DE69817484T2

DE69817484T2 - Verfahren zur isolierung bestimmter biologischer stoffe mittels magnetischer silika-partikel

Info

Publication number: DE69817484T2
Application number: DE69817484T
Authority: DE
Inventors: E. Craig SMITH; K. Charles YORK
Original assignee: Promega Corp
Current assignee: Promega Corp
Priority date: 1997-01-21
Filing date: 1998-01-21
Publication date: 2004-06-17
Anticipated expiration: 2018-01-22
Also published as: JPH11509742A; DE895546T1; JP3253638B2; EP0895546A4; US6368800B1; AU732756B2; DE69817484D1; EP0895546A1; AU6647598A; BR9805897A; US20020086326A1; DK1367137T3; US6027945A; DE69841555D1; EP1367137B1; EP1367137A1; CA2249393A1; US6673631B1; US20040086930A1; EP0895546B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Trennung oder Isolierung eines biologischen Zielmaterials von anderen Substanzen in einem Medium, um ein isoliertes Material ausreichender Reinheit für weitere Verarbeitung oder Analyse herzustellen. Die vorliegende Erfindung bezieht sich besonders auf Verfahren zur Trennung oder Isolierung von biologischen Zielmaterialien unter Verwendung von magnetisch ansprechenden Materialien, die imstande sind, das Material reversibel zu binden. Die vorliegende Erfindung bezieht sich spezieller auf Verfahren zur Trennung oder Isolierung von biologischen Zielmaterialien unter Verwendung von zumindest einem magnetisch ansprechenden Teilchen, das Kieselgel bzw. Silica, Silica-Derivate, wie z. B. Silica-Gel umfasst, welches reversibel dessen biologisches Zielmaterial bindet.
Hintergrund der Erfindung
Viele molekularbiologische Techniken, wie z. B. reverse Transkription, Klonierung, Restriktionsanalyse und Sequenzierung, umfassen die Verarbeitung oder Analyse von biologischen Materialien. Diese Techniken erfordern im Allgemeinen, dass solche Materialien im Wesentlichen frei von Verunreinigungen sind, welche bei solchen Verfahren- oder Analysenabläufen störend sind. Solche Verunreinigungen umfassen im Allgemeinen Substanzen, welche chemische Reaktionen blockieren oder unterdrücken (z. B. Nucleinsäuren- oder Proteinhybridisierungen, enzymatisch katalysierte Reaktionen und andere Arten von Reaktionen, welche in biologischen Techniken Verwendung finden), Substanzen, die den Abbau oder die Depolymerisation von Nucleinsäuren oder anderen biologischen Materialien von Interesse katalysieren, oder Substanzen, die einen "Hintergrund" liefern, der ein Beispiel für die Anwesenheit einer Menge an biologischem Zielmaterial von Interesse in einer Probe ist, wenn die Nucleinsäure nicht tatsächlich in der Probe vorhanden ist. Verunreinigungen umfassen auch makromolekulare Substanzen von In-vivo- oder In-vitro-Medien, aus denen ein Nucleinsäure-Material von Interesse isoliert wird, makromolekulare Substanzen wie etwa Enzyme, andere Arten von Proteinen, Polysaccharide oder Polynucleotide wie auch Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht wie Lipide, Enzym-Inhibitoren oder Oligonucleotide niedrigen Mofekufargewichts. Verunreinigungen können in das biologische Zielmaterial auch von Chemikalien oder anderen verwendeten Materialien eingeführt werden, die verwendet werden, um das Material aus anderen Substanzen zu isolieren. Häufige Verunreinigungen der letzten Art umfassen Spurenmetalle, Farbstoffe und organische Lösungsmittel.
Der Erhalt von DNA oder RNA, die ausreichend frei von Verunreinigungen für biologische Applikationen ist, wird erschwert durch die komplexen Systeme, in welchen DNA und RNA typischerweise gefunden werden. Diese Systeme, z. B. Zellen von Gewebe, Zellen von Körperflüssigkeiten wie Blut, Lymphe, Milch, Urin, Kot, Samen oder Lösungen, in welchen die Zielnucleinsäure-Amplifikationen durchgeführt werden, umfassen typischerweise signifikante Mengen an Verunreinigungen, von welchen die DNA oder RNA von Interesse isoliert werden muss, bevor sie in einem molekularbiologischen Verfahren verwendet wird.
Herkömmliche Protokolle zur Darstellung von DNA oder RNA von Zellen sind in der Literatur beschrieben. Siehe z. B. Kapitel 2 (DNA) und Kapitel 4 (RNA) in F. Ausubel et al. (Hrsg.), "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley-Interscience, New York (1993). Herkömmliche DNA-Isolierungs-Protokolle bedingen im Allgemeinen das Suspendieren der Zellen in einer Lösung und Verwenden von Enzymen und/oder Chemikalien, um behutsam die Zellen zu lysieren und dabei die DNA, welche in den Zellen enthalten ist, in die resultierende Lysatlösung abzugeben. Für die Isolierung der RNA umfassen die herkömmlichen Lyse- und Lösungsverfahren Maßnahmen zur Hemmung von Ribonucleasen, um Verunreinigungen von der RNA einschließlich der DNA abzutrennen.
Viele herkömmliche Protokolle, welche heute verwendet werden, bedingen im Allgemeinen auch die Verwendung von Phenol oder eines organischen Lösungsmittelge mischs, das Phenol und Chloroform enthält, um zusätzliche Zellmaterialien wie Proteine und Lipide von einer herkömmlichen Lysat-Lösung, welche wie oben beschrieben hergestellt wurde, zu extrahieren. Der Phenol/Chloroform-Extraktionsschritt wird im Allgemeinen gefolgt von der Ausfällung des Nucleinsäure-Materials, welches in der extrahierten wässrigen Phase noch vorhanden ist, durch die Zugabe von Ethanol zu dieser wässrigen Phase. Der Niederschlag wird typischerweise durch Zentrifugation aus der Lösung entfernt, und die erhaltenen Pellets des Niederschlags werden trocknen gelassen, bevor sie wieder in Wasser oder einer Pufferlösung für weitere Verarbeitung oder Analyse suspendiert werden.
Herkömmliche Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren haben signifikante Nachteile. Zu diesen Nachteilen zählen die Zeit, die für mehrfache Verfahrensschritte benötigt wird, die in der Extraktion notwendig sind, und die Gefahr der Verwendung von Phenol oder Chloroform. Phenol verursacht bei Kontakt schwere Verbrennungen. Chloroform ist stark flüchtig, toxisch und entflammbar. Diese Eigenschaften erfordern, dass Extraktionen mit Phenol und Phenol/Chloroform in einem Abzug durchgeführt werden.
Eine andere unerwünschte Eigenschaft von Extraktionen mit Phenol/Chloroform ist, dass die Oxidationsprodukte von Phenol Nucleinsäuren beschädigen können. Nur frisch redestilliertes Phenol kann effektiv verwendet werden, und Nucleinsäuren können nicht in der Gegenwart von Phenol gelassen werden. Im Allgemeinen werden Verfahren mit mehreren Schritten benötigt, um RNA nach einer Extraktion mit Phenol/Chloroform zu isolieren. Ethanol- (oder Isopropanol-) Fällungen müssen verwendet werden, um die DNA von einer wässrigen, mit Phenol/Chloroform extrahierten Lösung an DNA auszufällen und um restliches Phenol und Chloroform von der DNA zu entfernen. Weiters wird Ethanol- (oder Isopropanol-) Fällung benötigt, um einige Nucleosid-Triphosphat- und kurze (i. e. weniger als 30 Basen oder Basenpaare) einoder doppelsträngige Oligonucleotid-Verunreinigungen von der DNA zu entfernen. Außerdem produzieren unter den besten Umständen solche Verfahren relativ gerin ge Ausbeuten an isoliertem Nucleinsäuren-Material und/oder isoliertes Nucleinsäuren-Material kontaminiert mit Verunreinigungen.
Im Fachgebiet wurde ein Bedarf an Verfahren erkannt, die einfacher, sicherer oder effizienter als die herkömmlichen Extraktionsverfahren mit Phenol/Chloroform und Fällungen mit Ethanol sind, um DNA und/oder RNA ausreichend für die Manipulation mit molekularbiologischen Verfahren zu isolieren.
Fraktionierung von DNA, die aus Zellen gewonnen wurde, nach der Größe wird für viele molekularbiologische Verfahren benötigt. Solche Fraktionierung wird typischerweise durch Agarose- oder Polyacrylamid-Gelelektrophorese erzielt. Für die Analyse oder Behandlung mittels molekularbiologischer Verfahren nach der Fraktionierung muss die DNA in der oder den Fraktionen) von Interesse von Verunreinigungen wie Agarose, anderen Polysacchariden, Polyacrylamid, Acrylamid oder Acrylsäure, die in dem Gel bei solch einer Elektrophorese verwendet werden, getrennt werden. Daher herrscht auf dem Fachgebiet auch ein Bedarf an Verfahren, die solche Trennungen erzielen.
Verfahren zur Amplifikation von Nucleinsäuren oder Teilen davon, wie das allgemein bekannte Polymerase-Kettenreaktions-Verfahren (PCR) (siehe z. B. US-Patent Nr. 4.683.202) ergeben Lösungen von komplexen Mischungen von Enzymen, Nucleosidtriphosphaten, Oligonucleotiden und anderen Nucleinsäuren. Typischerweise werden die Verfahren durchgeführt, um deutlich erhöhte Mengen eines einzelnen Nucleinsäure-Segments ("Zielsegment") zu erhalten. Häufig ist es erforderlich, dieses Zielsegment von den anderen Komponenten in Lösung zu trennen, nachdem der Amplifikationsprozess durchgeführt wurde. Daher ist auf dem Fachgebiet ein weiterer Bedarf an einfachen Verfahren, um solche Trennungen zu erreichen, gegeben.
Silica-Materialien, einschließlich Glasteilchen wie Glaspulver, Silica-Teilchen und Glas-Mikrofasern, welche durch Zerreiben von Glasfaser-Filterpapieren hergestellt wurden, einschließlich Diatomeenerde, können in Kombination mit wässrigen Lösungen von chaotropen Salzen verwendet werden, um DNA von anderen Substanzen zu trennen und DNA vorzulegen, welche für die Verwendung in molekularbiologischen Verfahren geeignet ist. Siehe US-Patent 5.075.430 und die Verweise darin, einschließlich Marko et al., Anal. Biochem. 121, 382–387 (1982) und Vogelstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76, 615–619 (1979). Siehe auch Boom et al., J. Clin. Microbiol. 28, 495–503 (1990). Als Referenzen zu unversehrten Glasfaserfiltern, die in Verbindung mit wässrigen Lösungen eines chaotropen Mittels verwendet werden, um DNA von anderen Substanzen zu trennen, siehe Chen und Thomas, Anal. Biochem. 101, 339–341 (1980). Vogelstein et al., supra, schlagen vor, dass Silicagel für DNA-Separation nicht geeignet ist. Mit Bezug auf die Trennung von RNA unter Verwendung von Silica-Materialien und chaotropen Agentien siehe Gillespie et al., US-Patent 5.155.018.
Glasteilchen, Silica-Teilchen, Silicagel und Gemische davon wurden in verschiedenen unterschiedlichen Formen gebildet, um Matrizen zu erhalten, welche imstande sind, Nucleinsäure-Materialien reversibel zu binden, wenn sie in Kontakt mit einem Medium gebracht werden, welches solche Materialien in Gegenwart chaotroper Mittel enthält. Solche Matrizen werden so konstruiert, um an das Nucleinsäure-Material gebunden zu bleiben, während die Matrix einer äußeren Kraft wie Zentrifugation oder Vakuumfiltration ausgesetzt ist, um die Matrix und das daran gebundene Nucleinsäure-Material von übrigen Medien-Komponenten zu trennen. Das Nucleinsäure-Material wird dann von der Matrix durch Aussetzen der Matrix einer Elutionslösung, wie z. B. Wasser oder einem Elutionspuffer, eluiert. Zahlreiche gewerbliche Quellen bieten Silica-basierte Matrizen an, für die Verwendung in Zentrifugations- und/oder Filtrations-Isolierungssystemen welche entwickelt wurden. Siehe z. B. Wizard^TM-DNA-Reinigungssystem-Linie von Produkten von Promega Corporation (Madison, Wisconsin, USA); oder die QiaPrep^TM-Linie an DNA-Isolationssystemem von Qiagen Corp. (Chatsworth, Kalifornien, USA).
Magnetisch ansprechende Teilchen (in der Folge: "magnetische Teilchen") wurden herkömmlicherweise verwendet, um Polypeptid-Moleküle wie Proteine oder Antikörper zu isolieren und zu reinigen. In den letzten Jahren jedoch wurden magnetische Teilchen und Verfahren für die Verwendung von magnetischen Teilchen für die Isolierung von Nucleinsäure-Materialien entwickelt. Mehrere verschiedene Arten von magnetischen Teilchen, entwickelt für die Verwendung in der Isolierung von Nucleinsäuren, sind in der Literatur beschrieben, und viele dieser Arten an Teilchen sind im Handel erhältlich. Solche magnetischen Teilchen fallen im Allgemeinen in eine von zwei Kategorien: die eine wurde entwickelt, um Nucleinsäure-Material reversibel direkt zu binden, die andere wurde entwickelt, um dasselbe über zumindest eine Zwischensubstanz zu erzielen. Die Zwischensubstanz wird hierin als "Label" bezeichnet.
Die magnetischen Teilchen, die entwickelt wurden, um Nucleinsäure-Material indirekt zu binden, werden im Allgemeinen verwendet, um spezielle Nucleinsäure-Materialien wie mRNA gemäß dem folgenden grundlegenden Isolierungsverfahren zu isolieren. Zuerst wird ein Medium, das ein Nucleinsäure-Material enthält, mit einem Label in Kontakt gebracht, das imstande ist, an Nucleinsäure-Material von Interesse zu binden. Zum Beispiel bildet eines der häufig verwendeten Label, das biotinylierte Oligonucleotid Desoxythymidin (oligo-dT), Wasserstoffbindungen mit dem Poly-Adenosin-Schwanz des mRNA-Moleküls in einem Medium. Jedes so verwendete Label wird entwickelt, um sich an ein magnetisch ansprechendes Teilchen zu binden, wenn es mit einem Teilchen unter den geeigneten Bindungsbedingungen in Kontakt gebracht wird. Zum Beispiel ist das Biotin-Ende eines biotinylierten Oligo-dT/mRNA-Komplexes imstande, an Streptavidin-Gruppierungen an der Oberfläche eines mit Streptavidin beschichteten magnetisch ansprechenden Teilchens zu binden. Mehrere verschiedene gewerbliche Quellen sind für Streptavidin-magnetische Teilchen und Reagentien verfügbar, die entwickelt wurden, um in der mRNA-Isolierung verwendet zu werden unter Verwendung von biotinyliertem Oligo-dT wie oben beschrieben. Siehe z. B. PolyATract^®-Serie-9600^TM-mRNA-Isolierungssysteme der Promega Corporation; oder ProActive^TM-Linie von Streptavidin beschichteten Mikrosphären-Teilchen von den Bangs Laboratories (Carmel, Indiana, USA). Es wurden auch magnetische Teilchen und Label-Systeme entwickelt, die imstande sind, indirekt zu binden und andere Arten von Nucleinsäuren, wie z. B. doppelsträngige und einzelsträngige PCR-Template, zu isolieren. Siehe z. B. BioMag^TM superparamagnetische Teilchen von Advanced Magnetics, Inc. (Cambridge, Massachusetts, USA).
Indirekt bindende magnetische Trennsysteme für Nucleinsäure-Isolierung oder -Trennung erfordern zumindest drei Komponenten, nämlich magnetische Teilchen, ein Label und ein Medium, das Nucleinsäure-Material von Interesse enthält. Die Bindungsreaktion von Label und Nucleinsäure und von Label und Teilchen erfordert häufig unterschiedliche Lösungs- und/oder Temperatur-Reaktionsbedingungen. Jede zusätzlich im Isolierungsverfahren von Nucleinsäuren verwendete Komponente oder Lösung vergrößert das Risiko der Kontamination der isolierten Endprodukte mit Nucleasen, Metallen und anderen schädlichen Substanzen.
Einige Arten von magnetischen Teilchen wurden auch zur Verwendung beim direkten Binden und Isolieren von biologischen Materialien, besonders Nucleinsäuren, entwickelt. Eine solche Teilchenart ist ein magnetisch ansprechendes Glaskügelchen, virz mit kontrollierter Porengröße. Siehe z. B. magnetische, poröse Glasteilchen (MPG) von CPG, Inc. (Lincoln Park, New Jersey, USA); oder poröse magnetische Glasteilchen, beschrieben in den US-Patenten 4.395.271, 4.233.169 oder 4.297.337. Nucleinsäure-Material neigt jedoch dazu, sich so fest an Glas zu binden, dass es schwierig zu entfernen ist, wenn es einmal daran gebunden wurde. Daher neigen Elutionswirkungsgrade von magnetischen Glasteilchen dazu, niedrig zu sein – verglichen mit Elutionswirkungsgraden von Teilchen, die eine geringere Menge an Nucleinsäuren bindendem Material wie Silica enthalten.
Eine zweite Art von magnetisch ansprechenden Teilchen, die für die Verwendung beim direktem Binden und Isolieren von biologischen Materialien, besonders Nucleinsäuren, entwickelt wurden, sind Teilchen bestehend aus Agarose mit eingebet teten kleineren ferromagnetischen Teilchen und beschichtet mit Glas. Siehe z. B. US-Patent 5.395.498. Eine dritte Art eines magnetisch ansprechenden Teilchens, ein Teilchen, das imstande ist, direkt Enzyme, Proteine, Hormone oder Antikörper zu binden, wird durch Einbau von magnetischen Materialien in die Matrix aus polymeren Siliziumdioxid-Verbindungen hergestellt. Siehe z. B. das deutsche Patent DE 43 07 262 A1 . Die letzten beiden Arten von magnetischen Teilchen, die Agarose-Teilchen und die polymere Siliziumdioxid-Matrix, neigen unter den Bedingungen, die nötig sind, um biologische Materialien direkt an jedes solches magnetisches Teilchen zu binden, dazu, Eisen in das Medium einzuschleppen. Es ist auch schwer, solche Teilchen mit einer ausreichend einheitlichen und konzentrierten magnetischen Eigenschaft herzustellen, um schnelle und effiziente Isolierung von daran gebundenem Nucleinsäure-Material zu gewährleisten.
Was benötigt wird, ist ein Verfahren zur Isolierung von biologischen Einheiten, besonders von Nucleinsäuren, unter Verwendung eines magnetisch ansprechenden Teilchens, das imstande ist, rasch und effizient solche Einheiten ausreichend frei von Verunreinigungen für den Einsatz in molekularbiologischen Verfahren direkt zu isolieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Kurz gesagt umfasst die Erfindung in einem Aspekt ein Verfahren zur Isolierung eines biologischen Zielmaterials von anderen Materialien in einem Medium durch:
Bereitstellung eines Mediums, welches das biologische Zielmaterial enthält;
Bereitstellen magnetischer Kieselsäure- bzw. Silica-Teilchen;
Herstellung eines Komplexes aus den magnetischen Silica-Teilchen und dem biologischem Zielmaterial durch Kombination der magnetischen Silica-Teilchen mit dem Medium;
Entfernung des biologischen Zielmaterials vom Komplex durch Eluieren des biologischen Zielmaterials, wobei das isolierte biologische Zielmaterial erhalten wird.
In einem weiteren Aspekt ist die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Isolierung eines biologischen Zielmaterials von Interesse von anderen Materialien in einem Medium unter Verwendung von magnetischen Silica-Teilchen, die imstande sind, zumindest 2 μg biologisches Zielmaterial pro mg magnetischer Silica-Teilchen reversibel zu binden und zumindest 60% des daran gebundenen biologischen Zielmaterials abzugeben. In bevorzugten Anwendungen des vorliegenden Verfahrens sind zumindest 4 μg biologisches Zielmaterial pro mg magnetischer Silica-Teilchen gebunden, und zumindest 75% des biologischen Zielmaterials, das an den magnetischen Silica-Teilchen anhaftet, wird danach eluiert. Das biologische Zielmaterial, das gemäß dem Verfahren dieser Erfindung isoliert wird, ist bevorzugt Nucleinsäure.
Eine bevorzugte Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung umfasst die folgenden Schritte. Zuerst wird ein Gemisch gebildet, das ein Medium und magnetische Silica-Teilchen umfasst. Zweitens wird das biologische Zielmaterial an die magnetischen Silica-Teilchen im Gemisch angehaftet. Drittens werden die magnetischen Silica-Teilchen vom Gemisch unter Anwendung einer äußeren Kraft, insbesondere unter Verwendung magnetischer Kraft, entfernt, und viertens werden zumindest 60 des biologischen Materials, das an den magnetischen Silica-Teilchen anhaftet, durch Kontaktieren der Teilchen mit einem Eluens eluiert.
In einem anderen Aspekt ist die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA aus anderen Materialien in einem Medium unter Verwendung einer bevorzugten Form von magnetischen Silica-Teilchen, d. h. mit Siliziumoxid beschichtete magnetische Teilchen, worin die bevorzugten Teilchen imstande sind, zumindest 2 μg Plasmid-DNA-Material pro mg Teilchen zu binden und zumindest 60% des Plasmid-DNA-Materials, das daran gebunden ist, abzugeben. Eine bevorzugte Anwendung der Verfahren dieses Aspekts der Erfindung umfasst folgende Schritte. Zuerst wird ein Gemisch gebildet, das ein Medium einschließlich Plasmid-DNA, mit Siliziumoxid beschichtete magnetische Teilchen und ein chaotropes Salz umfasst. Zweitens wird die Plasmid-DNA an die mit Siliziumoxid beschichteten magnetischen Teilchen im Gemisch angehaftet. Drittens wird das mit Siliziumoxid beschichtete magnetische Teilchen vom Gemisch unter Verwendung einer äußeren Kraft, insbesondere unter Verwendung eines magnetischen Feldes, entfernt. Viertens werden zumindest 60% der Plasmid-DNA, die am mit Siliziumoxid beschichteten magnetischen Teilchen anhaftet, durch Kontaktieren des Teilchens mit einem Eluens eluiert.
In einem weiteren Aspekt ist die vorliegende Erfindung ein Baukasten zur Isolierung von biologischen Zielmaterialien aus einem Medium, welches dieselben enthält, wobei der Baukasten eine Aliquote von mit Siliziumoxid beschichteten Teilchen, die in einer wässrigen Lösung in einem ersten Behälter suspendiert sind, umfasst, wobei die Teilchen die Eigenschaft aufweisen, zumindest 2 μg biologisches Zielmaterial pro mg Teilchen reversibel zu binden. Gegebenenfalls umfasst der Baukasten andere Komponenten, die benötigt werden, um biologische Zielmaterialien aus einem Medium, welches dieselben enthält, gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung zu isolieren.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "magnetische Teilchen" auf Materialien, die kein magnetisches Feld besitzen, die aber ein magnetisches Dipol ausbilden, wenn sie einem magnetischen Feld ausgesetzt sind, i. e. Materialien, die imstande sind, in Gegenwart eines magnetischen Feldes magnetisiert zu werden, die aber selbst nicht magnetisch sind in Abwesenheit eines solchen Feldes. Der Begriff "magnetisch", wie er in diesem Kontext verwendet wird, umfasst Materialien, die paramagnetische oder superparamagnetische Materialien sind. Der Begriff "magnetisch", wie hierin verwendet, umfasst auch temporär magnetische Materialien, wie z. B. ferromagnetische oder ferrimagnetische Materialien mit niedrigen Curie-Temperaturen, vorausgesetzt dass solche temporär magnetische Materialien in dem Temperaturbereich paramagnetisch sind, bei dem die magnetischen Silica-Teilchen, die solche Materialien enthalten, gemäß den vorliegenden Methoden zur Isolierung biologischen Materials verwendet werden.
Der Begriff "magnetische Silica-Teilchen" bezieht sich auf ein magnetisches Teilchen, das Silica in Form von Silicagel, Siliziumoxid, festem Silica wie Glas oder Diatomeenerde oder einem Gemisch von zwei oder mehr der oben angeführten umfasst. Der Begriff "Silicagel", wie hier verwendet, bezieht sich auf Chromatographiereines Silicagel, einer Substanz, die im Handel aus einer Vielzahl an verschiedenen Quellen erhältlich ist. Silicagel wird am häufigsten durch Ansäuern einer Lösung, die Silikat, z. B. Natriumsilikat, enthält, bis zu einem pH niedriger als 10 oder 11, hergestellt, und dann wird die angesäuerte Lösung gelieren gelassen. Siehe z. B. die Diskussion der Silica-Herstellung in Kurt-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, Bd. 6, 4. Edition, Man Howe-Grant, Ed., John Wiley & Sons, Herausgeber, 1993, S. 773–775. Der Begriff "magnetische Silica-Teilchen", wie hier verwendet, bezieht sich bevorzugt auf Teilchen mit den oben beschriebenen Eigenschaften und jene, die die Eigenschaft aufweisen, zumindest 2 μg biologisches Zielmaterial pro mg magnetischer Silica-Teilchen zu binden, und unabhängig davon die Eigenschaft, zumindest 60% des biologischen Zielmaterials, das daran gebunden ist, im Elutionsschritt der vorliegenden Methode abzugeben. Die magnetischen Silica-Teilchen, die in der vorliegenden Erfindung bevorzugt verwendet werden, umfassen weiters ferromagnetische Materialien, die in die Silicagel-Matrix eingebaut sind. Der Elutionsschritt in den Isolierungsverfahren dieser Erfindung wird bevorzugt ohne nennenswerte Verunreinigung des Nucleinsäure-Materials durch Metalle oder Metallverbindungen (z. B. Eisen oder Eisenverbindungen) oder anderen störenden Spezies, die von den magnetischen Silica-Teilchen stammen, ausgeführt.
Der Begriff "Glasteilchen", wie hier verwendet, meint Teilchen von kristallinem Silica (z. B. α-Quarz oder Quarzgut), obwohl die kristallinen Silicas formal keine "Gläser" sind, weil sie nicht amorph sind, oder Teilchen aus Glas, die hauptsächlich aus Silica bestehen.
Der Begriff "mit Siliziumoxid beschichtete magnetische Teilchen" oder "SOCM-Teilchen" wird hierin verwendet, um sich auf die insbesondery bevorzugte Form von magnetischen Silica-Teilchen zu beziehen, die in diesen Verfahren und den Baukästen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Ein SOCM-Teilchen umfasst Siliziumoxid, das einen Kern von zumindest einem Teilchen eines superparamagnetischen oder paramagnetischen Materials beschichtet. Ein SOCM-Teilchen, das in den vorliegenden Verfahren und Baukästen verwendet wird, besitzt auch eine adsorbierende Oberfläche von wässrigem Siliziumoxid, die Oberfläche ist charakterisiert durch die Gegenwart von Silanolgruppen. Zielnucleinsäure-Material wie DNA oder RNA haftet an der adsorbierenden Oberfläche des Teilchens, obwohl andere Materialien, besonders störende Verunreinigungen wie Exonucleasen, nicht haften oder vom Teilchen zusammen mit Nucleinsäure-Materialien co-eluieren. Physikalische Eigenschaften der SOCM-Teilchen und Verfahren für die Herstellung solcher Teilchen sind in der WO 98/31461 mit dem Titel "Silica Absorbent on Magnetic Substrate" offenbart, deren Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen ist.
Die vorliegende Erfindung stellt praktische und effiziente Mittel zur Isolierung von biologischem Zielmaterial von Interesse aus einer Vielzahl verschiedener Medien bereit. Ein bevorzugter Aspekt des vorliegenden Verfahrens, das oben kurz beschrieben wurde, worin Magnetkraft verwendet wurde, um Teilchen vom Medium zu enffernen, liefert signifikante Vorteile gegenüber herkömmlichen Isolierungsverfahren, worin ein biologisches Zielmaterial reversibel an andere Silica-Materialien gebinden ist. Im Speziellen ersetzt der magnetische Entfernungsschritt des Verfahrens die Vakuumfiltrations- oder Zentrifugationsschritte, die in herkömmlichen Silicabindungsund Elutionsisolierungs-Verfahren benötigt werden. Daher ist es besonders zugänglich, um automatisiert zu werden. Kleine Laboratorien oder unabhängige Forscher müssen häufig spezialisierte und teure Ausrüstung kaufen, um solche Verfahren auszuführen, wie z. B. Vakuumleitungen und Vakuum für die Anwendung bei der Vakuumfiltration oder eine Mikrozentrifuge für Zentrifugationsverfahren. Im Gegensatz dazu benötigt die magnetische Trennung der vorliegenden Erfindung nur ein konzentriertes magnetisches Feld, wie es z. B. von einem starken leicht erhältlichen Magneten erzeugt wird. Preiswerte Geräte, die für die Verwendung im molekularbiologi schen Forschungs-Kontext speziell adaptiert sind, sind auch im Handel erhältlich, wie z. B. MagneSphere^® Technology Magnetic Separation Stand oder die PolyA-Tract^®-Serie-9600^TM-Multi-Magnet (beide erhältlich bei Promega Corporation, Madison, Wisconsin, USA).
Das biologische Zielmaterial, das unter Verwendung des Isolierungsverfahrens der vorliegenden Erfindung isoliert wurde, ist ausreichend frei von verunreinigendem Material für die weitere Verarbeitung oder Analyse unter Verwendung von molekularbiologischen Standardtechniken. Anwendungen des vorliegenden Verfahrens, um verschiedene unterschiedliche biologische Zielmaterialien aus einer Vielzahl von verschiedenen Medien zu isolieren, wird aus der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung offensichtlich.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 ist eine grafische Darstellung der μg Plasmid-DNA, die pro μg an zu entweder magnetischen kontrolliert-porösen Glas-Teilchen (CPG) oder magnetischen Silica-Teilchen zugegebener Plasmid-DNA gebunden wurden.
2 ist eine grafische Darstellung der μg Plasmid-DNA, die von entweder magnetischen CPG oder magnetischen Silica-Teilchen eluiert wurden, über der Menge an den Teilchen vor der Elution zugesetzter Plasmid-DNA.
3 ist eine grafische Darstellung der in 1 gezeigten Bindungsdaten und der in 2 gezeigten Elutionsdaten von magnetischen CPG und magnetischen Silica-Teilchen.
4 ist ein Fluoreszenzbild eines mit einem Fluoreszenzfarbstoff eingefärbten Agarose-Gels nach der Fraktionierung der DNA-Fragmente auf dem Gel unter Anwendung von Gel-Elektrophorese, worin die DNA-Fragmente durch Verdau von λ-DNA mit Hind III hergestellt wurden, und nach Bindung an und Elution der Fragmente von magnetische(n) Silica-Teilchen.
5 ist ein Fluoreszenzbild eines mit einem Fluoreszenzfarbstoff eingefärbten Agarose-Gels nach der Fraktionierung der DNA-Fragmente auf dem Gel unter Anwendung von Gel-Elektrophorese, worin die DNA-Fragmente durch Verdau von ϕX174-DNA mit Hae III hergestellt wurden, und nach Bindung an und Elution der Fragmente von magnetische(n) Silica-Teilchen.
6 ist ein Histogramm der Zählungen pro Million (CPM) an ³²P-markierter RNA, die auf magnetische Silica-Teilchen aufgebracht, daran gebunden und davon abgegeben wurde.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Das biologische Zielmaterial, das unter Anwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung isoliert wird, ist bevorzugt eine Nucleinsäure oder ein Protein, insbesondere ein Nucleinsäure-Material, wie z. B. RNA, DNA oder ein RNA/DNA-Hybrid. Wenn das biologische Zielmaterial, das unter Verwendung der vorliegenden Verfahren isoliert wird, eine Nucleinsäure ist, ist es vorzugsweise DNA oder RNA, einschließlich. aber nicht beschräntk auf Plasmid-DNA, DNA-Fragmente hergestellt durch Restriktionsenzym-Verdau, amplifizierte DNA, hergestellt durch eine Amplifikationsreaktion, wie z. B. Polymerase-Kettenreaktion (PCR), einzelsträngige DNA, mRNA oder Gesamt-RNA. Das Nucleinsäure-Material, das gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung isoliert wird, ist insbesondere Plasmid-DNA oder Gesamt-RNA.
Da Nucleinsäuren das besonders bevorzugte biologische Zielmaterial sind, die unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung isoliert wird, beschreibt die detaillierte Beschreibung der Erfindung vorwiegend diesen bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung. Jedoch beabsichtigt die detaillierte Beschreibung dieses speziellen Aspekts der vorliegenden Erfindung nicht die Einschränkung des Schutzumfangs der Erfindung. Die vorliegende Offenbarung liefert ausreichende Anleitung, um einem Fachmann auf dem Gebiet der vorliegenden Erfindung die Anwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung zu ermöglichen, um auch andere biologische Zielmaterialien als Nucleinsäure-Materialien, z. B. Proteine oder Antikörper, zu isolieren.
Die vorliegenden Verfahren zur Isolierung von biologischen Zielmaterialien können unter Verwendung eines beliebigen magnetischen Silica-Teilchens ausgeführt werden, aber die Verfahren werden bevorzugt ausgeführt unter Verwendung der SOCM-Form der magnetischen Silica-Teilchen. Die vorliegenden Verfahren werden auch bevorzugt ausgeführt unter Verwendung von magnetischen Silica-Teilchen mit den folgenden physikalischen Eigenschaften.
Die magnetischen Silica-Teilchen, die in den Verfahren dieser Erfindung verwendet werden, können jegliche mit unterschiedlicher Größe sein. Kleinere magnetische Teilchen liefern eine größere Oberfläche (pro Gewichtseinheit) für die Adsorption, aber kleinere Teilchen sind in der Menge an magnetischen Material, das im Vergleich zu größeren Teilchen in solche Teilchen eingebaut werden kann, beschränkt. Die mittlere Teilchengröße der magnetischen Silica-Teilchen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ist bevorzugt ungefähr 1 bis 15 μm, besonders etwa 3 bis 10 μm, insbesonders etwa 4 bis 7 μm. Die Teilchengrößenverteilung kann auch variieren. Jedoch wird eine relativ enge monodale Teilchengrößenverteilung bevorzugt. Die monodale Teilchengrößenverteilung ist bevorzugt so, dass etwa 80 Gew.% der Teilchen innerhalb eines Bereichs von 10 μm, speziell innerhalb eines Bereichs von 8 μm, insbesondere innerhalb eines Bereichs von 6 μm, um die mittlere Teilchengröße liegen.
Die magnetischen Silica-Teilchen, die in der vorliegenden Erfindung bevorzugt verwendet werden, weisen Poren auf, die vom Äußeren des Teilchens zugänglich sind. Die Poren liegen bevorzugt in einem kontrollierten Größenbereich, der ausreichend groß ist, um biologische Zielmaterialien, z. B. Nucleinsäuren, ins Innere des Teilchens zu lassen und an das Silicagel-Material auf der inneren Oberfläche der meisten Poren zu binden. Die Poren der besonders bevorzugten Form der magnetischen Silica-Teilchen sind so gestaltet, um eine große Oberfläche des Silicagels bereitzustellen, die imstande ist, ein biologisches Zielmaterial, besonders Nuclein-Material, zu binden. Das Gesamt-Porenvolumen der magnetischen Silica-Teilchen, gemessen nach dem Stickstoff-BET-Verfahren, beträgt vorzugsweise zumindest etwa 0,2 ml/g Teilchenmasse. Vom gesamten Porenvolumen, gemessen mittels Stickstoff-BET, sind vorzugsweise zumindest etwa 50% des Porenvolumens in Poren mit einem Durchmesser von 600 Å und größer enthalten.
Die magnetischen Silica-Teilchen können Substanzen wie z. B. Übergangsmetalle oder flüchtige organische Substanzen enthalten, welche den Nutzen der isolierten biologischen Zielmaterialien, die wesentlich mit solchen Substanzen verunreinigt sind, nachteilig beeinflussen könnten. Besonders könnten solche Verunreinigungen das nachgelagerte Bearbeiten, die Analyse und/oder Verwendung von solchen Materialien z. B. durch Inhibieren der Enzymaktivität oder Schädigung oder Abbau des Zielmaterials selbst beeinflussen. Jegliche solche in den magnetischen Silica-Teilchen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, enthaltene Substanzen liegen vorzugsweise in einer Form vor, die nicht leicht aus dem Teilchen und in das gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte isolierte biologische Zielmaterial ausgelaugt wird. Eisen ist eine solch unerwünschte Verunreinigung, besonders wenn das biologische Zielmaterial eine Nucleinsäure ist. Eisen in der Form von Magnetit ist im Kern einer besonders bevorzugten Form von magnetischen Silica-Teilchen der vorliegenden Erfindung, also SOCM-Teilchen, enthalten. Eisen hat einen breiten Absorptionspeak zwischen 260 und 270 Nanometer (nm). Nucleinsäuren haben die stärkste Absorption bei etwa 260 nm, daher kann eine Eisen-Verunrei nigung in Nucleinsäure-Proben die Genauigkeit der Ergebnisse quantitativer spektroskopischer Analysen solcher Proben negativ beeinflussen. Jegliche Eisen enthaltende magnetische Silica-Teilchen, die verwendet wurden, um Nucleinsäuren unter Anwendung der vorliegenden Erfindung zu isolieren, erzeugen bevorzugt kein isoliertes Nucleinsäure-Material, das so sehr mit Eisen verunreinigt ist, dass das Eisen bei spektralphotometrischen Analysen des Materials bei oder um 260 nm stört.
Die besonders bevorzugten magnetischen Silica-Teilchen, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, nämlich SOCM-Teilchen, laugen bei den nachfolgend beschriebenen Untersuchungen nicht mehr als 50 ppm, besonders bevorzugt nicht mehr als 10 ppm, insbesondere nicht mehr als 5 ppm, an Übergangsmetall aus. Speziell werden 0,33 g Teilchen (im Ofen bei 110°C getrocknet) in 20 ml wässriger 1 N HCl (unter Verwendung von entionisiertem Wasser) verwendet. Das erhaltene Gemisch wird dann nur gerührt, um die Teilchen zu dispergieren. Nach etwa 15 Minuten gesamter Kontaktzeit wird ein Teil der Flüssigkeit des Gemischs auf den Metallgehalt hin analysiert. Eine beliebige Elementaranalysentechnik kann verwendet werden, um die Menge an Übergangsmetall in der erhaltenen Flüssigkeit zu quantifizieren, aber Induktions-gekoppelte Plasma-Spektroskopie (ICP) wird bevorzugt.
Die WO 98/31461 offenbart Verfahren zur Herstellung von SOCM-Teilchen, die für die Verwendung in den Verfahren und den Baukästen der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Das besonders bevorzugte Verfahren für die Herstellung von SOCM-Teilchen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfasst die folgenden allgemeinen Schritte: (1) Herstellen von Magnetitkern-Teilchen durch wässrige Ausfällung eines Gemischs aus FeCl₂ und FeCl₃, (2) Abscheiden einer Siliziumoxidschicht auf Magnetitkern-Teilchen durch Aussetzen der Aufschlämmung der Teilchen einem Gemisch aus SiO₂ und Na₂O für zumindest 45 Minuten bei einer Temperatur von zumindest 60°C und Zugabe einer sauren Lösung zu dem Gemisch, bis der pH-Wert auf pH < 9 gesenkt wurde, (3) Alternlassen der erhaltenen Aufschlämmung für zu mindest 15 Minuten, bevorzugt unter fortgesetztem Rühren der Aufschlämmung, und (4) Waschen der Teilchen. Die Abscheidungs- und Alterungsschritte des bevorzugten Teilchenherstellungsverfahrens, das oben beschrieben wurde, kann wiederholt werden, um mehrfache Lagen an Siliziumoxidschichten auf dem Magnetitkern herzustellen, was somit eine zusätzliche Versicherung gegen Auslaugen von Metallen aus dem Kern in die Umgebung darstellt. SOCM-Teilchen, die durch das oben beschriebene Verfahren hergestellt wurden, werden besonders bevorzugt mittels Durchführung eines schonenden Oxidierungsschritts behandelt, um ein Auslaugen aus dem Kern weiter zu unterbinden.
Das biologische Zielmaterial, das unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung isoliert wird, kann von eukaryotischen oder prokaryotischen Kulturzellen oder von Zellen, die aus Gewebe mehrzelliger Organismen, einschließlich Tieren und Pflanzen, entnommen oder bezogen wurden; aus Körperflüssigkeiten wie Blut, Lymphe, Urin, Kot oder Samen; von Embryonen oder Föten; aus Nahrungsmitteln; aus Kosmetika; oder aus anderen beliebigen Quellen der Zellen erhalten werden. Einige biologische Zielmaterialien, wie z. B. spezielle Spezies von DNA oder RNA, werden gemäß dem vorliegenden Verfahren aus Organellen, Viren, Phagen, Plasmiden, Viroiden und dergleichen, die Zellen infizieren, isoliert. Zellen werden lysiert und das Lysat normalerweise auf unterschiedliche Weise ähnlich der auf dem Gebiet der Erfindung weiterverarbeitet, um wässrige Lösungen von DNA oder RNA zu erhalten, an denen die Trennungs- oder Isolierverfahren der vorliegenden Erfindung angewendet werden. Die DNA oder RNA in solch einer Lösung wird typischerweise zusammen mit anderen Komponenten, wie z. B. Proteinen, RNAs (im Fall der DNA-Trennung), DNAs (im Fall der RNA-Trennung) oder anderen Arten von Komponenten vorgefunden.
Ungeachtet der Natur der Quelle solcher Materialien wird das in den vorliegenden Verfahren zu isolierende Zielmaterial in einem Medium bereitgestellt, das biologische Zielmaterialien und andere Spezies enthält. Das biologische Zielmaterial muss im Medium in einer Form vorliegen, in welcher es an magnetische Silica-Teilchen im ersten Schritt des Verfahrens angehaftet werden kann. Wenn das Nucleinsäure-Material innerhalb der Zelle vorliegt, können die Zellwände oder Zellmembranen das Material nicht für die Adhäsion an die Teilchen bereitstellen. Selbst wenn solche Zellen lysiert oder ausreichend aufgebrochen sind, um das darin enthaltene Nucleinsäure-Material in die umgebende Lösung abzugeben, könnten Zelltrümmer in der Lösung die Adhäsion des Nucleinsäure-Materials an magnetischen Silica-Partikel behindern. In Fällen, wo das zu isolierende Nucleinsäure-Material unter Anwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung innerhalb eine Zelle enthalten ist, wird daher die Zelle bevorzugt durch Lysieren oder Spalten der Zelle verarbeitet, um Lysat zu erhalten, oder besonders bevorzugt zusätzlich verarbeitet durch Reinigen des Lysats von Zelltrümmern (z. B. durch Zentrifugieren oder Vakuumfiltration), die wahrscheinlich die Adhäsion des Nucleinsäure-Materials an magnetische Silica-Teilchen stören, wenn diese als Medium in den Verfahren der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden.
Beliebige einer Reihe von verschiedenen bekannten Verfahren zum Lysieren oder Spalten von Zellen, um darin enthaltene Nucleinsäure-Materialien abzugeben, sind geeignet für die Verwendung bei der Herstellung eines Mediums von Zellen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung. Das Verfahren, das gewählt wurde, um Nucleinsäure-Material aus einer Zelle freizusetzen, beruht auf der Art des Materials, das die Zelle enthält. Zum Beispiel, um eine Zelle mit einer relativ harten Zellwand, wie z. B. eine Pilz- oder Pflanzenzelle, dazu zu bringen, darin enthaltenes Nucleinsäure-Material freizusetzen, können grobe Behandlungen wie starke Proteasen und mechanisches Scheren mit einem Homogenisator oder Zerstören mit Schallwellen unter Verwendung eines Beschallers eingesetzt werden. Im Gegensatz dazu kann Nucleinsäure-Material leicht aus Zellen mit Lipiddoppelschicht-Membranen, wie z. B. E. coli-Bakterien oder tierischen Blutzellen, durch bloßes Suspendieren solcher Zellen in einer wässrigen Lösung und Zusatz eines Detergens zu der Lösung freigesetzt werden.
Wenn das Nucleinsäure-Material aus Zellen freigesetzt wird, die wie oben beschrieben lysiert oder gespalten wurden, behindern Zelltrümmer wahrscheinlich die Adhäsion des Nucleinsäure-Materials an magnetischen Silica-Teilchen und können unter Anwendung einer Anzahl an verschiedenen bekannten Techniken oder Kombinationen von Techniken entfernt werden. Die Lösung der lysierten oder gespaltenen Zelle wird bevorzugt zentrifugiert, um die einzelnen Zelltrümmer zu entfernen. Der Überstand wird dann bevorzugt durch Zugabe einer zweiten Lösung zum Überstand weiter verarbeitet, was eine Ausfällung von zusätzlichem, anderem Material bewirkt, und anschließendes Entfernen des Niederschlags von der erhaltenen Lösung durch Zentrifugieren.
In einem besonders bevorzugten Aspekt des vorliegenden Verfahrens ist das Nucleinsäure-Material von Interesse, das gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung isoliert wird, Plasmid-DNA, die ursprünglich in einer E. coli-Bakterienzelle enthalten war. Das Nucleinsäure-Material wird besonders bevorzugt aus der Bakterienzelle durch Zugabe einer basischen Lösung, wie z. B. einer Lösung von Natriumhydroxid, freigesetzt, um ein Lysat zu bilden. Das Lysat wird dann bevorzugt durch Zentrifugation weiter behandelt, um Zelltrümmer zu entfernen. Eine neutralisierende Lösung, wie z. B. ein saurer Puffer, wird bevorzugt zum erhaltenen Überstand zugegeben, um einen Niederschlag von zusätzlichem, möglicherweise störendem Material zu bilden. Der dadurch gebildete Niederschlag wird bevorzugt durch Zentrifugation entfernt. Der übrige Überstand des geklärten Lysats ist das Medium, das im ersten Schritt dieses besonders bevorzugten Aspekts des vorliegenden Verfahrens bereitgestellt wird.
Das Medium, das im ersten Schritt des Verfahrens der Erfindung bereitgestellt wird, muss nicht Nucleinsäure-Material enthalten, das direkt aus Zellen freigesetzt wurde. Das Nucleinsäure-Material kann das Produkt einer Amplifikationsreaktion sein, wie z. B. amplifizierte DNA, hergestellt unter Anwendung von Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Das Nucleinsäure-Material kann auch in Form eines DNA-Fragments durch Verdau von DNA mit einem Restriktionsenzym erhalten werden. Das Medium kann auch in Form eines Gemischs von geschmolzenem oder enzymatisch verdautem Elektrophoresegel oder Nucleinsäure-Material vorliegen.
Die magnetischen Silica-Teilchen, die im zweiten Schritt der Verfahren der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden, haben bevorzugt die Fähigkeit, einen Komplex mit dem Nucleinsäure-Material im Medium durch reversibles Binden von zumindest 2 μg Nucleinsäure-Material pro mg Teilchen zu bilden. Die Teilchen, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden, haben besonders bevorzugt die Fähigkeit zum reversiblen Binden von zumindest 4 μg und insbesondere bevorzugt zumindest 8 μg an Nucleinsäure-Material pro mg Teilchen. Die magnetischen Silica-Teilchen sollten bevorzugt die Fähigkeit haben, 60% das daran anhaftenden Nucleinsäure-Materials abzugeben. Die Teilchen haben besonders bevorzugt die Fähigkeit, 70% abzugeben und insbesonders bevorzugt zumindest 90% des daran anhaftenden Nucleinsäure-Materials abzugeben. Die magnetischen Silica-Teilchen, die im ersten Schritt der Verfahren der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden, sind besonders bevorzugt SOCM-Teilchen.
Ein Komplex der magnetischen Silica-Teilchen mit dem biologischen Zielmaterial wird im dritten Schritt gebildet, bevorzugt durch Aussetzen der Teilchen gegenüber einem Zielmaterial enthaltenden Medium unter Bedingungen, die so gewählt sind, dass die Bildung des Komplexes gefördert wird. Der Komplex wird bevorzugt in einem Gemisch aus magnetischen Silica-Teilchen, Medium und einem chaotropen Salz gebildet.
Chaotrope Salze sind Salze chaotroper Ionen. Solche Salze sind sehr gut löslich in wässrigen Lösungen. Chaotrope Ionen, die durch solche Salze bereitgestellt werden, bewirken in ausreichend hohen Konzentrationen in wässrigen Lösungen von Proteinen oder Nucleinsäuren, dass Proteine sich entfalten, Nucleinsäuren ihre Sekundärstruktur verlieren oder, im Fall doppelsträngiger Nucleinsäuren, schmelzen (d. h. sich die Stränge trennen). Es wird vermutet, dass chaotrope Ionen diese Wirkung haben, weil sie das Wasserstoffbrücken-Netzwerk, das in flüssigem Wasser existiert, stören und dadurch denaturierte Proteine und Nucleinsäuren thermodynamisch stabiler macht als deren korrekt gefalteten oder strukturierten Gegenstücke. Chaotope Ionen umfassen Guanidinium, Iodid, Perchlorat und Trichloracetat. Bevorzugt in der vorliegenden Erfindung ist das Guanidinium-Ion. Chaotrope Salze umfassen Guanidinhydrochlorid, Guanidinthiocyanat (welches manchmal als Guanidinisothiocyanat bezeichnet wird), Natriumiodid, Natriumperchlorat und Natriumtrichloracetat. Bevorzugt sind Guanidiniumsalze, und besonders bevorzugt ist Guanidinhydrochlorid.
Die Konzentration der chaotropen Ionen im gebildeten Gemisch bei dieser praktischen Umsetzung des vorliegenden Verfahrens liegt bevorzugt zwischen 0,1 und 7 M, aber besonders bevorzugt zwischen 0,5 und 5 M. Die Konzentration der chaotropen Ionen im Gemisch muss ausreichend hoch sein, um zu bewirken, dass das biologische Zielmaterial an magnetischen Silica-Teilchen im Gemisch anhaftet, aber nicht so hoch, dass es nennenswert denaturiert oder abgebaut wird oder dass das Zielmaterial aus dem Gemisch ausfällt. Proteine und große Moleküle doppelsträngiger DNA, wie z. B. chromosomale DNA, sind stabil bei chaotropen Salzkonzentrationen zwischen 0,5 und 2 M, fallen aber bekanntermaßen bei chaotropen Salzkonzentrationen über etwa 2 M aus der Lösung aus. Siehe z. B. US-Patent 5.346.994, ausgegeben an Piotr Chomcynski, Spalte 2, Zeile 56 bis 63. Im Gegensatz dazu bleiben RNA und kleinere DNA-Moleküle wie z. B. Plasmid-DNA, Restriktions- oder PCR-Fragmente von chromosomaler DNA oder einzelsträngige DNA unzersetzt und in Lösung bei chaotropen Salzkonzentration zwischen 2 und 5 M.
Bei jedem in der Erfindung verwendeten chaotropen Salz ist es wünschenswert, dass die Konzentration des Salzes in jeglichen Lösungen, in denen das Salz verwendet wird, um die Erfindung auszuführen, und unter jeglichen Bedingungen, denen die Lösung bei der Durchführung der Erfindung ausgesetzt wird, unter der Löslichkeit des Salzes in der Lösung bleibt.
In der Praxis der vorliegenden Erfindung wird das wie oben beschrieben gebildete Gemisch inkubiert, bis zumindest ein Teil des Nucleinsäure-Materials am magnetischen Silica-Teilchen anhaftet, um einen Komplex zu bilden. Dieser Inkubationsschritt wird bei einer Temperatur von zumindest 0°C, bevorzugt zumindest 4°C und besonders bevorzugt bei zumindest 20°C ausgeführt, vorausgesetzt dass die Inkubationstemperatur nicht höher als 67°C ist. Der Inkubationsschritt muss bei einer Temperatur ausgeführt werden, die unter der Temperatur liegt, bei der die magnetischen Silica-Teilchen die Fähigkeit verlieren, das Nucleinsäure-Material reversibel zu binden. Der Inkubationsschritt wird insbesonders bevorzugt bei etwa Raumtemperatur durchgeführt (d. h. etwa 25°C).
Der Komplex wird aus dem Gemisch unter der Verwendung eines magnetischen Feldes entfernt. Andere Arten der äußeren Kraft zusätzlich zum magnetischen Feld können auch eingesetzt werden, um die biologische Zielsubstanz gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung nach dem ursprünglichen Entfernungsschritt zu isolieren. Geeignete zusätzliche Arten an äußeren Kräften umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Schwerkraftsfiltration, Vakuumfiltration und Zentrifugation.
Das äußere magnetische Feld, das verwendet wird, um den Komplex aus dem Medium zu entfernen, kann geeigneterweise unter Anwendung jeglicher bekannter Mittel erzeugt werden. Zum Beispiel kann ein Magnet an der äußeren Oberfläche eines Behälters einer Lösung, die Teilchen enthält, positioniert werden und die Teilchen gezwungen werden, durch die Lösung zu wandern und sich an der inneren Oberfläche des Behälters in der Nähe des Magneten zu sammeln. Der Magnet kann dann in einer Position an der äußeren Oberfläche gehalten werden, so dass die Teilchen durch das magnetische Feld im Behälter gehalten werden, das vom Magneten erzeugt wird, während die Lösung aus dem Behälter dekantiert und verworfen wird. Eine zweite Lösung kann dann dem Behälter zugegeben und der Magnet entfernt werden, so dass die Teilchen in die zweite Lösung wandern. Alternativ dazu könnte eine magnetisierbare Sonde in die Lösung eingeführt und die Sonde magnetisiert werden, so dass sich die Teilchen am Ende der Sonde, die in die Lösung getaucht wird, ablagern. Die Sonde könnte dann aus der Lösung entfernt werden, wobei sie magnetisiert bleibt, und in eine zweite Lösung eingetaucht werden und das magnetische Feld unterbrochen werden, damit die Teilchen in die zweite Lösung übergehen können. Kommerzeille Quellen für Magneten, die für die Verwendung in beiden Arten von magnetischen Entfernungs- und Transfertechniken entwickelt wurden, die in oben allgemein beschrieben wurden, existieren. Siehe z. B. Magnesphere^® Technology Magnetic Separation Stand oder die PolyATract^®-Serie-9600^TM-Multi-Magnet, beide erhältlich von Promega Corporation; Magnetight Separation Stand (Novagen, Madison, WI); oder Danyl Magnetic Particle Concentrator (Dynal, Oslo, Norwegen).
In einem bevorzugten Aspekt der Verfahren der vorliegenden Erfindung wird der Komplex, der aus dem Medium im dritten Schritt entfernt wurde, zumindest einmal durch Spülen in einer Waschlösung gewaschen. Die Waschlösung in diesem bevorzugten zusätzlichen Schritt des Verfahrens umfasst bevorzugt eine Lösung, die imstande ist, Verunreinigungen von magnetischen Silica-Teilchen zu entfernen. Die Waschlösung umfasst bevorzugt ein Salz und ein Lösungsmittel, bevorzugt Alkohol. Die Konzentration des Alkohols in dieser letzten bevorzugten Form der Waschlösung ist bevorzugt 30 Vol.-%, besonders bevorzugt zumindest 40 Vol.-% und insbesondere bevorzugt zumindest 50 Vol.-%. Der Alkohol, der so verwendet wird, ist bevorzugt Ethanol oder Isopropanol, besonders bevorzugt Ethanol. Das Salz liegt bevorzugt in der Form eines Puffers vor, besonders bevorzugt in Form eines Acetatpuffers. Die Konzentration des Salzes in der Waschlösung ist ausreichend hoch, um zu gewährleisten, dass das Nucleinsäure-Material nicht während der (des) Waschschrittes) von den magnetischen Silica-Teilchen eluiert wird.
Der Komplex wird bevorzugt nach Entfernung aus dem Medium durch Resuspendieren des Komplexes in der Waschlösung gewaschen. Der Komplex wird bevorzugt nach dem ersten Waschen aus der Waschlösung entfernt und wird zumindest noch einmal gewaschen, besonders bevorzugt drei weitere Male unter Verwendung von frischen Waschlösungen für jeden Waschschritt gewaschen.
Viertens und letztens wird das Nucleinsäure-Material vom magnetischen Silica-Teilchen durch Aussetzen des Komplexes gegenüber einer Elutionslösung eluiert. Die Elutionslösung ist bevorzugt eine wässrige Lösung von geringer Ionenstärke, besonders bevorzugt Wasser oder ein Puffer mit geringer Ionenstärke bei etwa einem pH, bei dem das Nucleinsäure-Material stabil und weitgehend unversehrt bleibt. Jede wässrige Lösung mit geringer Ionenstärke bei oder unter einem TE-Puffer (d. h. 10 mM Tris-HCl, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), pH = 8,0) ist für die Verwendung in Elutionsschritten der vorliegenden Verfahren geeignet, aber die Elutionslösung ist auf einen pH zwischen etwa 6,5 und 8,5, besonders bevorzugt auf einen pH zwischen 7,0 und 8,0, gepuffert. TE-Puffer und destilliertes oder entionisiertes Wasser sind besonders bevorzugte Elutionslösungen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung. Die geringe Ionenstärke der bevorzugten Form der Elutionslösung, die oben beschrieben wurde, gewährleistet, dass das Nucleinsäure-Material vom Teilchen abgegeben wird. Andere Elutionslösungen, die für die Verwendung in den Verfahren dieser Erfindung geeignet sind, sind Fachleuten auf dem Gebiet klar.
Das Nucleinsäure-Material, das im Elutionsschritt des Verfahrens vom Komplex eluiert wird, wird bevorzugt durch äußere Kraft, wie z. B. Zentrifugation oder ein magnetisches Feld, besonders bevorzugt durch Zentrifugation, von den im Elutionsgemisch verbleibenden magnetischen Silica-Teilchen und -Komplexen getrennt. Zentrifugation wird bevorzugt, da es die Entfernung von Teilchen oder Teilchenfragmenten, die zu klein oder die nicht ausreichend magnetisch ansprechend sind, um durch die Verwendung eines magnetischen Feldes entfernt zu werden, zur Folge haben kann.
Das Nucleinsäure-Material, das unter Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung eluiert wurde, ist ohne weitere Isolierung für die Analyse oder weitere Verarbeitung durch molekularbiologische Verfahren geeignet. Die eluierte Nucleinsäure kann durch z. B. Sequenzieren, Restriktionsanalyse oder Nucleinsäure-Sonden-Hybridisierung analysiert werden. Daher können die Verfahren der Erfindung als Teil der Verfahren, die auf der Analyse von DNA oder RNA basieren, für u. a. die Diagnose von Krankheiten; Identifizierung von Pathogenen; Prüfen von Lebensmitteln, Kosmetika, Blut oder Blutprodukten oder anderen Produkten auf Verunreinigung mit Pathogenen; gerichtsmedizinische Untersuchungen; Vaterschaftstests; und Identifizierung des Geschlechts von Föten oder Embryonen angewendet werden.
Die eluierte DNA oder RNA, die durch das Verfahren der Erfindung bereitgestellt wird, kann durch beliebige unterschiedliche Exonucleasen und Endonucleasen prozessiert werden, die Reaktionen mit DNA bzw. RNA katalysieren, und – im Falle von DNA – durch Restriktionsenzyme, die an in der DNA vorhandenen Restriktionsstellen schneiden, verdaut werden. Restriktionsfragmente der eluierten DNA können an Vektoren gebunden und in geeignete Wirte zur Klonierung oder Expression transformiert werden. Segmente der eluierten DNA oder RNA können durch beliebige verschiedene Verfahren, die im Fachgebiet zum Amplifizieren von Zielnucleinsäuresegmenten bekannt sind, amplifiziert werden. Wenn die eluierte DNA eine Plasmid- oder eine andere Art einer autonom replizierenden DNA ist, kann sie in einen geeigneten Wirt zur Klonierung oder Expression von Genen auf der DNA transformiert werden, die im transformiertem Wirt exprimiert werden können. Es hat sich herausgestellt, dass Plasmid-DNAs, die durch Verfahren der vorliegenden Erfindung isoliert wurden, effizienter in eukaryotische Zellen transfiziert werden als solche, die durch Verfahren nach dem Stand der Technik isoliert wurden, worin Diatomeenerde statt des Silicagels in den Verfahren der Erfindung der vorliegenden Anmeldung eingesetzt wird.
Die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele führen verschiedene Ausführungsformen der Erfindung an. In Beispielen und andernorts in den Ausführungen und Ansprüchen verstehen sich Volumina und Konzentrationen als bei Raumtemperatur gemessen, sofern nicht anders angegeben. Nur die besonders bevorzugte Form der magnetischen Silica-Teilchen wurde in jedem der folgenden Beispiele eingesetzt, nämlich SOCM-Teilchen. Jedoch wird ein Fachmann auf dem Gebiet der vorliegenden Erfindung in der Lage sein, die Ausführungen der vorliegenden Offenbarung zu nutzen, um andere Formen der magnetischen Silica-Teilchen als SOCM-Teilchen, deren Verwendung in den Aspekten der Verfahren der vorliegenden Erfindung beschrieben wird, die in den folgenden Beispielen gezeigt wird, auszuwählen und zu verwenden.
Die gleiche Charge von SOCM-Teilchen wurde verwendet, um die in den Beispielen 1 und 6 weiter unten präsentierten Prüfresultate zu erhalten, während eine zweite Charge von SOCM-Teilchen verwendet wurde, um die in den Beispielen 2 bis 4 und 7 präsentierten Ergebnisse zu erhalten. Jedoch wurde gefunden, dass beide Chargen von SOCM-Teilchen annehmbare Ergebnisse lieferten, wenn sie wie unten beschrieben getestet wurden. Es wurde festgestellt, dass die erste Charge von SOCM-Teilchen, d. h. die Teilchen, die in den Beispielen 1 und 6 verwendet wurden, folgende physikalische Eigenschaften aufweisen: eine Oberfläche von 55 m²/g, ein Porenvolumen von 0,181 ml/g für Teilchen mit einem Durchmesser < 600 Å, eine mittlere Teilchengröße von 5,3 μm und einen Eisenaustritt von 2,8 ppm, wenn sie wie hierin zuvor beschrieben unter Verwendung von ICP untersucht wurden. Es wurde festgestellt, dass die andere Charge an SOCM-Teilchen, die in den nachstehenden Beispielen verwendet wurde, folgende Eigenschaften aufweist: eine Oberfläche von 49 m²/g, ein Porenvolumen von 0,160 ml/g (< 600 Å Durchmesser), ein Porenvolumen von 0,163 ml/g (> 600 Å Durchmesser), eine mittlere Teilchengröße von 5,5 μm und einen Eisenaustritt von 2,0 ppm.
Beispiel 1
Untersuchung der Bindungskapazität und Elutionseffizienz von magnetischen Silica-Teilchen für Plasmid-DNA
Die Bindungskapazität der SOCM-Form von magnetischen Silica-Teilchen und von magnetischen kontrolliert-porösen Glasteilchen (CPG) wurde durch Titrieren der zunehmenden Menge an Plasmid gegen eine gleichbleibende Menge an Teilchen in einem Endvolumen von 600 μl an Guanidinhydrochlorid (GHCl) bestimmt. Die verwendeten magnetischen CPG-Teilchen waren 5 μM magnetische Glasteilchen mit einer mittleren Porengröße von 500 Å, die von CPG Inc., N. J., USA, Bestellnummer MCPG0510 bezogen wurden.
Im vorliegenden Beispiel wurden 140 mg magnetisches Silica in 10 ml entionisiertem Wasser (DI H₂O) suspendiert und dann drei Mal mit 10 ml 5 M GHCl gewaschen, bevor, es bei einer Endkonzentration von 14 mg/ml in derselben Lösung suspendiert wurde. Ein Bindungsgemisch wurde durch Zugabe zunehmender Volumina an pGEM^®-3zf(+)-Plasmid-DNA von der Promega Corporation (Katalognummer P2271) in DI H₂O in einer Konzentration von 1,0 μg (μg) pro μl, entsprechend 5 μg, 10 μg, 20 μg, 40 μg, 60 μg und 80 μg DNA, zu 500 μl Teilchen erhalten, und es wurde durch Zugabe von DI H₂O auf ein Endvolumen von 600 μl gebracht. Das Plasmid/ Teilchen-Bindungsgemisch wurde dann für 2 bis 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Menge an Plasmid, die an das magnetische Silica gebunden ist, wurde durch Subtrahieren der Menge an Plasmid-DNA, die in der Lösung zurückbleibt, von der Gesamtmenge an Plasmid, das zu den Teilchen in jeder Probe gegeben wurde, wie folgt bestimmt. Die flüssige Fraktion des Untersuchungsgemisches wurde vom magnetischen Silica durch Zentrifugation bei 14.000facher Erdbeschleunigung für 20 Sekunden getrennt. Die Menge an Plasmid-DNA, die in der überstehenden Lösung verbleibt, wurde durch Beobachten des Absorptionsvermögen der Lösung bei 260 nm bestimmt. Eine Absorptionseinheit bei 260 nm entspricht einer Plasmid-DNA-Konzentration von 50 μg/ml.
Die magnetischen Silica-Teilchen, die im Bindungsgemisch verbleiben, wurden dann wie folgt vom Gemisch getrennt und gewaschen. Ein Magnet wurde außen am Behälter positioniert, um das Bindungsgemisch nahe an einer Seite des Behälters zu halten, wodurch die magnetischen Silica-Teilchen im Gemisch veranlasst wurden, sich an der Seite des Behälters, der am nähesten zum Magneten lag, abzusetzen. Der Magnet wurde dann in seiner Position an der Seite des Behälters belassen, während das Gemisch aus dem Behälter dekantiert wurde, wodurch im Wesentlichen alle magnetischen Silica-Teilchen im Behälter zurückgehalten wurden. Die zurückbleibenden magnetischen Silica-Teilchen wurden dann vier Mal mit 1 ml Waschlösung mit 80 mM KOAc und 10 μM EDTA, die 55% EtOH enthielt, gewaschen; der Magnet wurde von der Seite des Behälters während jedes Waschschritts entfernt und wieder an einer Seite des Behälters positioniert, um zu gewährleisten, dass die Teilchen im Behälter verbleiben, während die Waschlösung nach jedem Waschschritt dekantiert wird. Die nach dem letzten Waschschritt im Behälter verbleibendenTeilchen wurden für 3 bis 5 Minuten luftgetrocknet.
Schließlich wurde die Plasmid-DNA von den magnetischen Silica-Teilchen durch Zugabe von 1 ml DI Wasser bei Raumtemperatur eluiert. Die Teilchen wurden von der erhaltenen isolierten Plasmid-DNA-Lösung durch Zentrifugation entfernt. Die Menge der eluierten Plasmid-DNA wurde dann durch Messen des Absorptionsvermögens der Lösung bei 260 nm bestimmt.
Der Gesamtwirkungsgrad des Plasmid-Isolierprozesses wurde als Prozent der bei der abschließenden Elution gewonnenen DNA, bezogen auf die Menge an DNA, die mit dem Teilchen inkubiert wurde, bestimmt. Die Bindungskapazität wurde als jener Punkt bestimmt, an dem der Gesamtwirkungsgrad auf 90% abfiel.
Die Ergebnisse der Bindungsuntersuchungen, die oben beschrieben wurden, sind in 1 und zusammen mit Elutionsergebnissen in 3 dargestellt. Die Ergebnisse der DNA-Bindungskapazität, die mit magnetischem Silica (Δ) und magnetischen CPG (+) erhalten wurden, werden getrennt in 1 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass, wenn eine zunehmende Menge an Plasmid-DNA zu den magnetischen Silica-Teilchen gegeben wurde, die Teilchen ständig zunehmende Mengen an DNA banden, und zwar sogar 90 μg pro 130 μg an zugegebenem Plasmid. Die gesamte Bindungskapazität der magnetischen Silica-Teilchen betrug 8 μg Plasmid pro mg Teilchen. Dies ist signifikant höher als die Bindungskapazität der magnetischen CPG-Teilchen und zumindest vier Mal höher als die Bindungskapazität von 10 μM Silica-Kügelchen, die in Wizard^TM-Plus-Plasmid-DNA-Reinigungssystemen der Promega Corporation verwendet werden.
Die Ergebnisse der Elutionsuntersuchungen, die oben beschrieben wurden, sind in 2 und zusammen mit Elutionsergebnissen in 3 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass mehr als 90% der Plasmid-DNA, die an magnetische Silica-Teilchen in diesem Beispiel gebunden wurden, von den Teilchen eluiert wurden, während weniger als 60% der Plasmid-DNA, die an CPG-Teilchen gebunden waren, von diesen eluiert wurde.
Die Ergebnisse, die in den 1 bis 3 dargestellt werden, zeigen klar, dass magnetische Silica-Teilchen, die herin untersucht wurden, hervorragende Bindungs- und Elutionseigenschaften aufweisen.
Beispiel 2
Untersuchung der Bindungskapazität und Elutionseffizienz von magnetischen Silica-Teilchen für DNA-Fragmente
Gereinigte native λ-DNA von der Promega Corporation (Katalognummer D150) wurde mit Hind-III-Restriktionsenzym verdaut, einem Enzym, das native λ-DNA, in 8 Fragmente schneidet, die in der Größe von 23.000 bp bis 125 bp reichen. Diese Hind-III-verdaute λ-DNA wird im Folgenden als "λ-Hind-III-Verdau" bezeichnet.
Magnetisches Silica wurde wie vorher beschrieben hergestellt und in 5 M GHCl in einer Konzentration von 14 mg/ml resuspendiert. Ein ml der resuspendierten Teilchenlösung wurde mit 80 μl λ-Hind-III-Verdau (0,44 μg/μl) für 2 bis 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Menge an DNA, die an magnetisches Silica gebunden wurde, wurde durch Subtrahieren der DNA, die in Lösung verblieb, von der Gesamtmenge an DNA, die zu den Teilchen nach der Trennung der flüssigen und festen Phase zugegeben wurde, durch Zentrifugation bei 14.000facher Erdbeschleunigung für 20 Sekunden bestimmt. DNA-Konzentrationen wurden durch Messungen des Absorptionsvermögens bei 260 nm bestimmt. Eine Absorptionseinheit bei 260 nm entspricht einer DNA-Konzentration von 50 μg/ml.
Die magnetischen Silica-Teilchen, die im Bindungsgemisch verblieben, wurden dann wie folgt vom Gemisch getrennt und gewaschen. Ein Magnet wurde außen am Behälter positioniert, um das Bindungsgemisch nahe an einer Seite des Behälters zu halten, wodurch die magnetischen Silica-Teilchen im Gemisch veranlasst wurden, sich an der Seite des Behälters, die am nähesten zum Magneten lag, abzusetzen. Der Magnet wurde dann in seiner Position an der Seite des Behälters belassen, während das Gemisch aus dem Behälter dekantiert wurde, wodurch im Wesentlichen alle magnetischen Silica-Teilchen im Behälter zurückgehalten wurden. Die zurückbleibenden magnetischen Silica-Teilchen wurden dann vier Mal mit 1 ml Waschlösung aus 80 mM KOAc und 10 μM EDTA, die 55% EtOH enthielt, gewaschen; der Magnet wurde von der Seite des Behälters während jedes Waschschritts entfernt und wieder an einer Seite des Behälters positioniert, um zu gewährleisten, dass die Teilchen im Behälter verblüeben, während die Waschlösung nach jedem Waschschritt dekantiert wurde. Die nach dem letzten Waschschritt im Behälter verbliebenenTeilchen wurden für 3 bis 5 Minuten luftgetrocknet.
Schließlich wurde der λ-Hind-III-Verdau durch Zugabe von 200 μl DI Wasser bei Raumtemperatur eluiert. Die Teilchen wurden aus der erhaltenen isolierten λ-Verdau-Lösung durch Zentrifugation entfernt. Die Menge an λ-Hind-III-Verdau-DNA, die eluiert wurde, wurde dann durch Messen des Absorptionsvermögens der Lösung bei 260 nm bestimmt.
Ähnliche Bindungs- und Elutionsuntersuchungen an magnetischen Silica-Teilchen wurden unter der Verwendung von ϕX174-DNA, die mit Hae-III-Restriktionsenzym verdaut wurde, durchgeführt, einer Verdau-Reaktion, die 10 DNA-Fragmente erzeugt, die in der Größe von 1353 bp bis 72 bp reichen. Die Daten für diese Experimente sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1
Beispiel 3
Elektrophorese von DNA-Fragmenten nach der Elution von magnetischen Silica-Teilchen
Um zu bestimmen, ob magnetische Silica-Teilchen DNA-Fragmente von unterschiedlichem Molekulargewicht in unterschiedlichen Gewichten banden oder freisetzten, wurden die DNA-Fragmente, die in Beispiel 2 gebunden und von magnetischen Silica-Teilchen unter Verwendung von Elektrophorese eluiert wurden, wie folgt untersucht. Proben von λ-Hind-III-Verdau, die von zwei verschiedenen Proben an magnetischen Silica-Teilchen eluiert wurden, wurden auf ein Agarose-Gel aufgebracht und gemeinsam mit einer Kontrollprobe von unbehandeltem DNA-Verdau fraktioniert. Proben von gebundenem und eluiertem ϕX174-Hae-III-Verdau wurden ebenso auf einem Agarose-Gel gemeinsam mit einer Kontrollprobe von unbehandeltem DNA-Verdau fraktioniert. Die erhaltenen Gele der fraktionierten DNA wurden mit einem Fluoreszenzfarbstoff eingefärbt, der imstande war, DNA zu färben, und die gefärbten Gele wurden unter Verwendung eines "Molecular Dynamics Fluoroimager" analysiert. Die Intensität der Fluoreszenz der eluierten DNA-Fragmente von jedem der Restriktionsenzyme-Verdaue wurde mit Kontrollverdauen vor der Aufbringung und Elution von magnetischem Silica verglichen.
Die 4 und 5 zeigen ein visuelles Bild, das mit dem Fluorimeter vom fluoreszenzgefärbten Aarose-Gel der fraktionierten, aufgebrachten und eluierten DNA-Fragmente aufgenommen wurde, die wie oben beschrieben erhalten wurden. 4 zeigt 2 μg λ-Hind-III-Verdau, der auf einem 1% Agarose-Gel elektrophoresiert wurde. 5 zeigt 5 μg ϕX174-Hae-III-Verdau, elektrophoresiert auf einem 3% Agarose-Gel. In beiden Bildern ist Probe 1 die Kontrolle des unbehandelten DNA-Verdaus, während Probe 2 und 3 Proben von verdauter DNA sind, die gebunden und von zwei verschiedenen Proben von magnetischen Silica-Teilchen eluiert wurden.
Kein erheblicher Unterschied in der relativen Banden-Intensität oder im Hintergrund wurde zwischen Kontrolle und Proben von jedem Satz an verdauten Proben beobachtet, die hierin analysiert wurden, was zeigt, dass magnetische Silica-Teilchen, die hierin untersucht wurden, DNA-Fragmente nicht dem Molekulargewicht entsprechend selektiv binden oder abgeben.
Beispiel 4
Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterienkulturen unter Verwendung von magnetischen Silica-Teilchen und magnetischer Kraft
Einige der resuspendierten magnetischen Silica-Teilchen, die in Beispiel 1 hergestellt wurden, wurden verwendet, um pGME^®-3zf(+)-Plasmid-DNA aus einer Kultur von DN5α-E. coli-Bakterien zu isolieren, die mit beiden Formen von Plasmid-DNA transformiert wurden. Die folgenden Lösungen wurden im Isolierverfahren verwendet:
1. Zell-Resuspensionslösung:

50 mM Tris-HCl, pH = 7,5
10 mM EDTA
100 μg/ml DNase-freie Ribonuclease A (RNase A)

2. Säulenwaschlösung:

Hergestellt durch Anfertigen eines wässrigen Puffers bestehend aus entweder
200 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 7,5 oder
190 mM KOAc, 20 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 7,5
und durch Verdünnen des wässrigen Puffers 1 : 1,4 mit 95% Ethanol (EtOH)

3. TE-Puffer:

10 mM Tris-HCl, pH 7,5
1 mM EDTA

4. Neutralisierungslösung

1,32 M KOAc (Kaliumacetat), pH 4,8

5. Zell-Lyselösung

0,2 M NaOH
1% SDS (Natriumdodecylsulfat)

Die Bakterienkultur wurde durch folgende Schritte, die unten kurz beschrieben werden, behandelt, um ein geklärtes Lysat zu bekommen:

1. Die Zellen von 1 bis 3 ml Bakterienkultur wurden durch Zentrifugieren der Kultur für 1 bis 2 Minuten bei der höchsten Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge geerntet. Die geernteten Zellen wurden in 200 μl Zell-Resuspensionslösung resuspendiert und in ein Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. Die erhaltene Lösung der resuspendierten Zellen war trüb.
2. 200 μl Zell-Lyselösung wurden dann der Lösung der resuspendierten Zellen zugesetzt und durch Inversion vermischt, bis die Lösung relativ klar wurde, was anzeigte, dass die resuspendierten Zellen lysiert worden waren.
3. 200 μl Neutralisationslösung wurden dann der Lysatlösung zugesetzt und durch Inversion vermischt. Das Lysat wurde nach Zugabe der Neutralisationslösung trüb.
4. Die Lösung wurden dann in einer Mikrozentrifuge bei der höchsten Geschwindigkeit für 5 Minuten zentrifugiert, um das Lysat zu klären.
5. Der erhaltene Überstand des geklärten Lysats wurde in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen übertragen.

Plasmid-DNA wurde dann aus dem geklärten Lysat unter der Verwendung von magnetischen Silica-Teilchen isoliert, die in einer in Beispiel 1 hergestellten Lösung von Guanidinhydrochlorid suspendiert waren. Im Wesentlichen dasselbe Verfahren wurde zur Isolierung von Plasmid-DNA unter Verwendung von Teilchen und magnetischer Kraft verwendet, die in den in Beispiel 2 beschriebenen Plasmid-Bindungsuntersuchungen verwendet wurde. Jedoch wurde das vorliegende Isolierungsverfahren durch Zugabe von 1 ml der suspendierten magnetischen Silica-Teilchen zu dem in obigem Schritt 5 hergestellten geklärten Lysat und nicht durch Zugabe von 500 μl suspendierter Teilchen zu 5 bis 80 μg gereinigter Plasmid-DNA begonnen. Das Volumen jeder Lösung, die magnetischen Silica-Teilchen bei jedem nachfolgenden Schritt des folgenden vorliegenden Isolierungsverfahrens zugesetzt wurden, wurde proportional angepasst, um das größere Startvolumen zu berücksichtigen.
Die erhaltene isolierte Plasmid-DNA wurde qualitativ unter Verwendung von Gel-Elektrophorese und quantitativ unter Verwendung eines Spektralphotometers untersucht. Die Ergebnisse der Geluntersuchungen zeigten einen hohen Prozentsatz an intakter Supercoil-Plasmid-DNA in der Probe. Optische Dichtemessungen spiegelten die DNA-Ausbeute exakt wider, was sich anhand der Absorptions-Verhältnisse (260/250 nm und 260/280 nm) im erwarteten Bereich für DNA zeigt.
Beispiel 5
Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterienkulturen unter Verwendung von magnetischen Silica-Teilchen und Vakuumfiltration
Dasselbe Verfahren wird eingesetzt, um ein geklärtes Lysat einer Kultur von E. coli-Bakterien, die mit Plasmid-DNA transformiert wurden, zu erhalten, wie z. B. das geklärte Lysat-Herstellungsverfahren, das in Beispiel 4 angewandt wurde. Das Plasmid wird dann aus dem erhaltenen geklärten Lysat unter Verwendung einer Suspension von magnetischen Silica-Teilchen aus Beispiel 1 isoliert, jedoch unter Anwendung von Vakuumfiltration und nicht magnetischer Kraft, um die Teilchen vom Bindungsgemisch zu trennen, sobald die Plasmid-DNA einmal an den Teilchen anhaftet. Vakuumfiltration wird auch verwendet, um die Waschlösung von den Teilchen im Waschschritt des Isolierungsverfahrens zu entfernen.
Beispiel 6
Beschreibung der Bindung von RNA
Unter Verwendung magnetischen Silicas bei 14 mg/ml in 4 M Guanidinthiocyanat werden 700 μl resuspendierte magnetische Silica-Teilchen, die wie in Beispiel 1 hergestellt wurden, zu 30 μl Promega-RNA-Markern, Katalognummer 1550, markiert mit ³²P (ca. 200.000 cpm), und 5 μl einer 1 mg/ml Lösung von kalten (d. h. nichtmarkierten) Promega-RNA-Markern, Bestellnummer G3191, in einem Behälter zugesetzt.
Das erhaltene Gemisch wurde für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, nachher wurden die Teilchen unter Verwendung magnetischer Kraft eingefangen, um die Teilchen zu einer Seite des Behälters zu ziehen, während die überstehende Flüssigkeit in einen zweiten Behälter dekantiert wurde.
Der im zweiten Behälter gesammelte Überstand wurde aufbewahrt und gezählt.
Die eingefangenen Teilchen im ersten Behälter wurden dann drei Mal mit der Säulenwaschlösung gewaschen, die wie in Beispiel 4 oben beschrieben hergestellt worden war. Die Teilchen wurden nach jedem Waschschritt eingefangen, und die Waschlösung wurde dekantiert. Jede dekantierte Waschlösung wurde aufbewahrt und gezählt. Die Summe der Zählungen des Überstands und die ungültigen Waschzählungen wurde verwendet, um die Zahl der ungebundenen CPMs zu bestimmen.
Nach dem dritten Waschschritt wurde die RNA von den eingefangenen und gewaschenen Teilchen durch Resuspendieren der Teilchen in 250 μl Nanopure-Wasser, das auf 37°C erwärmt wurde, eluiert, und dann wurde magnetische Kraft verwendet, um die Teilchen an einer Seite des Behälters zu halten, während der Eluent abdekantiert und gesammelt wurde. 100 μl Eluent wurden dann gezählt.
Die übriggebliebenen Teilchen wurden in 500 μl Nanopure-Wasser resuspendiert und dann gezählt, um die Menge der nichteluierten CPMs zu bestimmen.
Die obere Analyse wurde doppelt ausgeführt. Die in 6 gezeigten Ergebnisse spiegeln die Zählungen wider, die für jeden Satz an Doppelansätzen und Zählungen gemittelt wurden, die in jedem Experiment gewonnen wurden. 6 zeigt, dass von 200.000 CPMs an RNA, die den magnetischen Silica-Teilchen in dieser Untersuchung ausgesetzt wurden, ein Mittelwert von 125.000 CPMs an die Teilchen gebunden wurde, und etwa 100.000 der CPMs, die an die Teilchen gebunden worden waren, wurden von den Teilchen im letzten Elutionsschritt freigesetzt und eluiert.
Diese Ergebnisse der RNA-Bindungs- und -elutionsuntersuchungen sind mit den Ergebnissen der DNA-Bindung und -elution vergleichbar, die in Beispiel 2 beschrieben wurden. Die vorliegende Untersuchung zeigt die mögliche Anwendung der magnetischen Silica-Teilchen gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung, um RNA zu isolieren.
Beispiel 7
Analyse des Auslaugens von Eisen aus magnetischen Silica-Teilchen
Magnetische Silica-Teilchen, wie z. B. die in den obigen Beispielen verwendeten, wurden durch Aufnahme eines Absorptionspeaks bei oder um 260 nm mittels Analyse von Lösungen, die den Partikeln ausgesetzt werden, mit einem Spektralphoto meter auf ihre Neigung gescreent, Eisen oder andere Materialien, die wahrscheinlich bei der quantitativen Analyse von Nucleinsäure-Materialien stören, auszulaugen.
Die magnetischen Silica-Teilchen wurden wie folgt analysiert. 140 mg magnetische Silica-Teilchen wurden in 10 ml DI Wasser resuspendiert und kurz gerührt. Die Teilchen wurden durch Platzieren eines Magneten an der Außenseite des Behälters, der das Teilchen/Wasser-Gemisch enthielt, für 1 Minute einem magnetischen Feld ausgesetzt. Teilchen im Gemisch, die an der Seite des Behälters gesammelt wurden, die dem Magneten am nähesten lag, wurden durch den Magneten an der Seite des Behälters gehalten, während die überstehende Flüssigkeit aus dem Behälter dekantiert wurde. Der Magnet wurden denn entfernt, und die Teilchen, die im Behälter zurückblieben, wurden in weiteren 10 ml DI Wasser resuspendiert. Die Sammel-, Dekantier- und Resuspendierungsschritte wurden drei Mal wiederholt.
Nach dem dritten solchen Schritt wurden die resuspendierten Teilchen nacheinander zwei Mal mit 10 ml 7 M Guanidinhydrochlorid, pH 5,9, zwei Mal mit 10 ml DI Wasser und zwei Mal mit 10 ml 50 mM EDTA (pH 8,0) gewaschen. Die Überstände aus jedem dieser Waschgänge wurden von 230 nm bis 300 nm unter Verwendung eines Hewlett-Dioden-Array-Spektralphotometers im Vergleich zu jeder der Kontrolllösungen als Blindprobe untersucht.
Bei keiner der durch Untersuchung der in den obigen Beispielen verwendeten magnetischen Silica-Teilchen erhaltenen Waschlösungen wurde bei 260 nm ein Absorptionsvermögen über dem Hintergrund beobachtet.

Claims

Verfahren zum Isolieren von biologischem Zielmaterial von anderem Material in einem Medium durch: a) Bereitstellung eines Mediums, welches das biologische Zielmaterial enthält; b) Bereitstellung magnetischer Kieselsäureteilchen, die fähig sind, das biologische Zielmaterial reversibel zu binden und Poren aufweisen, die von außerhalb der Teilchen zugänglich sind und ein mittels Stickstoff-BET gemessenes Gesamt-Porenvolumen von zumindest 0,2 ml/g Teilchenmasse aufweisen; c) Bildung eines Gemisches, welches das Medium und die magnetischen Kieselsäureteilchen umfasst; d) Bildung eines Komplexes aus den magnetischen Kieselsäureteilchen und dem biologischen Zielmaterial; e) Entfernung des Komplexes aus dem Medium durch Anlegen eines äußeren Magnetfelds; und f) Abtrennung des biologischen Zielmaterials vom Komplex durch Eluieren des biologischen Zielmaterials, wodurch das isolierte biologische Zielmaterial erhalten wird.
Verfahren zum Isolieren von biologischem Zielmaterial nach Anspruch 1, worin das nach dem Verfahren isolierte biologische Material aus einer Nucleinsäure besteht.
Verfahren zum Isolieren von biologischem Zielmaterial nach Anspruch 2, worin das isolierte biologische Nucleinsäure-Zielmaterial aus Plasmid-DNA-Material besteht.
Verfahren zum Isolieren von biologischem Zielmaterial nach Anspruch 2, worin das isolierte biologische Nucleinsäure-Zielmaterial aus DNA-Fragment-Material besteht.
Verfahren zum Isolieren von biologischem Zielmaterial nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die in Schritt (b) bereitgestellten magnetischen Kieselsäureteilchen fähig sind, zumindest 2 μg biologisches Zielmaterial pro Milligramm Teilchen zu binden.
Verfahren zum Isolieren von biologischem Zielmaterial nach Anspruch 5, worin die in Schritt (b) des Verfahrens bereitgestellten magnetischen Kieselsäureteilchen mit Siliziumoxid beschichtete magnetische Teilchen sind.
Verfahren zum Isolieren von biologischem Zielmaterial nach einem der Ansprüche 1 bis 6 worin das in Schritt (c) gebildete Gemisch das Medium, die magnetischen Kieselsäureteilchen und ein chaotropes Salz umfasst, worin die Konzentration des chaotropen Salzes ausreichend hoch ist, um die Bildung des Komplexes. aus magnetischen Kieselsäureteilchen und biologischem Material in Schritt (d) zu bewirken.
Verfahren zum Isolieren von biologischem Zielmaterial nach Anspruch 7, worin das chaotrope Salz in dem in Schritt (c) gebildeten Gemisch aus einem chaotropen Guanidiniumsalz, bestehend aus Guanidinhydrochlorid oder Guanidinthiocyanat, besteht.
Verfahren zum Isolieren von biologischem Zielmaterial nach Anspruch 7 oder 8, worin die Konzentration des chaotropen Salzes des in Schritt (c) gebildeten Gemisches zwischen 0,1 M und 7 M liegt.
Verfahren zum Isolieren von biologischem Zielmaterial nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin die Bildung des Komplexes aus den magnetischen Kieselsäureteilchen und dem biologischen Zielmaterial in Schritt (d) durch Inkubieren des Gemisches erreicht wird.
Verfahren zum Isolieren von biologischem Zielmaterial nach Anspruch 10, worin die Inkubation bei Raumtemperatur zumindest 30 s lang durchgeführt wird.
Verfahren zum Isolieren von biologischem Zielmaterial nach einem der Ansprüche 1 bis 11, weiters umfassend einen Schritt des Waschens der magnetischen Kieselsäureteilchen nach der Entfernung aus dem Medium, bevor das biologische Zielmaterial eluiert wird.
Verfahren zum Isolieren von biologischem Zielmaterial nach Anspruch 12, worin der Waschschritt unter Verwendung einer Waschlösung vorgenommen wird, die einen Alkohol und ein Salz umfasst.
Verfahren zum Isolieren von biologischem Zielmaterial nach Anspruch 13, worin der Waschschritt unter Verwendung einer Waschlösung erfolgt, die zumindest 30 Vol.-Alkohol und einen Puffer umfasst.
Verfahren zum Isolieren von biologischem Zielmaterial nach einem der Ansprüche 1 bis 14, worin in Schritt (f) zumindest 60% des biologischen Zielmaterials im Komplex eluiert werden.
Verfahren zum Isolieren von biologischem Zielmaterial nach einem der Ansprüche 1 bis 15, worin das in Schritt (f) aus dem Komplex eluierte biologische Zielmaterial nicht mehr als 50 ppm Übergangsmetall-Verunreinigungen enthält.
Verfahren zum Isolieren von biologischem Material nach einem der Ansprüche 1 bis 16, worin das biologische Zielmaterial in Schritt (f) unter Einsatz von Wasser oder einer Elutionslösung mit geringer Ionenstärke eluiert wird.
Set zum Isolieren von biologischem Zielmaterial aus einem Medium, wobei das Set Folgendes umfasst: (i) eine Allquote an mit Siliziumoxid beschichteten magnetischen Teilchen, die in einer wässrigen Lösung in einem ersten Behälter suspendiert sind, worin die Teilchen die Fähigkeit besitzen, zumindest 2 μg des biologischen Zielmaterials pro Milligramm Teilchen reversibel zu binden, Poren aufweisen, die von außerhalb der Teilchen zugänglich sind, und ein mittels Stickstoff-BET gemessenes Gesamtporenvolumen von zumindest 0,2 ml/g Teilchenmasse aufweisen; und (ii) eine Elutionslösung.
Set zum Isolieren von biologischem Zielmaterial nach Anspruch 18, weiters umfassend: ein chaotropes Salz in einem zweiten Behälter; und eine Waschlösung in einem dritten Behälter.