DE69737828T2

DE69737828T2 - Flüssige, nichtwässrige enzyme enthaltende zusammensetzungen

Info

Publication number: DE69737828T2
Application number: DE69737828T
Authority: DE
Inventors: Lotte Rugholm Henriksen; Mads Lykke
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1996-04-29
Filing date: 1997-04-29
Publication date: 2008-03-06
Anticipated expiration: 2017-04-30
Also published as: US20020164741A1; WO1997041215A1; ATE365208T1; US20010006636A1; EP0896618A1; DE69737828D1; US6355461B2; AU2635097A; EP0896618B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft flüssige Zusammensetzungen umfassend: 1) eine Laccase; 2) eine Substanz, die (a) in einem wässrigen Medium ein Substrat für das Enzym ist, (b) in einem wässrigen Medium ein Vorläufer für ein Substrat für das Enzym ist, oder (c) ein Co-Faktor für das Enzym ist; 3) eine nicht wässrige, flüssige Phase; und 4) höchstens 5 Gew.-% Wasser.
Die Erfindung ist gut geeignet für eine große Vielzahl an Anwendungen im Bereich sowohl von Lebensmitteln als auch außerhalb davon.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Industrielle Enzyme wurden allgemein als partikuläre Feststoffe (z. B. in Pulver- oder granulierter Form, gegebenenfalls mit einer Art von Beschichtung), oder in Form einer auf Wasser basierenden Lösung formuliert. Eine Anzahl fester Formulierungen (z. B. Enzympulver) haben den Nachteil, dass leicht Staubbildung stattfindet, die – wenn keine speziellen Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden – eine Kontamination der umliegenden Umgebung zum Ergebnis haben kann, und damit ein Risiko für die Gesundheit von Personen, die mit solchen Formulierungen hantieren, darstellt.
Während die Verwendung von auf Wasser basierenden, flüssigen Enzymformulierungen im Wesentlichen das Risiko einer Staubbildung beseitigt, ist es aufgrund der Tatsache, dass praktisch alle Enzyme ihre Aktivität in der Gegenwart von Wasser ausüben, allgemein nicht möglich, lagerungsstabile Formulierungen dieser Art herzustellen, welche – in ein und derselben Zusammensetzung – ein freies (z. B. nicht eingekapseltes oder unbeschichtetes) Enzym und zum Beispiel eine Substanz einbringen, die ein Substrat für das Enzym ist (einschließlich in diesem Zusammenhang ein Enzymsubstrat, welches, durch die Vermittlung des Enzyms und normalerweise in Kombination mit einem oder mehreren weiteren Reaktanden oder Reaktionsmitteln, reagiert, um eine Spezies zu bilden, die eine weitere anschließende wichtige Reaktion durchläuft, im Zusammenhang mit dem speziellen Zweck, für den die flüssige Enzymformulierung beabsichtigt ist).
Zum Beispiel wird es im Zusammenhang mit der Verwendung einer Peroxidase im Zusammenhang mit einer oxidierbaren Substanz, die als „Mediator" bekannt ist (auch bekannt als „Verstärker" oder „Beschleuniger") – z. B. ein Mediator vom substituierten Phenothiazin- oder substituierten Phenoxazin-Typ – zum Zwecke der „Farbstofftransfer- Inhibition" (d.h. Inhibition des Übertragung von Farbstoff von Gewebe zu Gewebe), im Zusammenhang mit dem Waschen von gefärbten Geweben oder Textilien (siehe z. B. WO 94/12621 und WO 94/12620 ), oder zum Bleichen von Geweben, z. B. Drellgewebe (wie in WO 96/12845 und WO 96/12846 beschrieben), allgemein nicht möglich sein, die Peroxidase und den Mediator (und gegebenenfalls eine Quelle von Wasserstoffperoxid) in ein und derselben auf Wasser basierenden flüssigen Zusammensetzung einzuschließen, ohne dass eine schnelle Oxidation und anschließende Transformation des Mediators stattfindet. US 4,943,530 offenbart eine flüssige Enzymformulierung, in der ein Enzym in einer im Wesentlichen wasserfreien Flüssigkeit zusammen mit einem anorganischen Dispersionsmittel dispergiert ist.
Unter Bezugnahme, wiederum beispielhaft, auf das oben erwähnte Bleichen von Gewebe (wie Drellgewebe), wird, wenn derzeit erhältliche flüssige Enzymformulierungen benutzt werden, die relativ kurze Zeitspanne, innerhalb der es möglich ist, zu arbeiten, sobald das Enzym (z. B. eine Peroxidase) mit dem Mediator in Kontakt gebracht wurde, es oft notwendig machen (i) das Bereitstellen von separaten Behältern oder Gefäßen (Tanks oder Ähnlichem), von denen jeder eine der interagierenden Bestandteile enthält, und von denen die individuellen Bestandteile in das Medium (wässriges Medium) dosiert werden können, in dem der Bleichprozess stattfinden soll, und (ii) ein Dosieren der individuellen Komponenten aus den jeweiligen Behältern in das Medium in den korrekten Mengen und den korrekten relativen Verhältnissen. Damit werden nicht nur mehrere Behälter verlangt, sondern es ist auch notwendig, mehrere Einheiten an Arbeitsschritten (einschließlich mehrerer Verteilungs- und Dosierungs-Arbeitsschritte) durchzuführen.
Damit besteht ein Bedarf an flüssigen, lagerungsstabilen Zusammensetzungen, die (a) nicht nur ein Enzym enthalten, sondern auch eine Substanz (z. B. eine Substanz von einer der vorstehend erwähnten Arten), die ansonsten – in Gegenwart von Wasser und durch die Vermittlung des Enzyms – eine interessierende Reaktion durchlaufen wird, und (b) geeignet sind für die nachfolgende Einführung in oder das Inkontaktbringen mit einem wässrigen Medium, wobei die fragliche Reaktion gestartet wird. Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen bereit, die diesen Bedarf erfüllen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie schon erwähnt, betrifft die vorliegende Erfindung damit eine flüssige Zusammensetzung, umfassend:

(A) eine Laccase (EC 1.10.3.2);
(B) eine Substanz (d.h. eine oder mehrere Substanzen), ausgewählt aus (i) Substanzen, die in einem wässrigen Medium Substrate für das Enzym sind, (ii) Substanzen, die in einem wässrigen Medium Vorläufer für Substrate für das Enzym sind, und (iii) Substanzen, die Co-Faktoren für das Enzym sind;
(C) eine nicht wässrige, flüssige Phase; und
(D) höchstens 5 Gew.-% Wasser.

Die zulässige obere Grenze für den Wassergehalt einer jeweiligen Art einer Ausführungsform einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung wird unter anderem abhängen von der Natur und den Eigenschaften des Enzymsubstrats, des Enyzmsubstrat-Vorläufers oder Enzym-Cofaktors, und der Natur und den Eigenschaften der nicht wässrigen flüssigen Phase. Für bestimmte Arten von Ausführungsformen der Zusammensetzungen der Erfindung kann es möglich sein, ausreichend stabile Zusammensetzungen herzustellen, die einen Wassergehalt von ungefähr 5 Gew.-% oder möglicherweise sogar höher haben. Jedoch wird normalerweise ein Wassergehalt, der ungefähr 2 Gew.-% nicht überschreitet, bevorzugt sein.
Für zahlreiche Ausführungsformen der Zusammensetzungen der Erfindung (z. B. Zusammensetzungen der Arten, die in den Ausführungsbeispielen hierin beispielhaft dargestellt und getestet werden), wird eine weiter bevorzugte obere Grenze für den Wassergehalt normalerweise in der Nähe von 1 Gew.-% der Zusammensetzung sein. Es wird jedoch allgemein wünschenswert sein, dass der Wassergehalt vieler Arten von Ausführungsformen nicht ungefähr 0,8 Gew.% überschreitet, weiter gewünscht ungefähr 0,6 Gew.-%, und eine sehr erwünschte obere Grenze wird oft ungefähr 0,5 Gew.-% sein. Für bestimmte Ausführungsformen kann eine obere Grenze für den Wassergehalt von ungefähr 0,2 Gew.-% geeignet sein, um eine geeignete Stabilität der Zusammensetzung zu erreichen.
Der Wassergehalt kann auf geeignete Weise bestimmt werden, z. B. durch so genannte Karl-Fischer-Titration (siehe Z. B. J.S. Fritz und G.H. Schenk, Jr., Quantitative Analytical Chemistry. 2. Ausgabe, Allyn und Bacon, Inc., Boston (1969), S. 276, und die darin genannte Referenz).
Herstellung von Zusammensetzungen der Erfindung
Was die Herstellung einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung betrifft, sind eine Anzahl Vorgehensweisen anwendbar, die hauptsächlich von der Form abhängen, in der die Laccase, die darin eingearbeitet werden soll, anfänglich erhältlich ist: Wenn die Laccase in Form einer im Wesentlichen wasserfreien festen Zubereitung erhältlich ist, kann die feste Enzymzubereitung (gegebenenfalls zusammen mit anderen Bestandteilen der Zusammensetzung, insbesondere Bestandteilen, die unlöslich sind oder zumindest geringe Löslichkeit in der zu verwendenden flüssigen Phase besitzen) – anschließend an einen beliebigen Vermahlungsschritt, der nötig sein kann, um feste Partikel von geeigneter Größe zu erreichen – einfach in der fraglichen nicht wässrigen, flüssigen Phase durch per se bekannte Verfahren dispergiert sein, falls geeignet im Zusammenhang mit der Zufügung von einem oder mehreren geeigneten Dispersionsmitteln.
In Fällen, in denen die Laccase als flüssige Lösung oder Konzentrat erhältlich ist, ist es oft möglich, zur Lösung/Konzentrat eine nicht wässrige – oft nicht mit Wasser mischbare – flüssige Substanz zuzufügen (z. B. ein Paraffinöl oder Ähnliches), welche gegenüber den Bestandteilen der Lösung/Konzentrat inert ist, und mit Wasser ein Azeotrop bildet, und welche daher – unter geeigneten Temperatur- und Druckbedingungen – verwendet werden kann, um Wasser aus der Lösung/Konzentrat durch Destillation zu entfernen (siehe z. B. EP 0 696 315 ). In solchen Fällen kann es geeignet sein, portionsweise in Intervallen während des Ablaufs des Destillationsprozesses (und gegebenenfalls zu Beginn des Destillationsprozesses) eine andere nicht wässrige Flüssigkeit zuzufügen, welche entweder alleine oder in Kombination mit einer oder mehreren anderen nicht wässrigen Flüssigkeiten die flüssige Phase der endgültigen Zusammensetzung der Erfindung verkörpern soll. Alternativ können wässrige Enyzmlösungen oder Konzentrate z. B. einer Sprühtrocknungs-Verfahrensweise unterzogen werden, wonach die sich ergebende getrocknete feste Enzymzubereitung, wie schon vorstehend beschrieben, behandelt werden kann.
Die vorstehend beschriebenen Verfahrensweisen zur Herstellung einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung stellen Aspekte der vorliegenden Erfindung dar.
Laccase (EC 1.10.3.2)
Enzymklassifikationsnummern (EC-Nummern), auf die in der vorliegenden Beschreibung mit Ansprüchen Bezug genommen wird, sind in Übereinstimmung mit den Recommendations (1992) of the Nomenclature Committe of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology, Academic Press Inc., 1992.
Obwohl die Laccase in einer Zusammensetzung der Erfindung – wenn die Löslichkeit der Laccase in der nicht wässrigen, flüssigen Phase genügend hoch ist – ganz oder teilweise in gelöster Form vorliegen kann, ist es im Allgemeinen stark bevorzugt, dass die Laccase vorwiegend oder im Wesentlichen ausschließlich in fester (amorpher und/oder kristalliner), allgemein partikulärer Form vorliegt, bevorzugt dispergiert in der flüssigen Phase. Kristalline Formen von Enzymen sind im Allgemeinen in diesem Zusammenhang sehr geeignet. Die wesentliche Abwesenheit von Wasser in den Zusammensetzungen gemäß der Erfindung macht es allgemein möglich, freie Enzyme in solchen Ausführungsformen zu verwenden (d.h. Enzyme, die nicht in irgendeiner Weise eingekapselt oder beschichtet sind). In einigen Fällen kann es geeignet sein, zwei oder mehr verschiedene Enzyme in eine Zusammensetzung der Erfindung einzubringen.
Laccasen sind aus einer Vielzahl von mikrobiellen Quellen erhältlich, besonders Bakterien und Pilze (einschließlich filamentöse Pilze und Hefen), und geeignete Beispiele von Laccasen werden unter denen gefunden, die erhältlich sind aus Pilzen, einschließlich Laccasen erhältlich aus Stämmen von Aspergillus, Neurospora (z. B. N. crassa), Podospora, Botrytis, Collybia, Fomes, Lentinus, Pleurotus, Trametes [einige Arten/Stämme dieser sind unter verschiedenen Namen bekannt und/oder wurden vorher innerhalb anderer Gattungen klassifiziert; z. B. Trametes villosa = T. pinsitus = Polyporus pinsitis (auch bekannt als P. pinsitus oder P. villosus) = Coriolus pinsitus], Polyporus, Rhizoctonia (z. B. R. solani, Coprinus (z. B. C. plicatilis), Psatyrella, Myceliophthora (z. B. M. thermophila), Schytalidium, Phlebia (z. B. P. radita; siehe WO 92/01046 ), Coriolus (z. B. C. hirsutus; siehe JP 2-238885 ), Pyricularia oder Rigidoporus. Bevorzugte Laccasen im Zusammenhang der Erfindung schließen Laccase sein, die aus Myceliophthora thermophila erhältlich ist, und Laccase, die aus Trametes villosa erhältlich ist.
Auch von Interesse im Zusammenhang der Erfindung, insbesondere im Zusammenhang mit der Verwendung einer Zusammensetzung der Erfindung in der Behandlung (z. B. dem Bleichen) von Cellulose-haltigem Gewebe oder Textil, sind modifizierte Oxidasen (z. B. modifizierte Laccasen, umfassend eine N-terminale, C-terminale und/oder interne Cellulose-Bindedomäne [CBD; siehe z. B. P. Tomme et al., Cellulose-Binding Domgins Classification and Properties in Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates, John N. Saddler und Michael H. Penner (Hrsg.), ACS Symposium Reihe, Nr. 618 (1996)]. Rekombinante Techniken, die geeignet zur Herstellung von CBD/Enzymhybriden sind, sind z. B. in WO 90/00609 , WO 94/24158 , WO 95/16782 und von Greenwood et al. in Biotechnology and Bioengineering 44 (1994), S. 1295–1305 beschrieben. Sie können zum Beispiel hergestellt werden durch Transformieren in eine Wirtszelle eines DNA-Konstrukts, das mindestens ein Fragment von DNA umfasst, das die Cellulose-Bindedomäne kodiert, ligiert mit oder ohne einem Linker, an eine DNA-Sequenz, die das interessierende Enzym kodiert (z. B. eine Laccase), und Wachsenlassen der transformierten Wirtszelle, um das rekombinante Produkt zu exprimieren (modifiziertes Enzym umfassend eine CBD).
Für Laccasen (und modifizierte Laccasen) wird die Menge an Laccase, die in eine Zusammensetzung der Erfindung eingebracht wird, allgemein innerhalb des Bereichs von 0,0001–500 mg sein (als reines Enzymprotein) pro Gramm der Zusammensetzung, typischer im Bereich von 0,01–50 mg/g. Die Menge an Laccase, die in eine gegebene Zusammensetzung eingebracht wird, wird unter anderem davon abhängen, ob oder ob nicht große Mengen an Substanzen wie Puffer oder anderen pH-regulierenden Substanzen in die Zusammensetzung eingebracht werden sollen. Bei einer typischen Zusammensetzung der Erfindung, die eine Laccase, ein Laccasesubstrat wie einen Mediator (vide supra) und einen Puffer in einer geeigneten Menge enthält, um einen geeigneten pH in einem wässrigen Medium, in das die Zusammensetzung eingeführt werden soll, beizubehalten, wird die Laccasekonzentration in einer solchen Zusammensetzung geeigneterweise im Bereich von ungefähr 0,1–5 mg/g, wie im Bereich von 0,25–2 mg/g (als reines Laccaseprotein), oft im Bereich von 0,5–1 mg/g sein.
Enzymsubstrate, Substratvorläufer und Cofaktoren
Substanzen der Bestandteile des Typs (B) in einer im Wesentlichen wasserfreien, flüssigen Zusammensetzung der Erfindung (d.h. Enzymsubstrate, Enzymsubstratvorläufer oder Enzym-Cofaktoren) können – abhängig unter anderem von der Löslichkeit der fraglichen Substanz(en) in der fraglichen, nicht wässrigen, flüssigen Phase – in gelöster und/oder dispergierter Form in der Zusammensetzung vorliegen.
Enzymsubstrate
Der Begriff „Substrat", wie in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendet, im Zusammenhang mit einer Laccase bezieht sich auf eine Substanz, die ein Reaktant in einer Reaktion ist, die durch das Enzym katalysiert wird. Wenn es geeignet ist, ein Enzymsubstrat in eine Zusammensetzung der Erfindung, wie hierin offenbart, einzubringen, wird die Natur des/der Enzymsubstrat(e), das/die für diesen Zweck geeignet ist/sind, unter anderem nicht nur von der Art der Laccase abhängen, die in der Zusammensetzung vorliegen soll, sondern auch von der beabsichtigten Anwendung der Zusammensetzung.
Substrate für Laccasen
(i) Mediatoren:
Wichtige Ausführungsformen einer Zusammensetzung der Erfindung sind Zusammensetzungen umfassend eine Laccase zusammen mit einem oxidierbaren Substrat, welches als Mediator wirkt (vide supra). Der Mediator in einer Zusammensetzung der Erfindung kann jeglicher Mediator sein, der zur Verwendung mit einer Laccase geeignet ist. Beispiele für Mediatoren schließen die folgenden ein: Halogenionen (z. B. Chlorid und Bromid); bestimmte Metallionen (z. B. Mn²⁺); Phenolarten (z. B. Acetosyringon (4-Hydroxy-3,5-dimethoxyacetophenon), Syringaldehyd (Hydroxy-3,5-dimethoxybenzaldehyd), Syringasäure (4-Hydroxy-3,5-dimethoxybenzoesäure), Alkylsyringate (wie Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Hexyl- oder Octylsyringat) und anderen Syringasäureestern [z. B. Syringasäureester von Polyethylenglykolen (PEGs) verschiedener Molekulargewichte, wie einem PEG 4000-Syringat], Ethyl-3-(4-Hydroxy-3, 5-dimethoxyphenyl)acrylat, p-Hydroxyzimtsäure, 2,4-Dichlorphenol, Vanillin, 7-Hydroxycumarin, 6-Hydroxy-2-naphthoesäure, und p-Hydroxybenzolsulfonat]; 2,2'-Azino-bis-3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonat (ABTS; siehe z. B. WO 94/12620 ); und 10-Methyl-, 10-Ethyl- und 10-Propylphenothiazin (siehe z. B. WO 94/12621 ). Andere geeignete Mediatoren sind z. B. beschrieben in WO 94/12619 , WO 94/12620 and WO 94/12621 .
Mediatoren vom Syringat-, Phenoxazin- oder Phenothiazin-Typ sind allgemein sehr geeignet im Zusammenhang der Erfindung, und einige Beispiele dafür sind Acetosyringon, Methylsyringat, 10-Phenothiazinpropionsäure, 10-Ethylphenothiazin-4-carbonsäure, 10-Phenoxazinpropionsäure und 10-Methylphenoxazin (beschrieben in WO 94/12621 ).
Ein Mediator wird allgemein in einer Zusammensetzung der Erfindung in einer Menge von von 10^–7 bis 10^–2 Mol/g der Zusammensetzung vorhanden sein und oft in einer Menge von von 10^–5 bis 10^–3 Mol/g der Zusammensetzung.
(ii) Farbstoff-Vorläufer:
Weitere wichtige Ausführungsformen einer Zusammensetzung der Erfindung sind Zusammensetzungen umfassend eine Laccase zusammen mit einem oder mehreren oxidierbaren Substraten in der Form von Farbstoff-Vorläufer(n), der/die in der Gegenwart von Wasser einer Laccase-katalysierten Oxidation unterzogen wird/werden (im Allgemeinen oxidative Radikalbildung), und anschließend polymerisiert wird/werden, um einen Farbstoff einer speziellen Farbe zu bilden. Solche Laccase-vermittelte Farbstoffbildung findet wichtige industrielle Anwendungen im Färben von Textilien (z. B. Wolle, Baumwolle und/oder synthetische Materialien), Garn, Fell, Häuten und Ähnlichem, und im Gebiet von Körperpflegeprodukten für Menschen, wo sie als geeignet für die Verwendung z. B. zum Färben von Haaren gefunden wurde.
Wie in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendet, soll der Begriff „Farbstoff-Vorläufer" nicht nur eine individuelle Substanz umfassen, die nach Oxidation in der Gegenwart einer Laccase zu einem stark gefärbten Farbstoff führt, sondern auch eine individuelle Substanz, die nach Oxidation in einer entsprechenden Weise nicht selbst alleine zu einem Produkt führt, das eine starke Farbe hat, sondern welche, wenn sie Oxidation in Gegenwart einer Substanz der vorherigen Kategorie von stark färbenden Substanzen unterzogen wird, zu einer Modifikation der sich ergebenden Farbe des Farbstoffs führt. Oxidierbare Substanzen, die eine solche modifizierende Wirkung auf die allgemeine Farbstofffarbe ausüben (solche Substanzen werden manchmal als „Modifizierer" bezeichnet), sind damit in die Bedeutung des Begriffs „Farbstoff-Vorläufer", wie im Zusammenhang der Erfindung benutzt, eingeschlossen.
Beispiele für Farbstoff-Vorläufer, die geeignet zur Einarbeitung in eine Zusammensetzung der Erfindung sind, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf: aromatische Diamine; Diamino-substituierte aromatische Carbonsäuren und Ester davon; Aminophenole; Phenole; Naphthole; und Phenolderivate von Zimtsäuren und Ester davon.
Beispiele für aromatische Diamine schließen ein:
2-Methyl-1,4-diaminobenzol,
4-Methyl-o-phenylendiamin,
4-Diaminobenzol(p-Phenylendiamin),
2-Methoxy-p-phenylendiamin,
2-Methyl-1,4-diaminobenzol (p-Toluylendiamin),
2-Chlor-1,4-diaminobenzol (o-Chlor-p-phenylendiamin),
4-Aminodiphenylamin (N-Phenyl-p-phenylendiamin),
1-Amino-4-β-methoxyethylamino-benzol(N-β-Methoxyethyl-p-phenylendiamin),
1-Amino-4-bis-(β-hydroxyethyl)-aminobenzol (N,N-bis-(β-Hydroxyethyl)-p-phenylendiamin),
1,3-Diaminobenzol (m-Phenylendiamin),
2-Methyl-1,3-diaminobenzol (2,6-Diaminotoluol),
2,4-Diaminotoluol, und
2,6-Diaminopyridin.
Beispiele für Diamino-substituierte aromatische Carbonsäuren und Ester davon schließen ein:
2,3-Diaminobenzoesäure,
3,4-Diaminobenzoesäure,
und Ester, z. B. Niederalkylester (wie Methyl, Ethyl, Propyl, 2-Propyl oder Butylester) davon.
Beispiele für Aminophenole schließen ein:
1-Hydroxy-2-aminobenzol (o-Aminophenol),
1-Hydroxy-3-aminobenzol (m-Aminophenol),
1-Methyl-2-hydroxy-4-aminobenzol (3-Amino o-Cresol),
1-Methyl-2-hydroxy-4-β-hydroxyethylaminobenzol (2-Hydroxy-4-β-hydroxyethylaminotoluol),
1-Hydroxy-4-aminobenzol (p-Aminophenol),
1-Hydroxy-4-methylaminobenzol (p-Methylaminophenol),
1-Methoxy-2,4-diaminobenzol (2,4-Diaminoanisol),
1-Ethoxy-2,3-diaminobenzol (2,4-Diaminophenetol), und
1-β-Hydroxyethyloxy-2,4-diaminobenzol (2,4-Diaminophenoxyethanol).
Beispiele für Phenole und Naphthole schließen ein:
1,2-Dihydroxybenzol (Pyrocatechol),
1,3-Dihydroxybenzol (Resorcinol),
1,3-Dihydroxy-2-methylbenzol (2-Methylresorcinol),
1,3-Dihydroxy-4-chlorbenzol (4-Chlorresorcinol),
1,2,3-Trihydroxybenzol (Pyrogallol),
1,2,4-Trihydroxybenzol,
1,2,4-Trihydroxy-5-methylbenzol (2,4,5-Trihydroxytoluol),
1,2,4-Trihydroxytoluol, 1,5-Dihydroxynaphthalin,
1,4-Dihydroxybenzol (Hydrochinon), und 1-Hydroxynaphthalin (α-Naphthol).
Beispiele für Phenolderivate von Zimtsäuren und Ester davon schließen ein:
p-Cumarinsäure (d.h. 4-Hydroxyzimtsäure),
Koffeinsäure (d.h. 3,4-Dihydroxyzimtsäure),
Sinapinsäure (Sinapinsäure; d.h. 3,5-Dimethoxy-4-hydroxyzimtsäure),
Ferulasäure (d.h. 4-Hydroxy-3-methoxyzimtsäure), und Ester, z. B. Niederalkylester (wie Methyl-, Ethyl-, Propyl-, 2-Propyl-or Butylester), von einem beliebigen von diesen.
Es kann angemerkt werden, dass im Fall von Zimtsäurederivaten wie die vorstehend erwähnten (von denen alle käuflich erhältlich sind), es anscheinend nicht klar festgestellt werden muss, ob sie eine oder beide von beiden möglichen geometrischen Formen (cis bzw. trans) umfassen; es scheint jedoch wahrscheinlich, dass die trans-Form allgemein vorherrschend ist.
Andere interessierende Substanzen als Farbstoff-Vorläufer im Zusammenhang mit der Erfindung schließen Salicylsäure (d.h. 2-Hydroxybenzoesäure) und Ester (z. B. Niederalkylester wie Methyl-, Ethyl-, Propyl-, 2-Propyl- oder Butylester) davon ein.
(iii) Andere Substrate:
Laccasen haben sich als sehr geeignet gezeigt, um ein Gelieren von Polysachariden, die phenolische Substituenten enthalten, zu verursachen (z. B. Arabinoxylane aus Weizen oder Kleie, oder Pektine aus Zuckerrüben und verwandten Pflanzen) für Nahrungsmittelanwendungen oder zur Herstellung von stark wasserabsorbierenden Materialien (siehe z. B. WO 96/03440 ). Ähnlich hat sich gezeigt, dass Laccasen sehr nützliche Anwendungen in der Herstellung von Produkten auf Lignocellulose-Basis aus Lignocellulosematerial (z. B. Faserstoff aus Holz) und phenolischen Polysachariden wie die oben erwähnten Arabinoxylane oder Pektine haben (siehe z. B. WO 96/03546 ).
Es wäre damit geeignet, eine Zusammensetzung der Erfindung bereitzustellen, die z. B. geeignete Mengen einer Laccase und eines Laccasesubstrats in Form eines phenolischen Polysacharids umfasst. Solche eine gebrauchsfertige, lagerungsstabile Zusammensetzung könnte vorteilhafterweise für die vorstehend erwähnten Anwendungen verwendet werden.
Enzymsubstrat-Vorläufer
Der Begriff „Vorläufer", wie in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendet, in Bezug auf ein Substrat für ein Enzym, das in eine flüssige Zusammensetzung der Erfindung eingebracht wird, bezeichnet eine Substanz oder Substanzen, die unter Bedingungen, die in der Verwendung der Zusammensetzung vorherrschen, das Enzymsubstrat per se erzeugt/erzeugen.
Cofaktoren
Der Begriff „Cofaktor", wie in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendet, im Zusammenhang mit einem Enzym, das in einer flüssigen Zusammensetzung der Erfindung eingearbeitet ist, bezieht sich auf jeden beliebigen organischen oder anorganischen Faktor, der für die Aktivität des Enzyms notwendig ist.
Ein Co-Faktor ist allgemein eine Nicht-Proteinspezies von relativ geringem Molekulargewichts, und kann normalerweise eingeteilt werden als entweder

(i) so genanntes „Coenzym" [z. B. Coenzym A, Coenzym Q (Ubichinon) oder Coenzym I (NADP, Nikotinamidadenindinukleotidphosphat)], d.h. eine vergleichsweise kleine organische Spezies, deren Gegenwart in stöchiometrischen Mengen wesentlich für die Aktivität eines speziellen Enzyms ist, oder
(ii) eine anorganische ionische Spezies (z. B. ein Metallion wie Ca²⁺ oder Cu²⁺).

Nicht wässrige, flüssige Phasen
Nicht wässrige, flüssige Phasen in Zusammensetzungen der Erfindung können einzelne Bestandteile oder Mischungen von zwei oder mehr Bestandteilen sein.
Die Natur der nicht wässrigen, flüssigen Phase, die in einer Zusammensetzung der Erfindung verwendet wird, wird klar unter anderem abhängen von den physikalischen und chemischen Eigenschaften der/des Enzyme(s) und den anderen Substanzen, die in die Zusammensetzung eingebracht werden, und von der beabsichtigten Verwendung der endgültigen Zusammensetzung. Die nicht-wässrige flüssige Phase in einer Zusammensetzung der Erfindung kann eine mit Wasser mischbare, nicht wässrige Flüssigkeit umfassen, oder eine im Wesentlichen mit Wasser nicht mischbare, nicht wässrige Flüssigkeit oder beides.
Nahrungsmittelanwendungen
Wenn die Zusammensetzung eine ist, die zum direkten oder indirekten Gebrauch zur Zubereitung eines Nahrungsmittels oder als Zutat zu einem Nahrungsmittel bestimmt ist, insbesondere einem Nahrungsmittel oder einer Zutat zu einem Nahrungsmittel zum menschlichen Verzehr, dann wird die nicht wässrige, flüssige Phase normalerweise mindestens die behördliche Bestimmungen oder andere Bestimmungen betreffs ihrer Sicherheit erfüllen müssen (fehlende Giftigkeit, physiologische Verträglichkeit, etc.).
Bei einigen Ausführungsformen von Zusammensetzungen, die für solche Zwecke bestimmt sind, kann die nicht wässrige, flüssige Phase geeigneterweise oft, z. B. ein oder mehrere verzehrbare Öle umfassen, z. B. Sojabohnenöl, Maisöl (Maisöl) oder Olivenöl, von denen alle in hohem Maße nicht mit Wasser mischbar sind. Andere nicht-wässrige flüssige Phasen von Bedeutung zum Einbringen in solche Zusammensetzungen, gegebenenfalls – aber oft sehr geeignet – in Kombination mit einem oder mehreren verzehrbaren Ölen (z. B. eines oder mehrere der vorstehend erwähnten), sind bestimmte oberflächenaktive Mittel (Tenside), wie bestimmte nicht ionische Tenside des Typs Span^TM [z. B. Span^TM 20 (Sorbitan-Monolaurat) oder Span^TM 80 (Sorbitan-Monooleat)] oder vom Tween^TM-Typ [z. B. Tween^TM 80 (Polyoxyethylen (20) Sorbitan-Monooleat), welches mit Wasser leicht mischbar ist].
Andere mit Wasser mischbare, nicht wässrige Flüssigkeiten, die geeignet zum Einbringen in einige Ausführungsformen von Zusammensetzungen der Erfindung sind, die für Nahrungsmittelanwendungen bestimmt sind, schließen z. B. hydroxylgruppenhaltige Flüssigkeiten ein wie Ethanol, Propylenglykol, Glycerin, oder Polyethylenglykole (PEG) verschiedener durchschnittlicher Molekulargewichte (z. B. PEG 200, PEG 400 oder PEG 600).
Anwendungen außerhalb des Nahrungsmittelbereichs
Nicht wässrige, flüssige Phasen, die Bestandteile umfassen, die unter den vorstehend erwähnten ausgewählt sind, sind auch von Bedeutung im Zusammenhang mit Ausführungsformen einer Zusammensetzung der Erfindung, die für Anwendungen außerhalb des Nahrungsmittelbereichs bestimmt ist. Weitere, mit Wasser nicht mischbare interessierende Materialien vom Öltyp in diesem Zusammenhang schließen z. B. ein Paraffinöle und bestimmte Silikonöle. Weitere relevante Tenside schließen ein flüssige, nicht ionische Tenside vom Typ ethoxylierter und/oder propoxylierter aliphatischer Alkohole [z. B. Softanol^TM 50 von BP Chemicals (das Kondensationsprodukt von C₁₂-C₁₄ geradkettigen, aliphatischen Alkoholen mit 5 Mol Ethylenoxid)], und vom Typ der durch Triton^TM X-100 vertreten wird (= Polyethylenglykol 4-Isooctylphenylether), d.h. das 1:1-Produkt einer Veretherungs-Kondensation eines Alkylphenols (insbesondere eines 4-Alkylphenols) mit einem Polyalkylenglykol, wobei Substanzen dieser Art manchmal als „Alkylphenolalkoxylate" bezeichnet werden.
Weitere, mit Wasser mischbare, nicht wässrige flüssige Phasen, die zum Einbringen in Ausführungsformen einer Zusammensetzung der Erfindung für Anwendungen außerhalb des Nahrungsmittelbereichs geeignet sind, schließen z. B. Ethylenglykol und Glykolether (wie Diethylenglykoldimethyl- oder -diethylether) ein.
Andere Bestandteile
Andere Bestandteile, die zum Einschließen in bestimmte Ausführungsformen von Zusammensetzungen gemäß der Erfindung geeignet sind, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf die folgenden:
Dispersionsmittel:
Dispersionsmittel [d.h. Materialien, die helfen, eine Trennung (z. B. Ausfällen) von dispergierten festen Substanzen zu verhindern oder zu verzögern] schließen ein z. B.: bestimmte, fein verteilte Tonerden [wie Kaolin (Porzellanerde), Bentonit, Fuller-Erde und Ähnliches]; und natürlich vorkommende und synthetische Polymere, z. B. so genannte „entflockende Polymere", sowie amphipathische Materialien vom anionischen Polymertyp.
Mittel zum Regulieren der Viskosität:
Beispiele für Materialien, die geeignet sind, die Viskosität von Ausführungsformen von Zusammensetzungen der Erfindung zu erhöhen, schließen verschiedene Gütestufen von Quarzstaub (z. B. verkauft unter Markennamen wie Aerosil^TM, Cab-O-Sil^TM oder Tix-O-Sil^TM), Bentonit, Kaolin, fein verteiltes Calciumcarbonat, Organo-Polysilikate (z. B. Claytone^TM) und polymere Materialien wie Hydroxypropylcellulose (z. B. Natrosol^TM) und Xanthangummis ein.
Mittel zum Regulieren des pH-Werts:
Beispiele für Mittel zum Regulieren des pH-Werts, die geeignet zum Einbringen in einige Ausführungsformen einer Zusammensetzung der Erfindung sind [d.h. Substanzen, die, wenn die Zusammensetzung der Erfindung mit einem flüssigen Medium in Kontakt gebracht wird, beim Anpassen und/oder Beibehalten (d.h. Puffern) des pHs des Mediums helfen, um einen pH-Wert bereitzustellen, der mit den pH-empfindlichen Bestandteilen der Zusammensetzung verträglich ist (wie einem darin vorhandenen Enzym)], schließen verschiedene wasserfreie anorganische und organische Salze ein, wie Pyrophosphate (z. B. Natriumdihydrogenpyrophosphat, Na₂H₂P₂O₇), verschiedene Polyphosphate, Kaliumdihydrogenphosphat (KH₂PO₄), Natriumhydrogencarbonat (NaHCO₃), Kaliumacetat (CH₃COOK) und Natriumacetat (CH₃COONa), sowie Benzoesäure/Benzoatpuffer.
Antioxidantien:
Bei bestimmten Ausführungsformen von Zusammensetzungen der Erfindung kann es vorteilhaft sein, in die Zusammensetzung eine Substanz einzubringen (ein Antioxidans), das einen oxidationsempfindlichen Bestandteil der Zusammensetzung gegen Oxidation schützen kann (z. B. durch Luftsauerstoff). Solche Substanzen schließen z. B. Salze wie Sulfite (z. B. Natriumsulfit) und Thiosulfate (z. B. Natriumthiosulfat) ein, sowie organische Antioxidantien wie Methionin, Ascorbinsäure oder Lezithine.
Hilfsstoffe für die Detergenszusammensetzung:
Es wird offensichtlich sein, dass bestimmte Ausführungsformen einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung (z. B. Ausführungsformen, die eine nicht wässrige, flüssige Phase in Form eines nicht ionischen Tensids umfassen) als eigene Detergenszusammensetzungen verwendet werden können. Beispiele dafür sind Zusammensetzungen, die eine Laccase, einen Mediator und ein flüssiges nicht ionisches Tensid enthalten, wobei solche Anwendungen als Detergentien zum Waschen von bunten (gefärbten) Textilien bei gleichzeitiger Inhibition des Farbstofftransfers verwendbar sind.
Wenn es geeignet ist, können verschiedene Hilfsstoffe, die verwendet werden, um die Waschleistung der Detergenszusammensetzungen zu erhöhen, zusätzlich in solche Zusammensetzungen der Erfindung eingebracht werden. Solche Hilfsstoffe schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf die folgenden: Weitere Tenside [z. B. lineare Alkylbenzolsulfonate (LAS), oder Alkylpolyglykoside]; Mittel gegen das Wiederablagern von Schmutz [z. B. Polyvinylpyrrolidon (PVP), oder Cellulosederivate wie Methylcellulose, Hydroxyethylcellulose oder Carboxymethylcellulose]; und Builder (z. B. Zeolithe, Polycarboxylate, Phosphate oder Silikate).
Vorläuferstoffe von Desinfektionsmitteln:
Die vorliegende Erfindung macht es möglich, lagerungsstabile Zusammensetzungen herzustellen, die, wenn sie mit einem geeigneten wässrigen Medium in Kontakt gebracht werden, eine antimikrobielle (z. B. fungizide oder bakteriozide) Substanz erzeugen, die zur Desinfektion eines durch mikrobielle Organismen kontaminierten Ortes geeignet ist. Solche Zusammensetzungen können zum Beispiel für die industrielle Verwendung als Desinfektionsmittel zum Desinfizieren von durch mikrobielle Organismen kontaminierten Oberflächen, Flächen, Objekten, Gebrauchsgegenständen und Ähnlichem verwendbar sein, oder zur Verwendung in der Körperpflege als Desinfektionsmittel zur Desinfektion von Zahnprotesen, Kontaktlinsen, Haut, Wunden, etc.
Oligosacharide:
Die derzeitigen Erfinder haben beobachtet, besonders im Fall von Zusammensetzungen gemäß der Erfindung, die eine Laccase umfassen, dass die Gegenwart einer relativ kleinen Menge (z. B. ungefähr 1 bis 2 Gew.-% der Zusammensetzung) eines Dextrins (d.h. ein Oligosacharid, das durch teilweise Hydrolyse von Stärke erhältlich ist) zu einer deutlichen Verbesserung der Lagerungsstabilität der Zusammensetzung führen kann, insbesondere bei relativ hohen Temperaturen (bis zu ungefähr 40°C). Daher zeigte zum Beispiel [und wie in den Ausführungsbeispielen hierin gezeigt (vide infra)] eine Zusammensetzung der Erfindung, die ausgehend von einem alkalischen (pH 9) M. thermophila-Laccasekonzentrat zubereitet wurde, und die Benzoesäure/Natriumbenzoat als Puffer und etwa 2 Gew.-% Dextrin enthielt, eine bemerkenswerte Lagerungsstabilität bei 40°C (gemessen als Grad der Beibehaltung der Bleichleistung); ähnliche Ergebnisse wurden unter der Verwendung von z. B. Natriumdihydrogenpyrophosphat als pH-regulierendem Mittel an Stelle von Benzoesäure/Natriumbenzoat beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigten entsprechende Zusammensetzungen, die ca. 2 Gew.-% von Maltose oder Glukose anstatt Dextrin enthielten, signifikant schlechtere Lagerungsstabilität. Es scheint daher, dass Oligosacharide wie Dextrine verwendet werden können, um die Stabilität von bestimmten Ausführungsformen von im Wesentlichen wasserfreien, flüssigen Zusammensetzungen der Erfindung verstärken zu können.
Anwendungsgebiete von Zusammensetzungen der Erfindung
Eine Anzahl von Anwendungsgebieten wurde in einem gewissen Maße schon vorstehend erwähnt. Um es zusammenzufassen, schließen nicht begrenzende Anwendungsgebiete von Zusammensetzungen der Erfindung z. B. die folgenden ein: Färben von Haaren; Färben von Textilien; Detergensanwendungen (Anwendungen beim Waschen von Textilien als Detergens per se, oder als Zusatzstoff für eine Detergenszusammensetzung); Inhibition von Farbstofftransfer beim Waschen von Textilien; Bleichen von Textilien (z. B. Bleichen von Drell); Desinfektion; die Entwicklung von Geschmack in Nahrungsmitteln; Gelieren von Polysacchariden zur Verwendung in Nahrungsmitteln; und Binden von phenolischen Polysacchariden an Lignocellulosematerialien (z. B. zum Herstellen von Faserplatten, Pappe und ähnlichen, auf Lignocellulose basierenden Materialien).
Andere interessierende Anwendungen der Erfindung auf dem Gebiet der Körperpflege schließen Anwendungen zum Reinigen von Kontaktlinsen, in der Zahnpflege und in der Mundhygiene ein.
Was Anwendungen der Erfindung für Zahnpflege und Mundhygiene betrifft, schließen besonders interessante Aspekte ein Weißmachen (Bleichen) von Zähnen und Munddesinfektion ein, unter Verwendung von Formulierungen (z. B. Zahnpasten oder flüssige Konzentrate, die in Wasser verdünnt werden können, um eine Mundspülung oder Ähnliches zu ergeben), die im Wesentlichen wasserfreie Zusammensetzungen der Erfindung bilden.
Die Erfindung wird weiterhin durch die folgenden nachstehend gezeigten Ausführungsbeispiele illustriert, von denen nicht beabsichtigt ist, dass sie in irgendeiner Weise den Schutzbereich der Erfindung begrenzen.
MATERIALIEN UND METHODEN
Materialien, die im Zusammenhang mit den nachstehend gezeigten Ausführungsbeispielen benutzt werden, schließen die folgenden ein (Händler und weitere Details werden in Klammern gezeigt):
Laccase aus Trametes villosa (flüssiges Konzentrat, hergestellt durch Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark; Trockenmassegehalt nach Mettler 29,5 Gew.-%, ungefähr 20 mg reines Laccaseprotein pro Gramm Konzentrat);
Laccase aus Myceliophthora thermophila (wässrige Konzentrate, hergestellt durch Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark; Trockenmassegehalt nach Mettler 18,5 Gew.-% oder 23,0 Gew.-%; ungefähr 50 mg reines, aktive Laccaseprotein pro Gramm Konzentrat);
Isopar^TM G (ein Paraffinöl; Exxon);
Span^TM 80 (Emulgator; ICI);
DPX 6592 (ein in Öl lösliches, anionisches polymeres amphipathisches Dispersionsmittel; erhalten von Allied Colloids Limited, England);
AC31 (ein in Öl lösliches, anionisches polymeres amphipathisches Dispersionsmittel; erhalten von Allied Colloids Limited, England);
Softanol^TM 50 (ein nicht ionisches Tensid von der Art eines aliphatischen ethoxylierten Alkohols, vide supra; BP Chemicals);
Glycerin [in „Fond Chemicals Codex (FCC) Reinheitsstufe; Solvay oder Dow Chemical];
Aerosil^TM 200 (Quarzstaub, spezifische Oberfläche 200 m² pro Gramm; Degussa);
Speswhite^TM (Kaolin; ECC International);
Claycote^TM (Kaolin; Goonvean); Glucidex^TM D21 (Dextrin; Roquette Frères);
10-Phenothiazinpropionsäure (PPT, Mediator ; Rhône-Poulenc);
Methylsyringat (MS, Mediator; Inventaa);
o-Aminophenol (Aldrich);
m-Phenylendiamin (Aldrich);
Kaliumdihydrogenphosphat (KH₂PO₄);
Natriumbenzoat (Pulver; Merck);
Benzoesäure (Pulver; Merck);
Glycin (Merck);
6'' De Meo Virgin Natural White Hair (De Meo Brothers Inc., USA) Shampoo (Minirisk^TM; Handelsprodukt von SuperBrugsen, Dänemark).
BEISPIEL 1: Zubereitung einer im Wesentlichen wasserfreien, PPT-enthaltenden Dispersion (Aufschlämmung) von Laccase (Laccase aus T. villosa)
Zubereitung einer Laccasedispersion
Pro 1000 g endgültiger Enzymdispersion:
263,6 g Isopar^TM G werden mit 54,0 g Span^TM 80 und 230,0 g DPX 6592 gemischt. Die Mischung wird auf Eis gestellt. 1017,0 g Laccasekonzentrat aus T. villosa wird zur gekühlten Mischung innerhalb einer Zeitspanne von einer Minute zugefügt, während die Mischung einer Homogenisierung unterzogen wird (z. B. mit einem Silverson-Mixer mit hoher Scherkraft; „Silverson high shear mixer"). Die Homogenisierung wird 30 Minuten lang fortgesetzt, um eine Emulsion zu erhalten (wässrige Phase in Ölphase). Während dieser Zeitdauer wird die Temperatur unter 15°C gehalten. Weitere 695,4 g Isopar^TM G werden dann als Verdünnungsmittel zugefügt.
Das Wasser wird aus der sich ergebenden Emulsion durch azeotrope Destillation von Wasser/Isopar^TM G unter Vakuum bei einer konstanten Temperatur von ungefähr 15°C entfernt. Nach der Entfernung von fast allem Wasser werden 600 g Softanol^TM 50 zur entwässerten Enzymdispersion zugefügt. Die Temperatur der sich ergebenden Dispersion wird dann auf ungefähr 90°C unter Vakuum erhöht, um das verbleibende Isopar^TM G zu entfernen.
Die sich ergebende Laccasedispersion [30 Gew.-% Gehalt an gesamten Feststoffen; vorherrschende Partikelgröße ca. 1,3 μm; Wassergehalt (wie durch Karl-Fischer-Titration bestimmt; siehe z. B. J.S. Fritz und G.H. Schenk, Jr., Quantitative Analytical Chemistry, 2.
Ausgabe, Allyn und Bacon, Inc., Boston (1969), S. 276 und die darin angegebene Referenz) ca. 0,2 Gew.-%] wird auf Raumtemperatur gekühlt.
Zubereitung von PPT-enthaltender Laccasedispersion (Aufschlämmung)

(a) Eine Mischung, die aus 90 Gew.-% Softanol^TM 50 und 10 Gew.-% Aerosil^TM 200 besteht, wird durch Zufügen von 0,50 kg von Aerosil^TM 200 zu 4,50 kg Softanol^TM 50 hergestellt. Nach dem Verrühren wird die Mischung homogenisiert (z. B. mit einer Fryma-Mühle). 6,0 g PPT werden in 94 g der homogenisierten Softanol^TM 50/Aerosil^TM 200-Mischung durch Magnetrühren und Erhitzen auf ca. 40°C gelöst. 54,5 g der sich ergebenden PPT-Lösung werden mit 5,8 g der Softanol^TM 50/Aerosil^TM 200-Mischung, 6,3 g Softanol^TM 50, 6,84 g Laccasedispersion aus T. villosa (vide supra) und 75,6 g KH₂PO₄ gemischt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur gerührt und schließlich mit einem Ultra-Turrax-Gerät 2 Minuten lang homogenisiert, was das Endprodukt ergibt (etwa 189 g).
(b) Eine PPT-enthaltende Laccasedispersion (Aufschlämmung) ähnlich zur vorstehend genannten, die aber Kaolin als Dispersions-/Verdickungsmittel enthält, kann wie folgt hergestellt werden. Eine Mischung, die aus 89 Gew.-% Softanol^TM 50 und 11 Gew.-% Aerosil^TM 200 besteht, wird durch Zufügen von 0,55 kg Aerosil^TM 200 zu 4,45 kg Softanol^TM 50 hergestellt. Nach dem Rühren wird die Mischung homogenisiert (z. B. mit einer Fryma-Mühle). 54,0 g PPT werden in 546 g der homogenisierten Softanol^TM 50/Aerosil^TM 200-Mischung durch Magnetrühren und Erhitzen auf etwa 40°C gelöst. 140 g der sich ergebenden PPT-Lösung werden mit 63,7 g der Softanol^TM 50/Aerosil^TM 200-Mischung, 11,5 g Softanol^TM 50, 15,75 g Laccasedispersion, 168 g KH₂PO₄ und 21 g Speswhite^TM gemischt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur gerührt und schließlich mit einem Ultra-Turrax-Gerät 2 Minuten lang homogenisiert, was das Endprodukt ergibt (ca. 420 g).

BEISPIEL 2: Verwendung einer PPT-enthaltenden Laccasedispersion aus T. villosa (Aufschlämmung) zum Bleichen von Drell
(a) Quantifizieren des Bleichgrades
Ein Minolta Chromameter CR 300 wurde verwendet, um den Bleichgrad zu quantifizieren, unter Verwendung der Änderung im Farbenraum (Koordinaten) L*a*b* (CIELAB-System; L* zeigt die Änderung an Schwarz (–L*)/Weiß (+L*), a* zeigt die Änderung an Grün (–a*)/Rot (+a*), und b* zeigt die Änderung an Blau (–b*)/Gelb) (+b*). Eine Verringerung von L* bedeutet einen Anstieg an schwarzer Farbe (Verringerung von weißer Farbe), ein Anstieg an L* bedeutet einen Anstieg an weißer Farbe (Verringerung von schwarzer Farbe); eine Verringerung von a* bedeutet einen Anstieg an grüner Farbe (eine Verringerung von roter Farbe), ein Anstieg an a* bedeutet einen Anstieg an roter Farbe (eine Verringerung von grüner Farbe); eine Verringerung von b* bedeutet einen Anstieg an blauer Farbe (eine Verringerung von gelber Farbe), und ein Anstieg an b* bedeutet einen Anstieg an gelber Farbe (eine Verringerung von blauer Farbe), in Übereinstimmung mit der nachstehenden Tabelle.

– (minus) Koordinate + (plus)

schwarz L* weiß

grün a* rot

blau b* gelb
Das Minolta Chromameter CR300 wurde im L*a*b*-Farbenraum benutzt. Die verwendete Lichtquelle war ein CIE-Lichtstandard C. Jede Messung war ein Durchschnitt von mindestens 3 Messungen. Das Instrument wurde unter Verwendung einer Minolta-Kalibrationsplatte (weiß) mit bekannten L*a*b*-Koordinaten (absolute Kalibration) kalibriert. Nach Kalibration mit der weißen Platte wurden die absoluten L*a*b*-Werte der verschiedenen Drellproben (vide infra) mehrere Male bei verschiedenen Positionen auf der Probe gemessen und der Durchschnitt der Koordinaten L*a*b* wurde berechnet. Die Veränderung der Farbe jeder Probe wurde dann als Differenz (Δ) zwischen den L*a*b*-Ergebnissen jeweils für die unbehandelte und die behandelte Proben berechnet, d.h. Δ(L*a*b*) wurde berechnet.
(b) Verwendeter Drell
Dakota 14 ounce pure indigo denim (Dakota 14 Unzen reiner Indigo-Drell, Standardgewebe von Swift, Frankreich) wurde verwendet. Der Drell (75 × 100 cm) wurde zu „Beinen" genäht (Drellzylinder), die jeweils ungefähr 350 bis 375 g wogen (nicht stone-washed). Der Drell wurde in deionisiertem Wasser gewaschen (Wäsche im 125 1 Maßstab), das Aquazym^TM 120 L und Denimax^TM T enthielt (beide erhältlich von Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark) zum Entschlichten und Abreiben des Drells (was eine „stone-washed" Erscheinung ergibt), jeweils in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Enzymlieferanten. Nach diesem Waschverfahren wurde keine Inaktivierung durch Carbonat durchgeführt. Nach dem Spülen mit 3 × 125 Litern deionisiertem Wasser, wurde der Drell in einem üblichen Wäschetrockner getrocknet, und schließlich die L*a*b*-Koordinaten wie vorstehend beschrieben gemessen.
(c) Ausrüstung zum Bleichen und Bedingungen
Ein Atlas LP2 Launder-o-meter wurde verwendet. 2 × 12 g Proben (jede misst ca. 12 × 22 cm) des Drells, der wie in (b) vorstehend beschrieben behandelt wurde, wurden in einem dicht verschließbaren Becher aus rostfreiem Edelstahl (Gesamtvolumen 1200 ml) zusammen mit 240 ml deionisiertem Wasser (Temperatur 15 bis 20°C) und 0,45 g PPT-enthaltender Laccasedispersion aus T. villosa [die Dispersion enthielt kein Kaolin, zubereitet wie vorstehend beschrieben in Beispiel 1(a), beziehungsweise Kaolin-enthaltende Dispersion, zubereitet wie in Beispiel 1(b)]. Der Becher wurde dicht versiegelt und in das Launder-o-meter platziert. Das Launder-o-meter wurde bei 42 upm und 60°C 30 Minuten lang betrieben. Nach der Bearbeitung wurde der pH der Verfahrensflüssigkeit im Becher nach dem Abkühlen gemessen, und die Drellproben wurden in deionisiertem Wasser gespült und getrocknet. Die L*a*b*-Koordinaten wurden gemessen, und der Bleichgrad wie vorstehend beschrieben berechnet.
(d) Lagerungsstabilität (Beibehaltung der Leistungsfähigkeit zum Bleichen von Drell) von PPT-enthaltenden Laccasedispersionen aus T. villosa

Die Lagerungsstabilität einer Dispersion wie in Beispiel 1(a) zubereitet (d.h. eine Dispersion, die kein Kaolin enthält), wurde durch Inkubieren von Proben davon in Dunkelheit jeweils bei 4°C und 20°C untersucht, bei verschiedenen Zeitdauern bis zu 36 Tagen und dann die Leistungsfähigkeit zum Bleichen von Drell der verschiedenen inkubierten Proben unter Verwendung des oben beschriebenen Launder-o-meters getestet. Die Ergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle gezeigt, welche ΔL*-Werte zeigt – wie vorstehend beschrieben bestimmt – zusammen mit den gemessenen Werten des endgültigen pHs in der abgekühlten Verfahrensflüssigkeit [siehe Abschnitt (c) vorstehend]:

Tage	4°C		20°C
Tage	ΔL*	pH	ΔL*	pH
0	7,95	6,04	7,95	6,04
1	10,59	6,19	10,59	6,19
8	9,95	6,06	10,39	6,12
15	10,14	5,99	9,64	6,00
22	10,11	5,92	10,49	5,93
29	10,59	6,04	9,03	6,01
36	10,30	6,02	9,80	6,04

In einer anderen Reihe von Experimenten wurde die Lagerungsstabilität einer Dispersion, die wie in Beispiel 1(b) zubereitet wurde [d.h. eine Dispersion, die Kaolin enthält (eingebracht als ein Verdickungsmittel und/oder Dispersionsstabilisator), welche eine derzeit bevorzugte Ausführungsform einer Mediator-enthaltenden Laccasedispersion der fraglichen Art ist], durch Inkubation von Proben davon in der Dunkelheit bei jeweils 5°C, 25°C und 40°C für verschiedene Zeitdauern untersucht, und dann die Leistungsfähigkeit zum Bleichen von Drell der verschiedenen inkubierten Proben unter Verwendung des Launder-o-meters wie vorstehend beschrieben getestet. Die Ergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle gezeigt, welche Daten für Zeitdauern bis zu 249 Tagen zeigt.

Tage	5°C		25°C		40°C
Tage	ΔL*	pH	ΔL*	pH	ΔL*	pH
0	11,02	6,05	11,02	6,05	11,02	6,05
19	10,71	5,83	10,30	5,85	10,66	5,81
31	10,28	5,90	11,29	5,93	9,95	5,83
62	8,67	5,87	9,15	5,93	5,74	5,96
82	10,76	5,88	10,61	5,91	5,95	5,94
101	10,56	5,88	9,92	6,04	5,49	6,12
154	10,90	6,26	11,10	6,32	5,70	6,40
189	10,21	5,75	8,74	5,75	3,78	6,02
221	10,99	5,92	8,11	5,94	3,90	6,03
249	10,08	5,65	9,33	5,86	3,13	6,02

Es ist aus den vorstehenden Tabellen offensichtlich, dass die Dispersionen sehr gute Stabilität bei Raumtemperaturen zeigen (ungefähr 20 bis 25°C), und sehr stabil bei Temperaturen von ungefähr 5°C oder weniger sind. Weiterhin zeigen die Daten für die Kaolin-enthaltenden Dispersion, dass eine zufriedenstellende Stabilität für eine Zeitdauer von mindestens einem Monat beibehalten wird, wenn die Dispersion bei 40°C gelagert wird.
BEISPIEL 3: Zubereitung einer im Wesentlichen wasserfreien Dispersion von Laccase (Laccase aus M. thermophila), die einen oder mehrere Farbstoff-Vorläufer zum Kolorieren von Haaren (Haarefärben) enthält
Zubereitung einer Laccasedispersion
109,6 g Isopar^TM G werden mit 9,9 g Span^TM 80 und 42,6 g DPX 6592 gemischt. Die Mischung wird auf Eis gelagert. 300,4 g Laccase aus M. thermophila-Konzentrat (Trockenmassegehalt nach Mettler 18,5 Gew.-%) wird zur gekühlten Mischung innerhalb einer Zeitdauer von 1 Minute zugefügt, während die Mischung einer Homogenisierung unterzogen wird (z. B. mit einem Silverson-Mixer mit hoher Scherkraft). Die Homogenisierung wird 30 lang Minuten fortgesetzt, um eine Emulsion zu erhalten (wässrige Phase in Ölphase). Während dieser Zeitdauer wird die Temperatur unter 15°C gehalten. Weitere 205,2 g Isopar^TM G werden dann als Verdünnungsmittel zugefügt.
Das Wasser wird aus der sich ergebenden Emulsion durch azeotrope Destillation von Wasser/Isopar^TM G unter Vakuum bei einer konstanten Temperatur von ungefähr 20°C entfernt. Nach der Entfernung von fast allem Wasser werden 110,8 g Softanol^TM 50 zur entwässerten Enzymdispersion zugefügt. Die Temperatur der sich ergebenden Dispersion wird dann auf ungefähr 105°C unter Vakuum erhöht, um das verbleibende Isopar^TM G zu entfernen.
Die sich ergebende Laccasedispersion [ungefähr 30 Gew.-% Gehalt an gesamten Feststoffen; vorherrschende Partikelgröße ungefähr 1,6 um; Wassergehalt (wie durch Standard-Karl-Fischer-Titration, vide supra, bestimmt) ca. 0,55 Gew.-%] wird auf Raumtemperatur abgekühlt.
Zubereitung einer Laccasedispersion, die Farbstoff-Vorläufer enthält (Aufschlämmung)

(a) Eine Lösung von o-Aminophenol und m-Phenylendiamin in Glycerin wird durch Lösen von 0,503 g o-Aminophenol und 0,506 g m-Phenylendiamin in 48,02 g Glycerin durch Magnetrühren und Erhitzen auf etwa 40°C zubereitet. Das Produkt wird dann auf Raumtemperatur abgekühlt, und 1,00 g Laccasedispersion aus M. thermophila (vide supra) werden zugefügt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur gerührt und schließlich 2 Minuten mit einem Ultra-Turrax-Gerät homogenisiert, was das Endprodukt ergibt [ca. 50 g; enthält ca. 1 Gew.-% o-Aminophenol, ca. 1 Gew.-% m-Phenylendiamin und ca. 1 mg Laccase (als reines Laccaseprotein) pro Gramm des Endprodukts].
(b) Eine Laccasedispersion (Aufschlämmung), die Farbstoff-Vorläufer enthält, ähnlich zur vorstehenden, die aber Kaolin als Dispersions-/Verdickungsmittel enthält, kann wie folgt zubereitet werden: 0,517 g o-Aminophenol und 0,499 g m-Phenylendiamin werden in 30,49 g Glycerin durch Magnetrühren und Erhitzen auf etwa 40°C gelöst. Das Produkt wird auf Raumtemperatur abgekühlt, und 0,59 g Laccasedispersion aus M thermophila (vide supra) und 17,44 g Claycote^TM werden zugefügt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur gerührt und wird schließlich mit einem Ultra-Turrax-Gerät 2 Minuten lang homogenisiert, was das Endprodukt ergibt [ca. 50 g; enthält ca. 1 Gew.-% o-Aminophenol, ca. 1 Gew.-% m-Phenylendiamin, ca. 35 Gew.-% Kaolin und ca. 1 mg Laccase (als reines Laccaseprotein) pro Gramm Endprodukt].

BEISPIEL 4: Färben von Haaren unter Verwendung einer im Wesentlichen wasserfreien Dispersion von Laccase aus M. thermophila, die Farbstoff-Vorläufer enthält
Laccasedispersionen (Aufschlämmungen), die Farbstoff-Vorläufer enthalten, hergestellt wie in den Abschnitten (a) und (b) (jeweils Dispersionen ohne Kaolin und mit Kaolin) von Beispiel 3 vorstehend beschrieben, wurden mit Standard-Testhaar zum Färben verwendet („De Meo Natural Virgin White Hair"), wie im Folgenden beschrieben:
(i) Verfahren zum Haarefärben

(a) Eine Strähne (1 Gramm) des Standard-Testhaars wurde in ein frisch zubereitetes Medium zum Färben, hergestellt durch Mischen von 0,5 g von Vorläufer enthaltender Dispersion und wässrigem Kaliumphosphatpuffer, pH 7 (Gesamtvolumen des Färbemediums 5 ml), 30 Minuten lang bei 30°C eingetaucht. Die gefärbte Haarprobe wurde dann unter laufendem Leitungswasser gespült, einmal mit Shampoo gewaschen („Minirisk"), nochmals in Leitungswasser gewaschen, gekämmt und luftgetrocknet. Unter Verwendung dieser Verfahrensweise wurde eine Strähne unter Verwendung von Vorläufer-enthaltender Dispersion ohne Kaolin gefärbt, während eine zweite Strähne unter Verwendung von Vorläufer-enthaltender Dispersion mit Kaolin gefärbt wurde.
(b) Für Vergleichszwecke (Kontrolle) wurde 1 Gramm einer weiteren Strähne Testhaar bei 30°C 30 Minuten lang in einem frisch zubereiteten wässrigen Medium inkubiert, das Laccase aus M. thermophila enthält (eine Verdünnung des wässrigen Konzentrats, auf das vorstehend Bezug genommen wird, in wässrigem Kaliumphosphatpuffer pH 7) und die gleichen Farbstoff-Vorläufer wie vorher (eine Lösung davon in wässrigem Kaliumphosphatpuffer pH 7) in den gleichen Konzentrationen wie in den in „(a)" vorstehend verwendeten Medien zum Färben. Die gefärbte Haarsträhne wurde dann in exakt der gleichen Weise wie vorstehend in „(a)” behandelt.

(ii) Einschätzung der Haarfarbe
Die Farbe der gefärbten Haarsträhnen wurde quantitativ auf eine Weise bestimmt, ähnlich zur vorstehend in Beispiel 2 beschriebenen, auf der Basis von Messungen von Änderungen (A) der Farbparameter L*, a* und b*, unter Verwendung eines Minolta CR200 Chromameters.
ΔL*, Δa* und Δb* werden relativ zu den Werten L*, a*, bzw. b* für das unbehandelte Haar definiert (z. B. AL* = L*_Probe – L*_{unbehandeltes
Haar}).
Die Menge an AE* wird dann berechnet als AE* = √(ΔL*² + Δa*² + Δb*²) und wird als ein Maß der gesamten quantitativen Farbänderung genommen.
1 zeigt die Färbeergebnisse (ΔL*, Aa*, Δb* und ΔE*-Werte), die erhalten wurden unter Verwendung

1) des Färbemediums, das aus einer Dispersion gemäß der Erfindung ohne Kaolin hergestellt wurde (hellgraue Schraffierung; mittlere Säulen),
2) des Färbemediums, das aus einer Dispersion gemäß der Erfindung mit Kaolin hergestellt wurde (dunkelgraue Schraffierung; rechte Säulen), und
3) dem Kontrollfärbemedium (mittelgraue Schraffierung; linke Säulen).

Es ist aus den Ergebnissen offensichtlich, dass das Haarefärben, das unter Verwendung von Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung erreicht wurde (die nicht nur Enzym umfassen, sondern auch die notwendigen Farbstoff-Vorläufer) einen sehr vorteilhaften Vergleich ergibt mit dem, was unter Verwendung der „traditionelleren" Vorgehensweise erreicht wird, welche eine „in situ"-Mischung von Enzym bzw. Farbstoff-Vorläufer(n) direkt vor dem Ausführen des Färbevorgangs notwendig macht.
BEISPIEL 5: Zubereitung einer im Wesentlichen wasserfreien, MS-enthaltenden Dispersion von Laccase (Laccase aus M. thermophila)
Zubereitung einer Laccasedispersion
67,1 g Isopar^TM G werden mit 9,2 g Span^TM 80 und 26,1 g AC31 gemischt. Die Mischung wird auf Eis platziert. 200,3 g eines Dextrin-enthaltenden Laccasekonzentrats aus M. thermophila, pH 9,0 [zubereitet durch Zufügen von 10,0 g 2 M Glycinpuffer, pH 9,0 und 4,1 g Glucidex^TM D21 zu 190,2 g wässrigem Laccasekonzentrat (23,0 Gew.-% Trockenmassegehalt nach Mettler)], wird zur gekühlten Mischung innerhalb einer Zeitdauer von 1 Minute zugef^ügt, während die Mischung einer Homogenisierung unterzogen wird (z. B. mit einem Silverson-Mixer mit hoher Scherkraft). Die Homogenisierung wird 30 Minuten lang durchgeführt, um eine Emulsion zu erhalten (wässrige Phase in Ölphase). Während dieser Zeitdauer wird die Temperatur unter 15°C gehalten. Weitere 130,0 g Isopar^TM G werden dann als Verdünnungsmittel zugefügt.
Wasser wird aus der sich ergebenden Emulsion durch azeotrope Destillation von Wasser/Isopar^TM G unter Vakuum bei einer konstanten Temperatur von ungefähr 20°C entfernt. Nach der Entfernung von fast allem Wasser werden 101,9 g Softanol^TM 50 zur entwässerten Enzymdispersion zugefügt. Die Temperatur der sich ergebenden Dispersion wird dann auf ungefähr 105°C unter Vakuum erhöht, um das verbleibende Isopar^TM G zu entfernen.
Die sich ergebende Laccasedispersion (ungefähr 30 Gew.-% Gehalt an gesamten Feststoffen) wird auf Raumtemperatur abgekühlt.
Zubereitung von MS-enthaltender Laccasedispersion (Aufschlämmung)
Eine Mischung, die aus 92 Gew.-% Softanol^TM 50 und 8 Gew.-% Aerosil^TM 200 besteht, wird durch Zufügen von 0,40 kg Aerosil^TM 200 zu 4,60 kg Softanol^TM 50 zubereitet. Nach dem Rühren wird die Mischung homogenisiert (z. B. mit einer Fryma-Mühle).
40,0 g Methylsyringat (MS) werden in 210,0 g der homogenisierten Softanol^TM 50/Aerosil^TM 200-Mischung durch Magnetrühren und Erhitzen auf ca. 40°C gelöst. 37,8 g der sich ergebenden MS-Lösung werden mit 15,0 g Benzoesäure, 15,1 g Natriumbenzoat, 2,2 g der Softanol^TM 50/Aerosil^TM 200-Mischung, 3,8 g Kaolin und ungefähr 1,1 g Laccasedispersion aus M. thermophila gemischt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur gerührt und schließlich auf einem Ultra-Turrax-Gerät 2 Minuten lang homogenisiert, was das Endprodukt ergibt (ca. 75 g).
BEISPIEL 6: Verwendung von MS-enthaltender Laccasedispersion aus M. thermophila (Aufschlämmung) zum Bleichen von Drell
Durch Enzyme bewirkter „stone-washed" Drell wurde unter Verwendung von MS-enthaltender M. thermophila-Laccasedispersion (zubereitet gemäß vorstehendem Beispiel 5) gebleicht, die bei 40°C für verschiedene Zeitdauern gelagert wurde. Die verwendete Ausrüstung und Verfahrensweise waren ansonsten wie in Beispiel 2 beschrieben (vide supra).
Die Ergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle gezeigt:

Tage 40°C

AL* pH

0 7,79 4,62

21 7,61 4,97

28 7,26 4,65

36 8,33 4,62
Wie für die PPT-enthaltende Laccasedispersion aus T. villosa in Beispiel 2 beobachtet, zeigen die letzteren Daten, dass eine zufriedenstellende Stabilität (Beibehaltung der Leistungsfähigkeit zum Bleichen) der fraglichen MS-enthaltenden M. thermophila-Laccasedispersion (die 2 Gew.-% Dextrin enthält) für eine Zeitdauer von mindestens einem Monat beibehalten wird, wenn die Dispersion bei 40°C gelagert wird.

Claims

Flüssige Zusammensetzung, umfassend. (a) eine Laccase (EC 1.10.3.2), (b) eine Substanz, ausgewählt unter (i) Substanzen, die in einem wässrigen Medium Substrate für das Enzym sind, (ii) Substanzen, die in einem wässrigen Medium Vorläufer für Substrate für das Enzym sind, und (iii) Substanzen, die Cofaktoren für das Enzym sind. (c) eine nicht wässrige flüssige Phase und (d) höchstens 5 Gew.-% Wasser.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, die höchstens 1 Gew.-% Wasser umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die Laccase in partikulärer fester Form vorliegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die Laccase in kristalliner Form vorliegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 3 oder 4, wobei die partikuläre feste Laccase in der flüssigen Phase dispergiert ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Substanz in der flüssigen Phase dispergiert ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 6, die weiterhin ein Dispersionsmittel umfasst.
Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die weiterhin ein die Viskosität regulierendes Mittel umfasst.
Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die weiterhin ein pH-regulierendes Mittel umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 3 bis 9, wobei das Laccase-Substrat ein Mediator (wie er hier definiert ist) ist, und die nicht-wässrige flüssige Phase ein nicht-ionisches Surfaktant umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei der Mediator aus der Gruppe bestehend aus Acetosyringon, Alkylsyringate, 10-substituierten Phenothiazinen und 10-substituierten Phenoxazinen ausgewählt ist.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10–11 in einer Bleiche für Gewebe oder zur Farbstofftransferinhibition.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10–11 zur Desinfektion eines mikrobiell kontaminierten Ortes.