DE69737460T2

DE69737460T2 - Verfahren zur in-vitro-vorbehandlung von myoblasten in der transplantation

Info

Publication number: DE69737460T2
Application number: DE69737460T
Authority: DE
Inventors: Jacques P. Bernière TREMBLAY
Original assignee: Universite Laval
Current assignee: Universite Laval
Priority date: 1996-10-18
Filing date: 1997-10-17
Publication date: 2008-04-10
Anticipated expiration: 2017-10-18
Also published as: WO1998017784A1; US20070178077A1; CA2269096C; DE69737460D1; US20020182193A1; EP0946713A1; AU4613397A; US20020012657A1; CA2269096A1; ATE356199T1; US7189391B2; EP0946713B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Vorbehandlung von Myoblasten eines gesunden Spenders in vitro vor einer Transplantation davon in kompatible Patienten, welche an rezessiven Myopathien, insbesondere einer Muskeldystrophie, leiden. Diese in-vitro-Vorbehandlung erhöht den Erfolg der Transplantation, während keine in-vivo-Vorbehandlung der Muskeln des Patienten durch eine Bestrahlung oder durch die Verabreichung eines Muskeltoxins erforderlich ist.
Hintergrund der Erfindung
Die Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ist eine progressive Erkrankung, welche durch einen Mangel an Dystrophin unterhalb der Sarkolemm-Membran gekennzeichnet ist^6,19,28,37. Ein möglicher Weg zur Einführung von Dystrophin in die Muskelfasern der Patienten, um die Degeneration zu begrenzen, ist die Transplantation von Myoblasten, welche aus normalen Individuen gewonnen werden^30,34,35. Mehrere Gruppen haben versucht, Transplantationen von Myoblasten bei DMD-Patienten vorzunehmen, wobei aber nur ein unzureichender Transplantationserfolg beobachtet wurde^17,22,24,38. Selbst bei einer experimentellen Transplantation von Myoblasten unter Verwendung von mdx-Mäusen, einem Tiermodell für DMD^10,25,29, wurde eine große Anzahl von Dystrophin-positiven Fasern nur dann beobachtet, wenn nackte mdx-Mäuse vorher bestrahlt wurden, um eine Regeneration der Muskelfasern durch die Myoblasten des Wirtes zu verhindern^32,43. Ein hoher Prozentsatz an Dystrophin-positiven Fasern wurde auch bei mit FK506 immunsupprimierten mdx-Mäusen und bei SCID-Mäusen beobachtet, wobei in beiden Fällen die Muskeln vorher durch die Injektion von Notexin geschädigt und bestrahlt wurden^23,27. Diese Ergebnisse zeigen, dass es für das Erreichen einer erfolgreichen Transplantation von Myoblasten nicht nur erforderlich ist, dass eine immundefiziente Maus oder eine ausreichend immunsupprimierte Maus zur Verfügung steht, sondern auch, dass die Muskeln des Wirtes geeignet vorbehandelt worden sind. Jedoch ist es in klinischen Studien unmöglich, schädigende Behandlungen wie Marcain, Notexin oder eine Bestrahlung anzuwenden. Falls ohne die Anwendung solcher Techniken gute Ergebnisse für die Transplantation von Myoblasten erzielt werden können, wäre dies für die Transplantation von Myoblasten in Menschen sehr nützlich.
In letzter Zeit hat das Interesse an den Wirkungen des basischen Fibroblastenwachstumsfaktors (bFGF) und anderen Wachstumsfaktoren auf Myoblastenkulturen und Myoblastenzelllinien zugenommen^1,4,5. Es ist berichtet worden, dass der basische FGF sowohl die Proliferation von Skelett-Myoblasten stimuliert als auch die Differenzierung davon in vitro inhibiert^15,16. Andere Wachstumsfaktoren oder trophische Faktoren wie der Insulinwachstumsfaktor I, Transferrin, von Blutplättchen stammender Wachstumsfaktor, epidermale Wachstumsfaktor, Adrenocorticotrophin und Makrophagenkolonie-stimulierende Faktor, sowie Proteinkinase C-Aktivatoren oder -Agonisten, durch welche die Wirkung von bFGF vermittelt wird²⁰, können auch eine ähnliche oder sogar bessere Wirkung als bFGF auf den Erfolg einer Transplantation von Myoblasten haben⁷. Die Ausnutzung dieser stimulierenden Eigenschaften, um den Erfolg einer Transplantation durch eine in-vitro-Vorbehandlung der Zellen eines Spenders zu erhöhen und um zumindest zum Teil die Anwendung der bisher bekannten Verfahren zur in-vivo-Vorbehandlung der Zellen eines Empfängers zu ersetzen, ist vor dem Artikel von Kinoshita et al. (Muscle and Nerve 18 (1995), 834-841) und Tremblay, 1996, veröffentlicht als WO 96/28541 , niemals vorgeschlagen worden. Die Dokumente von Tremblay und Kinoshita waren die ersten, welche lehrten, dass eine Vorbehandlung von Myoblasten mit einem muskulären Wachstumsfaktor oder trophischen Faktor, wie zum Beispiel dem basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), die Anzahl der funktionellen Muskelzellen nach einer Transplantation der vorbehandelten Myoblasten in ein Individuum erhöht. Jedoch wird weder bei Tremblay noch bei Kinoshita (vorstehend) ein Verfahren zur Erhöhung der Akzeptanz von transplantierten Myoblasten erwähnt, bei welchem die Metalloprotease-Expression stimuliert wird.
Ferner ist vor kurzem durch Overall und Sodek⁴⁴ veröffentlicht worden, dass Concanavalin A die Sekretion von Metalloproteasen durch Fibroblasten erhöht. Da diese Enzyme vermutlich in primären Myoblastenkulturen vorhanden sind und für den Abbau der extrazellulären Matrix verantwortlich sein können, wäre es wünschenswert, die Myoblasten in Gegenwart sowohl eines Wachstumsfaktors als auch eines Induktors der Produktion von Metalloproteasen vorzubehandeln, um die Migrationsstrecke der transplantierten Myoblasten zu vergrößern und um die Zahl der fusionierten Myoblasten, welche funktionelle Muskelproteine exprimieren, zu erhöhen. Eine attraktive Alternative wäre die Verwendung von Myoblasten eines Spenders, in welche ein Gen inseriert wird, welches eine Metalloprotease exprimiert.
Metalloproteasen sind Enzyme, welche für die Tumorinvasion, die Zellmigration⁴⁵ und die Restrukturierung der extrazellulären Matrix während der normalen Geweberemodellierung⁴⁶ notwendig sind. Matrilysin und Gelatinase A sind Metalloproteasen, welche bei einer Vielzahl von Krebsarten an der Gewebeinvasion beteiligt sind⁴⁷. Die Anwesenheit von Gelatinase A in der aktiven Form davon ist mit der Bildung neuer Muskelfasern während des Prozesses der Muskeldegeneration/regeneration in Beziehung gebracht worden⁴⁸. Es ist gezeigt worden, dass die Aktivität von Gelatinase A die Zellmigration durch Spaltung von Laminin-5, einer Komponente der extrazellulären Matrix, wodurch eine promigratorische kryptische Stelle exponiert wird, induzieren kann⁴⁹.
Aus dem Vorstehenden wird sehr deutlich, dass eine Verbindung, die in der Lage ist, die Expression einer Metalloprotease zu stimulieren, welche an einem extrazellulären Restrukturierungsprozess beteiligt ist, wie ein Phorbolester oder Concanavalin A, nützlich wäre, um den Erfolg einer Transplantation von Myoblasten zu erhöhen. Da Metalloproteasen vermutlich in das Kulturmedium sezerniert werden, wäre es auch nützlich zu untersuchen, ob Metalloproteasen wie Matrilysin, Gelatinase A oder andere Metalloproteasen der gleichen Klasse zu dem gleichen Zweck direkt mit Myoblasten in den Empfängermuskel injiziert werden können.
Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein in-vitro-Verfahren zur Vorbehandlung von Myoblasten eines Spenders, welche aus einer Biopsie eines gesunden Spenders gewonnen werden, vor ihrer Transplantation durch das Einbringen eines Genkonstrukts, das in der Lage ist, eine Metalloprotease zu exprimieren, welche an der Zerstörung der extrazellulären Matrix beteiligt ist, wodurch rekombinante Myoblasten des Spenders erhalten werden, und das Züchten der rekombinanten Myoblasten des Spenders in vitro in einem geeigneten Kulturmedium. Dieses Verfahren kann bei Patienten angewendet werden, welche an rezessiven Myopathien, insbesondere der Duchenne-Muskeldystrophie (DMD), erkrankt sind. In einem DMD-Tiermodell (mdx) wurden Myoblasten einer kompatiblen Spendermaus in einer Kultur zusammen mit muskulären Wachstumsfaktoren oder trophischen Faktoren, insbesondere dem basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), vor ihrer Transplantation in die Muskeln von mdx-Mäusen ohne eine vorhergehende schädigende Behandlung gezüchtet. Bei der Vorbehandlung mit bFGF wurde eine vierfache Erhöhung des Prozentsatzes der Muskelfasern, welche Dystrophin exprimieren, welcher ein Indikator für funktionelle Muskelzellen ist, erhalten. Es wird erwartet, dass diese Versuchsergebnisse bei einer natürlich auftretenden Dystrophie oder anderen Typen von rezessiven Myopathien in tierischen und menschlichen Individuen bestätigt werden können, da die mdx-Maus ein Tiermodell ist, in dem natürlicherweise eine Muskeldystrophie auftritt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein in-vitro-Verfahren zur Vorbehandlung von Myoblasten eines Spenders vor einer Transplantation, umfassend das Züchten der Myoblasten in einem geeigneten Kulturmedium in Gegenwart von Fibroblasten und Concanavalin A.
Durch das Züchten der Myoblasten in Gegenwart von Concanavalin A für zwei bis vier Tage vor einer Transplantation wird ferner die Migrationsstrecke der transplantierten Zellen in dem Empfängergewebe um das 3- bis 4-fache vergrößert. Concanavalin A verstärkt die Migration und erhöht die Zahl der fusionierten Zellen, welche ein Reportergen exprimieren. Das gleiche Ergebnis wird auch durch rekombinante Myoblasten hervorgerufen, welche Metalloproteasen exprimieren.
Die Metalloproteasen können durch rekombinante Myoblasten exprimiert oder gleichzeitig mit den transplantierten Myoblasten injiziert werden. Die Transplantation von Zellen zusammen mit einer Matrix abbauenden Menge an Metalloproteasen und die Transplantation von rekombinanten Zellen, welche diese Enzyme exprimieren, sind nicht auf Myoblasten begrenzt, sondern können vielmehr an einen beliebigen Typ von transplantierten Zellen angepasst werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, bei dem die Myoblasten eines Spenders rekombinante Myoblasten sind, welche ein Gen exprimieren, das eine Metalloprotease codiert, welche an der Zerstörung der extrazellulären Matrix beteiligt ist.
Weiterhin bereitgestellt wird ein Verfahren, welches das Reproduzieren eines der vorstehenden Verfahren und das Kombinieren des Induktors mit einem Wachstumsfaktor oder trophischen Faktor, um die Vermehrung der gesunden Myoblasten zu begünstigen, umfasst.
In einer speziellen Ausführungsform ist die Myopathie eine Duchenne-Muskeldystrophie.
In einer bevorzugten Ausführungsform bestehen die Myoblasten eines Spenders aus einer primären Myoblastenkultur, welche durch das Züchten einer enzymatisch erhaltenen Zelldispersion einer Muskelbiopsie des Spenders gewonnen wurde.
Es ist beobachtet worden, dass die Züchtung der Primärkulturen der Myoblasten eines Spenders, welche Fibroblasten enthalten, in Gegenwart eines Wachstumsfaktors oder trophischen Faktors ein in-vitro-Vorbehandlungsschritt ist, welcher zumindest zum Teil eine in-vivo-Vorbehandlung des Muskelgewebes des Empfängers durch eine Bestrahlung oder durch die Verabreichung eines Muskeltoxins ersetzt.
Der Wachstumsfaktor oder trophische Faktor ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), Insulinwachstumsfaktor I, Transferrin, von Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktor, epidermalen Wachstumsfaktor, Adrenocorticotrophin, Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktor, Proteinkinase C-Aktivatoren oder Agonisten hiervon, sowie Kombinationen davon.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Wachstumsfaktor oder trophische Faktor der basische Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF).
In einer mehr bevorzugten Ausführungsform wird die primäre Myoblastenkultur in Gegenwart von 100 ng eines rekombinanten menschlichen bFGF pro Milliliter des Kulturmediums für einen Zeitraum von etwa 48 Stunden vor der Transplantation gezüchtet, wodurch eine vierfache Erhöhung der Zahl an funktionellen Muskelzellen erhalten wird.
In einer noch anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Enzym, das an der Zerstörung der extrazellulären Matrix beteiligt ist, eine Metalloprotease wie Matrilysin und Gelatinase A, und ist der Induktor Concanavalin A.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist der Induktor Concanavalin A (Con A).
In einer speziellen Ausführungsform hat die Züchtung der primären Myoblastenkulturen in Gegenwart von 20 μg/ml Con A für 48 Stunden eine Vergrößerung der Migrationsstrecke der transplantierten Myoblasten sowie eine Erhöhung der Zahl der fusionierten Myoblasten um das 3- bis 4-fache zur Folge.
In der am meisten bevorzugten Ausführungsform werden die primären Myoblastenkulturen für zwei Tage in Gegenwart von sowohl Con A als auch bFGF gezüchtet, woraus sich ein überragendes Transplantationsergebnis im Vergleich zu jeder Behandlung allein ergeben würde.
In einer noch anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Myoblasten eines Spenders, umfassend ein Genkonstrukt, das in der Lage ist, eine Metalloprotease zu exprimieren, welche an der Zerstörung der extrazellulären Matrix beteiligt ist, für die Herstellung eines Medikaments für die Transplantation in ein Gewebe eines Empfängers zur Behandlung von rezessiven Myopathien.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Myoblasten eines Spenders, welche in vitro vorbehandelt worden sind, wobei die Vorbehandlung das Züchten der Myoblasten in einem geeigneten Kulturmedium in Gegenwart von Fibroblasten und Concanavalin A umfasst, für die Herstellung eines Medikaments für die Transplantation in einen Empfänger zur Behandlung von rezessiven Myopathien.
Beschreibung der Erfindung
Wenngleich der gegenwärtige Trend in der Forschung bei der Behandlung von DMD anscheinend in Richtung der Gentherapie und nicht der Zelltherapie geht, ist noch viel Arbeit an Tiermodellen erforderlich, bevor einer der Ansätze oder eine Mischung aus beiden Ansätzen zur Behandlung von vererbten Myopathien wie der DMD geeignet ist 32,34.
Nach einer Transplantation von Myoblasten wurde keine ausreichende Dystrophin-Expressionsrate erhalten, was nicht nur für klinische Prüfungen, sondern auch für Tierversuche zutrifft, bei denen keine Bestrahlung³³ in Kombination mit einer Zerstörung der Muskeln durch Marcain oder Notexin^26,27 angewendet wurde. Allerdings sind diese Techniken für die Anwendung in klinischen Prüfungen zu schädigend, zu invasiv oder zu risikoreich. Es ist berichtet worden, dass der basische FGF sowohl die Proliferation von Skelett-Myoblasten stimuliert als auch die Differenzierung davon durch die Suppression von regulatorischen Muskelfaktoren wie MyoD und Myogenin inhibiert^12,41. Die Expression von bFGF ist in regenerierenden Skelettmuskeln mittels Immunhistochemie und in-situ-Hybridisierung untersucht worden, wobei festgestellt wurde, dass sie im Vergleich zu unverletzten Muskeln hochreguliert ist^3,11. Ein erhöhter Spiegel an Skelettmuskel-Mitogenen ist auch in Homogenaten sich regenerierender Muskeln von mdx-Mäusen beobachtet worden³. Erhöhte Spiegel von bFGF werden in der extrazellulären Matrix von mdx-Skelettmuskeln¹³ und in mdx-Sattelitenzellen, welche an der Reparatur beteiligt sind³, beobachtet, wobei solche Zellen empfindlicher auf eine exogene Zufuhr von bFGF¹⁴ reagieren. Es besteht ein hoher Grad an Homologie zwischen dem bFGF aus verschiedenen Spezies², und daher ist ein rekombinanter menschlicher bFGF in Mauszellen wirksam⁹. In der vorliegenden Reihe von Experimenten wurden Myoblasten mit einem rekombinanten menschlichen bFGF vorbehandelt, um deren Proliferation zu erhöhen und um zu untersuchen, ob eine solche Behandlung, welche weniger invasiv ist, günstige Wirkungen auf eine Transplantation von Myoblasten haben könnte.
In den Experimenten der Erfinder wurden primäre Myoblastenkulturen derselben Spender mit oder ohne bFGF gezüchtet und gleichzeitig in beide Tibialisanterior (TA)-Muskeln derselben Mäuse transplantiert. Dies scheint ein gutes Modell zu sein, um die Wirkung von bFGF zu untersuchen, da die gleichen primären Myoblastenkulturen, die gleichen Transplantationsbedingungen und der gleiche Status der Immunsuppression verwendet wurden. Ein Vergleich der beiden TA-Muskel bei allen behandelten mdx-Mäusen ergab, dass der Prozentsatz der β-Galactosidasepositiven Fasern (dieses Enzym ist ein Reportergen) in Kulturen der linken TA-Muskeln (mit bFGF) signifikant höher als in Kulturen der rechten TA-Muskeln (ohne bFGF) war. In den Muskeln, in welche Myoblasten transplantiert wurden, die mit bFGF gezüchtet worden waren, lag der durchschnittliche Prozentsatz der Hybridfasern bei 34,4%, wobei zwei Muskeln mehr als 40% Spender- oder Hybridfasern enthielten. Dies sind die besten Ergebnisse, welche jemals nach einer Transplantation von Myoblasten ohne eine Behandlung mit Notexin oder eine Strahlungsbehandlung beschrieben wurden.
In der vorliegenden Studie wurden Myoblasten für 48 Stunden mit bFGF inkubiert, und etwa 5 Millionen dieser Zellen (etwa 1,75 Millionen myogene Zellen) wurden in einen TA-Muskel injiziert. Die gleiche Anzahl an Myoblasten, welche nicht mit bFGF inkubiert wurden, wurde in den als Kontrolle dienenden TA-Muskel auf der gegenüberliegenden Seite injiziert. Der höhere Prozentsatz an β-Galactosidase/Dystrophin-positiven Fasern war daher nicht auf eine höhere Proliferation der Myoblasten in vitro vor den Transplantationen zurückzuführen.
Die in-vitro-Ergebnisse der Erfinder zeigen, dass eine Inkubation mit bFGF für 2 Tage die Gesamtzahl der Zellen und den Prozentsatz der Muskelzellkerne nicht wesentlich verändert. Jedoch inhibierte der basische FGF die Fusion der Myoblasten in vitro signifikant. Dies hatte eine geringe, aber signifikante Erhöhung (35%) des Prozentsatzes der Myoblasten unter den einkernigen Zellen zur Folge. Diese Erhöhung scheint zu gering zu sein, um allein die mehr als vierfache Erhöhung der Wirksamkeit der Transplantation von Myoblasten, welche durch bFGF hervorgerufen wird, zu erklären. Vor kurzem berichtete sowohl die Gruppe von Partridge⁷ als auch von Karpati²⁴, dass ein hoher Prozentsatz (bis zu 99% bei den Ergebnissen von Partridge) der Myoblasten, welche in eine Maus injiziert wurden, innerhalb von 5 Tagen abstarben. Dieses drastische Ergebnis scheint nicht auf immunologische Probleme zurückzuführen sein, da es nach einer Autotransplantation²⁴ oder einer Transplantation in Nacktmäuse⁷ beobachtet wurde. Obwohl in den Experimenten der Erfinder für die mit bFGF behandelten Kulturen drei Tage nach der Transplantation etwas mehr überlebende Zellen beobachtet wurden, erreichte der Unterschied kein signifikantes Niveau und scheint daher nicht allein zu der günstigen Wirkung einer vierfachen Erhöhung beizutragen, welche 30 Tage nach der Transplantation beobachtet wurde.
Es wird angenommen, dass der basische FGF die Myogenese während der Muskelentwicklung und -regeneration in vivo reguliert³. Die Erhöhung des Prozentsatzes der Muskelfasern, die das Spendergen enthalten, welche durch die Zugabe von bFGF hervorgerufen wurde, scheint überraschend zu sein, da berichtet wurde, dass der bFGF die Differenzierung von Myoblasten in vitro inhibiert^1,13. Der basische FGF ist jedoch einer von vielen Wachstumsfaktoren, welche nach einer Muskelschädigung freigesetzt werden⁷. Diese Faktoren verstärken sehr wahrscheinlich alle zusammen die Proliferation der Myoblasten und letztendlich die Muskelreparatur. Die Erfinder haben auch beobachtet, dass nach einer Inkubation von primären Myoblastenkulturen für zwei Tage mit dem bFGF die Myoblastenfusion innerhalb weniger Tage nach der Entfernung von bFGF erfolgte (Daten nicht gezeigt). Die Inhibierung der Myoblastenfusion durch bFGF ist daher nicht irreversibel. Der basische FGF ist bereits in einem erhöhten Spiegel in mdx-Muskeln vorhanden, daher ist es nicht überraschend, dass die direkte intramuskuläre Injektion die Fusion der Spendermyoblasten mit den Fasern des Wirtes nicht erhöhte. Tatsächlich stimuliert der bFGF bei der direkten Injektion in den Muskel wahrscheinlich die Proliferation der Myoblasten des Wirtes, als auch des Spenders, so dass die Spendermyoblasten nicht begünstigt werden. Im Gegensatz dazu kann durch eine vorherige Stimulierung der Spendermyoblasten durch bFGF in einer Kultur die Proliferation dieser Myoblasten stärker begünstigt werden, so dass sie letztendlich stärker an der Muskelregeneration als die Myoblasten des Wirtes beteiligt sind.
Obwohl der bFGF die Fibroblasten stimuliert, welche eine Verunreinigung von primären Myoblastenkulturen darstellen, wurden die Transplantationsergebnisse der Erfinder durch die Inkubation der primären Myoblastenkultur für nur 48 Stunden mit bFGF nicht ungünstig beeinflusst, sondern im Gegenteil dadurch verbessert. Falls die primären Myoblastenkulturen durch eine Subclonierung von den Fibroblasten befreit werden, ist es vorstellbar, die Myoblasten eines Spender für einen längeren Zeitraum vorzubehandeln und auf diese Weise die Anzahl der Zellen, welche transplantiert werden sollen, ausgehend von einer verhältnismäßig kleinen Biopsie zu erhöhen.
Obwohl die Ergebnisse, welche nach einer Transplantation von Myoblasten, die mit bFGF gezüchtet wurden, erhalten wurden, nicht so gut sind wie solche, welche mittels Bestrahlung und Notexin erhalten werden²⁷, sind diese Ergebnisse trotzdem wichtig, da keine die Muskeln zerstörende Technik angewendet wurde. Das vorgeschlagene Verfahren zur in-vitro-Vorbehandlung könnte daher angewendet werden, um eine solche schädigende in-vivo-Vorbehandlung der Empfängerzellen entweder vollständig oder zumindest zum Teil zu ersetzen, was eine wesentliche Verminderung der unerwünschten Wirkungen zur Folge hat. Die Wirkungen von vielen Wachstumsfaktoren und trophischen Faktoren auf eine Myoblastenkultur sind beschrieben worden, wobei es möglich ist, dass andere Faktoren wie der Insulinwachstumsfaktor I, Transferrin, von Blutplättchen stammende Wachstumsfaktor, epidermale Wachstumsfaktor, Adrenocorticotrophin und Makrophagenkolonie-stimulierende Faktor ebenfalls ähnliche oder sogar bessere Wirkungen als der bFGF auf den Erfolg einer Transplantation von Myoblasten haben können⁷. Ferner, da die Wirkung von bFGF durch die Proteinkinase C vermittelt wird, könnten pharmakologische Mittel, welche verwendet werden, um die Aktivität dieser Enzyme zu erhöhen (wie Phorbolester) oder deren Wirkung nachzuahmen (Agonisten), ebenfalls für die Vorbehandlung von Myoblasten verwendet werden. Daher kann mindestens einer dieser Faktoren allein oder in Kombination mit bFGF oder ohne bFGF verwendet werden, um den Erfolg einer Transplantation von Myoblasten zu erhöhen. Obwohl der daran beteiligte Mechanismus spekulativ bleibt, scheint der bFGF die Langzeit-Lebensfähigkeit, Vermehrung und Fusion von Myoblasten zu verbessern. Die Ergebnisse der Erfinder legen nahe, dass die Vorbehandlung von Myoblasten mit dem bFGF ein mögliches Verfahren ist, um den Erfolg einer Transplantation von Myoblasten in DMD-Patienten zu erhöhen.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und Figuren, deren Zweck es ist, diese Erfindung zu veranschaulichen, weiter beschrieben.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt Querschnitte eines TA-Muskels von mdx-Mäusen 28 Tage nach Injektion der transgenen Myoblasten. Es sind Paare von Serienschnitten dreier verschiedener Muskeln aus drei Mäusen abgebildet. Die Tafeln a und b zeigen Schnitte von Muskeln, in die Myoblasten injiziert wurden, welche ohne bFGF gezüchtet wurden. Die Tafeln c bis f zeigen Schnitte von Muskeln, in die Myoblasten injiziert wurden, welche mit bFGF gezüchtet wurden. Bei jedem Paar wurde ein Schnitt auf β-Galactosidase gefärbt (Tafeln a, c und e). Der andere Schnitt des Paares wurde auf Dystrophin immungefärbt (Tafeln b, d und f). Die Muskeln, in die Myoblasten injiziert wurden, welche in Gegenwart von bFGF gezüchtet wurden, enthielten viel mehr β-Galactosidase- und Dystrophin-positive Fasern als Muskeln, in die Myoblasten injiziert wurden, welche ohne bFGF gezüchtet wurden. Die meisten Muskelfasern, welche β-Galactosidase exprimieren, waren Dystrophin-positiv. In jedem Paar von Tafeln sind dieselben Muskelfasern durch die gleichen Zahlen gekennzeichnet. Der Maßstabsbalken entspricht 100 μm.
2 zeigt die Anzahl der X-Gal-positiven Muskelfasern, welche nach einer Injektion von 500.000 Spenderzellen in eine Stelle des Tibialis anterior einer Empfängermaus gezählt wurden. Imm7-neo: exprimiert Neomycin. Imm7-Matrilysin: exprimiert Neomycin und Matrilysin. TnI-β-Gal: unbehandelte transgene Maus-Myo-blasten, exprimierend β-Gal. TnI-β-Gal + TPA: transgene Maus-Myoblasten/β-Gal, behandelt mit Phorbolester.
Beispiel 1
Materialien und Methoden
Myoblastenkulturen
Die primären Myoblastenkulturen wurden unter Verwendung von Muskelbiopsien neugeborener transgener Mäuse angelegt²⁶. Die Begründermaus (TnI-LacZ 1/29) wurde von Dr. Hasting (McGill University, Montreal, Kanada) auf dem CD1-Hintergrund bereitgestellt und im Labor der Erfinder vermehrt. Diese transgene Maus exprimiert das β-Galactosidase-Gen unter der Kontrolle des Promotors für das Troponin I-Gen der schnellen Skelettmuskeln der Wachtel¹⁶. Nach der Inkubation mit einem Substrat, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal) (Boehringer Mannheim, Kanada, Laval, Kanada), sind in diesen transgenen Mäusen blaue Muskelfasern erkennbar. Vor dem Anlegen der Myoblastenkulturen war es erforderlich, transgene Neugeborene anhand einer X-Gal-Färbung einer kleinen Muskelbiopsie zu identifizieren, da heterozygote transgene Mäuse als Eltern verwendet wurden. Aus Skelettmuskelfragmenten der transgenen Neugeborenen wurden die myogenen Zellen durch aufeinanderfolgende Enzymbehandlungen freigesetzt. Zuerst wurde ein Verdau für eine Stunde mit 600 E/ml Collagenase (Sigma, St. Louis, MO, USA) durchgeführt. Darauf folgte eine Inkubation für 30 Minuten in Hank's balancierter Salzlösung (HBSS), enthaltend 0,1% Gew./Vol. Trypsin (Gibco-Lab, Grand Island, NY, USA). Die Satellitenzellen wurden in 75 cm²-Kulturflaschen (Costar, Cambridge, MA, USA) in Proliferationsmedium, d.h. Medium 199 (Gibco-Lab) mit 15% fötalem Rinderserum (Gibco-Lab), 1% Penicillin (10.000 E/ml) und 1% Streptomycin (10.000 E/ml), überführt.
Transplantation von Myoblasten
Einen Tag nach dem Anlegen der Kultur wurde das Kulturmedium einiger Flaschen durch ein Medium ersetzt, welches 100 ng/ml eines menschlichen rekombinanten bFGF (Sigma) enthielt. Drei Tage nach dem Anlegen der Kultur wurden die Myoblasten mit 0,1% Trypsin von den Flaschen abgelöst und anschließend dreimal in HBSS suspendiert und zentrifugiert (6500 UpM, 5 Minuten). Das fertige Zellpellet wurde in nur 40 μl HBSS verdünnt.
Für dieses Experiment wurden siebzehn C57BL/10ScSn-mdx/mdx-Mäuse (mdx-Mäuse) in einem Alter von etwa einem Monat verwendet. Diese Arbeit wurde durch das Laval University Animal Care Committee autorisiert und überwacht und wurde entsprechend den durch das Canadian Council of Animal Care festgelegten Richtlinien durchgeführt.
Die mdx-Mäuse wurde in drei Gruppen eingeteilt. Bei den sechs mdx-Mäusen einer Gruppe erfolgte die Transplantation in beide Tibialis anterior (TA)-Muskeln, wobei mit bFGF gezüchtete Myoblasten in den linken TA injiziert wurden und ohne bFGF gezüchtete Myoblasten in den rechten TA injiziert wurden. Bei sechs anderen mdx-Mäusen wurden ohne bFGF gezüchtete Myoblasten nur in den linken TA injiziert. Diese sechs mdx-Mäuse erhielten dann viermal eine intramuskuläre Injektion (0, +1, +4 und +6 Tage nach der Transplantation) mit entweder 10 μl bFGF (100 ng/ml, 3 Mäuse) oder mit 10 μl HBSS (3 Mäuse). Den restlichen fünf Mäusen wurden normale CD1-Maus-Myoblasten, infiziert mit dem replikationsdefekten retroviralen Vektor LNPOZC7 (Gabe von Dr. C. Cepko, Harvard, Boston, MA), welcher das LacZ-Gen enthält, in beide TA-Muskeln transplantiert. In die linken TA-Muskeln wurden 4 Millionen Myoblasten injiziert, welche mit bFGF gezüchtet wurden, während in die rechten TA-Muskeln 4 Millionen Myoblasten injiziert wurden, welche ohne bFGF gezüchtet wurden. Drei Tage nach der Transplantation wurden diese 5 Mäuse getötet, um die Anzahl der β-Galactosidase-positiven Zellen zu bestimmen, welche in jedem TA-Muskel überlebt haben. Die Anzahl der β-Galactosidase-positiven Zellen wurde in 8 μm-Schnitten gezählt, welche alle 160 μm über den Muskel hinweg genommen wurden. Die Gesamtzahl der gezählten Zellen wurde mit 20 multipliziert, um einen Schätzwert für die Zahl der überlebenden Zellen zu erhalten, wobei eine Korrektur vorgenommen wurde, um den Prozentsatz der unmarkierten Zellen in den Kulturen mit und ohne bFGF zu berücksichtigen.
Für die Myoblasteninjektion wurden die Mäuse mit 0,05 ml einer Lösung, enthaltend 10 mg/ml Ketamin und 10 mg/ml Xylazin, betäubt. Die Haut wurde aufgeschnitten, um den TA-Muskel freizulegen. Die Myoblastensuspension wurde in eine Glasmikropipette mit einer 50 μm-Spitze (Drummond Scientific Company, Broomall, PE, USA) eingebracht. An 10 Stellen des TA-Muskels wurden insgesamt etwa 5 Millionen Zellen injiziert. Die Haut wurde dann mit feinen Nähten verschlossen. Anschließend wurde FK506 (Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd., Osaka, Japan) in einer Menge von 2,5 mg/kg verabreicht, um bei den Tiere eine Immunsuppression zu bewirken. Alternativ kann die immunsuppressive Behandlung mit anderen pharmakologischen Mitteln wie Cyclosporin (Sandoz), RS61443 (Syntex) oder Rapamycin (Wyeth-Ayerst) durchgeführt werden⁴².
Muskeluntersuchung
Drei bzw. 28 Tage nach der Transplantation der Myoblasten wurden die Mäuse mittels intrakardialer Perfusion mit 0,9%iger Kochsalzlösung unter einer tiefen Betäubung mit 10 mg/ml Ketamin und 10 mg/ml Xylazin getötet. Die TA-Muskeln wurden entnommen und in eine 30%ige Saccharoselösung bei 4°C für 12 Stunden gelegt. Die Proben wurden in OCT (Miles Inc., Elkhart, IN, USA) eingebettet und in Flüssigstickstoff eingefroren. Kryostat-Serienschnitte (8 μm) der Muskeln wurden auf gelatinebeschichteten Objektträgern aufgetaut. Diese Schnitte wurden in 0,25% Glutaraldehyd fixiert und in einer Dunkelkammer mit 0,4 mM X-Gal über Nacht (12 Stunden) bei Raumtemperatur gefärbt, um die Muskelfasern nachzuweisen, die β-Galactosidase enthalten. Das Dystrophin wurde auf angrenzenden Kryostat-Schnitten durch eine Immunperoxidase-Technik mit einem polyclonalen Schaf-Antikörper gegen das 60 kD-Dystrophin-Fragment (R27, Genica Co., Boston, MA, USA) nachgewiesen, wobei die Peroxidaseaktivität durch eine Inkubation für 10 Minuten mit 3,3'-Diaminobenzidin (DAB, 0,5 mg/ml, Sigma) und Wasserstoffperoxid (0,015%) sichtbar gemacht wurde.
Desminfärbung
Die Primärkulturen wurden mit PBS gewaschen und mit 100%igem Methanol bei –4°C fixiert. Sie wurden dann noch dreimal mit PBS gewaschen und für 1 h mit einem Anti-Mensch-Desmin-mAb (Dako, Kopenhagen, Dänemark), 1:50 verdünnt mit PBS, enthaltend 1% Blockierungsserum (d.h. 0,33% Kaninchenserum, 0,33% Pferdeserum und 0,33% fötales Kälberserum), inkubiert. Anschließend wurden sie dreimal in PBS mit 1% Blockierungsserum gewaschen und für 1 h mit einer 1:100-Verdünnung (in PBS mit 1% Blockierungsserum) eines Kaninchen-anti-Maus-Immun globulins (Dako) inkubiert. Nach drei Waschschritten mit PBS wurde die Peroxidaseaktivität wie bei der Dystrophin-Immunhistochemie mit DAB sichtbar gemacht.
Ergebnisse
Myoblasten aus Muskelbiopsien transgener Mäuse, welche β-Galactosidase unter der Kontrolle eines muskelspezifischen Promotors exprimieren, wurden mit oder ohne bFGF gezüchtet und in mdx-Muskeln injiziert, die vorher nicht bestrahlt oder mit Notexin geschädigt wurden. Einen Monat später wurden die Tiere getötet, und die injizierten Muskeln wurden auf das Vorhandensein von β-Galactosidase und Dystrophin untersucht. Es wurden viele positive Muskelfasern beobachtet. In früheren Experimenten der Erfinder waren Muskeln von mdx-Mäusen, welche keine Injektionen von transgenen Myoblasten erhielten, völlig frei von β-Galactosidasepositiven Fasern²². Daher sind alle β-Galactosidase-positiven Muskelfasern, welche in transplantierten mdx-Muskeln beobachtet wurden, auf die Fusion einiger Spendermyoblasten untereinander (Fasern des Spenders) oder mit den Myoblasten des Wirtes (Hybridfasern) zurückzuführen. In Serienschnitten der Muskeln wurde beobachtet, dass die meisten der β-Galactosidase-positiven Muskelfasern auch für Dystrophin positiv sind (1). In allen biopsierten TA-Muskeln wurde die Zahl der β-Galactosidase-positiven Muskelfasern gezählt und als Prozentsatz der Gesamtzahl der Fasern in einem Querschnitt angegeben. Für jeden Muskel wurden die Schnitte mit dem höchsten Prozentsatz an β-Galactosidase-positiven Muskelfasern ausgewählt. Bei mdx-Mäuse mit einer Transplantation in beide TA-Muskeln wurde der Prozentsatz der β-Galactosidase-positiven Muskelfasern in dem linken TA-Muskel (Transplantation von Myoblasten, welche mit bFGF gezüchtet wurden) mit dem Prozentsatz für den rechten TA-Muskel (Transplantation von Myoblasten, welche ohne bFGF gezüchtet wurden) der gleichen Maus verglichen (Tabelle 1). Ohne Notexin und eine Bestrahlung wurde nur ein geringer Prozentsatz an Hybrid- oder Spendermuskelfasern in dem rechten TA-Muskel beobachtet, d.h. die mittlere Anzahl der β-Galactosidase-positiven Fasern pro Muskelquerschnitt betrug 156,3, woraus sich ein mittlerer Prozentsatz der β-Galactosidase-positiven Fasern von 8,396% ergibt. Die linken TA-Muskel enthielten jedoch signifikant mehr Hybrid- oder Spendermuskelfasern, d.h. die mittlere Anzahl der β-Galactosidase-positiven Fasern pro Muskelquerschnitt betrug 773,7, woraus sich ein mittlerer Prozentsatz der β-Galactosidase-positiven Fasern von gleich 34,4% ergibt (1). Dies entspricht einer mehr als vierfachen Erhöhung der Wirksamkeit der Transplantation von Myoblasten, die durch die Zugabe von bFGF zu dem Kulturmedium hervorgerufen wurde.
Die Erfinder untersuchten auch, ob die günstige Wirkung von bFGF durch die direkte Injektion hiervon in den Muskel in 4 Intervallen nach der Transplantation der Myoblasten erzielt werden kann. Es wurde kein signifikanter Unterschied hinsichtlich des Prozentsatzes der Hybrid- oder Spendermuskelfasern (d.h. β-Galactosidase-positiven Fasern) zwischen den Gruppen, die intramuskuläre Injektionen von bFGF erhielten, und denjenigen, die HBSS-Injektionen (Kontrolle) erhielten, beobachtet (Tabelle 2). Der Prozentsatz der β-Galactosidase-positiven Muskelfasern war jedoch nach der wiederholten Injektion von HBSS (14,8%) oder von bFGF (15,9%) höher als nach der Injektion von Myoblasten allein, welche ohne bFGF gezüchtet wurden (Tabelle 1; 8,3%). Dies kann auf die Schädigung zurückzuführen sein, welche durch die wiederholten Injektionen verursacht wurde, was den Regenerationsprozess verstärken kann.
Vor kurzem ist durch Huard et al.²¹ und durch Beauchamp et al.⁷ berichtet worden, dass ein hoher Prozentsatz der Myoblasten, welche in einen Muskel injiziert werden, innerhalb der ersten Tage nach ihrer Transplantation absterben. Um zu untersuchen, ob die Erhöhung der Wirksamkeit einer Transplantation von Myoblasten nach der Züchtung mit bFGF auf einen verminderten Zelltod zurückzuführen sein könnte, haben die Erfinder normale CD1-Primärkulturen, welche mit oder ohne bFGF gezüchtet wurden, mit einem retroviralen Vektor markiert, der das β-Galactosidase-Gen unter der Kontrolle eines LTR-Promotors enthält. Normale Myoblasten wurden mit einem Retrovirus markiert, welches β-Galactosidase exprimiert, da nur reife Myoblasten und Myotuben von transgenen TnI-LacZ 1/29-Mäusen β-Galactosidase exprimieren können. Durch die Markierung unter Verwendung eines retroviralen Vektors exprimierte ein höherer Prozentsatz der Zellen in der Primärkultur das Reportergen. Die retroviral markierten Zellen wurden dann in einen Muskel von 5 Mäusen injiziert. Drei Tage nach der Transplantation bestimmten die Erfinder die Anzahl der β-Galactosidase-positiven Zellen. Bei allen 5 Mäusen war die Anzahl der Zellen in den linken TA-Muskeln (mit bFGF) nicht signifikant höher (3,29 ± 1,54 × 10⁵ Zellen) als in den rechten TA-Muskeln (ohne bFGF) (2,13 ± 0,40 × 10⁵ Zellen). Anmerkung: Da 4 × 10⁶ Zellen in jeden Muskel injiziert wurden, haben ohne bFGF nur 5,3% der injizierten Zellen für 3 Tage überlebt, während mit bFGF nur 8,2% der injizierten Zellen überlebten.

Um die günstigen Wirkungen von bFGF auf die Transplantation von Myoblasten zu verstehen, untersuchten die Erfinder den Effekt einer kurzen Stimulierung (2 Tage) mit 100 ng/ml bFGF auf primäre Myoblastenkulturen. Die Gesamtzahl der Zellen in jeder Flasche unterschied sich nicht signifikant (31,9 ± 6,8 × 10⁶ mit bFGF, n = 5; 30,0 ± 5,8 × 10⁶ ohne bFGF, n = 9; ungepaarter t-Test: p = 0,573). Die Myoblasten und die Myotuben wurden dann durch den Nachweis von Desmin mittels Immunperoxidase identifiziert. In diesen Kulturen wurde kein Unterschied hinsichtlich des Prozentsatzes der myogenen Kerne (der Kerne in den Myoblasten und in den Myotuben) zwischen den zwei Gruppen von Kulturen beobachtet (Tabelle 2, Zeile 1). Jedoch fusionierten in Abwesenheit von bFGF mehr myogene Zellen miteinander (Tabelle 2, Zeile 2). Es wurde ein höherer Prozentsatz der gesamten Kerne (einschließlich Myoblasten, Myotuben und Fibroblasten) beobachtet, die in den Kulturen, welche bFGF enthalten, als Myoblastenkerne vorlagen (Tabelle 2, Zeile 3). Die Vermehrung der Myoblasten wurde deutlicher, wenn der Prozentsatz der Myoblasten unter den einkernigen Zellen (mit Ausnahme der Myotuben) berechnet wurde (Tabelle 2, Zeilen 4 und 5). Dies entsprach jedoch nur einer Erhöhung von 35%. Tabelle 1: Effekt einer Kultur mit oder ohne bFGF auf die Bildung von Muskelfasern, enthaltend das Gen eines Spenders, in mdx-Mäusen

	Ohne bFGF (rechter TA-Muskel)	Mit bFGF (linker TA-Muskel)
Anzahl der mdx-Mäuse	Anzahl (%) der β-Gal.-positiven Fasern	Anzahl (%) der β-Gal.-positiven Fasern
1	170 (11,0)	514 (19,3)
2	259 (11,9)	438 (20,4)
3	259 (13,1)	1007 (37,4)
4	57 (4,1)	695 (34,0)
5	139 (6,1)	848 (43,8)
6	54 (3,6)	1140 (51,7)
Mittelwert ± SD	156,3 ± 91,5 (8,3 ± 4,2) #	773,7 ± 275,8 (34,4 ± 12,8) #

# Ein ungepaarter t-Test ergab einen signifikanten Unterschied (p < 0,05).

	Ohne bFGF (Mittelwert ± SD)	Mit bFGF (Mittelwert ± SD)	Signifikanz
1) % Myoblasten- und Myotubenkerne im Verhältnis zu der Gesamtzahl der Kerne	34,5 ± 5,3	35,1 ± 4,8	0,81
2) % Myotubenkerne im Verhältnis zu der Gesamtzahl der Kerne der Myoblasten und Myotuben	40,8 ± 8,0	11,5 ± 6,6	0,0001
3) % Myoblastenkerne im Verhältnis zu der Gesamtzahl der Kerne	21,1 ± 3,6	30,9 ± 3,8	0,0001
4) % Myoblastenkerne im Verhältnis zu den Nicht-Myotubenkernen	23,9 ± 5,4	32,2 ± 4,1	0,001
5) % Nicht-Myoblastenkerne im Verhältnis zu den Nicht-Myotubenkernen	76,1 ± 5,4	67,8 ± 4,1	0,001

	Anzahl (5%) der β-Gal.-positiven Fasern	Mittelwert ± SD
HBSS-IM-Injektionen
1	180 (12,4)
2	421 (14,1)	372,0 ± 172,8(14,8 ± 2,9)
3	515 (18,0)

bFGF-IM-Injektionen
1	176 (7,4)
2	482 (24,1)	289,7 ± 167,5 (15,9 ± 8,4)
3	211 (16,3)
		Ein t-Test ergab keinen signifikanten Unterschied (p > 0,05)

Beispiel 2
Aus den vorstehenden Ergebnisse kann auf einen Nutzen in vivo geschlossen werden, wobei die Ergebnisse an Patienten, welche an einer Muskeldystrophie leiden, überprüft werden können. Die gesunden Spender und die DMD-Empfänger sollten soweit möglich in Bezug auf ihre Kompatibilität für die MHC (HLA)-Klasse (A, B, C)- und -Klasse II (Dr)-Antigene übereinstimmen. Die Dystrophiepatienten sollten einer immunsuppressiven Behandlung, zum Beispiel durch Verabreichung von FK506, Cyclosporin, RS61443 oder Rapamycin, unterzogen werden. Im Anschluss daran würde eine Biopsie der Spender im Wesentlichen gemäß den in Beispiel 1 im Hinblick auf Myoblasten von Mäusen beschriebenen Verfahren behandelt. Der Erfolg der Transplantation könnte durch Messung der Inzidenz der Dystrophin-positiven Fasern in einer Biopsie, welche von der Transplantationsstelle erhalten wird, und durch Beurteilung der daraus resultierenden Erhöhung der Muskelstärke überwacht werden³⁹.
Beispiel 3
Myoblasten, welche mit einem Retrovirus infiziert sind, das ein β-Galactosidase-Gen exprimiert, sind für vier Tage in Anwesenheit oder Abwesenheit von 20 μg/ml Concanavalin A, einem Lektin, welches die Expression von Metalloproteasen stimuliert, gezüchtet worden. Diese Myoblasten wurden dann in eine einzige Stelle des Tibialis anterior-Muskels von acht Mäusen injiziert, um das Ausmaß zu bestimmen, in dem die transplantierten Zellen in der Lage sind, durch das Gewebe des Empfängers zu wandern. Nach 30 Tagen wurden die Mäuse getötet, und das Muskelgewebe wurde entnommen und tiefgefroren, und 10 μm dicke Schnitte hiervon wurden auf Objektträger aufgezogen. Das Vorhandensein von β-Galactosidase wurde mit X-Gal nachgewiesen. Die markierten Zellen wurden in einem Abstand beobachtet, welcher in den Muskeln von Mäusen, die mit Concanavalin A behandelt wurden, 3-4-mal größer war. Es ist bekannt, dass Concanavalin A die Sekretion von Metalloproteasen durch die Fibroblasten, die in den Primärkulturen vorhanden sind, induziert. Daher ist die Gegenwart von Metalloproteasen in dem Vorbehandlungsmedium oder während der Transplantation für die Ausbreitung der transplantierten Zellen von der Stelle der Injektion in das Muskelgewebe des Empfängers hinein vorteilhaft.
Drei Experimente bestätigten, dass eine erhöhte Expression von Enzymen, welche an der Zerstörung der extrazellulären Matrix beteiligt sind, tatsächlich die Migration der Myoblasten begünstigt.
Erstes Experiment: Myoblasten, welche aus CMVLacZ-Mäusen (welche ein β-Galactosidase-Gen exprimieren) gewonnen wurden, wurden für zwei (2) Tage in Gegenwart von zwanzig (20) μg/ml Concanavalin A, einem Lektin, das die Expression von Metalloproteasen stimuliert, gezüchtet. Wenn diese Myoblasten in den Tibialis anterior-Muskel von Empfängermäusen injiziert wurden, wurde die Migration der transplantierten Zellen um das dreifache (3-fache) erhöht, was mit Myoblasten vergleichbar ist, welche keiner Behandlung mit Concanavalin unterzogen wurden.
Zweites Experiment: Um zu überprüfen, ob Metalloproteasen tatsächlich an der verstärkten Ausbreitung von transplantierten Myoblasten beteiligten sind, haben die Erfinder eine immortalisierte Myoblastenzelllinie, welche bereits ein β-Gal-Gen exprimiert, mit einem Expressionsvektor, umfassend ein menschliches Matrilysin-Gen und ein Neomycin-Resistenzgen, stabil transfiziert⁵⁰. Durch diese Transfektion wurde die Fusionskapazität in vitro sowie die Faserbildung in vivo außerordentlich erhöht. Die Expression des β-Gal-Gens wurde gemessen. Der Clon Imm7-Matrilysin wurde mit demselben Clon (Imm7) verglichen, der nur mit dem Neomycin-Resistenzgen transfiziert wurde. Wie aus 2 ersichtlich ist, hatte die Injektion von 500.000 Zellen in den Tibialis anterior-Muskel von Empfängermäusen (nicht bestrahlt und keine Injektion eines myotoxischen Mittels wie Notexin) im Durchschnitt das Vorhandensein (n = 8 Mäuse) von 39 β-Galactosidase-positiven Fasern nach der Injektion des Clons, welcher Matrilysin exprimiert, zur Folge, während bei dem Kontroll-Clon drei (3) Wochen nach der Injektion keine Fasern beobachtet wurden.
Drittes Experiment: Myoblasten eines Tumors, erhalten aus G8-Mäusen, welche mit dem gleichen Konstrukt (Matrilysin- und Neomycin-Rekombinante) transfiziert und mit einem Fluoreszenzfarbstoff (PKH26) markiert wurden, ließ man acht (8) Tage nach der Injektion in den Tibialis anterior-Muskel von Empfängermäusen wandern. Die Migrationsstrecke entsprach dem Drei- bis Vierfachen des Abstandes, welcher mit dem Kontrollkonstrukt beobachtet wurde.
Wenn Myoblasten cloniert werden, wodurch die Fibroblasten entfernt werden, wird angenommen, dass rekombinante Myoblasten, die ein Metalloprotease-Genprodukt exprimieren, nützlich sein könnten, um den Erfolg einer Transplantation per se oder zusammen mit der Erhöhung aufgrund des Vorbehandlungsschrittes mit einem Wachstumsfaktor weiter zu erhöhen.
Alternativ könnten Metalloproteasen zusammen mit den Myoblasten eines Spenders direkt injiziert werden, um die Migration der transplantierten Zellen zu erhöhen.
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Claims

In vitro-Verfahren zum Vorbehandeln von Myoblasten eines Spenders vor einer Transplantation, umfassend a) das Einfügen eines Genkonstrukts, das in der Lage ist, eine Metalloprotease zu exprimieren, die an der Zerstörung extrazellulärer Matrix beteiligt ist, wodurch rekombinante Myoblasten des Spenders erhalten werden, und b) das Züchten der rekombinanten Myoblasten des Spenders in vitro in einem geeigneten Kulturmedium.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Metalloprotease Gelatinase A oder Matrilysin ist.
In vitro-Verfahren zum Vorbehandeln von Myoblasten eines Spenders vor einer Transplantation, umfassend das Züchten der Myoblasten in einem geeigneten Kulturmedium in Gegenwart von Fibroblasten und Concanavalin A.
Verfahren wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert, wobei das Kulturmedium des weiteren einen Wachstums- oder Nahrungsfaktor umfasst, um die Vermehrung der Myoblasten des Spenders zu erhöhen.
Verfahren wie in Anspruch 4 definiert, wobei der Wachstums- oder Nahrungsfaktor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), Insulinwachstumsfaktor I, Transferrin, Blutplättchen-abgeleitetem Wachstumsfaktor, epidermalem Wachstumsfaktor, Adrenocorticotrophin, Makrophagenkolonie-stimulierendem Faktor, Proteinkinase-C-Aktivatoren, Agonisten hiervon, und Kombinationen hiervon.
Verfahren wie in Anspruch 5 definiert, wobei der Faktor bFGF ist.
Verfahren wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert, wobei die Myoblasten des Spenders aus einer primären Myoblastenkultur erhalten wurden, die durch Züchten einer Zelldispersion einer Muskelbiopsie des Spenders gewonnen wurde.
Verfahren wie in Anspruch 7 definiert, wobei die primäre Myoblastenkultur in Gegenwart von 100 ng rekombinantem humanem basischem Fibroblastenwachstumsfaktor pro Milliliter des Kulturmediums für eine Dauer von 48 Stunden vor der Transplantation gezüchtet wird.
Verfahren wie in Anspruch 8 definiert, wobei die primäre Myoblastenkultur in Gegenwart von 100 ng rekombinantem humanem basischem Fibroblastenwachstumsfaktor und 20 μg Concanavalin A pro Milliliter des Kulturmediums für eine Dauer von 48 Stunden vor der Transplantation gezüchtet wird.
Verwendung eines Myoblasten eines Spenders, umfassend ein Genkonstrukt, das in der Lage ist, eine Metalloprotease zu exprimieren, die an der Zerstörung extrazellulärer Matrix beteiligt ist, für die Herstellung eines Medikaments für die Transplantation in ein Gewebe eines Empfängers zur Behandlung rezessiver Myopathien.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Metalloprotease Gelatinase A oder Matrilysin ist.
Verwendung eines Myoblasten eines Spenders, der in vitro vorbehandelt wurde, wobei die Vorbehandlung das Züchten der Myoblasten in einem geeigneten Kulturmedium in Gegenwart von Fibroblasten und Concanavalin A umfasst, für die Herstellung eines Medikaments für die Transplantation in einen Empfänger zur Behandlung rezessiver Myopathien.
Verwendung wie in einem der Ansprüche 10 bis 12 definiert, wobei das Kulturmedium des weiteren einen Wachstums- oder Nahrungsfaktor umfasst, um die Vermehrung der Myoblasten des Spenders zu erhöhen.
Verwendung wie in Anspruch 13 definiert, wobei der Wachstums- oder Nahrungsfaktor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), Insulinwachstumsfaktor I, Transferrin, Blutplättchen-abgeleitetem Wachstumsfaktor, epidermalem Wachstumsfaktor, Adrenocorticotrophin, Makrophagenkolonie-stimulierendem Faktor, Proteinkinase-C-Aktivatoren, Agonisten hiervon, und Kombinationen hiervon.
Verwendung wie in Anspruch 14 definiert, wobei der Faktor bFGF ist.
Verwendung wie in einem der Ansprüche 10 bis 15 definiert, wobei die Myoblasten des Spenders aus einer primären Myoblastenkultur erhalten wurden, die durch Züchten einer Zelldispersion einer Muskelbiopsie des Spenders gewonnen wurde.
Verwendung wie in Anspruch 16 definiert, wobei die primäre Myoblastenkultur in Gegenwart von 100 ng rekombinantem humanem basischem Fibroblastenwachstumsfaktor pro Milliliter des Kulturmediums für eine Dauer von 48 Stunden vor der Transplantation gezüchtet wird.
Verwendung wie in Anspruch 17 definiert, wobei die primäre Myoblastenkultur in Gegenwart von 100 ng rekombinantem humanem basischem Fibroblastenwachstumsfaktor und 20 μg Concanavalin A pro Milliliter des Kulturmediums für eine Dauer von 48 Stunden vor der Transplantation gezüchtet wird.
Verwendung nach Anspruch 10 oder 12, wobei die rezessive Myopathie Duchenne-Muskeldystrophie ist.