-
GEBIET DER ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft flüssige Zusammensetzungen umfassend:
1) eine Laccase; 2) eine Substanz, die (a) in einem wässrigen
Medium ein Substrat für
das Enzym ist, (b) in einem wässrigen
Medium ein Vorläufer
für ein
Substrat für
das Enzym ist, oder (c) ein Co-Faktor für das Enzym ist; 3) eine nicht
wässrige, flüssige Phase;
und 4) höchstens
5 Gew.-% Wasser.
-
Die
Erfindung ist gut geeignet für
eine große
Vielzahl an Anwendungen im Bereich sowohl von Lebensmitteln als
auch außerhalb
davon.
-
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
-
Industrielle
Enzyme wurden allgemein als partikuläre Feststoffe (z. B. in Pulver-
oder granulierter Form, gegebenenfalls mit einer Art von Beschichtung),
oder in Form einer auf Wasser basierenden Lösung formuliert. Eine Anzahl
fester Formulierungen (z. B. Enzympulver) haben den Nachteil, dass
leicht Staubbildung stattfindet, die – wenn keine speziellen Vorsichtsmaßnahmen
getroffen werden – eine
Kontamination der umliegenden Umgebung zum Ergebnis haben kann,
und damit ein Risiko für
die Gesundheit von Personen, die mit solchen Formulierungen hantieren,
darstellt.
-
Während die
Verwendung von auf Wasser basierenden, flüssigen Enzymformulierungen
im Wesentlichen das Risiko einer Staubbildung beseitigt, ist es
aufgrund der Tatsache, dass praktisch alle Enzyme ihre Aktivität in der
Gegenwart von Wasser ausüben,
allgemein nicht möglich,
lagerungsstabile Formulierungen dieser Art herzustellen, welche – in ein
und derselben Zusammensetzung – ein
freies (z. B. nicht eingekapseltes oder unbeschichtetes) Enzym und
zum Beispiel eine Substanz einbringen, die ein Substrat für das Enzym ist
(einschließlich
in diesem Zusammenhang ein Enzymsubstrat, welches, durch die Vermittlung
des Enzyms und normalerweise in Kombination mit einem oder mehreren
weiteren Reaktanden oder Reaktionsmitteln, reagiert, um eine Spezies
zu bilden, die eine weitere anschließende wichtige Reaktion durchläuft, im
Zusammenhang mit dem speziellen Zweck, für den die flüssige Enzymformulierung
beabsichtigt ist).
-
Zum
Beispiel wird es im Zusammenhang mit der Verwendung einer Peroxidase
im Zusammenhang mit einer oxidierbaren Substanz, die als „Mediator" bekannt ist (auch
bekannt als „Verstärker" oder „Beschleuniger") – z. B.
ein Mediator vom substituierten Phenothiazin- oder substituierten
Phenoxazin-Typ – zum
Zwecke der „Farbstofftransfer- Inhibition" (d.h. Inhibition
des Übertragung
von Farbstoff von Gewebe zu Gewebe), im Zusammenhang mit dem Waschen
von gefärbten
Geweben oder Textilien (siehe z. B.
WO
94/12621 und
WO 94/12620 ),
oder zum Bleichen von Geweben, z. B. Drellgewebe (wie in
WO 96/12845 und
WO 96/12846 beschrieben),
allgemein nicht möglich
sein, die Peroxidase und den Mediator (und gegebenenfalls eine Quelle von
Wasserstoffperoxid) in ein und derselben auf Wasser basierenden
flüssigen
Zusammensetzung einzuschließen,
ohne dass eine schnelle Oxidation und anschließende Transformation des Mediators
stattfindet.
US 4,943,530 offenbart
eine flüssige
Enzymformulierung, in der ein Enzym in einer im Wesentlichen wasserfreien Flüssigkeit
zusammen mit einem anorganischen Dispersionsmittel dispergiert ist.
-
Unter
Bezugnahme, wiederum beispielhaft, auf das oben erwähnte Bleichen
von Gewebe (wie Drellgewebe), wird, wenn derzeit erhältliche
flüssige
Enzymformulierungen benutzt werden, die relativ kurze Zeitspanne,
innerhalb der es möglich
ist, zu arbeiten, sobald das Enzym (z. B. eine Peroxidase) mit dem
Mediator in Kontakt gebracht wurde, es oft notwendig machen (i)
das Bereitstellen von separaten Behältern oder Gefäßen (Tanks
oder Ähnlichem),
von denen jeder eine der interagierenden Bestandteile enthält, und
von denen die individuellen Bestandteile in das Medium (wässriges
Medium) dosiert werden können,
in dem der Bleichprozess stattfinden soll, und (ii) ein Dosieren
der individuellen Komponenten aus den jeweiligen Behältern in das
Medium in den korrekten Mengen und den korrekten relativen Verhältnissen.
Damit werden nicht nur mehrere Behälter verlangt, sondern es ist
auch notwendig, mehrere Einheiten an Arbeitsschritten (einschließlich mehrerer
Verteilungs- und Dosierungs-Arbeitsschritte) durchzuführen.
-
Damit
besteht ein Bedarf an flüssigen,
lagerungsstabilen Zusammensetzungen, die (a) nicht nur ein Enzym
enthalten, sondern auch eine Substanz (z. B. eine Substanz von einer
der vorstehend erwähnten
Arten), die ansonsten – in
Gegenwart von Wasser und durch die Vermittlung des Enzyms – eine interessierende Reaktion
durchlaufen wird, und (b) geeignet sind für die nachfolgende Einführung in
oder das Inkontaktbringen mit einem wässrigen Medium, wobei die fragliche
Reaktion gestartet wird. Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen
bereit, die diesen Bedarf erfüllen.
-
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
-
Wie
schon erwähnt,
betrifft die vorliegende Erfindung damit eine flüssige Zusammensetzung, umfassend:
- (A) eine Laccase (EC 1.10.3.2);
- (B) eine Substanz (d.h. eine oder mehrere Substanzen), ausgewählt aus
(i) Substanzen, die in einem wässrigen
Medium Substrate für
das Enzym sind, (ii) Substanzen, die in einem wässrigen Medium Vorläufer für Substrate
für das
Enzym sind, und (iii) Substanzen, die Co-Faktoren für das Enzym
sind;
- (C) eine nicht wässrige,
flüssige
Phase; und
- (D) höchstens
5 Gew.-% Wasser.
-
Die
zulässige
obere Grenze für
den Wassergehalt einer jeweiligen Art einer Ausführungsform einer Zusammensetzung
gemäß der Erfindung
wird unter anderem abhängen
von der Natur und den Eigenschaften des Enzymsubstrats, des Enyzmsubstrat-Vorläufers oder
Enzym-Cofaktors, und der Natur und den Eigenschaften der nicht wässrigen
flüssigen
Phase. Für
bestimmte Arten von Ausführungsformen
der Zusammensetzungen der Erfindung kann es möglich sein, ausreichend stabile
Zusammensetzungen herzustellen, die einen Wassergehalt von ungefähr 5 Gew.-%
oder möglicherweise
sogar höher
haben. Jedoch wird normalerweise ein Wassergehalt, der ungefähr 2 Gew.-%
nicht überschreitet,
bevorzugt sein.
-
Für zahlreiche
Ausführungsformen
der Zusammensetzungen der Erfindung (z. B. Zusammensetzungen der
Arten, die in den Ausführungsbeispielen
hierin beispielhaft dargestellt und getestet werden), wird eine weiter
bevorzugte obere Grenze für
den Wassergehalt normalerweise in der Nähe von 1 Gew.-% der Zusammensetzung
sein. Es wird jedoch allgemein wünschenswert
sein, dass der Wassergehalt vieler Arten von Ausführungsformen
nicht ungefähr
0,8 Gew.% überschreitet,
weiter gewünscht
ungefähr
0,6 Gew.-%, und eine sehr erwünschte
obere Grenze wird oft ungefähr
0,5 Gew.-% sein. Für
bestimmte Ausführungsformen
kann eine obere Grenze für
den Wassergehalt von ungefähr
0,2 Gew.-% geeignet sein, um eine geeignete Stabilität der Zusammensetzung
zu erreichen.
-
Der
Wassergehalt kann auf geeignete Weise bestimmt werden, z. B. durch
so genannte Karl-Fischer-Titration (siehe Z. B. J.S. Fritz und G.H.
Schenk, Jr., Quantitative Analytical Chemistry. 2. Ausgabe, Allyn und
Bacon, Inc., Boston (1969), S. 276, und die darin genannte Referenz).
-
Herstellung von Zusammensetzungen
der Erfindung
-
Was
die Herstellung einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung betrifft, sind
eine Anzahl Vorgehensweisen anwendbar, die hauptsächlich von
der Form abhängen,
in der die Laccase, die darin eingearbeitet werden soll, anfänglich erhältlich ist:
Wenn die Laccase in Form einer im Wesentlichen wasserfreien festen
Zubereitung erhältlich
ist, kann die feste Enzymzubereitung (gegebenenfalls zusammen mit
anderen Bestandteilen der Zusammensetzung, insbesondere Bestandteilen,
die unlöslich
sind oder zumindest geringe Löslichkeit in
der zu verwendenden flüssigen
Phase besitzen) – anschließend an
einen beliebigen Vermahlungsschritt, der nötig sein kann, um feste Partikel
von geeigneter Größe zu erreichen – einfach
in der fraglichen nicht wässrigen,
flüssigen
Phase durch per se bekannte Verfahren dispergiert sein, falls geeignet
im Zusammenhang mit der Zufügung
von einem oder mehreren geeigneten Dispersionsmitteln.
-
In
Fällen,
in denen die Laccase als flüssige
Lösung
oder Konzentrat erhältlich
ist, ist es oft möglich, zur
Lösung/Konzentrat
eine nicht wässrige – oft nicht
mit Wasser mischbare – flüssige Substanz
zuzufügen
(z. B. ein Paraffinöl
oder Ähnliches),
welche gegenüber
den Bestandteilen der Lösung/Konzentrat
inert ist, und mit Wasser ein Azeotrop bildet, und welche daher – unter
geeigneten Temperatur- und Druckbedingungen – verwendet werden kann, um
Wasser aus der Lösung/Konzentrat
durch Destillation zu entfernen (siehe z. B.
EP 0 696 315 ). In solchen Fällen kann
es geeignet sein, portionsweise in Intervallen während des Ablaufs des Destillationsprozesses
(und gegebenenfalls zu Beginn des Destillationsprozesses) eine andere
nicht wässrige Flüssigkeit
zuzufügen,
welche entweder alleine oder in Kombination mit einer oder mehreren
anderen nicht wässrigen
Flüssigkeiten
die flüssige
Phase der endgültigen
Zusammensetzung der Erfindung verkörpern soll. Alternativ können wässrige Enyzmlösungen oder
Konzentrate z. B. einer Sprühtrocknungs-Verfahrensweise unterzogen
werden, wonach die sich ergebende getrocknete feste Enzymzubereitung,
wie schon vorstehend beschrieben, behandelt werden kann.
-
Die
vorstehend beschriebenen Verfahrensweisen zur Herstellung einer
Zusammensetzung gemäß der Erfindung
stellen Aspekte der vorliegenden Erfindung dar.
-
Laccase (EC 1.10.3.2)
-
Enzymklassifikationsnummern
(EC-Nummern), auf die in der vorliegenden Beschreibung mit Ansprüchen Bezug
genommen wird, sind in Übereinstimmung
mit den Recommendations (1992) of the Nomenclature Committe of the
International Union of Biochemistry and Molecular Biology, Academic
Press Inc., 1992.
-
Obwohl
die Laccase in einer Zusammensetzung der Erfindung – wenn die
Löslichkeit
der Laccase in der nicht wässrigen,
flüssigen
Phase genügend
hoch ist – ganz
oder teilweise in gelöster
Form vorliegen kann, ist es im Allgemeinen stark bevorzugt, dass
die Laccase vorwiegend oder im Wesentlichen ausschließlich in fester
(amorpher und/oder kristalliner), allgemein partikulärer Form
vorliegt, bevorzugt dispergiert in der flüssigen Phase. Kristalline Formen
von Enzymen sind im Allgemeinen in diesem Zusammenhang sehr geeignet. Die
wesentliche Abwesenheit von Wasser in den Zusammensetzungen gemäß der Erfindung
macht es allgemein möglich,
freie Enzyme in solchen Ausführungsformen
zu verwenden (d.h. Enzyme, die nicht in irgendeiner Weise eingekapselt
oder beschichtet sind). In einigen Fällen kann es geeignet sein,
zwei oder mehr verschiedene Enzyme in eine Zusammensetzung der Erfindung
einzubringen.
-
Laccasen
sind aus einer Vielzahl von mikrobiellen Quellen erhältlich,
besonders Bakterien und Pilze (einschließlich filamentöse Pilze
und Hefen), und geeignete Beispiele von Laccasen werden unter denen
gefunden, die erhältlich
sind aus Pilzen, einschließlich
Laccasen erhältlich
aus Stämmen
von Aspergillus, Neurospora (z. B. N. crassa), Podospora, Botrytis,
Collybia, Fomes, Lentinus, Pleurotus, Trametes [einige Arten/Stämme dieser
sind unter verschiedenen Namen bekannt und/oder wurden vorher innerhalb
anderer Gattungen klassifiziert; z. B. Trametes villosa = T. pinsitus
= Polyporus pinsitis (auch bekannt als P. pinsitus oder P. villosus)
= Coriolus pinsitus], Polyporus, Rhizoctonia (z. B. R. solani, Coprinus
(z. B. C. plicatilis), Psatyrella, Myceliophthora (z. B. M. thermophila),
Schytalidium, Phlebia (z. B. P. radita; siehe
WO 92/01046 ), Coriolus (z. B. C. hirsutus;
siehe
JP 2-238885 ),
Pyricularia oder Rigidoporus. Bevorzugte Laccasen im Zusammenhang
der Erfindung schließen
Laccase sein, die aus Myceliophthora thermophila erhältlich ist,
und Laccase, die aus Trametes villosa erhältlich ist.
-
Auch
von Interesse im Zusammenhang der Erfindung, insbesondere im Zusammenhang
mit der Verwendung einer Zusammensetzung der Erfindung in der Behandlung
(z. B. dem Bleichen) von Cellulose-haltigem Gewebe oder Textil,
sind modifizierte Oxidasen (z. B. modifizierte Laccasen, umfassend
eine N-terminale, C-terminale und/oder interne Cellulose-Bindedomäne [CBD;
siehe z. B. P. Tomme et al., Cellulose-Binding Domgins Classification
and Properties in Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates,
John N. Saddler und Michael H. Penner (Hrsg.), ACS Symposium Reihe,
Nr. 618 (1996)]. Rekombinante Techniken, die geeignet zur Herstellung
von CBD/Enzymhybriden sind, sind z. B. in
WO 90/00609 ,
WO 94/24158 ,
WO 95/16782 und von Greenwood et al.
in Biotechnology and Bioengineering 44 (1994), S. 1295–1305 beschrieben.
Sie können
zum Beispiel hergestellt werden durch Transformieren in eine Wirtszelle
eines DNA-Konstrukts, das mindestens ein Fragment von DNA umfasst,
das die Cellulose-Bindedomäne
kodiert, ligiert mit oder ohne einem Linker, an eine DNA-Sequenz, die das
interessierende Enzym kodiert (z. B. eine Laccase), und Wachsenlassen
der transformierten Wirtszelle, um das rekombinante Produkt zu exprimieren
(modifiziertes Enzym umfassend eine CBD).
-
Für Laccasen
(und modifizierte Laccasen) wird die Menge an Laccase, die in eine
Zusammensetzung der Erfindung eingebracht wird, allgemein innerhalb
des Bereichs von 0,0001–500
mg sein (als reines Enzymprotein) pro Gramm der Zusammensetzung,
typischer im Bereich von 0,01–50
mg/g. Die Menge an Laccase, die in eine gegebene Zusammensetzung
eingebracht wird, wird unter anderem davon abhängen, ob oder ob nicht große Mengen
an Substanzen wie Puffer oder anderen pH-regulierenden Substanzen
in die Zusammensetzung eingebracht werden sollen. Bei einer typischen
Zusammensetzung der Erfindung, die eine Laccase, ein Laccasesubstrat
wie einen Mediator (vide supra) und einen Puffer in einer geeigneten
Menge enthält,
um einen geeigneten pH in einem wässrigen Medium, in das die
Zusammensetzung eingeführt
werden soll, beizubehalten, wird die Laccasekonzentration in einer
solchen Zusammensetzung geeigneterweise im Bereich von ungefähr 0,1–5 mg/g,
wie im Bereich von 0,25–2
mg/g (als reines Laccaseprotein), oft im Bereich von 0,5–1 mg/g
sein.
-
Enzymsubstrate, Substratvorläufer und
Cofaktoren
-
Substanzen
der Bestandteile des Typs (B) in einer im Wesentlichen wasserfreien,
flüssigen
Zusammensetzung der Erfindung (d.h. Enzymsubstrate, Enzymsubstratvorläufer oder
Enzym-Cofaktoren) können – abhängig unter
anderem von der Löslichkeit
der fraglichen Substanz(en) in der fraglichen, nicht wässrigen, flüssigen Phase – in gelöster und/oder
dispergierter Form in der Zusammensetzung vorliegen.
-
Enzymsubstrate
-
Der
Begriff „Substrat", wie in der vorliegenden
Beschreibung und den Ansprüchen
verwendet, im Zusammenhang mit einer Laccase bezieht sich auf eine
Substanz, die ein Reaktant in einer Reaktion ist, die durch das
Enzym katalysiert wird. Wenn es geeignet ist, ein Enzymsubstrat
in eine Zusammensetzung der Erfindung, wie hierin offenbart, einzubringen,
wird die Natur des/der Enzymsubstrat(e), das/die für diesen
Zweck geeignet ist/sind, unter anderem nicht nur von der Art der
Laccase abhängen,
die in der Zusammensetzung vorliegen soll, sondern auch von der
beabsichtigten Anwendung der Zusammensetzung.
-
Substrate für Laccasen
-
(i) Mediatoren:
-
Wichtige
Ausführungsformen
einer Zusammensetzung der Erfindung sind Zusammensetzungen umfassend
eine Laccase zusammen mit einem oxidierbaren Substrat, welches als
Mediator wirkt (vide supra). Der Mediator in einer Zusammensetzung
der Erfindung kann jeglicher Mediator sein, der zur Verwendung mit
einer Laccase geeignet ist. Beispiele für Mediatoren schließen die
folgenden ein: Halogenionen (z. B. Chlorid und Bromid); bestimmte
Metallionen (z. B. Mn
2+); Phenolarten (z.
B. Acetosyringon (4-Hydroxy-3,5-dimethoxyacetophenon), Syringaldehyd
(Hydroxy-3,5-dimethoxybenzaldehyd), Syringasäure (4-Hydroxy-3,5-dimethoxybenzoesäure), Alkylsyringate
(wie Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Hexyl- oder Octylsyringat)
und anderen Syringasäureestern
[z. B. Syringasäureester
von Polyethylenglykolen (PEGs) verschiedener Molekulargewichte, wie
einem PEG 4000-Syringat],
Ethyl-3-(4-Hydroxy-3, 5-dimethoxyphenyl)acrylat, p-Hydroxyzimtsäure, 2,4-Dichlorphenol, Vanillin,
7-Hydroxycumarin, 6-Hydroxy-2-naphthoesäure, und p-Hydroxybenzolsulfonat]; 2,2'-Azino-bis-3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonat
(ABTS; siehe z. B.
WO 94/12620 );
und 10-Methyl-, 10-Ethyl- und 10-Propylphenothiazin (siehe z. B.
WO 94/12621 ). Andere geeignete
Mediatoren sind z. B. beschrieben in
WO 94/12619 ,
WO 94/12620 and
WO 94/12621 .
-
Mediatoren
vom Syringat-, Phenoxazin- oder Phenothiazin-Typ sind allgemein
sehr geeignet im Zusammenhang der Erfindung, und einige Beispiele
dafür sind
Acetosyringon, Methylsyringat, 10-Phenothiazinpropionsäure, 10-Ethylphenothiazin-4-carbonsäure, 10-Phenoxazinpropionsäure und
10-Methylphenoxazin (beschrieben in
WO
94/12621 ).
-
Ein
Mediator wird allgemein in einer Zusammensetzung der Erfindung in
einer Menge von von 10–7 bis 10–2 Mol/g
der Zusammensetzung vorhanden sein und oft in einer Menge von von
10–5 bis
10–3 Mol/g
der Zusammensetzung.
-
(ii) Farbstoff-Vorläufer:
-
Weitere
wichtige Ausführungsformen
einer Zusammensetzung der Erfindung sind Zusammensetzungen umfassend
eine Laccase zusammen mit einem oder mehreren oxidierbaren Substraten
in der Form von Farbstoff-Vorläufer(n),
der/die in der Gegenwart von Wasser einer Laccase-katalysierten
Oxidation unterzogen wird/werden (im Allgemeinen oxidative Radikalbildung),
und anschließend
polymerisiert wird/werden, um einen Farbstoff einer speziellen Farbe
zu bilden. Solche Laccase-vermittelte Farbstoffbildung findet wichtige
industrielle Anwendungen im Färben
von Textilien (z. B. Wolle, Baumwolle und/oder synthetische Materialien), Garn,
Fell, Häuten
und Ähnlichem,
und im Gebiet von Körperpflegeprodukten
für Menschen,
wo sie als geeignet für
die Verwendung z. B. zum Färben
von Haaren gefunden wurde.
-
Wie
in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendet, soll der Begriff „Farbstoff-Vorläufer" nicht nur eine individuelle
Substanz umfassen, die nach Oxidation in der Gegenwart einer Laccase
zu einem stark gefärbten
Farbstoff führt,
sondern auch eine individuelle Substanz, die nach Oxidation in einer
entsprechenden Weise nicht selbst alleine zu einem Produkt führt, das
eine starke Farbe hat, sondern welche, wenn sie Oxidation in Gegenwart
einer Substanz der vorherigen Kategorie von stark färbenden
Substanzen unterzogen wird, zu einer Modifikation der sich ergebenden
Farbe des Farbstoffs führt.
Oxidierbare Substanzen, die eine solche modifizierende Wirkung auf
die allgemeine Farbstofffarbe ausüben (solche Substanzen werden
manchmal als „Modifizierer" bezeichnet), sind
damit in die Bedeutung des Begriffs „Farbstoff-Vorläufer", wie im Zusammenhang
der Erfindung benutzt, eingeschlossen.
-
Beispiele
für Farbstoff-Vorläufer, die
geeignet zur Einarbeitung in eine Zusammensetzung der Erfindung
sind, schließen
ein, sind aber nicht beschränkt
auf: aromatische Diamine; Diamino-substituierte aromatische Carbonsäuren und
Ester davon; Aminophenole; Phenole; Naphthole; und Phenolderivate
von Zimtsäuren
und Ester davon.
-
Beispiele
für aromatische
Diamine schließen
ein:
2-Methyl-1,4-diaminobenzol,
4-Methyl-o-phenylendiamin,
4-Diaminobenzol(p-Phenylendiamin),
2-Methoxy-p-phenylendiamin,
2-Methyl-1,4-diaminobenzol
(p-Toluylendiamin),
2-Chlor-1,4-diaminobenzol (o-Chlor-p-phenylendiamin),
4-Aminodiphenylamin
(N-Phenyl-p-phenylendiamin),
1-Amino-4-β-methoxyethylamino-benzol(N-β-Methoxyethyl-p-phenylendiamin),
1-Amino-4-bis-(β-hydroxyethyl)-aminobenzol
(N,N-bis-(β-Hydroxyethyl)-p-phenylendiamin),
1,3-Diaminobenzol
(m-Phenylendiamin),
2-Methyl-1,3-diaminobenzol (2,6-Diaminotoluol),
2,4-Diaminotoluol,
und
2,6-Diaminopyridin.
-
Beispiele
für Diamino-substituierte
aromatische Carbonsäuren
und Ester davon schließen
ein:
2,3-Diaminobenzoesäure,
3,4-Diaminobenzoesäure,
und
Ester, z. B. Niederalkylester (wie Methyl, Ethyl, Propyl, 2-Propyl
oder Butylester) davon.
-
Beispiele
für Aminophenole
schließen
ein:
1-Hydroxy-2-aminobenzol (o-Aminophenol),
1-Hydroxy-3-aminobenzol
(m-Aminophenol),
1-Methyl-2-hydroxy-4-aminobenzol (3-Amino
o-Cresol),
1-Methyl-2-hydroxy-4-β-hydroxyethylaminobenzol (2-Hydroxy-4-β-hydroxyethylaminotoluol),
1-Hydroxy-4-aminobenzol
(p-Aminophenol),
1-Hydroxy-4-methylaminobenzol (p-Methylaminophenol),
1-Methoxy-2,4-diaminobenzol
(2,4-Diaminoanisol),
1-Ethoxy-2,3-diaminobenzol (2,4-Diaminophenetol),
und
1-β-Hydroxyethyloxy-2,4-diaminobenzol
(2,4-Diaminophenoxyethanol).
-
Beispiele
für Phenole
und Naphthole schließen
ein:
1,2-Dihydroxybenzol (Pyrocatechol),
1,3-Dihydroxybenzol
(Resorcinol),
1,3-Dihydroxy-2-methylbenzol (2-Methylresorcinol),
1,3-Dihydroxy-4-chlorbenzol
(4-Chlorresorcinol),
1,2,3-Trihydroxybenzol (Pyrogallol),
1,2,4-Trihydroxybenzol,
1,2,4-Trihydroxy-5-methylbenzol
(2,4,5-Trihydroxytoluol),
1,2,4-Trihydroxytoluol, 1,5-Dihydroxynaphthalin,
1,4-Dihydroxybenzol
(Hydrochinon), und 1-Hydroxynaphthalin (α-Naphthol).
-
Beispiele
für Phenolderivate
von Zimtsäuren
und Ester davon schließen
ein:
p-Cumarinsäure
(d.h. 4-Hydroxyzimtsäure),
Koffeinsäure (d.h.
3,4-Dihydroxyzimtsäure),
Sinapinsäure (Sinapinsäure; d.h.
3,5-Dimethoxy-4-hydroxyzimtsäure),
Ferulasäure (d.h.
4-Hydroxy-3-methoxyzimtsäure),
und Ester, z. B. Niederalkylester (wie Methyl-, Ethyl-, Propyl-,
2-Propyl-or Butylester), von einem beliebigen von diesen.
-
Es
kann angemerkt werden, dass im Fall von Zimtsäurederivaten wie die vorstehend
erwähnten
(von denen alle käuflich
erhältlich
sind), es anscheinend nicht klar festgestellt werden muss, ob sie
eine oder beide von beiden möglichen
geometrischen Formen (cis bzw. trans) umfassen; es scheint jedoch
wahrscheinlich, dass die trans-Form allgemein vorherrschend ist.
-
Andere
interessierende Substanzen als Farbstoff-Vorläufer im Zusammenhang mit der
Erfindung schließen
Salicylsäure
(d.h. 2-Hydroxybenzoesäure)
und Ester (z. B. Niederalkylester wie Methyl-, Ethyl-, Propyl-,
2-Propyl- oder Butylester) davon ein.
-
(iii) Andere Substrate:
-
Laccasen
haben sich als sehr geeignet gezeigt, um ein Gelieren von Polysachariden,
die phenolische Substituenten enthalten, zu verursachen (z. B. Arabinoxylane
aus Weizen oder Kleie, oder Pektine aus Zuckerrüben und verwandten Pflanzen)
für Nahrungsmittelanwendungen
oder zur Herstellung von stark wasserabsorbierenden Materialien
(siehe z. B.
WO 96/03440 ). Ähnlich hat
sich gezeigt, dass Laccasen sehr nützliche Anwendungen in der
Herstellung von Produkten auf Lignocellulose-Basis aus Lignocellulosematerial
(z. B. Faserstoff aus Holz) und phenolischen Polysachariden wie
die oben erwähnten
Arabinoxylane oder Pektine haben (siehe z. B.
WO 96/03546 ).
-
Es
wäre damit
geeignet, eine Zusammensetzung der Erfindung bereitzustellen, die
z. B. geeignete Mengen einer Laccase und eines Laccasesubstrats
in Form eines phenolischen Polysacharids umfasst. Solche eine gebrauchsfertige,
lagerungsstabile Zusammensetzung könnte vorteilhafterweise für die vorstehend erwähnten Anwendungen
verwendet werden.
-
Enzymsubstrat-Vorläufer
-
Der
Begriff „Vorläufer", wie in der vorliegenden
Beschreibung und den Ansprüchen
verwendet, in Bezug auf ein Substrat für ein Enzym, das in eine flüssige Zusammensetzung
der Erfindung eingebracht wird, bezeichnet eine Substanz oder Substanzen,
die unter Bedingungen, die in der Verwendung der Zusammensetzung
vorherrschen, das Enzymsubstrat per se erzeugt/erzeugen.
-
Cofaktoren
-
Der
Begriff „Cofaktor", wie in der vorliegenden
Beschreibung und den Ansprüchen
verwendet, im Zusammenhang mit einem Enzym, das in einer flüssigen Zusammensetzung
der Erfindung eingearbeitet ist, bezieht sich auf jeden beliebigen
organischen oder anorganischen Faktor, der für die Aktivität des Enzyms
notwendig ist.
-
Ein
Co-Faktor ist allgemein eine Nicht-Proteinspezies von relativ geringem
Molekulargewichts, und kann normalerweise eingeteilt werden als
entweder
- (i) so genanntes „Coenzym" [z. B. Coenzym A, Coenzym Q (Ubichinon)
oder Coenzym I (NADP, Nikotinamidadenindinukleotidphosphat)], d.h.
eine vergleichsweise kleine organische Spezies, deren Gegenwart
in stöchiometrischen
Mengen wesentlich für
die Aktivität
eines speziellen Enzyms ist, oder
- (ii) eine anorganische ionische Spezies (z. B. ein Metallion
wie Ca2+ oder Cu2+).
-
Nicht wässrige, flüssige Phasen
-
Nicht
wässrige,
flüssige
Phasen in Zusammensetzungen der Erfindung können einzelne Bestandteile oder
Mischungen von zwei oder mehr Bestandteilen sein.
-
Die
Natur der nicht wässrigen,
flüssigen
Phase, die in einer Zusammensetzung der Erfindung verwendet wird,
wird klar unter anderem abhängen
von den physikalischen und chemischen Eigenschaften der/des Enzyme(s)
und den anderen Substanzen, die in die Zusammensetzung eingebracht
werden, und von der beabsichtigten Verwendung der endgültigen Zusammensetzung.
Die nicht-wässrige
flüssige
Phase in einer Zusammensetzung der Erfindung kann eine mit Wasser
mischbare, nicht wässrige
Flüssigkeit
umfassen, oder eine im Wesentlichen mit Wasser nicht mischbare,
nicht wässrige
Flüssigkeit
oder beides.
-
Nahrungsmittelanwendungen
-
Wenn
die Zusammensetzung eine ist, die zum direkten oder indirekten Gebrauch
zur Zubereitung eines Nahrungsmittels oder als Zutat zu einem Nahrungsmittel
bestimmt ist, insbesondere einem Nahrungsmittel oder einer Zutat
zu einem Nahrungsmittel zum menschlichen Verzehr, dann wird die
nicht wässrige,
flüssige Phase
normalerweise mindestens die behördliche
Bestimmungen oder andere Bestimmungen betreffs ihrer Sicherheit
erfüllen
müssen
(fehlende Giftigkeit, physiologische Verträglichkeit, etc.).
-
Bei
einigen Ausführungsformen
von Zusammensetzungen, die für
solche Zwecke bestimmt sind, kann die nicht wässrige, flüssige Phase geeigneterweise
oft, z. B. ein oder mehrere verzehrbare Öle umfassen, z. B. Sojabohnenöl, Maisöl (Maisöl) oder
Olivenöl,
von denen alle in hohem Maße
nicht mit Wasser mischbar sind. Andere nicht-wässrige flüssige Phasen von Bedeutung
zum Einbringen in solche Zusammensetzungen, gegebenenfalls – aber oft
sehr geeignet – in
Kombination mit einem oder mehreren verzehrbaren Ölen (z.
B. eines oder mehrere der vorstehend erwähnten), sind bestimmte oberflächenaktive
Mittel (Tenside), wie bestimmte nicht ionische Tenside des Typs
SpanTM [z. B. SpanTM 20
(Sorbitan-Monolaurat) oder SpanTM 80 (Sorbitan-Monooleat)]
oder vom TweenTM-Typ [z. B. TweenTM 80 (Polyoxyethylen (20) Sorbitan-Monooleat),
welches mit Wasser leicht mischbar ist].
-
Andere
mit Wasser mischbare, nicht wässrige
Flüssigkeiten,
die geeignet zum Einbringen in einige Ausführungsformen von Zusammensetzungen
der Erfindung sind, die für
Nahrungsmittelanwendungen bestimmt sind, schließen z. B. hydroxylgruppenhaltige
Flüssigkeiten
ein wie Ethanol, Propylenglykol, Glycerin, oder Polyethylenglykole
(PEG) verschiedener durchschnittlicher Molekulargewichte (z. B.
PEG 200, PEG 400 oder PEG 600).
-
Anwendungen außerhalb
des Nahrungsmittelbereichs
-
Nicht
wässrige,
flüssige
Phasen, die Bestandteile umfassen, die unter den vorstehend erwähnten ausgewählt sind,
sind auch von Bedeutung im Zusammenhang mit Ausführungsformen einer Zusammensetzung der
Erfindung, die für
Anwendungen außerhalb
des Nahrungsmittelbereichs bestimmt ist. Weitere, mit Wasser nicht
mischbare interessierende Materialien vom Öltyp in diesem Zusammenhang
schließen
z. B. ein Paraffinöle
und bestimmte Silikonöle.
Weitere relevante Tenside schließen ein flüssige, nicht ionische Tenside
vom Typ ethoxylierter und/oder propoxylierter aliphatischer Alkohole
[z. B. SoftanolTM 50 von BP Chemicals (das
Kondensationsprodukt von C12-C14 geradkettigen,
aliphatischen Alkoholen mit 5 Mol Ethylenoxid)], und vom Typ der
durch TritonTM X-100 vertreten wird (= Polyethylenglykol
4-Isooctylphenylether), d.h. das 1:1-Produkt einer Veretherungs-Kondensation
eines Alkylphenols (insbesondere eines 4-Alkylphenols) mit einem Polyalkylenglykol,
wobei Substanzen dieser Art manchmal als „Alkylphenolalkoxylate" bezeichnet werden.
-
Weitere,
mit Wasser mischbare, nicht wässrige
flüssige
Phasen, die zum Einbringen in Ausführungsformen einer Zusammensetzung
der Erfindung für
Anwendungen außerhalb
des Nahrungsmittelbereichs geeignet sind, schließen z. B. Ethylenglykol und
Glykolether (wie Diethylenglykoldimethyl- oder -diethylether) ein.
-
Andere Bestandteile
-
Andere
Bestandteile, die zum Einschließen
in bestimmte Ausführungsformen
von Zusammensetzungen gemäß der Erfindung
geeignet sind, schließen
ein, sind aber nicht beschränkt
auf die folgenden:
-
Dispersionsmittel:
-
Dispersionsmittel
[d.h. Materialien, die helfen, eine Trennung (z. B. Ausfällen) von
dispergierten festen Substanzen zu verhindern oder zu verzögern] schließen ein
z. B.: bestimmte, fein verteilte Tonerden [wie Kaolin (Porzellanerde),
Bentonit, Fuller-Erde
und Ähnliches];
und natürlich
vorkommende und synthetische Polymere, z. B. so genannte „entflockende
Polymere", sowie
amphipathische Materialien vom anionischen Polymertyp.
-
Mittel zum Regulieren der Viskosität:
-
Beispiele
für Materialien,
die geeignet sind, die Viskosität
von Ausführungsformen
von Zusammensetzungen der Erfindung zu erhöhen, schließen verschiedene Gütestufen
von Quarzstaub (z. B. verkauft unter Markennamen wie AerosilTM, Cab-O-SilTM oder
Tix-O-SilTM), Bentonit, Kaolin, fein verteiltes
Calciumcarbonat, Organo-Polysilikate (z. B. ClaytoneTM)
und polymere Materialien wie Hydroxypropylcellulose (z. B. NatrosolTM) und Xanthangummis ein.
-
Mittel zum Regulieren des pH-Werts:
-
Beispiele
für Mittel
zum Regulieren des pH-Werts, die geeignet zum Einbringen in einige
Ausführungsformen
einer Zusammensetzung der Erfindung sind [d.h. Substanzen, die,
wenn die Zusammensetzung der Erfindung mit einem flüssigen Medium
in Kontakt gebracht wird, beim Anpassen und/oder Beibehalten (d.h. Puffern)
des pHs des Mediums helfen, um einen pH-Wert bereitzustellen, der
mit den pH-empfindlichen
Bestandteilen der Zusammensetzung verträglich ist (wie einem darin
vorhandenen Enzym)], schließen
verschiedene wasserfreie anorganische und organische Salze ein,
wie Pyrophosphate (z. B. Natriumdihydrogenpyrophosphat, Na2H2P2O7), verschiedene Polyphosphate, Kaliumdihydrogenphosphat
(KH2PO4), Natriumhydrogencarbonat
(NaHCO3), Kaliumacetat (CH3COOK)
und Natriumacetat (CH3COONa), sowie Benzoesäure/Benzoatpuffer.
-
Antioxidantien:
-
Bei
bestimmten Ausführungsformen
von Zusammensetzungen der Erfindung kann es vorteilhaft sein, in
die Zusammensetzung eine Substanz einzubringen (ein Antioxidans),
das einen oxidationsempfindlichen Bestandteil der Zusammensetzung
gegen Oxidation schützen
kann (z. B. durch Luftsauerstoff). Solche Substanzen schließen z. B.
Salze wie Sulfite (z. B. Natriumsulfit) und Thiosulfate (z. B. Natriumthiosulfat)
ein, sowie organische Antioxidantien wie Methionin, Ascorbinsäure oder
Lezithine.
-
Hilfsstoffe für die Detergenszusammensetzung:
-
Es
wird offensichtlich sein, dass bestimmte Ausführungsformen einer Zusammensetzung
gemäß der Erfindung
(z. B. Ausführungsformen,
die eine nicht wässrige,
flüssige
Phase in Form eines nicht ionischen Tensids umfassen) als eigene
Detergenszusammensetzungen verwendet werden können. Beispiele dafür sind Zusammensetzungen,
die eine Laccase, einen Mediator und ein flüssiges nicht ionisches Tensid
enthalten, wobei solche Anwendungen als Detergentien zum Waschen
von bunten (gefärbten)
Textilien bei gleichzeitiger Inhibition des Farbstofftransfers verwendbar
sind.
-
Wenn
es geeignet ist, können
verschiedene Hilfsstoffe, die verwendet werden, um die Waschleistung der
Detergenszusammensetzungen zu erhöhen, zusätzlich in solche Zusammensetzungen
der Erfindung eingebracht werden. Solche Hilfsstoffe schließen ein,
sind aber nicht beschränkt
auf die folgenden: Weitere Tenside [z. B. lineare Alkylbenzolsulfonate
(LAS), oder Alkylpolyglykoside]; Mittel gegen das Wiederablagern
von Schmutz [z. B. Polyvinylpyrrolidon (PVP), oder Cellulosederivate
wie Methylcellulose, Hydroxyethylcellulose oder Carboxymethylcellulose];
und Builder (z. B. Zeolithe, Polycarboxylate, Phosphate oder Silikate).
-
Vorläuferstoffe
von Desinfektionsmitteln:
-
Die
vorliegende Erfindung macht es möglich,
lagerungsstabile Zusammensetzungen herzustellen, die, wenn sie mit
einem geeigneten wässrigen
Medium in Kontakt gebracht werden, eine antimikrobielle (z. B. fungizide
oder bakteriozide) Substanz erzeugen, die zur Desinfektion eines
durch mikrobielle Organismen kontaminierten Ortes geeignet ist.
Solche Zusammensetzungen können
zum Beispiel für
die industrielle Verwendung als Desinfektionsmittel zum Desinfizieren
von durch mikrobielle Organismen kontaminierten Oberflächen, Flächen, Objekten,
Gebrauchsgegenständen
und Ähnlichem
verwendbar sein, oder zur Verwendung in der Körperpflege als Desinfektionsmittel
zur Desinfektion von Zahnprotesen, Kontaktlinsen, Haut, Wunden, etc.
-
Oligosacharide:
-
Die
derzeitigen Erfinder haben beobachtet, besonders im Fall von Zusammensetzungen
gemäß der Erfindung,
die eine Laccase umfassen, dass die Gegenwart einer relativ kleinen
Menge (z. B. ungefähr
1 bis 2 Gew.-% der Zusammensetzung) eines Dextrins (d.h. ein Oligosacharid,
das durch teilweise Hydrolyse von Stärke erhältlich ist) zu einer deutlichen
Verbesserung der Lagerungsstabilität der Zusammensetzung führen kann,
insbesondere bei relativ hohen Temperaturen (bis zu ungefähr 40°C). Daher
zeigte zum Beispiel [und wie in den Ausführungsbeispielen hierin gezeigt
(vide infra)] eine Zusammensetzung der Erfindung, die ausgehend
von einem alkalischen (pH 9) M. thermophila-Laccasekonzentrat zubereitet
wurde, und die Benzoesäure/Natriumbenzoat
als Puffer und etwa 2 Gew.-% Dextrin enthielt, eine bemerkenswerte
Lagerungsstabilität
bei 40°C
(gemessen als Grad der Beibehaltung der Bleichleistung); ähnliche
Ergebnisse wurden unter der Verwendung von z. B. Natriumdihydrogenpyrophosphat
als pH-regulierendem Mittel an Stelle von Benzoesäure/Natriumbenzoat
beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigten entsprechende Zusammensetzungen,
die ca. 2 Gew.-% von Maltose oder Glukose anstatt Dextrin enthielten,
signifikant schlechtere Lagerungsstabilität. Es scheint daher, dass Oligosacharide
wie Dextrine verwendet werden können,
um die Stabilität
von bestimmten Ausführungsformen
von im Wesentlichen wasserfreien, flüssigen Zusammensetzungen der
Erfindung verstärken
zu können.
-
Anwendungsgebiete von Zusammensetzungen
der Erfindung
-
Eine
Anzahl von Anwendungsgebieten wurde in einem gewissen Maße schon
vorstehend erwähnt. Um
es zusammenzufassen, schließen
nicht begrenzende Anwendungsgebiete von Zusammensetzungen der Erfindung
z. B. die folgenden ein: Färben
von Haaren; Färben
von Textilien; Detergensanwendungen (Anwendungen beim Waschen von
Textilien als Detergens per se, oder als Zusatzstoff für eine Detergenszusammensetzung);
Inhibition von Farbstofftransfer beim Waschen von Textilien; Bleichen
von Textilien (z. B. Bleichen von Drell); Desinfektion; die Entwicklung
von Geschmack in Nahrungsmitteln; Gelieren von Polysacchariden zur
Verwendung in Nahrungsmitteln; und Binden von phenolischen Polysacchariden
an Lignocellulosematerialien (z. B. zum Herstellen von Faserplatten,
Pappe und ähnlichen,
auf Lignocellulose basierenden Materialien).
-
Andere
interessierende Anwendungen der Erfindung auf dem Gebiet der Körperpflege
schließen
Anwendungen zum Reinigen von Kontaktlinsen, in der Zahnpflege und
in der Mundhygiene ein.
-
Was
Anwendungen der Erfindung für
Zahnpflege und Mundhygiene betrifft, schließen besonders interessante
Aspekte ein Weißmachen
(Bleichen) von Zähnen
und Munddesinfektion ein, unter Verwendung von Formulierungen (z.
B. Zahnpasten oder flüssige
Konzentrate, die in Wasser verdünnt
werden können,
um eine Mundspülung
oder Ähnliches
zu ergeben), die im Wesentlichen wasserfreie Zusammensetzungen der
Erfindung bilden.
-
Die
Erfindung wird weiterhin durch die folgenden nachstehend gezeigten
Ausführungsbeispiele
illustriert, von denen nicht beabsichtigt ist, dass sie in irgendeiner
Weise den Schutzbereich der Erfindung begrenzen.
-
MATERIALIEN UND METHODEN
-
Materialien,
die im Zusammenhang mit den nachstehend gezeigten Ausführungsbeispielen
benutzt werden, schließen
die folgenden ein (Händler
und weitere Details werden in Klammern gezeigt):
Laccase aus
Trametes villosa (flüssiges
Konzentrat, hergestellt durch Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark;
Trockenmassegehalt nach Mettler 29,5 Gew.-%, ungefähr 20 mg
reines Laccaseprotein pro Gramm Konzentrat);
Laccase aus Myceliophthora
thermophila (wässrige
Konzentrate, hergestellt durch Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark;
Trockenmassegehalt nach Mettler 18,5 Gew.-% oder 23,0 Gew.-%; ungefähr 50 mg
reines, aktive Laccaseprotein pro Gramm Konzentrat);
IsoparTM G (ein Paraffinöl; Exxon);
SpanTM 80 (Emulgator; ICI);
DPX 6592 (ein
in Öl lösliches,
anionisches polymeres amphipathisches Dispersionsmittel; erhalten
von Allied Colloids Limited, England);
AC31 (ein in Öl lösliches,
anionisches polymeres amphipathisches Dispersionsmittel; erhalten
von Allied Colloids Limited, England);
SoftanolTM 50
(ein nicht ionisches Tensid von der Art eines aliphatischen ethoxylierten
Alkohols, vide supra; BP Chemicals);
Glycerin [in „Fond Chemicals
Codex (FCC) Reinheitsstufe; Solvay oder Dow Chemical];
AerosilTM 200 (Quarzstaub, spezifische Oberfläche 200
m2 pro Gramm; Degussa);
SpeswhiteTM (Kaolin; ECC International);
ClaycoteTM (Kaolin; Goonvean); GlucidexTM D21
(Dextrin; Roquette Frères);
10-Phenothiazinpropionsäure (PPT,
Mediator ; Rhône-Poulenc);
Methylsyringat
(MS, Mediator; Inventaa);
o-Aminophenol (Aldrich);
m-Phenylendiamin
(Aldrich);
Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4);
Natriumbenzoat (Pulver; Merck);
Benzoesäure (Pulver;
Merck);
Glycin (Merck);
6'' De
Meo Virgin Natural White Hair (De Meo Brothers Inc., USA) Shampoo
(MiniriskTM; Handelsprodukt von SuperBrugsen,
Dänemark).
-
BEISPIEL 1: Zubereitung einer im Wesentlichen
wasserfreien, PPT-enthaltenden Dispersion (Aufschlämmung) von
Laccase (Laccase aus T. villosa)
-
Zubereitung einer Laccasedispersion
-
Pro
1000 g endgültiger
Enzymdispersion:
263,6 g IsoparTM G
werden mit 54,0 g SpanTM 80 und 230,0 g
DPX 6592 gemischt. Die Mischung wird auf Eis gestellt. 1017,0 g
Laccasekonzentrat aus T. villosa wird zur gekühlten Mischung innerhalb einer
Zeitspanne von einer Minute zugefügt, während die Mischung einer Homogenisierung
unterzogen wird (z. B. mit einem Silverson-Mixer mit hoher Scherkraft; „Silverson
high shear mixer").
Die Homogenisierung wird 30 Minuten lang fortgesetzt, um eine Emulsion
zu erhalten (wässrige
Phase in Ölphase).
Während
dieser Zeitdauer wird die Temperatur unter 15°C gehalten. Weitere 695,4 g
IsoparTM G werden dann als Verdünnungsmittel
zugefügt.
-
Das
Wasser wird aus der sich ergebenden Emulsion durch azeotrope Destillation
von Wasser/IsoparTM G unter Vakuum bei einer
konstanten Temperatur von ungefähr
15°C entfernt.
Nach der Entfernung von fast allem Wasser werden 600 g SoftanolTM 50 zur entwässerten Enzymdispersion zugefügt. Die
Temperatur der sich ergebenden Dispersion wird dann auf ungefähr 90°C unter Vakuum
erhöht,
um das verbleibende IsoparTM G zu entfernen.
-
Die
sich ergebende Laccasedispersion [30 Gew.-% Gehalt an gesamten Feststoffen;
vorherrschende Partikelgröße ca. 1,3 μm; Wassergehalt
(wie durch Karl-Fischer-Titration bestimmt; siehe z. B. J.S. Fritz
und G.H. Schenk, Jr., Quantitative Analytical Chemistry, 2.
-
Ausgabe,
Allyn und Bacon, Inc., Boston (1969), S. 276 und die darin angegebene
Referenz) ca. 0,2 Gew.-%] wird auf Raumtemperatur gekühlt.
-
Zubereitung von PPT-enthaltender Laccasedispersion
(Aufschlämmung)
-
- (a) Eine Mischung, die aus 90 Gew.-% SoftanolTM 50 und 10 Gew.-% AerosilTM 200
besteht, wird durch Zufügen
von 0,50 kg von AerosilTM 200 zu 4,50 kg
SoftanolTM 50 hergestellt. Nach dem Verrühren wird
die Mischung homogenisiert (z. B. mit einer Fryma-Mühle).
6,0
g PPT werden in 94 g der homogenisierten SoftanolTM 50/AerosilTM 200-Mischung
durch Magnetrühren und
Erhitzen auf ca. 40°C
gelöst.
54,5 g der sich ergebenden PPT-Lösung
werden mit 5,8 g der SoftanolTM 50/AerosilTM 200-Mischung,
6,3 g SoftanolTM 50, 6,84 g Laccasedispersion
aus T. villosa (vide supra) und 75,6 g KH2PO4 gemischt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur
gerührt
und schließlich
mit einem Ultra-Turrax-Gerät
2 Minuten lang homogenisiert, was das Endprodukt ergibt (etwa 189
g).
- (b) Eine PPT-enthaltende Laccasedispersion (Aufschlämmung) ähnlich zur
vorstehend genannten, die aber Kaolin als Dispersions-/Verdickungsmittel
enthält,
kann wie folgt hergestellt werden.
Eine Mischung, die aus 89
Gew.-% SoftanolTM 50 und 11 Gew.-% AerosilTM 200 besteht, wird durch Zufügen von
0,55 kg AerosilTM 200 zu 4,45 kg SoftanolTM 50 hergestellt. Nach dem Rühren wird
die Mischung homogenisiert (z. B. mit einer Fryma-Mühle).
54,0
g PPT werden in 546 g der homogenisierten SoftanolTM 50/AerosilTM 200-Mischung
durch Magnetrühren
und Erhitzen auf etwa 40°C
gelöst.
140 g der sich ergebenden PPT-Lösung
werden mit 63,7 g der SoftanolTM 50/AerosilTM 200-Mischung,
11,5 g SoftanolTM 50, 15,75 g Laccasedispersion,
168 g KH2PO4 und
21 g SpeswhiteTM gemischt. Die Mischung
wird bei Raumtemperatur gerührt
und schließlich
mit einem Ultra-Turrax-Gerät
2 Minuten lang homogenisiert, was das Endprodukt ergibt (ca. 420
g).
-
BEISPIEL 2: Verwendung einer PPT-enthaltenden
Laccasedispersion aus T. villosa (Aufschlämmung) zum Bleichen von Drell
-
(a) Quantifizieren des Bleichgrades
-
Ein
Minolta Chromameter CR 300 wurde verwendet, um den Bleichgrad zu
quantifizieren, unter Verwendung der Änderung im Farbenraum (Koordinaten)
L*a*b* (CIELAB-System; L* zeigt die Änderung an Schwarz (–L*)/Weiß (+L*),
a* zeigt die Änderung
an Grün
(–a*)/Rot
(+a*), und b* zeigt die Änderung
an Blau (–b*)/Gelb)
(+b*). Eine Verringerung von L* bedeutet einen Anstieg an schwarzer
Farbe (Verringerung von weißer
Farbe), ein Anstieg an L* bedeutet einen Anstieg an weißer Farbe
(Verringerung von schwarzer Farbe); eine Verringerung von a* bedeutet
einen Anstieg an grüner
Farbe (eine Verringerung von roter Farbe), ein Anstieg an a* bedeutet
einen Anstieg an roter Farbe (eine Verringerung von grüner Farbe);
eine Verringerung von b* bedeutet einen Anstieg an blauer Farbe
(eine Verringerung von gelber Farbe), und ein Anstieg an b* bedeutet
einen Anstieg an gelber Farbe (eine Verringerung von blauer Farbe),
in Übereinstimmung
mit der nachstehenden Tabelle.
– (minus) | Koordinate | +
(plus) |
schwarz | L* | weiß |
grün | a* | rot |
blau | b* | gelb |
-
Das
Minolta Chromameter CR300 wurde im L*a*b*-Farbenraum benutzt. Die
verwendete Lichtquelle war ein CIE-Lichtstandard C. Jede Messung
war ein Durchschnitt von mindestens 3 Messungen. Das Instrument
wurde unter Verwendung einer Minolta-Kalibrationsplatte (weiß) mit bekannten
L*a*b*-Koordinaten
(absolute Kalibration) kalibriert. Nach Kalibration mit der weißen Platte
wurden die absoluten L*a*b*-Werte der verschiedenen Drellproben
(vide infra) mehrere Male bei verschiedenen Positionen auf der Probe
gemessen und der Durchschnitt der Koordinaten L*a*b* wurde berechnet.
Die Veränderung
der Farbe jeder Probe wurde dann als Differenz (Δ) zwischen den L*a*b*-Ergebnissen
jeweils für
die unbehandelte und die behandelte Proben berechnet, d.h. Δ(L*a*b*)
wurde berechnet.
-
(b) Verwendeter Drell
-
Dakota
14 ounce pure indigo denim (Dakota 14 Unzen reiner Indigo-Drell,
Standardgewebe von Swift, Frankreich) wurde verwendet. Der Drell
(75 × 100
cm) wurde zu „Beinen" genäht (Drellzylinder),
die jeweils ungefähr
350 bis 375 g wogen (nicht stone-washed). Der Drell wurde in deionisiertem
Wasser gewaschen (Wäsche
im 125 1 Maßstab),
das AquazymTM 120 L und DenimaxTM T
enthielt (beide erhältlich
von Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark) zum Entschlichten und
Abreiben des Drells (was eine „stone-washed" Erscheinung ergibt),
jeweils in Übereinstimmung
mit den Empfehlungen der Enzymlieferanten. Nach diesem Waschverfahren
wurde keine Inaktivierung durch Carbonat durchgeführt. Nach
dem Spülen
mit 3 × 125
Litern deionisiertem Wasser, wurde der Drell in einem üblichen
Wäschetrockner
getrocknet, und schließlich
die L*a*b*-Koordinaten wie vorstehend beschrieben gemessen.
-
(c) Ausrüstung zum Bleichen und Bedingungen
-
Ein
Atlas LP2 Launder-o-meter wurde verwendet. 2 × 12 g Proben (jede misst ca.
12 × 22
cm) des Drells, der wie in (b) vorstehend beschrieben behandelt
wurde, wurden in einem dicht verschließbaren Becher aus rostfreiem
Edelstahl (Gesamtvolumen 1200 ml) zusammen mit 240 ml deionisiertem
Wasser (Temperatur 15 bis 20°C)
und 0,45 g PPT-enthaltender Laccasedispersion aus T. villosa [die
Dispersion enthielt kein Kaolin, zubereitet wie vorstehend beschrieben
in Beispiel 1(a), beziehungsweise Kaolin-enthaltende Dispersion,
zubereitet wie in Beispiel 1(b)]. Der Becher wurde dicht versiegelt
und in das Launder-o-meter platziert. Das Launder-o-meter wurde
bei 42 upm und 60°C
30 Minuten lang betrieben. Nach der Bearbeitung wurde der pH der
Verfahrensflüssigkeit
im Becher nach dem Abkühlen
gemessen, und die Drellproben wurden in deionisiertem Wasser gespült und getrocknet.
Die L*a*b*-Koordinaten wurden gemessen, und der Bleichgrad wie vorstehend
beschrieben berechnet.
-
(d) Lagerungsstabilität (Beibehaltung der Leistungsfähigkeit
zum Bleichen von Drell) von PPT-enthaltenden Laccasedispersionen
aus T. villosa
-
Die
Lagerungsstabilität
einer Dispersion wie in Beispiel 1(a) zubereitet (d.h. eine Dispersion,
die kein Kaolin enthält),
wurde durch Inkubieren von Proben davon in Dunkelheit jeweils bei
4°C und
20°C untersucht, bei
verschiedenen Zeitdauern bis zu 36 Tagen und dann die Leistungsfähigkeit
zum Bleichen von Drell der verschiedenen inkubierten Proben unter
Verwendung des oben beschriebenen Launder-o-meters getestet. Die Ergebnisse
werden in der nachstehenden Tabelle gezeigt, welche ΔL*-Werte
zeigt – wie
vorstehend beschrieben bestimmt – zusammen mit den gemessenen
Werten des endgültigen
pHs in der abgekühlten
Verfahrensflüssigkeit
[siehe Abschnitt (c) vorstehend]:
Tage | 4°C | 20°C |
ΔL* | pH | ΔL* | pH |
0 | 7,95 | 6,04 | 7,95 | 6,04 |
1 | 10,59 | 6,19 | 10,59 | 6,19 |
8 | 9,95 | 6,06 | 10,39 | 6,12 |
15 | 10,14 | 5,99 | 9,64 | 6,00 |
22 | 10,11 | 5,92 | 10,49 | 5,93 |
29 | 10,59 | 6,04 | 9,03 | 6,01 |
36 | 10,30 | 6,02 | 9,80 | 6,04 |
-
In
einer anderen Reihe von Experimenten wurde die Lagerungsstabilität einer
Dispersion, die wie in Beispiel 1(b) zubereitet wurde [d.h. eine
Dispersion, die Kaolin enthält
(eingebracht als ein Verdickungsmittel und/oder Dispersionsstabilisator),
welche eine derzeit bevorzugte Ausführungsform einer Mediator-enthaltenden
Laccasedispersion der fraglichen Art ist], durch Inkubation von
Proben davon in der Dunkelheit bei jeweils 5°C, 25°C und 40°C für verschiedene Zeitdauern untersucht,
und dann die Leistungsfähigkeit
zum Bleichen von Drell der verschiedenen inkubierten Proben unter
Verwendung des Launder-o-meters
wie vorstehend beschrieben getestet. Die Ergebnisse werden in der
nachstehenden Tabelle gezeigt, welche Daten für Zeitdauern bis zu 249 Tagen
zeigt.
Tage | 5°C | 25°C | 40°C |
ΔL* | pH | ΔL* | pH | ΔL* | pH |
0 | 11,02 | 6,05 | 11,02 | 6,05 | 11,02 | 6,05 |
19 | 10,71 | 5,83 | 10,30 | 5,85 | 10,66 | 5,81 |
31 | 10,28 | 5,90 | 11,29 | 5,93 | 9,95 | 5,83 |
62 | 8,67 | 5,87 | 9,15 | 5,93 | 5,74 | 5,96 |
82 | 10,76 | 5,88 | 10,61 | 5,91 | 5,95 | 5,94 |
101 | 10,56 | 5,88 | 9,92 | 6,04 | 5,49 | 6,12 |
154 | 10,90 | 6,26 | 11,10 | 6,32 | 5,70 | 6,40 |
189 | 10,21 | 5,75 | 8,74 | 5,75 | 3,78 | 6,02 |
221 | 10,99 | 5,92 | 8,11 | 5,94 | 3,90 | 6,03 |
249 | 10,08 | 5,65 | 9,33 | 5,86 | 3,13 | 6,02 |
-
Es
ist aus den vorstehenden Tabellen offensichtlich, dass die Dispersionen
sehr gute Stabilität
bei Raumtemperaturen zeigen (ungefähr 20 bis 25°C), und sehr
stabil bei Temperaturen von ungefähr 5°C oder weniger sind. Weiterhin
zeigen die Daten für
die Kaolin-enthaltenden Dispersion, dass eine zufriedenstellende Stabilität für eine Zeitdauer
von mindestens einem Monat beibehalten wird, wenn die Dispersion
bei 40°C
gelagert wird.
-
BEISPIEL 3: Zubereitung einer im Wesentlichen
wasserfreien Dispersion von Laccase (Laccase aus M. thermophila),
die einen oder mehrere Farbstoff-Vorläufer zum Kolorieren von Haaren
(Haarefärben)
enthält
-
Zubereitung einer Laccasedispersion
-
109,6
g IsoparTM G werden mit 9,9 g SpanTM 80 und 42,6 g DPX 6592 gemischt. Die Mischung
wird auf Eis gelagert. 300,4 g Laccase aus M. thermophila-Konzentrat
(Trockenmassegehalt nach Mettler 18,5 Gew.-%) wird zur gekühlten Mischung
innerhalb einer Zeitdauer von 1 Minute zugefügt, während die Mischung einer Homogenisierung
unterzogen wird (z. B. mit einem Silverson-Mixer mit hoher Scherkraft).
Die Homogenisierung wird 30 lang Minuten fortgesetzt, um eine Emulsion
zu erhalten (wässrige
Phase in Ölphase).
Während
dieser Zeitdauer wird die Temperatur unter 15°C gehalten. Weitere 205,2 g
IsoparTM G werden dann als Verdünnungsmittel
zugefügt.
-
Das
Wasser wird aus der sich ergebenden Emulsion durch azeotrope Destillation
von Wasser/IsoparTM G unter Vakuum bei einer
konstanten Temperatur von ungefähr
20°C entfernt.
Nach der Entfernung von fast allem Wasser werden 110,8 g SoftanolTM 50 zur entwässerten Enzymdispersion zugefügt. Die
Temperatur der sich ergebenden Dispersion wird dann auf ungefähr 105°C unter Vakuum
erhöht,
um das verbleibende IsoparTM G zu entfernen.
-
Die
sich ergebende Laccasedispersion [ungefähr 30 Gew.-% Gehalt an gesamten
Feststoffen; vorherrschende Partikelgröße ungefähr 1,6 um; Wassergehalt (wie
durch Standard-Karl-Fischer-Titration, vide supra, bestimmt) ca.
0,55 Gew.-%] wird auf Raumtemperatur abgekühlt.
-
Zubereitung einer Laccasedispersion, die
Farbstoff-Vorläufer
enthält
(Aufschlämmung)
-
- (a) Eine Lösung
von o-Aminophenol und m-Phenylendiamin in Glycerin wird durch Lösen von
0,503 g o-Aminophenol und 0,506 g m-Phenylendiamin in 48,02 g Glycerin
durch Magnetrühren
und Erhitzen auf etwa 40°C
zubereitet. Das Produkt wird dann auf Raumtemperatur abgekühlt, und
1,00 g Laccasedispersion aus M. thermophila (vide supra) werden
zugefügt.
Die Mischung wird bei Raumtemperatur gerührt und schließlich 2
Minuten mit einem Ultra-Turrax-Gerät homogenisiert, was das Endprodukt
ergibt [ca. 50 g; enthält
ca. 1 Gew.-% o-Aminophenol, ca. 1 Gew.-% m-Phenylendiamin und ca.
1 mg Laccase (als reines Laccaseprotein) pro Gramm des Endprodukts].
- (b) Eine Laccasedispersion (Aufschlämmung), die Farbstoff-Vorläufer enthält, ähnlich zur
vorstehenden, die aber Kaolin als Dispersions-/Verdickungsmittel
enthält,
kann wie folgt zubereitet werden:
0,517 g o-Aminophenol und
0,499 g m-Phenylendiamin werden in 30,49 g Glycerin durch Magnetrühren und
Erhitzen auf etwa 40°C
gelöst.
Das Produkt wird auf Raumtemperatur abgekühlt, und 0,59 g Laccasedispersion
aus M thermophila (vide supra) und 17,44 g ClaycoteTM werden
zugefügt.
Die Mischung wird bei Raumtemperatur gerührt und wird schließlich mit
einem Ultra-Turrax-Gerät
2 Minuten lang homogenisiert, was das Endprodukt ergibt [ca. 50
g; enthält
ca. 1 Gew.-% o-Aminophenol, ca. 1 Gew.-% m-Phenylendiamin, ca. 35
Gew.-% Kaolin und ca. 1 mg Laccase (als reines Laccaseprotein) pro
Gramm Endprodukt].
-
BEISPIEL 4: Färben von Haaren unter Verwendung
einer im Wesentlichen wasserfreien Dispersion von Laccase aus M.
thermophila, die Farbstoff-Vorläufer
enthält
-
Laccasedispersionen
(Aufschlämmungen),
die Farbstoff-Vorläufer
enthalten, hergestellt wie in den Abschnitten (a) und (b) (jeweils
Dispersionen ohne Kaolin und mit Kaolin) von Beispiel 3 vorstehend
beschrieben, wurden mit Standard-Testhaar zum Färben verwendet („De Meo
Natural Virgin White Hair"),
wie im Folgenden beschrieben:
-
(i) Verfahren zum Haarefärben
-
- (a) Eine Strähne (1 Gramm) des Standard-Testhaars
wurde in ein frisch zubereitetes Medium zum Färben, hergestellt durch Mischen
von 0,5 g von Vorläufer enthaltender
Dispersion und wässrigem
Kaliumphosphatpuffer, pH 7 (Gesamtvolumen des Färbemediums 5 ml), 30 Minuten
lang bei 30°C
eingetaucht. Die gefärbte Haarprobe
wurde dann unter laufendem Leitungswasser gespült, einmal mit Shampoo gewaschen
(„Minirisk"), nochmals in Leitungswasser
gewaschen, gekämmt
und luftgetrocknet. Unter Verwendung dieser Verfahrensweise wurde
eine Strähne
unter Verwendung von Vorläufer-enthaltender
Dispersion ohne Kaolin gefärbt,
während
eine zweite Strähne
unter Verwendung von Vorläufer-enthaltender
Dispersion mit Kaolin gefärbt
wurde.
- (b) Für
Vergleichszwecke (Kontrolle) wurde 1 Gramm einer weiteren Strähne Testhaar
bei 30°C
30 Minuten lang in einem frisch zubereiteten wässrigen Medium inkubiert, das
Laccase aus M. thermophila enthält
(eine Verdünnung
des wässrigen
Konzentrats, auf das vorstehend Bezug genommen wird, in wässrigem
Kaliumphosphatpuffer pH 7) und die gleichen Farbstoff-Vorläufer wie
vorher (eine Lösung
davon in wässrigem Kaliumphosphatpuffer
pH 7) in den gleichen Konzentrationen wie in den in „(a)" vorstehend verwendeten Medien
zum Färben.
Die gefärbte
Haarsträhne
wurde dann in exakt der gleichen Weise wie vorstehend in „(a)” behandelt.
-
(ii) Einschätzung der Haarfarbe
-
Die
Farbe der gefärbten
Haarsträhnen
wurde quantitativ auf eine Weise bestimmt, ähnlich zur vorstehend in Beispiel
2 beschriebenen, auf der Basis von Messungen von Änderungen
(A) der Farbparameter L*, a* und b*, unter Verwendung eines Minolta
CR200 Chromameters.
ΔL*, Δa* und Δb* werden
relativ zu den Werten L*, a*, bzw. b* für das unbehandelte Haar definiert
(z. B. AL* = L*Probe – L*unbehandeltes
Haar).
-
Die
Menge an AE* wird dann berechnet als AE* = √(ΔL*2 + Δa*2 + Δb*2) und wird als ein Maß der gesamten quantitativen
Farbänderung
genommen.
-
1 zeigt
die Färbeergebnisse
(ΔL*, Aa*, Δb* und ΔE*-Werte),
die erhalten wurden unter Verwendung
- 1) des
Färbemediums,
das aus einer Dispersion gemäß der Erfindung
ohne Kaolin hergestellt wurde (hellgraue Schraffierung; mittlere
Säulen),
- 2) des Färbemediums,
das aus einer Dispersion gemäß der Erfindung
mit Kaolin hergestellt wurde (dunkelgraue Schraffierung; rechte
Säulen),
und
- 3) dem Kontrollfärbemedium
(mittelgraue Schraffierung; linke Säulen).
-
Es
ist aus den Ergebnissen offensichtlich, dass das Haarefärben, das
unter Verwendung von Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung
erreicht wurde (die nicht nur Enzym umfassen, sondern auch die notwendigen
Farbstoff-Vorläufer)
einen sehr vorteilhaften Vergleich ergibt mit dem, was unter Verwendung
der „traditionelleren" Vorgehensweise erreicht
wird, welche eine „in
situ"-Mischung von
Enzym bzw. Farbstoff-Vorläufer(n)
direkt vor dem Ausführen
des Färbevorgangs
notwendig macht.
-
BEISPIEL 5: Zubereitung einer im Wesentlichen
wasserfreien, MS-enthaltenden Dispersion von Laccase (Laccase aus
M. thermophila)
-
Zubereitung einer Laccasedispersion
-
67,1
g IsoparTM G werden mit 9,2 g SpanTM 80 und 26,1 g AC31 gemischt. Die Mischung
wird auf Eis platziert. 200,3 g eines Dextrin-enthaltenden Laccasekonzentrats
aus M. thermophila, pH 9,0 [zubereitet durch Zufügen von 10,0 g 2 M Glycinpuffer,
pH 9,0 und 4,1 g GlucidexTM D21 zu 190,2
g wässrigem
Laccasekonzentrat (23,0 Gew.-% Trockenmassegehalt nach Mettler)],
wird zur gekühlten
Mischung innerhalb einer Zeitdauer von 1 Minute zugefügt,
während
die Mischung einer Homogenisierung unterzogen wird (z. B. mit einem
Silverson-Mixer mit hoher Scherkraft). Die Homogenisierung wird
30 Minuten lang durchgeführt,
um eine Emulsion zu erhalten (wässrige
Phase in Ölphase).
Während
dieser Zeitdauer wird die Temperatur unter 15°C gehalten. Weitere 130,0 g
IsoparTM G werden dann als Verdünnungsmittel
zugefügt.
-
Wasser
wird aus der sich ergebenden Emulsion durch azeotrope Destillation
von Wasser/IsoparTM G unter Vakuum bei einer
konstanten Temperatur von ungefähr
20°C entfernt.
Nach der Entfernung von fast allem Wasser werden 101,9 g SoftanolTM 50 zur entwässerten Enzymdispersion zugefügt. Die
Temperatur der sich ergebenden Dispersion wird dann auf ungefähr 105°C unter Vakuum
erhöht,
um das verbleibende IsoparTM G zu entfernen.
-
Die
sich ergebende Laccasedispersion (ungefähr 30 Gew.-% Gehalt an gesamten
Feststoffen) wird auf Raumtemperatur abgekühlt.
-
Zubereitung von MS-enthaltender Laccasedispersion
(Aufschlämmung)
-
Eine
Mischung, die aus 92 Gew.-% SoftanolTM 50
und 8 Gew.-% AerosilTM 200 besteht, wird
durch Zufügen
von 0,40 kg AerosilTM 200 zu 4,60 kg SoftanolTM 50 zubereitet. Nach dem Rühren wird
die Mischung homogenisiert (z. B. mit einer Fryma-Mühle).
-
40,0
g Methylsyringat (MS) werden in 210,0 g der homogenisierten SoftanolTM 50/AerosilTM 200-Mischung
durch Magnetrühren
und Erhitzen auf ca. 40°C
gelöst.
37,8 g der sich ergebenden MS-Lösung
werden mit 15,0 g Benzoesäure,
15,1 g Natriumbenzoat, 2,2 g der SoftanolTM 50/AerosilTM 200-Mischung, 3,8 g Kaolin und ungefähr 1,1 g
Laccasedispersion aus M. thermophila gemischt. Die Mischung wird
bei Raumtemperatur gerührt
und schließlich
auf einem Ultra-Turrax-Gerät
2 Minuten lang homogenisiert, was das Endprodukt ergibt (ca. 75
g).
-
BEISPIEL 6: Verwendung von MS-enthaltender
Laccasedispersion aus M. thermophila (Aufschlämmung) zum Bleichen von Drell
-
Durch
Enzyme bewirkter „stone-washed" Drell wurde unter
Verwendung von MS-enthaltender
M. thermophila-Laccasedispersion (zubereitet gemäß vorstehendem Beispiel 5)
gebleicht, die bei 40°C
für verschiedene
Zeitdauern gelagert wurde. Die verwendete Ausrüstung und Verfahrensweise waren
ansonsten wie in Beispiel 2 beschrieben (vide supra).
-
Die
Ergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle gezeigt:
Tage | 40°C |
AL* | pH |
0 | 7,79 | 4,62 |
21 | 7,61 | 4,97 |
28 | 7,26 | 4,65 |
36 | 8,33 | 4,62 |
-
Wie
für die
PPT-enthaltende Laccasedispersion aus T. villosa in Beispiel 2 beobachtet,
zeigen die letzteren Daten, dass eine zufriedenstellende Stabilität (Beibehaltung
der Leistungsfähigkeit
zum Bleichen) der fraglichen MS-enthaltenden M. thermophila-Laccasedispersion
(die 2 Gew.-% Dextrin enthält)
für eine
Zeitdauer von mindestens einem Monat beibehalten wird, wenn die
Dispersion bei 40°C
gelagert wird.