro Wirkungen auf Milzzellen untersucht. (repräsentative Sequenzen sind in Tabelle 1 aufgelistet). Mehrere ODNs, die CpG-Dinukleotide enthielten, induzierten B-Zell-Aktivierung und IgM-Sekretion; die Größenordnung dieser Stimulierung konnte typischerweise durch die Zugabe von mehr CpG-Dinukleotiden erhöht werden (Tabelle 1; vergleichen Sie ODN 2 mit 2a oder 3D mit 3Da und 3Db). Die Stimulierung schien nicht das Ergebnis eines Antisense-Mechanismus oder einer Verunreinigung zu sein. ODNs verursachten keine nachweisbare Proliferation von γδ- oder anderen T-Zell-Populationen.
  • Mitogene ODN-Sequenzen wurden einheitlich nicht-stimulierend, wenn das CpG-Dinukleotid mutiert wurde (Tabelle 1; vergleichen Sie ODN 1 mit 1a; 3D mit 3Dc; 3M mit 3Ma; und 4 mit 4a), oder wenn das Cytosin des CpG-Dinukleotides durch 5-Methylcytosin ersetzt wurde (Tabelle 1; ODN 1b, 2b, 3Dd und 3Mb). Eine partielle Methylierung des CpG-Motivs verursachte einen teilweisen Verlust der stimulierenden Wirkung (vergleichen Sie 2a mit 2c, Tabelle 1). Dagegen reduzierte die Methylierung anderer Cytosine die ODN-Aktivität nicht (ODN 1c, 2d, 3De und 3Mc). Diese Daten bestätigten, dass ein CpG-Motiv das wesentliche Element in ODN ist, die B-Zellen aktivieren.
  • Im Verlauf dieser Untersuchungen wurde klar, dass die das CpG-Dinukleotid flankierenden Basen eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der durch ein ODN induzierten Aktivität von murinen B-Zellen spielten. Es wurde bestimmt, dass das optimale stimulierende Motiv aus einem CpG besteht, das von zwei 5'-Purinen (vorzugsweise ein GpA-Dinukleotid) und von zwei 3'-Pyrimidinen (vorzugsweise ein TpT- oder TpC-Dinukleotid) flankiert wird. Mutationen des ODN, um das CpG-Motiv an diesess Ideal näherzubringen, verbesserten die Stimulierung (z.B. Tabelle 1, vergleichen Sie ODN 2 mit 2e; 3M mit 3Md), wohingegen Mutationen, die das Motiv störten, die Stimulierung verringerten (z.B. Tabelle 1, vergleichen Sie ODN 3D mit 3Df 4 mit 4b, 4c und 4d). Andererseits verringerten Mutationen außerhalb des CpG-Motivs die Stimulierung nicht (z.B. Tabelle 1, vergleichen Sie ODN 1 mit 1d; 3D mit 3Dg; 3M mit 3Me). Für die Aktivierung von menschlichen Zellen sind die besten flankierenden Basen leicht unterschiedlich (siehe Tabelle 5).
  • Von denen, die getestet wurden, waren ODNs, die kürzer als 8 Basen waren, nicht stimulierend (z.B. Tabelle 1, ODN 4e). Unter den 48 getesteten ODNs mit 8 Basen wurde eine hochstimulierende Sequenz als TCAACGTT (ODN 4) identifiziert, die das selbstkomplementäre „Palindrom" AAACGTT enthält. Bei der weiteren Optimierung dieses Motives wurde herausgefunden, dass ODNs mit Gs an beiden Enden eine erhöhte Stimulierung zeigten, insbesondere wenn das ODN durch Phosphothioat-Modifikationen der terminalen Internukleotidbindungen Nuklease-resistent gemacht wurde. ODN 1585 (5' GGGGTCAACGTTCAGGGGGG 3' (SEQ ID NO: 12)), bei dem die ersten zwei und letzten fünf Internukleotidbindungen Phosphothioat-modifiziert sind, bewirkte durchschnittlich eine 25,4-fache Zunahme der Maus-Milzzellenproliferation. Im Vergleich dazu bewirkte ODN 1638, das, abgesehen davon, dass die 10 Gs an den beiden Enden durch 10 As ersetzt sind, dieselbe Sequenz wie ODN 1585 hat, eine durchschnittliche 3,2-fache Zunahme der Proliferation. Die Wirkung der G-reichen Enden ist cis; die Zugabe eines ODN mit poly-G-Enden ohne CpG-Motiv zu Zellen zusammen mit 1638 ergab keine erhöhte Proliferation. Für Nukleinsäuremolekülen mit einer Länge von mehr als 8 Basenpaaren wurde herausgefunden, dass nicht-palindromische Motive, die ein unmethyliertes CpG enthielten, immunstimulierender wirken.
  • Andere Oktamer-ODN, die ein 6-Basen-Palindrom mit einem TpC-Dinukleotid am 5'-Ende enthalten, waren ebenfalls aktiv (z.B. Tabelle 1, ODN 4b, 4c). Andere Dinukleotide am 5'-Ende ergaben eine verringerte Stimulierung (z.B. ODN 4f; alle sechzehn möglichen Dinukleotide wurden getestet). Die Anwesenheit eines 3'-Dinukleotids reichte nicht aus, um das Fehlen eines 5'-Dinukleotids auszugleichen (z.B. Tabelle 1, ODN 4g). Die Zerstörung des Palindroms beendete die Stimulierung bei Oktamer-ODNs (z.B. Tabelle 1, ODN 4h), aber bei längeren ODNs waren Palindrome nicht notwendig. Tabelle 1: Stimulierung von Maus-B-Zellen durch Oligonukleotide
    Figure 00270001
    • 'Stimulierungsindizes sind die Mittelwerte und Standardabweichungen abgeleitet aus mindestens 3 unabhängigen Experimenten und werden mit Näpfen verglichen, die ohne zugegebene ODNs kultiviert sind.
    • ND = nicht ausgeführt.
    • CpG-Dinukleotide sind unterstrichen.
    • Punkte stehen für Identität; Striche stehen für Deletionen.
    • Z steht für 5 Methylcytosin.
    Tabelle 2. Identifizierung des optimalen CpG-Motivs für die murine IL-6-Produktion und B-Zellen-Aktivierung
    Figure 00280001
    • Punkte stehen für Identität; CpG-Dinukleotide sind unterstrichen; ND = nicht ausgeführt
    • a Das Experiment wurde mindestens dreimal mit ähnlichen Ergebnissen ausgeführt. Die Konzentration von IL-6 in unstimulierten Kontrollkulturen von sowohl CH12.LX als auch Milz-B-Zellen betrug ≤ 10 pg/ml. Die IgM-Konzentration in unstimulierten Kulturen betrug 547 ± 82 ng/ml. CpG-Dinukleotide sind unterstrichen, und Punkte stehen für Identität.
    • b [3H]-Uridinaufnahme wurde als vielfache Erhöhung (SI: Stimulierungsindex) gegenüber der unstimulierten Kontrolle (2322,67 ± 213,68 cpm) angegeben. Die Zellen wurden durch Zugabe von 20 μM verschiedener CpG O-ODN stimuliert. Die angegebenen Werte sind die Mittelwerte ± Standardabweichung dreifacher Messungen.
    • c Durch ELISA bestimmt.
  • Die Kinetiken der Lymphozyten-Aktivierung wurden unter Verwendung von Maus-Milzzellen untersucht. Wenn die Zellen gleichzeitig mit der ODN-Zugabe gepulst und nur vier Stunden später geerntet wurden, gab es schon einen zweifachen Anstieg des 3H-Uridineinbaus. Die Stimulierung erreichte ihren Höhepunkt zwischen 12–48 Std. und ließ dann nach. Nach 24 Stunden wurden keine intakten ODNs nachgewiesen, was vielleicht das folgende Nachlassen der Stimulierung erklärt. Wenn gereinigte B-Zellen mit oder ohne anti-IgM (submitogene Dosis) zusammen mit CpG-ODNs inkubiert wurden, stellte man fest, dass die Proliferation durch die Kombination der beiden Mitogene nach 48 Std. ungefähr 10-fach synergistisch erhöht war. Die Größenordnung der Stimulierung war konzentrationsabhängig und übertraf in konsistenter Weise die von LPS unter für beide optimalen Bedingungen. Oligonukleotide, die ein Nuklease-resistentes Phosphothioat-Rückgrat enthielten, waren ungefähr 200-fach wirksamer als unmodifizierte Oligonukleotide.
  • Der Anteil an durch CpG-ODN aktivierten B-Zellen wurde mit Hilfe der Zellzyklus-Analyse ermittelt. CpG-ODN induzierten den Zyklus bei mehr als 95% der B-Zellen. Durch Flusszytometrie nach CD23– (marginale Zone) und CD23+ (follikuläre) Subpopulationen sortierte Milz-B-Lymphozyten reagierten gleichermaßen auf die ODN-induzierte Stimulierung, genauso wie ruhende und aktivierte Populationen von B-Zellen, die durch Fraktionierung über Percoll-Gradienten isoliert wurden. Diese Arbeiten zeigen, dass CpG-ODN im Wesentlichen alle B-Zellen dazu veranlaßt, in den Zellzyklus einzutreten.
  • Immunstimulierende Nukleinsäuremoleküle blockieren die Apoptose von murinen B-Zellen
  • Als Reaktion auf die Vernetzung ihrer Antigenrezeptoren durch Anti-IgM wird bei bestimmten B-Zell-Linien wie WEHI-231 Wachstumsstop und/oder Apoptose ausgelöst (Jakway, J.P. et al., „Growth regulation of the B lymphoma cell line WEHI-231 by antiimmunoglobulin, lipopolysaccharide and other bacterial products" J. Immunol. 137:2225 (1986); Tsubata, T., J. Wu und T. Honjo: B-cell apoptosis induced by antigen receptor crosslinking is blocked by a T-cell signal through CD40." Nature 364:645 (1993)). Vor diesem Wachstumsstop werden WEHI-231-Zellen durch bestimmte Stimuli wie LPS und durch den CD40-Liganden gerettet. Es wurde festgestellt, dass auch das CpG-Motiv enthaltende ODNs WEHI-231 vor dem anti-IgM-induzierten Wachstumsstop retten konnten, was zeigt, dass keine zusätzlichen Zellpopulationen für diese Wirkung benötigt werden. Nachfolgende Arbeiten zeigen, dass CpG-ODN Bcl-x- und myc-Expression induzieren, was den Schutz vor Apoptose erklären könnte. Es wurde auch herausgefunden, dass CpG-Nukleinsäuren Apoptose in menschlichen Zellen blockieren können. Diese Inhibition der Apoptose ist wichtig, da sie die Immunaktivierung durch CpG-DNA verstärken und verlängern sollte.
  • Identifizierung des für die Induktion der murinen IL-6- und IgM-Sekretion und B-Zell-Proliferation optimalen CpG-Motivs
  • Um zu evaluieren, ob das für die B-Zellen stimulierende optimale CpG-Motiv identisch mit dem für die IL-6-Sekretion optimalen CpG-Motiv ist, wurde eine Reihe von ODNs untersucht, bei denen die Basen, die das CpG-Dinukleotid flankieren, zunehmend substituiert waren. Diese Reihe von ODNs wurde hinsichtlich ihrer Wirkung auf B-Zell-Proliferation, Ig-Produktion und IL-6-Sekretion, sowohl unter Verwendung von Milz-B-Zellen als auch CH12.LX-Zellen untersucht. Wie in Tabelle 2 gezeigt, enthält das optimale stimulierende Motiv ein unmethyliertes CpG, das von zwei 5'-Purinen und zwei 3'-Pyrimidinen flankiert ist. Im Allgemeinen reduziert eine Mutation entweder des 5'-Purins zu einem Pyrimidin oder des 3'-Pyrimidins zu einem Purin seine Wirkungen erheblich. Änderungen der 5'-Purine zu C waren besonders schädlich, aber Änderungen der 5'-Purine zu T oder 3'-Pyrimidine zu Purinen hatten eine weniger ausgeprägte Wirkung. Ausgehend von der Analyse von diesen und Werten von anderen ODNs wurde bestimmt, dass das optimale CpG-Motiv für die Induktion der IL-6-Sekretion TGACGTT ist, was identisch mit dem optimalen mitogenen und IgM-induzierenden CpG-Motiv ist (Tabelle 2). Dieses Motiv war stimulierender als alle anderen palindromhaltigen Sequenzen, die untersucht wurden (1639, 1707 und 1708).
  • Induktion der murinen Cytokin-Sekretion durch CpG-Motive in bakterieller DNA oder Oligonukleotiden
  • Wie in Beispiel 9 beschrieben, wurde die Menge an IL-6, die nach CpG-DNA-Stimulierung durch Milzzellen sekretiert wurde, mit Hilfe eines ELISA-Tests bestimmt. Milzzellkulturen mit vermindertem T-Zell-Gehalt wurden statt Ganzmilzzellen für die in vitro-Studien verwendet, nachdem vorausgehende Studien gezeigt hatten, dass T-Zellen wenig oder gar nichts zu dem IL-6 beitragen, das von CpG-DNA-stimulierten Milzzellen produziert wird. Wie in Tabelle 3 gezeigt, war die IL-6-Produktion in Zellen, die mit E. coli-DNA inkubiert wurden, aber nicht in Zellen, die mit Kalbsthymus-DNA kultiviert wurden, deutlich erhöht. Um zu bestätigen, dass die mit E. coli-DNA beobachtete erhöhte IL-6-Produktion nicht durch die Verunreinigung mit anderen bakteriellen Produkten verursacht wurde, wurde die DNA vor der Analyse mit DNAse verdaut. Die DNAse-Vorbehandlung hob die durch E. coli-DNA induzierte IL-6-Produktion auf (Tabelle 3). Zusätzlich produzierten Milzzellen von LPS-nichtreaktiven C3H/HeJ-Mäusen als Reaktion auf bakterielle DNA ähnliche IL-6-Konzentrationen. Um herauszufinden, ob die IL-6-Sekretion, die durch E. coli-DNA induziert wurde, durch die unmethylierten CpG-Dinukleotide in bakterieller DNA vermittelt wurde, wurde methylierte E. coli-DNA und eine Reihe von synthetischen ODN überprüft. Tabelle 3 zeigt, dass CpG-ODN die IL-6-Sekretion erheblich induzieren (ODN 5a, 5b, 5c), wohingegen CpG-methylierte E. coli-DNA oder ODN mit methylierten CpG (ODN 5 f) oder ohne CpG (ODN 5d) dies nicht taten. Änderungen an anderen Stellen als den CpG-Dinukleotiden (ODN 5b) oder die Methylierung von anderen Cytosinen (ODN 5g) verringerten die Wirkung von CpG-ODN nicht. Die Methylierung von einem einzigen CpG in einem ODN mit drei CpGs führte zu einer teilweisen Reduzierung der Stimulierung (vergleiche ODN 5c mit 5e; Tabelle 3). Tabelle 3. Induktion der murinen IL-6-Sekretion durch CpG-Motive in bakterieller DNA oder Oligonukleotiden
    Figure 00320001
    • Milzzellen mit vermindertem T-Zell-Gehalt von DBA/2-Mäusen wurden mit Phosphodiestermodifizierten Oligonukleotiden (O-ODN) (20 μM), Kalbsthymus-DNA (50 μg/ml) oder E. coli-DNA (50 μg/ml), mit oder ohne Enzymbehandlung, oder LPS (10 μg/ml) 24 Std. lang stimuliert. Die Werte zeigen den Mittelwert von Dreifachmessungen (pg/ml) ± Standardabweichung. CpG-Dinukleotide sind unterstrichen und Punkte zeigen Identität an. Z steht für 5-Methylcytosin.
  • CpG-Motive können als ein künstliches Adjuvans benutzt werden.
  • Nicht-spezifische Stimulatoren der Immunantwort nennt man Adjuvantien. Die Benutzung von Adjuvantien ist wesentlich, um eine starke Antikörper-Reaktion auf lösliche Antigene auszulösen (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory manual, Cold Spring harbor, N.Y. Current Edition). Die Gesamtwirkung von Adjuvantien ist dramatisch und ihre Wichtigkeit kann nicht überschätzt werden. Die Wirkung eines Adjuvans erlaubt die Benutzung viel geringerer Dosen von Antigen und ruft eine länger andauernde Antikörperreaktion hervor. Die nicht spezifische Aktivierung der Immunantwort entscheidet häufig über den Erfolg bei der Hervorrufung einer Immunantwort. Adjuvantien sollten für die ersten Injektionen verwendet werden, wenn es nicht einen sehr spezifischen Grund gibt, dies zu vermeiden. Die meisten Adjuvantien beinhalten zwei Bestandteile. Ein Bestandteil wurde entwickelt, um das Antigen vor dem schnellen Abbau zu schützen (z.B. Liposomen oder synthetische oberflächenaktive Stoffe (Hunter et al. 1981)). Liposomen sind nur dann wirksam, wenn das Immunogen in die äußere Lipidschicht eingebaut ist; eingeschlossene Moleküle werden vom Immunsystem nicht erkannt. Der andere Bestandteil ist eine Substanz, die die Immunantwort nicht-spezifisch stimulieren wird. Diese Substanzen wirken dadurch, dass sie die Konzentration an Lymphokinen erhöhen. Lymphokine stimulieren die Aktivität der Antigenverarbeitenden Zellen direkt und verursachen eine lokale Entzündungsreaktion an der Injektionsstelle. Bei den frühen Arbeiten verließ man sich ausschließlich auf durch Hitze getötete Bakterien (Dienes 1936) oder Lipopolysaccharide (LPS) (Johnson et al. 1956). LPS ist ziemlich toxisch und durch die Analyse seiner Strukturkomponenten konnte man zeigen, dass die meisten seiner Adjuvans-relevanten Eigenschaften in einem Teil liegen, den man Lipid A nennt. Lipid A ist in einer Reihe von synthetischen und natürlichen Formen verfügbar, die sehr viel weniger toxisch als LPS sind, behält aber dennoch die meisten der wichtigen Adjuvans-relevanten Eigenschaften des Eltern-LPS-Moleküls bei. Lipid A-Komponenten werden häufig unter Verwendung von Liposomen abgegeben.
  • Kürzlich führte eine starke Bewegung, wirkungsvolle Adjuvantien mit annehmbareren Nebenwirkungen zu finden, zur Produktion neuer synthetischer Adjuvantien. Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines Oligonukleotids mit der Sequenz 1826 TCCATGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID NO: 10) bereit, das ein Adjuvans mit CpG enthaltenden Nukleinsäuren ist. Die Sequenz ist eine stark immunaktivierende Sequenz und ein hervorragendes Adjuvans, dessen Wirksamkeit der von vollständigen Freund'schem Adjuvans vergleichbar oder ihr überlegen ist, aber keine offenkundige Toxizität aufweist.
  • Titration der Induktion der murinen ILO-6-Sekretion durch CpG-Motive
  • Bakterielle DNA und CpG-ODN induzierten die IL-6-Produktion in murinen Milzzellen mit vermindertem T-Zell-Gehalt in einer dosisabhängigen Weise, aber Wirbeltier-DNA und Nicht-CpG-ODN taten dies nicht (1). Bei ungefähr 50 μg/ml bakterieller DNA oder 40 μM CpG O-ODN erreichte die IL-6-Produktion ein Plateau. Die höchsten durch bakterielle DNA bzw. CpG-ODN induzierten Konzentrationen an IL-6 waren 1–1,5 ng/ml bzw. 2–4 ng/ml. Diese Konzentrationen waren erheblich höher als die, die nach der Stimulierung durch LPS (0,35 ng/ml) beobachtet werden konnten (1A). Um zu evaluieren, ob CpG-ODN mit einem Nuklease-resistenten DNA-Rückgrat ebenfalls die IL-6-Produktion induzieren würde, wurden S-ODN zu murinen Milzzellen mit vermindertem 7-Zell-Gehalt gegeben. CpG-S-ODN induziernen die IL-6-Produktion ebenfalls in einer dosisabhängigen Weise auf ungefähr das gleiche Niveau wie CpG-O-ODN, während Nicht-CpG-S-ODN IL-6 nicht induzierte (1C). Eine Konzentration von 0,05 μM CpG-S-ODN konnte die Maximalproduktion an IL-6 in diesen Zellen induzieren. Dieses Ergebnis zeigt, dass bei der Nuklease-resistenten DNA-Rückgrat-Modifikation die sequenzspezifische Fähigkeit von CpG-DNA, die IL-6-Sekretion zu induzieren, beibehalten wird, und dass CpG-S-ODN in diesem Testsystem mehr als 80-fach wirksamer sind als CpG-O-ODN.
  • Induktion der murinen IL-6-Sekretion durch CpG-DNA in vivo.
  • Um die Fähigkeit von bakterieller DNA und CpG-S-ODN, die IL-6-Sekretion in vivo zu induzieren, zu evaluieren, wurden BALB/c-Mäusen intravenös 100 μg E. coli-DNA, Kalbsthymus-DNA oder CpG oder nicht stimulierende S-ODN gespritzt, und 2 Std. nach der Stimulierung ihnen Blut abgenommen. Die Konzentration an IL-6 in den Seren der Gruppe, die E. coli-DNA injiziert bekommen hatte, betrug ungefähr 13 ng/ml, während kein IL-6 in den Seren der Gruppen nachgewiesen wurde, die Kalbsthymus-DNA oder PBS injiziert bekommen hatten (Tabelle 4). CpG-S-ODN induzierte die IL-6-Sekretion in vivo ebenfalls. Die IL-6-Konzentration in den Seren der Gruppen, denen CpG-S-ODN injiziert wurden waren, betrug ungefähr 20 ng/ml. Dagegen wurde IL-6 in den Seren der Gruppe mit nicht stimulierenden S-ODN nicht nachgewiesen (Tabelle 4). Tabelle 4. Durch CpG-DNA stimulierte Sekretion von murinem IL-6 in vivo.
    Figure 00340001
    • Mäuse (2 Mäuse/Gruppe) erhielten eine intravenöse Injektion von 100 μl PBS, 200 μg E. coli-DNA oder Kalbsthymus-DNA oder 500 μg CpG-S-ODN oder Nicht-CpG-Kontroll-S-ODN. Den Mäusen wurde 2 Std. nach der Injektion Blut abgenommen und eine 1:10-Verdünnung von jedem Serum wurde mit IL-6-ELISA analysiert. Die Empfindlichkeitsgrenze des IL-6-ELISA betrug 5 pg/ml. Die Sequenz des CpG-S-ODN lautet 5'GCATGACGTTGAGCT3' (SEQ. ID. No: 48) und die des nicht-stimulierenden S-ODN lautet 5'GCTAGATGTTAGCGT3' (SEQ. ID. No: 49). Beachten Sie, dass zwar ein CpG in Sequenz 48 enthalten ist, dieses aber zu nahe am 3'-Ende ist, um eine Stimulierung zu bewirken, wie hierin erklärt wird. Alle Werte zeigen Mittelwerte von Zweifachmessungen ± Standardabweichung an. Jedes Experiment wurde mindestens zweimal mit ähnlichem Ergebnis durchgeführt.
  • Kinetiken der murinen IL-6-Sekretion nach Stimulierung durch CpG-Motive in vivo.
  • Um die Kinetiken der Induktion der IL-6-Sekretion durch CpG-DNA in vivo zu evaluieren, erhielten BALB/c-Mäuse eine intravenöse Injektion mit CpG oder Kontroll-nicht-CpG-S-ODN. Die Serumkonzentrationen von IL-6 erhöhten sich innerhalb von 1 Std. erheblich und erreichten in der CpG-S-ODN-injizierten Gruppe nach 2 Std. einen Spitzenwert von ungefähr 9 ng/ml. (2). Die Konzentration von IL-6-Protein in den Sera nahm nach 4 Std. schnell ab und ging auf den Grundspiegel 12 Std. nach der Stimulierung zurück. Im Gegensatz zu den Gruppen; die durch CpG-DNA stimuliert wurden, konnte keine signifikante Zunahme an IL-6 in den Seren von den Gruppen festgestellt werden, die nicht-stimulierende S-ODN oder PBS injiziert bekommen hatten (2).
  • Gewebeverteilung und Kinetiken der durch CpG-Motive induzierten IL-6 mRNA-Expression in vivo.
  • Wie in 2 gezeigt, nahm die Konzentration von Serum-IL-6 nach der CpG-DNA-Stimulierung rapide ab. Um den möglichen Gewebeursprung dieses Serum-IL-6 und die Kinetiken der IL-6-Genexpression in vivo nach der CpG-DNA-Stimulierung zu untersuchen, erhielten BALB/c-Mäuse eine intravenöse Injektion mit CpG oder Nicht-CpG-S-ODN, und RNA wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Stimulierung aus Leber, Milz, Thymus und Knochenmark extrahiert. 3A zeigt, dass die Konzentration von IL-6-mRNA in Leber, Milz und Thymus innerhalb von 30 Min. nach der Injektion von CpG-S-ODN zunahm. Die Konzentration an Leber-IL-6-mRNA erreichte ihren Spitzenwert 2 Std. nach der Injektion und nahm schnell ab und kehrte 8 Std. nach der Stimulierung zum Grundniveau zurück (3A). Die Milz-IL-6-mRNA erreichte ihren Höchstwert 2 Std. nach der Stimulierung und nahm dann allmählich ab (3A). Die Thymus-IL-6-mRNA-Konzentration erreichte ihren Spitzenwert 1 Std. nach der Injektion und nahm dann allmählich ab (3A). Im Knochenmark nahm die Konzentration der IL-6-mRNA innerhalb 1 Std. nach der CpG-S-ODN-Injektion erheblich zu, kehrte aber dann zum Grundniveau zurück. Als Reaktion auf CpG-S-ODN zeigten Leber, Milz und Thymus einen stärkeren Anstieg der IL-6-mRNA-Expression als das Knochenmark.
  • Muster der durch CpG-DNA induzierten murinen Cytokin-Expression
  • Innerhalb der ersten sechs Stunden konnte in vivo oder in Ganzmilzzellen kein signifikanter Anstieg des Proteinniveaus der folgenden Interleukine festgestellt werden: IL-2, IL-3, IL-4, IL-5 oder IL-10 (Klinman, D.M. et al, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:2879–2883). Allerdings stieg im Serum von Mäusen, die eine Injektion von CpG-ODN erhielten, die Konzentration von TNF-α innerhalb von 30 Minuten und die Konzentration von IL-6 innerhalb von 2 Stunden erheblich. In den ersten zwei Stunden wurde auch eine erhöhte Expression von IL-12 und Interferon-gamma (IFN-γ)-mRNA in den Milzzellen festgestellt. Tabelle 5. Induktion der menschlichen PBMC-Cytokin-Sekretion durch Cpg-Oligos
    Figure 00370001
    • Punkte zeigen Identität an; CpG-Dinukleotide sind unterstrichen 1bestimmt durch ELISA mit Hilfe von Quantikin-Kits von R&D Systems (pg/ml). Die Zellen wurden in 10 %igem autologen Serum mit den angegebenen Oligodesoxynukleotiden (12 μg/ml) im Fall von TNF-α 4 Std. lang und bei den anderen Cytokinen 24 Std. inkubiert, bevor der Überstand gewonnen und getestet wurde. Die Daten sind angegeben als der Cytokin-Titer oberhalb desjenigen in Näpfen ohne hinzugesetztem Oligodesoxynucleotid.
  • CpG-DNA induziert die Cytokin-Sekretion durch humane PBMC, insbesondere Monozyten
  • Der gleiche Satz von ODN, der benutzt wurde, um die Mäuse-Cytokin-Expression zu untersuchen, wurde verwandt, um zu bestimmen, ob menschliche Zellen durch CpG-Motive ebenfalls induziert werden, Cytokine zu exprimieren (oder zu proliferieren) und um das/die verantwortliche(n) CpG-Motive) zu identifizieren. Der beste Induktor der TNF-α- und IFN-γ-Sekretion war Oligonukleotid 1619 (GTCGTT), dicht gefolgt von einem fast identischen Motiv in Oligonukleotid 1634 (GTCGCT) (Tabelle 5). Die Motive in den Oligodesoxynukleotiden 1637 und 1614 (GCCGGT und GACGGT) führten zu einer starken IL-6-Sekretion mit relativ geringer Induktion anderer Cytokine. Es scheint daher, dass menschliche Lymphozyten wie Mäuse-Lymphozyten, Cytokine differenziell als Reaktion auf CpG-Dinukleotide in Abhängigkeit von den umgebenden Basen sekretieren. Weiterhin unterscheiden sich die Motive, die die Mäusezellen am besten stimulieren, von denen, die bei den menschlichen Zellen am wirksamsten sind. Bestimmte CpG- Oligodesoxynukleotide sind schlechte Aktivatoren menschlicher Zellen (Oligodesoxynukleotide 1707 bzw. 1708, die die Palindrom-bildenden Sequenzen GACGTC bzw. CACGTG enthalten). Tabelle 6. CpG-DNA induziert die Cytokin-Sekretion durch menschliche PBMC
    Figure 00380001
    • 1 Die Konzentration aller Cytokine wurde wie bei der vorherigen Tabelle beschrieben durch ELISA mit Hilfe von Quantikin-Kits von R&D Systems bestimmt. Die Ergebnisse sind repräsentativ bei Verwendung von PBMC von verschiedenen Spendern.
    • 2 Die Zellen wurden 15 Min. lang mit L-Leucyl-L-Leucinmethylester (M-LME) vorbehandelt, um zu bestimmen, ob die Cytokin-Produktion unter diesen Bedingungen von Monozyten (oder von anderen L-LME-empfindlichen Zellen) stammte.
    • 3 EC-DNA wurde mit Hilfe von 2U/μg DNA CpG-Methylase (New England Biolabs) nach der Vorschrift des Herstellers methyliert und die Methylierung durch Verdau mit Hpa-II und Msp-I bestätigt. Als Negativkontrolle wurden Proben mit einbezogen, die die doppelte Höchstmenge an LPS enthielten, die in der höchsten Konzentration von EC-DNA enthalten war, was unter diesen experimentellen Bedingungen keine nachweisbare Cytokin-Produktion auslöste.
    • ND = nicht ausgeführt
  • Die auf die DNA reagierenden Zellen scheinen Monozyten zu sein, da die Cytokin-Sekretion durch Behandlung der Zellen mit L-Leucyl-L-Leucinmethylester (L-LME) aufgehoben wird, das selektiv toxisch auf Monozyten (aber auch auf cytotoxische T-Lymphozyten und NK-Zellen wirkt) wirkt, und die Ig-Sekretion durch B-Zellen nicht beeinträchtigt (Tabelle 6). Die die L-LME-Behandlung überlebenden Zellen hatten nach dem Ausschlusstest mit Trypanblau eine Lebensfähigkeit von >95%, was zeigt, dass das Fehlen einer Cytokin-Antwort bei diesen Zellen nicht einfach ein Zeichen eines unspezifischen Todes aller Zelltypen war. Die Cytokin-Sekretion als Reaktion auf E. coli (EC)-DNA erfordert unmethylierte CpG-Motive, da sie durch die Methylierung von EC-DNA aufgehoben wird (siehe Tabelle 6, neben der untersten Reihe). Eine LPS-Verunreinigung der DNA kann die Ergebnisse nicht erklären, da das Ausmaß der Verunreinigung bei der nativen und der methylierten DNA identisch war und da die Zugabe des Doppelten der Höchstmenge an verunreinigendem LPS keine Wirkung zeigte (nicht gezeigt).
  • Der Verlust der Cytokin-Produktion in den PBMC, die mit L-LME behandelt worden waren, legte nahe, dass möglicherweise Monozyten für die Cytokin-Produktion als Reaktion auf CpG-DNA verantwortlich sein könnten. Um diese Hypothese direkter zu testen, wurden die Wirkungen von CpG-DNA auf hoch gereinigte menschliche Monozyten und Makrophagen getestet. Wie vermutet, aktivierte CpG-DNA die Produktion der Cytokine IL-6, GM-CSF und TNF-α durch menschliche Makrophagen direkt, wohingegen Nicht-CpG-DNA dies nicht tat (Tabelle 7). Tabelle 7. CpG-DNA induziert die Cytokin-Expression in gereinigten menschlichen Makrophagen
    Figure 00400001
  • Biologische Rolle von IL-6 bei der Induktion der murinen IgM-Produktion in Reaktion auf CpG-Motive.
  • Die kinetischen Studien, die oben beschrieben wurden, zeigten, dass die Induktion der IL-6-Sekretion, die innerhalb von 1 Std. nach der CpG-Stimulierung stattfindet, der IgM-Sekretion vorausgeht. Da das optimale CpG-Motiv für die ODN, die die Sekretion von IL-6 induzieren, das gleiche ist wie für IgM (Tabelle 2), wurde überprüft, ob die CpG-Motive die IgM- und IL-6-Produktion unabhängig induzieren oder ob die IgM-Produktion abhängig von einer vorherigen IL-6-Sekretion ist. Die Zugabe von neutralisierenden anti-IL-6-Antikörpern inhibierte die in vitro IgM-Produktion, die durch CpG-ODN vermittelt wurde, in einer dosisabhängigen Weise, aber ein Kontroll-Antikörper hatte diese Wirkung nicht (4A). Dagegen hatte die Zugabe von anti-IL-6 keinen Einfluss auf den Basistiter oder die CpG-induzierte B-Zell-Proliferation (4B).
  • Erhöhte Transkriptionsaktivität des IL-6-Promotors in Reaktion auf CpG-DNA
  • Die erhöhte Konzentration von IL-6-mRNA und -Protein nach der CpG-DNA-Stimulierung könnte das Ergebnis transkriptioneller oder post-transkriptioneller Regulierung sein. Um zu bestimmen, ob die transkriptionelle Aktivität des IL-6-Promotors in mit CpG-ODN inkubierten B-Zellen hoch-geregelt war, wurde eine murine B-Zelllinie, WEHI-231, die IL-6 in Reaktion auf CpG-DNA produziert, mit einem IL-6-Promotor-CAT-Konstrukt transfiziert (pIL-6/CAT) (Pottratz, S.T. et al., 17B-estradiol) inhibits expression of human interleukin-6-promoter-reporter constructs by a receptor-dependent mechanism. J. Clin. Invest. 93:944). CAT-Tests wurden nach Stimulierung mit verschiedenen Konzentrationen von CpG- oder Nicht-CpG-ODN durchgeführt. Wie 5 zeigt, induziert CpG-ODN eine erhöhte CAT- Aktivität in einer dosisabhängigen Weise, wohingegen Nicht-CpG-ODN keine CAT-Aktivität induzierte. Dies bestätigt, dass CpG die Transkriptionsaktivität des IL-6-Promotors induziert.
  • Abhängigkeit der B-Zell-Aktivierung durch CpG-ODN von der Anzahl der 5'- und 3'-Phosphothioat-Internukleotid-Bindungen.
  • Um zu bestimmen, ob eine teilweise Schwefelmodifikation des ODN-Rückgrates ausreichend ist, um die B-Zell-Aktivierung zu verstärken, wurden die Wirkungen einer Reihe von ODN mit der gleichen Sequenz aber unterschiedlichen Anzahlen von S-Internukleotid-Bindungen an den 5'- und 3'-Enden getestet. Im Rahmen von früheren Arbeiten zum Nuklease-Abbau von ODN wurde bestimmt, dass mindestens zwei Phosphothioat-Bindungen am 5'-Ende der ODN benötigt wurden, um optimalen Schutz des ODN gegen Abbau durch intrazelluläre Exo- und Endo-Nukleasen zu gewährleisten. Daher wurden ausschließliche chimäre ODN mit zwei 5'-Phosphothioat-modifizierten Bindungen und einer variablen Anzahl von 3'-modifizierten Bindungen untersucht.
  • Die Lymphozyten-stimulierenden Wirkungen dieser ODN wurde bei drei Konzentrationen (3,3, 10 und 30 μM) gemessen, indem die Gesamtmenge an RNA-Synthese (durch 3H-Uridin-Einbau) oder DNA-Synthese (durch 3H-Thymidin-Einbau) in behandelten Milzzellkulturen gemessen wurde (Beispiel 10). O-ODN (0/0-Phosphothioat-Modifikationen) mit einem CpG-Motiv verursachten keine Stimulierung von Milzzellen, wenn sie nicht in einer Konzentration von mindestens 10 μM zu den Kulturen gegeben wurden (Beispiel 10). Wenn diese Sequenz jedoch mit zwei S-Verknüpfungen am 5'-Ende und mindestens drei S-Verknüpfungen am 3'-Ende modifiziert waren, wurde eine erhebliche Stimulierung bei einer Dosis von 3,3 μM beobachtet. Bei dieser geringen Dosis nahm die Stimulierung fortschreitend zu, wenn die Anzahl der 3'-modifizierten Basen erhöht wurde, bis diese den Wert sechs erreichte oder übertraf, wobei an diesem Punkt der Stimulierungsindex zu sinken begann. Im Allgemeinen betrug die optimale Anzahl der 3'-S-Verknüpfungen bei der Milzzellen-Stimulierung fünf. Bei allen drei Konzentrationen, die bei diesen Experimenten untersucht wurden, war das S-ODN weniger stimulierend als die optimalen chimären Verbindungen.
  • Abhängigkeit der CpG-vermittelten Lymphozyten Aktivierung von der Art der Rückgrat-Modifikation.
  • Phosphothioat-modifizierte ODN (S-ODN) sind bei weitem Nuklease-resistenter als Phosphodiester-modifizierte ODN (O-ODN). Daher könnte die im Vergleich zu O-ODN erhöhte Immunstimulierung durch S-ODN und S-O-ODN (d. h. chimäre Phosphothioat-ODN, bei denen die zentralen Verknüpfungen Phosphodiester sind, die aber zwei 5'- und fünf 3'-Verknüpfungen Phosphothioat-modifiziert sind) das Ergebnis der Nukleaseresistenz der ersten beiden sein. Um die Rolle der ODN-Nukleaseresistenz bei der Immunstimulierung durch CpG-ODN zu bestimmen, wurden die stimulierenden Wirkungen von chimären ODN getestet, bei denen die 5'- und 3'-Enden durch entweder Methylphosphonat (MP-), Methylphosphothioat (MPS-)-, Phosphothioat (S-)- oder Phosphodithioat (S2-)-Internukleotid-Verknüpfungen nukleaseresistent gemacht wurden (Beispiel 10). Diese Arbeiten zeigten, dass MP-O-ODN trotz ihrer Nukleaseresistenz tatsächlich weniger immunstimulierend als O-ODNs waren. Wurden jedoch die MP- und S-Modifikationen zusammengebracht, indem beide nicht -verbindenden O-Moleküle durch 5'- und 3'-MPS-Internukleotid- Verknüpfungen ersetzt wurden, dann wurde die Immunstimulierung wiederhergestellt und erreichte ein etwas höheres Niveau als das, das durch O-ODN ausgelöst wurde.
  • Zumindest bei Konzentrationen von 3,3 μM waren S-O-ODN bei weitem mehr stimulierend als O-ODN und sogar noch stimulierender als S-ODN. Bei Konzentrationen unter 3 μM war das S-ODN mit der 3M-Sequenz wirksamer als das entsprechende S-O-ODN, wohingegen das S-ODN mit der 3D-Sequenz weniger wirksam war als das entsprechende S-O-ODN (Beispiel 10). Beim Vergleich der stimulierenden CpG-Motive der beiden Sequenzen wurde festgestellt, dass die 3D-Sequenz genau dem stimulierenden Motiv entspricht, bei dem das CpG von zwei 5'-Purinen und zwei 3'-Pyrimidinen flankiert ist. Jedoch sind die Basen, die das CpG in ODN 3D unmittelbar flankieren, nicht optimal; es weist ein 5'-Pyrimidin und ein 3'-Purin auf. Bei weiteren Tests wurde herausgefunden, dass die Sequenzbedingung für die Immunstimulierung bei S-ODN zwingender ist als für S-O- oder O-ODN. S-ODN, die kaum mit dem optimalen CpG-Motiv übereinstimmen, verursachen wenig oder keine Lymphozyten-Aktivierung (z.B. Sequenz 3D). Jedoch sind S-ODN, die gut mit dem Motiv übereinstimmen, insbesondere an den Stellen, die das CpG unmittelbar flankieren, wirksamer als die entsprechenden S-O-ODN (z.B. Sequenz 3M, Sequenzen 4 und 6), wenngleich bei höheren Konzentrationen (höher als 3 μM) die Spitzenwirkung von S-O-ODN höher ist (Beispiel 10).
  • S2-O-ODN waren bemerkenswert stimulierend und verursachten bei jeder getesteten Konzentration eine erheblich größere Lymphozyten-Aktivierung als die entsprechenden S-ODN oder S-O-ODN.
  • Die erhöhte B-Zell-Stimulierung, die mit S- oder S2-Substitutionen tragenden CpG-ODN beobachtet wurde, könnte das Ergebnis von jedem oder allen der folgenden Effekte sein: Nukleaseresistenz, erhöhte zelluläre Aufnahme, zunehmende Bindung an Proteine und veränderte intrazelluläre Lokalisation. Jedoch kann Nukleaseresistenz nicht die einzige Erklärung sein, da die MP-O-ODN tatsächlich weniger stimulierend als die O-ODN mit CpG-Motiven waren. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die Aufnahme von ODN durch Lymphozyten erheblich durch die Rückgrat-Chemie beeinflusst wird (Zhao et al., (1993) Comparison of cellular binding and uptake of antisense phosphodiester, phosphothioate, and mixed phosphothioate and methylphosphonate oligonucleotides. (Antisense Research and Development 3, 53–66; Zhao et al., (1994) Stage specific oligonucleotide uptake in murine bone marrow B cell precursors. Blood 84, 3660–3666). Die höchste Bindung an Zellmembranen und die höchste Aufnahme wurden mit S-ODN beobachtet, gefolgt von S-O-ODN, O-ODN und MP-ODN. Diese unterschiedliche Aufnahme korreliert gut mit dem Ausmaß der Immunstimulierung.
  • Unmethylierte CpG-enthaltende Oligos weisen NK-Zellen-stimulierende Aktivität auf
  • Es wurden Experimente durchgeführt, um zu bestimmen, ob Oligonukleotide, die CpG enthalten, zusätzlich zu B-Zellen die Aktivität von natürlichen Killerzellen (NK) stimulieren. Wie Tabelle 8 zeigt, wurde eine deutliche Induktion der NK-Aktivität bei Milzzellen, die mit CpG-ODN 1 und 3Dd inkubiert wurden, beobachtet. Im Gegensatz dazu gab es im Vergleich keine Induktion bei Effektoren, die mit Nicht-CpG-Kontroll-ODN behandelt worden waren. Tabelle B. Induktion von NK-Aktivität durch CpG-Oligodesoxynukleotide (ODN)
    Figure 00440001
  • Induktion der NK-Aktivität durch DNA mit CpG-Motiven, aber nicht durch Nicht-CpG-DNA.
  • Bakterielle DNA, die 18 Std. bei 37 °C inkubiert worden war und dann auf ihre abtötende Aktivität auf K562 (Mensch)- oder Yac-1 (Maus)-Zielzellen getestet wurde, induzierte NK-lytische Aktivität sowohl in Mausmilzzellen mit vermindertem B-Zell-Gehalt als auch bei menschlichen PBMC, aber Wirbeltier-DNA hatte diese Wirkung nicht (Tabelle 9). Um zu bestimmen, ob die stimulierende Aktivität bakterieller DNA möglicherweise eine Folge ihres erhöhten Gehaltes an unmethylierten CpG-Dinukleotiden ist, wurden die aktivierenden Eigenschaften von mehr als 50 synthetischen ODN, die unmethylierte, methylierte oder gar keine CpG-Dinukleotide enthalten, getestet. Die in Tabelle 9 zusammengefassten Ergebnisse zeigen, dass synthetische ODN eine erhebliche NK-Aktivität stimulieren können, solange sie mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid enthalten. Zwischen den stimulierenden Wirkungen von ODN, in denen sich das CpG innerhalb von einem Palindrom befindet (wie ODN 1585, das das Palindrom AACGTT enthält), und den ODN ohne Palindrome (wie 1613 oder 1619), konnte unter dem Vorbehalt, dass die optimale Stimulierung im Allgemeinen mit ODN beobachtet wurde, bei denen das CpG von zwei 5'-Purinen oder einem 5'-GpT-Dinukleotid und zwei 3'-Pyrimidinen flankiert wurde, kein Unterschied festgestellt werden. Kinetische Experimente zeigten, dass die NK-Aktivität ihren Spitzenwert ungefähr 18 Std. nach der Zugabe der ODN erreichte. Diese Ergebnisse zeigen, dass die murine NK-Reaktion von der vorherigen Aktivierung von Monozyten durch CpG-DNA abhängt, was zur Produktion von IL-12, TNF-α und IFN-α/b führt (Beispiel 11). Tabelle 9. Induktion von NK-Aktivität durch DNA, die CpG-Motive enthält, aber nicht durch Nicht-CpG-DNA
    Figure 00450001
    • CpG-Dinukleotide in ODN-Sequenzen sind durch Unterstreichung gekennzeichnet; Z steht für Methylcytosin. Kleingeschriebene Buchstaben stehen für Nuklease-resistente Phosphothioat-modifizierte Internukleotidverknüpfungen, die, je nach den flankierenden Basen, in Titrationsexperimenten mehr als 20 Mal so wirksam wie nicht-modifizierte ODN waren. Bei einigen ODN wurden Poly G-Enden (g) verwendet, da sie die Menge an aufgenommenem ODN erheblich erhöhen.
  • Aus all diesen Studien wurde ein vollständigeres Verständnis der Immunwirkungen von CpG-DNA entwickelt, das in 6 zusammengefasst ist.
  • Die Immunaktivierung durch CpG-Motive kann von den Basen, die das CpG flankieren, und von der Anzahl und vom räumlichen Abstand der innerhalb eines ODN vorhandenen CpGs abhängen. Obwohl ein einzelnes CpG in einem idealen Basenkontext ein sehr starker und nützlicher Immunaktivator sein kann, können überlegene Wirkungen mit ODN festgestellt werden, die mehrere CpGs in geeignetem räumlichen Abstand und mit geeigneten flankierenden Basen enthalten. Das optimale CpG-Motiv für die Aktivierung von murinen B-Zellen ist TGACGTT.
  • Die folgenden Arbeiten wurden durchgeführt, um optimale ODN-Sequenzen für die Stimulierung von humanen Zellen zu identifizieren, indem die Wirkungen von Änderungen der Anzahl, des räumlichen Abstandes und der flankierenden Basen von CpG-Dinukleotiden untersucht wurden.
  • Identifizierung von Phosphothioat-ODN mit optimalen CpG-Motiven für die Aktivierung, von menschlichen NK-Zellen
  • Um einen klinischen Nutzen zu haben, müssen ODN einem Lebewesen in einer Form verabreicht werden, die sie gegen Nuklease-Abbau schützt. Verfahren, um dieses mit Phosphodiester-ODN zu erreichen, sind auf diesem Gebiet wohlbekannt, und umfassen das Einkapseln in Lipide oder Abgabesysteme wie Nanopartikel. Dieser Schutz kann auch durch chemische Substitutionen der DNA wie modifizierte DNA-Rückgrate erreicht werden, die solche umfassen, bei denen die Internukleotid-Verbindungen Nuklease-resistent sind. Manche Modifikationen können zusätzliche wünschenswerte Eigenschaften wie erhöhte zelluläre Aufnahme verleihen. Beispielsweise kann die Phosphodiester-Bindung durch Ersatz eines der nicht-verbrückenden Sauerstoffatome mit einem Schwefel modifiziert sein, was eine Phosphothioat-DNA ergibt. Phosphothioat-ODN weisen eine erhöhte zelluläre Aufnahme (Krieg et al., Antisense Res. Dev. 6:133, 1996.) und verbesserte B-Zell-Stimulierung auf, wenn sie auch ein CpG-Motiv aufweisen. Da die NK-Aktivierung stark mit den in vivo-Adjuvans-Wirkungen korreliert, ist die Identifikation von Phosphothioat-ODN, die humane NK-Zellen aktivieren werden, sehr wichtig.
  • Die Wirkungen von verschiedenen Phosphothioat-ODNs – die CpG-Nukleotide in verschiedenen Basenkontexten enthalten – auf die menschliche NK-Aktivierung (Tabelle 10) wurden untersucht. ODN 1840, das 2 Kopien des TGTCGTT-Motivs enthielt, wies eine erhebliche NK-lytische Aktivität auf (Tabelle 10). Um weiter zusätzliche, für die NK-Aktivierung optimale ODNs zu identifizieren, wurden ungefähr 100 ODN mit verschiedenen Anzahlen und räumlichen Abständen der CpG-Motive getestet, wobei ODN 1982 als Kontrolle diente. Tabelle 11 zeigt die Ergebnisse.
  • Wirksame ODNs begannen mit einem TC oder TG am 5'-Ende, aber diese Bedingung war nicht zwingend. ODNs mit internen CpG-Motiven (z.B. ODN 1840) sind im Allgemeinen weniger wirksamere Stimulatoren als solche, bei denen ein GTCGCT-Motiv unmittelbar dem 5'-TC folgt (z.B. ODN 1967 und 1968). ODN 1968, das ein zweites GTCGTT-Motiv in seiner 3'-Hälfte besitzt, war in Übereinstimmung damit stimulierender als ODN 1967, dem dieses zweite Motiv fehlt. ODN 1967 war jedoch in den Experimenten 1 und 3, aber nicht im Experiment 2 etwas wirksamer als ODN 1968. ODN 2005, das ein drittes GTCGTT-Motiv aufweist, induzierte im Durchschnitt eine leicht höhere NK-Aktivität als 1968. Jedoch war ODN 2006, bei dem der räumliche Abstand zwischen den GTCGTT-Motiven durch das Hinzufügen von zwei Ts zwischen jedem Motiv erhöht wurde, dem ODN 2005 und auch dem ODN 2007 gegenüber überlegen, in dem nur eines der Motive zusätzlich die abstandsbedingenden zwei Ts aufwies. Der minimale akzeptable räumliche Abstand zwischen CpG-Motiven ist ein Nukleotid, solange das ODN zwei Pyrimidine (bevorzugterweise T) am 3'-Ende (z.B. ODN 2015) aufweist. Überraschenderweise konnte man auch durch das Verbinden von zwei GTCGTT-Motiven an ihren Enden mit einem 5'-T ebenfalls einen akzeptabel starken Induktor für NK-Aktivität erzeugen (z.B. ODN 2016). Die Wahl eines Thymins (T) zur Trennung aufeinanderfolgender CpG-Dinukleotide ist nicht absolut, da ODN 2002 trotz der Tatsache, dass Adenin (A) seine CpGs trennte (d. h. CGACGTT), eine nennenswerte NK-Aktivierung induzierte. Es sollte auch festgestellt werden, dass ODNs, die keine CpG (z.B. ODN 1982), lange Abfolgen von CpGs oder CpGs in ungeeigneten Sequenzkontexten (z.B. ODN 2010) enthielten, keine stimulierende Wirkung auf die NK-Aktivierung hatten. Tabelle 10 ODN-Induktion von NK-lytischer Aktivität (LU)
    Figure 00480001
    • 1 Lytische Einheiten (LU) wurden gemessen wie beschrieben (8). Kurz gefasst wurden PBMC von normalen Spendern gesammelt und über Ficoll abzentrifugiert, dann mit oder ohne die angegebenen ODN (die zu einer Konzentration von 6 μg/ml zu den Kulturen hinzugegeben wurden) 24 Std. lang inkubiert. Danach wurde ihre Fähigkeit bestimmt, 51Cr-markierte K562-Zellen zu lysieren. Die gezeigten Ergebnisse sind typisch für solche, die mit mehreren verschiedenen normalen menschlichen Spendern erhalten wurden. 2Dieser Oligomix enthielt eine zufällige Auswahl an allen 4 Basen an jeder Position.
    Tabelle 11. Induktion der NK-LU durch Phosphothioat-CpG-ODN mit guten Motiven
    Figure 00490001
    • 1 PBMC wie im Wesentlichen hierin beschrieben. Die Ergebnisse sind repräsentativ für 6 getrennte Experimente; jedes Experiment steht für einen unterschiedlichen Spender. 2Dies ist die methylierte Version von ODN 1840; Z=5-Methylcytosin, LU sind lytische Einheiten; ND = nicht ausgeführt; CpG-Dinukleotide sind der Anschaulichkeit halber unterstrichen
  • Identifizierung von Phosphothioat-ODN mit optimalen CpG-Motiven für die Aktivierung der Proliferation von menschlichen B-Zellen
  • Die Fähigkeit eines CpG-ODN, die Proliferation von B-Zellen zu induzieren, ist ein gutes Maß für sein Potenzial als Adjuvans. Tatsächlich induzieren ODNs mit starken Adjuvanswirkungen im Allgemeinen auch die B-Zellen-Proliferation. Um zu bestimmen, ob die optimalen CpG-ODN für die Induktion der B-Zellen-Proliferation die gleichen sind wie für die Induktion der NK-Zellen-Aktivität, wurden ähnliche Sätze von ODN (Tabelle 12) getestet. Die konsistenteste Stimulierung trat bei ODN 2006 auf (Tabelle 12). Tabelle 12. Induktion der Proliferation humaner B-Zellen durch Phosphothioat-CpG-ODN
    Figure 00500001
    • 1 Zellen = humane Milzzellen, die nach der Gewinnung mittels Chirurgie bei –70 °C gelagert wurden, oder PBMC, die von normalen Spendern gesammelt wurden und über Ficoll abzentrifugiert wurden. Die Zellen wurden in Microtiter-Platten mit 96 Näpfen mit U-förmigem Boden mit oder ohne die angegebenen ODN inkubiert (die zu den Kulturen zu 6 μml gegeben wurden). N = 12 Experimente. Die Zellen wurden 4–7 Tage inkubiert, erhielten 18 Std. vor der Ernte und der Szintillationszählung einen 1 μCi 3H-Thymidin- Puls. Stimulierungsindex = das Verhältnis der cpm in Näpfen ohne ODN zu den Näpfen, in denen während der Inkubationsdauer mit den angezeigten ODN stimuliert wurde (es gab keine weiteren Zugaben von ODN, nachdem die Kulturen vorbereitet worden waren). ND = nicht ausgeführt
  • Identifizierung von Phosphothioat-ODN, die humane IL-12-Sekretion induzieren
  • Die Fähigkeit eines CpG-ODN, IL-12-Sekretion zu induzieren, ist ein gutes Maß für sein Potential als Adjuvans, besonders im Hinblick auf seine Fähigkeit, eine Th1-Immunantwort zu induzieren, die in hohem Maße von IL-12 abhängt. Daher wurde die Fähigkeit von einer Reihe von Phosphothioat-ODN untersucht, die IL-12-Sekretion von humanen PBMC in vitro zu induzieren (Tabelle 13). Diese Experimente zeigten, dass die meisten CpG-ODN in einigen menschlichen PBMC die IL-12-Sekretion induzieren konnten (z.B. Experiment 1). Jedoch reagierten andere Donoren nur auf einige CpG-ODN (z.B. Experiment 2). ODN 2006 war ein konsistenter Induktor der IL-12-Sekretion bei den meisten Individuen (Tabelle 13). Tabelle 13. Induktion der menschlichen IL-12-Sekretion durch Phosphothioat-CpG-ODN
    Figure 00510001
    • 1 PBMC von normalen Spendern gewonnen und über Ficoll abzentrifugiert, dann bei einer Konzentration von 106 Zellen/Napf in Mikrotiterplatten mit 96 Näpfen mit oder ohne die angegebenen ODN, die zu den Kulturen zu einer Konzentration von 6 μg/ml gegeben wurden, inkubiert. Überstände wurden nach 24 Std. gesammelt und durch ELISA wie im Methodenteil beschrieben auf ihre IL-12-Konzentrationen getestet. Für jedes Experiment wurde eine Standardkurve angefertigt, die für einen unterschiedlichen Spender steht.
  • Identifizierung von B-Zell- und Monocyten/NK Zellen-spezifischen Oligonukleotiden
  • Wie in 6 gezeigt, kann CpG-DNA direkt hoch gereinigte B-Zellen und Monozyten aktivieren. Bei den Mechanismen, durch die CpG-DNA diese Zellarten aktivieren, gibt es viele Ähnlichkeiten. Zum Beispiel benötigen beide die NFκB-Aktivierung, wie weiter unten erklärt wird.
  • Bei weiteren Studien zu verschiedenen Immunwirkungen von CpG-DNA wurde gezeigt, dass es mehr als eine Art von CpG-Motiv gibt. Insbesondere ist Oligo 1668, mit dem besten Maus-B-Zellen-Motiv, ein starker Induktor von sowohl der B-Zellen- als auch der natürlichen Killerzellen (NK)-Aktivierung, wohingegen Oligo 1758 ein schwacher B-Zellen-Aktivator ist, aber dennoch hervorragende NK-Reaktionen induziert (Tabelle 14). Tabelle 14. Verschiedene Cpg-Motive stimulieren in optimaler Weise die murine B-Zellen- und NK-Aktivierung
    Figure 00520001
    • CpG-Dinukleotide sind unterstrichen; Oligonukleotide wurden mit Phosphothioatmodifizierten Rückgraten synthetisiert, um ihre Nukleaseresistenz zu verbessern. 1Gemessen durch H-Thymidin-Einbau nach 48 Std. Inkubation mit Oligodesoxynukleotiden bei einer Konzentration von 200 nM wie in Beispiel 1 beschrieben. 2Gemessen in lytischen Einheiten.
  • Teleologische Basis der immunstimulierenden Nukleinsäuren
  • Wirbeltier-DNA ist in hohem Maße methyliert und CpG-Dinukleotide sind unterrepräsentiert. Das stimulierende CpG-Motiv ist in mikrobieller genomischer DNA jedoch weit verbreitet, aber in Wirbeltier-DNA durchaus selten. Darüber hinaus wurde berichtet, dass bakterielle DNA die Proliferation von B-Zellen und die Immunglobulin (Ig)-Produktion induziert, wohingegen Säugetier-DNA dies nicht tut (Messing, J.P. et al., J. Immunol. 147:1759 (1991)). In Beispiel 3 weiter beschriebene Experimente, bei denen herausgefunden wurde, dass die Methylierung von bakterieller DNA durch CpG-Methylase die mitogene Wirkung aushebt, zeigen, dass der Unterschied im CpG-Status der Grund für die B-Zellen-Stimulierung durch bakterielle DNA ist. Diese Ergebnisse stützen die folgende Schlussfolgerung: dass unmethylierte CpG-Dinukleotide innerhalb der bakteriellen DNA für die stimulierenden Wirkungen der bakteriellen DNA verantwortlich sind.
  • Vom teleologischen Standpunkt scheint es wahrscheinlich, dass die Lymphozyten-Aktivierung durch das CpG-Motiv einen Verteidigungsmechanismus des Immunsystems darstellt, der auf diese Weise bakterielle DNA von Wirts-DNA unterscheiden kann. Wirts-DNA, die üblicherweise in zahlreichen anatomischen Entzündungsregionen und -bereichen aufgrund von Apoptose (Zelltod) vorhanden wäre, würde im Allgemeinen aufgrund von CpG-Unterdrückung und -Methylierung wenig oder keine Lymphozyten-Aktivierung induzieren. Jedoch kann die Anwesenheit von bakterieller DNA, die unmethylierte CpG-Motive enthält, genau in infizierten anatomischen Regionen eine Lymphozyten-Aktivierung bewirken, wo sie nützlich ist. Dieser neue Aktivierungsweg stellt eine schnelle Alternative zur T-Zellenabhängigen Antigen-spezifischen B-Zellen-Aktivierung bereit. Da der CpG-Weg mit der B-Zellen-Aktivierung durch den Antigen-Rezeptor synergistisch wirkt, würden Antigen-Rezeptor-tragende B-Zellen mit Spezifität für bakterielle Antigene ein Aktivierungssignal durch Zellmembran-Ig erhalten und ein zweites Signal durch bakterielle DNA, und würden daher dazu neigen, bevorzugt aktiviert zu werden. Die wechelseitigen Beziehungen dieses Weges mit anderen Wegen, die zur B-Zellen-Aktivierung führen, stellen einen physiologischen Mechanismus bereit, der ein polyklonales Antigen verwendet, um Antigenspezifische Reaktionen zu induzieren.
  • Es ist jedoch wahrscheinlich, dass die 8-Zellen-Aktivierung nicht völlig unspezifisch wäre. B-Zellen, die einen für bakterielle Produkte spezifischen Antigen-Rezeptor tragen, könnten ein Aktivierungssignal durch Zellmembran-Ig und ein zweites von bakterieller DNA erhalten, wodurch sie Antigen-spezifische Immunantworten energischer auslösen könnten. Wie bei anderen Verteidigungsmechanismen des Immunsystems könnte die Reaktion auf bakterielle DNA in einigen Konstellationen unerwünschte Folgen haben. Zum Beispiel würden Autoimmun-Reaktionen auf körpereigene Antigene ebenfalls dazu neigen, bevorzugt durch bakterielle Infektionen ausgelöst zu werden, da Autoantigene ebenfalls ein zweites Aktivierungssignal an durch bakterielle DNA aktivierte autoreaktive B-Zellen liefern könnten. Tatsächlich ist die Induktion der Autoimmunität durch bakterielle Infektion eine übliche klinische Beobachtung. Ein Beispiel ist die Autoimmunerkrankung systemischer Lupus erythematodes, der: i) durch die Produktion von anti-DNA-Antikörpern gekennzeichnet ist; ii) durch Medikamente, die DNA-Methyltransferase inhibieren, induziert wird (Cornacchia, E.J. et al., J. Clin. Invest. 92:38 (1993)); und iii) mit reduzierter DNA-Methylierung verbunden ist (Richardson, B., L. et al., Arth. Rheum 35:647 (1992)), und der wahrscheinlich zumindest teilweise durch die Aktivierung von DNA-spezifischen B-Zellen durch stimulierende Signale, die von CpG-Motiven bereitgestellt werden, genauso wie durch die Bindung von bakterieller DNA an Antigen-Rezeptoren ausgelöst wird.
  • Weiterhin wird Sepsis, die durch hohe Morbidität und Mortalität infolge massiver und nichtspezifischer Aktivierung des Immunsystems gekennzeichnet ist, möglicherweise durch bakterielle DNA und andere, aus sterbenden Bakterien freigesetzte Produkte initiiert, die Konzentrationen erreichen, die ausreichend sind, um viele Lymphozyten direkt zu aktivieren. Weitere Belege für die Rolle von CpG-DNA beim Sepsis-Syndrom sind beschrieben in Cowdery, J., et al., (1996) The Journal of Immunology 156:4570–4575.
  • Anders als Antigene, die B-Zellen durch ihren Oberflächen-Ig-Rezeptor aktivieren, induzieren CpG-ODN keinen messbaren Ca2+-Strom, Veränderungen bei der Protein-Tyrosin-Phosphorylierung oder IP 3-Erzeugung. Flusszytometrie mit FITC-konjugierten ODN mit oder ohne CpG-Motiv wurde wie beschrieben in Zhao, Q. et al., (Antisense Research and Development 3:53–66 (1993)) ausgeführt, und zeigte äquivalente Membranbindung, zelluläre Aufnahme, Ausstrom und intrazelluläre Lokalisation. Dies legt nahe, dass es möglicherweise keine Zellmembranproteine gibt, die spezifisch für CpG-ODN sind. Die Daten lassen vermuten, dass Oligonukleotide mit unmethylierten CpGs die zelluläre Aufnahme für ihre Aktivität benötigen, anstatt durch die Zellmembran zu wirken: ODN, die kovalent an eine feste Teflonschicht gebunden waren, waren nicht-stimulierend, genau so wie biotinylierte ODN, die entweder an Avidin-Kügelchen oder an mit Avidin beschichteten Petrischalen immobilisiert waren. Mit FITC oder Biotin konjugierte CpG-ODN behielt ihre vollen mitogenen Eigenschaften, was die Abwesenheit von sterischer Hinderung anzeigt.
  • Kürzlich erhaltene Daten zeigen an, dass der Transkriptionsfaktor NFκB als direkter oder indirekter Vermittler der CpG-Wirkung beteiligt ist. Zum Beispiel nimmt das Ausmaß der NFκB-Bindeaktivität innerhalb von 15 Minuten nach der Behandlung von B-Zellen oder Monozyten mit CpG-DNA zu (7). Sie wird jedoch nicht durch DNA, die keine CpG-Motive enthält, erhöht. Weiterhin wurde herausgefunden, dass zwei verschiedene Inhibitoren der NFκB-Aktivierung, PDTC und Gliotoxin, die Lymphozytenstimulierung durch CpG-DNA völlig blockieren, wie anhand der B-Zellen-Proliferation oder Monozyten-Cytokin-Sekretion bestimmt wurde, was nahe legt, dass die NFκB-Aktivierung für beide Zelltypen benötigt wird.
  • Es gibt mehrere mögliche Mechanismen, durch die NFκB aktiviert werden kann. Diese umfassen die Aktivierung durch verschiedene Proteinkinasen oder die Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies. Es wurden keine Hinweise auf eine unmittelbar nach CpG-DNA-Behandlung von B-Zellen oder Monozyten induzierte Proteinkinase-Aktivierung gefunden, und Inhibitoren von Proteinkinase A, Proteinkinase C und Protein-Tyrosin-Kinasen hatten keine Wirkungen auf die CpG-induzierte Aktivierung. Allerdings verursachte CpG-DNA eine schnelle Induktion der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies sowohl in B-Zellen als auch Monozyten, wie durch den empfindlichen fluoreszierenden Farbstoff Dihydrorhodamin 123, beschrieben in Royall, J.A., und Ischiropoulos, H. (Archives of Biochemistry and Biophysics 302:348–355 (1993)) nachgewiesen wurde. Darüber hinaus blockieren Inhibitoren der Erzeugung dieser reaktiven Sauerstoffspezies komplett die Induktion von NFκB und die spätere Induktion der Zellproliferation und Cytokin-Sekretion durch CpG-DNA.
  • Rückwärts blickend war die nächste Frage, wie CpG-DNA so schnell zur Erzeugung der reaktiven Sauerstoffspezies führte. Vorherige Arbeiten der Erfinder zeigten, dass Oligonukleotide und Plasmide oder bakterielle DNA von den Zellen in Endosomen aufgenommen werden. Diese Endosomen werden im Inneren der Zelle schnell angesäuert. Um zu bestimmen, ob dieser Ansäuerungsschritt für den Mechanismus, durch den CpG-DNA reaktive Sauerstoffspezies aktiviert, wichtig ist, wurde der Ansäuerungsschritt mit spezifischen Inhibitoren der Endosomansäuerung, die Chloroquin, Monensin und Bafilomycin umfassen und die durch verschiedene Mechanismen wirken, blockiert. 8A zeigt die Ergebnisse einer Flusszytometrie-Studie, bei der murine B-Zellen mit dem Farbstoff Dihydrorhodamin 123 verwendet wurden, um die Konzentrationen reaktiver Sauerstoffspezies zu bestimmen. Die nur Farbstoff enthaltende Probe in Feld A der Figur zeigt, dass der Hintergrund an Zellen, die positiv auf den Farbstoff reagieren, bei 28,6% liegt. Wie erwartet wurde diese Konzentration an reaktiven Sauerstoffspezies auf 80% erheblich erhöht, wenn die Zellen 20 Minuten lang mit PMA und Ionomycin, einer Positivkontrolle, behandelt wurden (Feld B). Die mit dem CpG-Oligo behandelten Zellen zeigten ebenfalls eine Erhöhung der Konzentration reaktiver Sauerstoffspezies, so dass mehr als 50% der Zellen positiv wurden (Feld D). Hingegen zeigten Zellen, die mit einem Oligonukleotid behandelt wurden, das abgesehen davon, dass das CpG vertauscht war, die gleiche Sequenz aufwies, diesen erheblichen Anstieg des Titers reaktiver Sauerstoffspezies nicht (Feld E).
  • In Anwesenheit von Chloroquin sehen die Ergebnisse völlig anders aus (8B). Chloroquin erniedrigt den Hintergrund an reaktiven Sauerstoffspezies in den Zellen leicht, so dass von den unbehandelten Zellen in Feld A nur 4,3% positiv sind. Cloroquin hebt die Induktion reaktiver Sauerstoffspezies in mit CpG-DNA behandelten Zellen völlig auf (Feld B), reduziert aber nicht die Konzentration an reaktiven Sauerstoffspezies in mit PMA und Ionomycin behandelten Zellen (Feld E). Dies zeigt, dass anders als bei PMA plus Ionomycin die Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies nach der Behandlung mit CpG-DNA es erforderlich macht, dass die DNA in den Endosomen einem Ansäuerungsschritt unterzogen wird. Dies ist ein völlig neuartiger Mechanismus der Leukozyten-Aktivierung. Chloroquin, Monensin und Bafilomycin scheinen auch die Aktivierung von NFkB durch CpG-DNA ebenso wie die folgende Proliferation und Induktion der Cytokin-Sekretion zu blockieren.
  • Chronische Immunaktivierung durch Cpg-DNA und Autoimmunerkrankungen
  • Die B-Zellen-Aktivierung durch CpG-DNA wirkt synergistisch mit Signalen durch den B-Zellen-Rezeptor. Daher besteht die Möglichkeit, dass DNA-spezifische B-Zellen möglicherweise durch die durch das gleichzeitige Binden von bakterieller DNA an ihren Antigen-Rezeptor und durch co-stimulierende CpG-vermittelte Signale aktiviert werden. Darüber hinaus induziert CpG-DNA bei B-Zellen Resistenz gegen Apoptose, ein Mechanismus, von dem man glaubt, dass er wichtig für die Verhinderung von Immunantworten gegen körpereigene Antigene wie DNA wichtig ist. Tatsächlich kann die Einwirkung von bDNA die Produktion von anti-DNA-Ab auslösen. Im Hinblick auf diese mögliche Fähigkeit von CpG-DNA, Autoimmunität zu fördern, ist es deshalb wert, festzustellen, dass Patienten mit der Autoimmunkrankheit systemischer Lupus erythematodes hartnäckig erhöhte Titer von im Plasma zirkulierender DNA aufweisen, bei der hypomethylierte CpGs angereichert sind. Diese Erkenntnisse legen eine mögliche Rolle für die chronische Immunaktivierung durch CpG-DNA bei der Lupus-Ätiopathogenese nahe.
  • Eine Klasse von Medikamenten, die bei der Behandlung von Lupus wirken, sind Anti-Malaria-Medikamente wie Chloroquin. Während der therapeutische Mechanismus dieser Medikamente unklar gewesen ist, ist bekannt, dass sie die endosomale Ansäuerung inhibieren. Die Leukozyten-Aktivierung durch CpG-DNA wird nicht durch die Bindung an einen Oberflächenrezeptor der Zelle vermittelt, sondern erfordert die Aufnahme durch die Zelle, was durch adsorptive Endozytose in ein angesäuertes Chloroquin-empfindliches intrazelluläres Kompartiment geschieht. Dies legte die Vermutung nahe, dass die Leukozyten-Aktivierung durch CpG-DNA in Verbindung mit angesäuerten Endosomen erfolgt und sogar pH-abhängig sein könnte. Um diese Annahme zu testen, wurden spezifische Inhibitoren der DNA-Ansäuerung verwendet, um zu bestimmen, ob B-Zellen oder Monozyten auf CpG-DNA reagieren könnten, wenn die endosomale Ansäuerung verhindert war.
  • Das früheste Leukozyten-Aktivierungsereignis, das als Reaktion auf CpG-DNA nachgewiesen wurde, ist die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die in primären Milzzellen und sowohl B- als auch Monozyten-Zelllinien innerhalb von fünf Minuten induziert wird. Inhibitoren der endosomalen Ansäuerung, einschließlich Chloroquin, Bafilomycin A und Monensin, die unterschiedliche Wirkmechanismen aufweisen, blockierten die CpG-induzierte Erzeugung von ROS, hatten aber keine Wirkung auf die ROS-Erzeugung, die durch PMA oder Ligation von CD40 oder IgM vermittelt wurde. Diese Studien zeigen, dass die ROS-Erzeugung ein übliches Ereignis bei der Leukozyten-Aktivierung durch diverse Signalwege ist. Die ROS-Erzeugung ist im Allgemeinen unabhängig von der endosomalen Ansäuerung, die nur für die ROS-Reaktion auf CpG-DNA benötigt wird. Die ROS-Erzeugung als Reaktion auf CpG wird nicht durch den NFκB-Inhibitor Gliotoxin inhibiert, was bestätigt, dass sie gegenüber der NFκB-Aktivierung nicht sekundär ist.
  • Um zu bestimmen, ob die endosomale Ansäuerung durch CpG-DNA auch für ihre anderen immunstimulierenden Wirkungen benötigt wurde, wurden durchgeführt. Sowohl LPS als auch CpG-DNA induzierten eine ähnliche schnelle NFκB-Aktivierung, Erhöhung der Konzentationen proto-onkogener mRNA und Cytokin-Sekretion. Die Aktivierung von NFκB durch DNA war abhängig von CpG-Motiven, da sie nicht durch mit CpG-Methylase behandelte bDNA induziert wurde und auch nicht durch ODN, bei denen Basen vertauscht waren, um die CpGs zu unterbrechen. Supershift-Experimente unter Verwendung von spezifischen Antiköpern zeigten, dass die aktivierten NFκB-Komplexe die p50- und p65-Bestandteile umfasst. Nicht unerwartet, wurde die NFκB-Aktivierung in LPS- oder CpG- behandelten Zellen vom Abbau von IκBα und IκBβ begleitet. Inhibitoren der endosomalen Ansäuerung blockierten jedoch selektiv alle CpG-induzierten, aber keine der LPS-induzierten zellulären Aktivierungsereignisse. Die sehr geringe Konzentration von Chloroquin (<10 μM), von der gezeigt werden konnte, dass sie die CpG-vermittelte Leukozyten-Aktivierung inhibiert, ist bemerkenswert, da sie weit unter der Konzentration liegt, die für die anti-Malaria-Aktivität und andere veröffentlichte Immunwirkungen benötigt wird (z.B. 100–1000 μM). Diese Experimente stützen die Rolle eines pH-abhängigen Signalmechanismus bei der Vermittlung der stimulierenden Wirkungen von CpG-DNA. Tabelle 15. Spezifische Blockade der CpG-induzierten TNF-α- und IL-12-Expression durch Inhibitoren der endosomalen Ansäuerung oder NFκB-Aktivierung
    Figure 00580001
    • Legende von Tabelle 15 IL-12- und TNF-α-Tests: Die murine Monozyten-Zelllinie J774 (1 × 105 Zellen/ml bei IL-12 oder 1 × 106 Zellen/ml bei TNF-α) wurden mit oder ohne die angegebenen Inhibitoren bei den gezeigten Konzentrationen 2 Std. lang inkubiert und dann mit einer Konzentration von 2 μM des CpG-Oligodesoxynukleotids (ODN) 1826 (TCCATGACGTTCCTGACGTT SEQ ID NO: 10) oder durch LPS (10 μg/ml) für 4 Std. (TNF-α) oder 24 Std. (IL-12) stimuliert und nach dieser Zeit der Überstand geerntet. ELISA zur Bestimmung von IL-12 oder TNF-α (pg/ml) wurden mit den Überständen durchgeführt wie im Wesentlichen beschrieben (A. K. Krieg, A.-K. Yi, S. Matson, T.J. Waldschmidt, G. A. Bishop, R. Teasdale, G. Koretzky und D. Klinman, Nature 374, 546 (1995); Yi, A.-K., D. M. Klinman, T. L. Martin, S. Matson und A. M. Krieg, J. Immunol., 157, 5394–5402 (1996); Krieg, A.M., J. Lab. Clin. Med., 128, 128–133 (1996). Die Zellen, die mit ODNs, denen die CpG-Motive fehlten, inkubiert wurden, zeigten keine induzierte Cytokin-Sekretion. Eine ähnliche spezifische Inhibition der CpG-Reaktionen wurde bei IL-6-Tests festgestellt, und bei Experimenten unter Verwendung von primären Milzzellen oder den B-Zelllinien CH12.LX und WEHI-231. 2,5 μg/ml Chloroquin ist äquivalent <5 μM. Andere Inhibitoren der NFκB-Aktivierung, einschließlich PDTC und die Calpain-Inhibitoren I und II, ergaben ähnliche Ergebnisse wie die gezeigten Inhibitoren. Die gezeigten Ergebnisse sind repräsentativ für die in zehn getrennten Experimenten erhaltenen Ergebnisse.
  • Eine übermäßige Immunaktivierung durch CpG-Motive trägt möglicherweise zur Pathogenese der Autoimmunerkrankung systemischer Lupus erythematodes bei, die mit erhöhten Konzentrationen zirkulierender hypomethylierter CpG-DNA verbunden ist. Chloroquin und verwandte anti-Malaria-Verbindungen sind wirksame therapeutische Agenzien für die Behandlung von systemischem Lupus erythematodes und anderer Autoimmunerkrankungen, obwohl ihr Wirkmechanismus unklar war. Das Aufzeigen der Fähigkeit extrem geringer Chloroquin-Konzentrationen durch uns, die CpG-vermittelte Leukozyten-Aktivierung spezifisch zu inhibieren, legt einen möglichen neuen Mechanismus für seine nützliche Wirkung nahe. Es ist bemerkenswert, dass die Auslösung von wieder auftretendem Lupus häufig mikrobiellen Infektionen zugeschrieben wird. In infizierten Geweben vorhandene bDNA-Konzentrationen können ausreichend sein, um eine lokale Entzündungsreaktion auszulösen. Zusammen mit der wahrscheinlichen Rolle von CpG-DNA als Vermittler des Sepsis-Syndroms und von anderen Krankheiten schlagen unsere Arbeiten neue therapeutische Anwendungen für anti-Malaria-Medikamente vor, die als Inhibitoren der endosomalen Ansäuerung wirken.
  • Die CpG-induzierte ROS-Erzeugung könnte eine zufällige Folge der Zellaktivierung oder von einem Signal sein, das diese Aktivierung vermittelt. Der ROS-Fänger N-Acetyl-L-Cystein (NAC) blockiert die CpG-induzierte NFκB-Aktivierung, die Cytokin-Produktion und die B-Zellen-Proliferation, was eine kausale Rolle für die ROS-Erzeugung in diesen Stoffwechselwegen vorschläge. Diese Ergebnisse passen zu früheren Belegen, die eine Rolle der ROS bei der Aktivierung von NfκB stützen. WEHI-231-B-Zellen (5 × 105 Zellen/ml) wurden 30 Minuten lang mit oder ohne Chloroquin (5 μg/ml [<10 μM]) oder Gliotoxin (0,2 μg/ml) vorinkubiert. Zellaliquots wurden dann wie oben 10 Minuten lang in RPMI-Medium mit oder ohne CpG-ODN (1826) oder Nicht-CpG-ODN (1911) bei einer Konzentration von 1 μM oder Phorbolmyristatacetat (PMA) plus Ionomycin (iono) inkubiert. Die Zellen wurden dann mit Dihydrorhodamin-123 gefärbt und durch Flusszytometrie auf intrazelluläre ROS-Produktion wie beschrieben analysiert (A. K. Krieg, A.-K. Yi, S. Matson, T. J. Waldschmidt, G. A. Bishop, R. Teasdale, G. Koretzky und D. Klinman, Nature 374, 546 (1995); Yi, A.-K., D. M. Klinman, T. L. Martin, S. Matson und A. M. Krieg, J. Immunol., 157, 5394–5402 (1996); Krieg, A. M., J. Lab. Clin. Med., 128, 128–133 (1996)). J774-Zellen, eine monozytische Zelllinie, zeigte ähnliche, pH-abhängige, CpG-induzierte ROS-Reaktionen. Dagegen induzierte CpG-DNA nicht die Erzeugung von extrazellulären ROS oder anderen nachweisbaren Neutrophilen-ROS. Diese Konzentrationen von Chloroquin (und die, die mit anderen Inhibitoren der endosomalen Ansäuerung benutzt wurden) verhinderten die Ansäuerung internalisierter CpG-DNA unter Verwendung von Fluorescein-konjugierten ODN, wie beschrieben von Tonkinson, et al. (Nucl. Acids. Res. 22, 4268 (1994); A. M. Krieg, In: Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics. Herausgeber, S. Akhtar, CRC Press, Inc., S. 177 (1995)). Bei höheren Konzentrationen als denen, die zur Inhibierung der endosomalen Ansäuerung benötigt wurden, wurden nicht -spezifische inhibitorische Wirkungen beobachtet. Jedes Experiment wurde mindestens dreimal mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt.
  • Während NFκB bekanntermaßen ein wichtiger Regulator der Genexpression ist, war seine Rolle bei der transkriptionellen Reaktion auf CpG-DNA unklar. Um zu bestimmen, ob diese NFκB-Aktivierung für die CpG-vermittelte Induktion der Genexpression benötigt wurde, wurden Zellen mit CpG-DNA in Anwesenheit oder Abwesenheit von Pyrrolidindithiocarbamat (PDTC), einem Inhibitor der IκB-Phosphorylierung, aktiviert. Diese Inhibitoren der NFκB-Aktivierung hemmten die durch CpG-induzierte Expression von Protooncogen- und Cytokin-mRNA und Protein vollständig, was die essentielle Rolle von NFκB als Vermittler dieser Ereignisse zeigt. Keiner dieser Inhibitoren reduzierte die Lebensfähigkeit der Zellen unter den in diesen Arbeiten verwendeten experimentellen Bedingungen. A J774, eine murine Monozytenzelllinie, wurde in Anwesenheit von Kalbsthymus (CT)-, E. coli (EC)- oder methylierter E. coli (mEC)-DNA (wie beschrieben4 mit CpG-Methylase methyliert), bei 5 μg/ml, oder einem CpG-Oligodesoxynukleotid (ODN 1826; Tabelle 15) oder einem Nicht-CpG-ODN (ODN 1745; TCCATGAGCTTCCTGAGTCT) bei 0,75 μM 1 Std. lang inkubiert; danach wurden die Zellen lysiert und Kernextrakte zubereitet. Ein doppelsträngiges ODN, das eine Konsens-NFκB-Stelle enthielt, wurde am 5'-Ende radiomarkiert und im Wesentlichen wie beschrieben (J. D. Dignam, R. M. Lebovitz und R. G. Roeder, Nucleic Acids Res. 11, 1475 (1983); M. Briskin, M. Damore, R. Law, G. Lee, P. W. Kincade, C. H. Sibley, M. Kuehl und R. Wall, Mol. Cell. Biol. 10, 422 (1990)) als Sonde für EMSA verwendet. Die Position des p50/p65-Heterodimers wurde durch Supershifting mit den für p65- und p50-spezifischen Antikörpern bestimmt (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Die Chloroquin-Inhibierung der CpG-induzierten, aber nicht der LPS-induzierten NFκB-Aktivierung wurde mit J774-Zellen geklärt. Die Zellen wurden für 2 Std. in Anwesenheit oder Abwesenheit von Chloroquin (20 μg/ml) vorinkubiert und dann 1 Std. lang wie oben entweder mit ED-DNA, CpG-ODN, Nicht-CpG-ODN oder LPS (1 μg/ml) stimuliert. In einer B-Zelllinie, WEHI-231, und primären Milzzellen wurde eine ähnliche Chloroquin-empfindliche CpG-induzierte Aktivierung von NFκB beobachtet. Diese Experimente wurden dreimal mit einer Bandbreite der Chloroquin-Konzentrationen von 2,5 bis 20 μg/ml durchgeführt und ergaben ähnliche Ergebnisse.
  • Es konnte ebenfalls gezeigt werden, dass die CpG-stimulierte mRNA-Expression in B-Zellen und Monozyten die endosomale Ansäuerung und NFκB-Aktivierung benötigt. J774-Zellen (2 × 106 Zellen/ml) wurden 2 Std. lang in Anwesenheit oder Abwesenheit von Chloroquin (2,5 μg/ml [< 5 μM]) oder N-Tosyl-L-Phenylalaninchlormetrylketon (TPCK; 50 μM) inkubiert, einem Serin-/Threonin-Proteaseinhibitor, der die IκB-Proteolyse verhindert und daher die NFκB-Aktivierung blockiert. Die Zellen wurden dann durch die Zugabe von E. coli-DNA (EC; 50 μg/ml), Kalbsthymus-DNA (CT; 50 μg/ml), LPS (10 μg/ml), CpG-ODN (1826; 1 μM), oder Kontroll-nicht-CpG-ODN (1911; 1 μM) 3 Std. lang stimuliert. WEHI-231-B-Zellen (5 × 105 Zellen/ml) wurden in Anwesenheit oder Abwesenheit von Gliotoxin (0,1 μg/ml) oder Bisgliotoxin (0,1 μg/ml) 2 Std. lang inkubiert und mit CpG-ODN (1826) oder Kontroll-nicht-CpG-ODN (1911; TCCAGGACTTTCCTCAGGTT) bei 0,5 μM für 8 h stimuliert. In beiden Fällen wurden die Zellen geerntet und die RNA wurde mit Hilfe von RNAzol nach Anweisung des Herstellerprotokolls dargestellt. Ein mehrere Sonden umfassender RNase Schutztest wurde wie beschrieben durchgeführt (A.-K. Yi, P. Hornbeck, D.E. Lafrenz und A.M. Krieg, J. Immunol, 157, 4918–4925 (1996). Vergleichbare Mengen von RNA wurden unter Verwendung von ribosomaler mRNA als Ladekontrolle (L32) auf jede Spur geladen. Diese Experimente wurden dreimal mit ähnlichen Ergebnissen ausgeführt.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass Leukozyten auf CpG-DNA über einen neuen Signalweg reagieren, der die pH-abhängige Erzeugung von intrazellulären ROS umfasst. Der pH-abhängige Schritt kann der Transport oder die Verarbeitung der CpG-DNA, die ROS-Erzeugung oder ein anderes Ereignis sein. Viele halten ROS für sekundäre Botenstoffe in Signalwegen in diversen Zelltypen, aber es wurde bisher noch nicht gezeigt, dass sie ein stimulierendes Signal in B-Zellen vermitteln.
  • Vermutlich gibt es ein Protein in oder nahe den Endosomen, das spezifisch CpG-Motiveenthaltende DNA erkennt und zur Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies führt. Um jedes Protein im Zellzytoplasma nachzuweisen, das möglicherweise spezifisch an CpG-DNA bindet, wurden electrophoretic mobility shift assays (EMSA) mit 5'-radioaktiv markierten Oligonukleotiden mit oder ohne CpG-Motiven benutzt. Es wurde eine Bande gefunden, die anscheinend ein Protein zeigt, das spezifisch an einzelsträngige Oligonukleotide mit CpG-Motiven bindet, aber nicht an Oligonukleotide, denen CpG-Motive fehlen oder an Oligonukleotide, bei denen das CpG-Motiv methyliert wurde. Diese Bindungsaktivität wird blockiert, wenn ein Überschuss an Oligonukleotiden zugegeben wurde, die die NFkB-Bindungsstelle enthalten. Dies schlägt vor, dass ein NFkB oder ein verwandtes Protein einen Bestandteil des Proteins oder Proteinkomplexes ist, der an die stimulierenden CpG-Oligonukleotide bindet.
  • Zu Zeiten, an denen NFkB stark aktiviert war, wurde keine Aktivierung von CREB/ATF-Proteinen festgestellt. Diese Daten stellen deshalb keinen Beweis dafür dar, dass NFkB-Proteine tatsächlich an die CpG-Nukleinsäuren binden, sondern eher dafür, dass diese Proteine auf irgendeine Weise für die CpG-Aktivität benötigt werden. Es ist möglich, dass ein CREB/ATF oder verwandtes Protein auf irgendeine Weise mit NFkB-Proteinen oder anderen Proteinen wechselwirkt, was die bemerkenswerte Ähnlichkeit der Bindungsmotive für CREB-Proteine und dem optimalen CpG-Motiv erklären könnte. Es besteht weiterhin die Möglichkeit, dass die Oligos an CREB/ATF- oder ein verwandtes Protein binden, und dass dies zur NFkB-Aktivierung führt.
  • Alternativ ist es sehr gut möglich, dass die CpG-Nukleinsäuren an eines der TRAF-Proteine binden, die an die cytoplasmatische Region von CD40 binden und die NFkB-Aktivierung vermitteln, wenn CD40 quervernetzt wird. Beispiele für solche TRAF-Proteine umfassen TRAF-2 und TRAF-5.
  • Verfahren zur Herstellung immunstimulierender Nukleinsäuren
  • Zur Verwendung für die vorliegende Erfindung können Nukleinsäuren de novo unter Verwendung von einer Anzahl von Verfahrensweisen synthetisiert werden, die in der Technik wohlbekannt sind. Zum Beispiel das b-Cyanoethylphosphoramidit-Verfahren (S.L. Beaucage und M.H. Caruthers, (1981) Tet. Let. 22:1859); das Nukleosid-H-Phosphonat-Verfahren (Garegg et al., (1986) Tet. Let. 27:4051–4054; Froehler et al., (1986) Nucl. Acid. Res. 14:5399–5407; Garegg et al., (1986) Tet. Let. 27:4055–4058, Gaffney et al., (1988) Tet. Let. 29:2619–2622). Diese Reaktionen können von einer Vielzahl auf dem Markt erhältlicher automatischer Oligonukleotidsyntheseapparate ausgeführt werden. Alternativ können Oligonukleotide ausgehend von vorhandenen Nukleinsäuresequenzen (z.B. genomischer oder cDNA) mit Hilfe von bekannten Techniken, wie denjenigen, die von Restriktionsenzymen, Exonukleasen oder Endonukleasen Gebrauch machen, hergestellt werden.
  • Zur Benutzung in vivo sollten Nukleinsäuren vorzugsweise relativ resistent gegen Abbau (z.B. durch Endo- und Exo-Nukleasen) sein. Sekundärstrukturen wie Stem loops können Nukleinsäwen gegen Abbau stabilisieren. Alternativ kann eine Nukleinsäure-Stabilisierung durch Phosphat-Rückgrat-Modifikationen erreicht werden. Eine bevorzugte stabilisierte Nukleinsäure hat zumindest ein teilweise Phosphothioat-modifiziertes Rückgrat. Phosphothioate können mit Hilfe von automatischen Techniken synthetisiert werden, die entweder von der Phosphoramidat- oder H-Phosphonat-Chemie Gebrauch machen. Aryl- und Alkyl-Phosphonate können z.B. wie in U.S. Patent Nr. 4,469,863 beschrieben hergestellt werden; und Alkylphosphotriester (bei denen der geladene Sauerstoffteil alkyliert ist, wie in U.S. Patent Nr. 5,023,243 und dem Europäischen Patent Nr. 092,574 beschrieben) können durch automatische Festphasensynthese unter Verwendung kommerziell erhältlicher Reagenzien hergestellt werden. Verfahren zum Ausbilden anderer DNA-Rückgrat-Modifikationen und Substitutionen sind beschrieben worden (Uhlmann, E. und Peyman, A. (1990) Chem. Rev. 90:544; Goodchild, J. (1990) Bioconjugate Chem. 1:165). 2'-O-Methyl-Nukleinsäuren mit CpG-Motiven verursachen ebenfalls eine Immunaktivierung, genauso wie Ethoxy-modifizierte CpG-Nukleinsäuren. Tatsächlich wurde keine Rückgrat-Modifikation gefunden, die die CpG-Wirkung vollständig aufhebt, auch wenn sie erheblich reduziert wird, wenn das C durch ein 5-Methyl-C ersetzt ist.
  • Zur Verabreichung in vivo können Nukleinsäuren mit einem Molekül verbunden sein, das zu einer höheren Bindungsaffinität zu Zielzellen- (z.B. B-Zellen, Monozyten und natürliche Killerzellen (NK))-Oberflächen und/oder erhöhten zellulären Aufnahme durch Zielzellen führt, um einen „Nukleinsäure-Abgabekomplex" auszubilden. Nukleinsäuren können mit geeigneten Molekülen ionisch oder kovalent unter Verwendung von Techniken verbunden werden, die in der Technik gut bekannt sind. Eine Vielzahl von Kopplungs- oder Vernetzungs-Reagenzien, wie z.B. Protein A, Carbodiimid und N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP), können verwendet werden. Alternativ können Nukleinsäuren in Liposomen oder Virosomen unter Verwendung von wohlbekannten Techniken eingekapselt werden.
  • Therapeutische Anwendungen immunstimulierender Nukleinsäuremoleküle
  • Auf der Grundlage ihrer immunstimulierenden Eigenschaften können Nukleinsäuremoleküle mit mindestens einem unmethylierten CpG-Dinukleotid einem Lebewesenin vivo verabreicht werden, um eine „Defizienz des Immunsystems" zu behandeln. Alternativ können Nukleinsäuremoleküle, die mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid enthalten, mit Lymphozyten (z.B. B-Zellen, Monozyten- oder NK-Zellen) von einem Lebewesen mit einer Defizienz des Immunsystems ex vivo in Kontakt gebracht werden, und aktivierte Lymphozyten können anschließend in das Lebewesen erneut implantiert werden.
  • Wie hierin berichtet sekretieren eine erhöhte Anzahl von Milzzellen als Reaktion auf Nukleinsäuremoleküle, die unmethyliertes CpG enthalten, IL-6, IL-12, IFN-y, IFN-α, IFN-β, IL-1, IL-3, IL-10, TNF-α, TNF-β, GM-CSF, RANTES und vermutlich weitere. Es wurde festgestellt, dass die zunehmende IL-6-Expression bei B-Zellen, CD4+-T-Zellen und Monozyten auftrat.
  • Immunstimulierende Oligonukleotide können einem Lebewesen auch in Verbindung mit einer Impfung verabreicht werden, um das Immunsystem des Lebewesens aufzufrischen und auf diese Weise eine bessere Wirkung des Impfserums zu bewirken. Bevorzugterweise wird das immunstimulierende Oligonukleotid kurz vor oder zeitgleich mit dem Impfstoff verabreicht. Ein konventionelles Adjuvans kann optional zusammen mit dem Impfstoff, der mindestens aus einem Antigen besteht, verabreicht werden, da das konventionelle Adjuvans die Impfwirkung durch Verstärkung der Antigen-Absorption weiter verbessern kann.
  • Wenn der Impfstoff ein DNA-Impfstoff ist, bestimmen mindestens zwei Komponenten seine Wirksamkeit. Erstens bestimmt das durch den Impfstoff codierte Antigen die Spezifität der Immunantwort. Zweitens wirkt das Rückgrat des Plasmides als Adjuvans für die Impfung, wenn es CpG-Motive enthält. Demnach wirkt CpG-DNA als ein wirksames „Gefahrensignal" und bewirkt, dass das Immunsystem auf neue Antigene in dem Gebiet energisch reagiert. Diese Wirkungsweise ist vermutlich primär das Ergebnis der stimulierenden lokalen Wirkungen der CpG-DNA auf dendritische Zellen und andere „professionelle" Antigenpräsentierende Zellen, genauso wie das der co-stimulierenden Wirkungen auf B-Zellen.
  • Immunstimulierende Oligonukleotide und Impfstoffe, die unmethylierte CpG enthalten, die Lymphozyten direkt aktivieren und eine Antigen-spezifische Reaktion co-stimulieren, unterscheiden sich grundlegend von herkömmlichen Adjuvantien (z.B. Aluminium-Präzipitaten), die bei der alleinigen Injektion inert sind und von denen man glaubt, dass sie dadurch wirken, dass sie das Antigen absorbieren und es auf diese Weise den Immunzellen wirksamer präsentieren. Weiterhin funktionieren konventionelle Adjuvantien nur bei bestimmten Antigenen, induzieren nur eine Antikörper (humorale)-Immunantwort (Th2), und sind sehr schlechte Induktoren der zellulären Immunantworten (Th1). Bei vielen Pathogenen trägt die humorale Antwort wenig zum Schutz bei und kann sogar schädlich sein.
  • Zusätzlich kann ein immunstimulierendes Oligonukleotid vor, zusammen mit oder nach der Verabreichung einer Chemotherapie oder Immunotherapie zur Erhöhung der Reaktionsfähigkeit der malignen Zellen auf nachfolgende Chemotherapie oder Immunotherapie oder zur Beschleunigung der Erholung des Knochenmarks durch Induktion der stärkenden Cytokine wie GM-CSF verabreicht werden. CpG-Nukleinsäuren erhöhen auch die Zell-lytische Aktivität natürlicher Killerzellen und die Antikörper-abhängige zelluläre Cytotoxizität (ADCC). Die Induktion der NK-Aktivität und ADCC kann alleine oder in Verbindung mit anderen Behandlungen ebenfalls bei einer Krebs-Immunotherapie nützlich sein.
  • Eine andere Anwendung der beschriebenen immunstimulierenden Oligonukleotide ist die Desensibilisierungstherapie gegen Allergien, die im Allgemeinen durch die IgE-Antikörper-Produktion gegen harmlose Allergene verursacht werden. Die durch unmethylierte CpG-Nukleinsäuren induzierten Cytokine gehören vorwiegend zu einer „Th1" genannten Klasse, die am deutlichsten bei einer zellulären Immunantwort ist und die mit IL-12 und IFN-γ zusammenhängt. Die andere wichtige Art der Immunantwort nennt man Th2-Immunantwort, und diese hängt eher mit einer Antikörper-Immunantwort und mit der Produktion von IL-4, IL-5 und IL-10 zusammen. Im Allgemeinen scheinen allergische Krankheiten durch Th2-Typ-Immunantworten vermittelt zu werden und Autoimmunkrankheiten durch Th1-Immunantworten. Aufgrund der Fähigkeit der immunstimulierenden Oligonukleotide, die Immunantwort eines Lebewesens von einer Th2-Antwort (die mit der Produktion von IgE-Antikörpern und Allergien verbunden ist) zu einer Th1-Antwort (die vor allergischen Reaktionen schützt) umzulenken, kann einem Lebewesen zur Behandlung oder Verhinderung einer Allergie eine wirksame Dosis eines immunstimulierenden Oligonukleotids (oder eines Vektors, der eine Nukleinsäure enthält) alleine oder in Verbindung mit einem Allergen verabreicht werden.
  • Nukleinsäuren, die unmethylierte CpG-Motive enthalten, haben möglicherweise auch einen erheblichen therapeutischen Nutzen bei der Behandlung von Asthma. Die Konzentrationen von Th2-Cytokinen, insbesondere IL-4 und IL-5, sind in den Luftwegen von asthmatischen Lebewesen erhöht. Diese Cytokine fördern wichtige Aspekte der asthmatischen Entzündungsreaktion, die den Wechsel von IgE-Isotypen, die Chemotaxis und die Aktivierung von Eosinophilen und das Wachstum von Mastzellen umfassen. Th1-Cytokine, insbesondere IFN-γ und IL-12, können die Bildung von Th2-Klonen und die Produktion von Th2-Cytokinen unterdrücken.
  • Wie im Detail im folgenden Beispiel 12 beschrieben, verhinderten Oligonukleotide, die ein unmethyliertes CpG-Motiv (d. h. TCCATGACGTTCCTGACGTT; SEQ ID NO. 10) enthalten, nicht aber ein Kontroll-Oligonukleotid (TCCATGAGCTTCCTGAGTCT; SEQ ID NO 11), die Entwicklung eines entzündlichen zellulären Infiltrates und Eosinophilie in einem murinen Asthmamodell. Weiterhin war die Unterdrückung der eosinophilen Entzündung mit einer Unterdrückung einer Th2-Antwort und einer Induktion einer Th2-Antwort verbunden.
  • Für die Verwendung zur Behandlung kann eine wirksame Menge eines geeigneten immunstimulierenden Nukleinsäuremoleküls einem Lebewesen alleine oder in Form von einem Abgabekomplex auf jede Weise verabreicht werden, die erlaubt, dass das Oligonukleotid durch die geeignete Zielzelle (z.B. B-Zellen und Monozyten) aufgenommen wird. Bevorzugte Arten der Verabreichung sind orale und transdermale Verabreichung (z.B. über ein Pflaster). Beispiele für andere Arten der Verabreichung umfassen Injektionen (subkutan, intravenös, parenteral, intraperitoneal, intrathecal etc.). Die Injektion kann eine Bolusinjektion oder eine Dauerinfusion sein.
  • Eine Nukleinsäure alleine oder als Nukleinsäure-Abgabekomplex kann zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger verabreicht werden. Wie hierin verwendet, soll die Formulierung „pharmazeutisch akzeptabler Träger" Substanzen umfasst, die zusammen mit einer Nukleinsäure oder einem Nukleinsäure-Abgabekomplex verabreicht werden können und die den Nukleinsäuren erlauben, ihre angegebenen Funktionen zu erfüllen. Beispiele solcher Träger umfassen Lösungen, Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Verzögermittel, Emulsionen u.ä. Die Benutzung solcher Medien für pharmazeutisch aktive Substanzen ist auf diesem Gebiet wohlbekannt. Ein jeglicher anderer herkömmlicher Träger, der für die Verwendung mit den Nukleinsäwen geeignet ist, fällt in den Umfang der vorliegenden Erfindung.
  • Der Begriff „wirksame Menge" eines Nukleinsäuremoleküls bezeichnet die Menge, die notwendig oder ausreichend ist, um eine erwünschte biologische Wirkung zu realisieren. Zum Beispiel könnte eine wirksame Menge eines Nukleinsäwemoleküls, das mindestens ein unmethyliertes CpG enthält, zur Behandlung einer Defizienz des Immunsystems die Menge sein, die notwendig ist, um einen Tumor, Krebs oder eine bakterielle, virale oder Pilzinfektion zu beseitigen. Eine wirksame Menge für die Verwendung als Impfstoffadjuvans könnte die Menge sein, die nützlich ist, um die Immunantwort eines Lebewesens auf einen Impfstoff zu verstärken. Eine „wirksame Menge" zur Behandlung von Asthma kann die Menge sein, die dafür nützlich ist, eine Immunantwort vom Typ Th2, die mit Asthma verbunden ist, zu einer Antwort vom Typ Th1 umzulenken. Die wirksame Menge für eine jegliche Anwendung kann in Abhängigkeit von Faktoren wie der Krankheit oder dem Zustand, der behandelt wird, der besonderen Nukleinsäure, die verabreicht wird (z.B. die Anzahl an unmethylierten CpG-Motiven oder ihre Stelle innerhalb der Nukleinsäure), die Größe des Lebewesens oder der Schwere der Krankheit oder des Zustandes, schwanken. Der Durchschnittfachmann kann die wirksame Menge eines speziellen Oligonukleotides empirisch bestimmen, ohne dass unangemessene Versuche notwendig sind.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, die in keiner Weise als weiter einschränkend ausgelegt werden sollten.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Wirkungen von ODNs auf die Gesamt-RNA-Synthese und den Zellzyklus von B-Zellen
  • B-Zellen wurden aus Milzgewebe gereinigt, das von 6–12 Wochen alten spezifisch pathogen-freien DBA/2- oder BXSB-Mäusen (gezüchtet in den Tierställen der University of Iowa; es wurden keine besonderen Unterschiede zwischen den Stämmen bemerkt), die hinsichtlich 7-Zellen verarmt waren durch anti-Thy-1.2 und Komplement und Zentrifugation über Lymphocyte M (Cedarlane Laboratories, Hornby, Ontario, Canada) („B-Zellen"). Die B-Zellen enthielten weniger als 1% CD4+- oder CD8+-Zellen. 8 × 104 B-Zellen wurden dreifach in Mikrotiterplatten mit 96 Näpfen mit 100 μl RPMI, das 10% FBS (bei 65 °C 30 Min. lang hitzeinaktiviert), 50 μM 2-Mercaptoethanol, 100 U/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamat enthielt, gegeben. Zu Beginn der 20-stündigen Kultur bei 37 °C wurden 20 μM ODN hinzugegeben, die Zellen mit 1 μCi 3H-Uridin gepulst und 4 Std. später geerntet und gezählt. Ig-sekretierende B-Zellen wurden mit Hilfe des ELISA Spot Tests nach 48-stündiger Kultur der Ganzmilzzellen bei einer Konzentration von 20 μM der ODN gezählt. Die in Tabelle 1 gezeigten Daten zeigen den Stimulierungsindex im Vergleich zu Zellen, die ohne ODN inkubiert wurden. 3H-Thymidin-Einbau-Tests ergaben ähnliche Ergebnisse, aber etwas nicht-spezifischer Inhibition durch von abgebautem ODN freigesetztem Thymidin (Matson. S und A.M. Krieg (1992) Nonspecific suppression of 3H-thymidine incorporation by control oligonucleotides. Antisense Research and Development 2:325).
  • Beispiel 2: Wirkungen von ODN auf die Produktion von IgM durch B-Zellen
  • Einzelzell-Suspensionen aus den Milzen frisch getöteter Mäuse wurden nach dem Verfahren von Leibson et al., J. Exp. Med. 154:1681 (1981)) mit anti-Thyl, anti-CD4, anti-CD8 und Komplement behandelt. Ruhende B-Zellen (<02% T-Zellen-Kontamination) wurden nach dem Verfahren von DeFranco et al., J. Exp. Med. 155:1523 (1982) aus der 63–70% Bande eines diskontinuierlichen Percoll-Gradienten isoliert. Diese wurden 48 Std. lang wie oben beschrieben in 30 μM ODN oder 20 μg/ml LPS inkubiert. Mit Hilfe des ELIspot-Tests (Klinman, D.M. et al., J. Immunol. 144:506 (1990)) wurde bestimmt, dass die Zahl der aktiv IgM sekretierenden Zellen zu diesem Zeitpunkt maximal war. Bei diesem Test wurden B-Zellen 6 Std. lang auf mit anti-Ig beschichteten Mikrotiterplatten inkubiert. Das von ihnen produzierte Ig (>99% IgM) wurden unter Verwendung von Phosphatase-markiertem anti-Ig nachgewiesen (Southern Biotechnology Associated, Birmingham, AL). Die von individuellen B-Zellen produzierten Antikörper wurden durch Zugabe von BCIP (Sigma Chemical Co., St. Louis MO) sichtbar gemacht, das in Anwesenheit von Phosphatase ein unlösliches blaues Präzipitat bildet. Die Verdünnung der Zellen, die 20–40 Punkte/Napf ergab, wurde verwendet, um die Gesamtzahl der Antikörper-produzierenden B-Zellen/Probe zu bestimmen. Alle Tests wurden dreifach durchgeführt (Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt). Bei einigen Experimenten wurden die Kulturüberstände durch ELISA auf IgM getestet, und zeigten als Reaktion auf CpG-ODN ähnliche Zunahmen.
  • Beispiel 3: Stimulierung von B-Zellen durch bakterielle DNA
  • DBA/2 B-Zellen wurden ohne DNA oder mit 50 μg/ml DNA von a) Micrococcus lysodeikticus; b) NZB/N-Mausmilz; und c) genomische Milz-DNAs der NFS/N-Maus 48 Std. lang inkubiert, und danach 4 Stunden vor der Zellernte mit 3H-Thymidin gepulst. Doppelte DNA-Proben wurden 30 Minuten lang bei 37 °C vor der Zugabe zu den Zellkulturen mit DNASE I verdaut. Auch E. coli-DNA induzierte nach 48 Std. ebenfalls eine 8,8-fache Zunahme der IgM-sekretierenden B-Zellen, wie unter Verwendung des ELISA-Spot Tests gezeigt werden konnte.
  • DBA/2 B-Zellen wurden entweder ohne Zusatz, 50 μg/ml LPS oder dem ODN 1; 1a; 4; oder 4a bei einer Konzentration von 20 μM inkubiert. Die Zellen wurden inkubiert und nach 4, 8, 24 und 48 Stunden geerntet. BXSB-Zellen wurden wie in Beispiel 1 mit 5, 10, 20, 40 oder 80 μM-Konzentrationen des ODN 1; 1a; 4; oder 4a oder LPS inkubiert. Bei diesem Experiment zeigten Näpfe ohne ODN 3833 cpm. Jedes Experiment wurde mindestens dreimal mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt. Die Standardabweichungen von drei verschiedenen Näpfen waren <5%.
  • Beispiel 4: Wirkungen von ODN auf natürliche Killer (NK)-Aktivität
  • 10 × 106 C57BL/6-Milzzellen wurden in zwei ml RPMI (mit Zusätzen wie in Beispiel 1 beschrieben) mit oder ohne 40 μM CpG- oder Nicht-CpG-ODN 48 Std. lang inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und dann als Effektorzellen für einen Kurzzeit-51Cr-Freisetzungstest mit YAC-1 und 2C11, zwei NK-empfindlichen Zielzelllinien, verwendet (Ballas, Z. K. et al. (1993) J. Immunol. 150:17). Verschiedene Konzentrationen der Effektorzellen wurden zu 104 51Cr-markierten Zielzellen in Mikrotiterplatten mit V-förmigem Boden mit einem Volumen von 0,2 ml gegeben und 4 Std. lang bei 37 °C in 5% CO2 inkubiert. Die Platten wurden anschließend abzentrifugiert und die Radioaktivität eines Aliquots des Überstandes gemessen. Die spezifische Lyse in Prozent wurde bestimmt als das Verhältnis des in Anwesenheit der Effektorzellen freigesetzten 51Cr minus des 51Cr, das freigesetzt wurde, wenn die Zielzellen alleine inkubiert wurden, und den Gesamt-Zählern, die freigesetzt wurden, wenn die Zellen in 2 %-iger Essigsäure lysiert wurden, minus den freigesetzten 51Cr cpm, wenn die Zellen alleine inkubiert werden.
  • Beispiel 5: In vivo-Studien mit CpG-Phosphothioat-ODN
  • Die Mäuse wurden gewogen und erhielten eine IP-Injektion von 0,25 ml steriler PBS oder den in PBS gelösten angegebenen Phosphothioat-ODN. Vierundzwanzig Stunden später wurden die Milzzellen geerntet, gewaschen und unter Verwendung von mit Phycoerythrin konjugiertem 6B2 für Flusszytometrie gefärbt, um zusammen mit Biotin-konjugiertem anti-Ly-6A/E oder anti-Iad (Pharmingen, San Diego, CA) oder anti-Bla-1 (Hardy, R.R. et al., J. Exp. Med. 159:1169 (1984) auf B-Zellen zu gaten. Für jede Bedingung wurden zwei Mäuse untersucht und individuell analysiert.
  • Beispiel 6: Titration von Phosphothioat-ODN zur B-Zellen-Stimulierung
  • B-Zellen wurden mit Phosphothioat-ODN mit der Sequenz des Kontroll-ODN 1a oder der CpG-ODN 1d und 3Db inkubiert und dann entweder nach 20 Std. mit 3H-Uridin oder nach 44 Std. mit 3H-Thymidin gepulst, bevor sie geerntet und die cpm gemessen wurden.
  • Beispiel 7: Rettung der B-Zellen vor Apoptose
  • WEHI-231-Zellen (5 × 104/Napf) wurden vor der Zugabe von anti-IgM (1 μ/ml) 1 Std. lang bei 37 °C in Anwesenheit oder Abwesenheit von LPS oder des Kontroll-ODN 1a oder der CpG-ODN 1d und 3Db inkubiert. Die Zellen wurden weitere 20 Std. inkubiert, bevor sie einen 4-stündigen Puls mit 2 μCi/Napf 3H-Thymidin erhielten. Bei diesem Experiment zeigten Zellen ohne ODN oder anti-IgM einen Einbau von 90,4 × 103 cpm 3H-Thymidin durch die Zugabe von anti-IgM. Das in Tabelle 1 gezeigte Phosphodiester-ODN ergab einen ähnlichen Schutz, wenn auch mit etwas unspezifischer Unterdrückung infolge ODN-Abbaus. Jedes Experiment wurde mindestens dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.
  • Beispiel 8: In vivo-Induktion von murinem IL-6
  • Weibliche DBA/2-Mäuse (2 Monate alt) erhielten eine IP-Injektion von 500g CpG- oder Kontroll-Phosphothioat-ODN. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion wurde den Mäusen Blut abgenommen. Für jeden Zeitpunkt wurden zwei Mäuse untersucht. IL-6 wurde durch Elisa gemessen, und die IL-6-Konzentration durch Vergleich mit einer Standardkurve, die mit rekombinantem IL-6 aufgenommen wurde, ermittelt. Die Empfindlichkeit dieses Tests betrug 10 pg/ml. Nach 8 Std. waren die Konzentrationen nicht messbar.
  • Beispiel 9: Systemische Induktion der murinen IL-6-Transkription
  • Mäuse und Zelllinien. DBA/2-, BALB/c- und C3H/HeJ-Mäuse im Alter von 5–10 Wochen wurden als Lymphozytenquelle verwendet. Alle Mäuse wurden von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erhalten und gezüchtet und unter spezifischen Pathogen-freien Bedingungen in den Tierställen der University of Iowa gehalten. Die Maus-B-Zelllinie CH12.LX wurde freundlicherweise von Dr. G. Bishop zur Verfügung gestellt (University of Iowa, Iowa City).
  • Zellpräparation. Die Mäuse wurden durch Genickbruch getötet. Einzelzellsuspensionen wurden aseptisch aus dem Milzgewebe der Mäuse hergestellt. Maus-Splenozyten mit vermindertem T-Zellen-Gehalt wurden unter Verwendug von anti-Thy-1.2 und Komplement und Zentrifugation über Lymphocyte M (Cedarlane Laboratories, Hornby, Ontario, Canada) wie beschrieben (Krieg, A.M. et al., (1989) A role for endogenous retroviral sequences in the regulation of lymphocyte activation. J. Immunol. 143:2448) hergestellt.
  • ODN und DNA. Phosphodiester-Oligonukleotide (O-ODN) und Rückgrat-modifizierte Phosphothioat-Oligonukleotide (S-ODN) wurden von der DNA Core facility der Universität Iowa oder von Operon Technologies (Alameda, CA) erhalten. E. coli-DNA (Stamm B) und Kalbsthymus-DNA wurden bei Sigma gekauft (St. Louis, MO). Alle DNA und ODN wurden durch Extraktion mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) und/oder Ethanolpräzipitation gereinigt. E. coli- und Kalbsthymus-DNA wurden vor der Verwendung durch 10-minütiges Aufkochen und anschließende 5-minütige Kühlung auf Eis einzelsträngig gemacht, bevor sie benutzt wurden. Bei einigen Experimenten wurden E. coli- und Kalbsthymus-DNA 2 Std. lang bei 37 °C in 1 × SSC mit 5 mM MgCl2 mit DNase I (2 U/μg DNA) verdaut. Um das Cytosin in CpG-Dinukleotiden in E. coli-DNA zu methylieren, wurde E. coli-DNA in NEB-Puffer 2, der mit 160 μM S-Adenosylmethionin supplementiert war, mit CpG-Methylase (M. SssI; 2 U/μg DNA) behandelt und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Methylierte DNA wurde wie oben gereinigt. Die Effizienz der Methylierung wurde durch Hpa II-Verdau und anschließende Analyse durch Gelelektrophorese bestätigt. Alle Enzyme wurden bei New England Biolabs (Beverly, MA) gekauft. Die LPS-Konzentration in ODN war kleiner als 12,5 ng/mg und E. coli- und Kalbsthymus-DNA enthielten weniger als 2,5 ng LPS/mg DNA, wie durch den Limulus-Test bestimmt wurde.
  • Zellkultur. Alle Zellen wurden bei 37 °C und 5% CO2 24 Std. lang (für die IL-6-Produktion) oder 5 Tage lang (für die IgM-Produktion) in einem befeuchteten Inkubator in RPMI-1640 ergänzt mit 10% (v/v) Hitze-inaktiviertem fötalen Kalbsserum (FCS), 1,5 mM L-Glutamin, 50 μg/ml), CpG oder Nicht-CpG-Phosphodiester-ODN (O-ODN (20 μM), Phosphothioat-ODN (S-ODN) (0,5 μM) oder E. coli- oder Kalbsthymus-DNA (50 μg/ml) inkubiert. Die Konzentrationen von Stimulanzien wurden auf der Grundlage von vorläufigen Arbeiten mit Titrationen gewählt. In einigen Fällen wurden Zellen 5 Tage lang mit CpG-O-ODN zusammen mit verschiedenen Konzentrationen (1–10 μg/ml) neutralisierendem Ratten-IgGI-Antikörper gegen murines IL-6 (Hybridoma MP5-20F3) oder Kontroll-Ratten-IgG1 mAb gegen E. coli b-Galactosidase (Hybridoma GL113; ATCC, Rockville, MD) (20) behandelt. Am Ende der Inkubation wurden Fraktionen des Kulturüberstandes wie unten durch ELISA analysiert.
  • In vivo-Induktion von IL-6 und IgM. BALB/c-Mäuse erhielten intravenöse (iv) Injektionen von PBS, Kalbsthymus-DNA (200 μg/100 μl PBS/Maus), E. coli-DNA (200 μg/100 μl PBS/Maus) oder CpG- oder Nicht-CpG-S-ODN (200 μg/100 μl PBS/Maus). Mäusen (zwei/Gruppe) wurde zu verschiedenen Zeitpunkten durch retroorbitale Punktierung Blut abgenommen, und sie wurden zu verschiedenen Zeitpunkten durch Genickbruch getötet. Leber, Milz, Thymus und Knochenmark wurden entfernt, und aus diesen Organen mit Hilfe von RNAzol B (Tel-Test, Friendswood, TX) nach dem Protokoll des Herstellers RNA hergestellt.
  • ELISA. Immun 1-Platten mit flachem Boden (Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA) wurden mit 100 μl/Napf anti-Maus-IL-6 mAb (MP5-20F3) (2 μg/ml) oder anti-Maus-IgM μ-Ketten-spezifisch (5 μg/ml; Sigma, St. Louis, MO) in Carbonat-Bicarbonatpuffer, pH 9,6 (15 nM Na2CO3, 35 mM NaHCO3) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Platten wurden anschließend mit TPBS (0,5 mM MgCl2o6H2O, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 0,14 M NaCl, 6,6 mM K2HPO4, 0,5% Tween 20) gewaschen und 2 Std. lang bei Raumtemperatur mit 10% FCS in TPBS geblockt und erneut gewaschen. Kulturüberstände, Mausseren, rekombinantes Maus-IL-6 (Pharmingen, San Diego, CA) oder gereinigter Maus-IgM (Calbiochem, San Diego, CA) wurden in geeigneter Weise in 10% FCS verdünnt und dreifach in Näpfen bei Raumtemperatur 6 Std. lang inkubiert. Die Platten wurden gewaschen, und 100 μl/Napf biotinylierte monoklonale Ratten-anti-Maus-IL-6-Antikörper (MP5-32C11, Pharmingen, San Diego, CA) (1 μg/ml in 10% FCS) oder biotinyliertes anti-Maus Ig (Sigma, St. Louis, MO) hinzugegeben und 45 Min. lang bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von mehrmaligem Waschen mit TPBS. 1:4000 in 10% FCS (100 μl/Napf) verdünnte, mit Avidin (Bio-rad Laboratories, Hercules, CA) konjugierte Mehrrettich-Peroxidase (HRP) wurden hinzugegeben und bei Raumtemperatur 30 Min. lang inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und 30 Min. lang mit O-Phenylendiamindihydrochlorid (OPD; Sigma, St. Louis, MO) in 0,05 M Phosphat-Citrat-Puffer, pH 5,0, entwickelt. Die Reaktion wurde mit 0,67 N H2SO4 abgestoppt, und die Platten bei 490–600 nm mit einem Mikroplattenlesegerät (Cambridge Technology, Inc., Watertown, MA) ausgelesen. Die Ergebnisse sind in den 1 und 2 gezeigt.
  • RT-PCR. Ein Sense-Primer, ein Antisense-Primer und eine interne Oligonukleotidsonde für IL-6 wurden unter Verwendung veröffentlichter Sequenzen (Montgomery, RA. und M.S. Dallman (1991), Analysis of cytokine gene expression during fetal thymic ontogeny using the polymerase chain reaction (J. Immunol.) 147:554) synthetisiert. Die cDNA-Synthese und IL-6-PCR wurden im Wesentlichen ausgeführt wie beschrieben von Montgomery und Dallman (Montgomery, RA. und M.S. Dallman (1991), Analysis of cytokine gene expression during fetal thymic ontogeny using the polymerase chain reaction (J. Immunol.) 147:554) unter Verwendung von RT-PCR-Reagenzien der Perkin-Elmer Corp. (Hayward, CA). Nach 30 Amplifikationszyklen wurden Proben durch Gelelektrophorese und anschließende Unblot-Analyse (Stoye, J.P. et al., (1991) DNA hybridization in dried gels with fragmented probes: an improvement over blotting techniques, Techniques 3:123) analysiert. Kurz gesagt wurde das Gel bei Raumtemperatur 30 Min. lang in Denaturierungspuffer (0,05 M NaOH, 1,5 M NaCl) hybridisiert und anschließend 30 Min. lang in Renaturierungspuffer (1,5 M NaCl, 1 M Tris, pH 8) inkubiert und 30 Min. lang in doppelt destilliertem Wasser gewaschen. Das Gel wurde getrocknet und 2 Std. lang bei 47 °C in Hybridisierungspuffer (5 × SSPE, 0,1% SDS) mit 10 μg/ml denaturierter Lachsspermien-DNA prähybridisiert. Das Gel wurde mit 2 × 106 cpm/ml g32[P]ATP-endmarkierter interner Oligonukleotidsonde gegen IL-6 (5'CATTTCCACGATTTCCCA3') SEQ ID No. 56) über Nacht bei 47 °C hybridisiert, 4 Mal gewaschen (2 × SSC, 0,2% SDS) und zur Anfertigung eines Autoradiogramms verwendet. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt.
  • Zell-Proliferationstest. DBA/2-Maus-Milz-B-Zellen (5 × 104 Zellen/100 μl/Napf) wurden 24 Std. lang bei 37 °C mit Medien, CpG oder Nicht-CpG-S-ODN (0,5 μM) oder O-ODN (20 μM) behandelt. Die Zellen wurden die letzten vier Std. entweder mit [3H]-Thymidin oder [3H]-Uridin (1 μCi/Well) gepulst. Die Mengen an eingebautem [3H] wurden mit einem Liquid Scintillation Analyzer (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL) gemessen.
  • Transfektionen und CAT-Tests. WEHI-231-Zellen (107 Zellen) wurden mit 20 μg Kontrolle oder menschlichem IL-6-Promotor-CAT-Konstrukt (freundlicherweise von S. Manolagas, Univ. von Arkansas zur Verfügung gestellt) (Pottratz, S.t. et al., (1994) 17B-estradiol inhibits expression of human interleukin-6 promoter-reporter constructs by a receptor-dependent mechanism. J. Clin. Invest. 93:944) bei 250 mV und 960 μF elektroporiert. Nach der Elektroporation wurden die Zellen mit verschiedenen Konzentrationen an CpG- oder Nicht-CpG-ODN stimuliert. Die Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)-Aktivität wurde mit einem Lösungstest (Seed, B. und J.Y. Sheen (1988) A single phase-extraction assay for chloramphenicol acetyl transferase activity. Gene 76:271) 16 Std. nach der Transfektion gemessen. Die Ergebnisse werden in 5 gezeigt.
  • Beispiel 10: Oligodesoxynukleotid-Modifikationen bestimmen die Größenordnung der B-Zellen-Stimulierung durch CpG-Motive
  • ODN wurden auf einem Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA) Modell 380A, 380B oder 394 DNA-Synthesizer unter Verwendung von Standardprozeduren (Beacage und Caruthers (1981) Deoxynucleoside phosphoramidites – A new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis. Tetrahedron Letters 22, 1859–1862) synthetisiert. Phosphodiester-ODN wurden unter Verwendung von Standard-beta-Cyanoethylphosphoramidit-Chemie synthetisiert. Phosphothioat-Bindungen wurden durch Oxidation der Phosphit-Bindung mit elementarem Schwefel anstatt der Standard-Iod-Oxidierung eingefügt. Die vier gewöhnlichen Nukleosid-Phosphoramidite wurden von Applied Biosystems gekauft. Die Schutzgruppen von allen Phosphodiester- und Thioatenthaltenden ODN wurden durch Behandlung mit konzentriertem Ammoniak für 12 Std. bei 55 °C entfernt. Die ODN wurden durch Gel-Ausschluss-Chromatographie gereinigt und vor der Benutzung bis zur Trockne lyophilisiert. Phosphodithioat-Bindungen wurden unter Verwendung von Desoxynukleosid-S-(b-Benzoylmercaptoethyl)-pyrrolidinothiophosphoramiditen eingefügt (Wiesler, W.T. et al., (1993) In Methods in Molecular Biology: Protocols for Oligonucleotides and Analogs – Synthesis and Properties, Agrawal, S. (Hrsg.), Humana Press, 191–206). Die Schutzgruppen von ODN, die Dithioate enthielten, wurden durch 12-stündige Behandlung mit konzentriertem Ammoniak bei 55 °C und anschließender Umkehrphasen-HPLC-Reinigung entfernt.
  • Um Oligomere, die bei jeder erwünschten Internukleotid-Bindung Methylphosphonothioate oder Methylphosphonate genauso wie Phosphodiester enthielten, wurden zwei verschiedene synthetische Zyklen benutzt. Die wesentlichen Syntheseunterschiede bei den beiden Zyklen sind das Kopplungsmittel, wo Dialkylaminomethylnukleosidphosphine verwendet werden, und die Oxidationsmittel im Falle von Methylphosphonothioate. Um beide Derivate zu synthetisieren, wurde aufgrund der langsameren Kopplungskinetik für die Dialkylaminomethylnukleosidphosphine die Kondensationszeit erhöht (Jager und Engels, (1984) Synthesis of deoxynucleoside methylphosphonates via a phosphonamidite approach. Tetrahedron Letters 24, 1437–1440). Nach Abschluss des Kupplungsschrittes wird der Methylphosphinodiester mit dem Schwefelungsmittel (5% elementarer Schwefel, 100 millimolar N,N-Diamethylaminopyridin in Kohlenstoffdisulfid/Pyridin/Triethylamin) behandelt, und zwar vier Mal hintereinander für jeweils 450 Sekunden, um Methylphosphonothioate zu produzieren. Um Methylphosphonat-Bindungen zu erzeugen, wird der Methylphosphinodiester mit Standardoxidationsmittel (0,1 M Iod in Tetrahydrofuran/2,6-Lutidin/Wasser) behandelt.
  • Das an das Silicagel gebundene Oligomer wurde vier Tage lang bei 4 Grad Celsius mit destilliertem Pyridin/konzentriertem Ammoniak, 1:1, (v/v) behandelt. Der Überstand wurde in Vakuum getrocknet, in Wasser gelöst und mit einer G50/50-Sephadex-Säule chromatographiert.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet O-ODN auf ODN, die Phosphodiester sind; S-ODN sind vollständig Phosphothioat-modifiziert; S-O-ODN sind chimäre ODN, bei denen die zentralen Bindungen Phosphodiester sind, aber die zwei 5'- und fünf 3'-Bindungen Phosphothioatmodifiziert sind; S2-O-ODN sind chimäre ODN, bei denen die zentralen Bindungen Phosphodiester sind, aber die zwei 5'- und fünf 3'-Bindungen Phosphodithioat-modifiziert sind; und MP-O-ODN sind chimäre ODN, bei denen die zentralen Bindungen Phosphodiester, aber die zwei 5'- und die fünf 3'-Bindungen Methylphosphonat-modifiziert sind. Die untersuchten ODN-Sequenzen (CpG-Dinukleotide sind durch Unterstreichung angezeigt) umfassen
    Figure 00760001
  • Diese Sequenzen stehen im wahrsten Sinne des Wortes für Hunderte von CpG- und Nicht-CpG-ODN, die im Verlauf dieser Arbeiten getestet wurden.
  • Mäuse. DBA/2- oder BXSB-Mäuse, die von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erhalten und unter spezifischen Pathogen-freien Bedingungen gehalten wurden, wurden im Alter von 5–10 Wochen mit im Wesentlichen identischen Ergebnissen als Lymphozytenquelle verwendet.
  • Zell-Proliferationstest. Bei Zell-Proliferationstests wurden Maus-Milzzellen (5 × 104 Zellen/100 μl/Napf) wie angegeben 24 oder 48 Std. lang bei 37 °C und 5% CO2 in einem angefeuchteten Inkubator in RPMI-1640 ergänzt mit 10% (v/v) Hitze-inaktiviertem fötalem Kälberserum (erhitzt auf 65 °C für Experimente mit O-ODN oder 56 °C für Experimente nur mit modifizierten ODN), 1,5 μM L-Glutamin, 50 μM 2-Mercaptoethanol, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin inkubiert. Zu jedem Napf wurden 1 μCi 3H-Uridin oder – Thymidin (wie angegeben) gegeben, und die Zellen wurden nach vier weiteren Stunden Inkubation geerntet. Die Filter wurden durch Szintillationszählung gezählt. Die Standardabweichungen von Dreifachnäpfen waren < 5%. Die Ergebnisse werden in den 6–8 gezeigt.
  • Beispiel 11: Induktion der NK-Aktivität
  • Phosphodiester-ODN wurden von Operon Technologies (Alameda, CA) gekauft. Phosphothioat-ODN wurden von der DNA core facility, University of Iowa, oder von The Midland Certified Reagent Company (Midland TX) erworben. E. coli (Stamm B)-DNA und Kalbsthymus-DNA wurden von Sigma gekauft (St. Louis, MO). Alle DNA und ODN wurden durch Extraktion mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) und/oder Ethanolfällung gereinigt. Die Konzentration von LPS in ODN war geringer als 12,5 ng/mg und E. coli- und Kalbsthymus-DNA enthielten weniger als 2,5 ng LPS/mg DNA, wie durch den Limulus-Test bestimmt wurde.
  • Virusfreie, 4–6 Wochen alte DBA/2-, C57BL/6 (B6)- und kongenital thymuslose BALB/C-Mäuse wurden per Vertrag durch the Veterans Affairs from the National Cancer Institute (Bethesda, MD) erhalten. C57BL/6-SCID-Mäuse wurden in der SPF barrier facility der Tierställe der University of Iowa gezüchtet.
  • Menschliche periphäre mononukleäre Blutleukozyten (PBMC) wurden wie früher beschrieben (Ballas, Z.K. et al., (1990) J. Allergy Clin. Immunol. 85:453; Ballas, Z.K. und W. Rasmussen (1990) J. Immunol. 145:1039; Ballas, Z.K. und W. Rasmussen (1993) J. Immunol. 150:17) erhalten. Humane oder murine Zellen wurden bei einer Konzentration von 5 × 106/Napf 24 Std. lang bei 37 °C in einer angefeuchteten 5% CO2-Atmosphäre in Platten mit 24 Näpfen (Ballas, Z.K. et al., (1990) J. Allergy Clin. Immunol. 85:453; Ballas, Z.K. und W. Rasmussen (1990) J. Immunol. 145:1039; und Ballas, Z.K. und W. Rasmussen (1993) J. Immunol. 150:17) inkubiert, entweder mit Medium alleine oder mit CpG- oder Nicht-CpG-ODN bei den angezeigten Konzentrationen oder mit E. coli oder Kalbsthyms (50 μg/ml). Alle Kulturen wurden nach 18 Std. geerntet, und die Zellen wurden in einem Standard 4 Std. 51Cr-Freisetzungstest wie früher beschrieben als Effektoren gegen K562 (menschlich) oder YAC-1 (Maus)-Zielzellen benutzt. Bei der Berechnung der lytischen Einheiten (LU) wurde 1 LU als die Zahl von Zellen definiert, die benötigt wird, um 30% spezifische Lyse zu bewirken. Wo angegeben wurden neutralisierende Antikörper gegen IFN-β (Lee Biomolecular, San Diego, CA) oder IL-12 (C15.1, C15.6, C17.8 und C17.15; zur Verfügung gestellt von Dr. Giorgio Trinchieri, The Wistar Institute, Philadelphia, PA) oder ihre Isotypen-Kontrollen zu Beginn der Kulturen mit einer Konzentration von 10 μg/ml hinzugefügt. Bei der anti-IL-12-Zugabe wurden jeweils 10 μg von jeder der 4 MAB (oder Isotypenkontrollen) gleichzeitig hinzugefügt. Die Konzentration des verwendeten rekombinanten menschlichen IL-2 betrug 100 U/ml.
  • Beispiel 12: Verhinderung der Entwicklung eines zellulären Entzündungs-Infiltrats und von Eosinophilie in einem Mäusemodell für Asthma
  • 6–8 Wochen alte C56BL/6-Mäuse (von The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) wurden durch intraperitoneale (i.p.) Injektion an den Tagen 0 und 7 mit 5000 Schistosoma mansoni-Eiern immunisiert. Schistosoma mansoni-Eier enthalten ein Antigen (Schistosoma mansoni Ei-Antigen (SEA)), das eine Th2-Immunantwort (z.B. Produktion von IgE-Antikörper) induziert. Die IgE-Antikörper-Produktion ist als eine wichtige Ursache von Asthma bekannt.
  • Die immunisierten Mäuse wurden anschließend mit Oligonukleotiden (30 μg in 200 μl Saline durch i.p.-Injektion) behandelt, die entweder ein unmethyliertes CpG-Motiv (d. h. TCCATGACGTCCTGACGTT; SEQ ID NO. 10) enthielten oder es nicht enthielten (d. h. Kontrolle TCCATGAGCTTCCTGAGTCT; SEQ ID NO. 11). Lösliches SEA (10 μg in 25 μl Saline) wurden an den Tagen 14 und 21 durch intranasale Einträufelung verabreicht. Als Kontrolle wurde Saline benutzt.
  • Die Mäuse wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Exposition der Luftwege geopfert. Eine Spülung der gesamten Lunge wurde durchgeführt, um Entzündungszellen der Luftwege und Lungenbläschen zu ernten. Die Cytokinkonzentrationen wurden in der Spülflüssigkeit durch ELISA gemessen. RNA wurde aus der ganzen Lunge unter Verwendung von CsCl-Gradienten für die Northern Analyse und RT-PCR-Studien isoliert. Die Lungen wurden aufgepumpt und für die histologische Untersuchung mit 4% Paraformaldehyd durchgespült.
  • 9 zeigt, dass viele Entzündungszellen in den Lungen vorhanden sind, wenn Mäuse zunächst eine i.p.-Injektion von den Eiern erhalten und anschließend das Ei-Antigen (offene Kreise) inhalieren. Wenn die Mäuse zunächst jedoch eine Nukleinsäure, die ein unmethyliertes CpG-Motiv enthält, zusammen mit den Eiern erhalten, wird die Zahl der Entzündungszellen in der Lunge durch die nachfolgende Inhalation des Ei-Antigens (offene Dreiecke) nicht erhöht.
  • 10 zeigt, dass die gleichen Ergebnisse erhalten werden, wenn nur Eosinophile, die in der Lungenspülung vorhanden sind, gemessen werden. Eosinophile sind der Typ von Entzündungszellen, der am engsten mit Asthma verbunden ist.
  • 11 zeigt, dass es wenig Wirkung auf das nachfolgende Einströmen von Eosinophilen in die Lungen nach der Inhalation von SEA hat, wenn die Mäuse zur Zeit der ersten Exposition mit den Eiern mit einem Kontroll-Oligo behandelt werden. Dementsprechend entwickeln die Mäuse eine akute Entzündungsreaktion in den Lungen, wenn sie die Eier an den Tagen 14 und 21 inhalieren. Gibt man ihnen jedoch ein CpG-Oligo zusammen mit den Eiern zur Zeit der ersten Exponierung mit dem Antigen an den Tagen 0 und 7, so wird die Zunahme an Eosinophilen fast komplett aufgehoben, wenn die Mäuse das Ei-Antigen am Tage 14 inhalieren.
  • 12 zeigt, dass sehr geringe Dosen des Oligonukleotids (< 10 μg) diesen Schutz verleihen können.
  • 13 zeigt, dass die folgende Entzündungsreaktion mit den Konzentrationen des Th2-Cytokins IL-4 in der Lunge korreliert.
  • 14 zeigt, dass die Verabreichung eines Oligonukleotides, das ein unmethyliertes CpG-Motiv enthält, die Cytokin-Reaktion der Lunge tatsächlich zur Produktion von Il-12 umlenken kann, was eine Immunreaktion vom Typ Th1 anzeigt.
  • 15 zeigt, dass die Verabreichung eines Oligonukleotides, das ein unmethyliertes CpG-Motiv enthält, ebenfalls die Cytokin-Reaktion der Lunge zur Produktion von IFN-γ umlenken kann, was eine Immunreaktion vom Typ Th1 anzeigt.
  • Beispiel 13: CpG-Oligonukleotide induzieren die Sekretion von Cytokinen durch menschliche PBMC
  • Humane PBMC wurden durch Standardzentrifugation von Vollblut über Ficoll Hypaque hergestellt. Die Zellen (5 × 105/ml) wurden im Fall von TNF-α 4 Std. lang und im Fall der anderen Cytokine 24 Std. lang in 10 %-igem autologen Serum in Mikrotiterplatten mit 96 Näpfen mit CpG- oder Kontroll-Oligodesoxynukleotiden (24 μg/ml bei Phosphodiesteroligonukleotiden; 6 μg/ml bei Nuklease-resistenten Phosphothioatoligonukleotiden) inkubiert, bevor der Überstand gewonnen und getestet wurde, wobei die Bestimmung mittels ELISA unter Verwendung von Quantikin-Kits oder Reagenzien von R&D Systems (pg/ml) oder Cytokin-ELISA-Kits von Biosource (für den IL- 12-Test) erfolgte. Die Tests wurden nach Anweisung des Herstellers durchgeführt. Die Daten sind in Tabelle 6 als die Cytokin-Konzentration gezeigt, die über die in Näpfen ohne zugefügte Oligodesoxynukleotide gemessene Konzentration hinausgeht.

Claims (32)

  1. Verwendung eines immunstimulierenden Oligonucleotids, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, für die Zubereitung eines Medikaments für die Behandlung oder Verhinderung von Asthma, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid nicht in Verbindung mit einem verabreichten Allergen verabreicht wird.
  2. Verwendung eines immunstimulierenden Oligonucleotids, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, für die Zubereitung eines Medikaments für die orale Verabreichung für die Behandlung oder Verhinderung von Asthma.
  3. Verwendung eines immunstimulierenden Oligonucleotids, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, für die Zubereitung eines Medikaments für die Behandlung oder Verhinderung von Allergie, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid nicht in Verbindung mit einem verabreichten Allergen verabreicht wird.
  4. Verwendung eines immunstimulierenden Oligonucleotids, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, für die Zubereitung eines Medikaments für die orale Verabreichung für die Behandlung oder Verhinderung von Allergie.
  5. Verwendung eines immunstimulierenden Oligonucleotids, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, für die Zubereitung eines Medikaments für die Behandlung oder Verhinderung von Ekzem, allergischer Rhinitis, Nasenkatarrh, Heuschnupfen, Nesselausschlag oder Nahrungsmittelallergie.
  6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1–5, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid eine Sequenz aufweist umfassend ein CpG-Motiv, das durch die Formel: 5'N1X1CGX2N23' dargestellt ist, wobei mindestens ein Nucleotid aufeinanderfolgende CpG trennt; X1 Adenin, Guanin oder Thymin ist; X2 Cytosin oder Thymin ist; N irgendein Nucleotid ist und N1 und N2 ca. 0–26 Basen betragen, unter der Voraussetzung, dass N1 und N2 kein CCGG-Quadmer oder nicht mehr als ein CCG- oder CGG-Trimer enthalten und das Oligonucleotid ca. 8–30 Basen lang ist.
  7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1–5, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid ein CpG-Motiv umfasst, das durch die Formel: 5'N1X1X2CGX3X4N23' dargestellt ist, wobei mindestens ein Nucleotid aufeinanderfolgende CpG trennt; X1X2 aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus GpT, GpG, GpA, ApT und ApA; X3X4 aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus TpT oder CpT; N irgendein Nucleotid ist und N1 und N2 ca. 0–26 Basen betragen, unter der Voraussetzung, dass N1 und N2 kein CCGG-Quadmer oder nicht mehr als ein CCG- oder CGG-Trimer enthalten und die Oligonucleotidsequenz ca. 8–30 Basen lang ist.
  8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei X1X2 aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus GpT, GpG, GpA und ApA und X3X4 aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus TpT, CpT und GpT.
  9. Verwendung nach Anspruch 1–5, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid Folgendes ist: i. TCCATGTCGCTCCTGATGCT; ii. TCCATGTCGTTCCTGATGCT; oder iii. TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT.
  10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1–5, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid TCCATGACGTTCCTGACGTT ist.
  11. Verwendung nach Anspruch 6, wenn das Medikament für die Behandlung von Asthma bestimmt ist, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid: (a) GTCG(T/C)T oder TGACGTT; (b) TGTCG(T/C)T; (c) TCCATGTCGTTCCTGTCGTT; (d) TCCTGACGTTCCTGACGTT ist.
  12. Verwendung nach einem der Ansprüche 1–8, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, im Bereich von 8–30 Basen lang ist.
  13. Verwendung nach einem der Ansprüche 1–8 und 12, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, ein TC oder TG am 5'-ende aufweist.
  14. Verwendung nach einem der Ansprüche 1–8, 12 und 13, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, mindestens zwei aufeinanderfolgende CpG enthält, die durch mindestens ein Thymin getrennt sind.
  15. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, einstrangig ist.
  16. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, kein palindromisches CpG-Motiv enthält.
  17. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, kein modifiziertes Phosphatrückgrat umfasst.
  18. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, ein Phosphodiesteroligonucleotid ist.
  19. Verwendung nach einem der Ansprüche 1–16, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, eine Phosphatrückgratmodifikation enthält.
  20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei die Phosphatrückgratmodifikation an den ersten beiden Nucleotiden des 5'-Endes der Nucleinsäure auftritt.
  21. Verwendung nach Anspruch 19 oder 20, wobei die Phosphatrückgratmodifikation an den letzten fünf Nucleotiden des 3'-Endes der Nucleinsäure auftritt.
  22. Verwendung nach einem der Ansprüche 19–21, wobei die Phosphatrückgratmodifikation eine Phosphorthionat modifizierte Verknüpfung ist.
  23. Verwendung nach Anspruch 19, wobei die zentralen Verknüpfungen in dem immunstimulierenden Oligonucleotid Phosphodiesterverknüpfungen sind und die beiden 5'- und die fünf 3'-Verknüpfungen Phosphorthionat modifizierte Verknüpfungen sind.
  24. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament für einen Menschen bestimmt ist.
  25. Verwendung nach einem der Ansprüche 1–23, wobei das Medikament für einen Hund, eine Katze, ein Pferd, eine Kuh, ein Schaf, eine Ziege, ein Huhn, einen Affen, eine Ratte oder Mause bestimmt ist.
  26. Verwendung nach einem der Ansprüche 1, 3 und 5–23, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, oral, transdermal oder durch subkutane, intravenöse, parenterale, intraperitoneale oder intrathekale Einspritzung verabreicht wird.
  27. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, mit einem Sterol, kationischen Lipid, Virosom oder einem Liposom assoziiert ist, um einen Oligonucleotidabgabekomplex zu bilden.
  28. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
  29. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament im Wesentlichen aus einem immunstimulierenden Oligonucleotid besteht, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält.
  30. Verwendung nach einem der Ansprüche 1–5, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, ein Ribonucleotid oder eine Desoxyribonucleotid ist.
  31. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, synthetisch ist.
  32. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, stabilisiert ist.
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