DE69737023T2

DE69737023T2 - Methode zur behandlung von krebs und pathogenen infektionen unter verwendung von antigen-präsentierenden zellen beladen mit rna

Info

Publication number: DE69737023T2
Application number: DE69737023T
Authority: DE
Inventors: K. Smita Durham NAIR; J. David Durham BOCZKOWSKI; Eli Durham GILBOA
Original assignee: Duke University
Current assignee: Duke University
Priority date: 1996-04-30
Filing date: 1997-04-30
Publication date: 2007-06-28
Anticipated expiration: 2017-05-01
Also published as: US7601343B2; CA2253632A1; EP0918848A4; US20100015108A1; JP2000509281A; US6670186B1; US20120288931A1; EP0918848B1; PT918848E; EP2298927A3; EP2298927A2; JP2006254920A; JP3955311B2; JP3836151B2; CA2253632C; US6387701B1; WO1997041210A1; EP1721987A1; EP0918848A1; DK0918848T3

Description

Hintergrund der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung von Tumorbildung oder Pathogeninfektion in einem Patienten.
Zuvor beschriebene Verfahren zur Behandlung von Krebsen schließen die Verwendung von Chemotherapeutika, Strahlungstherapie und gezielte Chirurgie ein. Die Identifikation einiger weniger Tumorantigene führte zu der Entwicklung von zellbasierten Therapien. Diese Verfahren beruhen darauf, dass zuerst ein Tumorantigen (d.h. ein Polypeptid, das vorzugsweise in Tumorzellen im Verhältnis zu Nicht-Tumorzellen exprimiert wird) identifiziert wird. Aus Melanompatienten wurden etliche humane Tumorantigene isoliert und identifiziert und charakterisiert (Boon und van der Bruggen J. Exp. Med. (1996) 183: 725-729). Diese Polypeptidantigene können auf Antigen-präsentierende Zellen geladen werden und dann Patienten in einem Verfahren der Immuntherapie (d.h. als ein Vakzin) verabreicht werden. Alternativ können die polypeptidgeladenen Antigen-präsentierenden Zellen verwendet werden, um CTL-Proliferation ex vivo zu stimulieren. Die stimulierten CTL werden dann dem Patienten in einem Verfahren der eingeführten Immuntherapie verabreicht.
Es wurde eine Reihe von Verfahren für die Behandlung von Infektionen mit intrazellulären Pathogenen wie Viren und Bakterien beschrieben. Zum Beispiel werden Antibiotika üblicherweise verwendet, um bakterielle Infektionen zu behandeln. Zubereitungen abgetöteter Pathogene können auch als Vakzine dienen. Zusätzlich wurden auf CTL basierte Therapien für die Behandlung solcher Infektionen beschrieben.
Celluzzi et al. (J. Exp. Med. (1996) 183: 283-287) berichten von dendritischen gepulsten APCs mit MHC Klasse I präsentierenden Peptidantigenen, die schützende Immunität gegen eine letale Herausforderung durch einen mit dem Antigengen transfizierten Tumor induzieren.
WO 95/34638 berichtet von der Ex-vivo-Aussetzung humaner dendritischer Zellen an von Lymphom abgeleitete Immunglobuline als Antigene, gefolgt von der Reinfusion an einen Lymphompatienten, um einen tumorreaktive Immunantwort zu induzieren und/oder zu steigern.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wurde nun entdeckt, dass Tumorbildung in einem Patienten durch die Verabreichung einer/von Antigen-präsentierenden Zelle(n) an einen Patienten, die mit Antigen beladen ist/sind, das in RNA kodiert ist, welche von einem Tumor abgeleitet ist, behandelt oder verhindert werden kann. Der Einfachheit halber kann eine RNA-angereicherte Tumorzubereitung anstelle von gereinigter RNA verwendet werden. Die Erfindung umgeht folglich den Bedarf dafür, RNA zu reinigen oder ein Tumorantigen zu isolieren und zu identifizieren. Unter Verwendung ähnlicher Verfahren und von Pathogen abgeleiteter RNA kann Pathogeninfektion in einem Patienten behandelt oder verhindert werden. Die RNA-beladenen Antigen-präsentierenden Zellen können verwendet werden, um CTL-Proliferation ex vivo oder in vivo zu stimulieren. Die ex vivo expandierte CTL kann einem Patienten in einem Verfahren der eingeführten Immuntherapie verabreicht werden.
Demgemäß bietet die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer RNA-gepulsten Antigenpräsentierenden Zelle (APC), wobei das Verfahren das Einführen in eine APC eines Verfahrens zur Herstellung einer RNA-gepulsten Antigen-präsentierenden Zelle (APC) in vitro umfasst, wobei dieses Verfahren das Einbringen in eine Antigen-präsentierende Zelle in vitro von RNA umfasst, ausgewählt aus RNA, umfassend Tumor-spezifische RNA, und RNA, umfassend Pathogen-spezifische RNA, wodurch eine RNA-gepulste APC hergestellt wird. Tumor-abgeleitete RNA schließt Tumor-spezifische RNA ein, welche ein Zelloberflächentumorantigenepitop kodiert, das T-Zell-Proliferation induziert. Pathogenabgeleitete RNA schließt Pathogen-spezifische RNA ein, welche ein Pathogenantigenepitop kodiert, das T-Zell-Proliferation induziert. Nach Einführen von RNA in eine APC (d.h. „Beladen" der APC mit RNA) wird die RNA innerhalb der APC translatiert und das resultierende Protein wird durch die MHC-Klasse-I- oder -Klasse-II-Verarbeitungs- und -Präsentationswege verarbeitet. Präsentation von RNA-kodierten Peptiden startet die Ereigniskette, in welcher das Immunsystem eine Antwort auf die präsentierten Peptide hervorbringt.
Vorzugsweise ist die APC eine kompetente (engl. professional) APC wie eine dendritische Zelle oder ein Makrophage. Alternativ kann jede APC verwendet werden. Zum Beispiel können Endothelzellen und künstlich erzeugte APC verwendet werden. Die auf die APC geladene RNA kann der APC als gereinigte RNA oder als eine fraktionierte Zubereitung eines Tumors oder Pathogens bereitgestellt werden. Die RNA kann polyA⁺-RNA einschließen, welche unter Verwendung von konventionellen Verfahren isoliert werden kann (z.B. Verwendung von poly-dT-Chromatographie). Sowohl zytoplasmatische als auch nukleäre RNA sind bei der Erfindung nützlich. Ebenfalls nützlich bei der Erfindung ist RNA, die definierte Tumor- oder Pathogenantigene oder -epitope kodiert und RNA-„Minigene" (d.h. RNA-Sequenzen, die definierte Epitope kodieren). Falls gewünscht kann Tumor-spezifische oder Pathogen-spezifische RNA verwendet werden; solche RNA kann unter Verwendung von in der Technik bekannten Techniken zubereitet werden, wie zum Beispiel durch Subtraktionshybridisierung gegen RNA aus Nicht-Tumorzellen oder gegen verwandte, aber nicht pathogene Bakterien oder Viren.
Die auf APC geladene RNA kann aus einer Zelle isoliert werden oder sie kann durch Ausnutzen konventioneller molekularbiologischer Techniken hergestellt werden. Zum Beispiel kann RNA aus Tumorzellen extrahiert werden, in cDNA revers transkribiert werden, welche durch PCR amplifiziert werden kann, und die cDNA wird dann in RNA transkribiert, die bei der Erfindung verwendet werden soll. Falls gewünscht kann die cDNA in ein Plasmid kloniert werden bevor sie als eine Matrize für RNA-Synthese verwendet wird. RNA, die in vitro synthetisiert wird, kann selbstverständlich teilweise oder vollständig mit Ribonukleotidanaloga oder -derivaten synthetisiert sein. Solche Analoga und Derivate sind in der Technik wohl bekannt und können zum Beispiel verwendet werden, um gegen Nuklease resistente RNAs zu produzieren. Die Verwendung von RNA-Amplifikationstechniken erlaubt einem, große Mengen des RNA-Antigens aus einer kleinen Zellzahl zu gewinnen.
Die RNA kann aus einem gefrorenen oder fixierten Gewebe isoliert sein. Tumorproben werden üblicherweise aus Krebspatienten isoliert und dann gelagert, zum Beispiel als Cryostat- oder Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Gewebeschnitte. Da Krebspatienten oftmals wenige Tumorzellen haben, ist die Isolation von RNA aus fixierten Geweben besonders vorteilhaft beim Herstellen der APCs der Erfindung, da das Verfahren eine kleine Gewebeprobe nutzen kann. Mikroschnitttechniken können verwendet werden, um Tumorzellen von normalen Zellen abzusondern. RNA kann dann aus den Tumorzellen isoliert werden und in vitro amplifiziert werden (z.B. durch PCR oder reverse Transkriptions-PCR (RT-PCR)). Die resultierende, amplifizierte RNA kann dann verwendet werden, um die hierin beschriebenen RNA-beladenen APCs zu produzieren.
Falls gewünscht kann einen Immunmodulator kodierende RNA auch in die APC eingeführt werden, die mit der Tumor-abgeleiteten oder Pathogen-abgeleiteten RNA beladen ist. Bei dieser Ausführung wird der RNA-kodierte Immunmodulator in der APC exprimiert und steigert die therapeutische Wirkung der RNA-beladenen APCs (z.B. als Vakzine). Vorzugsweise ist der Immunmodulator ein Cytokin oder ein co-stimulierender Faktor (z.B. ein Interleukin, wie zum Beispiel IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 oder IL-15 oder GM-CSF).
Um RNA in eine APC einzuführen, kann die APC mit der Tumor- oder Pathogen-abgeleiteten RNA in der Anwesenheit eines kationischen Lipids, wie zum Beispiel DOTAP oder 1:1 (w/w) DOTMA:DOPE (d.h. LIPOFECTIN, in Kontakt gebracht werden. Alternativ kann „nackte" RNA in die Zellen eingeführt werden. Andere in der Technik bekannte Transfektionsverfahren können auch verwendet werden, um die RNA in die APC einzubringen.
In einer Reihe oder obigen Verfahren kann die RNA, welche in die APC einzuführen ist, so verändert werden, dass sie eine Zell-Trafficking-Signalsequenz zusätzlich zu einem Tumorantigen oder Pathogenantigen kodiert. Von solch einer veränderten RNA kann gedacht werden, dass sie so ist, als ob sie zwei RNA-Sequenzen enthielte, die kovalent gekoppelt sind und welche die Expression eines chimären Polypeptids lenken. Eine RNA-Sequenz kodiert das Tumor- oder Pathogenantigen während die andere RNA-Sequenz die Zell-Trafficking-Sequenz kodiert, wodurch folglich ein chimäres Polypeptid gebildet wird. Die chimären Polypeptide, die ein Antigen enthalten, welches an eine Traffickingsequenz gekoppelt ist, werden in den MHC-Klasse-II-Antigenpräsentationsweg eingeschleust. Beispiele geeigneter Traffickingsequenzen werden unten bereitgestellt.
Da die Durchführung der Erfindung es nicht erfordert, dass ein Antigen der Tumorzelle oder des Pathogens identifiziert wird, ist DNA, die aus im Wesentlichen irgendeiner Art von Tumor oder Pathogen gewonnen wird, nützlich. Zum Beispiel ist die Erfindung anwendbar, aber nicht beschränkt auf die Entwicklung von Therapeutika für die Behandlung von Melanom, Blasenkrebsen, Brustkrebsen, Pankreaskrebsen, Prostatakrebsen, Kolonkrebsen und Eierstockkrebsen. Zusätzlich kann die Erfindung Infektionen mit Pathogenen wie Salmonella, Shigella, Enterobacter, humanem Immunschwächevirus, Herpesvirus, Influenzavirus, Poliomyelitisvirus, Masernvirus, Mumpsvirus oder Rubellavirus behandeln oder verhindern.
Die in Übereinstimmung mit der Erfindung produzierten Antigen-präsentierenden Zellen können verwendet werden, um CTL-Antworten in vivo und ex vivo zu induzieren. Folglich bezieht sich die Erfindung auf Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung von Tumorbildung in einem Patienten, indem dem Patienten eine therapeutisch wirksame Menge an APC verabreicht wird, die mit Tumor-abgeleiteter RNA beladen sind. Die Tumorabgeleitete RNA kann aus dem Patienten gewonnen werden, z.B. als eine RNA-angereicherte Tumorzubereitung. Alternativ kann die in solch einem Behandlungsplan verwendete Tumorabgeleitete RNA aus einem anderen Patienten gewonnen werden, der mit demselben oder einem ähnlichen Krebstyp heimgesucht ist. Ähnlich kann die mit Pathogen-abgeleiteter RNA beladene APC verwendet werden, um eine Pathogeninfektion in einem Patienten zu behandeln oder zu verhindern.
Ebenfalls hierin sind Verfahren zur Herstellung einer zytotoxischen T-Lymphozyte (CTL) beschrieben. Solch eine CTL kann hergestellt werden, indem eine T-Lymphozyte in vitro mit einer Antigen-präsentierenden Zelle in Kontakt gebracht wird, die mit Tumor-abgeleiteter oder Pathogen-abgeleiteter RNA beladen ist, und indem die T-Lymphozyte unter Bedingungen gehalten wird, welche der CTL-Proliferation zuträglich sind, wodurch eine CTL erzeugt wird. Die resultierende CTL zeigt eine bemerkenswerte Spezifität für das Pathogen oder die Zellen des Tumors, aus welchen die beladene RNA gewonnen worden ist. Solch eine CTL kann einem Patienten in einer Reihe von konventionellen eingeführten Immuntherapieverfahren verabreicht werden. Falls gewünscht kann man im Hinblick auf die Sensitivierung (d.h. Aktivierung) der CTL untersuchen. Zu diesem Zweck kann jeder der in der Technik bekannten Tests, wie zum Beispiel Zytotoxizitätstests, verwendet werden. Zum Beispiel kann der Zytotoxizitätstest das Detektieren der Abtötung von RNA-beladenen Zelle(n) einschließen (z.B. für Fibroblasten oder dendritische Zellen, die wie hierin beschrieben erzeugt worden sind (d.h. eine RNA-beladene Zelle), die auf ihrer Oberfläche ein Tumorantigenepitop oder Pathogenantigenepitop, das durch die RNA kodiert wird, präsentieren). Ein anderes geeignetes Verfahren für die Detektion von CTL-Sensitivierung liegt im Detektieren einer Zunahme in der Cytokinsekretion im Verhältnis zu dem Spiegel der Cytokinsekretion (z.B. TNF-α oder γ-Interferon), der vor dem Kontaktieren der CTL erhalten worden ist (z.B. in einem In-situ-Immuntest, wie zum Beispiel einem ELISPOT-Test).
Eine Variation der obigen Verfahren ist ein Verfahren zum Erzeugen einer Tumorspezifischen (oder Pathogen-spezifischen) CTL-Antwort. Da die meisten Krebspatienten normalerweise eine nicht detektierbare oder schwache Tumor-spezifische CTL-Antwort zeigen, ist dieses Verfahren besonders nützlich, da es ein Verfahren zur Erzeugung einer CTL-Antwort unter Verwendung von aus irgendeinem Patienten gewonnenen Antigenen bereitstellt. Wenn eine CTL-Antwort erst einmal erzeugt worden ist, kann man konventionelle Verfahren nutzen, tun die Antigene zu identifizieren, welche die CTL-Antwort induzieren. Zum Beispiel können Antigene in Tumorextrakten fraktioniert werden (z.B. durch HPLC) und die Fraktionen können untersucht werden, um zu bestimmen, welche Fraktion ein Antigen enthält, das durch die Tumor-spezifische CTL erkannt wird, die in Übereinstimmung mit der Erfindung hergestellt worden ist. Dieses Verfahren dient folglich als eine Plattform für Antigenentdeckung. Das Verfahren umfasst

a) das Einführen von polyA⁺-RNA in eine Antigen-präsentierende Zelle in vitro, welche wenigstens 80 % (vorzugsweise wenigstens 90 % oder 100 %) der polyA⁺-RNA-Arten enthält, wodurch eine mit RNA beladene APC erzeugt wird; Und
b) Kontaktieren einer T-Lymphozyte mit der mit RNA beladenen APC, wodurch eine Tumor-spezifische oder Pathogen-spezifische CTL-Antwort erzeugt wird. Falls gewünscht kann die Induktion solch einer CTL-Antwort durch Detektieren der Sensibilisierung der kontaktierten T-Lymphozyte unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren detektiert werden. Beim Umsetzen dieses Verfahrens in die Praxis wird unfraktionierte, aus Tumor gewonnene (oder aus Pathogen gewonnene) Gesamt-RNA typischerweise verwendet werden, um die RNA-beladene APC zu erzeugen, da bei Gesamt-RNA sicher ist, dass sie eine RNA enthält, die das Tumorantigen (oder Pathogenantigen) kodiert.

Hierin sind auch Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung von Tumorbildung in einem Patienten durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer APC, die mit Tumor-abgeleiteter RNA beladen ist, an einen Patienten beschrieben. Ähnlich stellt die Erfindung Verfahren zur Behandlung von Pathogeninfektion in einem Patienten bereit durch Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer mit Pathogen-abgeleiteten RNA-beladenen APC an den Patienten. Die bei diesen verschiedenen therapeutischen Verfahren verwendeten T-Lymphozyten können aus dem zu behandelnden Patienten gewonnen werden oder es kann CTL mit angepasstem Haplotyp aus einem Donor verwendet werden. Ähnlich kann die bei diesem Verfahren verwendete RNA von dem zu behandelnden Patienten gewonnen werden oder es kann RNA aus einem Donor verwendet werden.
Mit „RNA-beladene" oder „RNA-gepulste" Antigen-präsentierende Zelle ist eine APC (z.B. ein Makrophage oder eine dendritische Zelle) gemeint, welche mit RNA inkubiert oder transfiziert war, z.B. aus einem Tumor oder Pathogen gewonnene RNA. Solche RNA kann in die APC durch die Verwendung von konventionellen Nukleinsäuretransfektionsverfahren wie Lipid-vermittelte Transfektion, Elektroporation und Calciumphosphattransfektion geladen werden. Zum Beispiel kann RNA in APC durch Inkubieren der APC mit der RNA (oder Extrakt) für 1 bis 24 Stunden (z.B. 2 Stunden) bei 37 °C, vorzugsweise in der Anwesenheit eines kationischen Lipids, eingeführt werden.
Mit „Tumor-abgeleiteter" RNA ist eine RNA-Probe gemeint, welche ihren Ursprung in einer Tumorzelle hat und welche RNA einschließt, die einem Tumorantigen(en) entspricht. Inkludiert ist RNA, die ein ganzes oder einen Teil eines zuvor identifizierten Tumorantigens kodiert. Ähnlich ist „Pathogen-abgeleitete" RNA eine RNA-Probe, welche ihren Ursprung in einem Pathogen hat (z.B. ein Bakterium oder Virus, einschließlich intrazellulären Pathogenen). Solche RNA kann „in vitro transkribiert" werden, z.B. revers transkribiert werden, um cDNA zu erzeugen, die durch PCR amplifiziert und anschließend in vitro transkribiert werden kann, mit Klonieren der DNA oder ohne die DNA zu klonieren. Ebenfalls inkludiert ist RNA, die als eine fraktionierte Zubereitung einer Tumorzelle oder eines Pathogens bereitgestellt wird. Da sogar unfraktionierte RNA-Zubereitung (z.B. Gesamt-RNA oder Gesamt-polyA⁺-RNA) verwendet werden kann, ist es nicht notwendig, dass ein Tumor- oder Pathogen-Antigen identifiziert wird. In einer Ausführung wird die Zubereitung im Hinblick auf einen Nicht-RNA-Bestandteil(e) der Zelle fraktioniert, um die Konzentration eines Nicht-RNA-Bestandteils zu reduzieren, wie zum Beispiel Protein, Lipid und/oder DNA, und um die Zubereitung für RNA anzureichern. Falls gewünscht kann die Zubereitung weiter im Hinblick auf die RNA fraktioniert werden (z.B. durch Subtraktionshybridisierung), so dass „Tumor-spezifische" oder „Pathogen-spezifische" RNA produziert wird.
Mit „Tumor-spezifischer" RNA ist eine RNA-Probe gemeint, welche im Verhältnis zu unfraktionierter aus Tumor gewonnener RNA einen hohen Gehalt an RNA hat, die bevorzugt in einer Tumorzelle vorhanden ist, im Vergleich mit einer Nicht-Tumorzelle. Zum Beispiel schließt Tumor-spezifische RNA RNA ein, die in einer Tumorzelle vorhanden ist, die aber nicht in einer Nicht-Tumorzelle vorhanden ist. Ebenfalls wird von dieser Definition eine RNA-Probe umfasst, die RNA einschließt, die sowohl in Tumor- als auch in Nicht-Tumorzellen vorhanden ist, die aber in einem höheren Spiegel in Tumorzellen als in Nicht-Tumorzellen vorhanden ist. Ebenfalls in dieser Definition eingeschlossen ist RNA, die ein zuvor identifiziertes Tumorantigen kodiert und die in vitro produziert wird, z.B. aus einem Plasmid oder durch PCR. Alternativ kann Tumor-spezifische RNA zubereitet werden durch Fraktionieren einer RNA-Probe, so dass der Prozentsatz an einem Tumorantigen entsprechender RNA erhöht wird, im Verhältnis zu unfraktionierter Tumor-abgeleiteter RNA. Zum Beispiel kann Tumor-spezifische RNA durch Fraktionieren von Tumor-abgeleiteter RNA zubereitet werden, unter Verwendung von konventionellen Subtraktionshybridisierungstechniken gegen RNA aus Nicht-Tumorzellen. Ähnlich bezieht sich „Pathogen-spezifische" RNA auf eine RNA-Probe, die im Verhältnis zu unfraktionierter aus Pathogen gewonnener RNA einen höheren RNA-Gehalt hat, der vorzugsweise in dem Pathogen vorhanden ist, im Vergleich mit einem nicht-pathogenen Stamm der Bakterien oder des Virus.
Mit „Trafficking-Sequenz" ist eine Aminosäuresequenz (oder eine RNA, die eine Aminosäuresequenz kodiert) gemeint, welche so wirkt, dass sie das intrazelluläre Trafficking (z.B. die gerichtete Bewegung von Organelle zu Organelle oder zu der Zelloberfläche) eines Polypeptids, an welche sie angeheftet ist, kontrolliert.
Diese Erfindung bietet etliche Vorteile. In Übereinstimmung mit der Erfindung durchgeführte Impfungen umgehen den Bedarf, spezifische Tumorabstoßungsantigene oder Pathogenantigene zu identifizieren, da das/die korrekte(n) Antigen(e) automatisch aus der Tumor- oder Pathogen-abgeleiteten RNA ausgewählt wird/werden, wenn unfraktionierte RNA verwendet wird. Falls gewünscht kann das Risiko der Erzeugung einer Autoimmunantwort durch die Verwendung von Tumor-spezifischer RNA vermindert werden. Zusätzlich löst die Impfung mit Zellen, die mit unfraktionierter Tumor-abgeleiteter RNA beladen sind, wahrscheinlich Immunantworten gegen etliche Tumorantigene aus, wodurch die Wahrscheinlichkeit von „Fluchtmutanten" reduziert wird. Aktive Immuntherapie kann verwendet werden, um Krebse zu behandeln, für welche spezifische Tumorantigene bis jetzt noch nicht identifiziert worden sind, was die große Mehrheit der Krebse ist. Ferner kann die in APCs einzuführende RNA aus fixierten Gewebeproben gewonnen werden. Fixierte Proben aus Tumorgeweben werden routinemäßig im Verlauf der Krebsdiagnose zubereitet; folglich erfordert die Verwendung von RNA aus solchen Proben es nicht, dass ein Patient einem zusätzlichen invasiven Vorgehen ausgesetzt wird. Da die meisten Krebspatienten niedrige Tumorlasten haben, sind die hierin beschriebenen Verfahren, welche die Isolation und Amplifikation von RNA aus fixierten Tumorgeweben einschließen, besonders wertvoll. Die hierin beschriebenen Verfahren können wirksam verwendet werden, sogar wenn der Tumor selbst eine schlechte Immunogenität zeigt. Zusätzlich sind die hierin beschriebenen APCs nützlich für die Reduktion der Größe von bereits bestehenden Tumoren, einschließlich Metastasen, sogar nach Entfernen des Primärtumors. Schließlich bietet die Erfindung den Vorteil, dass Antigen-präsentierende Zellen, die mit in vitro transkribierter RNA beladen sind, potentere Vakzine sein können, als es Antigen-präsentierende Zellen sind, die mit Peptidantigenen beladen sind.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Grafik, die die primäre in vitro erfolgende OVA-spezifische CTL-Induktion mit den RNA-gepulsten dendritischen Zellen erläutert. DC wurden mit Gesamt-RNA oder polyA⁺-RNA, erhalten aus E.G7-OVA- oder 'EL4-Zellen, oder mit in vitro transkribierter OVA-RNA in der Anwesenheit des kationischen Lipids DOTAP, wie hierin beschrieben, gepulst. Mit dem OVA-Peptid gepulste DC wurden zum Vergleich verwendet. DC und naive T-Zellen wurden für fünf Tage bei R/S-Verhältnissen von 20:1 inkubiert. Lebensfähige Lymphozyten wurden geerntet und die CTL-Aktivität wurde in einem Routine-Europium-Freisetzungstest bestimmt. E.G7-OVA- und EL4-Zellen wurden als Ziele verwendet. Dieses Experiment wurde dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.
2 ist eine Grafik, welche zeigt, dass die Sensibilisierung von mit E.G7-OVA-RNA gepulsten DC für die Stimulation von OVA-spezifischen primären CTL-Antworten durch die polyA⁺-Fraktion von RNA vermittelt wird. DC wurden mit Gesamt-RNA, polyA^–-RNA oder polyA⁺-RNA gepulst und mit naiven T-Zellen in 96-Well-Platten mit U-förmigem Boden für fünf Tage kultiviert. Die polyA⁺-RNA-Fraktion aus E.G7-OVA-Zellen wurde mit einem Gegensinnoligonukleotid, das für die das CTL-Epitop kodierende Region des OVA-Gens spezifisch ist, oder mit einem Kontrolloligonukleotid behandelt, gefolgt von RNase-H-Behandlung, um die hybridisierte RNA zu eliminieren. Mit OVA-Peptid gepulste DC wurden als eine Kontrolle verwendet. E.G7-OVA-, EL4- und RMA-Zellen, gepulst mit dem OVA-Peptid, wurden als Ziele verwendet.
3 ist ein Histogramm, das die Induktion von Antitumorimmunität in vivo in Mäusen nach einer einzelnen Immunisierung mit RNA-gepulsten DC abbildet. DC wurden mit entweder Gesamt- oder polyA⁺-RNA aus E.G7-OVA-Zellen oder EL4-Zellen oder mit in vitro transkribierter OVA-RNA oder Kontroll-Gegensinn-OVA-RNA gepulst. Mäuse wurden mit 2 × 10⁶ DC oder 5 × 10⁶ bestrahlten E.G7-OVA- oder EL4-Zellen, die intraperitoneal injiziert worden sind, immunisiert, gefolgt von einer Herausforderung mit 2 × 10⁷ lebenden E.G7-OVA-Zellen. Mäuse wurden periodisch auf Tumorwachstum untersucht und wurden geschlachtet, wenn der Tumordurchmesser 3-4 cm erreichte. Sämtliche Mäuse wurden an den Tagen 35-40 nach der Herausforderung geschlachtet.
4 ist ein Histogramm, das den Rückgang von spontaner Metastasenbildung in Mäusen, die mit polyA⁺-RNA oder Gesamt-RNA gepulsten DC immunisiert worden sind, in dem B16-F10.9-Melanommodell abbildet. Mäuse erhielten durch Injektion in die Pfote lebende F10.9-Zellen und die Beine wurden amputiert, wenn der Tumordurchmesser 5,5-7,5 mm erreichte. Impfungen wurden zwei Tage nach der Amputation gestartet und es folgten zwei oder mehr Impfungen in wöchentlichen Intervallen. Mäuse wurden intraperitoneal mit DC, die mit 2 × 10⁶ Gesamt-, polyA^–- oder polyA⁺-RNA gepulst worden sind, oder mit bestrahlen F10.9-Zellen oder mit F10.9/K1-Zellen oder mit PBS (als eine Kontrolle) geimpft. Mäuse wurden auf der Basis des Metastasentodes in den nicht immunisierten oder Kontrollgruppen (28-32 Tage nach der Amputation) geschlachtet. Metastasenlasten wurden durch Wiegen der Lungen und durch Auszählen der Anzahl an metastatischen Knötchen beurteilt.
Detaillierte Beschreibung
Bevor detaillierte Arbeitsbeispiele der Erfindung bereitgestellt werden, werden gewisse Parameter der Erfindung allgemein beschrieben.
Eine Anzahl von Verfahren ist geeignet, um Tumor- oder Pathogen-abgeleitete RNA zu erzeugen, welche bei der Erfindung verwendet werden kann. Wie die folgenden Beispiele erläutern, ist es nicht notwendig, dass die RNA den APC in einer gereinigten Form bereitgestellt wird. Vorzugsweise ist die RNA-Probe (d.h. die fraktionierte Tumorzubereitung oder die IVT-RNA-Probe) zu wenigstens 50 %, bevorzugter 75 %, 90 % oder sogar 99 % RNA (w/v). Beim Ausüben der Erfindung werden Antigen-präsentierende Zellen, vorzugsweise kompetente APC wie dendritische Zellen und Makrophagen, verwendet. Solche Zellen können nach zuvor beschriebenen Vorgehensweisen isoliert werden.
Jedes einer Reihe von Verfahren kann verwendet werden, um RNA-enthaltende Tumorzubereitungen herzustellen. Zum Beispiel können die Tumorzubereitungen durch Beschallen von Tumorzellen in einem Säugerzellkulturmedium wie Opti-MEM oder einem Puffer wie phosphatgepufferter Salzlösung hergestellt werden. Ähnlich kann Pathogen-abgeleitete RNA durch Beschallen von pathogenen Bakterien oder Zellen, die ein pathogenes Virus enthalten, hergestellt werden. Andere Verfahren zum Aufbrechen von Zellen sind ebenfalls geeignet, vorausgesetzt, dass das Verfahren nicht vollständig die Tumor- oder Pathogen-abgeleitete RNA abbaut. Typischerweise hat die RNA-Zubereitung 10⁶-10⁸ Zellen/ml, am bevorzugtesten 10⁷ Zellen/ml. Als Alternativen oder zusätzlich zur Beschallung kann die Tumor- oder Pathogen-abgeleitete RNA durch Nutzen von üblichen RNA-Aufreinigungsverfahren wie Guanidinisothiocyanatverfahren und/oder Oligo-dT-Chromatographieverfahren zum Isolieren von polyA⁺-RNA zubereitet werden. Nach konventionellen Verfahren synthetisierte IVT-RNA kann anstelle von RNA in Tumorzubereitungen verwendet werden. Zum Beispiel kann RNA aus einem Tumor oder Pathogen revers zu cDNA transkribiert werden, welche dann durch konventionelle PCR-Techniken amplifiziert wird, um einen im Wesentlichen unbegrenzten Vorrat an cDNA, die dem Tumor- oder Pathogen-RNA-Antigen entspricht, bereitzustellen. Konventionelle In-vitro-Transkriptionstechniken und bakterielle Polymerasen werden dann verwendet, um die IVT-RNA herzustellen. Als eine Alternative hierzu kann die IVT-RNA aus einer klonierten DNA-Sequenz synthetisiert werden, die ein Tumor- oder Pathogen-Polypeptidantigen kodiert. Verfahren zum Identifizieren solcher Antigene sind in der Technik bekannt; es wurden zum Beispiel etliche Melanompeptidantigene identifiziert. Aus cDNA, die identifizierte Peptidantigene kodiert, in vitro transkribierte RNA kann als Tumor- oder Pathogen-spezifische RNA bei der Erfindung dienen. Als eine Alternative hierzu kann RNA aus „Minigenen" transkribiert sein, die aus einem Teil der Tumorantigen-cDNA besteht, welche ein Epitop kodiert. Tumor- oder Pathogen-spezifische RNA kann auch durch Nutzen konventioneller Techniken für Subtraktionshybridisierung hergestellt werden. Zum Beispiel kann eine RNA-Probe aus Tumorzellen oder Nicht-Tumorzellen beim Subtraktionshybridisierungsverfahren verwendet werden, um Tumor-spezifische RNA zu gewinnen.
Falls gewünscht kann die aus Tumor gewonnene oder aus Pathogen gewonnene RNA aus gefrorenen oder fixierten Geweben zubereitet werden. Obwohl dies nicht erforderlich ist, kann die Gewebeprobe für Tumor-spezifische RNA angereichert werden.
Mikroschnitttechniken, die zum Abtrennen von Tumorzellen von Nicht-Tumorzellen geeignet sind, wurden beschrieben (Zhuang et al., 1995, Cancer Res. 55: 467-471; Luqmani et al., 1992, Analy. Biochem. 200: 291-295; Luqmani et al., 1994, Analy. Biochem. 222: 102-109; Turbett et al., 1996, BioTech. 20: 846-853). Wenn die Tumorzellen erst einmal von den Nicht-Tumorzellen abgetrennt sind, kann Tumor-abgeleitete RNA von den Tumorzellen unter Verwendung von bekannten Techniken isoliert werden. Zum Beispiel kann Tumor-abgeleitete polyA⁺-RNA durch Hybridisieren der RNA an eine feste Phase, wie zum Beispiel Oligo(dT), gekoppelt an paramagnetische Perlen (siehe z.B. Raineri et al., 1991, Nucl. Acids. Res. 19: 4010), isoliert werden. Der erste cDNA-Strang wird dann durch reverse Transkription synthetisiert, die RNA wird entfernt und der zweite Strang wird synthetisiert (z.B. mit DNA-Polymerase). Konventionelle In-vitro-Transkriptionsverfahren können dann verwendet werden, um die RNA zu synthetisieren. Andere in der Technik bekannte Verfahren zum Amplifizieren von RNA aus einer kleinen Anzahl an Zellen oder sogar einer einzelnen Zelle können bei der Erfindung ebenfalls verwendet werden.
Ein RNA-Molekül, das ein Tumor- oder Pathogenantigenepitop kodiert, kann, falls gewünscht, so verändert werden, dass es auch eine Zell-Trafficking-Signalsequenz kodiert. Solch ein chimäres RNA-Molekül kann unter Verwendung von konventionellen Techniken der Molekularbiologie erzeugt werden. Die chimäre RNA, welche in eine APC eingeführt wird, kodiert ein chimäres Polypeptid, welches ein Antigen enthält, das an eine Traffickingsequenz gekoppelt ist, welche das chimäre Polypeptid in den MHC-Klasse-II-Antigenpräsentationsweg lenkt. Zum Beispiel können die bei dieser Ausführung der Erfindung genutzte Traffickingsequenzen das Trafficking des Polypeptids zu dem endoplasmatischen Retikulum (ER), einem Lysosom oder einem Endosom lenken und schließen Signalpeptide (die aminoterminalen Sequenzen, die während der Translation Proteine in das ER lenken), ER-Retentionspeptide wie KDEL (Sequenz ID Nr. 1), und Lysosom-Targeting-Peptide wie KFERQ (Sequenz ID Nr. 2), QREK (Sequenz ID Nr. 3), und andere Pentapeptide mit Q, die auf einer Seite durch vier Reste flankiert sind, ausgewählt aus K, R, D, E, F, I, V und L, ein. Ein bevorzugtes Signalpeptid, das bei der Erfindung verwendet werden kann, ist das LAMP-1-Sortiersignal (Wu et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 11671-11674; Lin et al., 1996, Cancer Research 56: 21-26). Ein anderes Beispiel eines Signalpeptids, das bei der Erfindung nützlich ist, ist ein Signalpeptid, das im Wesentlichen identisch ist mit jenem einer MHC-Untereinheit wie Klasse II α und β; zum Beispiel ist das Signalpeptid von MHC Klasse II α in der Sequenz MAISGVPVLGFFIIAVLMSAQESWA (Sequenz ID Nr. 4) enthalten. Falls gewünscht mag das durch die RNA der Erfindung kodierte Signalpeptid nur einen Teil (typischerweise wenigstens zehn Aminosäurereste) der spezifizierten 25-Restesequenz einschließen, vorausgesetzt, dass der Teil das Trafficking des Polypeptids zu dem ER bewirkt.
Für das Einführen der Tumor- oder Pathogen-abgeleiteten RNA in eine Antigenpräsentierende Zelle geeignete Transfektionsverfahren sind in der Technik bekannt. Zum Beispiel können 5-50 μg RNA in 500 μl Opti-MEM mit einem kationischen Lipid in einer Konzentration von 10-100 μg vermischt werden und bei Raumtemperatur für 20-30 Minuten inkubiert werden. Andere geeignete Lipide schließen LIPOFECTIN^TM (1:1 (w/w) DOTMA:DOPE), LIPOFECTAMINE^TM (3:1 (w/w) DOSPA:DOPE), DODAC:DOPE (1:1), CHOL:DOPE (1:1), DMEDA, CHOL, DDAB, DMEDA, DODAC, DOPE, DORI, DORIE, DOSPA, DOTAP und DOTMA ein. Der resultierende RNA-Lipid-Komplex wird dann zu 1-3 × 10⁶ Zellen, vorzugsweise 2 × 10⁶ Antigen-präsentierenden Zellen in einem Gesamtvolumen von ungefähr 2 ml (z.B. in 0pti-MEM) hinzugefügt und bei 37 °C für 2-4 Stunden inkubiert. Alternativ kann die RNA in die Antigen-präsentierenden Zellen eingeführt werden durch Nutzen von konventionellen Techniken, wie zum Beispiel Elektroporation oder Calciumphosphattransfektion mit 1-5 × 10⁶ Zellen und 5-50 μg RNA. Typischerweise werden 5-20 μg polyA⁺-RNA oder 25-50 μg Gesamt-RNA verwendet.
Wenn die RNA als eine Tumor- oder Pathogenzubereitung bereitgestellt wird, wird die Zubereitung typischerweise fraktioniert oder anderweitig behandelt, um die Konzentration an Proteinen, Lipiden und/oder DNA in der Zubereitung zu reduzieren und um die Zubereitung für RNA anzureichern. Zum Beispiel können in der Technik bekannte RNA-Aufreinigungsverfahren verwendet werden, um wenigstens teilweise die RNA von den Tumorzellen oder dem Pathogen zu reinigen. Es ist auch akzeptabel, dass die RNA-Zubereitung mit Proteasen oder RNase freien DNasen behandelt wird. Selbstverständlich kann die RNA unter Verwendung von in der Technik bekannten nukleaseresistenten Analoga oder Derivaten synthetisiert werden, um die RNA weniger empfänglich für Ribonukleasen zu machen.
Falls gewünscht kann einen Immunmodulator, wie z.B. ein Cytokin oder ein Co-Stimulationsfaktor, kodierende RNA in die RNA-beladenen APCs der Erfindung eingeführt werden. Bei dieser Ausführung der Erfindung kann die den Immunmodulator kodierende RNA in die APC vor, gleichzeitig mit oder nach dem Einführen der Tumor- oder Pathogenabgeleiteten RNA eingeführt werden. Die hierin beschriebenen Verfahren zum Einführen von Tumor-abgeleiteter oder Pathogen-abgeleiteter RNA in die APC sind ebenfalls geeignet für das Einführen von RNA, die einen Immunmodulator kodiert (z.B. ein Cytokin oder einen Co-Stimulationsfaktor), in die APC. Sequenzen, die zahlreiche Proteine kodieren, sind in der Technik bekannt und können bei der Erfindung verwendet werden. Falls gewünscht kann zwei oder mehr Immunmodulatoren kodierende RNA in die APC eingeführt werden. Typischerweise werden 5-20 μg jeder RNA in die APC eingeführt, wie oben für Tumor- und Pathogen-abgeleitete RNA beschrieben.
Die mit RNA beladenen Antigen-präsentierenden Zellen der Erfindung können verwendet werden, um CTL-Proliferation in vivo oder ex vivo zu stimulieren. Die Fähigkeit von RNA-beladenen Antigen-präsentierenden Zellen, eine CTL-Antwort zu stimulieren, kann gemessen oder detektiert werden durch Messen oder Detektieren von T-Zell-Aktivierung, zum Beispiel, in einem konventionellen Zytotoxizitätstest. In unten bereitgestellten Beispielen schließt der Zytotoxizitätstest das Untersuchen der Fähigkeit der Effektorzellen Zielzellen zu lysieren ein. Falls gewünscht können die Zielzellen in Übereinstimmung mit der Erfindung hergestellte RNA-beladene APCs sein, d.h. APCs, die einen RNA-kodierten Zelloberflächentumor oder ein Antigenepitop eines Pathogens präsentieren, der T-Zellproliferation induziert. Wie unten beschrieben kann der häufig verwendete Europium-Freisetzungstest verwendet werden, um CTL-Sensitivierung zu untersuchen. Typischerweise werden 5-10 × 10⁶ Zielzellen mit Europiumdiethylentriaminpentaacetat für 20 Minuten bei 4 °C markiert. Nach etlichen Waschschritten werden 10⁴ Europium-markierte Zielzellen und Reihenverdünnungen von Effektorzellen in einem Effektor-Ziel-Verhältnis im Bereich von 50:1 bis 6,25:1 in 200 μl RPMI 1640 mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalen Kälberserum in 96-Well-Platten inkubiert. Die Platten werden bei 500 × g für drei Minuten zentrifugiert und dann bei 37 °C in 5 % CO₂ für vier Stunden inkubiert. Eine 50μl-Aliquote des Überstands wird gesammelt und die Europium-Freisetzung wird durch zeitaufgelöste Fluoreszenz (Volgmann et al., J. Immunol. Methods 119: 45-51, 1989) gemessen.
Bei einem alternativen Verfahren zum Detektieren der CTL-Sensitivierung wird eine Zunahme in der Cytokinsekretion durch die CTL detektiert, im Verhältnis zu dem Spiegel an Cytokinsekretion vor dem In-Kontakt-Bringen der CTL mit einer RNA-beladenen APC. In-situ-Hybridisierungstests wie ELISPOT-Tests können verwendet werden, um die Sekretion von Cytokinen wie TNF-α und/oder γ-Interferon zu detektieren.
Beispiele
Von den folgenden Arbeitsbeispielen wird gedacht, dass sie die Erfindung erläutern, nicht beschränken. Als erstes werden die bei diesen Beispielen verwendeten Verfahren beschrieben.
Mäuse
Sieben bis acht Wochen alte und ausgesonderte weibliche C57BL/6-Zuchtmäuse (H-2^b) wurden von dem Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erhalten.
Zelllinien
Der F10.9-Klon des B16-Melanoms mit Ursprung in C57BL/6 ist eine stark metastasierende, schwach immunogene und geringfügig Klasse-I-exprimierende Zelllinie. F10.9/K1 ist eine gering metastasierende und hoch immunogene Zelllinie, gewonnen durch das Transfizieren von F 10.9-Zellen mit Klasse-I-Molekül, H-2K^b-cDNA. RMA- und RMA-S-Zellen werden aus dem mit Rauscher-Leukämievirus induzierten T-Zelllymphom RBL-5 mit Ursprung in C57BL/6 (H-2^b) gewonnen. Andere verwendete Zelllinien waren EL4 (C57BL/6, H-2^b, Thymom), E.G7-OVA (mit der cDNA aus Hühnerovalbumin (OVA) transfizierte EL4-Zellen), A20 (H-2^d-B-Zelllymphom) und L929 (H-2^k-Fibroblasten). Zellen wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS), 25 mM Hepes, 2 mM L-Glutamin und 1 mM Natriumpyruvat, gehalten. E.G7-OVA-Zellen wurden in Medium, ergänzt mit 400 μg/ml G418 (GIBCO, Grand Island, NY gehalten und F10.9/K1-Zellen wurden in 800 μg/ml G418 enthaltendem Medium gehalten.
Antigen-präsentierende Zellen und Responder-T-Zellen
Aus naiven weiblichen ausgesonderten C57BL/6-Zuchttieren gewonnene Splenozyten wurden mit Ammoniumchlorid-Tris-Puffer für drei Minuten bei 37 °C behandelt, um rote Blutzellen abzureichern. Splenozyten (3 ml) mit 2 × 10⁷ Zellen/ml wurden über eine 2ml-Metrizamidgradientensäule (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norwegen; Analysegüte, 14,5 g zu 100 ml PBS hinzugefügt, pH 7,0) geschichtet und bei 600 × g für 10 Minuten zentrifugiert. Die für dendritische Zellen angereicherte Fraktion aus der Zwischenschicht wurde durch Anheften für 90 Minuten weiter angereichert. Anhaftende Zellen (überwiegend dendritische Zellen (DC) und einige wenige kontaminierende Makrophagen (Mϕ)) wurden durch sanftes Abkratzen wiedergewonnen und einer zweiten Anhaftungsrunde bei 37 °C für 90 Minuten ausgesetzt, um die kontaminierenden Mϕ abzureichern. Nicht anhaftende Zellen wurden vereinigt als Milz-DC und die FACS-Analyse zeigte ungefähr 80 % bis 85 % DC (mAb 33D1), 1-2 % Mϕ (mAb F4/80), 10 % T-Zellen und < 5 % B-Zellen (Daten nicht gezeigt).
Das Pellet wurde resuspendiert und für Mϕ durch zwei Anhaftungsrunden bei 37 °C für jeweils 90 Minuten angereichert. Mehr als 90 % der anhaftenden Population wurde als Mϕ durch FACS-Analyse identifiziert, mit 5 % Lymphozyten und > 55 % DC.
B-Zellen wurden aus der nicht anhaftenden Population (B- und T-Zellen) durch Schwenken auf anti-Ig-überzogenen Platten abgetrennt. Die abgetrennte Zellpopulation, welche zu > 90 % T-Lymphozyten durch FACS-Analyse umfasste, wurde als Responder-T-Zellen verwendet.
Isolierung von zellulärer Gesamt- und polyA⁺-RNA
Gesamt-RNA wurde aus aktiv wachsenden Gewebekulturzellen wie zuvor beschrieben (Chomczynski und Sacchi, 1987, Analy. Biochem, 162: 156-159) isoliert. Kurz, 10⁷ Zellen wurden in 1 ml Guanidinisothiocyanat-(GT-)Puffer (4 M Guanidinisothiocyanat, 25 mM Natriumcitrat, pH 7,0, 0,5 % Sarcosyl, 20 mM EDTA und 0,1 M 2-Mercaptoethanol) lysiert. Die Proben wurden verwirbelt, worauf nacheinander die Zugaben von 100 μl M Natriumacetat, 1 ml wassergesättigtes Phenol und 200 μl Chlorophorm:Isoamylalkohol (49:1) folgten. Suspensionen wurden verwirbelt und dann auf Eis für 15 Minuten gestellt. Die Röhrchen wurden bei 1000 × g bei 4 °C für 20 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde vorsichtig in ein frisches Röhrchen übertragen. Ein gleiches Volumen an Isopropanol wurde hinzugefügt und die Proben wurden bei –20 °C für wenigstens eine Stunde abgestellt. RNA wurde durch Zentrifugation wie oben pelletiert. Das Pellet wurde in 300 μl GT-Puffer resuspendiert und wurde dann in ein Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. RNA wurde wiederum durch Hinzufügen eines gleichen Volumens an Isopropanol und durch Stellen der Röhrchen bei –20 °C für wenigstens eine Stunde gefällt. Die Röhrchen wurden bei einer hohen Geschwindigkeit bei 4 °C für 20 Minuten mikrozentrifugiert. Überstände wurden dekantiert und die Pellets wurden einmal mit 70 % Ethanol gewaschen. Den Pellets wurde bei Raumtemperatur erlaubt zu trocknen und sie wurden dann in TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,4) resuspendiert. Möglicherweise kontaminierende DNA wurde durch Inkubieren der RNA-Probe in 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT und 4 U/ml RNase-freie DNase (Boehringer-Mannheim) für 15 Minuten bei 37 °C entfernt. Die Lösung wurde eingestellt auf 10 mM Tris, 10 mM EDTA, 0,5 % SDS und 1 mg/ml Pronase (Boehringer-Mannheim), gefolgt von Inkubation bei 37 °C für 30 Minuten. Proben wurden einmal mit Phenol-Chloroform extrahiert und einmal mit Chloroform; RNA wurde wiederum in Isopropanol bei –20 °C gefällt. Nach Zentrifugation wurden die Pellets mit 70 % Ethanol gewaschen, dann luftgetrocknet und in sterilem Wasser resuspendiert. Gesamt-RNA wurde durch Messen der optischen Dichte (OD) bei 260 und 280 nm quantifiziert. Die OD260/280-Verhältnisse lagen typischerweise bei 1,65-2,0. Die RNA wurde bei –70 °C gelagert.
PolyA⁺-RNA wurde entweder aus Gesamt-RNA unter Verwendung eines OLIGOTEX^TM-polyA⁺-Aufreinigungskits (Qiagen) oder direkt aus Gewebekulturzellen unter Verwendung des Messenger RNA Isolation Kit (Stratagene) isoliert, wie durch die Protokolle der Hersteller vorgegeben. Falls gewünscht können als Alternative konventionelle Verfahren verwendet werden, um polyA⁺-RNA zuzubereiten.
Produktion von in vitro transkribierter RNA
Das 1,9 kb große EcoRI-Fragment von Hühnerovalbumin-cDNA in pUC18 (McReynolds et al., 1978, Nature 273: 723), enthaltend die kodierende Region und die 3'-untranslatierte Region, wurde in die EcoRI-Stelle von pGEM4Z (Promega) kloniert. Klone, die das Insert sowohl in Sinn- als auch Gegensinnorientierungen enthielten, wurden isoliert und Plasmidpräparationen im großen Maßstab wurden unter Verwendung des Maxi Prep Kits TM-Plasmidpräparationskits (Qiagen) gemacht. Plasmide wurden mit BamHI für die Verwendung als Matrizen für die In-vitro-Transkription linearisiert. Transkription wurde durchgeführt bei 37 °C für drei bis vier Stunden unter Verwendung des MEGAscript In Vitro Transcription Kit TM (Ambion) gemäß dem Protokoll des Herstellers und durch Einstellen der GTP-Konzentration auf 1,5 mM und Einschließen von 6 mM m⁷G(5¹)ppp(5¹)G-Cap-Analog (Ambion). Andere konventionelle In-vitro-Transkriptionsverfahren sind ebenfalls geeignet. Matrizen-DNA wurde mit RNase-freier DNase 1 verdaut und RNA wurde durch Phenol:Chloroform- und Chloroform-Extraktion wiedergewonnen, gefolgt von Isopropanolfällung. RNA wurde durch Mikrozentrifugation pelletiert und das Pellet wurde einmal mit 70 % Ethanol gewaschen. Das Pellet wurde luftgetrocknet und in sterilem Wasser resuspendiert.
RNA wurde für 30 Minuten bei 30 °C in 20 mM Tris-HCl, pH 7,0, 50 mM KCl, 0,7 mM MnCl₂, 0,2 mM EDTA, 100 μg/ml acetyliertes BSA, 10 % Glycerol, 1 mM ATP und 5000 U/ml Hefe-Poly(A)-Polymerase (United States Biochemical) inkubiert. Die mit Kappen versehene polyadenylierte RNA wurde durch Phenol:Chloroform- und Chloroformextraktion wiedergewonnen, gefolgt von Isopropanolfällung. RNA wurde durch Mikrozentrifugation pelletiert und das Pellet wurde einmal mit 70 % Ethanol gewaschen. Das Pellet wurde luftgetrocknet und in sterilem Wasser resuspendiert. RNA wurde durch Messen der OD bei 260 und 280 nm quantifiziert und die RNA wurde bei –70 °C gelagert.
Oligodesoxynukleotidgerichtete Spaltung von OVA-mRNA durch RNase H
Das für die ortsspezifische RNase-H-Spaltung von Ovalbumin-mRNA verwendete Vorgehen wurde ausgehend von jenem zuvor Beschriebenen (Donis-Keller, 1979, Nucl. Acid. Res. 7: 179-192) angepasst. Kurz, 5-10 μg mRNA aus E.G7-OVA-Zellen wurden in 20 mM HEPES-KOH, pH 8,0, 50 mM KCl, 4 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 50 μg/ml BSA und 2 μM von entweder dem Oligodesoxynukleotid 5'-CAG TTT TTC AAA GTT GAT TAT ACT-3' (Sequenz ID Nr. 5), das an die Sequenz in der OVA-mRNA hybridisiert, welche für das CTL-Epitop SIINFEKL (Sequenz ID Nr. 6) kodiert, oder dem Oligodesoxynukleotid 5'-TCA TAT TAG TTG AAA CTT TTT GAC-3' (Sequenz ID Nr. 7) (Oligos, Etc.), welches als eine Negativkontrolle diente, suspendiert. Die Proben wurden auf 50 °C für drei Minuten erhitzt, gefolgt von Inkubation bei 37 °C für 30 Minuten. RNase H (Boehringer-Mannheim) wurde mit 10 U/ml hinzugefügt und die Verdauung schritt für 30 Minuten bei 37 °C fort. RNA wurde durch Phenol:Chloroform- und Chloroformextraktion wiedergewonnen, gefolgt von Isopropanolfällung. RNA wurde durch Mikrozentrifugation pelletiert und das Pellet wurde einmal mit 70 % Ethanol gewaschen. Das Pellet wurde dann luftgetrocknet und in sterilem Wasser resuspendiert. Spaltung von OVA-mRNA wurde durch mit Oligo dT geprimter reverser Transkription von Test- und Kontrollproben bestätigt, gefolgt von PCR mit OVA-spezifischen Primern, welche die Spaltstelle flankieren. PCR mit Actin-spezifischen Primern wurde verwendet, um zwischen Test- und Kontrollproben zu kontrollieren.
Pulsen von APC
APC wurden zweimal in Opti-MEM-Medium (GIBCO, Grand Island, NY gewaschen. Zellen wurden in Opti-MEM-Medium mit 2-5 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert und zu 15 ml Polypropylenröhrchen (Falcon) hinzugefügt. Das kationische Lipid DOTAP (Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) wurde verwendet, um RNA an Zellen zuzuführen (Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7915-7918). RNA (in 250-500 μl Opti-MEM-Medium) und DOTAP (in 250-500 μl Opti-MEM-Medium) wurden in einem 12 × 75mm-Polystyrolröhrchen bei Raumtemperatur (RT) für 20 Minuten vermischt. Das routinemäßig verwendete RNA-DOTAP-Verhältnis war 1:2 und variierte in gewissen Experimenten zwischen 2:1 und 1:2. Der Komplex wurde zu den APC (2-5 × 10⁶ Zellen) in einem Gesamtvolumen von 2 ml hinzugefügt und bei 37 °C in einem Wasserbad mit gelegentlichem Schütteln für zwei Stunden inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und als Simulatoren für die primäre CTL-Induktion in vitro verwendet.
Das synthetische Peptid, das das CTL-Epitop in Hühnerovalbumin OVA kodiert, aa 257-264 SIINFEKL (H-2K^b) (Sequenz ID Nr. 6), wurde für das Peptidpulsen verwendet. Das Peptid hatte unblockierte (freie) Amino- und Carboxylenden (Research Genetics, Birmingham, AL). Peptide wurden in serumfreiem IMDM gelöst und bei –20 °C gelagert.
Induktion von CTL in vitro
T-Zellen (5 × 10⁶ Zellen/ml) und RNA- oder Peptid-gepulste APC (2,5 × 10⁵ Zellen/ml) wurden in IMDM mit 10 % FCS, 1 mM Natriumpyruvat, 100 IU/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin und 5 × 10^–5 M β-Mercaptoethanol in 96-Well-Platten mit U-förmigem Boden kultiviert, um ein R/S-Verhältnis von 20:1 zu ergeben. Nach fünf Tagen wurden die Zellen als Effektoren in einem vierstündigen Standard-Europium-Freisetzungstest verwendet.
Zytotoxizitätstest
Bei diesen Tests wurden 5-10 × 10⁶ Zielzellen mit Europium-Diethylentriaminpentaacetat für 20 Minuten bei 4 °C markiert. Nach etlichen Waschschritten wurden 10⁴ mit Europium markierte Zielzellen und Reihenverdünnungen von Effektorzellen in Effektor-Zielzellen-Verhältnissen von 50:1 bis 6,25:1 in 200 μl RPMI 1640 mit 10 % hitzeinaktiviertem FCS in 96-Well-Platten mit V-förmigem Boden inkubiert. Die Platten wurden bei 500 × g für drei Minuten zentrifugiert und bei 37 °C und 5 % CO₂ für vier Stunden inkubiert. 50 μl des Überstandes wurden geerntet und Europium-Freisetzung wurde durch zeitaufgelöste Fluoreszenz gemessen (Delta-Fluorometer, Wallace Inc., Gaithersburg, MD). Die spontane Freisetzung war geringer als 25 %. Standardabweichungen (SE) der Mittelwerte von dreifachen Kulturen waren niedriger als 5 %.
Immuntherapie
E.G7-OVA-Modell: C57BL/6-Mäuse wurden einmal mit bestrahlten, RNA-gepulsten APC (2 × 10⁶ Zellen/Maus) oder 5 × 10⁶ E.G7-OVA- oder EL4-Zellen immunisiert. 10-14 Tage nach der Immunisierung wurden die Mäuse mit 2 × 10⁷ lebenden E.G7-OVA-Zellen, die subkutan in die Flankenregion injiziert worden sind, herausgefordert. Mäuse wurden auf einer regulären Basis für Tumorwachstum und -größe überwacht. Mäuse mit Tumorgrößen von >3,5 cm wurden geschlachtet. Alle Überlebenden wurden 40 Tage nach der Herausforderung geschlachtet.
F10.9-B16-Melanommodell: Mäuse wurden durch Injektion von 2 × 10⁵ F10.9-Zellen in die Fußpfote erhalten. Das Protokoll nach der Operation war im Wesentlichen wie zuvor beschrieben (Porgador et al., 1995, Cancer Res. 55: 4941-4949). Die Beine der Mäuse wurden amputiert, wenn der lokale Tumor in der Fußpfote einen Durchmesser von 5,5-7,5 mm hatte. Die Mortalität nach der Amputation war geringer als 5 %. Zwei Tage nach der Amputation wurden die Mäuse intraperitoneal immunisiert, gefolgt von zwei wöchentlichen Impfungen für insgesamt drei Impfungen. Die Mäuse wurden auf der Basis des metastatischen Todes in den nicht-immunisierten oder Kontrollgruppen geschlachtet (an den Tagen 28-32 nach der Amputation). Die Metastaselasten wurden durch Wiegen der Lungen und durch Auszählen der Anzahl an metastatischen Knötchen bewertet.
Induktion einer primären CTL-Antwort in vitro unter Verwendung dendritischen Zellen, die mit Hühnerovalbumin-RNA transfiziert worden sind
Die Fähigkeit von RNA-gepulsten Milzdendritenzellen (DC), gewonnen aus C57BL/6-(H-2K^b)-Mäusen, eine primäre CTL-Antwort in vitro zu induzieren, wurde in dem E.G7-OVA-Tumorsystem gezeigt. E.G7-OVA-Zellen wurden aus der EL4-Tumorzelllinie (H-2K^b-Haplotyp) durch Transfektion mit der Hühnerovalbumin-cDNA abgeleitet (Moore et al., 1988, Cell 54: 777-785). Das Hühnerovalbumin kodiert ein einzelnes dominantes Epitop (aa 257-264) in C57BL/6-Mäusen (Rotzschke et al., 1991, Euro. Journal Immunology, 21: 2891-2891).
Mit dem OVA-Peptid (aa 257-264) gepulste dendritische Zellen, inkubiert mit T-Zellen aus naiven Mäusen, induzieren eine potente CTL-Antwort in vitro (1). Dieses Beispiel zeigt, dass RNA als eine Antigenquelle verwendet werden kann, um DC zu sensibilisieren, um Antigen an CD8⁺-T-Zellen zu präsentieren. Milz-DC wurden aus C57BL/6-Mäusen isoliert und mit OVA-Peptid gepulst oder mit RNA inkubiert, die in vitro aus einem Plasmid synthetisiert worden ist, welches die Hühnerovalbumin-cDNA kodiert (OVA-IVT-RNA), und verwendet, um eine OVA-spezifische primäre CTL-Antwort in vitro zu stimulieren. Wie in 1 gezeigt waren sowohl mit OVA-Peptid als auch mit OVA-IVT-RNA gepulste DC in der Lage, eine OVA-spezifische primäre CTL-Antwort zu induzieren (1). RNA-gepulste DC waren durchgängig effektivere Stimulatoren als Peptid-gepulste DC. Um zu prüfen, ob aus E.G7-OVA-Zellen isolierte RNA in der Lage war, DC zu sensibilisieren, um eine primäre, OVA-spezifische CTL-Antwort zu stimulieren, wurde Gesamt-RNA oder polyA⁺-RNA aus E.G7-OVA oder EL4-Zellen isoliert und mit DC inkubiert. Wie in 1 gezeigt waren DC, die mit entweder Gesamt- oder polyA⁺-RNA aus E.G7-OVA-Zellen aber nicht aus EL4-Zellen gepulst worden sind, in der Lage, eine starke OVA-spezifische CTL-Antwort zu induzieren. Überraschenderweise waren mit unfraktionierter RNA, Gesamt- oder polyA⁺-RNA gepulste DC so potente Induktoren einer primären CTL-Antwort wie DC, die mit dem ein definiertes CTL-Epitop kodierenden OVA-Peptid gepulst worden waren. Die Stimulation einer CTL-Antwort durch mit (Gesamt- oder polyA⁺-)EL4-RNA gepulste DC lag nur geringfügig über dem Hintergrund und war statistisch nicht signifikant (Vergleiche mit der Lyse von EL4-Zielzellen durch mit OVA-Peptid stimulierte CTL oder mit OVA-IVT-RNA gepulste DC), was die Immundominanz des OVA-Epitops und die verhältnismäßige Schwäche der EL4-kodierten Antigene widerspiegelt.
Wie durch 2 erläutert waren Gesamt-RNA, ebenso wie polyA⁺-RNA, aber nicht polyA^–-RNA, isoliert aus E.G7-OVA-Zellen, in der Lage, DC zu sensibilisieren, um eine primäre CTL-Antwort zu stimulieren. Um zu beweisen, dass die Sensibilisierung von DC in der Tat durch RNA vermittelt wird, wurde polyA⁺-RNA aus E.G7-OVA-Zellen mit entweder einem Gegensinnoligonukleotid, das die Sequenz überspannt, welche das einzelne CTL-Epitop, das in dem Hühnerovalbumingen vorhanden ist, kodiert, oder mit einem Kontrolloligodesoxynukleotid inkubiert, und dann mit RNase H behandelt, um jede RNA-Sequenz zu entfernen, an welche die Oligodesoxynukleotidsonde hybridisiert hatte. Wie in 2 gezeigt, wurde die Induktion einer primären, OVA-spezifischen CTL-Antwort aufgehoben, wenn die polyA⁺-RNA mit dem Gegensinn-, aber nicht mit dem Kontrolloligodesoxynukleotid inkubiert worden ist. 2 zeigt auch, dass Zellen, die das vollständige Ovalbumingen exprimieren, E.G7-OVA-Zellen, und RMA-S-Zellen, die mit dem acht Aminosäuren langen OVA-Peptid, welches das einzelne dominante CTL-Epitop kodiert, gepulst worden sind, zu einem ähnlichen Ausmaß nach Stimulation mit Gesamt- oder polyA⁺-E.G7-OVA-RNA gepulsten DC lysiert werden. Dies zeigt deshalb, dass die Mehrheit der durch E.G7-OVA-RNA gepulsten DC präsentierten Epitope dem zuvor definierten, einzelnen dominanten CTL-Epitop, das in dem Hühnerovalbumingen kodiert wird, entspricht.
Induktion von Antitumorimmunität durch mit Tumor-RNA gepulste DC
Dieses Beispiel zeigt, dass die Impfung von Mäusen mit OVA-RNA-gepulsten DC einen Schutz gegen eine Herausforderung mit E.G7-OVA-Tumorzellen bereitstellte. Mäuse wurden einmal mit 2 × 10⁶ RNA-gepulsten DC oder mit 5 × 10⁶ bestrahlten E.G7-OVA-Zellen immunisiert. Zehn Tage später wurden Mäuse mit einer tumorigenen Dosis von E.G7-OVA-Zellen herausgefordert. Das Auftreten und die Größe des Tumors wurden auf einer regulären Basis bestimmt. 3 zeigt die Größe der Tumoren am Tage 37 nach der Tumorimplantation. Die durchschnittliche Tumorgröße in mit bestrahlten EL4-Zellen immunisierten Mäusen war 25 cm, während die durchschnittliche Tumorgröße in mit den OVA-exprimierenden EL4-Zellen (E.G7-OVA) immunisierten Tieren nur 7,03 cm war. Dieser Unterschied ist eine Widerspiegelung der hohen Immunogenität des Hühner-OVA-Antigens, exprimiert in EL4-Zellen, und der schwachen Immunogenität der elterlichen EL4-Tumorzelllinie. Die Impfung mit RNA-gepulsten DC (Gesamt- oder polyA⁺-Fraktion), gewonnen aus E.G7-OVA-Zellen, war so wirksam wie die Impfung mit den hoch immunogenen E.G7-OVA-Zellen (Durchschnittstumorgröße 7 cm). Impfung mit DC, die mit Gesamt- oder polyA⁺-RNA, gewonnen aus EL4-Tumorzellen, inkubiert worden sind, hatte eine leicht schützende Wirkung (durchschnittliche Tumorgröße: 22 cm bzw. 19,5 cm), welche nicht statistisch signifikant war, in Übereinstimmung mit der schwachen bis nicht detektierbaren Immunogenität von EL4-abgeleiteten Antigenen. In Übereinstimmung mit den primären CTL-Induktionsdaten (1) stellt die Impfung von Mäusen mit OVA-IVT-RNA-gepulsten DC die wirksamste Antitumorantwort bereit (durchschnittliche Tumorgröße: 3,9 cm), während Impfung mit der Kontroll-Gegensinn-OVA-IVT-RNA eine signifikante schützende Antwort nicht auslöste.
Die Potenz von mit aus Tumor abgeleiteter RNA gepulsten DC wurde weiter in dem B16/F10.9-(H-2^b)-Melanommetastasemodell bewertet. Der B16/F10.9-Melanomtumor ist schwach immunogen, exprimiert niedrige Spiegel an MHC-Klasse I-Molekülen und ist hoch metastasierend, sowohl in experimentellen als auch in spontanen Metastasetestsystemen (Porgador et al., 1996, J. Immunology 156: 1772-1780). Porgador et al. zeigten, dass, wenn Impfungen nach dem Entfernen des primären Tumorimplantates durchgeführt worden sind, nur bestrahlte Tumorzellen, die sowohl mit dem IL-2- als auch den H-2K^b-Genen transduziert worden sind, in der Lage sind, signifikant die Metastasenausbreitung von B16/F10.9-Tumorzellen in der Lunge zu beeinträchtigen (Porgador et al., 1995, Cancer Research 55: 4941-4949). Folglich stellt das B16/F10.9-Melanommodell und das von Porgador et al. verwendete experimentelle Design ein stringentes und klinisch relevantes experimentelles System dar, um die Wirksamkeit von Begleitbehandlungen für metastasierenden Krebs zu bewerten.
Um zu zeigen, dass die Immunisierung mit Tumor-RNA-gepulsten DC in Übereinstimmung mit der Erfindung in der Lage war, die Regression von bereits bestehenden Lungenmetastasen zu bewirken, wurden primäre Tumore durch Implantation von B16/F10.9-Tumorzellen in die Fußpfote induziert. Wenn die Fußpfote einen Durchmesser von 5,5-7,5 mm erreichte, wurden die Tumoren chirurgisch entfernt. Zwei Tage später wurden Mäuse mit bestrahlten B16/F10.9-Zellen, die mit dem H-2K^b-Gen transduziert worden sind (F10.9K1), oder mit RNA-gepulsten DC-Zubereitungen immunisiert (4). Die Mäuse erhielten insgesamt drei Impfungen, die in wöchentlichen Intervallen gegeben worden sind. Das durchschnittliche Lungengewicht einer normalen Maus beträgt 0,18-0,22 g. Mit PBS (einer Negativkontrolle) behandelte Mäuse waren von Metastasen überwältigt. Das mittlere Lungengewicht von Mäusen bei dieser Behandlungsgruppe war 0,81 g; annähernd 3/4 des Gewichtes trugen die Metastasen bei, welche zu viele waren, um ausgezählt zu werden (> 100 Knötchen). Eine ähnliche Metastaselast wurde gesehen, wenn Mäuse mit bestrahlten B16/10.9-Zellen behandelt worden sind (Daten nicht gezeigt), was zahlreiche vorangegangene Beobachtungen bestätigt, dass die Behandlung mit bestrahlten B16/F10.9-Tumorzellen alleine keinen therapeutischen Nutzen bei diesem Tumormodell hat. Wie ebenfalls zuvor gezeigt, hatte eine Immunisierung mit H-2K^b-exprimierenden B16/F10.9-Zellen (F10.9K1, als eine Positivkontrolle) einen mäßigen therapeutischen Nutzen, wie angezeigt durch eine statistisch signifikante Abnahme in dem durchschnittlichen Lungengewicht der Tiere in dieser Behandlungsgruppe. Es wurde jedoch ein dramatisches Ansprechen bei Tieren gesehen, die mit DC behandelt worden sind, welche mit aus F10.9-Zellen in Übereinstimmung mit der Erfindung abgeleiteter Gesamt-RNA gepulst worden sind. Das mittlere Lungengewicht der Mäuse in dieser Behandlungsgruppe war 0,37 g. Ein signifikant dramatisches Ansprechen wurde auch bei Mäusen beobachtet, die mit DC behandelt worden sind, welche mit aus F10.9-Zellen in Übereinstimmung mit der Erfindung gewonnener polyA⁺-RNA gepulst worden sind (Durchschnittslungengewicht: 0,42 g). Im Gegensatz dazu wurde keine statistisch signifikante Reduktion der Metastaselast in Mäusen gesehen, welche mit DC behandelt worden sind, die mit entweder der aus F 10.9-Zellen abgeleiteten polyA^–-RNA-Fraktion oder mit aus EL4-Tumorzellen isolierter Gesamt-RNA gepulst worden sind.
Die Beobachtung, dass das OVA-Protein exprimierende Zellen (E.G7-OVA) oder mit dem OVA-Peptid gepulste Zellen wirksam durch CTL lysiert worden sind, und die Sensibilisierung von mit polyA⁺-RNA fraktionierten DC legen stark nahe, dass die RNA-vermittelte Stimulation von CTL über die Translation der Eingabe-RNA und die Erzeugung der vorhergesagten auf Klasse I beschränkten Epitope geschieht, in diesem Falle ein einzelnes dominantes Epitop, das in dem Hühner-OVA-Peptid kodiert ist. Diese Daten zeigen, dass die RNA-vermittelte Sensibilisierung von DC wirksamer ist als das Pulsen mit Peptid, da die transfizierte RNA als eine kontinuierliche Quelle für die Produktion von antigenischen Peptiden dienen kann.
Therapeutische Verwendung
Die Erfindung kann verwendet werden, um die Tumorbildung in einem Patienten zu behandeln oder zu verhindern (z.B. Melanomtumore, Blasentumore, Brustkrebstumore, Kolonkrebstumore, Prostatakrebstumore und Eierstockkrebstumore). Ähnlich kann die Erfindung verwendet werden, um Infektion in einem Patienten mit einem Pathogen wie ein Bakterium (z.B. Salmonella, Shigella oder Enterobacter) oder ein Virus (z.B. ein menschliches Immunschwächevirus, ein Herpesvirus, ein Influenzavirus, ein Poliomyelitisvirus, ein Masernvirus, ein Mumpsvirus oder ein Rubellavirus) zu behandeln oder zu verhindern.
Beim Behandeln oder Verhindern der Tumorbildung oder der Pathogeninfektion in einem Patienten ist es nicht erforderlich, dass die Zelle(n), welche dem Patienten verabreicht wird/werden, aus jenem Patienten gewonnen wird/werden. Folglich kann die Antigenpräsentierende Zelle aus einem passenden Donor oder aus einer in vitro wachsen gelassenen Zellkultur gewonnen werden. Verfahren zum Übereinstimmen von Haplotypen sind in der Technik bekannt. Ähnlich ist es nicht erforderlich, dass die RNA aus dem zu behandelnden Patienten gewonnen wird. RNA aus einem Donor kann verwendet werden.
Es ist zu bevorzugen, dass die Behandlung vor oder beim Einsetzen der Tumorbildung oder Infektion beginnt und solange fortdauert bis sich der Krebs oder die Infektion gebessert haben. Wie jedoch die hierin beschriebenen Beispiele erläutern ist die Erfindung für die Verwendung sogar dann geeignet, nachdem sich ein Tumor ausgebildet hat, da die Erfindung einen Rückgang des Tumors bewirken kann. Beim Behandeln eines Patienten mit einer erfindungsgemäß produzierten Zelle oder Vakzin hängt die optimale Dosierung des Vakzins oder der Zelle von Faktoren wie dem Gewicht des Säugers, der Schwere des Krebses oder der Infektion und der Stärke des CTL-Epitops ab. Allgemein sollte dem Patienten eine Dosierung von 10⁵-10⁸ RNA-beladene Antigen-präsentierende Zellen/kg Körpergewicht, vorzugsweise 10⁶-10⁷ Zellen/kg Körpergewicht, in einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff verabreicht werden. Die Zellen können unter Verwendung von Infusionstechniken, die bei der Krebstherapie üblicherweise verwendet werden (siehe z.B. Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988), verabreicht werden. Die optimale Dosierung und das Behandlungsregime für einen bestimmten Patienten können leicht von einem Fachmann der Medizin durch Überwachung des Patienten für Krankheitsanzeichen und durch entsprechendes Anpassen der Behandlung bestimmt werden.
Wo die Antigen-präsentierende Zelle verwendet wird, um eine CTL-Antwort in vitro zu induzieren, können die resultierenden Effektor-CTL anschließend einem Säuger in einem CTL-basierten Therapieverfahren verabreicht werden (siehe z.B. PCT/LJS91/06441). In vitro hergestellte CTL mit den Antigen-präsentierenden Zellen der Erfindung können einem Säuger in einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff durch Nutzen von konventionellen Infusionsverfahren verabreicht werden (siehe z.B. Rosenberg et al., oben). Typischerweise werden 10⁹-10¹⁰ Zellen über die Dauer von 30 Minuten verabreicht, wobei die Behandlung falls notwendig wiederholt wird. Solch ein CTL-basiertes Therapieverfahren kann mit anderen Verfahren kombiniert werden, wie zum Beispiel der direkten Applikation der Antigen-präsentierenden Zellen der Erfindung. Die CTL und Antigen-präsentierenden Zellen können für den Patienten, der die Therapie durchmacht, autolog oder heterolog sein. Falls gewünscht kann die Behandlung auch die Applikation von Mitogenen (z.B. Phytohämagglutinin) oder Lymphokinen (z.B. IL-2 oder IL-4) einschließen, um die CTL-Proliferation zu steigern.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung einer RNA-gepulsten Antigen-präsentierenden Zelle (APC), wobei das Verfahren umfasst: Einbringen in eine Antigen-präsentierende Zelle in vitro von RNA, ausgewählt aus: (i) RNA, umfassend Tumor-spezifische RNA; und (ii) RNA, umfassend Pathogen-spezifische RNA, wobei eine RNA-gepulste APC hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die APC eine dendritische Zelle, ein Makrophage oder eine Endothelzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die APC eine künstlich erzeugte APC ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die RNA Tumor-spezifische RNA umfasst, welche poly A⁺ RNA umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die RNA Tumor-spezifische RNA umfasst, welche Cytoplasma-RNA umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die RNA einem Tumorantigen oder einem Pathogenantigen entspricht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die RNA einem Epitop entspricht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die RNA Tumor-spezifische RNA ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die RNA in die APC durch Inkontaktbringen der APC mit der RNA in der Gegenwart eines kationischen Lipids eingebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die RNA Tumor-spezifische RNA umfasst, die als ein Tumorextrakt, der in Bezug auf eine nicht-RNA-Komponente des Tumorextraktes fraktioniert wird, bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die RNA Pathogen-spezifische RNA ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Tumor-spezifische RNA Melanom-spezifische RNA, Blasentumor-spezifische RNA, Brustkrebs-spezifische RNA, Kolonkrebs-spezifische RNA, Prostatakrebs-spezifische RNA oder Eierstockkrebs-spezifische RNA umfasst.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Pathogen-spezifische RNA virale RNA umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Virus aus Hepatitis-Viren, humanen Immundefizienten Viren (HIV), Influenza-Viren, Poliomyelitis-Viren, Masern-Viren, Herpes-Viren, Mumps-Viren und Röteln-Viren ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Pathogen-spezifische RNA bakterielle RNA umfasst.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Bakterium aus Salmonella, Shigella und Enterobacter ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die RNA aus einer Zelle isoliert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die RNA durch PCR-Amplifizierung und in vitro-Transkription hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die RNA Tumor-spezifische RNA ist, die nukleäre RNA umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die RNA einem Minigen entspricht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die RNA aus Tumor-spezifischer RNA besteht, die ein spezielles Antigen codiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die RNA aus Pathogen-spezifischer RNA besteht, die ein spezielles Pathogenantigen codiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die APC eine professionelle APC ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die RNA von geklonter cDNA transkribiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 4, 5, 12, 19 und 20, wobei die RNA von einem Tumor erhalten wird und Tumor-spezifische RNA umfasst, welche ein Antigen codiert, das T-Zellen-Proliferation und Tumorimmunität induziert, wobei die RNA-gepulste APC auf ihrer Oberfläche ein Tumorantigenepitop präsentiert, das durch die RNA codiert wird, wobei das Epitop T-Zellen-Proliferation induziert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die RNA von cDNA transkribiert wird.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Virus ein humanes immundefizientes Virus (HIV) ist.
RNA-gepulste APC, erhältlich gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 27.
RNA-gepulste APC nach Anspruch 28, wobei die RNA Tumor-spezifische RNA umfasst.
RNA-gepulste APC nach Anspruch 28, wobei die RNA Pathogen-spezifische RNA umfasst.
RNA-gepulste APC nach Anspruch 30, wobei das Pathogen HIV ist.
RNA-gepulste APC nach Anspruch 30, wobei die RNA isoliert, gereinigt, fraktioniert, amplifiziert oder in vitro transkribiert wird.
RNA-gepulste APC nach Anspruch 28, wobei die RNA auch eine Zelltransportsignal-Sequenz codiert.
RNA-gepulste APC nach Anspruch 33, wobei das Zelltransportsignal ein Antigenepitop, das in der RNA codiert wird, zum endoplasmatischen Retikulum, einem Lysosom oder einem Endosom in der Zelle leitet.
RNA-gepulste APC nach Anspruch 33, wobei das Zelltransportsignal ein LAMP-1 Sortiersignal ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend RNA-gepulste APCs gemäß einem der Ansprüche 28 bis 35 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verwendung von RNA-gepulsten APCs gemäß einem der Ansprüche 28, 29 und 33 bis 35, wobei die RNA Tumor-spezifische RNA umfasst, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Vorbeugung von Krebs.
Verwendung nach Anspruch 37, wobei das Medikament in einer Dosierung von 10⁵ bis 10⁸ Antigen-präsentierenden Zellen pro kg Körpergewicht verwendet wird.
Verwendung gemäß Anspruch 37 oder 38, wobei der Tumor Melanom, Blasenkrebs, Brustkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Kolonkrebs oder Eierstockkrebs ist.
Verwendung von RNA-gepulsten APCs gemäß einem der Ansprüche 28 und 30 bis 35, wobei die RNA Pathogen-spezifische RNA umfasst, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Vorbeugung von Pathogeninfektion.