-
Die
Erfindung bezieht sich auf eine sehr bemerkenswerte Verbesserung
des in vivo-Transfers von Nukleinsäuren oder von Nukleinsäuren, die
mit Produkten assoziiert sind, die erlauben, die Ausbeute von solchen Transfers
zu erhöhen,
in die Zellen der quergestreiften Muskeln und auf die Kombination
einer Nukleinsäure und
des Transferverfahrens gemäß der Erfindung
für deren
Verwendung für
die Gentherapie.
-
Der
Transfer von Genen in eine gegebene Zelle ist die Basis der Gentherapie.
Indessen besteht eines der Probleme darin, dahin zu gelangen, eine
ausreichende Nukleinsäuremenge
in Zellen des zu behandelnden Wirts eindringen zu lassen; tatsächlich muss
diese Nukleinsäure,
im allgemeinen ein Gen von Interesse, in transfizierten Zellen exprimiert
werden. Einer der Ansätze,
der in dieser Hinsicht herangezogen wird, ist die Integration der
Nukleinsäure
in virale Vektoren, insbesondere in Retroviren, Adenoviren oder
mit Adenoviren assoziierte Viren gewesen. Diese Systeme nutzen die
Mechanismen des Eindringens in Zellen, die von den Viren entwickelt
worden sind, wie auch deren Schutz gegen den Abbau aus. Indessen
weist dieser Ansatz Nachteile auf und insbesondere ein Risiko der
Produktion von infektiösen
Viruspartikeln, welche in der Lage sind, sich in dem Wirtsorganismus
zu verbreiten, und im Falle der retroviralen Vektoren ein Risiko
einer Insertionsmutagenese. Außerdem
bleibt das Insertionsvermögen
eines therapeutischen oder zu Impfzwecken dienenden Gens in ein
virales Genom beschränkt.
-
In
jedem fraglichen Fall erfordert die Entwicklung von viralen Vektoren,
die im Rahmen einer Gentherapie einsetzbar sind, auf komplexe Techniken
von defekten Viren und Komplementationszelllinien zurückzugreifen.
-
Ein
anderer Ansatz (Wolf et al., Science 247, 1465-68, 1990; Davis et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 7213-18, 1996) hat folglich
darin bestanden, in den Muskel oder in den Kreislauf eine Nukleinsäure von Plasmid-Natur
zu verabreichen, welche assoziiert ist oder nicht assoziert ist
mit Komponenten, die dazu bestimmt sind, die Transfektion durch
diese zu begünstigen,
wie Proteinen, Liposomen, geladenen Lipi den oder kationischen Polymeren,
wie Polyethylenimin, die in vitro gute Transfektionsmittel sind
(Behr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982-6, 1989; Felgner
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7, 1987; Boussif et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7297-301, 1995).
-
Seit
der anfänglichen
Veröffentlichung
von J.A. Wolff et al., welche die Fähigkeit des Muskelgewebes, in
Form von freiem Plasmid injizierte DNA zu inkorporieren (Wolff et
al., Science 247, 1465-1468, 1990) haben zahlreiche Autoren versucht,
diesen Prozess zu verbessern (Manthorpe et al., 1993, Human Gene
Ther. 4, 419-431; Wolff et al., 1991, BioTechniques 11, 474-485).
Aus diesen Versuchen treten einige Tendenzen in den Vordergrund,
wie insbesondere:
- • die Verwendung von mechanischen
Lösungen,
um den Eintritt der DNA in die Zellen zu erzwingen, indem die DNA
auf Kügelchen
adsorbiert wird, die dann in die Gewebe beschleunigt oder geschossen
werden („gene
gun") (Sanders Williams
et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2726-2730; Fynan et
al, 1993, BioTechniques 11, 474-485). Diese Verfahren haben sich
im Rahmen von Impfstrategien als wirksam erwiesen, erreichen aber
lediglich die oberflächlichen
Schichten der Gewebe. Im Falle des Muskels wird deren Verwendung
einen chirurgischen Zugang erfordern, um zu ermöglichen, den Muskel zu erreichen,
denn die Partikel durchdringen die kutanen Gewebe nicht;
- • die
Injektion von DNA, nicht mehr in Form von freiem Plasmid, sondern
assoziiert mit Molekülen,
die in der Lage sind, als Vehikel zu dienen, welche den Eintritt
der Komplexe in die Zellen vereinfachen. Die kationischen Lipide,
die in zahlreichen anderen Transfektionsverfahren eingesetzt werden,
haben sich, was eine Anwendung im Muskelgewebe angeht, bis heute
als enttäuschend
erwiesen, denn jene, die getestet wurden, haben sich als Inhibitoren
der Transfektion erwiesen (Schwartz et al., 1996, Gene Ther. 3, 405-411).
Das gleiche gilt für
die kationischen Peptide und Polymere (Manthorpe et al., 1993, Human
Gene Ther. 4, 419-431). Der einzige Fall einer günstigen Kombination scheint
die Mischung von Polyvinylalkohol oder Polyvinylpyrrolidon mit der
DNA zu sein. Die Erhöhung,
die aus diesen Kombinationen resultiert, stellt lediglich einen
Faktor unter 10 bezogen auf die nackt injizierte DNA dar (Mumper
et al., 1996, Pharmaceutical Research 13, 701-709);
- • die
Vorbehandlung des Muskels, in den die Injektion vorgenommen werden
soll, mit Lösungen,
die dazu bestimmt sind, die Diffusion und/oder die Stabilität der DNA
zu verbessern (Davis et al., 1993, Hum. Gene Ther. 4, 151-159) oder
den Eintritt der Nukleinsäuren
zu begünstigen,
beispielsweise die Induktion von Phänomenen einer Vermehrung oder
Regeneration von Zellen. Die Behandlungen haben insbesondere die Verwendung
von Lokalanästhetika
oder von Cardiotoxin, von Vasokonstriktoren, Endotoxin oder anderen Molekülen betroffen
(Manthorpe et al., 1993, Human Gene Ther. 4, 419-431; Danko et al.,
1994, Gene Ther. 1, 114-121; Vitadello et al., 1994, Hum. Gene Ther.
5, 11-18). Diese Vorbehandlungsprotokolle sind schwierig auszuführen, wobei
insbesondere Bupivacain erforderlich macht, um wirksam zu sein,
in Dosen sehr nahe an letalen Dosen injiziert zu werden. Die vorab
erfolgende Injektion von hyperosmotischer Saccharose, welche dazu
bestimmt ist, die Diffusion zu verbessern, erhöht des Transfektionsniveau
im Muskel nicht (Davis et al., 1993).
-
Die
Elektroporation oder Verwendung von elektrischen Feldern, um Zellen
zu permeabilisieren, wird gleichfalls in vitro eingesetzt, um die
Transfektion von Zellen in Kultur mit DNA zu begünstigen. Gleichwohl war bis
heute zugestanden worden, dass dieses Phänomen einem Effekt entspricht,
welcher von einem Schwellenwert abhängig ist, und dass diese Elektropermeabilisierung
lediglich bei elektrischen Feldern von relativ hoher Stärke, in
der Größenordnung
von 800 bis 1200 Volt/cm für
tierische Zellen, beobachtet werden kann. Diese Technik wurde gleichfalls
vorgeschlagen, um in vivo die Wirksamkeit von Antitumormitteln,
wie Bleomycin, in soliden Tumoren beim Menschen zu verbessern (amerikanisches
Patent Nr. 5 468 228, L.M. Mir). Mit Impulsen von sehr kurzer Dauer
(100 Mikrosekunden) sind diese elektrischen Bedingungen (800 bis
1200 Volt/cm) sehr gut für
den intrazellulären
Transfer von kleinen Molekülen
angepasst. Diese Bedingungen (Impulse von 100 Mikrosekunden) wurden
ohne Verbesserung für
den Transfer von Nukleinsäuren
in vivo in die Leber angewendet, wo Felder unter 1000 Volt/cm sich
als vollständig
unwirksam und sogar als inhibitorisch verglichen mit der Injektion
von DNA in Abwesenheit von elektrischen Impulsen erwiesen haben
(Patent WO 97/07826 und Heller et al., FEBS Letters, 389, 225-8,
1996).
-
Diese
Technik weist außerdem
Schwierigkeiten bei einer Anwendung in vivo auf, denn die Verabreichung
von Feldern einer solchen Intensität kann mehr oder weniger umfangreiche
Gewebeläsionen
hervorrufen, die kein Problem für
die Behandlung von Tumorgeweben darstellen, aber einen Hauptnachteil
für den
gesunden Patienten oder für
den kranken Patienten darstellen können, wenn die Nukleinsäure in andere
Gewebe als Tumorgewebe, insbesondere in den quergestreiften Muskel
verabreicht wird.
-
Die
Anmeldung WO 98/43702 beschreibt eine Methode zur Einführung von
pharmazeutischen Verbindungen und von Nukleinsäuren in den Skelettmuskel unter
Verwendung eines Stroms, der aus zweipoligen Wellen gebildet wird.
-
Wohingegen
alle aufgeführten
Untersuchungen die Notwendigkeit von hohen elektrischen Feldern,
in der Größenordnung
von 1000 Volt/cm, erwähnen,
um in vivo wirksam zu sein, haben die Anmelder auf wahrhaft unerwartete
und bemerkenswerte Weise jetzt gezeigt, dass der Transfer von Nukleinsäuren in
Muskeln in vivo auf sehr bedeutende Weise ohne unerwünschte Wirkungen
erhöht
werden könnte,
indem der Muskel elektrischen Impulsen von einpoligen Wellen von
geringer Intensität,
beispielsweise von 100 oder 200 Volt/cm, und einer relativ langen
Dauer unterworfen wird. Außerdem
haben die Anmelder festgestellt, dass die große Variabilität der Expression
des Transgens, die im Stand der Technik bezüglich des Transfers von DNA
in den Muskel beobachtet worden war, durch das erfindungsgemäße Verfahren
bemerkenswert verringert wird.
-
Aus
diesem Grund betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Transfer von
Nukleinsäuren
in einen oder mehrere quergestreifte Muskeln in vivo, in welchem
die Zellen der Muskeln mit der zu transferierenden Nukleinsäure durch
direkte Verabreichung in das Gewebe oder durch topische oder systemische
Verabreichung in Kontakt gebracht werden und in welchem der Transfer
durch Anwendung von einem oder mehreren elektrischen Impulsen von
einpoligen Wellen mit einer Intensität zwischen 1 und 800 Volt/cm
auf die Muskeln sichergestellt wird.
-
Die
Intensität
des Felds liegt vorzugsweise zwischen 4 und 400 Volt/cm und die
gesamte Dauer der Anwendung liegt über 10 Millisekunden. Die Anzahl
von eingesetzten Impulsen beträgt
beispielsweise 1 bis 100000 Impulse und die Frequenz der Impulse
liegt zwischen 0,1 und 1000 Hertz. Die Frequenz der Impulse liegt
vorzugsweise zwischen 0,2 und 100 Hertz. Die Impulse können auch
auf unregelmäßige Weise
abgegeben werden und die Funktion, welche die Intensität des Felds
in Abhängigkeit
von der Zeit beschreibt, kann variabel sein. Als Beispiel kann das
abgegebene elektrische Feld aus der Kombination von wenigstens einem Feld
mit einer Intensität
von > 400 V/cm und
vorzugsweise zwischen 500 und 800 Volt/cm mit einer kurzen Einheitsdauer
(< 1 ms), gefolgt
von einem oder mehreren Impulsen von geringerer Intensität, beispielsweise < 400 Volt/cm und
vorzugsweise < 200
Volt/cm und mit einer längeren
Einheitsdauer (> 1
ms), resultieren. Das Integral der Funktion, welche die Variation
des elektrischen Felds mit der Zeit beschreibt, beträgt über 1 kV × ms/cm.
Gemäß einer
bevorzugten Weise der Erfindung liegt dieses Integral über oder
bei 5 kV × ms/cm.
-
Gemäß einer
bevorzugten Weise der Erfindung liegt die Feldstärke der Impulse zwischen 30
und 300 Volt/cm.
-
Die
elektrischen Impulse, beispielsweise mit Rechteckwellen, sind Impulse
von einpoligen oszillierenden Wellen von begrenzter Dauer.
-
Die
Verabreichung von elektrischen Impulsen kann durch eine jegliche
Methode, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt ist, erfolgen,
beispielsweise:
- • System von äußerlichen
Elektroden, welche auf beiden Seiten des zu behandelnden Gewebes
plaziert werden, insbesondere nicht-invasive Elektroden, die in
Kontakt mit der Haut plaziert sind,
- • System
von in die Gewebe implantierten Elektroden,
- • System
von Elektroden/Injektionsgerät,
welches die gleichzeitige Verabreichung der Nukleinsäuren und des
elektrischen Felds erlaubt.
-
Im
Rahmen der Erfindung müssen
die Ausdrücke
Transfer von DNA oder von Nukleinsäuren durch Anwendung von einem
oder mehreren elektrischen Impulsen wie auch die Ausdrücke Elektrotransfer
oder ferner Elektrotransfektion als äquivalent angesehen werden
und bezeichnen den Transfer von Nukleinsäuren oder von DNA durch die
Anwendung oder in Gegenwart eines elektrischen Felds.
-
Da
die Verabreichung in vivo erfolgt, ist es manchmal erforderlich,
auf Zwischenprodukte zurückzugreifen,
welche die elektrische Kontinuität
mit äußerlichen,
nicht invasiven Elektroden sicherstellen. Es wird sich beispielsweise
um Elektrolyt in Form eines Gels handeln.
-
Die
Nukleinsäuren
können
durch ein jegliches geeignetes Mittel verabreicht werden, werden
aber vorzugsweise in vivo direkt in den Muskel injiziert oder durch
einen anderen Weg, lokal oder systemisch, verabreicht, der diese
an dem Anwendungsort des elektrischen Felds verfügbar macht. Die Nukleinsäuren können mit
Mitteln verabreicht werden, die den Transfer erlauben oder vereinfachen,
wie dies zuvor erwähnt
worden ist. Insbesondere können
diese Nukleinsäuren
frei in Lösung
vorliegen oder mit synthetischen Mitteln assoziiert sein oder in
viralen Vektoren enthalten sein. Die synthetischen Mittel können Lipide
oder Polymere, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind,
oder ebenso weiterhin Targeting-Elemente, welche die Anheftung an
die Membran der Zielgewebe erlauben, sein. Unter diesen Elementen
kann man Vektoren, die Zucker, Peptide, Antikörper oder Hormonrezeptoren
enthalten, aufführen.
-
Es
versteht sich, dass unter diesen Bedingungen der Erfindung die Verabreichung
der Nukleinsäuren der
Anwendung der elektrischen Felder vorausgehen, gleichzeitig mit
dieser erfolgen oder dieser sogar folgen kann.
-
Aus
diesem Grund hat die Erfindung gleichfalls eine Nukleinsäure und
ein elektrisches Feld mit einer Intensität zwischen 1 und 800 Volt/cm
als Kombinationsprodukt für
deren gleichzeitige, getrennte oder zeitlich gestaffelte Verabreichung
an den quergestreiften Muskel in vivo zum Gegenstand. Die Intensität des Felds
liegt vorzugsweise zwischen 4 und 400 Volt/cm, noch mehr bevorzugt
liegt die Intensität
des Felds zwischen 30 und 300 Volt/cm.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
ist in der Gentherapie einsetzbar, d.h. der Therapie, bei welcher
die Expression eines transferierten Gens, aber gleichfalls die Modulation
oder die Blockierung eines Gens erlaubt, die Behandlung einer speziellen
Pathologie sicherzustellen.
-
Die
Muskelzellen werden vorzugsweise mit dem Ziel einer Gentherapie
behandelt, welche erlaubt:
- • entweder die Korrektur der
Dysfunktionen der Muskelzellen selbst (beispielsweise für die Behandlung
von Myopathien oder Muskeldystrophien, die mit genetischen Defekten
verbunden sind),
- • oder
den Schutz und/oder die Regeneration der Vaskularisation oder der
Innervierung des Muskels oder anderer Muskeln oder Organe durch
trophische, neurotrophische und angiogenetische Faktoren, welche durch
das Transgen produziert werden,
- • oder
die Umwandlung des Muskels in ein Organ, welches Produkte sezerniert,
die zu einer therapeutischen Wirkung führen, wie das Produkt des Gens
selbst (beispielsweise Thrombose und Hämostase regulierende Faktoren,
trophische Faktoren, Hormone, wie Insulin, oder andere) oder wie
ein aktiver Metabolit, der im Muskel dank der Hinzufügung des
therapeutischen Gens synthetisiert wird,
- • oder
eine Impfanwendung oder immunstimulierende Anwendung.
-
Ein
anderer Gegenstand der Erfindung ist die Kombination der elektrischen
Impulse eines Felds mit Zusammensetzungen, die Nukleinsäuren enthalten,
die in Hinblick auf eine jegliche Verabreichung, welche erlaubt,
Zugang zu einem quergestreiften Muskel zu haben, auf topischem,
kutanem, oralem, vaginalem, parenteralem, intranasalem, intravenösem, intramuskulärem, subkutanem,
intraokularem, transdermalem u.s.w. Wege formuliert sind. Die pharmazeutischen
Zusammensetzungen der Erfindung enthalten vorzugsweise einen pharmazeutisch
annehmbaren Träger
oder ein pharmazeutisch annehmbares Vehikel, welcher bzw. welches
für eine
injizierbare Formulierung, insbesondere für eine direkte Injektion auf
der Ebene des gewünschten Organs,
oder für
eine jegliche andere Verabreichung annehmbar ist. Es kann sich insbesondere
um sterile, isotonische Lösungen
oder um trockene, insbesondere lyophilisierte Zusammensetzungen
handeln, die durch Zugabe von sterilisiertem Wasser oder physiologischer
Kochsalzlösung
je nach Fall die Konstituierung von injizierbaren Lösungen erlauben.
Die Nukleinsäure dosen,
die für
die Injektion eingesetzt werden, wie auch die Anzahl von Verabreichungen
und das Volumen der Injektionen können abhängig von verschiedenen Parametern
und insbesondere abhängig
von der eingesetzten Verabreichungsweise, der betreffenden Pathologie,
des zu exprimierenden Gens oder ferner der Dauer der angestrebten
Behandlung angepasst werden.
-
Die
Nukleinsäuren
können
synthetischen oder biosynthetischen Ursprungs sein oder aus Viren
oder prokaryotischen Zellen oder eukaryotischen Zellen, die von
einzelligen Organismen (beispielsweise Hefen) oder mehrzelligen
Organismen stammen, extrahiert werden. Sie können in Kombination mit der
Gesamtheit oder einem Teil der Komponenten des Herkunftsorganismus
und/oder des Synthesesystems verabreicht werden.
-
Die
Nukleinsäure
kann eine Desoxyribonukleinsäure
oder eine Ribonukleinsäure
sein. Es kann sich um Sequenzen natürlicher oder künstlicher
Herkunft und insbesondere um genomische DNA, cDNA, mRNA, tRNA und
rRNA, hybride Sequenzen oder synthetische oder halbsynthetische
Sequenzen von modifizierten oder nicht-modifizierten Oligonukleotiden
handeln. Diese Nukleinsäuren
können
durch eine jegliche Technik erhalten werden, die den Fachleuten
auf diesem Gebiet bekannt ist, und insbesondere durch Screenen von Banken,
durch chemische Synthese oder ferner durch gemischte Methoden, welche
die chemische oder enzymatische Modifizierung von Sequenzen, die
durch Screenen von Banken erhalten worden sind, umfassen. Sie können chemisch
modifiziert werden.
-
Insbesondere
kann die Nukleinsäure
eine Sinn- oder Antisinn-DNA oder -RNA oder mit katalytischer Aktivität, wie ein
Ribozym, sein. Unter „Antisinn" versteht man eine
Nukleinsäure
mit einer Sequenz, die komplementär zu einer Zielsequenz ist,
beispielsweise eine mRNA-Sequenz, deren Expression man durch Hybridisierung
an die Zielsequenz blockieren möchte.
Unter „Sinn" versteht man eine
Nukleinsäure
mit einer Sequenz, die homolog oder identisch zu einer Zielsequenz
ist, beispielsweise eine Sequenz, die an einen proteinartigen und
an der Expression eines gegebenen Gens beteiligten Transkriptionsfaktor
bindet. Gemäß einer bevorzugten
Ausführungweise
umfasst die Nukleinsäure
ein Gen von Interesse und Elemente, die die Expression des Gens
von Interesse erlauben. Das Nukleinsäurefragment liegt vorteilhafterweise
in Form eines Plasmids vor.
-
Die
Desoxyribonukleinsäuren
können
einzel- oder doppelsträngig
sein ebenso wie kurze Oligonukleotide oder längere Sequenzen. Sie können therapeutische
Gene, die Transkription oder die Replikation regulierende Sequenzen
oder Regionen für
eine Bindung an andere Zellbestandteile u.s.w. enthalten. Im Sinne
der Erfindung versteht man unter „therapeutischem Gen" insbesondere ein
jegliches Gen, welches eine RNA oder ein proteinartiges Produkt
mit einer therapeutischen Wirkung kodiert. Das proteinartige Produkt
kodiert vielleicht ein Protein, ein Peptid u.s.w. Dieses proteinartige
Produkt kann gegenüber
der Zielzelle homolog sein (d.h. ein Produkt, das in der Zielzelle
normalerweise exprimiert wird, wenn jene keinerlei Pathologie aufweist). In
diesem Falle erlaubt die Expression des Transgens beispielsweise,
eine unzureichende Expression in der Zelle oder die Expression eines
aufgrund einer Modifikation inaktiven oder schwach aktiven Proteins
zu beheben oder erlaubt ferner, das Protein überzuexprimieren. Das therapeutische
Gen kann auch eine Mutante eines zellulären Proteins mit einer erhöhten Stabilität, einer
modifizierten Aktivität
u.s.w. kodieren. Das proteinartige Produkt kann gleichfalls gegenüber der
Zielzelle heterolog sein. In diesem Falle kann ein exprimiertes Protein
beispielsweise eine fehler- oder mangelhafte Aktivität in der
Zelle komplettieren oder bereitstellen (Behandlung von Myopathien/Muskeldystrophien
oder Enzymdefekten oder -mängeln)
oder ermöglichen,
gegen eine Pathologie zu kämpfen
oder eine Immunantwort zu stimulieren.
-
Unter
den therapeutischen Produkten im Sinne der Erfindung kann man insbesondere
die Gene aufführen,
die kodieren für
- – die
Enzyme, wie a-1-Antitrypsin, die Proteinasen
(Metalloproteinasen,
Urokinase, uPA, tPA, ... Streptokinase), die Proteasen, die Vorstufen
spalten, um aktive Produkte (ACE, ICE, ...) oder deren Antagonisten
(TIMP-1, Gewebeplasminogenaktivator-Inhibitor PAI, TFPI, freizusetzen,
- – die
Blutderivate, wie die an der Gerinnung beteiligten Faktoren:
Faktoren
VII, VIII, IX, die Komplementfaktoren, Thrombin,
- – die
Hormone oder die Enzyme, die an dem Syntheseweg der Hormone beteiligt
sind, oder die Faktoren, die an der Kontrolle der Synthese oder
der Exkretion oder der Sekretion der Hormone beteiligt sind, wie Insulin,
Insulin nahe stehende Faktoren (IGF), oder Wachstumshormon, ACTH,
die Enzyme der Synthese der Sexualhormone,
- – die
Lymphokine und Zytokine: Interleukine, Chemokine (CXC und CC), Interferone,
TNF, TGF, chemotaktische Faktoren oder Aktivatoren, wie MIF, MAF,
PAF, MCP-1, Eotaxin, LIF u.s.w. (französisches Patent Nr. 92 03120),
- – die
Wachstumsfaktoren, beispielsweise die IGF, EGF, FG F, KGF, NGF,
PDGF, PIGF, HGF, Proliferin,
- – die
angiogenetischen Faktoren, wie VEGF oder FG F, Angiopoietin 1 oder
2, Endothelin,
- – die
Enzyme der Synthese von Neurotransmittern,
- – die
trophischen, insbesondere neurotrophischen Faktoren für die Behandlung
von neurodegenerativen Erkrankungen, von Traumatismen, die dem Nervensystem
Schaden zugefügt
haben, oder von retinalen Degenerationen, wie die Mitglieder der
Familie der Neurotrophine, wie NGF, BDNF, NT3, NT4/5, NT6, deren Derivate
und verwandte Gene – die
Mitglieder der Familien des CNTF, wie CNTF, Axokin, LIF und dessen Derivate – IL6 und
dessen Derivate – Cardiotrophin
und dessen Derivate – GDNF
und dessen Derivate – die
Mitglieder der Familie der IGF, wie IGF-1, IFGF-2 und deren Derivate – die Mitglieder
der Familie der FG F, wie FGF 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 und deren
Derivate, TGFb,
- – die
Knochenwachstumsfaktoren,
- – die
hämopoetischen
Faktoren, wie Erythropoietin, GM-CSF, M-CSF, LIF u.s.w.,
- – die
Proteine der zellulären
Architektur, wie Dystrophin oder ein Minidystrophin (französisches
Patent Nr. 91 11947), die Suizid-Gene (Thymidinkinase, Cytosindesaminase,
Enzyme mit Cytochrom P450), die Gene von Hämoglobin und von anderen proteinartigen
Transportmolekülen,
- – die
Gene, welche den Proteinen entsprechen, welche an dem Stoffwechsel
der Lipide beteiligt sind, vom Typ Apolipoprotein, ausgewählt unter
den Apolipoproteinen A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E,
F, G, H, J und apo(a), die Enzyme des Stoffwechsels, wie beispielsweise
die Lipasen, Lipoprotein-Lipase, hepatische Lipase, Lecithin-Cholesterol-Acyltransferase,
7-alpha-Cholesterolhydroxylase, Phosphatidylsäurephosphatase oder ferner
Proteine, die für
den Transfer von Lipiden zuständig
sind, wie das für
den Transfer der Cholesterolester zuständige Protein und das für den Transfer
der Phospholipide zuständige
Protein, ein Bindungsprotein der HDL oder ferner ein Rezeptor, der
beispielsweise unter den Rezeptoren für die LDL, den Rezeptoren der
Chylomikronen-Überreste
(„Remnants") und den Scavenger-Rezeptoren
u.s.w. ausgewählt
wird. Man kann außerdem
Leptin für
die Behandlung von Obesität
zusetzen.
- – die
Faktoren, welche den Blutdruck regulieren, wie die an dem NO-Stoffwechsel beteiligten
Enzyme, Angiotensin, Bradykinin, Vasopressin, ACE, Renin, die Enzyme,
die die Mechanismen der Synthese oder des Ausstoßes („relargage") der Prostaglandine, von Thromboxan
oder von Adenosin kodieren, die Rezeptoren von Adenosin, die Kallikreine
und Kallistatine, ANP, ANF, die diuretischen oder antidiuretischen
Faktoren, die an der Synthese, dem Stoffwechsel oder dem Ausstoß der Mediatorsubstanzen,
wie Histamin, Serotonin, den Katecholaminen und den Neuropeptiden,
beteiligten Faktoren,
- – die
anti-angiogenetischen Faktoren, wie der Ligand von Tie-1 und von
Tie-2, Angiostatin, der Faktor ATF, die Derivate von Plasminogen,
Endothelin, die Thrombospondine 1 und 2, PF-4, Interferon a oder
b, Interleukin 12, TNFa, der Rezeptor der Urokinase, flt1, KDR,
PAI1, PAI2, TIMP1, das Prolactin-Fragment,
- – die
gegen Apoptose schützenden
Faktoren, wie die AKT-Familie,
- – die
Proteine, die in der Lage sind, einen Zelltod zu induzieren, die
entweder durch sich selbst aktiviert werden, wie die Caspasen, oder
vom „Pro-Drug"-Typ, welche eine
Aktivierung durch andere Faktoren erfordern, oder die Proteine,
die Pro-Drugs aktivieren zu einem Mittel, welches einen Zelltod
hervorruft, wie die Thymidinkinase des Herpes-Virus, die Desaminasen,
welche insbesondere ermöglichen,
die Anti-Krebs-Therapien mit in Betracht zu ziehen,
- – die
an den interzellulären
Kontakten und der interzellulären
Adhäsion
beteiligten Proteine: VCAM, PECAM, ELAM, ICAM, Integrine, Cathenine,
- – die
Proteine der extrazellulären
Matrix,
- – die
an der Wanderung von Zellen beteiligten Proteine,
- – die
Proteine vom Signaltransduktionstyp, FAK-Typ, MEKK, p38-Kinase,
Tyrosinkinasen, Serin-Threonin-Kinasen,
- – die
an der Regulation des Zellzyklus beteiligten Proteine (p21, p16,
Cycline, ...) wie auch die mutierten oder abgeleiteten dominant
negativen Proteine, die den Zellzyklus blockieren und gegebenenfalls
die Apoptose induzieren können,
- – die
Transkriptionsfaktoren: jun, fos, AP1, p53, ... und die Proteine
der p53-Signalkaskade,
- – die
für die
Struktur der Zelle verantwortlichen Proteine, wie die intermediären Filamente
(Vimentin, Desmin, Keratine), Dystrophin, die an der muskulären Kontraktionsfähigkeit
und der Kontrolle der muskulären Kontraktionsfähigkeit
beteiligten Proteine, insbesondere die an dem Calciumstoffwechsel
und dem Calcium-Fluss in den Zellen beteiilgten Proteine (SERCA,
...).
-
Im
Falle von Proteinen, die durch Ligand-und-Rezeptor-Systeme wirken,
kann in Betracht gezogen werden, den Liganden oder den Rezeptor
(Bsp. FGF-R, VEGF-R, ...) einzusetzen. Man kann gleichfalls Gene aufführen, die
Fragmente oder Mutanten von Proteinen von Liganden oder Rezeptoren,
insbesondere der vorerwähnten
Proteine, kodieren, die entweder eine höhere Aktivität als das
vollständige
Protein oder eine Antagonisten-Aktivität, ja sogar vom „dominant
negativen" Typ bezogen
auf das Ausgangsprotein aufweisen (beispielsweise Fragmente von
Rezeptoren, die die Verfügbarkeit
von zirkulierenden Proteinen hemmen, die assoziiert sind oder nicht
assoziiert sind mit Sequenzen, die eine Sekretion dieser Fragmente
gegenüber
einer Verankerung in der Zellmembran induzieren, oder von anderen
für die
Modifikation des intrazellulären
Verkehrs von diesen Ligand-Rezeptor-Systemen zuständigen Systemen
derart, dass die Verfügbarkeit
von einem der Elemente umgeleitet wird), oder sogar eine eigene
Aktivität,
welche sich von jener des vollständigen
Proteins (Bsp. ATF) unterscheidet, aufweist.
-
Unter
den anderen Proteinen oder Peptiden, die durch den Muskel sekretiert
werden können,
ist es wichtig, die Antikörper,
die variablen einzelkettigen Antikörperfragmente (ScFv) oder ein
jegliches anderes Antikörperfragment,
welches Erkennungsfähigkeiten
aufweist für
dessen Einsatz in der Immuntherapie, beispielsweise für die Behandlung
von Infektionskrankheiten, von Tumoren, von Autoimmunerkrankungen,
wie multipler Sklerose (Antiidiotyp-Antikörper), wie auch die ScFv, die
sich an die proinflammatorischen Zytokine, wie beispielsweise IL1
und TNFa, binden, für
die Behandlung von rheumatoider Arthritis mit Nachdruck aufzuführen. Andere
Proteine von Interesse sind, nicht erschöpfend, lösliche Rezeptoren, wie beispielsweise
der lösliche CD4-Rezeptor und der
lösliche
TNF-Rezeptor für
die anti-HIV-Therapie, der TNFα-Rezeptor
oder der lösliche IL1-Rezeptor
für die
Behandlung von rheumatoider Arthritis, der lösliche Acetylcholinrezeptor
für die
Behandlung von Myasthenie; Substrat- oder Inhibitorpeptide von Enzymen
oder ebenso Agonisten- oder Antagonistenpeptide von Rezeptoren oder
von Adhäsionsproteinen,
wie beispielsweise für
die Behandlung von Asthma, von Thrombosen, von Restenose, Metastasen
oder Entzündungen;
künstliche,
chimäre
oder verkürzte
Proteine. Unter den Hormonen von wesentlichem Interesse kann man
Insulin im Falle von Diabetes, Wachstumshormon und Calcitonin aufführen. Man
kann ferner Proteine aufführen,
die in der Lage sind, eine Antitumor-Immunität zu induzieren oder die Immunantwort
zu stimulieren (IL2, GM-CSF, IL12 u.s.w.). Schließlich kann
man die Zytokine aufführen,
die die TH1-Antwort verringern, wie IL10,
IL4 und IL13.
-
Die
zahlreichen Beispiele, die vorausgegangen sind, und jene, die folgen,
veranschaulichen den potentiellen Umfang des Anwendungsbereichs
der Erfindung.
-
Die
therapeutische Nukleinsäure
kann gleichfalls ein Gen oder eine Antisinn-Sequenz sein, dessen bzw.
deren Expression in der Zielzelle erlaubt, die Expression von Genen
oder die Transkription von zellulären mRNAs zu kontrollieren.
Solche Sequenzen können
beispielsweise in der Zielzelle in RNA, die zu zellulären mRNAs
komplementär
ist, transkribiert werden und so deren Translation in Protein gemäß der in
dem Europäischen
Patent Nr. 140 308 beschriebenen Technik blockieren. Die therapeutischen
Gene umfassen gleichfalls die Sequenzen, die Ribozyme kodieren,
die in der Lage sind, selektiv Ziel-RNAs zu zerstören (Europäisches Patent
Nr. 321 201).
-
Wie
weiter oben angegeben, kann die Nukleinsäure gleichfalls ein oder mehrere
Gene umfassen, die ein Antigen-Peptid kodieren, welches in der Lage
ist, in dem Menschen oder dem Tier eine Immunantwort zu erzeugen.
Bei dieser besonderen Ausführungsweise
erlaubt die Erfindung folglich die Realisierung entweder von Impfstoffen
oder von immunthe rapeutischen Behandlungen, die auf den Menschen
oder das Tier angewendet werden, insbesondere gegen Mikroorganismen,
Viren oder Krebserkrankungen. Es kann sich insbesondere um Antigen-Peptide,
die für
das Epstein-Barr-Virus, das HIV-Virus, das Hepatitis B-Virus (Europäisches Patent
Nr. 185 573), das Pseudotollwutvirus, das „syncitia forming virus", andere Viren spezifisch
sind, oder ferner um für
Tumore spezifische Antigene, wie die Proteine MAGE (Europäisches Patent
Nr. 259 212), wie die Proteine MAGE 1, MAGE 2, oder Antigene, die
eine Antitumor-Antwort stimulieren können, wie bakterielle Heat-shock-Proteine,
handeln.
-
Die
Nukleinsäure
umfasst vorzugsweise gleichfalls Sequenzen, die die Expression des
therapeutischen Gens und/oder des Gens, welches das Antigen-Peptid
kodiert, in dem Muskel erlauben und/oder begünstigen. Es kann sich um Sequenzen
handeln, die von Natur aus für
die Expression des betreffenden Gens verantwortlich sind, wenn diese
Sequenzen in der Lage sind, in der transfizierten Zelle zu funktionieren.
Es kann sich gleichfalls um Sequenzen von unterschiedlicher Herkunft
handeln (die für
die Expression von anderen Proteinen verantwortlich oder sogar synthetisch
sind). Es kann sich insbesondere um Promotorsequenzen von eukaryotischen
oder viralen Genen handeln. Es kann sich beispielsweise um Promotorsequenzen
handeln, die aus dem Genom der Zelle, die man zu transfizieren wünscht, stammen.
Unter den eukaryotischen Promotoren kann man einen jeglichen Promotor
oder eine jegliche abgeleitete Sequenz einsetzen, der bzw. die die
Transkription eines Gens auf spezifische oder nicht spezifische
Weise, stark oder schwach stimuliert oder unterdrückt. Es
kann sich insbesondere um ubiquitäre Promotoren (HPRT; Vimentin,
a-Aktin, Tubulin u.s.w.), um Promotoren von therapeutischen Genen
(Typ MDR, CFTR u.s.w.), um gewebespezifische Promotoren (Typ Promotoren
der Gene von Desmin, den Myosinen, der Kreatinkinase, der Phosphoglyceratkinase) oder
ferner um Promotoren, die auf einen Stimulus ansprechen, wie Promotoren,
die auf die natürlichen
Hormone ansprechen (Steroidhormonrezeptor, Retinsäurerezeptor
u.s.w.), oder um einen Promotor, der durch die Antibiotika (Tetracyclin,
Rapamycin u.s.w.) reguliert wird, um Promotoren, die auf eine Diät ansprechen,
wie die Promotoren, die auf Ballaststoffe ansprechen, oder um andere
Promotoren, welche auf andere Moleküle natürlichen oder synthetischen
Ursprungs ansprechen, handeln. Es kann sich ebenso um Promotorsequenzen handeln,
die aus dem Genom eines Virus stammen. In dieser Hinsicht kann man
beispielsweise die Promotoren der EIA-Gene des Adenovirus, MLP oder
die Promotoren, die aus den Genomen der Viren CMV, RSV, SV40 u.s.w.
stammen, aufführen.
Es kann sich um induzierbare oder reprimierbare Promotoren handeln.
Außerdem
können
diese Expressionssequenzen durch Hinzufügung von Aktivierungssequenzen
und Regulationssequenzen, die eine konditionale, vorübergehende/transitorische
Expression, eine gewebespezifische oder hauptsächliche Expression u.s.w. erlauben,
modifiziert werden.
-
Außerdem kann
die Nukleinsäure
gleichfalls, insbesondere stromaufwärts von dem therapeutischen Gen,
eine Signalsequenz umfassen, die das synthetisierte therapeutische
Produkt in die Sekretionswege der Zielzelle dirigiert. Diese Signalsequenz
kann die natürliche
Signalsequenz des therapeutischen Produkts sein, es kann sich aber
gleichfalls um eine jegliche andere funktionsfähige Signalsequenz oder um
eine künstliche Signalsequenz
handeln. Die Nukleinsäure
kann gleichfalls eine Signalsequenz umfassen, die das synthetisierte
therapeutische Produkt in Richtung eines speziellen Kompartiments
der Zelle, wie beispielsweise die Peroxisomen, die Lysosomen und
die Mitochondrien für
die Behandlung von beispielsweise genetisch bedingten mitochondrialen
Erkrankungen, dirigiert.
-
Andere
Gene, für
welche ein Interesse besteht, wurden insbesondere durch McKusick,
V.R. Mendelian (Inheritance in man, catalogs of autosomal dominant,
autosomal recessive, and X-linked phenotypes. B. Auflage. John Hopkins
University Press (1988)), und in Stanbury, J.B., et al. (The metabolic
basis of inherited disease, 5. Auflage. McGraw-Hill (1983)) beschrieben. Die Gene von
Interesse decken die Proteine, die am Stoffwechsel der Aminosäuren, der
Lipide und anderer Bestandteile der Zelle beteiligt sind, mit ab.
-
Man
kann so nicht einschränkend
die Gene aufführen,
die mit Krankheiten des Stoffwechsels der Kohlenhydrate in Verbindung
stehen, wie beispielsweise Fructose-1-phosphataldolase, Fructose-1,6-diphosphatase, Glucose-6-phosphatase,
lysosomale a-1,4-Glucosidase, Amylo-1,6-glucosidase, Amylo-(1,4:1,6)-transglucosidase,
muskuläre
Phosphorylase, muskuläre
Phosphofructokinase, Phosphorylase-b-kinase, Galactose-1-phosphaturidyltransferase,
alle Enzyme des Pyruvatdehydrogenase-Komplexes, Pyruvatcarboxylase, 2-Oxoglutaratglyoxylasecarboxylase,
D-Glyceratdehydrogenase.
-
Man
kann gleichfalls aufführen:
- – die
mit Krankheiten des Stoffwechsels der Aminosäuren in Verbindung stehenden
Gene, wie beispielsweise Phenylalaninhydroxylase, Dihydrobiopterinsynthetase,
Tyrosinaminotransferase, Tyrosinase, Histidinase, Fumarylacetoacetase,
Glutathionsynthetase, g-Glutamylcysteinsynthetase,
Ornithin-d-aminotransferase, Carbamoylphosphatsynthetase, Ornithincarbamoyltransferase,
Argininosuccinatsynthetase, Argininosuccinatlyase, Arginase, L-Lysindehydrogenase,
L-Lysinketoglutaratreductase,
Valintransaminase, Leucin-Isoleucin-Transaminase, Decarboxylase der 2-Ketosäuren mit
verzweigter Kette, Isovaleryl-CoA-dehydrogenase, Acyl-CoA-dehydrogenase,
3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA-lyase,
Acetoacetyl-CoA-3-ketothiolase, Propionyl-CoA-carboxylase, Methylmalonyl-CoA-mutase,
ATP:Cobalaminadenosyltransferase, Dihydrofolatreductase, Methylentetrahydrofolatreductase,
Cystathionin-b-synthetase, der Sarcosindehydrogenase-Komplex, die Proteine,
die zu dem System der Spaltung von Glycin gehören, b-Alanintransaminase,
Serum-Carnosinase, zerebrale Homocarnosinase;
- – die
Gene, die mit Krankheiten des Stoffwechsels der Fette und der Fettsäuren in
Verbindung stehen, wie beispielsweise Lipoproteinlipase, Apolipoprotein
C-II, Apolipoprotein E, andere Apolipoproteine, Lecithin-Cholesterol-Acyltransferase,
der Rezeptor der LDL, Sterolhydroxylase aus der Leber, „Phytansäure"-a-hydroxylase;
- – die
Gene, die mit lysosomalen Defekten in Verbindung stehen, wie beispielsweise
lysosomale a-L-Iduronidase, lysosomale Iduronatsulfatase, lysosomale
Heparan-N-sulfatase, lysosomale N-Acetyl-a-D-glucosaminidase, lysosomale Acetyl-CoA:a-Glucosamin-N-acetyltransferase,
lysosomale N-Acetyl-a-D-glucosamin-6-sulfatase, lysosomale Galactosamin-6-sulfatsulfatase,
lysosomale b-Galactosidase,
lysosomale Arylsulfatase B, lysosomale b-Glucuronidase, N-Acetylglucosaminylphosphotransferase,
lysosomale a-D-Mannosidase,
lysosomale a-Neuraminidase, lysosomale Aspartylglycosaminidase,
lysosomale a-L-Fucosidase, lysosomale saure Lipase, lysosomale saure
Ceramidase, lysosomale Sphingomyelinase, lysosomale Glucocerebrosidase
und lysosomale Galactocerebrosidase, lysosomale Galactosylceramidase,
lysosomale Arylsulfatase A, a-Galactosidase A, lysosomale saure
b-Galactosidase, Kette a von lysosomaler Hexosaminidase A.
-
Man
kann gleichfalls nicht einschränkend
die Gene aufführen,
die mit den Krankheiten des Stoffwechsels der Steroide und der Lipide
in Verbindung stehen, die Gene, die mit Krankheiten des Stoffwechsels
der Purine und der Pyrimidine in Verbindung stehen, die Gene, die
mit Krankheiten des Stoffwechsels des Porphyrins und des Häms in Verbindung
stehen, die Gene, die mit Krankheiten des Stoffwechsels des Bindegewebes, der
s und der Knochen in Verbindung stehen, wie auch die Gene, die mit
Krankheiten des Bluts und der hämopoetischen
Organe, der Muskeln (Myopathie), des Nervensystems (neurodegenerative
Erkrankungen) oder des Kreislaufapparats (beispielsweise Behandlung
der Ischämien
und der Stenose) in Verbindung stehen, und die Gene, die an genetisch
bedingten mitochondrialen Erkrankungen beteiligt sind.
-
In
dem erfindungsgemäßen Verfahren
kann die Nukleinsäure
mit einer jeglichen Art von Vektoren oder einer jeglichen Kombination
dieser Vektoren, welche erlauben, den Transfer von Genen zu verbessern,
kombiniert werden, beispielsweise, nicht einschränkend, mit Vektoren, wie Viren,
synthetischen oder biosynthetischen Agentien (beispielsweise lipidartigen,
polypeptidartigen, glycosidischen oder polymeren) oder ferner beschleunigten
oder nicht beschleunigten Kugeln. Die Nukleinsäuren können auch in einen Muskel injiziert
werden, der einer Behandlung unterzogen worden ist, welche darauf
abzielt, den Transfer von Genen zu verbessern, beispielsweise einer
Behandlung von pharmakologischer Natur unter lokaler oder systemischer
Anwendung oder einer enzymatischen, permeabilisierenden (Verwendung
von grenzflächenaktiven
Mitteln), chirurgischen, mechanischen, thermischen oder physikalischen
Behandlung.
-
Der
Vorteil der Verwendung des Muskels im Rahmen einer Gentherapie beruht
auf zahlreichen Faktoren: • der
bemerkenswerten Stabilität
der Expression der Transgene für
mehr als mehrere Monate, welche folglich die stabile und anhaltende Produktion
eines intramuskulären
oder sezernierten therapeutischen Proteins erlaubt,
- • der
Leichtigkeit des Zugangs zum Muskelgewebe, welche eine direkte,
schnelle und nicht gefährliche
Verabreichung in ein nicht-vitales Organ erlaubt,
- • dem
bedeutenden Volumen der Muskelmasse, welches eine Mehrzahl von Verabreichungsstellen
ermöglicht,
- • den
umfassend nachgewiesenen sekretorischen Fähigkeiten des Muskels.
-
Zu
diesen Vorteilen kommt die Sicherheit hinzu, die durch die lokale
Behandlung, welche mit der Verwendung von lokalen und zielgerichteten
elektrischen Feldern verbunden ist, beigetragen wird.
-
Durch
die Gesamtheit dieser Vorteile und die mit der Verwendung von schwachen
Feldern verbundene Sicherheit könnte
die Erfindung auf der Ebene des Herzmuskels für die Behandlung von Cardiopathien,
beispielsweise unter Verwendung eines dazu angepassten Defibrillators,
eingesetzt werden. Sie könnte
auch Anwendung finden für
die Behandlung der Restenose durch die Expression von Genen, die
inhibitorisch auf die Proliferation von glatten Muskelzellen wirken,
wie des GAX-Proteins.
-
Die
Kombination von wenig starken Feldern und von langen Verabreichungsdauern,
welche insbesondere auf die Muskeln in vivo angewendet wird, verbessert
die Transfektion durch die Nukleinsäuren, ohne bemerkenswerte Schädigungen
der Gewebe zu verursachen. Diese Ergebnisse verbessern die Ausbeute
der DNA-Transfers im Rahmen der Gentherapie, welche Nukleinsäuren einsetzt.
-
Folglich
erlauben die Vorteile des Muskelgewebes, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
verbunden sind, erstmalig in Betracht zu ziehen, durch Gentherapie
ein Mittel in physiologischen und/oder therapeutischen Dosen entweder
in den Muskelzellen oder sekretiert in deren Umgebung oder in den
Blutkreislauf oder in den lymphatischen Kreislauf zu produzieren.
Außerdem
erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren
zum ersten Mal die feine Modulation und die Kontrolle der wirksamen
Menge eines exprimierten Transgens durch die Möglichkeit, das Volumen des
zu transfizierenden Muskelgewebes zu modulieren, beispielsweise
mittels einer Mehrzahl von Verabreichungsstellen, oder ferner die
Möglichkeit,
die Anzahl, die Form, die Oberfläche
und die Anordnung der Elektroden zu modulieren. Ein zusätzliches
Kontrollelement ergibt sich aus der Möglichkeit, die Wirksamkeit
der Transfektion durch die Variation der Feldstärke, der Anzahl, der Dauer
und der Frequenz der Impulse und, selbstverständlich gemäß dem Stand der Technik, der
Verabreichungsmenge und des Verabreichungsvolumens der Nukleinsäuren zu
modulieren. Man kann so ein für
das gewünschte
Produktions- oder Sekretionsniveau geeignetes Transfektionsniveau
erhalten. Das Verfahren erlaubt schließlich ein Mehr an Sicherheit
verglichen mit den chemischen oder viralen Verfahren zum Transfer
von Genen in vivo, bei welchen die Beeinträchtigung von anderen Organen
als des Zielorgans nicht vollständig
ausgeschlossen und beherrscht werden kann. Tatsächlich erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren
die Kontrolle der Lage der transfizierten Gewebe (streng verbunden
mit dem Gewebevolumen, das den örtlichen
elektrischen Impulsen unterworfen wird) und trägt folglich die Möglichkeit
einer Rückkehr
zu der Ausgangssituation durch die vollständige oder teilweise operative
Entfernung des Muskels, welche durch den nicht-vitalen Charakter
dieses Gewebes und durch seine Regnerationsfähigkeiten ermöglicht wird,
bei. Diese große
Anpassungsfähigkeit
der Verwendung erlaubt, das Verfahren je nach der Tierspezies (Anwendungen
beim Menschen oder veterinärmedizinische
Anwendungen), dem Alter des Patienten, dessen physiologischem und/oder
pathologischen Zustand zu optimieren.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
erlaubt außerdem
erstmals, Nukleinsäuren
von großer
Größe durch Transfektion
zu transferieren im Gegensatz zu den viralen Methoden, die durch
die Größe des Kapsids
begrenzt werden. Diese Möglichkeit
ist essentiell für
den Transfer von Genen von sehr großer Größe wie jenem des Dystrophins,
oder von Genen mit Introns und/oder regulatorischen Elementen von
großer
Größe, was
beispielsweise für
eine physiologisch regulierte Produktion von Hormonen erforderlich
ist. Diese Möglichkeit
ist essentiell für
den Transfer von Episomen oder künstlichen
Hefe-Chromosomen oder von Minichromosomen.
-
Die
folgenden Beispiele sind dazu bestimmt, die Erfindung auf nichteinschränkende Weise
zu veranschaulichen.
-
In
diesen Beispielen wird Bezug genommen werden auf die folgenden Figuren:
-
1 Wirkungen von elektrischen Impulsen
von hoher Feldstärke
auf die Transfektion des kranialen Tibia-Muskels bei der Maus mittels
der Plasmid-DNA pXL2774; Mittelwerte ± Standardabweichung.
-
2 Wirkungen von elektrischen Impulsen
von mittlerer Feldstärke
auf die Transfektion des kranialen Tibia-Muskels bei der Maus mittels
der Plasmid-DNA pXL2774; Mittelwerte ± Standardabweichung.
-
3 Wirkungen von elektrischen Impulsen
von geringer Feldstärke
und von unterschiedlichen Dauern auf die Transfektion des kranialen
Tibia-Muskels bei der Maus mittels der Plasmid-DNA pXL2774; Mittelwerte ± Standardabweichung.
-
4 Wirkungen von elektrischen Impulsen
von geringer Feldstärke
und von unterschiedlichen Dauern auf die Transfektion des kranialen
Tibia-Muskels bei der Maus mittels der Plasmid-DNA pXL2774; Mittelwerte ± Standardabweichung.
-
5 Wirksamkeit
der Elektrotransfektion des kranialen Tibia-Muskels der Maus mit geringen elektrischen
Feldstärken
mittels der Plasmid-DNA pXL2774: Mittelwerte ± Standardabweichung.
-
6 Kinetik
der Expression der Luciferase in dem kranialen Tibia-Muskel der
Maus. Verabreichung des Plasmids pXL2774 mit Elektrotransfer (¦) und
ohne Elektrotransfer (X); Mittelwerte ± Standardabweichung (H =
Stunde; J = Tag).
-
7 Niveau
der Expression des Transgens abhängig
von der verabreichten DNA-Dosis mit Elektrotransfer (•) und ohne
Elektrotransfer (?)
-
8 Wirkung
von verschiedenen Elektrodenarten auf die Wirksamkeit des Elektrotransfers.
-
9 Kinetik
der Serumkonzentration von sekretierter alkalischer Phosphatase.
Verabreichung des Plasmids pXL3010 mit Elektrotransfer (¦) und
ohne Elektrotransfer (?); Mittelwerte ± Standardabweichung.
-
10 Kinetik
der Expression von FGF1 im Muskel mit Elektrotransfer (weiße Histogrammbalken) oder
ohne Elektrotransfer (schwarze Histogrammbalken).
-
11 Karten
der Plasmide pXL3179 und pXL3212.
-
12 Karten
der Plasmide pXL3388 und pXL3031.
-
13 Karten
der Plasmide pXL3004 und pXL3010.
-
14 Karten
der Plasmide pXL3149 und pXL3096.
-
15 Karten
der Plasmide pXL3353 und pXL3354.
-
16 Karte
des Plasmids pXL3348.
-
Beispiel 1: Unter den
Bedingungen des Standes der Technik ausgeführtes Experiment, bei welchem
die elektrischen Felder sich als Inhibitoren der Transfektion erweisen.
-
Es
wurden die Standard-Elektroporationsbedingungen, wie jene, die im
Stand der Technik eingesetzt und die vorstehend diskutiert worden
waren, getestet und sie haben sich als unwirksam erwiesen, ja sogar
derart, dass sie eine inhibitorische Wirkung auf den Transfer von
Nukleinsäuren
(Plasmid-DNA) in den quergestreiften Muskel haben.
-
Material und
Methoden – Allgemeine
Verfahrensbedingungen
-
In
diesem Beispiel wurden die folgenden Produkte eingesetzt:
DNA
pXL2774 (Patent PCT/FR 96/01414) ist eine Plasmid-DNA, die das Luciferase-Reportergen
umfasst. Die anderen Produkte sind von Lieferanten des Handels erhältlich:
Ketamin, Xylazin, physiologische Kochsalzlösung (NaCl 0,9%).
-
Es
wurden ein Oszilloskop und ein Generator von elektrischen Impulsen
(rechteckig oder quadratisch) des Handels (Electro-pulsateur PS
15, Jouan, Frankreich) eingesetzt. Die eingesetzten Elektroden sind
die Plattenelektroden aus rostfreiem Stahl mit einem Abstand von
1 bis 15 mm.
-
Das
Experiment erfolgt an C57 B1/6-Mäusen.
Die Mäuse,
die aus unterschiedlichen Käfigen
stammen, werden zufallsgesteuert vor dem Experiment in Gruppen eingeteilt
(„Randomisierung").
-
Die
Mäuse werden
durch eine Ketamin-Xylazin-Mischung anästhesiert. Die Lösung von
Plasmid (30 μl
von einer Lösung
mit 500 μg/ml
NaCl 0,9%) wird längs
durch die Haut hindurch in den kranialen Tibia-Muskel der linken und rechten Pfote
mit Hilfe einer Hamilton-Spritze injiziert. Die beiden Elektroden
werden mit einem leitfähigen
Gel bestrichen und die Pfote, die die Injektion erhalten hat, wird
zwischen den Elektroden in Kontakt mit jenen angeordnet.
-
Die
elektrischen Impulse werden rechtwinklig zu der Achse des Muskels
mit Hilfe eines Generators von Rechteckimpulsen eine Minute nach
der Injektion angewendet. Ein Oszilloskop erlaubt, die Intensität in Volt
(die in den Beispielen angegebenen Werte repräsentieren die maximalen Werte),
die Dauer in Millisekunden und die Frequenz in Hertz der abgegebenen
Impulse, die 1 Hz beträgt,
zu kontrollieren. Es werden 8 aufeinanderfolgende Impulse abgegeben.
-
Für die Auswertung
der Transfektion des Muskels werden die Mäuse 7 Tage nach der Verabreichung des
Plasmids getötet.
Die kranialen Tibia-Muskeln der linken und rechten Pfote werden
dann entnommen, gewogen, in Lysepuffer gegeben und zerkleinert.
Die erhaltene Suspension wird zentrifugiert, um einen klaren Überstand
zu erhalten. Die Messung der Luciferase-Aktivität erfolgt an 10 μl Überstand
mit Hilfe eines Luminometers des Handels, in welchem das Substrat
automatisch zu der Lösung
hinzugesetzt wird. Die Intensität der
Lichtreaktion wird in RLU (Relative Luminescence Unit) für einen
Muskel unter Kenntnis des Gesamtvolumens der Suspension angegeben
(1.106 RLU sind äquivalent zu 30 pg Luciferase).
Jeder experimentelle Zustand wird an 10 Stellen getestet: 5 Tiere,
die auf beiden Seiten eine Injektion erhalten. Die statistischen
Vergleiche erfolgen mit Hilfe von nicht-parametrischen Tests.
-
Ergebnisse
und Diskussion
-
Zwei
Figuren, deren Maßstab
linear oder logarithmisch ist, veranschaulichen die Ergebnisse.
-
In
diesem ersten Experiment wurden die Wirkungen eines elektrischen
Feldes von 800 bis 1200 Volt/cm, welches die Elektroporation von
Tumoren erlaubt (Mir et al., Eur. J. Cancer 27, 68, 1991), getestet.
-
Man
stellt gemäß der 1 fest, dass, bezogen auf die Kontrollgruppe,
wo die DNA ohne elektrische Impulse injiziert wird:
- • mit
8 Impulsen von 1200 Volt/cm und einer Dauer von 0,1 ms ist der Mittelwert
der Luciferase-Aktivität
viel geringer,
- • bei
Impulsen von 1200 Volt/cm und 1 ms sind 3 Tiere gestorben, ist der
Mittelwert der Luciferase-Aktivität viel geringer,
- • mit
Impulsen von 800 Volt/cm und 1 ms ist der Mittelwert der Luciferase-Aktivität ebenfalls
signifikant verringert.
-
Die
meisten Muskeln, die der Wirkung des elektrischen Felds unterzogen
worden sind, sind sichtbar verändert
(zerreibbar und von weißlichem
Aussehen).
-
Beispiel 2: Experiment
eines Elektrotransfers von Nukleinsäuren mit moderaten elektrischen
Feldern
-
Dieses
Experiment wird mit C57 B1/6-Mäusen
ausgeführt.
Abgesehen von der elektrischen Feldstärke der Impulse und deren Dauer
sind die Ausführungsbedingungen
jene des Beispiels 1.
-
Die
Ergebnisse sind in der 2 gezeigt.
Man reproduziert das Ergebnis des Beispiels 1, d.h. die inhibitorische
Wirkung einer Reihe von 8 Impulsen bei 800 Volt/cm mit einer Dauer
von 1 ms auf die im Muskel nachgewiesene Luciferase-Aktivität. Mit einem
Feld von 600 Volt/cm beobachtet man die gleiche Inhibition und die
gleiche Veränderung
des Muskelgewebes. Im Gegensatz dazu erlaubt die Verringerung der
Spannung auf bemerkenswerte und überraschende
Weise, die Muskeln nicht mehr sichtbar zu verändern und außerdem ist bei
400 und 200 Volt/cm das Transfektionsniveau der Muskeln im Mittel
höher als
jenes, das bei den nicht einem Feld unterworfenen Muskeln erhalten
wird. Es ist festzuhalten, dass bezogen auf die Vergleichsgruppe (die
keinem elektrischen Feld unterworfen worden ist) die Streuung der
Werte der Luciferase-Aktivität
bei 200 Volt/cm verringert ist (SEM (Standardabweichung) = 20,59
des Mittelwertes gegenüber
43,32% in Abwesenheit des elektrischen Felds (2A)).
-
Beispiel 3: Experiment
eines Elektrotransfers von Nukleinsäuren mit Impulsen von geringer
Feldstärke,
welches eine sehr starke Stimulation der Expression des Transgens
zeigt.
-
Dieses
Experiment wird mit C57 B1/6-Mäusen
ausgeführt.
Abgesehen von der elektrischen Feldstärke der Impulse und deren Dauer
und der Tatsache, dass die Impulse 25 s nach der Injektion der DNA
abgegeben werden, sind die Ausführungsbedingungen
jene der vorangegangenen Beispiele.
-
Die
Ergebnisse sind in der 3 gezeigt.
Der Mittelwert der Expression des Luciferase-Transgens ist bei einer
Impulsdauer von 20 ms bei 100 Volt/cm und ausgehend von einer Impulsdauer
von 5 ms bei 200 Volt/cm deutlich erhöht.
-
Dieses
Experiment zeigt auch deutlich, dass der Mittelwert der Luciferase-Aktivität, der durch
Elektrotransfektion des Muskels mit der DNA erhalten wird, eine
Funktion der Dauer der elektrischen Impulse ist, wenn man Spannungen
von 200 und 100 Volt/cm einsetzt. Man stellt auch fest, dass die
Streuung der Werte bei den Gruppen von elektrotransfizierten Muskeln
bemerkenswert verringert ist (3A). In
Abwesenheit von elektrischen Impulsen (Kontrolle) repräsentiert
die Standardabweichung (SEM) 77,43% des Mittelwerts, wohingegen
die Standardabweichung bezogen auf den Mittelwert auf 14% (200 Volt/cm,
5 ms), 41,27 (200 Volt/cm, 20 ms) und zwischen 30% und 48% für den Elektrotransfer
bei 100 Volt/cm elektrisches Feld verringert ist.
-
Unter
den besten Bedingungen dieses Experiments verbessert man die Expression
des Transgens bezogen auf die in Abwesenheit von elektrischen Impulsen
injizierte Kontrolle um einen Faktor von 89,7.
-
Beispiel 4: Experiment
eines Elektrotransfers von Nukleinsäuren in den Muskel bei 200
Volt/cm, welches eine Erhöhung
der Expression des Transgens um einen Faktor von über 200
zeigt
-
Dieses
Experiment wird an DBA 2-Mäusen
mit elektrischen Impulsen einer Feldstärke von 200 Volt/cm und variabler
Dauer ausgeführt,
wobei die anderen Bedingungen dieses Experiments jene des Beispiels
3 sind.
-
Dieses
Beispiel bestätigt,
dass bei 200 Volt/cm die Transfektion mittels der Luciferase-Aktivität ab einer
Impulsdauer von 5 ms erhöht
ist, dann bei längeren
Dauern weiter zunimmt (4 und 5).
Man beobachtet bei der Elektrotransfektion auch hier wieder eine
Verringerung der inter-individuellen Variabilität, was angegeben wird durch
die Standardabweichung bezogen auf die nicht-elektrotransfizierte
Kontrolle (der sich auf die Standardabweichung beziehende Wert beträgt 35% für die Kontrolle
und 25, 22, 16, 18, 16 und 26% für
Impulsreihen von 1, 5, 10, 15, 20 bzw. 24 ms).
-
Bei
den besten Bedingungen dieses Experiments verbessert man die Expression
des Transgens verglichen mit der in Abwesenheit von elektrischen
Impulsen injizierten Kontrolle um einen Faktor von 205. Es erweist
sich so, dass die Variation der Dauer von jedem abgegebenen Impuls
ein Mittel ist, um die Wirksamkeit des Transfers von Nukleinsäuren zu
modulieren und das Expressionsniveau des Transgens anzupassen.
-
Beispiel 5: Wirksamkeit
des Elektrotransfers von Nukleinsäuren abhängig von dem Produkt „Anzahl
der Impulse × Feldstärke × Dauer
von jedem Impuls"
-
Die 5 exemplifiziert
die Bedeutung des Parameters, der dem Produkt „Anzahl der Impulse × Feldstärke × Dauer
von jedem Impuls" entspricht.
Dieser Parameter entspricht tatsächlich
dem Integral abhängig von
der Zeit der Funktion, die die Variation des elektrischen Felds
beschreibt.
-
Die
Darstellung der während
der Experimente 2, 3 und 4 mit elektrischen Feldstärken von
200 V/cm, 100 V/cm oder in Abwesenheit von elektrischen Feldern
erhaltenen Ergebnisse in 5 zeigt, dass die Wirksamkeit
der Transfektion abhängig
von dem Produkt der gesamten Dauer der Exposition gegenüber dem
elektrischen Feld mit der Feldstärke
zunimmt. Bei einem Wert über
1 kV × ms/cm
des Produkts „Feldstärke × gesamte
Dauer der Impulse" wird
ein Stimulationseffekt erhalten. Gemäß einer bevorzugten Weise wird
eine Stimulation bei einem Wert über
oder gleich 5 kV × ms/cm
des Produkts „Feldstärke × gesamte
Dauer der Impulse" erhalten.
-
Beispiel 6: Wirkung der
Erhöhung
der Dauer der elektrischen Impulse.
-
Dieses
Beispiel veranschaulicht, dass man die Einheitsdauer der Impulse
deutlich über
die Werte, die in Beispiel 4 getestet worden sind, erhöhen kann.
-
Dieses
Experiment wird mit C57B1/6-Mäusen
ausgeführt.
Das eingesetzte Plasmid ist das Plasmid pXL 2774, die verabreichte
DNA-Menge beträgt
15 μg. Der
Elektropulsator, der eingesetzt wird, um die elektrischen Impulse
einer Dauer über
20 ms abzugeben, ist ein im Handel erhältlicher Elektropulsator (Genetronics,
Modell T 820, USA, San Diego, CA). Die elektrischen Impulse sind
von der Anzahl und von der Dauer her variabel, aber: von einer konstanten
Feldstärke
von 200 Volt/cm; die anderen Bedingungen dieses Experiments sind
jene, die in Beispiel 1 beschrieben worden sind. Die Ergebnisse
sind in der Tabelle 1 aufgeführt.
-
Tabelle
1: Mittelwerte +/– Standardabweichung
der Luciferase-Aktivität in Millionen
RLU pro Muskel. N = 10 für jede
Gruppe. Elektrotransfer-Bedingungen: Feldstärke 200 V/cm, 8 oder 4 Impulse
(variable Einheitsdauer), Frequenz 1 Hz.
-
Man
stellt eine Erhöhung
der Expression des Transgens mit der Verlängerung der Einheitsdauer der Impulse
(wenigstens bis zu 40 ms für
eine Reihe von 8 Impulsen und wenigstens bis zu 50 ms für eine Reihe von
4 Impulsen mit einer Intensität
von 200 Volt/cm) fest. Dieses Beispiel zeigt, dass das Optimum der
Dauer der Impulse von der Anzahl von eingesetzten Impulsen abhängt und
dass die Einheitsdauer der Impulse bis zu 80 ms erreichen kann,
wobei dieser Wert für
die Dauer nicht einschränkend
verstanden wird.
-
Beispiel 7: Wirksamkeit
des Elektrotransfers abhängig
von der Anzahl von elektrischen Impulsen
-
Dieses
Beispiel weist die Wirkung der Erhöhung der Anzahl von elektrischen
Impulsen auf die Wirksamkeit des Transfers von Nukleinsäuren nach.
-
Dieses
Beispiel wird mit C57B1/6-Mäusen
ausgeführt.
Das eingesetzte Plasmid ist das Plasmid pXL 2774, die verabreichte
DNA-Menge beträgt
15 μg. Die
elektrischen Impulse sind von variabler Anzahl. Die Dauer von jedem
Impuls beträgt
20 ms. Die Feldstärke
beträgt
200 Volt/cm. Die anderen Bedingungen dieses Experiments sind jene,
die in Beispiel 1 beschrieben worden sind. Die Ergebnisse sind in
der Tabelle 2 aufgeführt.
-
Tabelle
2: Mittelwerte +/– Standardabweichung
der Luciferase-Aktivität in Millionen
RLU pro Muskel. M = 10 pro Gruppe. Bedingungen: Feldstärke 200
V/cm, variable Anzahl von Impulsen von 20 ms, Frequenz 1 Hz.
-
Man
beobachtet, dass die Expression der Luciferase auf sehr bedeutende
Weise ab der Anwendung eines einzigen Impulses zunimmt und dass
sie abhängig
von der Anzahl von Impulsen weiter zunimmt. Es erweist sich folglich,
dass die Variation der Anzahl von abgegebenen Impulsen ein Mittel
ist, um die Wirksamkeit des Transfers von Nukleinsäuren zu
modulieren und das Expressionsniveau des Transgens anzupassen.
-
Es
wird gleichfalls eine Verringerung der Variabilität der Reaktion
bestätigt,
welche nachgewiesen wird durch die Verringerung des Werts der Standardabweichung
bezogen auf den Mittelwert für
alle Gruppen, die dem Elektrotransfer unterworfen worden waren.
-
Beispiel 8: Wirkung der
Erhöhung
der Frequenz der elektrischen Impulse.
-
Dieses
Beispiel zeigt, dass die Erhöhung
der Frequenz der Impulse es auf unerwartete Weise erlaubt, die Wirksamkeit
der Transfektion zu verbessern. Andererseits und unter einer klinischen
Perspektive muss die Erhöhung
der Frequenz den Komfort für
den Patienten verbessern, indem die gesamte Dauer der Behandlung verringert
wird.
-
Dieses
Experiment wird mit C57B1/6-Mäusen
ausgeführt.
Das eingesetzte Plasmid ist das Plasmid pXL 2774, die verabreichte
DNA-Menge beträgt
15 μg. Die
Frequenz der elektrischen Impulse ist variabel (von 0,1 bis 4 Hertz).
Die Dauer von jedem Impuls beträgt
20 ms, die Feldstärke
beträgt
200 Volt/cm, die anderen Bedingungen dieses Experiments sind jene,
die in Beispiel 1 beschrieben worden sind. Die Ergebnisse sind in der
Tabelle 3 aufgeführt.
-
Tabelle
3: Mittelwerte +/– Standardabweichung
der Luciferase-Aktivität in Millionen
RLU pro Muskel. N = 10 für jede
Gruppe. Bedingungen: Feldstärke
200 V/cm, 8 oder 4 Impulse von 20 ms, variable Frequenz.
-
Die
in dem Experiment „A", Tabelle 3, erhaltenen
Ergebnisse zeigen, dass die höchsten
Frequenzen (≥ 1
Hz) wirkungsvoller sind als die schwachen Frequenzen, die einer
längeren
Dauer zwischen zwei aufeinanderfolgenden Impulsen (10 s bei 0,1
Hz) entsprechen. Die Wirksamkeit der Transfektion nimmt mit der
Frequenz über
den Bereich der getesteten Werte von 0,1 bis 4 Hertz bei 4 Impulsen
und von 0,1 bis 3 Hertz bei 8 Impulsen zu.
-
Beispiel 9: Wirkung der
Anwendung eines elektrischen Felds, das gemäß einer abhängig von der Zeit abnehmenden
Exponentialfunktion variiert
-
Dieses
Beispiel weist die Wirkung der Anwendung eines elektrischen Felds,
das gemäß einer
abnehmenden Exponentialfunktion variiert, auf die Wirksamkeit des
Transfers von Nukleinsäuren
nach.
-
Dieses
Experiment wird mit C57B1/6-Mäusen
ausgeführt.
-
Das
eingesetzte Plasmid ist das Plasmid pXL 3031. Das Plasmid pXL3031
(12) ist ein von dem Plasmid pXL2774 (WO 97/10343)
abgeleiteter Vektor, in den das luc+-Gen, welches die modifizierte
(zytoplasmatische) Luciferase von Photinus pyralis, welche aus pGL3basic
(Genbank: CVU47295) stammt, kodiert, unter der Kontrolle des Promotors,
der aus der frühen
Region des humanen Zytomegalievirus (hCMV IE, Genbank HS5IEE) stammt,
und des Polyadenylierungssignals der späten Region des SV40-Virus (Genbank SV4CG)
eingeführt
worden war. Die verabreichte DNA-Menge ist 10 μg.
-
Der
eingesetzte Generator von elektrischen Impulsen erlaubt, Impulse
mit einer elektrischen Feldstärke,
die gemäß einer
abhängig
von der Zeit abnehmenden Exponentialfunktion variiert, abzugeben
(Elektropulsator Equibio, Modell easyjectT plus, Kent, Vereinigtes
Königreich).
Die auferlegte Spannung ist die Spannung am Peak der Exponentialfunktion.
Der zweite einstellbare Parameter ist die Kapazität (μFarad), die
erlaubt, die abgegebene Energiemenge und die Zeitkonstante der Exponentialfunktion
variieren zu lassen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 aufgeführt.
-
Tabelle
4: Faktor der Erhöhung
der Expression (Luciferase-Aktivität), erhalten durch Anwendung
eines Impulses mit exponentieller Abnahme. Der Erhöhungsfaktor
wird berechnet durch Bezugnahme auf die Luciferase-Aktivität, die bei
der Verabreichung des Plasmids pXL3031 ohne Elektrotransfer erhalten
wird (Mittelwerte des Erhöhungsfaktors,
N = 4 bis 6 pro Bedingung).
-
Zu
Vergleichszwecken betrug in dem gleichen Experiment der Erhöhungsfaktor
der Expression, der bei dem Transfer von pXL3031 in Gegenwart eines
elektrischen Feldes mit Impulsen von Rechteckform (Feldstärke von
200 V/cm, 8 Impulse von 20 ms bei einer Frequenz von 1 Hertz) erhalten
wird, 44.
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass man elektrische Impulse von Rechteckform
oder einer abhängig
von der Zeit exponentiell abnehmenden Intensität einsetzen kann. Außerdem kann
in diesem letzteren Falle eine bedeutende Erhöhung der Expression bei einer
geringen Feldstärke
und einer hohen Kapazität
(z.B. 200 V/cm, Kapazität
3000 μFarad)
oder einer hohen Feldstärke
und einer geringen Kapazität
(z.B. 400 V/cm, Kapazität 300 μFarad) erhalten
werden.
-
Beispiel 10: Wirkung der
Kombination eines kurzen Impulses von hoher Spannung und von mehreren
langen Impulsen von geringer Spannung.
-
Dieses
Beispiel zeigt, dass das abgegebene elektrische Feld eine Kombination
von wenigstens einem Feld zwischen 500 und 800 Volt/cm für eine kurze
Dauer, beispielsweise 50 oder 100 μs, und wenigstens einem schwachen
Feld (< 100 Volt/cm)
während
einer längeren
Dauer, beispielsweise ≥ 1
ms und bis zu 90 ms in diesem Experiment, sein kann.
-
Die
geringen Werte des elektrischen Felds sind hier 80 V/cm, welche
angewendet werden in Form von 4 Impulsen einer Dauer von 90 ms mit
einer Frequenz von 1 Hertz. Für
dieses Experiment werden zwei Elektropulsatoren eingesetzt. Die
elektrischen Impulse werden durch das eine, dann durch das andere
Gerät angewendet,
wobei die Änderung
in weniger als einer Sekunde mit Hilfe eines Handbetriebs erfolgt.
-
Das
eingesetzte Plasmid ist das Plasmid pXL3031. Die verabreichte DNA-Menge
beträgt
3 μg. Die Werte
des elektrischen Felds sind in der Tabelle 5 angegeben; die anderen
Bedingungen dieses Experiments sind jene, die in Beispiel 1 beschrieben
worden sind.
-
Tabelle
5: Mittelwerte +/– Standardabweichung
der Luciferase-Aktivität in Millionen
RLU pro Muskel. N = 10 Muskeln pro Gruppe.
-
Die
Tabelle 5, welche die für
die beiden Reihen von Experimenten erhaltenen Ergebnisse zusammenfasst,
zeigt, dass ein kurzer Impuls von hoher Spannung oder dass vier
aufeinanderfolgende lange Impulse und von geringer Spannung die
Transfektion bezogen auf die Kontrollgruppe, die eine Injektion
von pXL3031 erhalten hat, aber keinem elektrischen Feld unterworfen
worden ist, nur wenig verbessern. Das gleiche gilt, wenn die Impulse
mit schwachem Feld vor dem Impuls mit hohem Feld angewendet werden.
-
Im
Gegensatz dazu erhöht
in den beiden Reihen von Experimenten die Kombination eines kurzen
Impulses von hoher Spannung, gefolgt von vier aufeinanderfolgenden
langen Impulsen und von geringer Spannung die Wirksamkeit des Transfers
der DNA sehr deutlich.
-
Die
in den Beispielen 1 und 2 erhaltenen Ergebnisse haben gezeigt, dass
8 Impulse von 600, 800 oder 1200 Volt von einer Einheitsdauer von
1 ms bei 1Hz Verletzungen hervorriefen und die Transfektion inhibierten. Die
in Beispiel 10 erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass es unter besonderen
Bedingungen möglich
ist, Feldstärken
von hoher Spannung auf eine keine Verletzungen hervorrufende Weise
einzusetzen tatsächlich
werden aus makroskopischer Sicht die Muskeln niemals sichtbar verändert. Die
Verwendung von hohen elektrischen Feldern von kurzer Dauer kombiniert
mit schwachen Feldern von längerer
Dauer erweist sich als ein ergänzendes
Mittel, um die Wirksamkeit des Transfers der DNA zu modulieren.
-
Beispiel 11: Elektrotransfer
mit Plasmiden von unterschiedlichen Größen, von Genen unter der Kontrolle
von verschiedenen Promotoren oder mit Stellen für ein variables Targeting des
durch das Transgen exprimieren Proteins.
-
11.a – Elektrotransfer
mit Plasmiden von unterschiedlicher Größe
-
Es
wurden Plasmide von unterschiedlicher Größe (2,8 kb, 3,8 kb, 8,6 kb,
20 kb und 52,5 kb), welche das Luciferase kodierende Gen umfassen,
getestet. Die verabreichte Menge Plasmid betrug 10 μg pro Muskel. Es
wird ein elektrisches Feld mit einer Intensität von 200 V/cm in 8 Impulsen
von 20 ms bei 2 Hz angewendet, wobei die anderen Bedingungen dieses
Experiments jene sind, die in Beispiel 1 beschrieben worden sind.
-
Man
beobachtet eine ungefähr
50-fache Erhöhung
der Expression des Transgens mit den Plasmiden von 2,8 kb und 3,8
kb, eine ungefähr
80-fache mit dem
Plasmid von 8,6 kb und eine 3- bis 6-fache mit den Plasmiden von
20 und 52,6 kb.
-
Dieses
Beispiel zeigt so die Möglichkeit,
Plasmide von bedeutender Größe, die
bis zu 20 kb und höher geht,
zu transferieren.
-
11.b Kontrolle
des Lumineszenzsignals in Abwesenheit von einem Luciferase kodierenden
Gen
-
Als
Kontrolle und um die Möglichkeit
auszuschließen,
dass die bei der quantitativen Bestimmung der Luciferase-Aktivität beobachteten
Lumineszenzsignale auf Radikale, die im Gewebe infolge der elektrischen Behandlung
produziert werden, zurückzuführen sind,
wurde die Luciferase-Aktivität
an mit einem Plasmid, welches nicht Luciferase kodiert, behandelten
und einem elektrischen Feld unterworfenen Muskeln getestet.
-
Tabelle
6: Luciferase-Aktivität
in Muskeln, in die verschiedene Plasmide injiziert worden waren,
mit oder ohne Anwendung eines elektrischen Felds. Bedingungen: 200
V/cm, 8 Impulse von 20 ms, Frequenz 1 Hz. Mittelwerte +/– Standardabweichung
der Luciferase-Aktivität
in Millionen RLU pro Muskel.
-
Die
Ergebnisse zeigen, dass die Grundaktivität der Luciferase in Muskeln,
denen ein Plasmid, welches keine Luciferase kodiert, injiziert worden
ist, ganz und gar vernachlässigbar
ist.
-
11.c – Elektrotransfer
von Genen unter der Kontrolle von verschiedenen Promotoren
-
Der
Einfluss von verschiedenen Promotoren wurde auf der Ebene der Expression
der mit und ohne Anwendung des elektrischen Felds transferierten
Gene getestet.
-
Die
pro Muskel injizierte Plasmidmenge beträgt 2 μg. Das angewendete elektrische
Feld ist 200 V/cm in 8 Impulsen von 20 ms bei 1 Hz, die anderen
Bedingungen dieses Experiments sind jene, die in Beispiel 1 beschrieben
worden sind. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 7 aufgeführt. Das
getestete Plasmid ist das Plasmid pXL3031 für das CMV-LUC Konstrukt. Das
PGK-Konstrukt entspricht der Substitution des CMV-Promotors durch den
PGK-Promotor in pXL3031.
-
Tabelle
7: Mittelwerte +/– Standardabweichung
der Luciferase-Aktivität in Millionen
RLU pro Muskel.
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass, wenn die DNA in Gegenwart eines elektrischen
Felds transferiert wird, der Erhöhungsfaktor
der Expression des Transgens vergleichbar ist unabhängig von
der Herkunft oder der Stärke
des Promotors.
-
11.d – Elektrotransfer eines Gens
mit unterschiedlichen Stellen für
ein Targeting des durch das Transgen exprimierten Proteins.
-
Dieses
Beispiel veranschaulicht den Transfer eines Gens, welches Proteine
mit unterschiedlichen zellulären
Lokalisationen kodiert. Das Plasmid pXL3031 kodiert eine Luciferase,
die im Zytosol synthetisiert wird, und das Plasmid pXL2774 kodiert
eine Luciferase, die für
die Peroxysomen bestimmt ist (Targeting).
-
Die
Menge von pro Muskel injiziertem Plasmid beträgt 10 μg. Das angewendete elektrische
Feld ist 200 V/cm in 8 Impulsen von 20 ms bei 1 Hz, die anderen
Bedingungen dieses Experimetns sind jene, die in Beispiel 1 beschrieben
worden sind. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 8 aufgeführt.
-
Tabelle
8: Mittelwerte +/– Standardabweichung
der Luciferase-Aktivität in Millionen
ALU.
-
Diese
Ergebnisse weisen nach, dass das erfindungsgemäße Verfahren für den Transfer
von Genen, welche Proteine von unterschiedlichen zellulären Lokalisationen
und insbesondere peroxysomale Proteine oder zytosolische Proteine
kodieren, angewendet werden kann.
-
Beispiel 12: Kinetische
und histologische Analyse der Expression des Transgens.
-
12.a – Kinetik
der Expression des Transgens
-
Dieses
Beispiel zeigt, das der Transfer von Nukleinsäuren in Gegenwart eines elektrischen
Felds unter den erfindungsgemäßen Bedingungen
erlaubt, die Expression eines Transgens auf hohem und stabilem Niveau
während
einer Dauer von wenigstens 4 Monaten zu erhalten.
-
Dieses
Experiment wird mit C57B1/6-Mäusen
ausgeführt.
Das eingesetzte Plasmid ist das Plasmid pXL 2774, die verabreichte
DNR-Menge beträgt
15 μg. Der
DNA-Injektion folgt die Anwendung eines elektrischen Felds unter
den folgenden Bedingungen: Intensität 200 V/cm, 8 Impulse von 20
ms, Frequenz 1 Hz, oder nicht (Kontrollgruppe). Die anderen Bedingungen
dieses Experiments sind jene, die in Beispiel 1 beschrieben werden.
Die Luciferase-Aktivität
wird an Gruppen von 10 zu unterschiedlichen Zeitpunkten getöteten Mäusen bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der 6 aufgeführt.
-
Man
beobachtet bei der Kontrollgruppe, dass die Expression der Luciferase
ab der 3. Stunde nach der Injektion des Plasmids nachweisbar ist
und bis zum 3. Tag (J3) zunimmt, dann nach 35 Tagen in bemerkenswerter
Weise abnimmt.
-
Man
stellt fest, dass bei der den elektrischen Impulsen unterworfenen
Gruppe die Expression des Transgens auf einem Niveau bestehen bleibt,
welches sehr deutlich höher
ist als jenes der Kontrollgruppe. Außerdem und in bemerkenswerter
Weise beobachtet man, dass dieses Expressionsniveau hoch und über 35 Tage
hinaus und wenigstens bis 120 Tage konstant bleibt. Dieses hohe
und dauerhafte Expressionsniveau des Transgens ist ein besonders
vorteilhaftes Ergebnis aus der Perspektive von klinischen Langzeitbehandlungen mit
therapeutischen Genen.
-
12.b – Histologische
Analyse
-
Es
wurde eine histologische Analyse unter den gleichen Bedingungen,
aber unter Verabreichung des Plasmids pCOR CMV-lacZ (pXL3004), welches
die a-Galactosidase mit nukleärer
Lokalisation kodiert, ausgeführt.
-
Das
Plasmid pXL3004 (13) ist ein von dem Plasmid
pXL2774 (WO 97/10343) abgeleiteter Vektor, in den das um eine nukleäre Lokalisationssequenz
(nls) (Nouvel et al., 1994, Virology 204:180-189)) ergänzte lacZ-Gen
unter der Kontrolle des CMV-Promotors des Plasmids pCDNA3 (Invitrogen,
Niederlande) und des Polyadenylierungssignals der frühen Region
des SV40-Virus (Genbank SV4CG) eingeführt worden ist.
-
Die
Tiere werden sieben Tage nach der Verabreichung des Plasmids getötet. Die
histologische Analyse erlaubt, die Zellen nachzuweisen, die die β-Galactosidase
exprimieren und deren Kern sich in der Schnittebene befindet (Xgal-Histochemie).
-
Die
Anzahl von Muskelfasern, welche positive Kerne auf der Ebene der
untersuchten Schnitte aufweisen, beträgt im Mittel 76 in der Gruppe
(n = 8), welche das Plasmid pXL3004 erhalten hat, dann den elektrischen
Impulsen unterworfen worden ist, gegenüber einem Mittelwert von 8,5
in der Kontrollgruppe (n = 8) (Tiere, die das Plasmid pXL3004 erhalten
haben, aber keinen elektrischen Impulsen unterworfen worden sind).
-
Man
beobachtet, dass die Anzahl von Muskelfasern, welche das Transgen
exprimieren, im Mittel neunmal höher
ist bezogen auf die Kontroll gruppe. Die meisten dieser Muskelfasern
sind ruhend mit Kernen, die sich an der Peripherie befinden. Sehr
seltene Muskelfasern mit zentral positioniertem Kern (zentronukleär) exprimieren
die (3-Galactosidase.
Man beobachtet gleichfalls, dass entlang der Injektionsbahn des
Plasmids die Dichte der positiven Muskelfasern pro Einheit Oberfläche in der
Gruppe, die durch Elektrotransfer behandelt worden ist, bedeutender
ist verglichen mit der Kontrollgruppe.
-
Die
Gesamtheit dieser Ergebnisse zeigt, dass bezogen auf Muskeln, die
keinem elektrischen Feld unterworfen worden sind, der Elektrotransfer
eine sehr deutliche Erhöhung
der Anzahl von Muskelfasern, die das Transgen exprimieren, wie auch
eine sehr deutliche Erhöhung
der Oberfläche
der Zone, die das Transgen exprimiert, ermöglicht. Es wird gleichfalls
beobachtet, dass die Anwendung des elektrischen Felds keine bemerkenswerte
Entzündungsreaktion
mit sich bringt.
-
Beispiel 13: Auswirkung
des Injektionszeitpunkts der Nukleinsäure bezogen auf die Anwendung
des elektrischen Felds.
-
Dieses
Beispiel veranschaulicht die Tatsache, dass die Nukleinsäure wenigstens
30 min und sogar wenigstens eine Stunde vor der Anwendung des elektrischen
Felds verabreicht werden kann.
-
Dieses
Experiment wird mit C57B1/6-Mäusen
ausgeführt.
Das eingesetzte Plasmid ist das Plasmid pXL 2774. Die verabreichte
DNA-Menge beträgt
15 μg oder
1,5 μg.
Der Injektion von DNA folgt oder geht voran die Anwendung eines
elektrischen Felds unter den folgenden Bedingungen:
Intensität 200 V/cm,
8 Impulse von 20 ms, Frequenz 1 Hz. Die anderen Bedingungen dieses
Experiments sind jene, die in Beispiel 1 beschrieben wurden. Eine
Kontrollgruppe wird aus Tieren gebildet, die eine Injektion des Plasmids
erhalten haben, die aber keinen elektrischen Impulsen unterworfen
worden sind. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 9 aufgeführt.
-
Tabelle
9A: DNA-Injektion in Abwesenheit eines elektrischen Felds
-
Tabelle
9B: DNA-Injektion vor Anwendung des elektrischen Felds
-
Tabelle
9C: DNA-Injektion nach Anwendung des elektrischen Felds
Tabelle
9: Mittelwerte +/– Standardabweichung
der Luciferase-Aktivität in Millionen
RLU pro Muskel. N = 10 Muskeln pro Gruppe.
-
Die
Anwesenheit der DNA im Zeitpunkt der Anwendung des elektrischen
Felds ist eine Bedingung für die
Wirksamkeit der Elektrotransfektion. In bemerkenswerter Weise wird
beobachtet, dass die Injektion des Plasmids wenigstens 30 min und
sogar 1 h (Experimente 4 und 5) vor der Anwendung des elektrischen
Felds ausgeführt
werden kann und dies ohne bemerkenswerte Modifizierung des Expressionsniveaus.
Ein ähnliches Ergebnis
wird ebenso mit mit einer Dosis von 15 μg Plasmid pro Muskel wie auch
einer 10-fach geringeren Dosis von 1,5 μg erhalten.
-
Diese
Beobachtungen erlauben insbesondere, eine Mehrzahl von Injektionen
des gleichen Plasmids oder von unterschiedlichen Plasmiden in den
Muskel zu verschiedenen Zeitpunkten vor der Anwendung des elektrischen
Felds in Betracht zu ziehen. Es ist gleichfalls möglich, eine
Mehrzahl von Injektionen in eine ausgedehnte Zone des Muskels vorzunehmen,
dann eine Reihe von elektrischen Impulsen auf die Gesamtheit des zu
behandelnden Gebiets, in welchem die Injektionen vorgenommen worden
sind, anzuwenden.
-
Beispiel 14: Statistische
Untersuchung zur Beziehung zwischen der injizierten DNA-Dosis und
dem Expressionsniveau
-
Die
in diesem Beispiel aufgeführte
statistische Untersuchung erlaubt, die Wirkungs/Dosis-Beziehung eines
in Gegenwart oder in Abwesenheit eines elektrischen Felds verabreichten
Transgens zu vergleichen. Diese Untersuchung bestätigt gleichfalls,
dass das erfindungsgemäße Verfahren
die Variabilität
der Expression des Transgens beträchtlich verringert.
-
C57B16-Mäuse im Alter
von 5 Wochen erhielten eine Injektion von Plasmid pXL3031 in den
kranialen Tibia-Muskel und beidseitig. Die Plasmid-Dosen variieren
von 0,25 bis 32 μg
DNA. Jede Dosis wird an 10 Tieren getestet. Unverzüglich nach
der Injektion des Plasmids unterwirft man eine der beiden Pfoten
einem Feld von 250 V/cm mit 4 Impulsen von 20 ms und einer Frequenz
von 1 Hz.
-
Die
Tiere werden 5 Tage nach der Behandlung getötet und die Expression des
Transgens wird in dem Gewebeextrakt von jedem Muskel untersucht.
Die Ergebnisse sind in der 7 aufgeführt.
-
Der
Vergleich der Entwicklung der Varianzen abhängig von jener der Mittelwerte
für jede
Reihe von 10 Wiederholungen zeigt klar, dass die Verteilung der
Expression des Transgens log-normal ist. Die graphische Analyse
der Ergebnisse der 7, die durch die Berechnung
bestätigt
wird, zeigt, dass die Expression linear mit dem Logarithmus der
Dosis von injizierter DNA variiert.
-
Der
Cochran-Test zeigt, dass es eine Homogenität der Varianzen für jede Regression
(mit und ohne Elektrotransfer) gibt, was erlaubt, die restlichen
Varianzen einzusetzen, um die Gesamtheit der Berechnungen auszuführen.
-
Ein
Test bezüglich
der Abweichung von der Linearität
ist mit 5%-igem Risiko nicht signifikant in dem Falle, wo es einen
Elektrotransfer gegeben hat; im Gegensatz dazu existiert eine sehr
signifikante Abweichung von der Linearität (p < 0,01), was eine bedeutende Heterogenität der Reaktionen
in Abwesenheit des Elektrotransfers zum Ausdruck bringt. Die restliche
Varianz ist fünfmal
geringer mit dem Elektrotransfer.
-
Berücksichtigt
man abgeschätzte
Werte der restlichen Varianzen, ist es möglich, fünfmal weniger Tiere einzusetzen,
um in einem Test für
den Vergleich der Transfektionswirksamkeit die gleiche Potenz zu
erhalten je nachdem, ob man den Elektrotransfer anwendet oder nicht.
Um einen Unterschied bei der Expression um einen Faktor 2, 5 oder
10 mit einem Konfidenzintervall von P = 95% nachzuweisen, erfordert
es so 33, 8 bzw. 5 Tiere, wenn das Transgen durch Elektrotransfer
verabreicht wird, und 165, 40 bzw. 25 Tiere in Abwesenheit eines
Elektrotransfers. Nachfolgend wird eine Tabelle aufgeführt, die
diese Berechnungsart in dem Falle, wo der Elektrotransfer eingesetzt
wird, zusammenfasst.
-
-
So
erlaubt die Verringerung der Variabilität zwischen den Individuen,
die mit dem Elektrotransfer erzielt wird, genaue analytische Untersuchungen
hinsichtlich des Vergleichs der Expression von verschiedenen Genen
auszuführen.
Sie erlaubt gleichfalls eine bessere Definition der Behandlungsdosen
und muss das Risiko, welches mit dem Überschrei ten der in dem therapeutischen
Fenster annehmbaren Dosen verbunden sind, verhüten.
-
Der
Test zum Vergleich der Neigungen, die für jede Regression erhalten
werden, ist nicht-signifikant. Man kann folglich mit einem 5%-igen Risiko damit
rechnen, dass es eine Parallelität
der beiden Regressionen gibt.
-
Die
Berechnung der relativen Potenz zeigt, dass man, um ein Expressionsniveau
zu erreichen, das vergleichbar ist mit jenem, das in Gegenwart eines
Elektrotransfers erhalten wird, in Abwesenheit eines Elektrotransfers
ungefähr
250-mal mehr pro Muskel injizierte DNA (243 ± 85; Konfidenzintervall P
= 95%) benötigt.
-
Die
Berechnung der relativen Potenz zeigt korrelierend, dass bei einer
gegebenen DNA-Menge das Expressionsniveau ungefähr 500-fach höher ist
in Anwesenheit von Elektrotransfer verglichen mit dem in Abwesenheit
eines Elektrotransfers erhaltenen Expressionsniveau.
-
Beispiel 15: Vergleich
der verschiedenen Elektrodentypen
-
Dieses
Beispiel hat zum Ziel, die Wirkung von zwei Elektrodentypen, Plattenelektroden
und nadelförmigen
Elektroden, auf die Wirksamkeit des Nukleinsäuretransfers zu vergleichen.
Die nadelförmigen
Elektroden wurden gleichfalls entsprechend unterschiedlichen Implantationsorientierungen
getestet.
-
Das
Plasmid pXL 2774 (150 μg)
wird in den Triceps-Muskel der Ratte injiziert. Die Plattenelektroden werden
plaziert, wie in Beispiel 1 angegeben. Der Abstand zwischen den
Elektroden beträgt
für die
Plattenelektroden 1,2 cm. Bei den nadelförmigen Elektroden beträgt der Abstand
zwischen den Elektroden 0,9 cm. Die nadelförmigen Elektroden werden in
das Muskelgewebe auf eine äquivalente
Länge entweder
rechtwinklig oder parallel zur Achse der Fasern zu beiden Seiten
des Injektionsorts eingeführt.
Unabhängig
von der Art der Elektroden oder von deren Orientierung sind die
Bedingungen für
die Anwendung des elektrischen Felds die Folgenden: Intensität 200 V/cm,
8 Impulse von 20 ms bei 2 Hz. Die Ergebnisse sind in der 8 aufgeführt.
-
Die
erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die Anwendung des elektrischen
Felds mit Hilfe der beiden parallelen, in den Muskel implantierten
Nadeln Ergebnisse liefert, die vergleichbar sind mit jenem, das
mit Plattenelektroden, die in Kontakt mit der Haut, die den Muskel
umgibt, gebracht werden, erhalten wird. Es wird gleichfalls gezeigt,
dass die Wirksamkeit des Elektrotransfers von der Implantierungsrichtung
der nadelförmigen
Elektroden bezogen auf die Achse der Muskelfasern unabhängig ist.
-
Dieses
Beispiel zeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren den Elektrotransfer
von Nukleinsäuren mit
Hilfe von äußerlichen
oder invasiven Elektroden erlaubt und dies unabhängig von ihrer Orientierung.
Die Verwendung von nadelförmigen
Elektroden ist besonders vorteilhaft, um den Transfer von Nukleinsäuren in die
Muskeln von großer
Größe sicherzustellen,
da man sich an elektrische Impulse von mäßiger Spannung (beispielsweise
100 V mit einem Abstand von 0,5 cm, um ein elektrisches Feld von
200 V/cm abzugeben) hält.
-
Beispiel 16: Wirksamkeit
des Elektrotransfers bei verschiedenen Muskeln der Maus, der Ratte,
des Kaninchens und des Affen.
-
Dieses
Beispiel veranschaulicht, dass der Elektrotransfer von Nukleinsäuren auf
unterschiedliche Arten von Muskeln in unterschiedlichen Spezies
von Säugetieren
(Maus, Kaninchen, Ratte und Affe) anwendbar ist.
-
Die
Bedingungen für
die Anwendung des elektrischen Felds sind in der Tabelle 10A in
Hinblick auf jede Spezies definiert. Die Ergebnisse sind in der
Tabelle 10A aufgeführt.
-
Tabelle
10A: Verstärkungsfaktor
der Expression der Luciferase, welcher mit der Elektrotransfektion
erhalten wird. Dieser Faktor wird durch Bezugnahme auf die Luciferaseaktivität, welche
bei Injektion des Plasmids pXL3031 oder pXL2774 ohne Elektrotransfer
erhalten wird, berechnet. Mittelwerte aus 10 Muskeln pro Gruppe.
Die Luciferaseaktivität
wird 7 Tage nach der Verabreichung des Plasmids quantitativ bestimmt.
-
Der
Elektrotransfer wird gleichfalls beim Affen (Macaca fascicularis)
untersucht. Das eingesetzte Plasmid ist das Plasmid pXL3179, welches
das den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 1 (FGF1 oder aFGF) kodierende
Gen umfasst.
-
Das
Plasmid pXL3179 (11) ist ein Vektor, welcher
abgeleitet ist von dem Plasmid pXL2774 (WO 97/10343), in welches
das eine Fusion zwischen dem Signalpeptid des Interferons von humanen
Fibroblasten und der cDNA von FGF1 (Fibroblastenwachstumsfaktor
1) (sp-FGF1, Jouanneau et al., 1991, PNAS 88:2893-2897) kodierende
Gen unter die Kontrolle des aus der frühen Region des humanen Zytomegalievirus (hCMV
IE) stammenden Promotors und des Polyadenylierungssignals aus der
späten
Region des SV40-Virus (Genbank SV4CG) eingeführt worden ist.
-
Die
Anwesenheit von FGF1 wird durch Immunhistochemie bestimmt. Die Werte
geben die Anzahl von positiven Schnitten 3 Tage nach einer intramuskulären Injektion
von 500 μg
des Plasmids pXL3179 an. Die Anwendungsbedingungen des elektrischen
Felds sind die folgenden: Inten sität des elektrischen Felds 200 V/cm,
8 Impulse von 20 ms bei 1 Hz. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden
Tabelle aufgeführt.
-
Tabelle
10B: Nachweis der Expression von FGF1 in verschiedenen Muskeln des
Affen (Macaca fascicularis) durch Immunhistochemie. Die Werte geben
die Anzahl von positiven Schnitten 3 Tage nach intramuskulärer Injektion
von 500 μg
des Plasmids pXL3179, welches FGF1 kodiert, mit oder ohne Elektrotransfer
an.
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass der Elektrotransfer die Expression eines
Transgens in unterschiedlichen Arten von Muskeln, in unterschiedlichen
Spezies von Säugetieren
auf bemerkenswerte Weise erhöht.
-
Beispiel 17: Wirksamkeit
des Elektrotransfers beim Diaphragma-Muskel der Ratte
-
Die
Möglichkeit,
Gene von therapeutischem Interesse auf dauerhafte und stabile Weise
direkt auf der Höhe
des Diaphragmas zu exprimieren, ist ein besonders interessanter
therapeutischer Ansatz im Rahmen der Behandlung von bestimmten degenerativen
Erkrankungen, die die Funktionsfähigkeit
dieses Muskels beeinträchtigen,
wie insbesondere der Duchenne-Myopathie.
-
Die
Ratten werden mit einer Mischung von Largactyl und Ketamin (1 mg/kg
Largactyl, 150 mg/kg Ketamin) anästhesiert.
In diesem Experimenten wird das Diaphragma durch einen Einschnitt
entlang des Sternums zugänglich
gemacht. Die Injektion erfolgt in das halbe Diaphragma (50 μg des Plasmids
pXL 2774 in 50 μl
20 mM NaCl und 5% Glucose). Die Plattenelektroden werden dann auf
beiden Seiten der Ebene des Diaphragmas entlang der Injektionsbahn
(Abstand zwischen den Elektroden = 1 mm) angeordnet. Die Bedingungen
des Elektrotransfers sind die folgenden: Feldstärke 160 V/cm oder 300 V/cm,
8 Impulse von 20 ms, Frequenz 1 Hz. Das elektrische Feld wird weniger
als eine Minute nach der Injektion angewendet. Das Tier wird dann
wieder vernäht.
-
Tabelle
11: Mittelwerte +/– Standardabweichung
der Luciferase-Aktivität
in Millionen RLU pro Muskel. N = 12 für jede Gruppe.
-
Dieses
Beispiel zeigt eine signifikante Verstärkung der Expression des Transgens
in dem Diaphragma nach Anwendung von 8 Impulsen von 20 ms mit einer
Feldstärke
von 160 V/cm (p < 0,003
mit dem nicht-parametrischen
Mann-Whitney-Test).
-
Beispiel 18: Transfer
eines die sekretierte alkalische Phosphatase (SeAP) kodierenden
Gens und Kinetik der Expression der SeAP.
-
Dieses
Beispiel veranschaulicht die Fähigkeit
des erfindungsgemäßen Verfahrens,
den Muskel in ein Organ umzuwandeln, das ein Polypeptid von therapeutischem
Interesse oder von Interesse in Zusammenhang mit Impfungen sezerniert,
und die Anwesenheit einer hohen und stabilen Konzentration des Polypeptids
von Interesse sicherzustellen.
-
In
diesem Beispiel wurde das Elektrotransferverfahren an der ausgewachsenen
Maus mit einem Plasmid getestet, welches das die sekretierte plazentare
humane alkalische Phosphatase kodiert. Ausgewachsene C57BL6-Mäuse erhielten
in den kranialen Tibia-Muskel und einseitig eine Injektion des Plasmids
pXL3010.
-
Das
Plasmid pXL3010 (13) ist ein Vektor, der von
ColEl abgeleitet ist, in welchen das die aus pSEAP-basic (Clontech,
Genbank: CVU09660) stammende, sekretierte alkalische Phosphatase
kodierende Gen unter der Kontrolle des CMV-Promotors, welcher aus
dem Plasmid pCDNA3 (Invitrogen, Niederlande) stammt, und des Polyadenylierungssignals
der späten
Region des SV40-Virus (Genbank SV4CG) eingeführt worden ist.
-
Die
Bedingungen für
den Elektrotransfer sind die folgenden elektrisches Feld 200 V/cm,
8 Impulse von 20 ms, Frequenz 1 Hz. Das elektrische Feld wird 20
s nach der Injektion angewendet. Die Blutentnahmen erfolgten 7 Tage
später
auf der Höhe
des retroorbitalen Plexus. Die Konzentration von alkalischer Phosphatase im
Serum wird bestimmt wird gemessen mit Hilfe eines Chemolumineszenztests
(Phospha-light, Tropix, Bedford, MA 01730). Die Injektion eines
nicht-kodierenden Plasmids (pUC19) in den Muskel, gefolgt von der
Anwendung eines elektrischen Felds oder nicht, erlaubt, die Abwesenheit
des der endogenen alkalischen Phosphatase-Aktivität entsprechenden
Signals zu verifizieren. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 12 aufgeführt.
-
Tabelle
12: Mittelwerte ± Standardabweichung
der im Blut zirkulierenden Konzentration von alkalischer Phosphatase
(SeAP) in ng/ml Serum.
-
Wenn
das Plasmid pXL3010 durch Elektrotransfektion verabreicht wird,
stellt man eine Erhöhung
der SeAP-Konzentration im Blut um einen Faktor von 140 oder 170
fest.
-
Die
Injektion von 400 μg
Plasmid (Injektion von 100 μg
DNA in den kranialen Tibia-Muskel beidseitig und auf zwei Mal im
Abstand von 30 min vor Anwendung des elektrischen Felds) erlaubt,
mit dem Elektrotransfer eine Serumkonzentration von 2200 ng/ml von
alkalischer Phosphatase gegenüber
16 ng/ml in Abwesenheit des Elektrotransfers zu erreichen.
-
Es
ist anzumerken, dass die Zugabe einer nicht-kodierenden DNA (pUC19),
die erlaubt, bei konstanter DNA-Menge (10 μg DNA insgesamt pro Maus) zu
arbeiten, erlaubt, das Expressionsniveau der alkalischen Phosphatase
bei geringen injizierten Mengen von pXL3010-Plasmid (≤ 1 μg) noch zu
erhöhen.
-
Es
wurde eine Kinetik der Expression der SeAP ausgeführt. Die
verabreichte Plasmid-Dosis beträgt 15 μg pro Muskel
beidseitig, was 30 μg
pro Maus entspricht. Die Ergebnisse sind in der 9 aufgeführt. Man beobachtet
ab 7 Tage nach der Injektion eine bedeutende und dauerhafte (wenigstens
während
zweier Monate) Erhöhung
der im Blut nachgewiesenen SeAP-Konzentration, wenn das Plasmid
pXL3010 durch Elektrotransfer verabreicht wird.
-
Die
Gesamtheit dieser Ergebnisse bestätigt, dass der Transfer von
Nukleinsäuren
in den Muskel mit dem erfindungsgemäßen Verfahren es erlaubt, ein
hohes und dauerhaftes Expressionsniveau zu erhalten ebenso für im Muskel
lokalisierte Proteine wie auch für
sekretierte Proteine, und dass es so möglich ist, den Muskel in ein
Organ, welches ein Polypeptid von Interesse sezerniert, umzuwandeln.
-
Beispiel 19: Transfer
eines Erythropoietin (EPO) kodierenden Gens
-
Ausgewachsene
C57B1/6-Mäuse
haben in den kranialen Tibia-Muskel und einseitig eine Injektion
von Plasmid pXL3348 erhalten. Das Plasmid pXL3348 (16)
ist ein Vektor, der von dem Plasmid pXL2774 abgeleitet ist, in welchen
das Erythropoietin-Gen aus der Maus (NCBI: 193086) unter der Kontrolle
des Promotors, welcher aus der frühen Region des humanen Zytomegalievirus
(hCMV IE) stammt, und des Polyadenylierungssignals der späten Region
des SV40-Virus (Genbank SV4CG) eingeführt worden ist.
-
Die
Bedingungen für
den Elektrotransfer sind die folgenden: elektrische Feldstärke 200
V/cm, 8 Impulse von 20 ms, Frequenz 1 Hz. Das elektrische Feld wird
unverzüglich
nach der Injektion der Plasmid-DNA angewendet.
-
Tabelle
13: Mittelwerte ± Standardabweichung.
N = 4 bis 5.
-
Man
beobachtet bei dem Elektrotransfer eine sehr deutliche Erhöhung der
Erythropnietin-Menge im Blut am Tag 7 (J7) und am Tag 24 (J24) bei
einer Verabreichung von 10 μg
pXL3348. Außerdem
ist die physiologische Wirkung der Erhöhung des Erythropoietins, die
durch eine Erhöhung
des Hämatokrits
zum Ausdruck kommt, sehr bedeutend (85%) ab Tag 7 (J7) und dies
sogar bei einer sehr geringen Plasmidmenge (1 μg).
-
Beispiel 20: Transfer
eines vaskulären
Wachstumsfaktor (VEGF) kodierenden Gens
-
Ausgewachsene
C57B16- oder SCID-Mäuse
erhielten in den kranialen Tibia-Muskel und beidseitig eine Injektion
von pCOR hVEGF (pXL3212, 15 μg).
-
Das
Plasmid pXL3212 (11) ist ein Vektor, der von
dem Plasmid pXL2774 (WO 97/10343) abgeleitet ist, in welchen die
den VEGF165 („Vascular
Endothelial Growth Factor",
Genbank: HUMEGFAA) kodierende cDNA unter der Kontrolle des aus der
frühen
Region des humanen Zytomegalievirus (hCMV IE) stammenden Promotors
und des Polyadenylierungssignals der späten Region des SV40-Virus (Genbank
SV4CG) eingeführt
wurde.
-
Die
Bedingungen des Elektrotransfers sind die folgenden: elektrische
Feldstärke
250 V/cm, 8 Impulse von 20 ms, Frequenz 2 Hz. Die Blutabnahmen erfolgten
auf der Höhe
des retroorbitalen Plexus. Die Abnahmen erfolgten einen Tag vor
und sieben Tage nach der Injektion des Plasmids. Die immunenzymatische
quantitative Bestimmung des humanen VEGF erfolgte mit Hilfe des
Kits Quantikine (R&D
System). Der Test wurde mit humanem VEGF in Mäuse-Serum kalibriert. Die Ergebnisse
sind in der Tabelle 14 aufgeführt.
-
Tabelle
14: Serumkonzentration (ng/l) von VEGF bei C57B16- und SCID-Mäusen
-
Beispiel 21: Transfer
eines Faktor IX kodierenden Gens.
-
Ausgewachsene
C57B16- oder SCID-Mäuse
erhielten in den kranialen Tibia-Muskel und beidseitig eine Injektion
von pXL3388 (15 μg).
-
Das
Plasmid pXL3388 (12) ist ein Vektor, der von
dem Plasmid pXL2774 (WO 97/10343) abgeleitet ist, in welchen die
den humanen Faktor IX (Christmas-Faktor), Genbank: HUMFIXA) kodierende
cDNA unter der Kontrolle des aus der frühen Region des humanen Zytomegalievirus
stammenden Promotors (hCMV IE, Genbank HS5IEE) und des Polyadenylierungssignals
der späten
Region des SV40-Virus (Genbank SV4CG) eingeführt wurde.
-
Die
Bedingungen des Elektrotransfers sind die folgenden: elektrische
Feldstärke
200 V/cm, 8 Impulse von 20 ms, Frequenz 2 Hz. Die Blutabnahmen erfolgten
auf der Höhe
des retroorbitalen Plexus. Die Abnahmen erfolgten sieben Tage nach
der Injektion des Plasmids. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 15
aufgeführt.
-
Tabelle
15: Plasmakonzentration von Faktor IX bei C57B16- oder SCID-Mäusen
-
Der
humane Faktor IX ist im Blut lediglich dann nachweisbar, wenn das
Plasmid unter den Bedingungen des erfindungsgemäßen Verfahrens verabreicht
worden ist.
-
Beispiel 22: Transfer
eines den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 1 (FGF1) kodierenden Gens
-
Ausgewachsene
C57B16- oder SCID-Mäuse
erhielten in den kranialen Tibia-Muskel und beidseitig eine Injektion
von pCOR FGF1 (pXL3096, 15 μg).
-
Das
Plasmid pXL3096 (14) ist ein Vektor, der abgeleitet
ist von dem um eine Sequenz, die in der Lage ist, eine Dreifachhelix
zu bilden (TH, Wils et al., 1997, Gene Ther. 4:323-330), ergänzten Plasmid pXL2774
(WO 97/10343), in das das eine Fusion zwischen dem Signalpeptid
des Interferons von humanen Fibroblasten und der cDNA von FGF1 (Fibroblastenwachstumsfaktor
1) (sp-FGF1, Jouanneau et al., 1991, PNAS 88:2893-2897) kodierende
Gen unter der Kontrolle des aus der frühen Region des humanen Zytomegalievirus
(hCMV IE) stammenden Promotors, gefolgt von der Leader-Sequenz (transkribiert,
nicht translatiert) des TK-Gens von HSV1 und dem Polyadenylierungssignal
aus der späten
Region des SV40-Virus (Genbank SV4CG), eingeführt worden ist.
-
Die
Bedingungen für
den Elektrotransfer sind die folgenden: elektrische Feldstärke 200
V/cm, 8 Impulse von 20 ms, Frequenz 2 Hz. Die Anwesenheit von FGF1
wird dann durch Immunhistochemie nachgewiesen.
-
Die
Ergebnisse für
die C57BL6-Mäuse
sind in der 10 aufgeführt. Man stellt fest, dass
die Anzahl von positiven Fasern sehr deutlich höher ist bei der Gruppe, die
dem elektrischen Feld unterworfen worden ist, verglichen mit der
Kontrollgruppe (welche eine Injektion von pXL3096 erhalten hat,
aber keinem elektrischen Feld unterworfen worden ist). Die Anwesenheit
von FGF1 bei der Kontrollgruppe ist am Tag 21 und Tag 35 praktisch
nicht nachweisbar, wohingegen eine bedeutende Anzahl von positiven
Fasern bei den durch Elektrotransfer behandelten Gruppen beobachtbar
bleibt.
-
Die
Ergebnisse für
die SCID-Mäuse
sind in der Tabelle 16 aufgeführt.
Tabelle
16: Expression von FG F, immunhistochemische Untersuchung und Anzahl
von positiven Fasern auf einem Muskelschnitt, der in dem medianen
Abschnitt des Muskels entnommen wurde.
-
Die
Expression von FGF1, wie durch die Anzahl von durch Immunhistochemie
nachgewiesenen positiven Fasern bestimmt, wird einzig in den Muskeln
nachgewiesen, die dem elektrischen Feld unterworfen worden sind.
Es ist festzuhalten, dass die Expression von FGF1 sogar bei einer
geringen Dosis von verabreichtem Plasmid (1,5 μg) nachgewiesen wird.
-
Beispiel 23: Transfer
eines den neurotrophen Faktor NT3 kodierenden Gens
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
wurde auf die ausgewachsene Maus (C57B16) und die kleine Xt/pmn-Maus
für den
Transfer des Neurotrophin 3 (NT3) kodierenden Gens angewendet. Die
pmn-Mäuse
bilden ein Mäuse-Modell für die amyotrophe
Lateralsklerose (ALS), die durch eine frühe und schnelle Degeneration
der Motoneuronen und durch eine mittlere Lebensdauer von ungefähr 40 Tagen
gekennzeichnet ist.
-
23.1 – Transfer des NT3 kodierenden
Gens in ausgewachsene Mäuse
-
C57B1/6-Mäuse im Alter
von 5 Wochen haben in den kranialen Tibia-Muskel und einseitig eine Injektion
des Plasmids pXL3149 (12,5 μg),
welches das Neurotrophin 3 (NT-3) aus der Maus kodierende Gen enthält, erhalten.
-
Das
Plasmid pXL3149 (14) ist ein Vektor, der von
dem Plasmid pXL2774 (WO 97/10343) abgeleitet ist, in welchen das
Neurotrophin 3 (NT-3) kodierende Gen aus der Maus (Genbank MMNT3)
unter der Kontrolle des Promotors, welcher aus der frühen Region
des humanen Zytomegalievirus (hCMV IE) stammt, und des Polyadenylierungssignals
der späten
Region des SV40-Virus (Genbank SV4CG) eingeführt worden ist.
-
Die
Bedingungen für
den Elektrotransfer sind die folgenden: elektrische Feldstärke 250
V/cm, 4 Impulse von 20 ms, Frequenz 1 Hz. Das elektrische Feld wird
unverzüglich
nach der Injektion der Plasmid-DNA angewendet. Die Anwesenheit von
NT3 wird im 12000 g-Überstand
von Muskelhomogenisaten in PBS-Puffer 7 Tage nach der Behandlung
der Mäuse
untersucht. Die NT3-Menge wird durch quantitative ELISA-Bestimmung [Kit
Promega} gemessen.
-
Die
Mittelwerte (± 95%-Konfidenzintervall)
von 20 Muskeln sind 77 +/–11
pg/Muskel (ohne Elektrotransfer verabreichte Plasmid-DNA) und 2700
+/– 900
pg/Muskel (mit Elektrotransfer verabreichte Plasmid-DNA) Man beobachtet
so eine Erhöhung
der produzierten NT3-Menge im Muskel um den Faktor 55, wenn das
Plasmid pXL3149 unter den Bedingungen des erfindungsgemäßen Verfahrens
transferiert wird.
-
23.2 – Transfer des NT3 kodierenden
Gens in kleine Mäusen
-
Ein
Vergleichsexperiment wurde an heterozygoten Xt pmn-Mäusen im
Alter von 4 bis 5 Tagen mit dem Plasmid pXL3149 ausgeführt. Die
injizierten Dosen sind 130 μg
pro Tier und die Injektionen erfolgen an einer Mehrzahl von Stellen
in unterschiedliche Muskeln des Tiers Gastroknemicus 25 μg, kranialer
Tibiamuskel 12,5 μg).
-
Die
Bedingungen für
den Elektrotransfer sind die folgenden: elektrische Feldstärke 500
V/cm, 4 Impulse von 20 ms, Frequenz 1 Hz.
-
Die
Anwesenheit von NT3 wird 7 Tage nach der Verabreichung des Plasmids
im Plasma und im Muskel (Gastroknemicus oder kranialer Tibiamuskel)
untersucht. Ein Vergleichstest hinsichtlich des NT3-Grundniveaus
erfolgt durch Verabreichung einer NaCl 0,9%-Lösung. Die Menge von NT3 wird
durch eine quantitative ELISA-Bestimmung [Kit Promega] bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 17 aufgeführt.
-
Tabelle
17: Mittelwerte ± Standardabweichung
der Menge von NT3 (pg pro Muskel und pg pro ml Plasma).
-
Unter
den Bedingungen des Experiments beobachtet man ein Grundniveau des
Signals des Nachweises von NT3 in dem Gastroknemicus-Muskel und
in dem kranialen Tibia-Muskel. In Abwesenheit eines Elektrotransfers
ist das Expressionsniveau des NT3-Gens, welches bei der Injektion
des Plasmids pXL3149 erhalten wird, nicht höher als das Grundniveau des
Nachweises von NT3 im Muskel. Wenn das Plasmid mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
verabreicht wird, stellt man fest, dass die im Muskel nachgewiesene
Menge von NT3 sehr signifikant erhöht ist. Man beobachtet gleichfalls,
dass die durch den Muskel sezernierte und im Plasma nachgewiesene
NT3-Menge unter diesen Bedingungen sehr deutlich erhöht ist (Erhöhungfaktor
~ x 35):
Diese Ergebnisse zeigen, dass bei einer gegebenen
DNA-Menge das erfindungsgemäße Verfahren
erlaubt, die Wirksamkeit des DNA-Transfers sehr signifikant zu verbessern
und nicht nur im Muskel, sondern gleichfalls im Plasma eine bedeutende
Erhöhung
der Menge eines Neurotrophins, wie NT3, zu erhalten.
-
Beispiel 24: Transfer
des humanes Wachstumshormon kodierenden Gens
-
C57B1/6-Mäuse haben
in den kranialen Tibia-Muskel und einseitig eine Injektion des Plasmids pXL3353
(10 μg)
oder des Plasmids pXL3354 (10 μg)
erhalten. Das Plasmid pXL3353 (15) ist
ein Vektor, der von dem Plasmid pXL2774 abgeleitet ist, in das das
vollständige
Gen des humanen Wachstumshormons (XbaI/SphI-Fragment von hGH, das
sich von dem Transkriptionsstartsignal, BamH1-Stelle, bis 224 bp
nach der polyA-Stelle erstreckt) unter der Kontrolle des aus der
frühen
Region des humanen Zytomegalievirus (hCMV IE) stammenden Promotors
und des Polyadenylierungssignals der späten Region des SV40-Virus eingeführt worden
ist.
-
Die
cDNA des Gens von humanem Wachstumshormon wurde erhalten durch umgekehrte
Transkription einer mRNA-poly(A+)-Bank der humanen Hypophyse, gefolgt
von 30 Zyklen PCR-Amplifizierung mit den folgenden Oligonukleotiden:
Zu
der 5'-Region komplementäres Oligonukleotid:
5'- GGGTCTAGAGCCACCATGGCTACAGGCTCCCGGAC-3'
Dieses Oligonukleotid
enthält
eine XbaI-Stelle und die Kozak-Sequenz.
Zu
der 3'-Region komplementäres Oligonukleotid:
5'- GGGATGCATTTACTAGAAGCCACAGCTGCCTC-3'
Dieses Oligonukleotid
enthält
eine NsiI-Stelle und das Stop-Codon.
-
Das
amplifizierte Fragment wurde in das Plasmid pCR2.1 (TA Cloning kit,
Invitrogen) eingeführt
und sequenziert. Ein XbaI/NsiI-Fragment von 681 bp, welches die
cDNA von hGH enthält,
wurde mit dem XbaI/NsiI-Fragment von pXL3353 ligiert, wodurch das
Plasmid pXL3354 erzeugt wurde (15).
-
Die
Bedingungen für
den Elektrotransfer sind die folgenden: elektrische Feldstärke 200
V/cm, 8 Impulse von 20 ms, Frequenz 1 Hz. Das elektrische Feld wird
unverzüglich
nach der Injektion der Plasmid-DNA angewendet. Es wird das Vorhandensein
von hGH 7 Tage nach der Behandlung der Mäuse an dem bei 12000 g zentrifugierten Überstand
der Muskelhomogenisate in PBS-Puffer untersucht. Die hGH-Menge wird
durch eine quantitative ELISA-Bestimmung (Boehringer Mannheim) gemessen.
-
Tabelle
18: Mittelwerte ± Standardabweichung
des hGH-Proteins (Pikogramm)/Muskel
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass der Elektrotransfer ermöglicht, eine sehr bedeutende
Erhöhung
des humanen Wachstumshormons zu erhalten. Es ist festzuhalten, dass
diese Amplifizierung gleichfalls mit dem Plasmid, welches das vollständige Gen
mit allen seinen Regulationssequenzen enthält, beobachtet wird.
-
Beispiel 25: Wirkung des
Elektrotransfers auf die Expression von Impftransgenen
-
Dieses
Beispiel weist nach, dass das erfindungsgemäße Verfahren gleichfalls anwendbar
ist auf den Transfer von Genen, die Polypeptide von Interesse in
Zusammenhang mit Impfungen kodieren.
-
Das
Experiment erfolgt an weiblichen Balb/c-Mäusen im Alter von 9 Wochen.
Die eingesetzten Elektroden sind Plattenelektroden aus rostfreiem
Stahl im Abstand von 5 mm. VR-HA ist eine Plasmid-DNA, welche das
Gen des Hämagglutinins
aus dem Grippevirus (Stamm A/PR/8/34) umfasst. VR-gB ist eine Plasmid-DNA, welche
das Gen des Glycoproteins B (gB) des humanen Zytomegalievirus (Stamm
Towne) umfasst.
-
Die
Plasmid-Lösung
(50 μl einer
Lösung
mit 20 μg/ml
oder 200 μg/ml
in NaCl 0,9%) wird längs
durch die Haut hindurch in den kranialen Tibia- Muskel einseitig injiziert. Die elektrischen
Impulse werden 20 s nach der Verabreichung des Plasmids rechtwinklig
zu der Achse des Muskels mit Hilfe eines Generators von Rechteckimpulsen
(elektrische Feldstärke
200 V/cm, 8 aufeinanderfolgende Impulse mit einer Dauer von 20 ms,
Frequenz 1 Hz) angwendet.
-
Zur
Auswertung der Stimulation der Immunantwort wurde dem folgenden
Immunisierungsprotokoll gefolgt.
J 0 (Tag 0) Entnahme des Vorimmun-Serums
J
1 (Tag 1) primäre
Injektion, + oder – Elektrotransfer
J
2 (Tag 2) Entnahme von Immunserum
J 2 (Tag 2) Wiederholungs-Injektion,
+ oder – Elektrotransfer
J
42 (Tag 42) Entnahme von Immunserum
J 63 (Tag 63) Entnahme
von Immunserum
-
Die
Blutentnahmen erfolgen auf der Höhe
des retro-orbitalen Sinus. Die quantitativen Bestimmungen der spezifischen
Antikörper
erfolgen durch ELISA. Jeder experimentelle Zustand wird an 10 Tieren,
die eine einseitige Injektion erhalten haben, getestet.
-
Die
Ergebnisse, die die Titer von Antikörpern, die gegen Hämagglutinin
des Grippevirus gerichtet sind, betreffen, sind in der Tabelle 19A
aufgeführt.
-
Tabelle
19-a: Titer von Antikörpern,
die gegen Hämagglutinin
des Grippe-Virus gerichtet sind, erhalten nach Injektion von 1 oder
10 μg DNA
(VR-HA) in Abwesenheit oder in Gegenwart von elektrischen Impulsen.
Die Ergebnisse sind die geometrischen Mittelwerte von 10 Tieren
(8 Tiere für
die Gruppe, denen 1 μg
DNA in Gegenwart von elektrischen
-
Impulsen
injiziert worden ist, und entnommen am Tag 63 (J 63)) ± Standardabweichung.
Der Wert von p wurde durch Vergleich von jeweils zwei der Gruppen,
die eine Injektion in Gegenwart und in Abwesenheit von elektrischen
Impulsen erhalten haben, unter Verwendung des nicht-parametrischen Tests
von Mann-Whitney erhalten.
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass die Titer von Antikörpern, die gegen das Hämagglutinin
des Grippe-Virus gerichtet sind, um einen Faktor von ungefähr 10 erhöht sind
in den Gruppen, die den elektrischen Impulsen unterworfen worden
waren. So weisen die Mäuse,
die 1 μg
DNA in Gegenwart von elektrischen Impulsen erhalten hatten, einen
mittleren Antikörpertiter
auf, der leicht höher
ist als jener der Mäuse,
die 10 μg
DNA in Abwesenheit von elektrischen Impulsen erhalten hatten.
-
Die
Ergebnisse, die die Titer von Antikörpern, die gegen das Glycoprotein
B des humanen Zytomegalievirus gerichtet sind, betreffen, sind in
der Tabelle 19B aufgeführt.
-
Tabelle
19B: Titer von Antikörpern,
die gegen das Glycoprotein B (gB) des humanen Zytomegalievirus gerichtet sind,
erhalten nach Injektion von 10 μg
DNA (VR-gB) in Abwesenheit oder in Gegenwart von elektrischen Impulsen.
Die Ergebnisse sind die geometrischen Mittelwerte von 10 Tieren
(9 Tiere für
die Gruppe, die eine Injektion in Gegenwart von elektrischen Impulsen
erhalten hat) ± Standardabweichung.
Der Wert von p wurde durch Vergleich von jeweils zwei der Gruppen,
die eine Injektion in Gegenwart und in Abwesenheit von elektrischen
Impulsen erhalten haben, unter Verwendung des nicht-parametrischen
Mann-Whitney-Tests erhalten.
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass die Titer von Antikörpern, die gegen das Glycoprotein
B des humane Zytomegalievirus gerichtet sind, um einen Faktor von
4 am Tag 42 (J42) erhöht
sind in der Gruppe, die den elektrischen Impulsen unterworfen worden
war. Man stellt gleichfalls fest, dass der Variationskoeffizient
in den Gruppen von Tieren, die den elektrischen Impulsen unterzogen
worden sind, im Mittel dreimal geringer ist.