DE69822255T2

DE69822255T2 - Verfahren zum Vernetzen von Kollagenmaterial und daraus hergestellte Bioprothesenvorrichtungen

Info

Publication number: DE69822255T2
Application number: DE69822255T
Authority: DE
Inventors: Marc Hendriks; Michel Verhoeven; Patrick T. Cahalan; Mark W. San Juan Capistrano Torrianni; Benedicte Fouache; Linda Cahalan
Original assignee: Medtronic Inc
Current assignee: Medtronic Inc
Priority date: 1997-08-18
Filing date: 1998-08-18
Publication date: 2005-01-27
Anticipated expiration: 2018-08-19
Also published as: EP0897942B1; US6166184A; DE69822255D1; EP0897942A1

Description

Prothesenimplantate, die aus natürlichen oder synthetischen Materialien bestehen können, schließen z.B. Herzklappen, Gefäßtransplantate, Harnblasenprothesen und Sehnenprothesen ein. Bioprothesen (d.h. Prothesen, die von natürlichem Gewebe stammen) werden synthetischen oder mechanischen Prothesen typischerweise vorgezogen. Herzklappen aus natürlichem Gewebe z.B. werden mechanischen Herzklappen vorgezogen, da die Herzklappen aus Gewebe den natürlichen Blutfluss besser stimulieren als mechanische Herzklappen. Außerdem sind bei Verwendung von Herzklappen aus natürlichem Gewebe keine Blutkoagulantien notwendig.
Herzklappen-Prothesen aus Gewebe bestehen typischerweise entweder aus Aortenklappen von Schweinen oder Perikard von Rindern. Solche Herzklappen werden typischerweise durch Vorbehandlung des Gewebes mit Glutaraldehyd oder einem anderen Vernetzungsmittel, wie nachfolgend besprochen, und Annähen des Gewebes an einen biegsamen Stent aus einer Metalllegierung oder einem Polymer hergestellt. Solche tierischen Gewebe bestehen hauptsächlich aus Kollagen und Elastin. Diese Komponenten stellen Gewebe, insbesondere Herzklappen, mit der benötigten mechanischen Festigkeit und Biegsamkeit bereit.
Materialien auf Kollagenbasis, einschließlich ganzem bzw. vollständigem Gewebe, finden verstärkt bei der Herstellung biomedizinischer Vorrichtungen wie Prothesenimplantaten Anwendung. Dies gilt vor allem für Herzklappen. Kollagen ist ein natürlich vorkommendes Protein mit guter Biokompatibilität. Es ist die Hauptstrukturkomponente von Wirbeltieren und bildet extrazelluläre Fasern oder Netze in praktisch allen Körpergeweben wie Haut, Knochen, Knorpel und Blutgefäßen. Bei medizinischen Vorrichtungen stellt Kollagen eine physiologischere isotrope Umgebung bereit, die das Wachstum und die Funktion verschiedener Zelltypen erwiesenermaßen begünstigt und das rasche Überwachsen des Wirtsgewebes nach der Implantation vereinfacht.
Prinzipiell können basierend auf den Unterschieden bezüglich Reinheit und Integrität des zu Anfang in dem Material vorliegenden Kollagenfaserbündelnetzes drei Arten von Materialien auf Kollagenbasis identifiziert werden. Die erste Art schließt vollständiges Gewebe wie nicht-kollagene Substanzen oder Zellen ein. Als Ergebnis der Verwendung von ganzem Gewebe bleiben die natürlich bestehende Zusammensetzung und die native Festigkeit und Struktur des Kollagenfaserbündelnetzes erhalten. Xenotransplantate aus vollständigem Gewebe wurden bei der Entwicklung bzw. Herstellung von Herzklappenprothesen und auch Gefäßprothesen eingesetzt. Die Gegenwart löslicher Proteine, Glycoproteine, Glycosaminoglycane und Zellbestandteile in solchen Xenotransplantaten aus vollständigem Gewebe kann eine immunologische Antwort des Wirtsorganismus auf das Implantat induzieren.
Die zweite Art Material auf Kollagenbasis schließt nur die Kollagenmatrix ohne die nicht-kollagenen Substanzen ein. Die natürlich vorkommende Struktur des Kollagenfaserbündelnetzes wird so erhalten, die Antigenität des Materials jedoch reduziert. Die durch Entfernung der antigenen nicht kollagenen Substanzen erhaltenen Kollagenfasermaterialien haben im Allgemeinen geeignete mechanische Eigenschaften.
Die dritte Art Material auf Kollagenbasis sind gereinigte Kollagenfasern. Man erhält gereinigtes Kollagen, indem vollständiges Gewebe zunächst durch mechanische oder enzymatische Wirkung dispergiert oder angelöst wird. Die Kollagendispersion oder -lösung wird dann entweder durch Lufttrocknung, Lyophilisierung oder Ausfällung des Kollagens rekonstituiert. Auf diese Weise kann aus dem Kollagen eine Vielzahl geometrischer Formen wie Lagen, Schläuche, Schwämme oder Fasern gewonnen werden. Die entstandenen Materialien besitzen jedoch nicht die mechanische Festigkeit der natürlich vorkommenden Kollagenfaserstrukturen.
Ein Hauptproblem bei der Verwendung von Materialien auf Kollagenbasis und insbesondere von Xenotransplantaten aus vollständigem Gewebe, bei denen Spender und Empfänger phylogenetisch weit auseinander liegen, für Implantationen ist, dass diese Materialien für eine hyperakute Abstoßung anfällig sind. Dabei handelt es sich um eine rasche und starke Abstoßungsreaktion, die zur Zerstörung des Xenotransplantates führt. Die hyperakute Abstoßung scheint durch Komponenten der natürlichen Immunität, hauptsächlich natürliche Antikörper und Komplement ausgelöst zu werden.
Um Materialien auf Kollagenbasis bei der Herstellung medizinischer Vorrichtungen, insbesondere Bioprothesenimplantate, zu verwenden, muss ihre Haltbarkeit und in vivo-Leistung typischerweise verbessert werden. Dies kann durch Vernetzung des Materials erfolgen. Die Vernetzung der Materialien auf Kollagenbasis wird zur Unterdrückung der Antigenität des Materials verwendet, um die hyperakute Abstoßungsreaktion zu verhindern. Darüber hinaus erfolgt die Vernetzung zur Verbesserung der mechanischen Eigenschaften und zur Verstärkung der Zerfallsbeständigkeit.
Die Vernetzung kann mittels physikalischer Verfahren, z.B. UV-Bestrahlung und dehydrothermaler Vernetzung erfolgen. Diese Verfahren resultieren in einer direkten, jedoch allgemein wenig dichten Vernetzung. Es sind verschiedene chemische Vernetzungsverfahren für Materialien auf Kollagenbasis bekannt. Diese Verfahren beinhalten die Reaktion eines bifunktionellen Reagenz mit den Amingruppen von Lysin- oder Hydroxylysinresten an verschiedenen Polypeptidketten oder die Aktivierung von Carboxylgruppen von Glutaminsäure- und Asparaginsäureresten und die anschließende Reaktion mit einer Amingruppe einer anderen Polypeptidkette, so dass eine Aminbindung entsteht.
Verglichen mit anderen bekannten Verfahren liefert die Glutaraldehyd (GA)-Vernetzung von Kollagen Materialien mit dem höchsten Vernetzungsgrad. Es ist momentan das am häufigsten verwendete chemische Vernetzungsreagenz für Materialien auf Kollagenbasis. Glutaraldehyd ist ein aliphatisches Molekül aus fünf Kohlenstoffen mit einem Aldehyd an jedem Ende der Kette, wodurch es bifunktionell wird. Das Aldehyd kann mit den Aminogruppen an dem Kollagen chemisch in Wechselwirkung treten, so dass chemische Bindungen entstehen. Dieses Vernetzungsmittel ist leicht erhältlich, kostengünstig und bildet wässrige Lösungen, die Gewebe in relativ kurzer Zeit wirksam vernetzen können. Bei Einsatz der GA-Vernetzung können eine erhöhte Beständigkeit gegenüber biologischem Zerfall, eine reduzierte Antigenität und verbesserte mechanische Eigenschaften der Materialien auf Kollagenbasis erzielt werden. Trotz der verbesserten Wirtsakzeptanz hat sich herausgestellt, dass die Vernetzung von Materialien auf Kollagenbasis mittels GA sowohl in vitro als auch in vivo zytotoxische Eigenschaften besitzt. Die Vernetzung von Materialien auf Kollagenbasis mittels GA führt außerdem häufig zu einer Versteifung des Materials und zur Verkalkung.
Die Vernetzung kann auch mit Diisocyanaten durch Brückenbildung von Amingruppen an zwei aneinandergrenzenden Polypeptidketten erfolgen. Im ersten Schritt erfolgt eine Reaktion der Isocyanatgruppe mit einer (Hydroxy)lysinamingruppe, was zu Bildung einer Harnstoffbindung führt. Danach erfolgt eine Vernetzung durch Reaktion der zweiten Isocyanatgruppe mit einer anderen Amingruppe. Diisocyanate zeigen keine Kondensationsreaktionen wie bei der GA-Vernetzung beobachtet. Außerdem verbleiben keine Restreagenzien in dem Material. Ein Nachteil ist jedoch die Toxizität der Diisocyanate und die begrenzte Wasserlöslichkeit der meisten Diisocyanate.
Ein weiteres Vernetzungsverfahren beinhaltet die Bildung eines Acylazids. Das Acylazidverfahren beinhaltet die Aktivierung von Carboxylgruppen in der Polypeptidkette. Die aktivierten Gruppen bilden durch Reaktion mit Kollagenamingruppen einer anderen Kette Vernetzungen. Zunächst werden die Carboxylgruppen durch Reaktion mit einem Alkohol verestert. Dieser Ester wird dann durch Reaktion mit Hydrazin (H₂N–NH₂) in ein Hydrazid umgewandelt. Durch Reaktion mit einer sauren Lösung von Natriumnitrit werden Acylazidgruppen gebildet. Bei niedrigen Temperaturen und basischen pH-Werten reagiert die Acylazidgruppe mit einer primären Amingruppe, so dass Amidbindungen entstehen. Diese Mehrstufenreaktion führt zu guten Materialeigenschaften; es sind jedoch lange Reaktionszeiten (z.B. 7 Tage) notwendig. Alternativ wurde kürzlich ein Verfahren entwickelt, bei dem kein Veresterungsschritt oder die Verwendung von Hydrazin notwendig ist. Bei diesem Verfahren wird eine Carboxylgruppe durch Reaktion mit Diphenylphosphorylazid (DPPA) in einem einzigen Schritt in eine Acylazidgruppe verwandelt. Dadurch wird die Reaktionsgeschwindigkeit signifikant erhöht; die Reaktion erfolgt jedoch in einem organischen Lösungsmittel (z.B. DMF), was nicht wünschenswert ist.
Wasserlösliche Carbodiimide können ebenfalls zur Aktivierung der freien Carboxylgruppen von Glutaminsäure- und Asparaginsäureanteilen in Kollagen verwendet werden. Die Aktivierung der Carboxylgruppen mit Carbodiimiden wie 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid HCl (EDC) ergibt O-Acylisoharnstoffgruppen. Eine Kondensationsreaktion durch nucleophilen Angriff einer freien Amingruppe eines (Hydroxy)lysinrestes mit Harnstoff als austretender Gruppe führt zur Bildung einer Amidvernetzung. Der O-Acylisoharnstoff kann auch hydrolysiert oder in einen N-Acylharnstoff umgelagert werden, der sehr viel stabiler ist und keine Reaktion zur Bildung einer Vernetzung eingeht. Die Zugabe von N-Hydroxysuccinimid (NHS) verhindert diese Umlagerung jedoch. In Gegenwart von NHS kann der O-Acylisoharnstoff in eine NHS-aktivierte Carboxylgruppe umgewandelt werden, die zur Bildung einer Vernetzung ebenfalls mit einer freien Amingruppe reagieren kann. Die Zugabe von NHS erhöht die Reaktionsgeschwindigkeit. Die Vernetzung mit EDC und NHS liefert außerdem Kollagenmaterial mit einem hohen Vernetzungsgrad; sie führt jedoch auch zu einem Material mit geringer Zugfestigkeit.
Daher besteht nach wie vor der Bedarf nach Verfahren zur Vernetzung von Materialien auf Kollagenbasis.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Herstellung einer Bioprothesenvorrichtung (typischerweise eines Implantats oder einer implantierbaren Vorrichtung) bereit, das Material auf Kollagenbasis umfasst.
Die Verfahren beinhalten die Vernetzung des Materials auf Kollagenbasis. Signifikanterweise liefern die erfindungsgemäßen Verfahren ein Material mit einem im Allgemeinen hohen Vernetzungsgrad und einer im Allgemeinen großen Beständigkeit gegenüber enzymatischer Verdauung, während das Material ohne wesentliche Versteifung im Laufe der Zeit einen relativ hohen Biegsamkeitsgrad beibehält. Dieses Material ist außerdem vorzugsweise stark hydrophil, was, so wird vermutet, die Biokompatibilität des Materials erhöht. Die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich besonders für die Vernetzung kardiovaskulärer Bioprothesen wie Herzklappen und Gefäßtransplantaten.
Dementsprechend wird ein Verfahren zur Herstellung einer Bioprothesenvorrichtung aus einem Material auf Kollagenbasis mit Kollagenamingruppen und Kollagencarboxylgruppen bereitgestellt. Das Verfahren umfasst folgende Schritte: Blockierung bzw. Deaktivierung zumindest eines Teils der Kollagenamingruppen durch ein Blockierungs- bzw. Deaktivierungsmittel; Aktivierung zumindest eines Teils der Kollagencarboxylgruppen nach der Deaktivierung zumindest eines Teils der Kollagenamingruppen zur Bildung aktivierter Carboxylgruppen, und In-Kontakt-bringen der aktivierten Kollagencarboxylgruppen mit einem polyfunktionellen Spacer (vorzugsweise einem bifunktionellen Spacer) zur Vernetzung des Materials auf Kollagenbasis.
Ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren schließt außerdem ein Verfahren zur Vernetzung eines Materials auf Kollagenbasis ein, das Kollagenamingruppen und Kollagencarboxylgruppen umfasst. Das Verfahren umfasst folgende Schritte: Deaktivierung zumindest eines Teils der Kollagenamingruppen mit einem Deaktivierungsmittel zur Bildung deaktivierter Amingruppen, In-Kontakt-bringen des Materials auf Kollagenbasis mit den deaktivierten Amingruppen mit einem polyfunktionellen Spacer (vorzugsweise einem bifunktionellen Spacer) über einen Zeitraum, der ausreicht, dass der Spacer das Material auf Kollagenbasis durchdringt, und Aktivierung zumindest eines Teils der Kollagencarboxylgruppen des Materials auf Kollagenbasis gegenüber dem polyfunktionellen Spacer zur Vernetzung des Materials auf Kollagenbasis.
Bioprothesenvorrichtungen, die ein erfindungsgemäß hergestelltes vernetztes Material auf Kollagenbasis umfassen, stellen weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung dar.
Das Deaktivierungsmittel ist vorzugsweise aus der Gruppe eines Acylierungsmittels, eines Aminierungsmittels und eines biologisch aktiven Derivates davon ausgewählt. Sofern es für eine verbesserte Stabilität notwendig ist, umfasst der Deaktivierungsschritt die Reaktion der Kollagenamingruppen mit einem Aminierungsmittel in Gegenwart eines Reduktionsmittels. Signifikanterweise schließt das erfindungsgemäße Verfahren die Deaktivierung von mindestens 75% der Kollagenamingruppen ein. Wie hierin verwendet, sind die Kollagenamingruppen diejenigen, die ursprünglich in dem Material auf Kollagenbasis vorliegen.
Der Aktivierungsschritt umfasst vorzugsweise das In-Kontaktbringen der freien Kollagencarboxylgruppen mit einem Aktivierungsmittel, das aus der Gruppe von Carbodiimid, einem Azid, 1,1'-Carbonyldiimidazol, N,N'-Disuccinimidylcarbonat, 2-Ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydrochinolin, 1,2-Benzisoxazol-3-yl-diphenylphosphat, N-Ethyl-5-phenylisoxazolium-s'-sulfonat und Mischungen davon ausgewählt ist. Ein besonders bevorzugtes Aktivierungsmittel ist das teilweise wasserlösliche Carbodiimid 1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimid HCl. Zur Verbesserung der Stabilität der reaktiven Zwischenverbindung umfasst der Aktivierungsschritt, besonders wenn das Aktivierungsmittel ein Carbodiimid ist, vorzugsweise die Umsetzung der Kollagencarboxylgruppen mit einem Aktivierungsmittel in Gegenwart eines Stabilisators wie N-Hydroxysuccinimid.
Der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete polyfunktionelle Spacer ist vorzugsweise bifunktionell und hydrophil. Ein besonders bevorzugter Spacer ist ein hydrophiler Diaminspacer. Eine bevorzugte Klasse solcher Spacer ist aus der Gruppe von Polyethylenglycolspacern, Polypropylenglycolspacern, Polyethylenpropylenglycolspacern und Mischungen davon ausgewählt. Solche Spacer werden vorzugsweise durch die folgende allgemeine Formel: H2N–CH (CH3)–CH2–[OCH2CH (CH3)]X–[OCH2CH2]y–[OCH2CH(CH3]Z–NH2 repräsentiert, in der x + z = 0–70 und y = 0–90.
Die Erfindung wird weiterhin mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben:
1. Schrumpftemperatur
und Anteil freier Amingruppen
on Kollagen, das mittels EDC/NHS und JEFFAMINE^®-Spacern eines unterschiedlichen Molekulargewichts vernetzt wurde (RT, t = 24 Stunden; 0,25M MES; pH = 5,0; Molverhältnis Spacer:COOH = 1:1; Molverhältnis EDC:NHS:COOH = 5:2:1; Reaktionsvolumen = 250 ml/g).
2. Schrumpftemperatur
und Anteil freier Amingruppen
von Kollagen, das mittels EDC/NHS und JEFFAMINE^® D230 vernetzt wurde, als Funktion des Molverhältnisses Spacer:COOH (RT, t = 24 Stunden; 0,25M MES; pH = 5,0; Molverhältnis EDC:NHS:COOH = 5:2:1; Reaktionsvolumen = 500 ml/g).
3. Schrumpftemperatur
und Anteil freier Amingruppen
von Kollagen, das mittels EDC/NHS und JEFFAMINE^® D230 vernetzt wurde, als Funktion der Reaktionszeit (RT; 0,25M MES; pH = 5,0; Molverhältnis Spacer:COOH = 1:1; Molverhältnis EDC:NHS: COOH = 5:2:1; Reaktionsvolumen = 20 ml/g).
4. Schrumpftemperatur
und Anteil freier Amingruppen
von Kollagen, das mittels EDC/NHS und JEFFAMINE^® D230 vernetzt wurde, als Funktion der JEFFAMINE^© D230-Konzentration (RT; t = 2,5 Stunden; 0,25M MES; pH = 5,0; Molverhältnis Spacer:COOH = 1:1; Molverhältnis EDC:NHS: COOH = 5:2:1).
5. Pronaseverdauung verschiedener Kollagenscheiben (d = 10 mm), die nach der Deaktivierung unterschiedlich vernetzt wurden; nicht vernetztes und deaktiviertes Kollagen wurde innerhalb einer Stunde verdaut (0,1 M Tris-HCl (pH = 7,4), 5 mM CaCl₂, 0,05 mg/ml NaN₃, 25 U/ml Pronase; 37° C; Pronaseaktivität = 4,5 U/mg).
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer Bioprothesenvorrichtung bereit, die ganz oder teilweise von natürlichen Geweben, die Materialien auf Kollagenbasis enthalten, stammt bzw. abgeleitet ist. Solche Bioprothesenvorrichtungen schließen z.B. Herzklappen oder andere Teile des Herzens, Gefäßersatz oder -transplantate, Harntrakt- und Blasenersatz, Darm- und Geweberesektionen und Sehnenersatz ein. Solche Materialien auf Kollagenbasis schließen ganzes Gewebe (d.h. Gewebe, das kollagene und nicht-kollagene Substanzen oder Zellen enthält), nur die Kollagenmatrix ohne die nicht-kollagenen Substanzen und gereinigte Kollagenfasern ein. Typischerweise wird bei der Herstellung von Bioprothesenimplantaten jedoch vorzugsweise ganzes Gewebe verwendet.
Die vorliegende Erfindung stellt spezifisch Verfahren zur Herstellung einer Bioprothesenvorrichtung aus einem Material auf Kollagenbasis, wie z.B. Herzklappen, durch Vernetzung des Materials auf Kollagenbasis mit einem polyfunktionellen Spacer (vorzugsweise einem bifunktionellen Spacer) bereit. Noch spezifischer beinhalten diese Verfahren zunächst die Blockierung bzw. Deaktivierung zumindest eines Teils (und vorzugsweise des Großteils) der freien Kollagenamingruppen mit einem oder mehreren Deaktivierungsmitteln, die darauf folgende Aktivierung zumindest eines Teils (und vorzugsweise des Großteils) der Kollagencarboxylgruppen mit einem oder mehreren Aktivierungsmitteln sowie dann das In-Kontaktbringen der aktivierten Kollagencarboxylgruppen mit einem oder mehreren polyfunktionellen Spacern (vorzugsweise bifunktionellen Spacern) zur Vernetzung des Materials auf Kollagenbasis. Auf diese Weise sind im Allgemeinen nur die Carboxylgruppen und wenn überhaupt nur wenige der Amingruppen des Materials auf Kollagenbasis an der Vernetzung beteiligt. Dies bedeutet signifikante Vorteile, wie sie nachfolgend genauer diskutiert werden.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren können die freien Amingruppen der Materialien auf Kollagenbasis (hierin häufig einfach als „Kollagen" bezeichnet) durch verschiedene Arten chemischer Reagenzien deaktiviert werden. Die vier wichtigsten Reaktionsarten, durch die eine Deaktivierung der freien Amine erreicht werden kann, sind: (1) Acylierungsreaktion, (2) Aminierungsreaktion, vorzugsweise mittels einer reduktiven Aminierung unter Verwendung von Aldehyden oder Ketonen, (3) Aminierungsreaktion unter Verwendung von Epoxiden und (4) Aminierungsreaktion mit Sulphonyl- oder Sulfonsäurederivaten. Vorzugsweise werden kleine Deaktivierungsmittel, d.h. solche einer Länge von zwei bis sechs Kohlenstoffatomen, verwendet, um eine signifikante Unterbrechung der nativen Dreifachhelixstruktur des Kollagens zu verhindern. Zwar sind solche Reaktionen, die die Verwendung der kleinen Deaktivierungsmittel beinhalten, bevorzugt, doch es können auch biologisch aktive Verbindungen zur Deaktivierung der freien Amingruppen verwendet werden.
Es gibt zahlreiche Acylierungsmittel zur Verwendung bei der Deaktivierung der Amingruppen mittels einer Acylierungsreaktion. Besonders wichtig sind Isocyanate, Isothiocyanate, Säurehalide, Säureanhydride, aktivierte Ester (d.h. Ester mit einer guten austretenden Gruppe, die bei Reaktion mit einem Amin leicht freigesetzt wird) wie N-Hydroxysuccinimidester und Imidoester. Die Ester- und Imidoesterreagenzien sind die bevorzugtesten. Viele Ester sind leicht erhältlich, relativ leicht herzustellen und stabile, im Vergleich zu dem entsprechenden Acylhalid oder- anhydrid.
Imidoester sind für Aminogruppen spezifisch. Unter leicht alkalischen Bedingungen reagieren sie mit Aminen zu Imidoaminen; die Produkte tragen bei einem physiologischen pH-Wert eine positive Ladung. Bei der Amidierung bleibt daher die Nettoladung des Proteins erhalten, was die Wirkung der Ladung auf die Proteinkonformation minimiert. Isocyanate und Isothiocyanate reagieren mit Aminogruppen, aber auch mit Sulfhydryl-, Imidazolyl-, Tyrosyl- und Carboxylgruppen von Proteinen. Zwar liefern nur Aminogruppen stabile Produkte, doch diese Acylierungsmittel sind weniger spezifisch als aktivierte Ester oder Imidoester.
Bevorzugte Acylierungsmittel schließen N-Hydroxysuccinimidester (NHS) wie Essigsäure-Nhydroxysuccinimidester, Sulfo-NHS-acetat und Propionsäure-Nhydroxysuccinimidester, p-Nitrophenylester wie p-Nitrophenylformat, p-Nitrophenylacetat und p-Nitrophenylbutyrat, 1-Acetylimidazol und Citraconsäureanhydrid (reversibles Deaktivierungsmittel) ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Es gibt zahlreiche Aminierungsmittel (z.B. Alkylierungsmittel) zur Verwendung bei der Deaktivierung der Amingruppen mittels Aminierungsreaktion. Besonders bevorzugt sind Aldehyde und Ketone. Die Reaktion eines freien Amins mit einem Aldehyd oder Keton liefert ein Imin (oder eine Schiff-Base), die recht stabil ist (besonders wenn eine Arylgruppe vorliegt). Falls notwendig, kann das gebildete Imin jedoch durch Reduktion mit Reduktionsmitteln wie Natriumcyanoborhydrid, Natriumborhydrid oder Borreagenzien wie Dimethylaminboran, Trimethylaminboran oder Morpholinboran weiter stabilisiert werden.
Aldehyde sind bevorzugte Aminierungsmittel, da Ketone im Allgemeinen langsamer reagieren und häufig höhere Temperaturen und längere Reaktionszeiten erfordern. Es kann eine große Vielzahl von Aldehyden verwendet werden. Vorzugsweise handelt es sich bei den Aldehyden um monofunktionelle Aldehyde, um eine unerwünschte Vernetzung zu vermeiden. Beispiele für monofunktionelle Aldehyde schließen Propanal, Butanal und Hexanal (Caproaldehyd) ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Bei Verwendung eines Aminierungsmittels handelt es sich bei der gebildeten Struktur um ein sekundäres Amin, das theoretisch mit aktivierten Carboxylen reagieren könnte. Es hat sich jedoch überraschenderweise herausgestellt, dass diese sekundären Amingruppen ausreichend sterisch behindert sind, damit unter typischen Reaktionsbedingungen keine Vernetzung erfolgt.
Epoxide können ebenfalls als Aminierungsmittel zur Deaktivierung der Amingruppen verwendet werden. Ein Epoxid bildet ebenfalls ein sekundäres Amin; es ist jedoch zu erwarten, dass auch solche Gruppen sterisch ausreichend behindert sind, damit unter typischen Reaktionsbedingungen keine Vernetzung erfolgt. Das Epoxid ist vorzugsweise ein monofunktionelles Epoxid. Geeignete Epoxide schließen z.B. Isopropylglycidylether und n-Butylglycidylether ein. Die Verwendung eines Epoxids als Deaktivierungsmittel ist weniger wünschenswert, da die Reaktion häufig langsam und weniger wirksam ist.
Sulphonyl- oder Sulfonsäurederivate sind eine weitere Gruppe von Aminierungsmitteln, die zur Deaktivierung freier Amingruppen eingesetzt werden können. Vorzugsweise ist das Sulphonyl- oder Sulfonsäurederivat monofunktionell. Ein beispielhaftes Reagenz ist beispielsweise 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure.
Eine große Vielzahl biologisch aktiver Derivate solcher Verbindungen (d.h. diejenigen, die eine geeignete reaktive Komponente wie z.B. Ester, Aldehyde oder Ketone enthalten) kann ebenfalls zur Deaktivierung der freien Amingruppen verwendet werden. Als Ergebnis können wünschenswerte biologische Funktionen in der Kollagenmatrix vorliegen, die die Biokompatibilität und die Gesamtleistung verbessern können. Ein Beispiel ist das aldehydfunktionelle Heparin, das entweder durch Periodatoxidation (Periodat-Heparin) oder Zerfall salpetriger Säure (NAD-Heparin) gewonnen wird.
Die erfindungsgemäßen Verfahren schließen vorzugsweise die Deaktivierung der freien Amingruppen mittels einer Acylierungsreaktion oder einer Aminierungsreaktion ein. Noch bevorzugter erfolgt die Deaktivierung der freien Kollagenamingruppen unter Berücksichtigung der Problemlosigkeit der Handhabung und der Deaktivierungswirksamkeit durch Einsatz aktivierter Ester wie Essigsäure-N-hydroxysuccinimid (HAc-NHS) (für die Acylierung) oder kurzkettiger aliphatischer monofunktioneller Aldehyde wie Propanal oder Butanal (für die Aminierung, z.B. Alkylierung).
Signifikanterweise sind die Acylierungsmittel besonders bevorzugt, da sie einen Großteil der freien Amingruppen ohne wesentliche Verdrehung der Dreifachhelixkonfiguration des Kollagens deaktivieren können. Dies ist ein wichtiges Auswahlkriterium für die Auswahl des Deaktivierungsmittels und lässt sich relativ leicht bestimmen. Zur Bestimmung des Ausmaßes, in dem die Deaktivierung die native Dreifachhelixkonfiguration des Kollagens unterbrochen hat, kann z.B. die Kalorimetrie verwendet werden. Die Unterbrechung der Dreifachhelix ist durch einen Rückgang des Einsetzens der Kollagendenaturierungstemperatur gekennzeichnet.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren kann ein Gemisch der oben genannten Deaktivierungsmittel verwendet werden. Das Deaktivierungsmittel (oder Deaktivierungsmittelgemisch) wird in einer Menge eingesetzt, die wirksam ist, um zumindest einen Teil, vorzugsweise den Großteil (d.h. mehr als etwa 50%) der freien Amingruppen zu deaktivieren. Noch bevorzugter wird/werden das/die Deaktivierungsmittel in einer relativ zu der Anzahl der freien Amingruppen signifikant überschüssigen Molmenge verwendet.
Die Deaktivierungsreaktion erfolgt vorzugsweise in einer wässrigen Lösung und noch bevorzugter in einer wässrigen Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6 bis 7. Die Temperatur dieser Reaktion sollte unterhalb der Temperatur liegen, bei der das Material auf Kollagenbasis denaturiert. Daher erfolgt die Reaktion vorzugsweise bei Raumtemperatur (d.h. 20–25° C) und noch bevorzugter bei etwa 21° C, obwohl erhöhte Temperaturen die Reaktionsgeschwindigkeit erhöhen.
Solche Deaktivierungsmittel können vorzugsweise mindestens 75%, vorzugsweise 80% und am bevorzugtesten etwa 90% der freien Kollagenamingruppen deaktivieren. Eine solche Deaktivierung oder Blockierung der freien Kollagenamingruppen reduziert die Bildung von Nulllängenvernetzungen, d.h. die Reaktion aktivierter Carboxylgruppen mit freien Kollagenamingruppen. Dies ist vorteilhaft, da eine große Anzahl von Nulllängenvernetzungen Kollagenmaterialien steif und spröde macht, was den gewünschten mechanischen Eigenschaften einer Bioprothesenvorrichtung entgegensteht.
Typischerweise ist die relativ kleine Anzahl der nicht deaktivierten freien Amingruppen aufgrund der sterischen Behinderung nicht leicht zugänglich und wäre daher nicht in der Lage, an der Nulllängenvernetzung teilzunehmen. Ein weiterer günstiger Aspekt ist die Tatsache, dass man glaubt, dass die Deaktivierung der Amingruppen eine Verbesserung der Biokompatibilität des Materials auf Kollagenbasis bedeutet, da es Hinweise darauf gibt, dass die freien Amingruppen an der Immunreaktion beteiligt sind.
Sobald die freien Kollagenamingruppen ausreichend deaktiviert sind, können die freien Kollagencarboxylgruppen vernetzt werden. Dies erfolgt zunächst durch Aktivierung der Carboxylgruppen. Dies erfolgt vorzugsweise durch anfängliches In-Kontakt-bringen des Materials auf Kollagenbasis mit dem Vernetzungsmittel (d.h. dem Spacer), das Zulassen des Eindringens in das Material auf Kollagenbasis und die anschließende Aktivierung der Carboxylgruppen, die eine Wechselwirkung mit dem Vernetzungsmittel erlaubt.
Die freien Carboxylgruppen können nach einer Vielzahl von Verfahren aktiviert werden. Carbodiimidreagenzien sind bekannte Aktivierungsmittel und werden herkömmlicherweise am häufigsten verwendet. Die Reaktion zwischen einer Carboxylgruppe und einem Carbodiimid liefert die reaktive Zwischenverbindung O-Acylisoharnstoff. Diese Zwischenverbindung ist für einen nukleophilen Angriff in einem nachfolgenden Schritt anfällig. Darüber hinaus kann eine intramolekulare Umlagerungsreaktion erfolgen, bei der sich der O-Acylisoharnstoff in den sehr viel stabileren und sehr viel weniger reaktiven N-Acylharnstoff umlagert. Unter typischen Reaktionsbedingungen liegt die Halbwertszeit des O-Acylisoharnstoffs im Bereich von Sekunden bis Minuten.
Dieser reaktive O-Acylisoharnstoff kann durch Einsatz eines Succinimids oder anderer Stabilisatoren stabilisiert werden. Die Verwendung eines Stabilisators zusätzlich zu dem Aktivierungsmittel kann die Halbwertszeit des O-Acylisoharnstoffes unter typischen Reaktionsbedingungen auf 30–40 Minuten erhöhen. Signifikanterweise wird auch die intramolekulare Umlagerungsreaktion unterdrückt. Typischerweise können auch diese Stabilisatoren selbst die Carboxylgruppen aktivieren, wenn auch sehr viel weniger wirksam als in Kombination mit Carbodiimiden.
Beispiele für andere Aktivierungsmittel als Carbodiimid schließen diejenigen ein, die typischerweise bei der Peptidsynthese verwendet werden, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Beispiele schließen 1,1'-Carbonyldiimidazol (CDI), N,N'-Disuccinimidylcarbonat (DSC), 2-Ethoxy-1ethoxycarbonyl-1,2-dihydrochinolin (EEDQ), 1,2-Benzisoxazol-3-yl-diphenylphosphat (BDP) und N-Ethyl-5-phenylisoxazoliums'-sulfonat (Woodwards-Reagenz K) ein. Solche Aktivierungsmittel sind zumindest teilweise in Wasser löslich. Zwar können Aktivierungsmittel, die nicht zumindest teilweise wasserlöslich sind, wie beispielsweise Azide (z.B. Diphenylphosphorylazid, offenbart in dem US-Patent Nr. 5,264,551 (Petite et al.)) bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, doch sie sind nicht sonderlich wünschenswert. Es können Mischungen der Aktivierungsmittel verwendet werden.
Vorzugsweise werden die freien Kollagencarboxylgruppen durch das In-Kontakt-bringen mit einem Carbodiimid, das zumindest teilweise in Wasser löslich ist, aktiviert. Ein besonders bevorzugtes wasserlösliches Carbodiimid, das sich für die erfindungsgemäße Verwendung eignet, ist 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid HCl (EDC). Andere geeignete Carbodiimide schließen z.B. Cyanamid und N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), N,N'-Diisopropylcarbodiimid (DIC) und 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimidmetho-p-toluolsulfonat (CMC) ein.
Wie zuvor angegeben, bilden sich bei Verwendung eines Carbodiimids zur Aktivierung der Carboxylgruppen O-Acylisoharnstoffgruppen, die sich in weniger reaktive N-Acylharnstoffgruppen umlagern können. Die Zugabe von N-Hydroxysuccinimid (NHS) mindert bekannterweise diese Umlagerungstendenz. Andere Stabilisatoren wie N-Hydroxybenzotriazol (HOBt), N-Hydroxy-5-norbornen-endo-2,3-dicarboximid (HONB), 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) und das Sulfoderivat von N-Hydroxysuccinimid sind ebenfalls in der Lage dies zu erreichen. Es können auch Mischungen solcher Stabilisatoren verwendet werden. Bei besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren werden die Kollagencarboxylgruppen mit Hilfe einer Mischung aus Carbodiimid (vorzugsweise EDC) und NHS aktiviert.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren können verschieden Mischungen der obigen Aktivierungsmittel und wahlweise Stabilisatoren verwendet werden. Das oder die Aktivierungsmittel wird/werden in Mengen eingesetzt, die wirksam sind, zumindest einen Teil und vorzugsweise den Großteil (d.h. mehr als 50%) der freien Kollagencarboxylgruppen zu aktivieren. Noch bevorzugter wird/werden das/die Aktivierungsmittel in einer relativ zu der Anzahl der freien Kollagencarboxylgruppen überschüssigen Molmenge verwendet. Der oder die Stabilisator (en) wird/werden in einer Menge verwendet, die wirksam ist, um den Großteil der aktivierten Carboxylgruppen zu stabilisieren. Vorzugsweise wird/werden der/die Stabilisator en) in einer Menge verwendet, die mindestens einem Niveau entspricht, das der Anzahl der freien Kollagencarboxylgruppen gleicht. Noch bevorzugter wird/werden der/die Stabilisator en) in einer relativ zu der Anzahl der freien Kollagencarboxylgruppen überschüssigen, vorzugsweise jedoch die Molkonzentration des/der Aktivierungsmittel(s) nicht übersteigenden Molmenge verwendet.
Die Aktivierungsreaktion erfolgt vorzugsweise in einer wässrigen Lösung, noch bevorzugter in einer wässrigen Pufferlösung mit einem pH-Wert von 4 bis 9 (vorzugsweise 5 bis 7 und am bevorzugtesten 5 bis 6). Die Temperatur dieser Reaktion sollte unterhalb der Temperatur liegen, bei der das Material auf Kollagenbasis denaturiert. Daher erfolgt die Reaktion vorzugsweise bei Raumtemperatur und noch bevorzugter bei etwa 21° C, obwohl erhöhte Temperaturen die Reaktionsgeschwindigkeit erhöhen.
Anschließend werden die aktivierten Carboxylgruppen zur Vernetzung des Materials auf Kollagenbasis mit einem polyfunktionellen Spacer (vorzugsweise einem bifunktionellen Spacer) umgesetzt. Man glaubt, dass der Einbau von Spacern die Bildung von Vernetzungen erlaubt, die nicht nur den Abstand zwischen zwei aneinander grenzenden Kollagenfasern oder -faserbündeln überbrücken, sondern der gesamten Matrix auch zusätzliche Biegsamkeit verleihen. Der bifunktionelle Spacer ist vorzugsweise ein Diaminspacer, auch wenn andere bifunktionelle Spacer wie Diepoxide und Diester verwendet werden können. Noch bevorzugter ist der bifunktionelle Spacer ein stark hydrophiler Diaminspacer, der in wässrigen Lösungen löslich ist, wobei sich die reaktiven Komponenten vorzugsweise an den jeweiligen Enden der längsten Molekülkette befinden. Die Spacer können geradkettige oder verzweigtkettige geeignet substituierte Verbindungen sein. Weitere Substitutionen in der Kette sollten den Vernetzungsprozess nicht stören und/oder die Löslichkeit der Spacer in wässrigen Lösungen nicht reduzieren. Man glaubt, dass die Hydrophilie des Spacers vorteilhaft ist, da sie eine Infiltrierung und Diffusion von Gewebeflüssigkeit durch die Bioprothesenmatrix bewirken kann.
Geeignete hydrophile Diaminspacer schließen z.B. die Diaminderivate von Polyethylenglycol- und Polypropylenglycololigomeren und -polymeren sowie Polyethylenpolypropylenglycol-Copolymeren wie z.B. O,O'-Bis(3-aminopropyl)diethylenglycol, O,O'-Bis(2-aminopropyl)polypropylenglycol und O,O'-Bis(2-aminopropyl)polyethylenglycol ein. Weiterhin sind aliphatische Diamine mit einer Länge von zwei bis acht Kohlenstoffatomen geeignete Spacer. Dazu gehören Verbindungen mit Substitutionen in der Kohlenstoffkette, z.B. 1,4-Diaminobutan, 1,6-Diaminohexan und 1,5-Diamino-2-methylpentan.
Eine bevorzugte Klasse hydrophiler Diaminspacer schließt Polyethylenglycolspacer, Polypropylenglycolspacer und Polyethylenpropylenglycolspacer ein, die durch die folgende allgemeine Formel repräsentiert werden: H2N–CH(CH3)–CH2–[OCH2CH (CH3)]X–[OCH2CH2]y–[OCH2CH (CH3]Z–NH2 worin x + z = 0–70 und y = 0–90, vorzugsweise x + z = 0–35 und y = 0–45. Solche Spacer sind im Handel von einer Vielzahl von Quellen wie z.B. Aldrich Chemical Co., und Texaco Chemical Co. unter dem Handelsnamen „JEFFAMINE^®" erhältlich. Bei solchen Verbindungen handelt es sich um stark hydrophile Polymere mit einem stark variierenden, jedoch gut gekennzeichneten Molekulargewicht.
Die Verwendung hydrophiler Spacer kann das vernetzte Material vorteilhafterweise hydrophil machen. Wie zuvor angegeben, glaubt man, dass dies eine gute Infiltrierung und Diffusion von Gewebeflüssigkeit durch die Bioprothesenmatrix bewirkt. Dadurch werden Sauerstoff, Nährstoffe und Elektrolyte in das Gewebe transportiert und metabolische Substanzen aus dem Gewebe abgeleitet. Als Ergebnis wird das Wachstum der kapillaren Blutgefäße und Zellen und entsprechend eine gute Heilungsreaktion auf das implantierte Material begünstigt.
Darüber hinaus glaubt man, dass Vernetzungsmittel mit einer sehr biegsamen, langkettigen Struktur die Vernetzung zwischen benachbarten Fasern oder Faserbündeln bewirken, was eine günstige Wirkung auf die mechanischen Eigenschaften des entstandenen vernetzten Materials hat.
Der/die Spacer wird/werden in Mengen verwendet, die wirksam sind, um eine gewünschte Anzahl der aktivierten Carboxylgruppen zu vernetzen. Vorzugsweise beinhaltet diese Menge ein Molverhältnis des/der bifunktionellen Spacer(s) relativ zu der Anzahl der aktivierten Carboxylgruppen von mindestens 1–2 und noch bevorzugter von etwa 1:1.
Die Vernetzungsreaktion erfolgt vorzugsweise in einer wässrigen Lösung, noch bevorzugter in einer wässrigen Pufferlösung mit einem pH-Wert von 4 bis 9 (vorzugsweise von 5 bis 7, noch bevorzugter von 5 bis 6). Die Temperatur dieser Reaktion sollte unterhalb der Temperatur liegen, bei der das Material auf Kollagenbasis denaturiert. Daher erfolgt die Reaktion vorzugsweise bei Raumtemperatur und noch bevorzugter bei etwa 21° C, obwohl erhöhte Temperaturen die Reaktionsgeschwindigkeit erhöhen.
Die erfindungsgemäßen Verfahren beinhalten vorzugsweise die anfängliche Deaktivierung der freien Kollagenamingruppen, das In-Kontakt-bringen des Materials auf Kollagenbasis mit den Spacermolekülen, so dass sie das Material auf Kollagenbasis tränken (d.h. durchdringen) können, und die anschließende Aktivierung der Kollagencarboxylgruppen gegenüber den Spacermolekülen. Das Tränken des Kollagenmaterials vor Zugabe der Reagenzien, die die Carboxylgruppen gegenüber den Spacermolekülen aktivieren, verbessert die Wirksamkeit des Vernetzungsprozesses erheblich. Dieser Schritt erfolgt typischerweise in etwa 15 Minuten. Die Temperatur dieses Tränkschrittes sollte unterhalb der Temperatur liegen, bei der das Material auf Kollagenbasis denaturiert. Daher erfolgt die Reaktion vorzugsweise bei Raumtemperatur und noch bevorzugter bei etwa 21° C, obwohl erhöhte Temperaturen die Reaktionsgeschwindigkeit erhöhen.
Die Vernetzung der Materialien auf Kollagenbasis gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren liefert ein Material mit einem im Allgemeinen hohen Vernetzungsgrad und einer im Allgemeinen großen Beständigkeit gegenüber enzymatischer Verdauung, während das Material im Laufe der Zeit einen relativ hohen Biegsamkeitsgrad ohne wesentliche Versteifung beibehält. Dieses Material ist vorzugsweise auch stark hydrophil, was, wie man glaubt, die Biokompatibilität des Materials erhöht. Die hohe Reduktion der freien Amingruppen trägt ebenfalls zu einer besseren Biokompatibilität bei, indem sie das antigene Potential des Materials senkt. Wie oben aufgeführt, kann die Biokompatibilität dieses Materials auch durch Deaktivierung der Amingruppen mit geeigneten biologisch aktiven Molekülen wie z.B. dem sehr blutkompatiblen Molekül Heparin anstelle der Verwendung kleiner, biologisch inaktiver Moleküle verbessert werden. Aufgrund dieser Eigenschaften eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren besonders für die Vernetzung kardiovaskulärer Bioprothesen wie Herzklappen und Gefäßtransplantaten.
Die Erfindung wird mit Bezug auf die folgenden, nicht beschränkenden Beispiele weiter beschrieben. Diese Beispiele werden angeboten, um einige spezifische und illustrative Ausführungsformen und Techniken weiter zu veranschaulichen.
Experimentelle Beispiele
Materialien und Verfahren
Herstellung von DSC. Als Modell für Aortenherzklappen von Schweinen wurde Schafslederhautkollagen (DSC) eingesetzt, da dieses Material eine gewebematrix-ähnliche Struktur besitzt, gleichzeitig aber ein reines Kollagenmaterial ist. Letzteres erlaubt eine genauere Bewertung und Charakterisierung des Materials nach Durchführung des Vernetzungsverfahrens und damit ein besseres Verständnis der Beziehung zwischen der Vernetzungschemie und dem anschließenden mechanischen und biologischen Materialverhalten. Das Material erhielt man von der Zuid-Nederlandse Zeemlederfabriek (Oosterhout, Niederlande). DSC wurde in einem Verfahren hergestellt, bei dem die Haut zunächst enthaart und anschließend zur Entfernung der Epidermis in eine Kalknatriumsulfidlösung getaucht wurde. Nicht-kollagene Substanzen wurden mittels proteolytischer Enzyme entfernt; danach wurde die Haut gesplittet, um die Lederhautschicht zu erhalten. Das verbleibende Kollagenfasernetz wurde vor dem Gefriertrocknen ausgiebig mit Wasser (4 Mal), Aceton (2 Mal) und entionisiertem Wasser (2 Mal) gewaschen. Dieses Verfahren lieferte nicht vernetztes DSC (NDSC).
Deaktivierung freier Amingruppen – Acylierungsprozess. Zur Deaktivierung der freien Amingruppen des Kollagens wurde das Acylierungsmittel Essigsäure-N-hydroxysuccinimidester (HAc-NHS; Sigma, Zwijndrecht, Niederlande) verwendet, um eine nachfolgende Reaktion der aktivierten Carboxylgruppen mit diesen Amingruppen zu verhindern. Eine Lage von 1 Gramm (g) NDSC wurde in 20 Milliliter (ml) einer 0,25-molaren (M), 0,55 g HAc-NHS enthaltenden 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES) (Fluka, Buchs, Schweiz)-Pufferlösung (pH = 6,5) getaucht; das Molverhältnis von HAc-NHS zu freien Amingruppen des Kollagens betrug etwa 10:1. Man ließ die Reaktion über 6 Stunden erfolgen, wobei alle 2 Stunden eine zusätzliche Menge von 0,11 g HAc-NHS zugesetzt wurde. Nach der Reaktion wurde das DSC 4 Ma1 mit entionisiertem Wasser gewaschen und gefriergetrocknet. Dieses Verfahren lieferte HAc-NHS-deaktiviertes DSC (HBDSC).
Deaktivierung freier Amingruppen – reduktiver Aminierungsprozess. Zur Deaktivierung der freien Amingruppen des Kollagens wurde Butanal (oder Butyraldehyd), ein monofunktionelles Aldehydreagenz, verwendet, um die anschließende Reaktion der aktivierten Carboxylgruppen mit diesen Amingruppen zu verhindern. Zur reduktiven Stabilisierung der nach der Reaktion von Butanal mit den freien Kollagenamingruppen gebildeten Schiff-Base wurde Natriumcyanoborhydrid (NaCNBH₃) verwendet.
Eine Lage von 1 g NDSC wurde 6 Stunden lang in 50 ml einer 3,9 ml Butyraldehyd (p.a. Acros, Geel, Belgien) und 1 mg/ml NaCNBH₃ (Aldrich, Zwijndrecht, Niederlande) enthaltenden 0,25 M MES-Pufferlösung (pH = 6,5) getaucht, wobei alle 2 Stunden eine zusätzliche Menge von 1 mg/ml NaCNBH₃ zugesetzt wurde. Das Molverhältnis von Butanal zu freien Amingruppen des Kollagens betrug etwa 125:1. Nach der Reaktion wurde das DSC 4 Ma1 mit entionisiertem Wasser gewaschen und gefriergetrocknet. Dieses Verfahren lieferte Butanaldeaktiviertes DSC (BBDSC).
Vernetzung mit EDC, NHS und „JEFFAMINE^® "-Spacern. 1 g-Proben von HAc-NHS-deaktiviertem DSC (HBDSC) wurden in eine 1,15 g 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid HCl (EDC, Aldrich, Zwijndrecht, Niederlande), 0,276 g N-Hydroxysuccinimid (NHS, Aldrich, Zwijndrecht, Niederlande) und die gewünschte Menge JEFFAMINE^® enthaltende 0,25 M MES-Pufferlösung (pH = 5,0) getaucht. Es wurden zwei Arten von JEFFAMINE^® verwendet: Poly(propylenglycol)bis(2-aminopropylether) (JEFFAMINE^® D) und Poly(propylenglycol-bethylenglycol-b-propylenglycol)bis(2-aminopropylether) (JEFFAMINE^® ED). Das Molverhältnis von EDC zu NHS zu freien Kollagen-COOH-Gruppen betrug 5:2:1 und wurde während der Experimente stets konstant gehalten. In vier Experimenten wurde der Einfluss des mittleren Molekulargewichts des Spacers, das Molverhältnis des Spacers zu freien Kollagen- COOH-Gruppen, die Reaktionszeit sowie die Konzentration der Reagenzien auf den Vernetzungsgrad untersucht.
In dem ersten Experiment wurden Spacermoleküle mit unterschiedlichem mittlerem Molekulargewicht (Mn) verwendet: JEFFAMINE^® D230, JEFFAMINE^® D400 (beide von Aldrich, Bornem, Belgien), JEFFAMINE^® ED600, JEFFAMINE^© ED900, JEFFAMINE^© ED2001 und JEFFAMINE^® ED4000 (alle von Texaco Chemical Company, Bellaire, TX, USA) mit einem Mn von 230 g/Mol, 400 g/Mol, 600 8/Mol, 900 8/Mol, 2000 8/Mol bzw. 4000 g/Mol. Außerdem wurde eine Probe in eine nur EDC und NHS enthaltende Lösung eingetaucht. Die Reaktionszeit betrug 24 Stunden, das Reaktionsvolumen betrug 250 ml und das Molverhältnis von Spacer zu Kollagen-COOH wurde auf 1:1 eingestellt.
Bei dem zweiten Experiment wurden Molverhältnisse von Spacer zu Kollagen-COOH von 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1 und 10:1 verwendet. Die Reaktionszeit betrug 24 Stunden, das Reaktionsvolumen 500 ml und es wurde der JEFFAMINE^® D230-Spacer verwendet.
Bei dem dritten Experiment wurde die Reaktionszeit zwischen 1 und 96 Stunden variiert. Das Reaktionsvolumen betrug 500 ml und es wurde der JEFFAMINE^® D230-Spacer in einem Molverhältnis von Spacer zu Kollagen-COOH-Gruppen von 1:1 verwendet.
Bei dem vierten Experiment wurde die Konzentration der Reagenzien durch Variierung des gesamten Reaktionsvolumens zwischen 10 ml/g und 500 ml/g Kollagen variiert. Es wurde der JEFFAMINE^® D230-Spacer verwendet, wobei das Molverhältnis von Spacer zu Kollagen-COOH konstant bei 1:1 gehalten und die Reaktionszeit auf 150 Minuten eingestellt wurde. Bei diesem Experiment wurde die Pufferkonzentration auf 1 M MES angehoben, um eine gute Pufferkapazität in den konzentrierteren Lösungen aufrecht zu erhalten.
In allen Experimenten wurden die Proben nach der Vernetzungsreaktion sukzessive 2 Stunden lang in einer 0,1 M Na₂HPO₄-Lösung und 3 Mal in entionisiertem Wasser gewaschen und gefriertgetrocknet.
Die Untersuchung der Wirkung des Molverhältnisses von Spacer zu Kollagen-COOH-Gruppen wurde weiter ausgedehnt, indem ein weiteres Experiment durchgeführt wurde, bei dem Molverhältnisse von Spacer zu Kollagen-COOH von 1:4, 1:2, 1:1 und 2:1 verwendet wurden. Die Reaktion erfolgte über 150 Minuten in einem 1 M MES-Puffer (pH = 5,0); das Reaktionsvolumen betrug 20 ml/g Kollagen. Das Molverhältnis von EDC zu NHS zu Kollagen-COOH wurde wie zuvor bei 5:2:1 gehalten.
Die Untersuchung der Wirkung der Reaktionszeit wurde teilweise, d.h. zwischen 1 und 4 Stunden wiederholt, um den Reaktionsverlauf genauer zu kennzeichnen. Die Reaktion erfolgte in einem 1 M MES-Puffer (pH = 5,0); das Reaktionsvolumen betrug 20 ml/g Kollagen. Das Molverhältnis EDC:NHS:Kollagen-COOH wurde wie zuvor bei 5:2:1 gehalten, während das Molverhältnis von Spacer zu Kollagen-COOH auf 1:1 eingestellt wurde.
Die Wirkung des Lösungs-pH wurde ebenfalls untersucht. Es wurden über 150 Minuten Vernetzungsreaktionen in einem 1M MES-Puffer durchgeführt, wobei der pH-Wert zwischen 5 und 7 variierte; das Reaktionsvolumen betrug 20 ml/g Kollagen. Das Molverhältnis von EDC zu NHS zu Kollagen-COOH wurde wie zuvor bei 5:2:1 gehalten, während das Molverhältnis von Spacer zu Kollagen-COOH auf 1:1 eingestellt wurde.
Anteil freier Amingruppen. Der Anteil der primären Amingruppen der behandelten und nicht behandelten DSC-Proben, ausgedrückt als Anzahl der freien Amingruppen pro 1000 Aminosäuren (n/1000), wurde mit Hilfe eines kolorimetrischen Tests mit 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS, 1,0 M Lösung in Wasser, Fluka, Buchs, Schweiz) bestimmt. Eine Probe von 5–15 Milligramm (mg) DSC wurde mit 5 ml einer 4% (Gewicht/Volumen) wässrigen NaHCO₃ (Aldrich, Bornem, Belgien)-Lösung und anschließend mit 5 ml einer frisch hergestellten 0,5% (Gewicht/Volumen) wässrigen TNBS-Lösung versetzt. Nach der Reaktion über 2 Stunden bei 40° C wurden 25 ml 6 M HCl (Merck, Darmstadt, Deutschland) zugesetzt und die Temperatur auf 60° C erhöht. Nach abgeschlossenem Anlösen von DSC (etwa 90 Minuten nach Zugabe von HCl) wurde die entstandene Lösung mit 15 ml entionisiertem Wasser verdünnt und die Extinktion auf einem Hewlett-Packard HP8452A UV/VIS-Spektrophotomer bei einer Wellenlänge von 345 nm gemessen. Unter Anwendung desselben Verfahrens mit Ausnahme dessen, dass nach der Zugabe von HCl eine DSC-Probe zugesetzt wurde, wurde eine Kontrolle hergestellt. Der Anteil der freien Amingruppen wurde mit Hilfe eines Molabsorptionskoeffizienten von 14600 lMol^–1cm^–1 für Trinitrophenyllysin (Wang C.L. et al., Biochim. Biophys. Acta, 544, 555–567, 1978) berechnet.
Vernetzungsgrad. Zur Untersuchung der Wirksamkeit der verschiedenen Vernetzungsverfahren wurde die Differentialscanningkalorimetrie eingesetzt. Die Erwärmung von (vernetztem) Kollagen induziert je nach Wesen und Grad der Vernetzung einen Strukturübergang der nativen Dreifachhelixstruktur bei einer bestimmten Temperatur. Der Einbau kovalenter Vernetzungen erhöht die Stabilität der Dreifachhelix und damit die Denaturierungstemperatur. Die Temperatur, bei der die Denaturierung erfolgt, wird häufig auch als Schrumpftemperatur (T_S) bezeichnet, da das Schrumpfen die makroskopische Manifestation der Umwandlung der nativen Dreifachhelixstruktur in die Zufallsspiralkonfiguration ist.
Mit Hilfe einer Perkin Elmer DSC7-Serie wurden behandelte und nicht behandelte Kollagenproben gekennzeichnet. Bei einem typischen Durchgang wurden 5–8 Milligramm (mg) Kollagen in eine 50 Mikroliter (μl)-Aluminiumprobenschale (2 Bar maximaler Innendruck) gegeben; danach wurden 5 μl/mg 0,1 M Phosphatpuffer (pH = 6, 88; 0, 05 M Na₂HPO₄, 0, 05 M NaH₂PO₄, beide von Merck, Darmstadt, Deutschland) zugesetzt, um das Kollagen zu hydratisieren. Die Probenschale wurde mit einer geeigneten Abdeckung bedeckt und das Ganze wurde zusammengepresst. Als Vergleich wurde eine leere Probenschale verwendet. Typischerweise wurde ein Durchgang bei 20° C (Fülltemperatur) begonnen; nach 2 Minuten wurden die Proben mit einer Erwärmungsgeschwindigkeit von 2° C/Minute auf 100° C erwärmt. Zur Optimierung der Datenerfassung und zur Berechnung typischer Eigenschaften wurde eine Gerätesoftware eingesetzt.
Pronaseverdauungstest. Die Verdauung von behandeltem und nicht behandeltem DSC erfolgte durch Eintauchen einer Kollagenscheibe eines Durchmessers von 10 mm in 5 ml einer 5 mM CaCl₂ (Janssen Chimica, Geel, Belgien), 0,05 mg/ml NaN₃ (Merck, Darmstadt, Deutschland) und 25 U/ml Pronase (von Streptomyces griscus, 7000 U/g, Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland) enthaltenden vorgewärmten (T = 37° C) Lösung von 0,1 M TRIS-HCl (Aldrich, Bornem, Belgien), pH = 7,4. Die absolute Pronasemenge betrug etwa 4,5 U/mg Kollagen.
Der Zerfall wurde in dem gewünschten Zeitabstand durch Zugabe von 0,5 ml 0,25 M EDTA (Janssen Chimica, Geel, Belgien) unterbrochen. Nach 5-minütiger Homogenisierung wurde die Scheibe 3 Ma1 5 Minuten lang in 0,1 M Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid (TRIS-HCl, pH = 7,4) und 3 Ma1 5 Minuten lang in entionisiertem Wasser gewaschen und gefriergetrocknet. Der verbleibende Gewichtsprozentsatz wurde gravimetrisch bestimmt und als Maß für die Beständigkeit gegenüber enzymatischer Verdauung verwendet.
Wasserabsorptionsexperimente. Behandelte und nicht behandelte Kollagenscheiben (Durchmesser 12 mm) wurden auf eine Wasseroberfläche gelegt und es wurde die Zeit gemessen, bis zu der diese Proben vollständig benetzt waren. Danach wurden die nassen Proben mit fusselfreiem Tissue-Papier abgetupft. Das Nassgewicht der Proben wurde gemessen und danach das Verhältnis von Nassgewicht zu Trockengewicht berechnet.
Bewertung der in vitro-Zytotoxizität. Gemäß dem hierin offenbarten Verfahren vernetzte Kollagenproben wurden in einem in vitro-Zytotoxizitätstest bewertet. Die Proben wurden routinemäßig durch Ethylenoxid (ETO) sterilisiert. Die Zytotoxizität wurde gemäß dem Verfahren von Van Luyn M.J.A. et al., Mater. Med., 2, 142–248 (1991) bestimmt. Kurz gesagt beinhaltet dieses Verfahren das 7-tägige Einwirken einer Methylcellulosekultur menschlicher Fibroblasten auf das Testmaterial (8 mm-Scheiben). Dieses Testverfahren ist laut Berichten empfindlicher als die etablierten Testverfahren, d.h. Agar-Überzugstest und Filterdiffusionstest.
Subkutane Rattenimplantate. Die NIH-Richtlinien für die Pflege und den Einsatz von Labortieren (NIH-Veröffentlichung # 85–23, Fassung von 1985) wurden beachtet.
Bei etwa 3 Monaten alten Albino-Oxford-Rattenmännchen (AO, gezüchtet in Rijksuniversiteit Groningen, Niederlande) erfolgten subkutane Implantationen. Parallel zur Wirbelsäule wurden eine subkutane Tasche erzeugt und anschließend ETOsterilisierte 8 Millimeter (mm) große Scheiben der behandelten Kollagene implantiert. An den Tagen 1, 2, 5 und 10 und den Wochen 3 und 6 wurden die Kollagenscheiben mit dem sie umgebenden Gewebe ausgeschnitten und bezüglich der Zellreaktion, des Verkalkungsgrades und des Matrixzerfalls und/oder der Matrixsubstitution bewertet.
Alle explantierten Proben wurden in 2% (Volumen/Volumen) Glutaraldehyd in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, pH = 7,4) während mindestens 24 Stunden bei 4° C immersionsfixiert; anschließend wurden die Proben in klassierten Alkoholen dehydratisiert und in EPON^® 812 eingebettet. Vor der Messung mittels Lichtmikroskopie (LM) wurden halbdünne Schnitte (1 μm) hergestellt und typischerweise mit Toluidine Blue-Farbe gefärbt, um die Zellreaktion bzw. -antwort zu ermitteln, und mit von Kossa-Farbe, um den Verkalkungsgrad zu bestimmen.
Vernetzung von Schweineaortenklappen. Es wurden frische Aortenherzklappen von Schweinen ausgewählt und im Schlachthof zerlegt (Premium Fleisch Emsland, Lingen, Deutschland). Von der Herzklappen wurden so viel Fett und Myokard wie möglich entfernt. Nach der Gewinnung wurden die Aortenwurzeln (dünne Lagen und ein kleines Stück der Aorta) viermal mit einer eiskalten Salzlösung (0,9 Gew.-% NaCl) gespült und eine Nacht lang bei 4° C in 10 mM HEPES aufbewahrt.
Die folgenden Vernetzungsverfahren wurden eingesetzt:

(1) Es erfolgte eine GA-Vernetzung durch 24-stündiges Eintauchen einer Herzklappe in 100 ml einer 0,2 Gewichtsprozent (Gew.-%) Glutaraldehyd enthaltenden 10 mM HEPES-Pufferlösung (pH = 7,4) bei Raumtemperatur. Nach der Vernetzung wurde die Herzklappe fünf Mal 30 Minuten lang in Salzlösung gespült; danach wurde die Herzklappe in 0,2 Gew.% Glutaraldehyd aufbewahrt.
(2) Es wurde eine EDC/NHS-Kontrollvernetzung durchgeführt, indem eine Herzklappe in 100 ml einer 1,15 g EDC und 0,14 g NHS (Molverhältnis EDC:NHS:COOH (Kollagen) = 5:1:1) enthaltenden 0,05 mM MES-Pufferlösung (pH = 5,5) getaucht wurde, in der Annahme, dass eine Herzklappe etwa 1 g Kollagen enthält. Die Vernetzung erfolgte über 24 Stunden bei Raumtemperatur. Nach der Vernetzung wurde die Herzklappe fünf Mal jeweils 30 Minuten lang in Salzlösung gespült und in 20 Gew.-% IPA (pH = 7,4) enthaltender 10 mM HEPES aufbewahrt.
(3) Es wurde eine HAc-NHS/JEFFAMINE^® D230-Vernetzung durchgeführt, indem eine Herzklappe in 100 ml eines 0,25 M MES-Puffers (pH = 6,5) getaucht wurde, die mit 2,75 g HAc-NHS versetzt waren. Man ließt die Deaktivierungsreaktion 6 Stunden lang erfolgen, wobei nach 2 und 4 Stunden jeweils zusätzlich 0,55 g HAc-NHS zugegeben wurden. Danach wurde die Herzklappe drei Ma1 jeweils 15 Minuten lang mit Salzlösung gespült. Nach dem Spülen mit Salzlösung wurde die Herzklappe mit dem Spacer getränkt, indem die Herzklappe in 100 ml eines 1,38 g Jeffamine^® D230 enthaltenden 0,25 M MES-Puffer (pH = 5,0) getaucht wurde. Nach 30 Minuten wurde die Herzklappe entfernt und in 100 ml eines 1,38 g JEFFAMINE^® D230, 5,75 g EDC und 1,38 g NHs enthaltenden 0,25 M MES-Puffers (pH = 5,0) getaucht. Man ließ die Vernetzungsreaktion 14 Stunden lang erfolgen. Danach wurde die Herzklappe fünf Mal jeweils 30 Minuten lang in Salzlösung gespült und danach in 20 Gew.-% IPA (pH = 7,4) enthaltendem 10 mM HEPES aufbewahrt.
(4) Es wurde eine Butanal/JEFFAMINE^® D230-Vernetzung durchgeführt, indem eine Herzklappe in 100 ml eines 0,25 M MES-Puffers (pH = 6,5) getaucht wurde, dem 8 ml Butanal und 100 mg NaCNBH₃ zugesetzt worden waren. Die Deaktivierungsreaktion ließ man 6 Stunden erfolgen, wobei nach 2 und 4 Stunden jeweils weitere 100 mg NaCNBH₃ zugesetzt wurden. Danach wurde die Herzklappe drei Mal jeweils 15 Minuten lang in Salzlösung gespült. Nach dem Spülen mit Salzlösung wurde die Herzklappe mit dem Spacer getränkt, indem die Herzklappe in 100 ml eines 1,38 g JEFFAMINE^® D230 enthaltenden 0,25 M MES-Puffers (pH = 5,0) getaucht wurde. Nach 30 Minuten wurde die Herzklappe entfernt und in 100 ml eines 1,38 g JEFFAMINE^® D230, 5,75 g EDC und 1,38 g NHS enthaltenden 0,25 M MES-Puffers (pH = 5,0) getaucht. Die Vernetzungsreaktion ließ man 14 Stunden erfolgen. Danach wurde die Herzklappe fünf Mal jeweils 30 Minuten lang in Salzlösung gespült und danach in 20 Gew.-% IPA (pH = 7,4) enthaltendem 10 mM HEPES aufbewahrt.
(5) Es wurde eine HAc-NHS/JEFFAMINE^® ED2001-Vernetzung durchgeführt, indem eine Herzklappe in 100 ml eines 0,25 M MES-Puffers (pH = 6,5) getaucht wurde, dem 2,75 g HAc-NHS zugesetzt worden waren. Die Deaktivierungsreaktion ließ man 6 Stunden erfolgen, wobei nach 2 und 4 Stunden jeweils weitere 0,55 g HAc-NHS zugesetzt wurden. Danach wurde die Herzklappe drei Mal jeweils 15 Minuten lang in Salzlösung gespült. Nach dem Spülen mit Salzlösung wurde die Herzklappe mit dem Spacer getränkt, indem die Herzklappe in 100 ml eines 12 g JEFFAMINE^® ED2001 enthaltenden 0,25 M MES-Puffers (pH = 5,0) getaucht wurde. Nach 30 Minuten wurde die Herzklappe entfernt und in 100 ml eines 12 g JEFFAMINE^® ED2001, 5, 75 g EDC und 1, 38 g NHS enthaltenden 0, 25 M MES-Puffers (pH = 5,0) getaucht. Die Vernetzungsreaktion ließ man 14 Stunden erfolgen. Danach wurde die Herzklappe fünf Mal jeweils 30 Minuten lang in Salzlösung gespült und danach in 20 Gew.-% IPA (pH = 7,4) enthaltendem 10 mM HEPES aufbewahrt.
(6) Es wurde eine Butanal/Jeffamine^© ED2001-Vernetzung durchgeführt, indem eine Herzklappe in 100 ml eines 0,25 M MES-Puffers (pH = 6,5) getaucht wurde, dem 8 ml Butanal und 100 mg NaCNBH₃ zugesetzt worden waren. Die Deaktivierungsreaktion ließ man 6 Stunden lang erfolgen, wobei nach 2 und 4 Stunden jeweils weitere 100 mg NaCNBH₃ zugesetzt wurden. Danach wurde die Herzklappe drei Mal jeweils 15 Minuten lang in Salzlösung gespült. Nach dem Spülen mit Salzlösung wurde die Herzklappe mit dem Spacer getränkt, indem die Herzklappe in 100 ml eines 12 g JEFFAMINE^® ED2001 enthaltenden 0,25 M MES-Puffers (pH = 5,0) getaucht wurde. Nach 30 Minuten wurde die Herzklappe entfernt und in 100 ml eines 12 g JEFFAMINE^® ED2001, 5,75 g EDC und 1,38 g NHS enthaltenden 0,25 M MES-Puffers (pH = 5,0) getaucht. Die Vernetzungsreaktion ließ man 14 Stunden lang erfolgen. Danach wurde die Herzklappe fünf Mal jeweils 30 Minuten lang in Salzlösung gespült und danach in 20 Gew.-IPA (pH = 7,4) enthaltendem 10 mM HEPES aufbewahrt.

Implantationsprotokoll. Jeweils drei 8 mm große Scheiben der flachen Lagen und der Aortenwand der behandelten Schweineherzklappen wurden drei Mal in Salzlösung gewaschen und subdermal in den Rücken von 3 Wochen alten Sprague Dawley-Rattenmännchen implantiert (2 Implantate pro Tier). Alle Proben wurde nach 8 Wochen rückgewonnen. Die sie umgebende Gewebekapsel wurde entfernt. Die explantierten Proben wurden in zwei Hälften geschnitten, wobei eine Hälfte anschließend für die histochemische Färbung verwendet und die andere für die nachfolgende Kalziumanalyse lyophilisiert wurde.
Kalziumanalyse. Die lyophilisierten Proben wurden gewogen und anschließend in 6 N HCl bei 85° C 24 Stunden lang bei Atmosphärendruck hydrolysiert. Durch induktiv gekoppelte Plasmaatomemissionsspektroskopie (ICP-AES) mit einem Perkin-Elmer Sciex Elan 500 in DSM Research, Geleen, Niederlande wurde der Kalziumspiegel in der Lösung bestimmt. Bei niedrigen Kalziumspiegeln wurden die Analysen zur Bestimmung des Kalziumspiegels in der Lösung wiederholt, diesmal jedoch mit einem Massenspektrometer (MS). Die Ergebnisse sind als Milligramm Kalzium pro Gramm Trockengewebe ausgedrückt.
Ergebnisse und Diskussion Das erfindungsgemäße Verfahren schließt die folgenden Grundschritte ein: 1) Deaktivierung freier Amingruppen, 2) Tränken mit einem Diaminspacer, 3) Carbodiimidaktivierung von Carboxylgruppen und 4) Vernetzung mit dem Diaminspacer.
Deaktivierung freier Amingruppen. Der erste Schritt in dem Vernetzungsprozess ist die Deaktivierung der freien ε-Amingruppen der Aminosäuren Lysin und Hydroxylysin. Der Hauptgrund dafür ist die Verhinderung einer weiteren Teilnahme an den nachfolgenden Vernetzungsschritten. Ohne die Deaktivierung dieser Amingruppen löst die Carbodiimidaktivierung der Carboxylgruppen hauptsächlich die sogenannte Nulllängenvernetzung aus, d.h. die direkte Kopplung einer Carboxylgruppe an eine Amingruppe. Es ist bekannt, dass eine große Anzahl dieser Vernetzungen kollagene Materialien steif und spröde macht. In dem US-Patent Nr. 5,475,052 (Rhee et al.) wurde außerdem darauf hingewiesen, dass die Deaktivierung freier Amingruppen die Immunogenität von Materialien auf Kollagenbasis verbessert.
Acylierungsprozess. Die Kollagenamingruppen wurden mittels eines NHS-aktivierten Essigsäureesters in einer Acylierungsreaktion deaktiviert. Der Reaktionsmechanismus ist in Schema 1 dargestellt.
Schema 1
Bei diesem Reagenz fand sich eine Wirksamkeit von etwa 90%, begleitet von einem geringen Rückgang der Denaturierungstemperatur des basischen Materials (siehe Tabelle 1). Dieser Rückgang wird sehr wahrscheinlich durch eine lokale Unterbrechung der Dreifachhelixstruktur der Kollagenmoleküle bewirkt. Man kann sicher annehmen, dass die wenigen nicht deaktivierten Amingruppen aufgrund der sterischen Behinderung nicht leicht zugänglich sind.
Tabelle 1. Wirkung der Amingruppendeaktivierung auf den Anteil der freien Amingruppen und T_S
Reduktiver Aminierungsprozess. Die freien Amingruppen wurden alternativ mittels des monofunktionellen Aldehyds Butanal unter Reduktionsbedingungen deaktiviert. Der Reaktionsmechanismus ist in Schema 2 dargestellt.
Schema 2.
Diese Reaktion war wirksamer als die vorherige; die Wirksamkeit betrug etwa 95%. Außerdem veränderte sie auch die Denaturierungstemperatur nicht dramatisch.
Tabelle 2. Wirkung der Amingruppendeaktivierung auf den Anteil der freien Amingruppen und T_S
Wie in dem Reaktionsmechanismus gezeigt, liefert die Reaktion von Butanal mit einer freien Amingruppe ein sekundäres Amin, das im Prinzip mit einer aktivierten Carboxylgruppe reagieren kann. Diese Butanal-deaktivierten Amine nahmen jedoch, eventuell wegen der sterischen Behinderung, nicht an der weiteren Vernetzung teil.
Zwar handelt es sich bei Butanal um eine aldehydfunktionelle Verbindung, doch sie sollte nicht mit Glutaraldehyd verglichen werden, da diese Verbindung, anders als Glutaraldehyd, kein Polymernetz bilden kann. Daher wird überschüssiges Reagenz nach der Reaktion leicht ausgewaschen und stellt keine Bedrohung für die Biokompatibilität des Materials auf Kollagenbasis dar.
Tränken mit einem Diaminspacer. Nach der Deaktivierung der freien Amingruppen ist der nächste Schritt in dem Prozess vorzugsweise das Tränken des Kollagenmaterials mit den Spacermolekülen. Das Tränken des Kollagenmaterials vor Zugabe der Reagenzien, die die Carboxylgruppen gegenüber den Spacermolekülen aktivieren, um das Material auf Kollagenbasis zu vernetzen, verbessert die Wirksamkeit des Vernetzungsprozesses erheblich. Die Erfinder möchten zwar nicht durch die Theorie eingeschränkt sein, man glaubt jedoch, dass dies durch die Tatsache erklärt werden kann, dass die Reaktionsgeschwindigkeit in einem dichten Material wie Kollagen großenteils diffusionsabhängig ist. Indem man es den Spacermolekülen erlaubt, die Matrix vor Initiierung der Reaktion zu durchdringen, wird ein Teil der Diffusionseinschränkung überwunden.
Ein bevorzugtes Spacermolekül ist das diamino-funktionelle Derivat eines Poly(propylenglycol)/Poly(ethylenglycol)-Polymers wie des im Handel unter dem Handelsnamen JEFFAMINE^® erhältlichen. Dieser Spacer ist aufgrund der ihm innewohnenden starken Hydrophilie und Biegsamkeit vorteilhaft. Man vermutet, dass die hochbiegsame Natur dieser Spacermoleküle die mechanischen Eigenschaften des vernetzen Materials verbessert. Man vermutet, dass die hydrophile Natur dieser Reagenzien bezüglich des Eindringens in die dichte Kollagenmatrix günstig ist. Es besteht außerdem die Hypothese, dass die Verwendung dieser Arten von Spacermolekülen das vernetze Material stark hydrophil macht. Dies sollte eine gute Infiltrierung und Diffusion der Gewebeflüssigkeit durch die Materialmatrix und damit die Versorgung mit Sauerstoff, Nährstoffen und Elektrolyten sowie das Ableiten der Metaboliten bewirken. Man glaubt außerdem, dass das Einwachsen der kapillaren Blutgefäße und Zellen begünstigt und dementsprechend die Heilungsreaktion verbessert wird.
Der Durchmesser der Kollagendreifachhelix beträgt etwa 15 Angstrom; der gesamte Durchmesser einer Mikrofibrille, die typischerweise 5 Kollagenmoleküle nebeneinander umfasst, beträgt etwa 40 Angstrom. Die Fibrillen wiederum bestehen aus einer Reihe von Mikrofibrillen und besitzen einen Durchmesser von etwa 500 Angstrom. Die berechneten Moleküllängen von JEFFAMINE^®-Spacern eines unterschiedlichen mittleren Molekülgewichts sind wie folgt: 230 Gramm/Mol, 13 Angstrom; 400 Gramm/Mol, 24 Angstrom; 600 Gramm/Mol, 37 Angstrom; 900 Gramm/Mol, 55 Angstrom; 2000 Gramm/Mol, 123 Angstrom und 4000 Gramm/Mol, 248 Angstrom.
Unter Berücksichtigung dieser Abmessungen bedeutet dies, dass z.B. JEFFAMINE^® 230 nur intramolekulare Vernetzungen oder Vernetzungen innerhalb einer Mikrofibrille bilden kann, während längere Moleküle auch Vernetzungen zwischen verschiedenen Mikrofibrillen bilden können. Es ist im Gegenteil sehr zweifelhaft, ob die JEFFAMINE^®-Spacer mit einem hohen Molekulargewicht, z.B. JEFFAMINE^® 2000 oder mehr, intramolekulare Vernetzungen bilden können.
Carbodiimidaktivierung der Carboxylgruppen. Die Vernetzung von Kollagenmaterialien mittels Aktivierung der Carboxylgruppen hat in den letzten 5–10 Jahren zunehmendes Interesse geweckt. Beispielsweise wurde die Carbodiimidaktivierte Vernetzung von Kollagen (Olde Damink L.H.H. Doktorarbeit, Universität Twente, Enschede, Niederlande, 1993) ebenso wie die Acylazidvernetzung (US-Patente Nr. 4,958,008 (Petite et al.) und 5,264,551 (Petite et al.)) beschrieben.
Die wasserlösliche Carbodiimidverbindung EDC aktiviert Carboxyle, und die Zugabe von NHS erhöht die Wirksamkeit der Aktivierungsreaktionen sogar noch mehr (siehe Schema 3). NHS unterdrückt bei Reaktion mit der Verbindung (1) nicht nur die Bildung des Nebenproduktes N-Acylharnstoff, der nach der intramolekularen Umlagerung der Verbindung (1) gebildet wird, sondern bildet auch einen sehr viel stabileren aktivierten Carboxylester. Während die Halbwertszeit t_1/2 der Verbindung (1) im Bereich von Sekunden bis Minuten liegt, wird die t_1/2 der Verbindung (2) unter den typischerweise für den derzeit offenbarten Vernetzungsprozess eingesetzten Reaktionsbedingungen auf 30–40 Minuten erhöht.
Schema 3. EDC/NHS-Aktivierung von Carboxylgruppen EDC = 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid.HCl NHS = N-Hydroxysuccinimid
Vernetzung mit einem Diaminspacer. Da die ε-Amingruppen von Lysin und Hydroxylysin deaktiviert wurden, wird die Nulllängenvernetzung, d.h. die direkte Reaktion zwischen Carboxylgruppen der Asparaginsäure und Glutaminsäure mit diesen freien Aminen verhindert (siehe Schema 4). Nach der Deaktivierung erfolgt die Vernetzung durch Reaktion der beiden Amingruppen des Spacers mit den aktivierten (*) Carboxylgruppen. Reagiert der Diaminspacer nur auf einer Seite, werden anhängende Amingruppen in das Kollagen eingebaut. Je höher die Anzahl der anhängenden Amingruppen, um so weniger wirksam ist die Vernetzung. Die Bestimmung des Anteils der freien Amingruppen vor und nach der Vernetzung gibt die Anzahl der Spacermoleküle an, die auf einer Seite reagiert haben, und ist daher ein Maß für die Vernetzungswirksamkeit.
Schema 4.
Nulllängenvernetzung deaktiviert
Es wurde der Einfluss des Molekulargewichts der Spacermoleküle auf die Schrumpftemperatur und den Anteil der Amingruppen untersucht. Man stellte fest, dass mit JEFFAMINE® D230, der JEFFAMINE^®-Verbindung mit dem geringsten Molekulargewicht, vernetztes Kollagen den größten Anstieg der Schrumpftemperatur aufwies, wohingegen die Zunahme der Schrumpftemperatur mit steigendem Molekulargewicht geringer war (1). Man glaubt, dass die Spacer mit einem hohen Molekulargewicht die Kollagenmatrix aufgrund ihrer Größe schwerer durchdringen können. Die EDC/NHS-Vernetzung in Abwesenheit einer JEFFAMINE^®-Verbindung induziert trotz Deaktivierung von 90% der freien Amingruppen einen Anstieg der Schrumpftemperatur. Da erwartet werden kann, dass die am leichtesten erreichbaren Amingruppen deaktiviert waren, kann diese Beobachtung möglicherweise durch eine Reaktion der aktivierten Carboxylgruppen mit verfügbaren Hydroxylgruppen, die esterartige Bindungen bilden, oder sogar anderer Carboxylgruppen, die Carboxylanhydride bilden, erklärt werden.
Mit JEFFAMINE^® D230 vernetztes Kollagen weist außerdem den höchsten Anteil freier Amingruppen auf. Der Anteil der freien Carboxylgruppen des Kollagens beträgt etwa 120/1000 Aminosäuren. Das bedeutet, dass theoretisch die Bildung von 60 Vernetzungen pro 1000 Aminosäuren möglich ist. Aufgrund der sterischen Behinderung und weil einige Carboxylgruppen zu weit von einander entfernt sind, tritt ein solch hoher Vernetzungsgrad jedoch nie auf. Wird das Material weniger wirksam vernetzt, steigt die Anzahl der anhängenden Spacermoleküle und auch die Anzahl der freien Amingruppen. Die beobachtete Zunahme von 2 Amingruppen pro 1000 Aminosäuren nach der Vernetzung mit JEFFRMINE^® D230 ist sehr gering und zeigt an, dass entweder nur einige wenige Spacermoleküle umgesetzt wurden oder das Material sehr wirksam vernetzt wurde. Da die Vernetzung mit JEFFAMINE^® D230 zum größten Anstieg der Schrumpftemperatur führte, wird diese Spacerverbindung beim Großteil der nachfolgenden Experimente verwendet.
Der Einfluss des Molverhältnisses des JEFFAMINE^®-Spacers zu der Anzahl der Carboxylgruppen ist in 2 dargestellt. Die Zunahme des Molverhältnisses hatte keine tiefgreifende Wirkung auf die Schrumpftemperatur, obwohl sie die Maskierungsreaktionen, d.h. die einseitige Kopplung von Spacermolekülen, wie bei einem Anstieg des Anteils der freien Amingruppen beobachtet, erhöhte. Ein Molverhältnis von 1:1 bedeutet, dass pro Carboxylgruppe 2 Amingruppen vorliegen. Eine Abnahme des Verhältnisses JEFFAMINE^®:COOH auf 1:2, d.h. 1 Amin pro Carboxyl, hatte keinen Einfluss auf die Schrumpftemperatur und bewirkte auch keine signifikante Abnahme des Anteils der freien Amingruppen.
Bei der Carbodiimid-aktivierten Vernetzung handelt es sich um eine schnelle Reaktion. 3 zeigt, dass die Vernetzung hauptsächlich innerhalb von 1,5–2 Stunden erfolgte. Längere Reaktionszeiten bewirkten lediglich den Einbau mehr anhängender Gruppen. Mit steigender Dichte der Kollagenmaterialien können jedoch längere Reaktionszeiten erwünscht sein, um eine homogene Verteilung der Vernetzungen in dem Material zu erreichen.
Die Reaktionsgeschwindigkeit während der Vernetzung der Kollagenmaterialien ist stark diffusionsabhängig. Neben dem makroskopischen Ereignis der Reagenzdiffusion in die dreidimensionale Struktur des Kollagenmaterials gibt es ein mikroskopisches Ereignis, das die Diffusion der geeigneten Reagenzien in die Oberfläche eines Kollagenmoleküls umfasst, um die kovalente Bindung der Spacerverbindung zu erzielen. Dies bedeutet, dass die Wirksamkeit der Vernetzungsreaktion mit Zunahme der Volumenkonzentration der Reagenzien erhöht sein sollte. 4 bestätigt dies. Die Zunahme der Volumenkonzentration des JEFFAMINE-Spacers, EDC und NHS (bei Aufrechterhaltung konstanter Molverhältnisse) zeigte eine dramatische Wirkung auf die erzielte Schrumpftemperatur. Der große Anstieg des Anteils der freien Amingruppen bestätigt außerdem, dass eine große Anzahl Reaktionen stattfindet. Es zeigt auch, dass die Vernetzungsreaktion bei zu hohen Konzentrationen sehr unwirksam wird.
Pronaseverdauungstest. Eine Technik, die herkömmlicherweise bei der Charakterisierung eines Vernetzungsprozesses verwendet wird, ist der enzymatische Verdauungstest. Die enzymatische Verdauung hat keine definitive Korrelation mit der Stabilität des Materials in der Körperumgebung, stellt jedoch einen guten Vergleich verschiedener Vernetzungstechniken in vitro dar.
Darüber hinaus kann durch Verwendung verschiedener Enzymarten bestimmt werden, wo sich die Vernetzungen befinden. Pronase z.B. greift vorzugsweise die nicht helikalen Telopeptidregionen des Kollagenmaterials an; im Gegensatz dazu greift Kollagenase die Dreifachhelix selbst an. Unterschiede in der Beständigkeit gegenüber einem bestimmten Enzym können daher zur Lokalisierung der gebildeten Vernetzungen beitragen.
Die Ergebnisse der Pronaseverdauungstests sind in 5 dargestellt. Es ist zu beachten, dass EDC/NHS, Jeff^® ED2001 und Jeff^® D230 für mit dieser Art Vernetzungsmittel HBDSCvernetzt und Glutaraldehyd für mit Glutaraldehyd NDSCvernetzt stehen. Die nachfolgende Tabelle 3 zeigt die Schrumpftemperaturen des gemäß diesen verschiedenen Vernetzungsverfahren vernetzten Kollagens.
Tabelle 3. Schrumpftemperatur von Proben in einem Pronaseverdauungstest.
Alle Materialien zerfielen innerhalb von 72 Stunden vollständig (NDSC und HBDSC sogar innerhalb 1 Stunde), mit Ausnahme der mit dem JEFFAMINE D230-Spacer vernetzten Kollagenscheibe. Nach 9 Tagen waren 29% des Anfangsgewichtes übrig. Die Stabilität des JEFFAMINE D230-vernetzten Kollagens ist im Vergleich zu den anderen vernetzten Kollagenen wie Glutaraldehyd signifikant.
Wasserabsorptionstests. Die in der nachfolgenden Tabelle 4 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die verwendeten Vernetzungstechniken allgemein dazu neigen, die Benetzbarkeit der Kollagenmaterialien zu erhöhen. Dies kann im Gegensatz zu den Erwartungen stehen, da die Vernetzung das Kollagennetz typischerweise zusammenziehen würde, so dass der Eintritt von Wasser behindert wäre.
Tabelle 4. Ergebnisse des Wasserabsorptionsexperimentes
Die Vernetzung mit Hilfe der JEFFAMINE^®-Spacer zeigt die schnellste Rehydratation, wohingegen die Glutaraldehydvernetzung dazu tendiert, ein bisschen langsamer zu sein. Es gibt Hinweise darauf, dass die stark hydrophilen, vernetzten Kollagenmaterialien die Infiltrierung und Diffusion von Gewebeflüssigkeit durch die Materialmatrix begünstigen und damit die Versorgung mit Sauerstoff, Nährstoffen und Elektrolyten sowie das Ableiten der Metaboliten bewirken. Das Einwachsen kapillarer Blutgefäße und Zellen wird ebenfalls begünstigt und damit die Heilungsreaktion verbessert. Darüber hinaus verbessert die Hydrophilie die Kompatibilität des Materials mit Blut.
Bewertung der in vitro-Zytotoxizität. Es wurde wiederholt gezeigt, dass Glutaraldehyd-vernetzte Kollagenmaterialien aufgrund der Freisetzung toxischer Glutaraldehydverbindungen zytotoxische Eigenschaften besitzen. Dies wurde von Speer D.P. et al., J. Biomed. Mater. Res., 14, 753–764 (1980) bestätigt, die herausfanden, dass Glutaraldehydkonzentrationen von nur 3 ppm das Wachstum der Fibroblastenzellen, gemessen mittels H³-Thymidin-Aufnahme, hemmten. Die in vivo-Freisetzung von Glutaraldehydsubstanzen manifestiert sich in einer fortbestehenden Entzündungsreaktion.
Die Zytotoxizität der Kollagenproben wurde in einem sehr empfindlichen in vitro-Test gemessen (Van Luyn M.J.A., Doktorarbeit, Rijksuniversiteit Groningen, Groningen, Niederlande, 1992). In diesem Test zeigten Glutaraldehydvernetzte Kollagenproben eine Hemmung des Zellwachstums von bis zu 80%, inklusive der Gegenwart vieler Zellen mit einer abweichenden Morphologie; ein stark zytotoxisches Material. Erfindungsgemäß mittels JEFFAMINE^® D230-Spacer vernetzte Kollagenproben wiesen eine Hemmung des Zellwachstums von 25% auf, während Zellen mit einer abweichenden Morphologie nicht beobachtet wurden. Gemäß den Standards dieses Zytotoxizitätstests korreliert diese Anzahl mit einem nicht toxischen bis leicht zytotoxischen Material, was als den herkömmlichen Zytotoxizitätstest bestanden gelten würde.
Untersuchung eines subkutanen Rattenimplantats. Ein weiteres Charakterisierungsmodell ist die akute Implantation vernetzter Kollagenmaterialien in Ratten. Diese ersten Implantatuntersuchungen zielten hauptsächlich auf eine erste Durchmusterung des in vivo-Verhaltens. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren mittels JEFFAMINE^® D230-Spacern vernetztes Kollagen wurde mit Glutaraldehyd-vernetztem Kollagen verglichen.
Entzündungsreaktion. Das JEFFAMINE^® D230-Kollagen zeigte eine sehr ruhige Gewebereaktion mit einer dünnen, normal aussehenden Fasereinkapselung der gesamten Scheibe. An Tag 1 wurde die Scheibe vollständig mit Granulozyten und Makrophagen infiltriert; ab Tag 5 wurde die Bildung von Fremdkörper-Riesenzellen beobachtet; das Einwachsen der Fibroblasten wurde deutlich sichtbar und war am Tag 10 fast abgeschlossen. Die Kollagenmatrix schien sehr stabil mit kaum Anzeichen für einen Zerfall; die Fibroblastenaktivität führte zur Bildung von Neokollagen, auch wenn dies nicht deutlich sichtbar war.
Das Glutaraldehydkollagen wies eine dickere und aktivere Faserkapsel auf. Innerhalb der Kollagenscheibe wurde die erhöhte Zellinfiltrierung und der Zelltod von Neutrophilen und Makrophagen beobachtet. Das zelluläre Einwachsen aller Zelltypen einschließlich Fibroblasten war geringer; zwischen den Kollagenfibrillen und den infiltrierten Zellen wurden Freiräume beobachtet, und die Zellpseudopodia hafteten nicht vollständig an Kollagenfibrillenbündeln und umgaben sie nicht. Eine Neokollagenbildung wurde nicht oder kaum beobachtet.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das erfindungsgemäß vernetzte Material keine ungünstige Entzündungsreaktion hervorrief und sich als biokompatibel erwies, was die früheren in vitro-Ergebnisse bestätigte. Die Ergebnisse belegen eine verbesserte Biokompatibilität im Vergleich zu dem Glutaraldehydkollagen.
Verkalkung. Das JEFFAMINE^® D230-Kollagen zeigte während der 6-wöchigen Implantatsdauer weder bei der von Kossa-Färbung noch bei der TEM-Analyse Anzeichen einer Verkalkung.
Im Gegensatz dazu wies das Glutaraldehyd-vernetzte Kollagen ab Tag 10 eine Verkalkung auf; nach 3 Wochen war die Verkalkung weiter fortgeschritten und wies große Kalkablagerungen auf; nach 6 Wochen wurden vollständig verkalkte Kollagenstrukturen beobachtet.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die offenbarte Vernetzungstechnologie die Verkalkung des implantierten Kollagenmaterials verhinderte, was eine signifikante Verbesserung gegenüber dem Glutaraldehydkollagen darstellt.
Vernetzung von Aortenherzklappen von Schweinen. Die Ergebnisse dieses Experiments veranschaulichen den signifikanten Unterschied zwischen der minimalen Verkalkung der Dünnschichtgewebe, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens fixiert wurden, und dem hohen Verkalkungsgrad, der bei dünnen Lagen, die mittels des Glutaraldehydverfahrens oder der EDC/NHS-Kontrolle fixiert wurden, beobachtet wurde. Der Kalziumspiegel (in mg Kalzium pro g Trockengewebe) in den dünnen Lagen der Schweineaortenherzklappe betrug bei dem Vernetzungsverfahren: (1) 194,23; (2) 171,20; (3) 5,85; (4) 1, 34; (5) 1, 65 und (6) 2, 22 .
Signifikanterweise wurde auch eine Abnahme des Verkalkungsgrades in der Aortenwand beobachtet. Die Aortenwand scheint weitaus anfälliger für eine Verkalkung zu sein als die dünnen Lagen; in dieser Hinsicht bestätigen die gewonnenen Ergebnisse, dass das erfindungsgemäße Verfahren eine Verbesserung gegenüber dem Glutaraldehydfixierungsverfahren darstellt. Der Kalziumspiegel (in mg Kalzium pro g Trockengewebe) der Schweineaortenwand betrug bei dem Vernetzungsverfahren: (1) 112,60; (2) 96,40; (3) 63,23; (4) 49,17; (5) 92,50 und (6) 48,70.

Claims

Verfahren zur Vernetzung von Material auf Kollagenbasis mit Kollagenamingruppen und Kollagencarboxylgruppen, mit den folgenden Schritten: Deaktivieren mindestens eines Teils der Kollagenamingruppen mit Hilfe eines Deaktivierungsmittels zur Bildung deaktivierter Amingruppen, In-Kontakt-Bringen des Materials auf Kollagenbasis mit den deaktivierten Amingruppen mit einem polyfunktionellen Spacer, und Aktivieren mindestens eines Teils der Kollagencarboxylgruppen nach Deaktivieren mindestens eines Teils der Kollagenamingruppen, wobei der polyfunktionelle Spacer das Material auf Kollagenbasis vernetzt und der Schritt des In-Kontakt-Bringens vor oder nach dem Aktivierungsschritt erfolgen kann.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Deaktivierungsmittel aus einem Acylierungsmittel, einem Aminierungsmittel und einem biologisch aktiven Derivat davon ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem der Deaktivierungsschritt das In-Kontakt-Bringen der Kollagenamingruppen mit einem Acylierungsmittel umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 3, bei dem das Acylierungsmittel aus einem N-Hydroxysuccinimidester, einem p-Nitrophenylester, 1-Acetylimidazol und Citraconsäurean hydrid ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, bei dem das Acylierungsmittel aus Essigsäure-N-hydroxysuccinimidester, Sulfo-NHS-acetat, Propionsäure-N-hydroxysuccinimidester, p-Nitrophenylformat, p-Nitrophenylacetat, p-Nitrophenylbutyrat, 1-Acetylimidazol und Citraconsäureanhydrid ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem der Deaktivierungsschritt das In-Kontakt-Bringen der Kollagenamingruppen mit einem Aminierungsmittel umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das Aminierungsmittel ein Aldehyd oder Keton ist.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, bei dem das Aminierungsmittel ein monofunktionelles Aldehyd ist.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem das monofunktionelle Aldehyd aus Propanal, Butanal und Hexanal ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, bei dem der Deaktivierungsschritt das In-Kontakt-Bringen der Kollagenamingruppen mit einem Aminierungsmittel in Gegenwart eines Reduktionsmittels umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem das Reduktionsmittel aus Natriumcyanoborhydrid, Natriumborhydrid, Dimethylaminboran, Trimethylaminboran und Morpholinboran ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem das Material auf Kollagenbasis ganzes Gewebe um faßt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem jeder Schritt in einer wäßrigen Lösung durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem der Deaktivierungsschritt die Deaktivierung von 75% oder mehr der Kollagenamingruppen umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 14, bei dem der Deaktivierungsschritt die Deaktivierung von 80% oder mehr der Kollagenamingruppen umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 15, bei dem der Deaktivierungsschritt die Deaktivierung von 90% oder mehr der Kollagenamingruppen umfaßt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem der Aktivierungsschritt das In-Kontakt-Bringen der Kollagencarboxylgruppen mit einem Aktivierungsmittel umfaßt, das aus einem Carbodiimid, einem Azid, 1,1'-Carbonyldiimidazol, N,N'-Disuccinimidylcarbonat, 2-Ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydrochinolin und 1,2-Benzisoxazol-3-yl-diphenylphosphat, N-Ethyl-5-phenylisoxazolium-s'sulfonat sowie Mischungen davon ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 17, bei dem das Aktivierungsmittel ein Carbodiimid ist.
Verfahren nach Anspruch 18, bei dem das Carbodiimid zumindest teilweise wasserlöslich ist.
Verfahren nach Anspruch 20, bei dem das Carbodiimid 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid HCl ist.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, bei dem das Carbodiimid aus 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid HCl, Cyanamid, N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, N,N'-Diisopropylcarbodiimid, 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimidmetho-p-toluolsulfonat und Mischungen davon ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem der Aktivierungsschritt das In-Kontakt-Bringen der Kollagencarboxylgruppen mit einem Aktivierungsmittel in Gegenwart eines Stabilisators umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 22, bei dem der Stabilisisator aus N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxybenzotriazol, N-Hydroxy-5-norbornen-endo-2,3-dicarboximid, 4-Dimethylaminopyridin, den Sulfoderivaten von N-Hydroxysuccinimid und Mischungen davon ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 22, bei dem der Aktivierungsschritt das In-Kontakt-Bringen der Kollagencarboxylgruppen mit einem Carbodiimid und N-Hydroxysuccinimid umfaßt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem der Schritt der Umsetzung der Kollagencarboxylgruppen mit einem polyfunktionellen Spacer ihre Umsetzung mit einem Diaminspacer umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 25, bei dem der Diaminspacer hydrophil ist.
Verfahren nach Anspruch 26, bei dem der Diaminspacer aus Polyethylenglycolspacern, Polypropylenglycolspacern, Polyethylenpropylenglycolspacern und Mischungen davon ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, bei dem der hydrophile Diaminspacer durch die folgende allgemeine Formel: H2N–CH(CH3)–CH2–[OCH2CH(CH3)]x–(OCH2 CH2]y–[OCH2CH(CH3]Z–NH2 repräsentiert ist, in der x + z = 0–70 und y = 0–90.
Verfahren nach Anspruch 28, bei dem x + z = 0–35 und y = 0–45.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem der Schritt des In-Kontakt-Bringens dem Aktivierungsschritt vorangeht.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, bei dem das Material auf Kollagenbasis mit den deaktivierten Amingruppen über einen Zeitraum, der ausreicht, daß der Spacer das Material auf Kollagenbasis durchdringt, mit einem polyfunktionellen Spacer in Kontakt gebracht wird, und anschließend zumindest ein Teil der Kollagencarboxylgruppen des Materials auf Kollagenbasis für den polyfunktionellen Spacer aktiviert wird, um das Material auf Kollagenbasis zu vernetzen.
Bioprothesenvorrichtung, die ein vernetztes Material auf Kollagenbasis umfaßt, das nach einem der Ansprüche 1 bis 31 hergestellt worden ist.
Bioprothesenvorrichtung nach Anspruch 32, bei der die Vorrichtung eine Herzklappe ist.