DE69828193T2

DE69828193T2 - Hyaluronan synthase gen und seine verwendung

Info

Publication number: DE69828193T2
Application number: DE69828193T
Authority: DE
Inventors: H. Paul WEIGEL; Kshama Kumari; Paul Deangelis
Original assignee: University of Oklahoma
Current assignee: University of Oklahoma
Priority date: 1997-10-31
Filing date: 1998-10-30
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2018-10-31
Also published as: CA2307842A1; JP2001521741A; ATE284954T1; US7087413B2; US20060013829A1; US20060216793A1; US7504246B2; US20030082780A1; US7115405B2; AU762036B2; BR9814834B1; US20050202540A1; CA2307842C; AU1370699A; WO1999023227A9; US20060018924A1; JP4731013B2; ES2235378T3; US7060466B2; DE69828193D1

Description

Hintergrund
1. Gebiet
Die vorliegende Patentanmeldung betrifft ein Nucleinsäuresegment mit einem Segment mit codierender Sequenz, das enzymatisch aktive Streptococcus equisimilis-Hyaluronatsynthase (seHAS) und betrifft die Verwendung dieses Nucleinsäuresegmentes in der Herstellung von rekombinanten Zellen, die Hyaluronatsynthase, sowie deren Hyaluronsäureprodukt. Hyaluronat ist als Hyaluronsäure oder Hyaluronan bekannt.
2. Kurze Beschreibung des verwandten Gebietes
Das Auftreten von Streptokokkeninfektionen ist weltweit ein Gesundheitsproblem und ein wirtschaftliches Problem und speziell in den Entwicklungsländern. Eine Ursache dafür ist auf die Fähigkeit der Streptokokken-Bakterien zurückzuführen, unerkannt mit Hilfe der Phagocyten-Zellen des Körpers, d.h. der Makrophagen und polymorphkernigen Zellen (PMN) zu wachsen. Diese Zellen sind für das Erkennen und Umfließen fremder Mikroorganismen verantwortlich. Eine wirksame Möglichkeit der Bakterien, die Überwachung zu umgehen, besteht darin, sich mit Polysaccharidkapseln, wie beispielsweise einer Hyaluronsäure (HA)-Kapsel zu überziehen. Die Struktur von HA ist sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten identisch. Da HA in der Regel nicht-immunogen ist, rufen die gekapselten Bakterien keine Immunantwort hervor und werden daher zur Zerstörung nicht aufs Ziel genommen. Darüber hinaus übt die Kapsel eine antiphgocytische Wirkung auf PMN's in vitro aus und verhindert die Anhaftung von Streptococcus an Makrophagen. Genau aus diesem Grund sind in Streptokokken der Gruppe A und Gruppe C die HA-Kapseln die Haupt-Virulenzfaktoren bei natürlichen und experimentellen Infektionen. Streptococcus der Gruppe A sind für zahlreiche Humanerkrankungen verantwortlich, einschließlich Pharyngitis, Eiterflechten, Infektionen des Tiefengewebes, rheumatisches Fieber und toxisches Schocksyndrom. Der Streptococcus equisimilis Gruppe C ist verantwortlich für Osteomyelitis, Pharyngitis, Hirnabszesse und Lungenentzündung.
Strukturell ist HA ein hochmolekulares lineares Polysaccharid von repetierenden Disaccharid-Einheiten, die aus N-Acetylglucosamin (GlcNAc) und Glucuronsäure (GlcA) bestehen. Die Zahl der repetierenden Disaccharide in einem HA-Molekül kann 30.000 mit einem M_r>10⁷ überschreiten. HA ist das einzige Glykosaminoglykan, das sowohl von Zellen von Säugetieren als auch von Bakterienzellen und speziell Streptococci der Gruppen A und C und Pasturella multocida Typ A synthetisiert wird. Diese Stämme bauen HA auf, das in das Medium sowie die HA-Kapseln abgesondert wird. Der Mechanismus, mit dem diese Bakterien HA synthetisieren, ist von breitem medizinischem Interesse, da die Erzeugung der HA-Kapsel ein sehr wirksamer und geschickter Weg ist, den die Streptococci zur Umgehung der Überwachung durch das Immunsystem nutzen.
HA wird von Säugetierzellen und Bakterienzellen mit Hilfe des Enzyms Hyaluronatsynthase synthetisiert, das auf der Plasmamembran lokalisiert worden ist. Es wird angenommen, dass die Synthese von HA in diesen Organismen ein mehrstufiger Prozess ist. Die Einleitung umfasst das Binden eines anfänglichen Präkursors, UDP-GlciNAc oder UDP-GlcA. Diesem folgt die Elongation, die eine alternierende Addition der zwei Zucker an die wachsende Oligosaccharid-Kette umfasst. Das wachsende Polymer wird durch den Bereich der Plasmamembran der Zelle und in den extrazellulären Raum gestoßen. Obgleich das biosynthetische System zu HA eines der ersten Synthesewege des Membran-Heteropolysaccharids war, das untersucht wurde, wird der Mechanismus der HA-Synthese immer noch nicht richtig verstanden. Dieses kann darauf zurückzuführen sein, dass die heute entwickelten in vitro-Systeme insofern unzureichend sind, dass ein de-novo-Biosynthese von HA nicht erreicht worden ist.
Die Richtung des HA-Polymerwachstums ist immer noch ein Thema, wo es in der Fachwelt Meinungsverschiedenheiten gibt. Die Anlagerung der Monosaccharide könnte an dem reduzierenden oder nichtreduzierenden Ende der wachsenden HA-Kette erfolgen. Darüber hinaus bleiben Fragen bestehen (i) ob naszierende Ketten kovalent an einem Protein gebunden sind, an einem UDP oder an einem Lipid-Intermediat, (ii) ob Ketten unter Verwendung eines Primers initiiert werden, und (iii) nach dem Mechanismus, mit dem das reife Polymer durch die Plasmamembran des Streptococcus stößt. Ein Verständnis des Mechanismus der HA-Biosynthese kann die Entwicklung alternativer Strategien zur Kontrolle von Streptokokken- und Pasturella-Infektionen durch Eingriff in den Prozess ermöglichen.
HA ist nahezu in jedem Gewebe bei den Wirbeltieren identifiziert worden und hat eine weit verbreitete Verwendung in zahlreichen klinischen Anwendungen vor allem und nicht zuletzt als eine intraartikuläre Matrixergänzung und in der Augenchirurgie. Auch die wissenschaftliche Literatur hat eine Abkehr von der ursprünglichen Ansicht gezeigt, dass HA hauptsächlich eine passive Strukturkomponente in der Matrix einiger weniger Bindegewebe und in der Kapsel bestimmter Stämme von Bakterien ist, zu der Erkenntnis, dass dieses allgegenwärtige Makromolekül aktiv in zahlreichen biologischen Prozessen beteiligt ist: von einer modulierenden Zellmigration und Differenzierung während der Embryogenese zur Regulation extrazellularer Matrixorganisation und Metabolismus bis zu wichtigen Rollen in den komplexen Prozessen der Metastase, Wundheilung und Entzündung. Ferner ist deutlich geworden, dass HA metabolisch hoch aktiv ist und dass Zellen sehr viel Aufmerksamkeit auf die Prozesse ihrer Synthese und Katabolismus lenken. Beispielsweise liegt die Halbwertszeit von HA in Geweben im Bereich von 1 bis 3 Wochen in Knorpel bis zu weniger als 1 Tag in der Epidermis.
Heute ist eindeutig, dass ein einzelnes Protein beide Zuckersubstrate nutzt, um HA zu synthetisieren. Die Abkürzung HAS für die HA-Synthese hat weit verbreiteten Anhang zur Bezeichnung dieser Klasse von Enzymen gefunden. Markovitz et al. haben erfolgreich die HAS-Aktivität von Streptococcus pyrogenes charakterisiert und die Membranlokalisation des Enzyms entdeckt sowie dessen Anforderungen an Zuckernucleotid-Präkursoren und Mg²⁺. Prehm hat festgestellt, dass sich ausdehnende HA, die von B6-Zellen erzeugt wird, von Hyaluronidase abgebaut wird, die dem Medium zugegeben wird, und haben vorgeschlagen, dass HAS an der Plasmamembran angesiedelt ist. Philipson und Schwanz haben außerdem gezeigt, dass die HAS-Aktivität mit Plasmamembranmarkern in Maus-Oligodendrogliomzellen kofraktionierten.
HAS setzt eine HA mit hohem M_r zusammen, die gleichzeitig durch die Membran in den extrazellulären Raum stößt (oder im Fall von Bakterien die Zellkapsel aufbaut), wenn die Glykosaminoglykansynthese abläuft. Diese Art der Biosynthese ist unter den Makromolekülen einzigartig, da Nucleinsäuren, Proteine und Lipide in dem Nucleus, dem endoplasmatischen Retikulum/Golgi, Zytoplasma oder den Mitochondrien synthetisiert wird. Die Extrusion der wachsenden Kette in den extrazellulären Raum ermöglicht außerdem ein ungehindertes Polymerwachstum, wodurch die außergewöhnliche Größe von HA erreicht wird, während die Begrenzung der Synthese innerhalb eines Golgi- oder post-Golgi-Kompartimentes die Gesamtmenge oder Länge der erzeugten Polymere beschränken könnte. Eine hohe Konzentration von HA im Inneren eines begrenzten Lumens könnte auch eine Umgebung hoher Viskosität erzeugen, die für andere Organellenfunktionen hinderlich sein könnte.
In mehreren Untersuchungen ist versucht worden, HAS aus Stämmen von Streptococci zu solubilisieren, identifizieren und zu reinigen, die eine Kapselschicht aus HA aufbauen, sowie aus eukaryotischen Zellen. Obgleich die Streptokokken- und Maus-Oligodendroglia-Enzyme erfolgreich mit Detergens solubilisiert und untersucht wurden, blieben Bemühungen zur Reinigung einer aktiven HAS für die weitere Untersuchung oder das molekulare Klonen über Jahrzehnte ohne Erfolg. Prehm und Mausolf verwendeten Periodat-oxidiertes UDP-GlcA oder UDP-GlcNAc zur Affinitätsmarkierung eines Proteins von -52 kDa in Streptokokkenmembranen, die mit HAS einer Co-Reinigung unterzogen wurden. Dieses führte zu einer Veröffentlichung mit der Behauptung, dass die Gruppe C-Streptokokken-HAS geklont worden ist, was leider auf einem Irrtum beruhte. Dieser Untersuchung gelang es nicht, die Expression einer aktiven Synthase zu demonstrieren und wird in Wirklichkeit einen Peptidtransporter geklont haben. Von Triscott und van de Rijn wurde Digitonin benutzt, um HAS aus Streptokokkenmembranen in einer aktiven Form zu solubilisieren. Van de Rijn und Drake haben selektiv 3 Streptokokkenmembranproteine von 42, 33, und 27 kDa mit 5-Azido-UDP-GlcA radiomarkiert und vorgeschlagen, dass das 33-kDa-Protein HAS war. Wie sich jedoch später zeigte, hat sich das HAS in Wirklichkeit als das 42-kGa-Protein erwiesen.
Trotz dieser Bemühungen stagnierte der Fortschritt beim Verständnis der Regulation und der Mechanismen der HA-Synthese, da es keine Molekularsonden für HAS-mRNA oder HAS-Protein gab. Der große Durchbruch kam 1993, als DeAngelis et al. von dem molekularen Klonen und der Charakterisierung des Gruppe A-Streptokokken-Gens berichteten, dass das Protein HasA codiert. Von diesem Gen war bekannt, dass es ein Teil eines Operons war, das für die bakterielle HA-Synthese benötigt wird, obgleich die Funktion dieses Proteins, das heute als spHAS (die S. pyrogenes HAS) bezeichnet wird unbekannt war. spHAS erwies sich danach als verantwortlich für die HA-Elongation und war die erste Glykosaminglykansynthase, die identifiziert und geklont wurde und danach erfolgreich exprimiert wurde. Das S. pyrogenes HA-Syntheseoperon codiert zwei andere Proteine. HasB ist eine UDP-Glucosedehydrogenase, die zur Umwandlung von UDP-Glucose zu UDP-GlcA erforderlich ist, eines der Substrate für die HA-Synthese. HasC ist eine UDP-Glucosepyrophosphorylase, die zur Umwandlung von Glucose-1-phosphat und UTP zu UDP-Glucose erforderlich ist. Die Cotransfektion sowohl von hasA- als auch hasB-Genen entweder in ihre kapselfreien Streptococcus-Stämme oder Enterococcus faecalis verlieh ihnen die Fähigkeit zur Synthese von HA und eine Kapsel zu erzeugen. Dieses liefert den ersten nachhaltigen Beweis dafür, dass es sich bei HasA um eine HA-Synthase handelt.
Das schwer bestimmbare HA-Synthase-Gen wurde schließlich mit einem Transposon-Mutageneseversuch geklont, bei dem ein kapselfreier Mutant Gruppe A-Stamm erzeugt wurde, der einen Interrupt des HA-Syntheseoperons enthielt. Bekannte Sequenzen des Transposons erlaubten den Bereich der Verbindung mit der Streptokokken-DNA zu identifizieren und dann von Wildtyp-Zellen zu klonen. Die codierte spHAS war zu 5 bis 10% identisch mit einer Familie von Hefe-Chitinsynthasen und zu 30% identisch mit dem Xenopus laevis-Protein DG42 (im Zuge der Entwicklung während der Gastrulation exprimiert), dessen Funktion zu diesem Zeitpunkt unbekannt war. DeAngelis und Weigel exprimierten die aktive rekombinante spHAS in Escherichia coli und zeigten, dass das einzelne gereinigte Genprodukt HA mit hohem M_r synthetisiert, wenn es in vitro mit UDP-GlcA und UDP-GlcNAc inkubiert wurde, womit gezeigt wird, dass beide Glykosyltransferase-Aktivitäten, die für die HA-Synthese benötigt werden, durch das gleiche Protein katalysiert werden, wie erstmalig 1959 vorgeschlagen wurde. Dieses gab den Anlass für die fast gleichzeitige Identifizierung der eukaryotischen HAS-cDNA's im Jahr 1996 durch 4 Laboratorien die nachwiesen, dass es sich bei HAS um eine Multigenfamilie handelte, die verschiedene Isoenzyme codiert. Es wurden rasch zwei Gene (HAS1 und HAS2) in Säugern (29–34) entdeckt sowie ein drittes Gen HRS3, das später entdeckt wurde. Eine zweite Streptokokken-seHAS oder Streptococcus equisimilis-Hyaluronatsynthase ist jetzt entdeckt worden und wird hierin offenbart.
Wie ausgeführt, haben wir außerdem das authentische HAS-Gen aus der Gruppe C Streptococcus equisimilis (seHAS) entdeckt; das seHAS-Protein hat hochgradige Identität (näherungsweise 70%) zu de spHAS-Enzym. Diese Identität ist jedoch deshalb von Interesse, weil das seHAS-Gen keine Kreuzhybridisierung mit dem spHAS-Gen zeigt.
Membranen, die von E. coli exprimierender rekombinanter seHAS hergestellt werden, synthetisieren HA, wenn beide Substrate bereitgestellt werden. Die Ergebnisse bestätigen, dass die frühere Veröffentlichung von Lansing et al., wonach behauptet wurde, dass die Gruppe C HAS geklont worden sei, falsch ist. Leider haben verschiedene Untersuchungen Antikörper zu diesem uncharakterisierten 52-kDa-Streptokokkenprotein eingesetzt, um das zu untersuchen, wovon man meinte, dass es eukaryotische HAS sei.
Itano und Kimata verwendeten eine Expressionsklonierung in einer mutanten Maus-Säuger-Karzinomen-Zelllinie, die zur HA-Synthese unfähig ist, um die erste vermutliche Säuger-HAS-cDNA (mmHAS1) zu klonen. In der HA-Synthese fehlerhafte Subklone fielen in drei separate Klassen, die für die HA-Synthese in Stomatozellen-Fusionsversuchen komplementär waren, was nahelegt, dass mindestens drei Proteine erforderlich sind. Zwei dieser Klassen bewahrten eine gewisse HA-Syntheseaktivität, während die andere keine zeigte. Die letztere Zelllinie wurde in kurzen Transfektionsexperimenten mit cDNA verwendet, die aus den Parentalzellen hergestellt wurde, um ein einzelnes Protein zu identifizieren, das die HA-Syntheseaktivität wieder herstellt. Die Sequenzanalysen ergaben eine deduzierte Primärstruktur für ein Protein von -65 kDa mit einer vorhergesagten Membrantopologie ähnlich derjenigen von spHAS. mmHAS1 ist zu 30% identisch mit spHAS und zu 55% identisch mit DG42. In dem gleichen Monat, in dem diese Veröffentlichung erschien, wurden von drei anderen Gruppen Veröffentlichungen eingereicht, in denen cDNA's beschrieben wurden, die das codierten, was anfänglich für das gleiche Maus- und Humanenzym gehalten wurde. Allerdings hatte unter außergewöhnlichen Umständen jedes der vier Laboratorien ein separates HAS-Isoenzym in beiden Spezies entdeckt.
Unter Anwendung eines ähnlichen funktionellen Vorgehens des Klonens zu dem von Itano und Kimata haben Shyjan et al. das Human-Homolog von HAS1 identifiziert. Es wurde eine mesentere Lymphknoten-cDNA-Genombank benutzt, um Maus-Schleimhaut-T-Lymphocyten zu transfizieren, die sodann auf ihre Fähigkeit zur Haftung in einem Rosetten-Assay gescreent wurden. Die Haftung an einem der Transfektionsprodukte war durch Antiseren auf CD44 gehemmt, ein bekanntes Zelloberflächen-HA-bindendes Protein, und wurde direkt durch Vorbehandlung mit Hyaluronidase beseitigt. Damit erforderte der Rosettentest mit diesem Transfektanten die Synthese von HA. Das Klonen und Sequenzieren der zuständigen cDNA identifizierte hsHAS1. Itano und Kimata berichteten auch von einer Human-HAS1-cDNA, die von einer fötalen Gehirn-Genombank isoliert wurde. Die von den zwei Gruppen veröffentlichten hsHAS1-cDNA's differierten jedoch in der Länge; sie codierten ein 578- oder ein 543-Aminosäureprotein. HAS-Aktivität ist lediglich für die längere Form nachgewiesen worden.
Auf der Grundlage der molekularen Identifikation von spHAS als eine authentische HA-Synthese und von Domänen mit nahezu Identität zu DG42, spHAS und NodC (ein β-GlcNAc-Transferase-Keimbildungsfaktor in Rhizobium) verwendeten Spicer et al. ein entartetes RT-PCR-Herangehen zum Klonen einer Maus-Embryo-cDNA, die ein zweites einzelnes Enzym codiert und die mit mmHAS2 bezeichnet wurde. Die Transfektion von mmHAS2-cDNA in COS-Zellen lenkte die de novo-Produktion eines HA-Zellenüberzugs, detektiert mit Hilfe des Partikelausschlussassays, womit ein nachhaltiger Beweis dafür erbracht wurde, dass das HAS2-Protein HA synthetisieren kann. Unter Anwendung eines ähnlichen Vorgehens haben Watanabe und Yamaguchi eine Human-fötale Hirn-cDNA-Genombank zur Kennzeichnung von hsHAS2 gescreent. Fulop et al. haben unabhängig eine ähnliche Strategie zur Identifizierung von mmHAS2 in RNA angewendet, die von Ovar-Kumuluszellen isoliert wurden, die aktiv HA synthetisieren, ein entscheidender Prozess für die normale Kumulus-Oophorus-Expansion in dem präovulatorischen Follikel. Kumulus-Zell-Oozyten-Komplexe wurden aus Mäusen unmittelbar nach der Einleitung eines Ovulationszyklus vor Beginn der HA-Synthese isoliert sowie zu späteren Zeitpunkten, wenn die HA-Synthese gerade begann (3 Stunden) oder bereits in Erscheinung trat (4 Stunden). RT-PCR zeigte, dass HAS2-mRNA anfangs fehlte, jedoch bei hohen Werten 3 bis 4 Stunden später exprimierte, was nahelegt, dass die Transkription von HAS2 die HA-Synthese in diesem Prozess reguliert. Beide hsHAS2 sind 552- Aminosäuren in der Länge und sind zu 99% identisch. mmHAS1 hat eine Länge von 583-Aminosäuren und ist zu 95% identisch mit hsHAS1, die eine Länge von 578-Aminosäuren hat.
Erst kürzlich verwendeten Spicer et al. eine PCR-Herangehensweise, um ein drittes HAS-Gen in Säugern zu identifizieren. Das mmHAS3-Protein hat eine Länge von 554-Aminosäuren und ist zu 71%, 56% bzw. 28% mit mmHAS1, mmHAS2, DG42 und spHAS identisch. Spicer et al. haben außerdem die drei Human- und Maus-Gene zu drei unterschiedlichen Chromosomen (HAS1 zu hsChr 19/mmChr 17; HAS2 zu hsChr 8/mmChr 15; HAS3 zu hsChr 16/mmChr 8) lokalisiert. Die Lokalisierung der dritten HAS-Gene an unterschiedlichen Chromosomen und das Auftreten von HA in der gesamten Klasse der Wirbeltiere legen nahe, dass diese Gen-Familie uralt ist und dass Isoenzyme durch Duplikation in der frühen Evolution der Vertebraten auftraten. Die hohe Identität (etwa 30%) zwischen den bakteriellen und eukaryotischen HAS's legt ebenfalls nahe, dass die zwei ein gemeinsames angestammtes Gen hatten. Vielleicht usurpierten primitive Bakterien das HAS-Gen von einem der Vorfahren der Vertebraten, bevor die eukaryotischen Genprodukte größer und komplexer wurden. Andererseits könnten die Bakterien ein größeres Vertebraten-HAS-Gen erhalten haben und für die Enzymaktivität nicht entscheidende regulatorische Sequenzen zerstört haben.
Eine bedeutende Rolle in den neueren Entwicklungen spielte die Entdeckung von X. laevis DG42 von Dawid und Mitarbeitern, obgleich dieses Protein nicht als eine HA-Synthase bekannt war. Nichtsdestoweniger waren dieses DG42 und spHAS zu 30% identisch und entscheidend für die Konzipierung von Oligonucleotiden, die eine Identifizierung von Säuger-HAS2 möglich machten. Ironischerweise ist der definitive Nachweis dafür, dass DG42 eine bona fide-HA-Synthase ist, erst nach den Entdeckungen der Säuger-Isoenzyme veröffentlicht worden, als DeAngelis und Achyuthan das rekombinante Protein in Hefe exprimierten (ein Organismus, der HA nicht synthetisieren kann) und zeigte, dass dieses HA synthetisiert, wenn isolierte Membranen mit den zwei Substraten ausgestattet werden. Meyer und Kreil zeigten auch, dass Lysate von Zellen, die mit cDNA für DG42 transfektiert wurden, erhöhte Mengen an HA synthetisieren. Heute, wo seine Funktion bekannt ist, kann DG42 damit als X1HAS bezeichnet werden.
Es gibt allgemeine, vorhergesagte Strukturmerkmale, die alle HAS-Proteine teilen, einschließlich eine große zentrale Domäne und Cluster von 2 bis 3 Transmembran- oder membranassoziierten Domänen sowohl an den Amino- als auch an den Carboxyl-Enden des Proteins. Die zentrale Domäne die bis zu etwa 88% der vorhergesagten intrazellularen HAS-Proteinsequenzen aufweist, enthält wahrscheinlich die katalytischen Bereiche des Enzyms. Diese vorhergesagte zentrale Domäne hat eine Länge von 264-Aminosäuren in spHAS (63% des gesamten Proteins) und eine Länge von 307 bis 328 Resten in den eukaryotischen HAS-Teilen (54 bis 56% des gesamten Proteins). Die exakte Zahl und die Orientierung der Membran-Domänen und die topologische Organisation der extrazellularen und intrazellularen Schleifen sind bisher für die jeweilige HAS noch nicht experimentell bestimmt worden.
spHAS ist ein Vertreter der HAS-Familie, der gereinigt und teilweise charakterisiert worden ist. Erste Untersuchungen unter Verwendung von spHAS-Alkaliphosphatase-Fusionsproteinen zeigen, dass der N-Terminus, C-Terminus und die große zentrale Domäne von spHAS in der Tat im Inneren der Zelle sind. spHAS hat 6 Cysteine, während HAS1, HAS2 und HAS3 13, 14 bzw. 14 Cys-Reste haben. Zwei von den 6 Cys-Resten in spHAS sind in HAS1 und HAS2 geschützt und identisch. Lediglich einer der geschützten Cys-Reste hat sich in allen Vertretern der HAS-Familie an der gleichen Position gezeigt (Cys-225 in spHAS). Dieses kann ein essentielles Cys sein, dessen Modifikation durch Sulfhydryl-Gifte teilweise die Enzymaktivität hemmt. Das mögliche Vorhandensein von Disulfid-Bindungen oder die Identifikation kritischer Cys-Reste, die für jede der mehrfachen HAS-Funktionen benötigt werden, wie nachstehend ausgeführt wird, sind bis jetzt noch nicht für jeden der Vertreter der HAS-Familie aufgeklärt worden.
Abgesehen von dem vorgeschlagenen einmaligen Synthesemodus an der Plasmamembran ist die HAS-Enzym-Familie in Bezug auf die große Zahl von Funktionen, die für die gesamte Polymerisation von HA erforderlich sind, außerordentlich ungewöhnlich. Im Inneren des HAS-Enzyms sind mindestens 6 diskrete Aktivitäten vorhanden: Bindungsstellen für jeden der zwei verschiedenen Zucker-Nucleotid-Präkursoren (UDP-GlcNAc und UDP-GlcA), zwei verschiedene Glykosyltransferase-Aktivitäten, eine oder mehrere Bindungsstellen, die das Wachstum des HA-Polymers zum Enzym verankern (möglicherweise in Verbindung mit einem B-X₇-B-Motiv) und eine ratschenähnliche Übertragungsreaktion, die das wachsende Polymer jeweils um einen Zucker weiterbewegt. Diese spätere Aktivität fällt wahrscheinlich mit dem schrittweisen Fortschreiten des Polymers durch die Membran hindurch zusammen. Alle diese Funktionen und möglicherweise andere, die bis jetzt noch unbekannt sind, sind in einem relativ kleinen Bereich der Proteingröße von 419 (spHAS) bis 588 (xHAS) Aminosäuren vorhanden.
Obgleich alle zur Verfügung stehenden Beweise die Schlussfolgerung stützen, dass lediglich das spHAS-Protein für die HA-Biosynthese in Bakterien oder in vitro erforderlich ist, ist es möglich, dass größere eukaryotische Vertreter der HAS-Familie Bestandteil von mehrkomponentigen Komplexen sind. Da die eukaryotischen HAS-Proteine um etwa 40% größer sind als spHAS, könnte deren zusätzliche Protein-Domäne in umfangreicheren Funktionen beteiligt sein, wie beispielsweise Trafficking und Lokalisation, Regulierung von Enzym-Aktivität und Vermittlung von Wechselwirkungen mit anderen Zellkomponenten.
Das unerwartete Ergebnis, dass es mehrfache Vertebraten-HAS-Gene gibt, die verschiedene Synthasen codieren, unterstützt die aufkommende übereinstimmende Meinung, dass HA ein wichtiger Regulator des Zellverhaltens und nicht einfach eine Strukturkomponente in Geweben ist. So hat sich in weniger als 6 Minuten das Gebiet von nur einer bekannten HAS (spHAS) zur Kenntnis einer multigenen Familie entwickelt, die rasche, zahlreiche und aufregende Fortschritte in der Zukunft im Bezug auf unser Verständnis der Synthese und der Biologie von HA verspricht.
Beispielsweise werden hierin nachfolgend Sequenzen der 2 HAS-Gene offenbart: von (1) Pasturella multocida und (2) Paramecium bursaria chlorella virus (PBCV-1 ). Das Vorhandensein von Hyaluronan-Synthase in diesen zwei Systemen und die Reinigung und Verwendung der Hyaluronan-Synthase von diesen zwei verschiedenen Systemen zeigen eine Fähigkeit zum Reinigen und Isolieren von Nucleinsäuresequenzen, die enzymatisch aktive Hyaluronan-Synthase in vielen verschiedenen prokaryotischen und viralen Quellen codieren.
Gruppe C Streptococcus equisimilis-Stamm D181 synthetisiert und sondert Hyaluronsäure (HA) ab. Wissenschaftler haben diesen Stamm sowie Gruppe A Streptococcus pyrogene-Stämme, wie beispielsweise S43 und A111, verwendet, um die Biosynthese von HA zu untersuchen und die HA-Syntheseaktivität in Bezug auf ihren Bedarf eines zweiwertigen Kations, Präkursor (UDP-GlcNAc und UDP-GlcA)-Nutzung und optimalen pH-Wert zu charakterisieren.
In der Vergangenheit ist HA kommerziell durch Isolation entweder von Hahnenkämmen oder extrazellulären Medien von Streptokokkenkulturen hergestellt worden. Eine der Methoden, die zum Herstellen von HA entwickelt worden ist, ist die über die Verwendung von Kulturen von HA produzierenden Streptokokken-Bakterien. Die US-P-4 517 295 beschreibt eine solche Prozedur, worin HA produzierende Streptococci unter anaeroben Bedingungen in einem an CO₂ angereicherten Aufzuchtmedium fermentiert werden. Unter diesen Bedingungen wird HA produziert und kann aus der Nährlösung extrahiert werden. Man ist allgemein der Ansicht, dass die Isolation von HA aus Hahnenkämmen aufwendig und schwierig ist, da man mit HA in einem weniger reinen Zustand beginnt. Der Vorteil der Isolation aus Hahnenkämmen besteht darin, dass die erzeugte HA eine höhere Molmasse hat. Allerdings ist die Herstellung von HA durch bakterielle Fermentation leichter, da die HA eine höhere Reinheit hat, um mit dieser zu beginnen. Die Molmasse der auf diese Weise erzeugten HA ist jedoch kleiner als die von Hahnenkämmen. Daher wäre eine Methode, mit der die Erzeugung von HA hoher Molmasse durch bakterielle Fermentation möglich wäre, eine Verbesserung gegenüber den existierenden Prozeduren.
HA mit hoher Molmasse hat eine große Vielzahl nützlicher Anwendungen, die von der Kosmetik bis zur Augenchirurgie reichen. In Folge ihrer Neigung zu hoher Viskosität und ihrer hohen Biokompatibilität findet die HA besondere Anwendung in der Augenchirurgie als Austausch für Glaskörperflüssigkeit. HA ist auch zur Behandlung von Rennpferden bei traumatischer Arthritis durch intraartikuläre Injektionen von HA verwendet worden, in Rasiercremes als eine Gleitmittel und in einer Vielzahl von kosmetischen Produkten, was auf ihre physiochemischen Eigenschaften der hohen Viskosität und ihre Fähigkeit zur Speicherung von Feuchtigkeit über längere Zeitdauer zurückzuführen ist. So hat das US-Ministerium "Fond and Drug Agency" im August 1997 die Verwendung von HA hoher Molmasse für die Behandlung schwerer Arthritis durch Injektion einer solchen hochmolekularen HA direkt in die befallenen Gelenke genehmigt. Im Allgemeinen gilt, dass es um so besser ist, je höher die Molmasse der eingesetzten HA ist. Der Grund dafür ist, dass die Viskosität der HA-Lösung mit der mittleren relativen Molekülmasse der einzelnen HA-Polymermoleküle in der Lösung zunimmt. Leider ist mit den derzeitig verfügbaren Isolationsprozeduren eine HA mit sehr hoher Molmasse, wie beispielsweise im Bereich bis zu 10⁷, schwer zu erhalten.
Um dieses oder andere Probleme zu lösen, besteht ein Bedarf nach neuartigen Methoden und Konstrukten, die angewendet werden können, um HA mit einer oder mehreren verbesserten Eigenschaften zu erzeugen, wie beispielweise größere Reinheit oder leichtere Herstellung. Insbesondere besteht eine Notwendigkeit zur Entwicklung einer Methode für die Erzeugung großer Mengen von HA mit relativ höherer Molmasse und relativ höherer Reinheit, als sie gegenwärtig kommerziell verfügbar ist. Eine noch andere Notwendigkeit besteht darin, dass man in der Lage ist, eine Methode für die Erzeugung von HA zu entwickeln, die über eine modifizierte Größenverteilung (HA_Δsize) verfügt sowie eine HA mit modifizierter Struktur (HA_Δmod).
Die vorliegende Patentanmeldung richtet sich auf einen oder mehrere Mängel auf dem Gebiet. Unter Anwendung der rekombinanten DNA-Technologie wird ein gereinigtes Nucleinsäuresegment, das über eine codierende Sequenz zum Codieren von enzymatisch aktiver seHAS verfügt in Verbindung mit Verfahren zur Erzeugung einer enzymatisch aktiven HA-Synthase offenbart und beansprucht, sowie Verfahren. zur Verwendung des Nucleinsäuresegmentes in der Herstellung rekombinanter Zellen, die HAS und ihr Hyaluronsäureprodukt erzeugen.
Daher besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Schaffung eines gereinigten Nucleinsäuresegmentes, das über eine codierende Sequenz zum Codieren von enzymatisch aktiver HAS verfügt.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines rekombinanten Vektors, der ein gereinigtes Nucleinsäuresegment enthält, das über eine codierende Sequenz verfügt, die enzymatisch aktive HAS codiert.
Eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung einer rekombinanten Wirtszelle, die mit einem rekombinanten Vektor transformiert ist, der ein gereinigtes Nucleinsäuresegment enthält, das über eine codierende Sequenz verfügt, die enzymatisch aktive HAS codiert.
Eine noch andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Gewährung eines Verfahrens zum Detektieren einer Bakterienzelle, die HAS exprimiert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Gewährung eines Verfahrens zum Erzeugen von Hyaluronsäure hoher und/oder niedriger Molmasse aus einem Hyaluronatsynthase-Gen, wie beispielsweise seHAS, sowie Verfahren zum Erzeugen von HA, die über eine modifizierte Größenverteilung und/oder eine modifizierte Struktur verfügen.
Diese und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden mit Hilfe der beigefügten Beschreibung, Patentansprüche und Zeichnungen offensichtlich.
Kurze Zusammenfassung
Die vorliegende Erfindung offenbart Hyaluronansynthase nach Anspruch 1, der hierin beigefügt ist. Die vorliegende Erfindung offenbart ein Nucleinsäuresegment nach Anspruch 9, der hierin beigefügt ist. Die vorliegende Erfindung offenbart einen rekombinanten Vektor nach Anspruch 10 und 11, die hierin beigefügt sind. Die vorliegende Erfindung offenbart eine rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 12, der hierin beigefügt ist. Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zum Herstellen von Hyaluronsäurepolymer nach Anspruch 16, der hierin beigefügt ist. Weitere Ausführungsformen der Erfindung werden in den abhängigen Ansprüchen beschrieben.
Die vorliegende Patentanmeldung umfasst die Anwendung einer rekombinanten DNA-Technologie auf die Lösung eines oder mehrerer der Probleme auf dem Gebiet der Herstellung von Hyaluronsäure (HA). Diese Probleme werden über die Isolation und Verwendung eines Nucleinsäuresegmentes angegangen, das über eine codierende Sequenz verfügt, die das enzymatisch aktive Streptococcus equisimilis (seHAS)-Hyaluronatsynthase-Gen codiert, bei dem es sich um ein Gen handelt, das für die HA-Kettenbiosynthese verantwortlich ist. Das seHAS-Gen wurde von der DNA einer geeigneten mikrobiellen Quelle geklont und zu anwendbaren rekombinanten Konstrukten für die Herstellung von HA und für die Herstellung großer Mengen des HAS-Enzyms selbst erarbeitet.
Die vorliegende Erfindung umfasst ein neuartiges Gen, seHAS. Die Expression dieses Gens steht in Korrelation mit der Virulenz von Streptokokken Gruppe A- und Gruppe C-Stämmen, indem ein Mittel zur Umgehung der Phagozytose und der Immunüberwachung bereitgestellt wird. Die Begriffe "Hyaluronsäuresynthase", "Hyaluronatsynthase", "Hyaluronansynthase" und "HA-Synthase" werden austauschbar zur Beschreibung eines Enzyms verwendet, welches eine Glykosaminglykan-Polysaccharidkette polymerisiert, die aus alternierenden Glucuronsäure und N-Acetylglucosamin-Zuckern, β-1,3- und β-1,4-verknüpft, zusammengesetzt ist. Mit dem Begriff "seHAS" wird das von Streptococcus equisimilis derivierte HAS-Enzym beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolation und die Charakterisierung eines Hyaluronat- oder Hyaluronsäuresynthase-Gen, cDNA und das Genprodukt (HAS) das für die Polymerisation von Glucuronsäure und N-Acetylglucosamid zu der Glucosaminglykanhyaluronsäure verwendet werden kann. Die vorliegende Erfindung identifiziert den seHAS-Locus und offenbart die Nucleinsäuresequenz, die das enzymatisch aktive seHAS-Gen von Streptococcus equisimilis codiert. Das HAS-Gen gewährt außerdem eine neue Sonde, um das Potential von Bakterienproben zur Erzeugung von Hyaluronsäure zu bewerten.
Durch die Anwendung der hierin ausgeführten Methoden und Kenntnisse wird die Fachwelt in der Lage sein, Nucleinsäuresegmente zu erhalten, die das seHAS-Gen codieren. Wie die Fachwelt angesichts der offenbarten Erfindung anerkennen wird, gewähren diese Vorteile eine bedeutende Nutzanwendung insofern man in der Lage ist, die Expression des seHAS-Gens zu kontrollieren und die Beschaffenheit des seHAS-Genprodukts, das seHAS-Enzyms, das erzeugt wird, zu kontrollieren.
Dementsprechend ist die Patentanmeldung auf die Isolation eines gereinigten Nucleinsäuresegmentes gerichtet, das über eine codierende Sequenz verfügt, die enzymatisch aktive HAS codiert unabhängig davon, ob sie aus prokaryotischen oder eukaryotischen Quellen stammt. Dieses ist deshalb möglich, da man das Enzym und im Grunde das Gen sowohl in Eukaryoten als auch in einigen Prokaryoten antrifft. Eukaryoten sind auch dafür bekannt, das sie HA erzeugen und somit über HA-Synthese-Gene verfügen, die in Verbindung mit der Offenbarung der vorliegenden Patentanmeldung eingesetzt werden können.
HA-Synthase codierende Nucleinsäuresegmente der vorliegenden Patentanmeldung sind als solche festgelegt, die frei von gesamter chromosomaler oder genomischer DNA isoliert sind, so dass sie leicht mit Hilfe der Methoden der rekombinanten DNA gehandhabt werden können. Dementsprechend bezieht sich die hierin verwendete Formulierung "ein gereinigtes Nucleinsäuresegment" auf ein DNA-Segment, das frei von unverbundener chromosomaler oder genomischer DNA isoliert ist und in einem Zustand gehalten wird, mit dem es für die Praxis rekombinanter Methoden verwendbar wird, wie beispielsweise DNA in Form eines diskreten isolierten DNA-Fragmentes oder eines Vektors (z.B. Plasmid, Phage oder Virus), der ein solches Fragment umfasst.
Die vorliegende Patentanmeldung offenbart ein gereinigtes Nucleinsäuresegment, das über eine codierende Sequenz zum Codieren von enzymatisch aktiver HAS verfügt. Speziell codiert das gereinigte Nucleinsäuresegment die seHAS von SEQ ID NO:2 oder das gereinigte Nucleinsäuresegment weist eine Nucleotidsequenz entsprechend der SEQ ID NO:1 auf.
Die vorliegende Patentanmeldung offenbart ein gereinigtes Nucleinsäuresegment, das über eine codierende Sequenz zum Codieren enzymatisch aktiver HAS verfügt, wobei das gereinigte Nucleinsäuresegment in der Lage ist, zu der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO:1 hybridisiert zu werden.
Die vorliegende Patentanmeldung offenbart außerdem einen natürlichen oder rekombinanten Vektor, der aus einem Plasmid, Cosmid, Phagen oder Virusvektor besteht.
Der rekombinante Vektor kann außerdem ein gereinigtes Nucleinsäuresegment aufweisen, das über eine codierende Sequenz zum Codieren enzymatisch aktiver HAS verfügt.
Speziell codiert das gereinigte Nucleinsäuresegment die seHAS der SEQ ID NO:2 oder das gereinigte Nucleinsäuresegment weist eine Nucleotidsequenz in Übereinstimmung mit SEQ ID NO:1 auf. Wenn es sich bei dem rekombinanten Vektor um ein Plasmid handelt, kann dieser ferner einen Expressionsvektor aufweisen. Der Expressionsvektor kann auch einen operativ mit der enzymatisch aktiven HAS codierenden Sequenz verknüpften Promotor enthalten.
Die vorliegende Erfindung offenbart eine rekombinante Wirtszelle, wie beispielsweise eine prokaryotische Zelle, die mit einem rekombinanten Vektor transformiert ist. In den rekombinanten Vektor einbezogen ist ein gereinigtes Nucleinsäuresegment mit einer codierenden Sequenz, die enzymatisch aktive HAS codiert. Speziell codiert das gereinigte Nucleinsäuresegment die seHAS der SEQ ID NO:2 oder das gereinigte Nucleinsäuresegment weist eine Nucleotidfolge entsprechend der SEQ ID NO:1 auf.
Die vorliegende Erfindung offenbart außerdem eine rekombinante Wirtszelle, wie beispielsweise eine eukaryotische Zelle, die mit einem rekombinanten Vektor transfiziert ist, der ein gereinigtes Nucleinsäuresegment mit einer codierenden Sequenz aufweist, die enzymatisch aktive HAS codiert. Speziell codiert das gereinigte Nucleinsäuresegment die seHAS der SEQ ID NO:2 oder das gereinigte Nucleinsäuresegment weist eine Nucleotidsequenz entsprechend der SEQ ID NO:1 auf. Das Konzept besteht darin, ein speziell modifiziertes seHAS-Gen zu schaffen, das eine enzymatisch aktive HAS codiert, die ein Hyaluronsäurepolymer erzeugen kann, das über eine modifizierte Struktur oder eine modifizierte Größenverteilung verfügt.
Die vorliegende Erfindung offenbart ferner eine rekombinante Wirtszelle, die einer Elektroporation unterworfen wurde, um einen rekombinanten Vektor in die rekombinante Wirtszelle einzuführen. In den rekombinanten Vektor kann ein gereinigtes Nucleinsäuresegment einbezogen sein, das über eine codierende Sequenz verfügt, die enzymatisch aktive HAS codiert. Speziell codiert das gereinigte Nucleinsäuresegment die seHAS der SEQ ID NO:2 oder das gereinigte Nucleinsäuresegment weist eine Nucleotidsequenz entsprechend der SEQ ID NO:1 auf. Die enzymatisch aktive HAS kann auch in der Lage sein, ein Hyaluronsäurepolymer zu erzeugen, das eine modifizierte Struktur oder eine modifizierte Größenverteilung hat.
Die vorliegende Erfindung offenbart außerdem eine rekombinante Wirtszelle, die mit einem rekombinanten Vektor transduziert ist, in den ein gereinigtes Nucleinsäuresegment einbezogen ist, das eine codierende Sequenz hat, die enzymatisch aktive HAS codiert. Speziell codiert das gereinigte Nucleinsäuresegment die seHAS der SEQ ID NO:2 oder das gereinigte Nucleinsäuresegment weist eine Nucleotidsequenz entsprechend der SEQ ID NO:1 auf. Die enzymatisch aktive HAS kann auch in der Lage sein, ein Hyaluronsäurepolymer zu erzeugen, das eine modifizierte Struktur oder eine modifizierte Größenverteilung hat.
Die vorliegende Erfindung offenbart darüber hinaus eine gereinigte Zusammensetzung, wobei die gereinigte Zusammensetzung ein Polypeptid aufweist, das eine codierende Sequenz hat, die enzymatisch aktive HAS codiert, und darüber eine Aminosäuresequenz entsprechend der SEQ ID NO:2 hat.
Außerdem offenbart die Erfindung ein Verfahren zum Detektieren einer DNA-Spezies, umfassend die Schritte: (1) Erhalten einer DNA-Probe; (2) Kontaktieren der DNA-Probe mit einem gereinigten Nucleinsäuresegment entsprechend der SEQ ID NO:1; (3) Hybridisieren der DNA-Probe und des gereinigten Nucleinsäuresegmentes, wodurch ein hybridisierter Komplex erzeugt wird; sowie (4) Detektieren des Komplexes.
Die vorliegende Erfindung offenbart außerdem ein Verfahren zum Detektieren einer Bakterienzelle, die mRNA codierende seHAS exprimiert, umfassend die Schritte: (1) Erhalten einer Probe einer Bakterienzelle; (2) Kontaktieren mindestens einer Nucleinsäure aus der Probe der Bakterienzelle mit gereinigtem Nucleinsäuresegment entsprechend der SEQ ID NO:1; (3) Hybridisieren der mindestens einen Nucleinsäure und des gereinigten Nucleinsäuresegmentes, wodurch ein hybridisierter Komplex erzeugt wird; und (4) Detektieren des hybridisierten Komplexes, wobei die Gegenwart des hybridisierten Komplexes kennzeichnend für einen Bakterienstamm ist, der mRNA codierende seHAS exprimiert.
Die vorliegende Erfindung offenbart ferner Verfahren zum Detektieren des Vorhandenseins von entweder seHAS oder spHAS in einer Zelle. Speziell umfasst das Verfahren die Verwendung der in den SEQ ID NO:3 bis 8 als Sonden ausgeführten Oligonucleotide. Diese Oligonucleotide würden einem Arzt ermöglichen, nach dem Vorhandensein entweder einer seHAS oder spHAS in einer Zelle zu suchen und diese zu detektieren.
Die vorliegende Erfindung umfasst ferner ein Verfahren zum Herstellen einer Hyaluronsäure, umfassend die Schritte: (1) Einführen eines gereinigten Nucleinsäuresegmentes, das über eine codierende Sequenz zum Codieren enzymatisch aktiver HAS verfügt, in einem Wirtsorganismus, wobei der Wirtsorganismus Nucleinsäuresegmente enthält, die Enzyme codieren, die UDP-GlcNAc und UDP-GlcA erzeugen; (2) Aufziehen des Wirtsorganismus in einem Medium zum Abscheiden von Hyaluronsäure und (3) Gewinnen der abgeschiedenen Hyaluronsäure.
Das Verfahren kann außerdem den Schritt des Extrahierens der abgeschiedenen Hyaluronsäure aus dem Medium sowie den Schritt des Reinigens der extrahierten Hyaluronsäure umfassen. Darüber hinaus kann der Wirtsorganismus eine strukturell modifizierte Hyaluronsäure oder eine größenmodifizierte Hyaluronsäure abscheiden.
Die vorliegende Erfindung offenbart eine pharmazeutische Zusammensetzung, aufweisend vorgewähltes pharmazeutisches Arzneimittel und eine wirksame Menge von Hyaluronsäure, die mit Hilfe einer rekombinanten HAS erzeugt wurde. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann über eine Hyaluronsäure mit einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit modifizierter Molmasse verfügen, die in der Lage ist, eine Immunantwort zu umgehen. Die modifizierte Molmasse kann außerdem eine pharmazeutische Zusammensetzung erzeugen, die zum Targeting eines speziellen Gewebes oder eines Zelltyps in dem Patienten mit einer Affinität für die pharmazeutische Zusammensetzung mit modifizierter Molmasse in der Lage ist.
Die vorliegende Erfindung offenbart außerdem eine gereinigte und isolierte Nucleinsäuresequenz, die enzymatisch aktive seHAS codiert, wobei die Nucleinsäuresequenz (a) die Nucleinsäuresequenz entsprechend der SEQ ID NO:1 ist; (b) komplementäre Nucleinsäuresequenzen zu der Nucleinsäuresequenz entsprechend der SEQ ID NO:1 sind; (c) Nucleinsäuresequenzen sind, die die Nucleinsäure entsprechend der SEQ ID NO: hybridisieren; und (d) Nucleinsäuresequenzen sind, die zu den komplementären Nucleinsäuresequenzen von SEQ ID NO:1 hybridisieren.
Die vorliegende Erfindung offenbart ferner ein gereinigtes und isoliertes Nucleinsäuresegment, im Wesentlichen bestehend aus einem Nucleinsäuresegment, das enzymatisch aktive HAS codiert.
Die vorliegende Erfindung offenbart ebenfalls ein isoliertes Nucleinsäuresegment, im Wesentlichen bestehend aus einem Nucleinsäuresegment, das seHAS codiert, das über ein Nucleinsäuresegment verfügt, das ausreichend duplikativ zu dem Nucleinsäuresegment entsprechend der SEQ ID NO:1 ist, um den Besitz der biologischen Eigenschaft des Codierens einer enzymatisch aktiven HAS zu ermöglichen. Das Nucleinsäuresegment kann auch eine cDNA-Sequenz sein.
Darüber hinaus offenbart die vorliegende Erfindung ein gereinigtes Nucleinsäuresegment, das über eine codierende Sequenz zum Codieren enzymatisch aktiver HAS verfügt, wobei das gereinigte Nucleinsäuresegment zum Hybridisieren zu der Nucleotidsequenz entsprechend der SEQ ID NO:1 in der Lage ist.
Kurze Beschreibung der verschiedenen Ansichten der Zeichnungen
Es zeigen:
1 dass es keine Kreuzhybridisierung zwischen seHAS- und spHAS-Genen gibt;
2 figurativ die Verwandtschaft von seHAS zu den bakteriellen und eukaryotischen HAS-Proteinen;
3 figurativ die evolutionären Beziehungen unter einigen der bekannten Hyaluronan-Synthasen;
4 die HA-Größenverteilung, die durch verschiedene gentechnisch bearbeitete Streptokokken-HAS-Enzyme erzeugt wird.
5 figurativ die Überexpression von rekombinanter seHAS und spHAS in E. coli;
6 die Reinigung von Streptokokken-HA-Synthese;
7 eine Gelfiltrationsanalyse von HA, synthetisiert mit Hilfe von rekombinanter Streptokokken-HAS, exprimiert in Hefemembranen;
8 eine Western-Blot-Analyse von rekombinanter seHAS unter Verwendung spezifischer Antikörper;
9 eine kinetische Analyse der HAS-Größenverteilungen, erzeugt durch rekombinante seHAS und spHAS;
10 graphisch die Hydropathie-Diagramme für seHAS und vorhergesagte Membran-assoziierte Bereiche;
11 ein graphisches Modell für die topologische Organisation des seHAS in der Membran;
12 eine Demonstration der Synthese von authentischer HA durch rekombinante seHAS;
13 eine Erkennung von Nucleinsäuresequenzen, die seHAS codieren, spHAS codieren oder sowohl seHAS als auch spHAS codieren, indem spezifische Oligonucleotide und PCR verwendet wurden;
14 Oligonucleotide, die für spezifische PCR-Hybridisierung verwendet wurden.
Detaillierte Beschreibung
Bevor mindestens eine der Ausführungsformen der Erfindung detailliert erläutert wird, ist darauf hinzuweisen, dass es als selbstverständlich gilt, dass die Erfindung nicht in ihrer Anwendung auf die Details der Konstruktion und der Anordnung der Komponenten beschränkt ist, wie sie in der folgenden Beschreibung ausgeführt oder in den Zeichnungen veranschaulicht sind. Die Erfindung ist mit anderen Ausführungsformen möglich oder kann in unterschiedlicher Weise praktiziert oder ausgeführt werden. Außerdem gilt als selbstverständlich, dass die hierin zum Einsatz gelangende Begriffswahl und Terminologie der Beschreibung dienen und nicht einschränkend auszulegen sind.
Die hierin verwendeten Begriffe "Nucleinsäuresegment" und "DNA-Segment" sind austauschbar und beziehen sich auf ein DNA-Molekül, das frei von der gesamten genomischen DNA einer speziellen Spezies isoliert worden ist. Daher bezeichnet eine "gereinigte DNA" oder Nucleinsäuresegment, wie sie hierin verwendet werden, ein DNA-Segment, das eine Hyaluronatsynthase ("HAS")-codierende Sequenz enthält, und dennoch isoliert von oder frei von unverwandter genomischer DNA ist, beispielsweise gesamter Streptococcus equisimilis oder z.B. genomische DNA vom Säugerwirt. In den Begriff "DNA-Segment" einbezogen sind DNA-Segmente und kleinere Fragmente solcher Segmente und auch rekombinante Vektoren, einschließlich beispielsweise Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren und dergleichen.
In ähnlicher Weise bezieht sich ein isoliertes oder gereinigtes seHAS-Gen aufweisendes DNA-Segment auf ein DNA-Segment, einschließlich HAS codierende Sequenzen, die im Wesentlichen weg von anderen natürlich auftretenden Genen von Protein codierenden Sequenzen isoliert sind. In diesem Zusammenhang wird der Begriff "Gen" der Einfachheit halber zur Bezeichnung eines funktionellen Proteins, Polypeptids oder einer Peptid codierenden Einheit verwendet. Wie in der Fachwelt als selbstverständlich gilt, schließt dieser funktionelle Begriff genomische Sequenzen ein, cDNA-Sequenzen oder Kombinationen davon. "Isoliert im Wesentlichen weg von anderen codierenden Sequenzen" bedeutet, dass das Gen, das von Interesse ist, in diesem Fall seHAS, den entscheidenden Teil der codierenden Sequenz des DNA-Segmentes bildet und dass das DNA-Segment keine größeren Anteile von natürlich auftretender codierender DNA enthält, wie beispielsweise große chromosomale Fragmente oder andere funktionale Gene oder DNA codierende Bereiche. Selbstverständlich bezieht sich dieses auf das DNA-Segment, das ursprünglich isoliert wurde und das keine Gene oder codierende Sequenzen ausschließt, die später hinzugefügt wurden oder vorsätzlich in dem Segment durch den Menschen belassen wurden.
Aufgrund bestimmter Vorteile in Verbindung mit der Verwendung prokaryotischer Quellen sind die meisten Vorteile der Isolation des HAS-Gens aus Prokaryoten, wie beispielsweise S. pyrogenes, S. equsimilis oder P. multocida leicht ersichtlich. Einer dieser Vorteile besteht typischerweise darin, dass eukaryotische Enzyme signifikante posttranslationale Modifikationen erfordern können, die sich nur in einem eukaryotischen Wirt erzielen lassen. Dadurch wird sich die Anwendbarkeit jedes der erhaltenen eukaryotischen HA-Synthase-Gene beschränken. Darüber hinaus wird man in der Fachwelt mühelos weitere Vorteile in Bezug auf Zeit und Einfachheit der genetischen Manipulation dort erkennen, wo man ein prokaryotisches Enzym-Gen zum Einsatz sucht. Diese weiteren Vorteile schließen ein: (a) die Einfachheit der Isolation eines prokaryotischen Gens aufgrund der relativ geringen Größe des Genoms und daher des reduzierten Umfanges des Screenings der entsprechenden Genombank und (b) die Einfachheit der Manipulation aufgrund der Gesamtgröße der codierenden Sequenz eines prokaryotischen Gens, die aufgrund des Fehlens von Intronen bedeutend geringer ist. Wenn das Produkt des seHAS-Gens (d.h. des Enzyms) darüber hinaus posttranslationale Modifikationen erfordert, würde dies am Besten in einer ähnlichen prokaryotischen Zellularumgebung (Wirt) erreicht werden, von der das Gen deriviert wurde.
Vorzugsweise werden in die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen ferner genetische Kontrollsequenzen einbezogen sein, die die Expression der Sequenz in einem ausgewählten rekombinanten Wirt ermöglicht. Selbstverständlich wird die Beschaffenheit der zum Einsatz gelangenden Kontrollsequenz in der Regel von der speziellen Anwendung abhängen, die vorgesehen ist (z. B. der zu klonende Wirt).
Speziell betrifft die Erfindung isolierte DNA-Segmente und rekombinante Vektoren, in die die DNA-Sequenzen eingebaut sind, die ein seHAS-Gen codieren, das im Inneren seiner Aminosäuresequenz eine Aminosäuresequenz entsprechend der SEQ ID NO:2 enthält. Darüber hinaus betrifft die Erfindung speziell isolierte DNA-Segmente und rekombinante Vektoren, in die DNA-Sequenzen eingebaut sind, die ein Gen codieren, das im Inneren seiner Aminosäuresequenz die Aminosäuresequenz eines HAS-Gens oder DNA enthält, und speziell ein HAS-Gen oder cDNA. Die mit der Streptococcus equisimilis-HAS korrespondieren. Wo beispielsweise das DNA-Segment oder der Vektor ein HAS-Protein voller Länge codiert oder zur Verwendung beim Exprimieren des HAS-Proteins vorgesehen ist, sind bevorzugte Sequenzen solche, wie sie weitgehend in der SEQ ID NO:2 ausgeführt sind.
Nucleinsäuresegmente mit HA-Synthase-Aktivität können mit Hilfe der hierin beschriebenen Methoden isoliert werden. Der Begriff "eine Sequenz, wie sie weitgehend in SEQ ID NO:2 ausgeführt ist" bedeutet, dass die Sequenz im Wesentlichen einem Abschnitt der SEQ ID NO:2 entspricht und relativ wenige Aminosäuren hat, die nicht mit den Aminosäuren der SEQ ID NO:2 identisch sind oder ein biologisch funktionelles Äquivalent davon sind. Der Begriff "biologisch funktionelles Äquivalent" gilt auf dem Fachgebiet als wohlverstanden und wird hierin weiter im Detail als ein Gen festgelegt, das eine Sequenz hat, die im Wesentlichen in der SEQ ID NO:2 ausgeführt ist und die mit der Fähigkeit von Prokaryoten zur Erzeugung von HA oder eines Hyaluronsäureüberzuges in Verbindung steht.
Beispielsweise sind die seHAS- und spHAS-codierenden Sequenzen zu näherungsweise 70% identisch und reich an den Basen Adenin (A) und Thymin (T). Die seHAS-Base enthält: A-26,71%, C-19,13%, G-20,81% und T-33,33% (A/T=60%). Währenddessen enthält spHAS: A-31,34%, C-16,42%, G-16,34% und T-35,8% (A/T=67%). In der Fachwelt wird uns überraschen, dass die seHAS-codierende Sequenz nicht mit dem spHAS-Gen und umgekehrt hybridisiert wird, obwohl sie zu 70% identisch sind. Diese unerwartete Unfähigkeit zur Kreuzhybridisierung könnte eine Folge kurzer Interruptionen von fehlangepassten Basen durch die offenen Translationsraster sein. Die Unfähigkeit von spHAS und seHAS zur Kreuzhybridisierung ist in 1 gezeigt. Die längste Strecke von identischen Nucleotiden, die sowohl die seHAS- als auch die spHAS-codierenden Sequenzen gemeinsam haben, beträgt lediglich 20 Nucleotide. Darüber hinaus werden die an A-T sehr reichen Sequenzen weniger stabile Hybridisierungskomplexe bilden als die an G-C-reichen Sequenzen. Eine andere mögliche Erklärung dafür könnte sein, dass es mehrere Strecken von A's oder T's in beiden Sequenzen gibt, die in ein in fehlangepasster und unstabiler Weise hybridisiert sind. Dieses würde die seHAS- und spHAS-Gensequenzen zueinander außerhalb des Rahmens bringen, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer produktiven Hybridisierung abnimmt.
Aufgrund dieses einzigartigen Phänomens, dass zwei Gene Proteine codieren, die zu 70% identisch nicht in der Lage sind, untereinander eine Kreuzhybridisierung einzugehen, ist es nützlich, an das beanspruchte Nucleinsäuresegment hinsichtlich seiner Funktionen zu denken, d.h. ein Nucleinsäuresegment, das enzymatisch aktiv Hyaluronatsynthase codiert. Für den Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet ist erkenntlich, dass ein enzymatisch aktive Hyaluronatsynthase codierendes Nucleinsäuresegment konservative oder halbkonservative Substitutionen zu den in SEQ ID NO:1 und 2 ausgeführten Sequenzen enthält und dennoch innerhalb des Schutzbereichs der Offenbarung der vorliegenden Erfindung liegt.
Insbesondere ist das Gebiet übervoll mit Beispielen für Möglichkeiten der Ärzte, strukturelle Änderungen an einem Nucleinsäuresegment vorzunehmen (d.h. konservative oder halbkonservative Aminosäuresubstitutionen zu codieren) und dennoch dessen enzymatische oder funktionelle Aktivität zu bewahren. Siehe hierzu beispielsweise: (1) Risler et al., "Amino Acid Substitutions in Structurally Related Proteins. A Pattern Recognition Approach", J. Mol. Biol. 204:1019–1029 (1988) ["...aufgrund der beobachteten Austauschbarkeit von Aminosäure-Seitenketten, konnten lediglich vier Gruppen aufgezeichnet werden; (i) Ile und Val; (ii) Leu und Met; (iii) Lys, Arg und GIn und (iv) Tyr und Phe"]; (2) Nicfind et al., "Amino Acid Similarity Coefficients for Protein Modeling and Sequence Alignment Derived from Main-Chain Folding Anoles", J. Mol. Biol., 219:481–497 (1991) [Ähnlichkeitsparameter machen es möglich, Aminosäure-Substitutionen zu konzipieren]; und (3) Overington et al., "Environment-Specific Amino Acid Substitution Tables: Tertiary Templates and Prediction of Protein Folde", Protein Science 1:216–226 (1992) ["Analyse beobachteter Substitutions muster als Funktion der örtlichen Umgebung zeigt, dass es verschiedene Muster gibt..." kompatible Änderungen können vorgenommen werden].
Diese Fundstellen und zahllose weitere zeigen, dass der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet mit einer vorgegebenen Nucleinsäuresequenz Substitutionen und Änderungen an der Nucleinsäuresequenz vornehmen könnte, ohne ihre Funktionalität zu verändern. Außerdem kann ein substituiertes Nucleinsäuresegment im hohen Grad identisch sein und seine enzymatische Aktivität in Bezug auf dessen unverfälschte Ausgangssubstanz bewahren und dennoch bei Versagen, sich damit zu hybridisieren.
Die Erfindung offenbart Nucleinsäuresegmente, die enzymatisch aktive Hyaluronatsynthase – seHAS und spHAS, codieren. Obgleich seHAS und spHAS zu 70% identisch sind und beide enzymatisch aktive Hyaluronatsynthase codieren, gehen sie keine Kreuzhybridisierung ein. Damit wäre für den Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet erkennbar, dass Substitutionen an dem in der SEQ ID NO:1 aufgelisteten seHAS-Nucleinsäuresegment vorgenommen werden könnten, ohne vom Schutzbereich und den Ansprüchen der vorliegenden Erfindung abzuweichen. In Tabelle I werden standardisierte und anerkannt funktionell äquivalente Aminosäuresubstitutionen dargestellt.
Tabelle I
Die vorliegende Erfindung offenbart ein gereinigtes Nucleinsäuresegment, das ein Protein entsprechend der SEQ ID NO:2 codiert, das weiter als ein rekombinanter Vektor definiert wird. Der hierin verwendete Begriff "rekombinanter Vektor" bezieht sich auf einen Vektor, der so modifiziert worden ist, dass er ein Nucleinsäuresegment enthält, das ein HAS-Protein oder ein Fragment davon codiert. Der rekombinante Vektor kann ferner als ein Expressionsvektor definiert werden, der einen Promotor aufweist, der operativ mit dem HAS-codierenden Nucleinsäuresegment verbunden ist.
Die vorliegende Erfindung offenbart außerdem eine Wirtszelle, die mit einem rekombinanten Vektor, der ein HAS-Gen aufweist, rekombinant gemacht wird. Die bevorzugte rekombinante Wirtszelle kann eine prokaryotische Zelle sein. Darüber hinaus offenbart die Erfindung, dass die rekombinante Wirtszelle eine eukaryotische Zelle ist. Der hierin verwendete Begriff "gentechnisch bearbeitete" oder "rekombinante Zelle" soll sich auf eine Zelle beziehen, in die ein rekombinantes Gen, wie beispielsweise ein HAS-codierendes Gen, eingeführt worden ist. Daher sind gentechnisch bearbeitete Zellen von natürlich auftretenden Zellen unterscheidbar, die kein rekombinant eingeführtes Gen enthalten. Gentechnisch bearbeitete Zellen sind damit Zellen, die ein Gen oder Gene haben, die in das Gen eingeführt wurden. Gentechnisch bearbeitete Zellen sind solche Zellen, die ein Gen oder Gene haben, die durch den Menschen eingeführt worden sind. Rekombinante eingeführte Gene werden entweder in Form eines cDNA-Gens vorliegen, einer Kopie eines genomischen Gens oder werden Gene enthalten, die angrenzend an einen Promotor angeordnet sind, der nicht auf natürliche Weise mit dem speziellen eingeführten Gen verbunden ist.
Wo die Verwendung eines anderen Wirtes als Streptococcus angestrebt wird, was zur Erzeugung von rekombinanter HA-Synthase zur Anwendung gelangen kann, kann es von Vorteil sein, ein prokaryotisches System einzusetzen, wie beispielsweise E. coli, B. subtilis, Lactococcus sp., oder sogar eukaryotische Systeme, wie beispielsweise Hefe oder Eierstöcke von Chinesischen Hamstern, Nierenzellen vom Afrikanischen Grünaffen, VERO-Zellen oder dergleichen. Wo dieses in Frage kommt, wird man selbstverständlich in der Regel anstreben, das HA-Synthase-Gen unter der Kontrolle von Sequenzen zu bringen, die in dem ausgewählten alternativen Wirt funktionsfähig sind. Die geeigneten DNA-Kontrollsequenzen sowie deren Konstruktion und Verwendung sind auf dem Fachgebiet allgemein gut bekannt und werden nachfolgend detaillierter diskutiert.
In die HA-Synthase codierenden DNA-Segmente weiter einbezogen sind DNA-Sequenzen, die auf dem Gebiet als funktionelle Quellen der Replikation bekannt sind oder als "Replikone", die eine Replikation von angrenzenden Sequenzen durch den speziellen Wirt ermöglichen. Derartige Quellen erlauben die Herstellung von extrachromosomal lokalisierten und replizierenden chimären Segmenten oder Plasmiden, mit denen die HA-Synthase-DNA-Sequenzen ligiert sind. In mehr bevorzugten Fällen ist der eingesetzte Ursprung ein solcher, der zur Replikation in bakteriellen Wirten in der Lage ist, die für biotechnologische Anwendungen geeignet sind. Für eine größere Vielseitigkeit geklonter DNA-Segmente kann es jedoch wünschenswert sein, alternativ oder sogar zusätzlich Quellen einzusetzen, die von anderen Wirtssystemen erkannt werden, deren Verwendung als mit einbezogen gilt (wie beispielsweise in einem Shuttle-Vektor).
Die Isolation und Verwendung anderer Replikationsquellen, wie beispielsweise das SV40, Polyom- oder Rinder-Papillomavirus als Quellen, die zum Klonen oder zur Expression in einer Reihe von Organismen zum Einsatz gelangen können, sind in der Fachwelt gut bekannt. In bestimmten Fällen lässt sich die Offenbarung der Erfindung in Bezug auf einen rekombinanten Transformationsvektor abgrenzen, in den eine HA-Synthase codierende Gensequenz zusammen mit einer entsprechenden Replikationsquelle und unter Kontrolle ausgewählter Kontrollsequenzen einbezogen ist.
Angesichts der Offenbarung der Erfindung ist damit von der Fachwelt zu erkennen, dass andere Möglichkeiten angewendet werden können, um das HAS-Gen oder die cDNA zu erhalten. Beispielsweise können Polymerasekettenreaktion oder RT-PCR-erzeugte DNA-Fragmente erhalten werden, die vollständige Komplemente von Genen oder cDNA's von einer Reihe von Quellen enthalten, in die andere Stämme von Streptococcus oder Formen von eukaryotischen Quellen einbezogen sind, wie beispielsweise cDNA-Genombanken. Im Sinne der vorliegenden Erfindung kann nahezu jede beliebige Vorgehensweise zum molekularen Klonen für die Erzeugung von DNA-Fragmenten eingesetzt werden. Die einzige Beschränkung, die daher für die spezielle Methode besteht, die allgemein für die Isolation einer DNA eingesetzt wird, besteht darin, dass die isolierten Nucleinsäuren eine biologisch funktionelle, äquivalente HA-Synthase codieren müssen.
Sobald die DNA isoliert worden ist, wird sie mit einem ausgewählten Vektor ligiert. Es kann nahezu jeder beliebige Klonierungsvektor eingesetzt werden, um die Vorteile im Rahmen der Erfindung zu realisieren. Typische anwendbare Vektoren schließen Plasmide und Phagen für die Verwendung in prokaryotischen Organismen ein und sogar virale Vektoren zur Verwendung in eukaryotischen Organismen. Beispiele schließen ein: pKK223-3, pSA3, rekombinante Lambda-, SV40-, Polyom-, Adenovirus, Rinder-Papillomvirus und Retroviren. Es wird allerdings angenommen, dass schließlich besondere Vorteile dort realisiert werden können, wo Vektoren zur Replikation sowohl von Lactococcus oder Bacillus-Stämmen und E. coli in der Lage sind, die eingesetzt werden.
Vektoren, wie diese, wurden mit Hilfe des pSA3-Vektors von Dao und Ferretti oder mit Hilfe des pAT19-Vektors von Trieu-Cuot, et al., exemplifiziert und ermöglichen die Ausführung einer klonalen Kolonieauswahl in einem leicht manipulierten Wirt, wie beispielsweise E. coli, gefolgt von einem nachfolgenden Transfer zurück zu Lactococcus oder Bacillus-Stämmen mit Lebensmittelqualität für die Erzeugung von HA. Diese sind gutartige und gut untersuchte Organismen, die in der Erzeugung bestimmter Lebensmittel und Produkte der Biotechnologie verwendet werden. Sie sind insofern vorteilhaft, dass man die Fähigkeit der Stämme Lacfococcus oder Bacillus zur Synthese von HA durch Gendosierung verbessern kann (d.h. Bereitstellen von zusätzlichen Kopien des HA-Synthase-Gens durch Amplifikation) und/oder Einschluss von zusätzlichen Genen zur Verbesserung der Verfügbarkeit von HA-Präkursoren. Die einem Bakterium innewohnende Fähigkeit zur Synthese von HA kann auch durch die Erzeugung von zusätzlichen Kopien oder Amplifikation des Plasmids verbessert werden, welches das HA-Synthese-Gen trägt. Diese Amplifikation kann bis zu einer 10-fachen Erhöhung der Plasmid-Kopiezahl betreffen und damit der Kopiezahl des HA-Synthasegens.
Eine andere Prozedur, mit der man die Kopiezahl des HA-Synthasegens weiter erhöhen kann ist die Insertion von mehrfachen Kopien des Gens in das Plasmid. Eine andere Methode würde das Integrieren des HAS-Gens in die chromosomale DNA einschließen. Diese zusätzliche Amplifikation wäre besonders gut durchführbar, da das bakterielle HA-Synthasegen eine kleine Größe hat. In einigen Szenarien wird der chromosomale DNA-ligierte Vektor eingesetzt, um den Wirt, der für die Zwecke des klonalen Screenings ausgewählt wird, wie beispielsweise E. coli, durch die Verwendung eines Vektors zu transfizieren, der zum Exprimieren der insertierten DNA in dem ausgewählten Wirt in der Lage ist.
Wo eine eukaryotische Quelle, wie beispielsweise dermale oder synoviale Fibroblasten oder Hahnenkamm-Zellen, zum Einsatz gelangt, wird es erstrebenswert sein, mit der Herstellung einer cDNA-Genbank zu beginnen. Dieses gelangt zur Ausführung, indem zuerst mRNA aus den vorgenannten Zellen isoliert wird, gefolgt von einer Herstellung einer doppelsträngigen cDNA unter Verwendung eines Enzyms mit Reversetranskriptaseaktivität und Ligation mit dem ausgewählten Vektor. Für die Herstellung der doppelsträngigen cDNA sind zahlreiche Möglichkeiten auf dem Gebiet verfügbar und bekannt, und es wird angenommen, dass alle diese Methoden anwendbar sind. Eine bevorzugte Methode umfasst die Umkehrtranskription. Sobald man eine Population von doppelsträngigen cDNA's erhalten hat, wird eine cDNA-Genbank in dem ausgewählten Wirt mit Hilfe anerkannter Methoden hergestellt, wie beispielsweise durch Ligation in den entsprechenden Vektor und Amplifikation des entsprechenden Wirtes. In Folge der hohen Zahl von Klonen, die erhalten wird, und der relativen Einfachheit des Screenings großer Zahlen von Klonen mit Hilfe der hierin ausgeführten Methoden wird man bestrebt sein, Phagenexpressionsvektoren, wie beispielsweise λgt11, λgt12, λGem11 und/oder λZAP, für das Klonen und Expressionsscreening der cDNA-Klone einzusetzen.
Die Erfindung betrifft ebenfalls isolierte DNA-Segmente und rekombinante Vektoren, in deren Sequenz eine Nucleinsäuresequenz einbezogen ist, wie sie weitgehend in der SEQ ID NO:1 ausgeführt ist. Der Begriff "weitgehend ausge führt in der SEQ ID NO:1" wird in dem gleichen Sinn wie vorstehend beschrieben verwendet und bedeutet, dass die Nucleinsäuresequenz weitgehend einem Abschnitt der SEQ ID NO:1 entspricht und relativ wenige Codone hat, die nicht identisch oder funktionell gleichwertig mit den Codonen der SEQ ID NO:1 sind. Der hierin verwendete Begriff "funktionell äquivalentes Codon" bezeichnet Codone, die die gleiche Aminosäure codieren, wie beispielsweise die 6 Codone für Arginin oder Serin, wie sie in Tabelle 1 aufgelistet sind, und bezieht sich auch auf Codone, die biologisch äquivalente Aminosäuren codieren.
Es gilt ebenfalls als selbstverständlich, dass Aminosäure- und Nucleinsäuresequenzen zusätzliche Reste enthalten können, wie beispielsweise zusätzliche N- oder C-terminale Aminosäuren oder 5'- oder 3'-Nucleinsäuresequenzen, und dennoch im Wesentlichen so sind, wie in einer der hierin offenbarten Sequenzen, so lange die Sequenz den vorstehend ausgeführten Kriterien genügt, einschließlich der Bewahrung der biologischen Proteinaktivität, was die Protein-Expression und Enzymaktivität betrifft. Die Hinzufügung terminaler Sequenzen gilt besonders für Nucleinsäuresequenzen, die beispielsweise verschiedene nicht codierende Sequenzen enthalten können, die entweder die 5'- oder 3'-Abschnitte der codierenden Sequenz flankieren oder verschiedene innere Sequenzen enthalten können, von denen bekannt ist, dass sie im Inneren der Gene auftreten. Insbesondere scheint die Aminosäuresequenz des HAS-Gens in Eukaryoten um 40% größer zu sein, als sie in Prokaryoten angetroffen wird.
Erlaubt man die Degeneration des genetischen Codes sowie konservative und halbkonservative Substitutionen, so werden Sequenzen, die zwischen etwa 40% und etwa 80% und mehr bevorzugt zwischen etwa 80% und etwa 90% oder sogar noch mehr bevorzugt zwischen etwa 90% und etwa 99% Nucleotide haben, die mit den Nucleotiden der SEQ ID NO:1 identisch sind, Sequenzen sein, die "im Wesentlichen so wie in SEQ ID NO:1 ausgeführt" sind.
Sequenzen, die im Wesentlichen die gleichen sind, wie sie in SEQ ID NO:1 ausgeführt sind, können auch funktionell als Sequenzen festgelegt werden, die zum Hybridisieren mit einem Nucleinsäuresegment in der Lage sind, welches das Komplement der SEQ ID NO:1 unter Standardbedingungen oder weniger strengen Bedingungen des Hybridisierens enthält. Geeignete Standardbedingungen der Hybridisierung sind der Fachwelt wohl bekannt und werden hierin eindeutig festgelegt.
Der hierin verwendete Begriff "Standardbedingungen der Hybridisierung" wird zur Beschreibung solcher Bedingungen verwendet, unter denen im Wesentlichen komplementäre Nucleinsäuresegmente standardmäßig Watson-Crick-Basenpaare bilden. Es sind eine Reihe von Faktoren bekannt, die die Spezifität des Bindens oder der Hybridisierung bestimmen, wie beispielsweise pH-Wert, Temperatur, Salzkonzentration, das Vorhandensein von Mitteln, wie beispielsweise Formamid und Dimethylsulfoxid, die Länge der Segmente, die hybridisieren, und dergleichen. Geht man davon aus, dass kürzere Nucleinsäuresegmente für die Hybridisierung verwendet werden, wie beispielsweise Fragmente zwischen etwa 14 und etwa 100 Nucleotide, so schließen die bevorzugten Bedingungen von Salz und Temperatur für die Hybridisierung 1,2 bis 1,8 × HPB bei 40° bis 50°C ein.
Selbstverständlich umfasst die vorliegende Erfindung auch DNA-Segmente, die zu der in SEQ ID NO:1 ausgeführten Sequenz komplementär oder weitgehend komplementär sind. Nucleinsäuresequenzen, die "komplementär" sind, sind solche, die in der Lage sind, nach den Standardregeln der Komplementarität nach Watson-Crick Basenpaare zu bilden. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "komplementäre Sequenzen" Nucleinsäuresequenzen, die weitgehend komplementär sind, was mit Hilfe des gleichen Nucleotidvergleichs bewertet werden kann, wie er vorstehend ausgeführt wurde, oder damit definiert werden kann, dass sie zum Hybridisieren mit dem Nucleinsäuresegment der SEQ ID NO:1 in der Lage sind.
Die Nucleinsäuresegmente der vorliegenden Erfindung können unabhängig von der Länge der codierenden Sequenz selbst mit anderen DNA-Sequenzen kombiniert werden, wie beispielsweise Promotoren, Polyadenylierungssignalen, zusätzlichen Restriktionsenzymstellen, mehrfachen Klonierungsstellen, Epitop-Tags, Polyhistidin-Sequenzen, anderen codierenden Segmenten und dergleichen, so dass ihre Gesamtlänge erheblich variieren kann. Man geht daher davon aus, dass ein Nucleinsäurefragment von fast jeder beliebigen Länge eingesetzt werden kann, wobei die Gesamtlänge vorzugsweise durch die leichte Herstellung und Verwendung in dem vorgesehenen Protokoll der rekombinanten DNA begrenzt ist.
Es gilt auch als selbstverständlich, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die spezielle Nucleinsäure und Nucleinsäuresequenzen der SEQ ID NO:1 und 2 beschränkt ist. Rekombinante Vektoren und isolierte DNA-Segmente können daher verschiedentlich die HAS codierenden Sequenzen selbst einbeziehen, codierende Sequenzen, die ausgewählte Veränderungen oder Modifikationen in der Sequenz der Grundcodierung tragen, oder sie können größere Polypeptide codieren, die nichtsdestoweniger HAS codierende Sequenzen enthalten, oder können biologisch funktionell äquivalente Proteine oder Peptide codieren, die variierende Aminosäuresequenzen haben.
Wir haben beispielsweise Hyaluronatsynthase in zwei anderen Systemen gefunden, charakterisiert und gereinigt: (a) die Gram-negativen Bakterien Pasturella multocida (SEQ ID NO:19); und (2) das Chlorella-Virus PBCV-1 (SEQ ID NO:7 und 8). Das Vorhandensein von Hyaluronansynthase in diesen zwei Systemen und unsere Möglichkeit zum Reinigen und Verwenden der Hyaluronansynthase aus diesen zwei verschiedenen Systemen in unsere Möglichkeit zur Reinigung und Isolierung von Nucleinsäuresequenzen, die enzymatisch aktive Hyaluronansynthase codieren.
Es wurde seit langem vermutet, dass die Kapsel vom Carter-Typ A P. multocida (SEQ ID NO:19) HA enthält. Die Charakterisierung der HA-Synthase von P. multocida führte zu interessanten enzymologischen Unterschieden zwischen dieser und den seHAS- und spHAS-Proteinen.
P. multocida-Zellen erzeugen eine leicht sichtbare extrazelluläre HA-Kapsel und da die zwei Streptokokken HAS's Membranproteine sind, wurden Membranpräparate des Erregers der Geflügelcholera getestet. In ersten Versuchen besaßen rohe Membranfraktionen, die aus der Ultraschallbehandlung kamen, allein sehr geringe Mengen an UDP-GlcNAc-abhängigen UDP-(¹⁴C)GlcA-Einbau in die HA(etwa 0,2 pM von GlcA-Transfer (μg Proteine)^–1h^–1), wenn sie einem Assay unter ähnlichen Bedingungen unterworfen wurden wie zum Messen der Aktivität von Streptokokken-HAS. Das Enzym aus E. coli mit dem rekombinanten hasA-Plasmid war gegenüber einer ersten Isolation schwer abbaubar. Diese Ergebnisse standen im Gegensatz zu den leicht detektierbaren Mengen, die mit Hilfe ähnlicher Methoden von Streptococcus erhalten wurden.
Ein alternatives Herstellungsprotokoll unter Anwendung einer eiskalten Lysozymbehandlung in Gegenwart von Proteaseinhibitoren in Verbindung mit einer Ultraschallbehandlung ermöglichte die Wiederherstellung von HAS-Aktivität aus beiden Spezies der Gram-negativen Bakterien. Es wurden spezifische Aktivitäten für HAS von 5 bis 10 pM von GlcA transferiert (μg Protein)^–1h^–1 und routinemäßig für Rohmembranen vom Wildtyp P. multocida mit der neuen Methode erhalten. Bei Fehlen von UDP-GlcNAc wurde nahezu keine Radioaktivität (<1% des identischen Assays mit beiden Zucker-Präkursoren) von UDP(¹⁴C)GlcA in das höher molekulare Material eingebaut. Aus einem kapselfreien Mutanten hergestellte Membranen, TnA, besaßen keine nachweisbare HAS-Aktivität bei Ergänzung mit beiden Zucker-Nucleotidpräkursoren (Daten sind nicht gezeigt). Die Gelfiltrationsanalyse unter Anwendung einer Sephacryl S-200-Säule zeigt, dass die relative Molekülmasse des überwiegenden Teils des ¹⁴C-markierten Produktes, das in vitro synthetisiert wurde, ≥8 × 10⁴ Da betrug, da das Material in freie Volumina eluierte, wobei ein solcher Wert in Übereinstimmung mit dem aus mindestens 400 Monomeren aufgebauten HA-Molekül steht. Dieses Produkt ist gegenüber einem Abbau durch Streptomyces-Hyaluronidase ansprechbar, jedoch gegenüber einer Proteasebehandlung beständig.
Die Parameter des HAS-Assays wurden variiert, um den Einbau von UDP-Zuckern in das Polysaccharid mit Hilfe von P. multocida-Membranen auf ein Maximum zu bringen. Die Streptokokken-spHAS erfordert Mg²⁺, weshalb dieses Metallion in die ersten Assays von P. multocida-Membranen einbezogen wurde. Das P. multocida-HAS (pmHAS) war relativ aktiv von pH 6,5 bis 8,6 in diesen Puffern vom Tris-Typ mit einem Optimum bei pH 7. Die HAS-Aktivität war im Bezug auf die Inkubationsdauer bei neutralem pH-Wert für mindestens 1 Stunde linear. Die pmHAS war offensichtlich weniger aktiv bei höheren Ionenstärken, da die Zugabe von 100 mM NaCl zu der Reaktion mit einem Gehalt von 50 mM Tris, pH 7 und 20 mM MgCl₂ den Zuckereinbau um etwa 50% verringerte.
Die Metallion-Spezifizität der pmHAS wurde bei pH 7 bewertet. Unter metallfreien Bedingungen in Gegenwart von EDTA war kein Einbau von radiomarkiertem Präkursor in das Polysaccharid nachweisbar (<0,5% maximales Signal). Mn²⁺ ergab die höchsten Einbauraten bei den niedrigsten Ionenkonzentrationen für die getesteten Metalle (Mg, Mn, Co, Cu und Ni). Mg²⁺ ergab etwa 50% der Mn²⁺-Stimulation, jedoch bei 10-fach höheren Konzentrationen. Co²⁺ oder Ni²⁺ bei 10 mM stützten niedrigere Werte der Aktivität (20% bzw. 9% von 1 mM Mn²⁺-Assays), jedoch waren mit 10 mM Cu²⁺ versorgte Membranen inaktiv. So führte ein Mischen von 10 mM Cu²⁺ und 20 mM Mg²⁺ mit dem Membrapräparat zu fast keinem Einbau von Marker in das Polysaccharid (<0,8% Mg, einziger Wert).
Die erste Charakterisierung der pmHAS wurde in Gegenwart von Mg²⁺ ausgeführt. Die Bindungsaffinität des Enzyms für seine Zucker-Nucleotidpräkursoren wurde bewertet, indem der scheinbare K_M-Wert gemessen wurde. Der Einbau von (¹⁴C)GlcA oder (³H)GlcNAc in Polysaccharid wurde bei variierenden Konzentrationen von UDP-GlcNAc oder UDP-GlcA beobachtet. In Mg²⁺-enthaltenden Kupfern betrugen die scheinbaren K_M-Werte etwa 20 μM für UDP-GlcA und etwa 75 μM für UDP-GlcNAc, die unter Nutzung der Hanes-Woolf-Kurven ([S]/v in Abhängigkeit von [S]) der Titrationswerte. Die V_max-Werte für beide Zucker waren die gleichen, da die Steigungen entsprechend 1/V_max der Hanes-Woolf-Kurven gleich waren. Im Vergleich zu den Ergebnissen aus den Assays mit Mg²⁺ war der K_M-Wert für UDP-GlcNAc um etwa 25 bis 50% bis etwa 105 μM erhöht und V_max nahm um einen Faktor von 2- bis 3-fach in Gegenwart von Mn²⁺ zu.
Die HA-Synthaseenzyme entweder von P, multocida, S. equisimilis oder S. pyrogenes nutzen UDP-Zucker, jedoch besitzen sie im Bezug auf pH- und Metallionen-Abhängigkeit und im Bezug auf K_M-Werte etwas andere kinetische Optima. Die Enzyme sind am aktivsten bei pH 7, jedoch zeigt die pmHAS nach Veröffentlichungen eine größere Aktivität bei leicht saurem pH-Wert und ist oberhalb von pH 7,4 relativ inaktiv. Die pmHAS nutzt Mn²⁺ effizienter als Mg²⁺ unter den Bedingungen des in vitro-Assays, jedoch ist die Identität des physiologischen Metall-Cofaktors in der Bakterien-Zelle unbekannt. Im Vergleich zu früheren Untersuchungen mit dem Streptokokkenenzym war Mg²+ sehr viel besser als Mn²⁺, wenngleich die kleinere Wirkung von Mn²⁺ bei etwa 10-fach niedrigeren Konzentrationen als der optimalen Mg²⁺-Konzentration maximal war. Offensichtlich bindet die pmHAS die UDP-Zucker fester als spHAS. Die gemessenen K_M-Werte für die pmHAS in Rohmembranen waren für jedes Substrat um etwa 2- bis 3-fach geringer als diejenigen, die von der HAS erhalten wurden, die in Streptokokkenmembranen angetroffen wird: 50 oder 39 μM für UDP-GlcA und 500 oder 150 μM für UDP-GlcNAc.
Anhand kinetischer Analysen war der V_max Wert der pmHAS um das 2- bis 3-fache höher in Gegenwart von Mn²⁺ als von Mg²⁺, jedoch war der UDP-GlcNAc-K_M-Wert in Assays mit dem ersteren Ion geringfügig erhöht. Diese Beobachtung der offensichtlich herabgesetzten Affinität legt nahe, dass die erhöhte Polymerisationsgeschwindigkeit nicht auf ein besseres Binden des Mn²⁺-Ion/Zucker-Nucleotid-Komplex an der/den enzymaktiven Stelle(n) zurückzuführen ist. Daher ist es möglich, dass Mn²⁺ einen etwas anderen Reaktionsschritt verstärkt, eine andere Stelle/Struktur des Enzyms verändert oder die Umgebung der Phospholipidmembran verändert. Die Gensequenz und die Proteinsequenz von pmHAS ist in SEQ ID NO:19 gezeigt.
Das Chlorellavirus PBCV-1 codiert eine funktionelle Glykosyltransferase, die ein Polysaccharid, Hyaluronan (Hyaluronsäure, HA) synthetisieren kann. Dieses Ergebnis steht im Widerspruch zu der allgemeinen Beobachtung, dass Viren entweder: (a) Glykosyltransferasen der Wirtszelle zur Erzeugung neuer Kohlenhydratstrukturen nutzen oder (b) Glykokonjugate der Wirtszelle während der Virionmutation sammeln. Außerdem ist die HA allgemein in Bezug auf Tiere und einige wenige ihrer virulenten Bakterienpathogene als eingeschränkt angesehen worden. Obgleich viele Pflanzen- Kohlenhydrate charakterisiert worden sind ist in Zellen von Pflanzen oder Protisten weder HA noch ein verwandtes Analogon zuvor nachgewiesen worden.
Die HAS-Enzyme von Vertebraten (DG42, HAS1, HAS2, HAS3) und Streptokokken-HasA-Enzyme (spHAS und seHAS) haben mehrere Bereiche mit Ähnlichkeit der Sequenz. Beim Sequenzieren des doppelsträngigen DNA-Genoms von Virus PBCV-1 (Paramecium bursaria Chlorella-Virus) wurde ein ORF (offenes Translationsraster), A98R (Zugriffnummer #442580), das ein 567-Proteinrest mit 28 bis 33% Aminosäureidentität zu den verschiedenen HAS's codiert, entdeckt. Dieses Protein wird als cvHAS (Chlorellla-Virus HA-Synthase) bezeichnet. Die Gensequenz, die PBCV-1, codiert, und ihre Proteinsequenz sind in den SEQ ID NO: 7 und 8 gezeigt.
PBCV-1 ist der Prototyp einer Familie (Phycodnarviridae) von großen (Durchmesser 175 bis 190 nm) polyedrischen, Plaque bildenden Viren, die in bestimmten einzelligen, eukaryotischen Chlorella-ähnlichen Grünalgen replizieren. Die PBCV-1-Virionen enthalten mindestens 50 verschiedene Proteine und eine Lipid-Komponente, die sich im Inneren des äußeren Glykoproteinkapsids befinden. Das PBCV-1-Genom ist ein lineares, nichtpermutiertes 330-kb dsDNA-Molekül mit kovalent geschlossenen Haarnadel-Enden.
Auf der Grundlage seiner abgeleiteten Aminosäuresequenz sollte das A98R-Genprodukt ein zusammenhängendes Membranprotein sein. Um diese Hypothese zu testen, wurde rekombinante A98R in Escherichia coli erzeugt und die Membranfraktion auf HAS-Aktivität assayiert. Die UDP-GlcA und UDP-GlcNAc wurden in das Polysaccharid durch die Membranfraktion eingebaut, die von Zellen deriviert wurde, die das A98R-Gen auf einem Plasmid, pCVHAS (mittlere spezifische Aktivität 2,5 pM GlcA-Transfer/μg Protein/min) enthalten, nicht jedoch Proben von Kontrollzellen (<0,001 pM GlcA Transfer/μg Protein/min). Keine Aktivität wurde in der löslichen Fraktion von Zellen nachgewiesen, die mit pCVHAS transformiert sind. UDP-GlcA und UDP-GlcNAc wurden gleichzeitig für die Polymerisation benötigt. Die Aktivität war optimal in Hepes-Puffer bei pH 7,2 in Gegenwart von 10 mM MnCl₂, während keine Aktivität nachgewiesen wurde, wenn das Metallion weggelassen wurde. Mg²⁺ und Co²⁺ waren etwa 20% so wirksam wie Mn²⁺ bei ähnlichen Konzentrationen. Das pmHAS hatte einen ähnlichen Metallbedarf, wobei andere HAS's Mg²+ bevorzugten.
Das rekombinante A98R-Enzym synthetisierte ein Polysaccharid mit einer mittleren relativen Molekülmasse von (3 ... 6) × 10⁶ Da, das kleiner war als dasjenige der HA, die durch rekombinante spHAS oder DG42 × 1 HAS in vitro synthetisiert wurde (etwa 10⁷ Da bzw. (etwa 5 ... 8) × 10⁶ Da; 13, 15). Das Polysaccharid wurde durch Streptomyces hyaluroniticus-HA-Lyase vollständig abgebaut, ein Enzym, das HA depolymerisiert, nicht jedoch strukturell verwandte Glykosaminglykane, wie beispielsweise Heparin und Chondroitin.
Es wurden PBCV-1 infizierte Chlorella-Zellen auf A98R-Gen-Expression untersucht. Ein etwa 1.700-Nucleotid A98R-Transkript erschien bei etwa 15 min Postinfektion und verschwand nach 60 min nach Infektion, was zeigt, dass A98R in frühzeitiges Gen ist. Dementsprechend wurden Membranfraktionen von nicht infizierten und PBCV-1 infizierten Chlorella-Zellen 50 und 90 min nach der Infektion auf HAS-Aktivität assayiert. Aktivität hatten infizierte Zellen, jedoch keine nicht infizierten Zellen. Wie das bakteriell derivierte rekombinante A98R-Enzym der radiomarkierte Einbau von UDP-[¹⁴C] GlcA in Polysaccharid sowohl von Mn²⁺ als auch von UDP-GlcNAc ab. Dieses radiomarkierte Produkt wurde ebenfalls durch HA-Lyase abgebaut. Disruptierte PBCV-1-Virionen hatten keine HAS-Aktivität.
Es wurden PBCV-1-infizierte Chlorella-Zellen auf HA-Polysaccharid unter Verwendung eines hochspezifischen ¹²⁵I-markierten, HA-bindenden Proteins analysiert. Extrakte von Zellen enthielten nach 50 und 90 min Postinfektion wesentliche Mengen an HA, nicht jedoch Extrakte von nicht infizierten Algen oder disruptierten PBCV-1-Virionen. Das markierte HA-bindende Protein zeigte außerdem Wechselwirkung mit intakten infizierten Zellen 50 und 90 min nach der Infektion, jedoch keine gesunden Zellen. Daher wurde ein wesentlicher Teil des neu synthetisierten HA-Polysaccharids an der äußeren Zelloberfläche der infizierten Algen immobilisiert. Die extrazelluläre HA spielt keine eindeutige Rolle in der Wechselwirkung zwischen dem Virus und dessen Algenwirt, da weder Plaquegröße noch Plaquezahl durch Einbeziehung entweder von testikulärer Hyaluronidase (465 Einheiten/ml) oder freiem HA-Polysaccharid (100 μg/ml) in das obere Agar des PBCV-1-Plaqueassays verändert wurde.
Das PBCV-1-Genom hat außerdem zusätzliche Gene, die auf eine UDP-Glc-Dehydrogenase (UDP-Glc DH) und eine Glutamin:Fructose-6-Phosphat-Aminotransferase (GFAT) codieren. UDP-Glc DH wandelt UDP-Glc in UDP-GlcA um – ein für die HA-Biosynthese notwendiger Präkursor. GFAT wandelt Fructose-6-Phosphat in Glucosamin-6-Phosphat um, ein Intermediat in dem UDP-GlcNAc-Stoffwechselweg. Beide dieser PBCV-1-Gene sind ähnlich wie die A98R-HAS frühzeitig exprimiert in der Infektion und codieren enzymatisch aktive Proteine. Das Vorhandensein mehrfacher Enzyme in dem HA-Biosyntheseweg zeigt, dass die HA-Erzeugung eine wichtige Funktion im Lebenszyklus der Chlorella-Viren übernehmen muss.
HA-Synthasen von Streptococcus, Vertebraten und PBCV-1 besitzen viele Motive von 2 bis 4 Resten, die in der gleichen relativen Reihenfolge auftreten. Diese konservativen Motive spiegeln wahrscheinlich Domänen wieder, die für die HA-Biosynthese, wie sie in 2 gezeigt wird, entscheidend sind. Die Proteinsequenzen von Gruppe C seHAS, Gruppe A spHAS, Maus-HAS1, HAS2, HAS3 und Frosch-HAS sind in 2 aufgeführt. Die Anordnung von 2 wurde unter Anwendung des DNA-mehrfachen Angleichungsprogrammes erreicht. Reste in seHAS sind mit anderen bekannten Vertretern der HAS-Familie (einschließlich Human-HAS1 und 2, nicht gezeigt) identisch und durch Schraffur und Sternchen gekennzeichnet. Die mit Punkten angegebenen Aminosäuren sind in allen Vertretern der größeren β-Glykosyltransferase-Familie konserviert. Das Rautensymbol zeigt den stark konservativen Cysteinrest, der für die Enzymaktivität entscheidend sein kann. Die ungefähren Mittelpunkte der vorhergesagten Membrandomänen MD1 bis MD7 sind mit Pfeilen bezeichnet. X1 zeigt Xeopus laevis und MM bedeutet Mus musculis.
Bereiche mit Ähnlichkeit zwischen den HAS's und anderen Enzymen, die β-verknüpfte Polysaccharide von UDP-Zuckerpräkursoren synthetisieren sind ebenfalls aufgedeckt, wenn mehrere Glykosyltransferasen sequenziert werden. Beispiele schließen bakterielle Cellulosesynthase ein, pilzliche und bakterielle Chitinsynthasen und die verschiedenen HAS's. Die Bedeutung dieser ähnlichen Strukturmotive wird deutlicher, wenn sich die dreidimensionalen Strukturen der Glykosyltransferasen akkumulieren.
3 stellt die evolutionären Beziehungen unter den bekannten Hyaluronansynthasen dar. Der phylogenetische Baum von 3 wurde mit Hilfe des Higgins-Sharp-Algorithmus unter Anwendung des DNA-mehrfachen Angleichungsprogramms erzeugt. Die berechneten übereinstimmenden Prozentanteile sind an dem jeweiligen Zweig des Dendrogrammes angegeben.
Die DNA-Segmente der vorliegenden Erfindung umfassen biologisch funktionelle, äquivalente HAS-Proteine und -Peptide. Diese Sequenzen können sich als eine Konsequenz von Kodon-Redundanz und funktioneller Äquivalenz ergeben, von der bekannt ist, dass sie natürlicherweise im Inneren von Nucleinsäuresequenzen und den dadurch codierten Proteinen auftreten. Andererseits lassen sich funktionell äquivalente Proteine oder Peptide auf dem Wege der Anwendung der Technologie der rekombinanten DNA erzeugen, worin Änderungen in der Proteinstruktur gentechnisch auf der Grundlage der Berücksichtigung der Eigenschaften der Aminosäuren bearbeitet werden können, die ausgetauscht werden sollen. Es können durch Anwendung der Locus-gerichteten Methoden der Mutagenese vom Menschen konzipierte Änderungen eingeführt werden, z.B. zur Einführung von Verbesserungen der Enzymaktivität oder der Antigenität des HAS-Proteins oder um HAS-Mutanten zu testen, um die Ha-Synthaseaktivität auf molekularer Ebene zu untersuchen.
Außerdem können sich spezifische Änderungen an der HAS-Codierungssequenz bei der Erzeugung von HA ergeben, die eine modifizierte Größenverteilung oder Strukturkonfiguration hat. Der Fachmann auf dem Gebiet könnte erkennen, dass die HAS-Codierungssequenz gentechnisch in einer Weise bearbeitet werden kann, um eine veränderte Hyaluronatsynthase zu erzeugen, die wiederum in der Lage ist, Hyaluronsäure mit unterschiedlichen Polymergrößen und/oder funktionellen Fähigkeiten zu erzeugen. Beispielsweise lässt sich die HAS-Codierungssequenz in einer solchen Weise verändern, dass die Hyaluronatsynthase eine veränderte Spezifität des Zuckersubstrates hat, so dass die Hyaluronatsynthase ein neues Hyaluronsäure-ähnliches Polymer erzeugt, das eine veränderte Struktur umfasst, wie beispielsweise ein zuvor nicht eingebauter Zucker oder Zucker-Derivat. Dieser neu eingebaute Zucker könnte zu einer modifizierten Hyaluronsäure mit unterschiedlichen funktionellen Eigenschaften führen, zu einer Hyaluronsäure mit kleinerer oder größerer Polymergröße/Molmasse oder zu beidem. Wie der Fachmann auf dem Gebiet erkennen kann lassen sich, wenn die HAS-Codierungssequenzen vorgegeben sind, Änderungen und/oder Substitutionen an der HAS-Codierungssequenz in der Art vornehmen, dass gewünschte Modifikationen der Eigenschaft und/oder Größe erreicht werden können. In Tabelle II sind die Spezifität von Zuckernucleotid und der Magnesiumion-Bedarf von rekombinanter seHAS zusammengestellt.
Tabelle II Zuckernucleotid-Spezifität und Maanesiumion-Bedarf von rekombinanter seHAS
Der hierin verwendete Begriff "modifizierte Struktur" bezeichnet ein Hyaluronsäure-Polymer, das einen Zucker oder ein Derivat enthält, die in dem natürlich auftretenden HA-Polysaccharid nicht angetroffen werden. Der Begriff "modifizierte Größenverteilung" bezeichnet die Synthese von Hyaluronsäuremolekülen einer Größenverteilung, die normalerweise in dem natürlichen Enzym nicht angetroffen wird; die gentechnisch bearbeitete Größe könnte sehr viel kleiner oder größer sein als normal.
Zahlreiche Hyaluronsäureprodukte unterschiedlicher Größe finden Anwendung auf den Gebieten der Arzneimittelversorgung und der Erzeugung eines Enzyms geänderter Struktur, das mit einer Hyaluronsäure anderer Größe kombiniert werden kann. Anwendungen in der Angiogenese und Wundheilung sind potentiell umfangreich, wenn Hyaluronsäure-Polymere von etwa 20 Monosacchariden in guten Mengen erzeugt werden können. Eine andere spezielle Anwendung für kleine Hyaluronsäure-Oligosaccharide ist die Stabilisierung rekombinanter Humanproteine, die für medizinische Zwecke verwendet werden. Ein Hauptproblem bei diesen Proteinen ist ihr Clearance aus dem Blut und eine kurze biologische Halbwertszeit. Eine der erfindungsgemäßen Lösungen dieses Problems besteht darin, ein kleines Molekülschild zu koppeln, womit verhindert wird, dass das Protein zu schnell aus dem Kreislauf eliminiert wird. Gut geeignet für diese Rolle ist Hyaluronsäure mit sehr geringer Molmasse und wäre nicht-immunogen und biokompatibel. Hyaluronsäure mit größerer Molmasse, die an einem Arzneimittel oder Protein gebunden ist, lässt sich verwenden, um auf das Retikuloendothel-Zellsystem zu zielen, das über endozytische Rezeptoren für Hyaluronsäure verfügt.
Angesichts der vorliegenden Offenbarung kann der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet erkennen, dass es mehrere Wege gibt, auf denen sich die Größenverteilung des Hyaluronsäure-Polymers, das durch die Hyaluronatsynthase aufgebaut wird, regulieren lässt, um unterschiedliche Größen zu geben. Erstens, lässt sich die kinetische Kontrolle der Produktgröße durch Herabsetzen der Temperatur verändern, durch Herabsetzen der Zeit der Enzymeinwirkung und durch Herabsetzen der Konzentration eines oder beider Zuckernucleotid-Substrate. Die Verringerung aller oder beliebiger dieser Variablen wird geringere Mengen und kleinere Größen an Hyaluronsäureprodukt ergeben. Die Nachteile dieser Vorgehensweisen bestehen darin, dass die Produktausbeute ebenfalls abnehmen wird und es schwierig sein kann, von Tag zu Tag oder Charge zu Charge Reproduzierbarkeit zu erreichen.
Zweitens, die Veränderung der intrinsischen Fähigkeit des Enzyms, ein großes Hyaluronsäureprodukt zu synthetisieren. Änderungen an dem Protein lassen sich gentechnisch mit Hilfe der Technologie der rekombinanten DNA bearbeiten, einschließlich Substitution, Deletion und Hinzufügung spezieller Aminosäuren (oder sogar die Einführung von prosthetischen Gruppen durch eine metabolische Bearbeitung). Derartige Änderungen, die zu einem intrinsisch langsameren Enzym führen, könnten dann eine besser reproduzierbare Kontrolle der Größe der Hyaluronsäure mit Hilfe kinetischer Maßnahmen erlauben. Die endgültige Größenverteilung der Hyaluronsäure wird durch bestimmte Merkmale des Enzyms ermittelt, die auf den speziellen Aminosäuren in der Sequenz beruhen. Unter den 20% der Reste, die zwischen den Streptokokken-Enzymen und den eukaryotischen Hyaluronatsynthasen absolut konservativ sind, befindet sich eine Reihe von Aminosäuren an eindeutigen Stellungen, die die Größe des Hyaluronsäure-Polymers, welches das Enzym aufbauen kann, kontrollieren oder stark beeinflussen. Spezielle Änderungen an irgendeinem dieser Reste können eine modifizierte HAS erzeugen, die ein HA-Produkt liefert, das eine modifizierte Größenverteilung hat. Gentechnisch bearbeitete Veränderungen an seHAS, spHAS, pmHAS oder cvHAS, die die intrinsische Größe der Hyaluronsäure verringern, die das Enzym vor der Freisetzung der Hyaluronsäure aufbauen kann, werden leistungsstarke Möglichkeiten zur Erzeugung eines Hyaluronsäureproduktes geringerer oder potentiell größerer Größe gewähren, als das native Enzym.
Schließlich lässt sich erzeugte Hyaluronsäure mit geringerer Molmasse mit speziellen Hyaluronidasen abbauen, um Hyaluronsäure geringerer Molmasse herzustellen. Diese Vorgehensweise ist jedoch schwer mit einer Reproduzierbarkeit zu erzielen, man muss die Hyaluronsäure sehr akribisch nachreinigen, um die Hyaluronidase sowie unerwünschte Abbauprodukte zu entfernen.
Wie in 4 gezeigt wird, kann Hyaluronsynthase gentechnisch zur Erzeugung von Hyaluronsäure-Polymeren unterschiedlicher Größe und speziell kleiner als der normale Wild-Typ des Enzyms bearbeitet werden. Die Figur zeigt die Verteilung der HA-Größen (in Millionen Dalton, ein Maß für die Molmasse) für eine Reihe von spHAS-Enzymen, von denen jedes gentechnisch durch ortsspezifische Mutagenese bearbeitet wurde, so dass es eine einzige Aminosäure-Änderung gegenüber dem nativen Enzym hat. Jedes der verschiedenen Cystein-Reste wurde durch Alanin ersetzt. Die Gruppe von 5 Kurven mit offenen Symbolen repräsentiert die folgenden spHAS-Proteine: Wild-Typ, C124A, C261A, C366A und C402A. Die ausgefüllten Kreise repräsentieren das schlecht exprimierte C225A-Protein, das lediglich teilweise aktiv ist.
Die gefüllten Dreiecke sind das C280A spHAS-Protein, von dem festgestellt wurde, dass es einen sehr viel größeren Bereich von HA-Polymeren synthetisiert, als das normale Enzym oder die anderen gezeigten Varianten. Diese reduzierte Praxis zeigt, dass es möglich ist, das Hyaluronatsynthase-Enzym gentechnisch so zu bearbeiten, dass es einen gewünschten Bereich von HA-Produktgrößen synthetisiert. Die seHAS-, pmHAS- und cvHAS-Gene, die Hyaluronatsynthase codieren, lassen sich auch durch ortsspezifische Mutagenese so gentechnisch bearbeiten, dass sie ein Enzym erzeugen, welches einen gewünschten Bereich von HA-Produktgrößen synthetisiert.
Strukturell modifizierte Hyaluronsäure ist grundsätzlich nichts anderes als die Veränderung der Größenverteilung des Hyaluronsäureproduktes durch Änderung spezieller Aminosäuren in der gewünschten HAS oder der spHAS. Derivate von UDP-GlcNAc, worin die N-Acetyl-Gruppe im Bezug auf UDP-GlcN fehlt oder durch eine andere chemisch verwendbare Gruppe ersetzt ist, werden erwartungsgemäß besonders nützlich sein. Die starke Substratspezifität muss auf einer speziellen Untergruppe von Aminosäuren unter den 20% beruhen, die konservativ sind. Spezielle Änderungen an einem oder mehreren dieser Reste erzeugen eine funktionelle Synthase, die weniger spezifisch mit einem oder mehreren der Substrate in Wechselwirkung tritt, als dieses für das native Enzym der Fall ist. Dieses veränderte Enzym könnte dann veränderte natürliche oder spezielle Zuckernucleotide nutzen, um Zucker-Derivate einzubauen, die so konzipiert sind, dass sie den Einsatz einer anderen Chemie für die folgenden Aufgaben ermöglicht: (i) kovalentes Kuppeln spezieller Arzneimittel, Proteine oder Toxine mit der strukturell modifizierten Hyaluronsäure für eine allgemeine oder gezielte Arzneimittelzuführung, radiologische Prozeduren, usw.; (ii) kovalentes Vernetzen der Hyaluronsäure selbst oder mit anderen Trägern, um ein Gel zu erzielen oder andere dreidimensionale Biomaterialien mit stärkeren physikalischen Eigenschaften; und (iii) kovalentes Verbinden von Hyaluronsäure mit einer Oberfläche, um einen biokompatiblen Film oder eine Monoschicht zu erzeugen.
Bakterien können auch gentechnisch so bearbeitet werden, dass sie Hyaluronsäure erzeugen. Beispielsweise haben wir Stämme von B. subtilis erzeugt, die das spHAS-Gen enthalten sowie das Gen für einen der Zuckernucleotid-Präkursoren. Wir haben diese Bakterien gewählt, da sie häufig in der Biotechnik für die Herstellung von Produkten zur Humananwendung verwendet werden. Diese Bakterien waren als erste Generation von Prototypen für die Erzeugung eines Bakteriums vorgesehen, das in der Lage ist, Hyaluronsäure in größeren Mengen zu erzeugen, als sie gegenwärtig unter Anwendung des natürlichen Wildtyp-Stammes verfügbar sind. Wir haben mehrfach Kopien dieser Gene eingegeben.
Beispielsweise wurden 3 Bacillus subtilis-Stämme so konstruiert, dass sie ein oder beide der Streptococcus pyogenes-Gene zur Hyaluronansynthase (spHAS) und UDP-Glucosedehydrogenase enthielten, deren Ergebnisse in Tabelle II-B gezeigt sind. Auf der Grundlage eines empfindlichen kommerziellen radiometrischen Assays zum Detektieren und quantifizieren von HA wurde festgestellt, dass der Stamm mit beiden Genen (Stamm #3) HA in dem Medium erzeugt und in dieses abscheidet. Der Elternstamm oder der Stamm mit nur dem Dehydrogenase-Gen (Stamm #1) erzeugt keine HA. Der Stamm #2, der nur das spHAS-Gen allein enthält, erzeugt HA, allerdings lediglich 10% von dem, was Stamm #3 erzeugt. Die Agarose-Gelelektrophorese zeigte, dass die vom Stamm #3 in das Medium abgeschiedene HA eine sehr hohe Molmasse hat.
Tabelle II-B
Bei diesen Versuchen wurden Streptokokken-Promotoren verwendet, die normalerweise bei diesen Genen angetroffen werden und die Proteinexpression bewirken. Es wird erwartet, dass der Aufbau von Stämmen mit spHAS- oder seHAS-Translationsraster unter Kontrolle eines B. subtilis-Promotors sogar noch weit bessere Ergebnisse liefern würde. Der verwendete Vektor ist ein Grampositiver E. coli-Shuttle-Vektor, der eine mittlere Kopiezahl in B. subtilis hat, und ein Gen für Erythromycin-Beständigkeit (ermöglicht die Beständigkeit gegenüber 8 μm/ml in B. subtilis oder 175 μg/ml in E. coli). Der B. subtilis-Wirtsstamm, der verwendet wird, ist 1A1 von BGSC, der einen Tryptophanbedarf hat, ansonsten aber ein Wild-Typ ist und Sporen bilden kann. Das Zellwachstum und die HA-Erzeugung erfolgten in Spezies Minimal Media, plus Tryptophan, Glucose, Spurenelemente und Erythromycin (8 μg/ml). Das Wachstum erfolgte bei 32°C unter heftiger Bewegung, bis das Medium verbraucht war (etwa 36 Stunden).
Dieses zeigt, dass diese biogenetisch bearbeiteten Zellen, die normalerweise Hyaluronsäure erzeugen würden, dafür kompetent wurden, dieses bei Transformation mit dem spHAS-Gen zu tun. Das seHAS ließe sich auch in non-Hyaluronsäure-erzeugende Bakterien einführen, um einen biogenetisch bearbeiteten Bakterienstamm zu erzeugen, der zur Erzeugung von Hyaluronsäure in der Lage ist.
Die vorliegende Erfindung offenbart außerdem eine gereinigte Zusammensetzung, die ein Polypeptid aufweist, das über eine Aminosäuresequenz entsprechend SEQ ID NO:2 verfügt. Der hierin verwendete Begriff "gereinigt" soll angeben, dass eine HAS-Proteinzusammensetzung, worin das HAS-Protein oder entsprechend modifiziertes HAS-Protein (z.B. das einen [HIS]_G-Schwanz enthält) bis zu einem beliebigen Grad im Bezug auf seinen natürlich erhältlichen Zustand gereinigt ist, d.h. in diesem Fall im Bezug auf seine Reinheit innerhalb eines prokaryotischen Zellextraktes. HAS-Protein lässt sich isolieren aus Streptococcus, Pasturella, Chlorella-Virus, Patientenproben, rekombinanten Zellen, infizierten Geweben, in isolierter Subpopulation von Geweben, die hohe Mengen an Hyaluronat in der extrazellulären Matrix enthalten, und dergleichen, was für den Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet angesichts der vorliegenden Offenbarung gut bekannt sein wird. Beispielsweise erzeugt rekombinantes seHAS- oder spHAS-Protein bis zu näherungsweise 10% des gesamten Membranproteins von E. coli. Eine gereinigte HAS-Proteinzusammensetzung bezeichnet daher auch ein Polypeptid, das über eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:2 frei von der Umgebung aufweist, in der es auf natürlichem Wege auftritt (5).
Wendet man sich der Expression des seHAS-Gens ob von einer genomischen DNA oder einer cDNA zu, so kann man mit der Herstellung eines Expressionssystems für die rekombinante Herstellung des HAS-Proteins weiter machen. Die gentechnische Bearbeitung von DNA-Segment(en) für die Expression in einem prokaryotischen oder eukaryotischen System kann mit Hilfe von Methoden der rekombinanten Expression ausgeführt werden, die der Fachwelt allgemein bekannt sind.
HAS lässt sich erfolgreich in eukaryotischen Expressionssystemen exprimieren, wobei die Erfinder jedoch der Ansicht sind, dass bakterielle Expressionssysteme zur Herstellung von HAS für alle Aufgaben verwendet werden können. Es wird angenommen, dass bakterielle Expression gegenüber eukaryotischer Expression im Bezug auf leichte Anwendbarkeit, Herstellungskosten und damit erhältliche Materialmenge Vorteile hat.
Die Reinigung von Streptokokken-Hyaluronansynthase (seHAS und spHAS) ist in Tabelle III und 6 dargestellt. Es wurden Fraktionen von verschiedenen Stufen des Reinigungsschemas mit Hilfe von SDS-PAGE auf einem 12,5%igen Gel analysiert, das sodann mit Coomassie Brilliant Blue R-250 angefärbt wurde. Spuren: Molmassenmarker; 1, ganze E. coli-Membranen, die das rekombinante seHAS-H6 enthielten; 2, unlösliche Fraktion nach Detergenssolubilisierung von Membranen; 3, solubilisierte Detergensfraktion; 4, Durchlauf aus dem Ni-NTA-Chromatographieharz; 5–9, fünf aufeinander folgende Wäschen der Säule (jeweils zwei Säulenvolumina); 10, die eluierte reine HA-Synthase, die ein einziges Band hat.
Tabelle III
Es wird vermutet, dass Transformation von Wirtszellen mit DNA-Segmenten, die HAS codieren, ein bequemes Hilfsmittel liefern, um ein HAS-Protein zu erhalten. Es wird außerdem vermutet, dass cDNA, genomische Sequenzen und Kombinationen davon für eukaryotische Expression geeignet sind, wenn natürlich die Wirtszelle die genomischen Transkripte bearbeitet, um funktionelle mRNA für die Translation in das Protein zu liefern.
Darüber hinaus offenbart die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zum Herstellen einer Proteinzusammensetzung, umfassend das Aufziehen einer rekombinanten Wirtszelle, die einen Vektor aufweist, der ein Protein codiert, in das eine Aminosäuresequenz entsprechend der SEQ ID NO:2 einbezogen ist oder funktionell ähnlich mit konservativen oder halbkonservativen Änderungen. Die Wirtszelle wird unter Bedingungen aufgezogen, die eine Nucleinsäure-Expression und Proteinerzeugung nach der Gewinnung des so erzeugten Proteins erlauben. Die Bedingungen der Erzeugung von HAS und schließlich von HA und einschließlich der Wirtszelle, die eine Nucleinsäureexpression, Proteinerzeugung und Gewinnung erlauben, werden dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet angesichts der erfindungsgemäßen Offenbarung des seHAS-Gens und des seHAS-Gen-Proteinproduktes HAS und durch die hierin beschriebenen Verfahren bekannt sein.
Bevorzugte Wirte für die Expression von Hyaluronsäure sind Prokaryoten, wie beispielsweise S. equisimilis, und andere geeignete Vertreter der Streptococcus-Spezies. Allerdings ist auch bekannt, dass HA mit Hilfe von heterologen Wirtszellen synthetisiert werden kann, die rekombinante HA-Synthase exprimieren, wie beispielsweise Spezies der Vertreter des Bacillus, Enterococcus oder sogar des Escherichia-Genus. Der am meisten bevorzugte Wirt für die Expression der HA-Synthase der vorliegenden Erfindung ist ein Bakterium, das mit dem HAS-Gen der vorliegenden Erfindung transformiert wurde, wie beispielsweise Lactococcus-Spezies, Bacillus subtilis oder E. coli.
In ähnlicher Weise wird angenommen, dass fast jeder eukaryotische Expressionssystem für die Expression von HAS genutzt werden kann, z.B. auf Basis von Baculovirus, Glutaminsynthase, Dihydrofolatreduktase, SV-40, Adenovirus, Cytomegalovirus, Hefe und dergleichen, die zum Einsatz gelangen könnten. Für die Expression auf diese Weise würde man die Codierungssequenzen neben und unter der Kontrolle des Promotors in Position bringen. Auf dem Gebiet gilt als selbstverständlich, dass, wenn man eine Codierungssequenz unter die Kontrolle eines solchen Promotors bringt, man das 5'-Ende der Transkriptions-Anfangsstelle des Leserasters der Transkription des Proteins zwischen etwa 1 und etwa 50 Nucleotide "abwärts" von (d.h. 3' von) dem gewählten Promotor in Position bringen muss. Auch werden Systeme des Saccharomyces cerevisiae-Hefeexpressionsvektors, wie beispielsweise pYES2, unter der Kontrolle des in 7 gezeigten GAL-Promotors HAS erzeugen. 7 zeigt, dass das spHAS-Enzym in rekombinanter Hefe unter Verwendung des pYES2-Plasmids erzeugt wurde. Wenn das Enzym UDP-GlcA und UDP-GlcNAc zugeführt bekommt, erzeugt es hochmolekulare HA.
Wo eukaryotische Expression in Betracht gezogen wird, wird man typischerweise auch anstreben, in die Transkriptionseinheit, in die ein HAS-Gen oder DNA einbezogen ist, eine entsprechende Polyadenylierungsstelle (z.B. 5'-AATAAA-3') einzubauen, sofern nicht eine in dem ursprünglich geklonten Segment enthalten war. Typischerweise ist die Stelle der Poly-A-Addition etwa 30 bis 2.000 Nucleotide "abwärts" der Terminationsstelle des Proteins an einer Position vor der Transkriptionstermination angeordnet.
Es gilt als selbstverständlich, dass nahezu jede der üblicherweise zum Einsatz gelangenden Wirtszellen in Verbindung mit der Expression von HAS in Übereinstimmung hiermit verwendet werden kann. Beispiele für bevorzugte Zelllinien zum Exprimieren von HAS-cDNA der vorliegenden Erfindung schließen Zelllinien ein, die typischerweise für die eukaryotische Expression eingesetzt werden, wie beispielsweise 239-, AtT-20-, HepG2-, VERO-, HeLa-, CHO-, WI 38-BHK-, COS-7-, RIN- und MDCK-Zelllinien. Darin einbezogen sind in der Regel Schritte der Bereitstellung eines rekombinanten Wirtes, der das rekombinante DNA-Segment trägt, welches das HAS-Enzym codiert und in der Lage ist, das Enzym zu exprimieren; ferner das Aufziehen des rekombinanten Wirts in Medien unter Bedingungen, die eine Transkription des geklonten HAS-Gens oder der cDNA ermöglichen und für die Erzeugung der Hyaluronsäure in der Lage sind; und Abtrennen und Reinigen des HAS-Enzyms oder der abgesonderten Hyaluronsäure aus dem rekombinanten Wirt.
In der Regel hängen Bedingungen, die für die Expression des geklonten HAS-Gens oder der cDNA geeignet sind, von dem Promotor ab, von dem Vektor und dem Hostsystem, die zum Einsatz gelangen. Wo man beispielsweise den 1ac-Promotor einsetzt, wird man anstreben, durch den Einschluss eines Materials eine Transkription einzuleiten, die die 1ac-Transkription stimuliert, wie beispielsweise Isopropylthiogalactosid. Beispielsweise wird das geklonte seHAS-Gen der vorliegenden Erfindung als ein HIS exprimiert, das Protein in E. coli entsprechend der Darstellung in 5 enthält. Wo andere Promotoren zum Einsatz gelangen, können andere Materialien erforderlich sein, um eine Transkription einzuleiten oder ansonsten aufwärts zu regulieren.
5 zeigt die Überexpression von rekombinanter seHAS und spHAS in E. coli. Es wurden Membranproteine (5 mg pro Spur) mit Hilfe der SDS-PAGE unter Verwendung eines 10% (Gewicht/Volumen) Gels unter reduzierenden Bedingungen fraktioniert. Das Gel wurde mit Coomassie Blue R-250 angefärbt, photographiert, gescannt und unter Anwendung eines dynamischen Molekular-Densitometers (Model PDSI P60) quantifiziert. Die Position von HA-Synthase ist mit Hilfe des Pfeiles markiert. Die Spur A ist native spHAS (Gruppe A); Spur C ist native seHAS; Spur E ist rekombinante seHAS; Spur P ist rekombinante spHAS; Spur V ist Vektor allein. Die zur Anwendung gelangenden Standards waren "Biorad" mit niedriger Mr und sind in kDa angegeben.
Um zusätzlich eine Expression der Synthase zu erhalten, wird man bevorzugt anstreben, eine Umgebung bereitzustellen, die für die HA-Synthese förderlich ist, indem man entsprechende Gene einbezieht, die Enzyme codieren, die für die Biosynthese der Zuckernuleotid-Präkursoren erforderlich sind, oder indem Aufzuchtmedien verwendet werden, die Substrate für die Präkursor-zuführenden Enzyme enthalten, wie beispielsweise N-Acetylglucosamin oder Glucosamin (GlcNAc oder GlcNH₂) und Glucose (Glc).
Ferner kann es wünschenswert sein, das Gen in einem Wirt einzubauen, der eine fehlerhafte Enzymhyaluronidase hat, so dass das Produkt, welches über das Enzym synthetisiert wird, nicht in dem Medium abgebaut wird. Darüber hinaus ließe sich ein Wirt so auswählen, dass die Erzeugung von HA optimiert wird. Beispielsweise wäre ein geeigneter Wirt ein solcher, der große Mengen der Zuckernucleotid-Präkursoren erzeugt, um das HAS-Enzym zu tragen und zu ermöglichen, dass es große Mengen an HA erzeugt. Ein solcher Wirt lässt sich selbstverständlich finden oder kann mit Hilfe einer Vielzahl von Methoden hergestellt werden, einschließlich mit Hilfe der Technologie der Mutagenese oder der rekombinanten DNA. Die Gene für die Zuckernucleotid synthetisierenden Enzyme und speziell die UDP-Glc-Dehydrogenase, die zur Erzeugung von UDP-GlcA erforderlich ist, könnten auch isoliert und in einen Vektor zusammen mit dem HAS-Gen oder der cDNA eingebaut werden. Die vorliegende Erfindung offenbart außerdem einen Wirt, der dieses benachbarte rekombinante Gen oder die cDNA's und die Amplifikation dieser Genprodukte enthält, wodurch eine vermehrte Erzeugung von HA möglich wird.
Die zum Aufziehen der Wirtszelle eingesetzten Mittel werden für nicht besonders kritisch angesehen. Nützliche Details wird man unter Bezugnahme auf die Offenbarung der US-P-4 517 295, 4 801 539, 4 784 990 oder 4 780 414 finden können, die hiermit insgesamt als Fundstellen einbezogen sind. Wo ein prokaryotischer Wirt zum Einsatz gelangt, wie beispielsweise S. equisimilis, kann es wünschenswert sein, eine Fermentation der Bakterien unter anaeroben Bedingungen in CO₂-angereicherten Aufzuchtmedien einzusetzen. Dieses ermöglicht eine umfangreichere Erzeugung von HA als unter aeroben Bedingungen. Eine andere Tatsache ist die, dass Streptokokken-Zellen, die anaerob aufgezogen werden, keine pyrogenen Exotoxine erzeugen. Geeignete Aufzuchtbedingungen lassen sich für andere prokaryotische Wirte aufgabenspezifisch herstellen, wie der Fachmann auf dem Gebiet angesichts der vorliegenden Offenbarung erkennen kann.
Sobald der geeignete Wirt konstruiert ist und unter für die Erzeugung von HA geeigneten Bedingungen aufgezogen wurde, wird man die so erzeugte HA abtrennen wollen. Im typischen Fall wird die HA abgesondert oder auf andere Weise durch den rekombinanten Organismus in das umgebende Medium abgestoßen und ermöglicht die leichte Isolation von HA aus dem Medium mit Hilfe bekannter Methoden. Beispielsweise kann die HA von den Zellen und Zelltrümmern durch Filtrieren und in Kombination mit der Abtrennung von dem Medium durch Ausfällen mit Hilfe von Alkoholen abgetrennt werden, wie beispielsweise Ethanol. Andere Mittel zum Ausfällen schließen organische Lösemittel ein, wie beispielsweise Aceton, oder quaternäre organische Ammoniumsalze, wie beispielsweise Salze, wie beispielsweise Getylpyridiniumchlorid (CPC).
Eine bevorzugte Methode für die Isolation von HA wurde in der US-P-4 517 295 beschrieben, die hiermit als Fundstelle einbezogen ist und worin die organische Carbonsäure, Trichloressigsäure, der Bakteriensuspension am Ende der Fermentation zugegeben wird. Die Trichloressigsäure bewirkt, dass sich die Bakterienzellen zusammenballen und sterben, womit die leichte Abtrennung dieser Zellen und der damit zusammenhängenden Trümmer von der HA als das gewünschte Produkt verbessert wird. Der geklärte Überstand wird eingeengt und dialysiert, um niedermolekulare Verunreinigungen einschließlich der organischen Säure zu entfernen. Die vorgenannten Prozedur nutzt die Filtration durch Filterkasetten, die Filter mit einer Porengröße von 0,22 μm enthalten. Die Diafiltration wird so lange fortgesetzt, bis die Leitfähigkeit der Lösung auf ungefähr 0,5 Mega-Ohm abnimmt.
Die eingeengte HA wird durch Zusetzen eines Überschusses an chemisch reinem Ethanol oder anderem organischen Lösemittel ausgefällt und die ausgefällte HA anschließend durch Waschen mit Ethanol und Vakuumtrocknung getrocknet und zur Entfernung des Alkohols lyophilisiert. Die HA kann sodann erneut in einem Borat-Puffer, pH 8, aufgelöst und mit CPC oder bestimmten anderen organischen Ammoniumsalzen, wie beispielsweise CETAB, einer gemischten Triethylammoniumbromid-Lösung, bei 4°C ausgefällt werden. Die ausgefällte HA wird durch Grobfiltration, erneute Suspension in 1 M NaCl, Diafiltration und durch Einengen entsprechend der weiteren Beschreibung in der vorgenannten Patentschrift gewonnen. Die resultierende HA wird filtersterilisiert und ist fertig, um zu einem entsprechenden Salz, Trockenpulver oder einer sterilen Lösung in Abhängigkeit von der gewünschten Endanwendung umgewandelt zu werden.
A. Typische genetische Bearbeitungsmethoden, die eingesetzt werden können
Sofern Zellen ohne übermäßige Zellmembranbarrieren als Wirtszellen verwendet werden, wird die Transfektion mit Hilfe der Methode der Calciumphosphat-Ausfällung ausgeführt, die der Fachwelt bekannt ist. Es können jedoch auch andere Methoden zur Anwendung gelangen, um DNA in die Zellen einzuführen, wie beispielsweise Zellkerninjektion, kationische Lipide, Elektroporation, Protoplastfusion oder mit Hilfe des "Biolistic(tm) Bioparticle"-Zuführungssystems, das von DuPont (1989) entwickelt wurde. Der Vorteil der Anwendung des DuPont-Systems ist ein hoher Transformationswirkungsgrad. Sofern prokaryotische Zellen oder Zellen zur Anwendung gelangen, die substantielle Zellwandkonstruktionen enthalten, ist die bevorzugte Transfektionsmethode eine Calcium-Behandlung unter Verwendung von Calciumchlorid, um "Kompetenz" oder Elektroporation einzuleiten.
Bei der Konstruktion geeigneter Vektoren, die die gewünschten Codierungs- und Kontrollsequenzen enthalten, kommen Standardmethoden der Ligation zum Einsatz. Es werden isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente aufgespalten, gezielt verändert und erneut in einer Form ligiert, die zur Konstruktion der erforderlichen Plasmide gewünscht wird. Die Aufspaltung wird durch Behandeln mit Restriktionsenzym (oder -enzymen) in einem geeigneten Puffer ausgeführt. In der Regel werden etwa 1 μg Plasmid oder DNA-Fragmente mit etwa 1 Enzymeinheit in etwa 20 μl Pufferlösung verwendet. Geeignete Puffer- und Substratmengen für die speziellen Restriktionsenzyme werden von Seiten des Herstellers vorgegeben. Man kann mit Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37°C arbeiten.
Nach den Inkubationen wird Protein durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt und die Nucleinsäure aus der wässrigen Fraktion durch Ausfällung mit Ethanol gewonnen. Sofern stumpfe Enden benötigt werden, wird die Herstellung für 15 min bei 15°C mit 10 Einheiten Polymerase I (Klenow), Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolausfällung hergestellt. Für die Ligation von näherungsweise äquimolaren Mengen der gewünschten Komponenten werden diese in geeigneter Weise mit gezielt verändertem Ende, um eine richtige Anpassung zu vermitteln, mit etwa 10 Einheiten T4-DNA-Ligase pro 0,5 μg DNA behandelt. Sofern als Komponenten aufgespaltene Vektoren verwendet werden, kann es nützlich sein, eine erneute Ligation des aufgespaltenen Vektors durch Vorbehandlung mit bakterieller alkalischer Phosphatase zu verhindern.
Bei der Analyse zur Bestätigung funktioneller Sequenzen in konstruierten Plasmiden war der erste Schritt die Amplifikation der Plasmid-DNA durch Klonen in spezielle kompetente E. coli-SURE-Zellen (Stratagene), indem die Transformation bei 30° bis 32°C ausgeführt wurde. Zweitens, wurde rekombinantes Plasmid verwendet, um E. coli K5-Stamm Bi8337-4l, der den UDP-GlcA-Präkursor erzeugen kann sowie nach Erfordernis durch antibiotische Resistenz ausgewählte erfolgreiche Transformanten. Sodann werden Plasmide aus der Genbank von Transformanten auf bakterielle Kolonien gescreent, die eine HA-Produktion zeigen. Diese Kolonien werden herausgenommen, amplifiziert und die Plasmide durch Restriktionskartierung gereinigt und analysiert. Sodann werden die Plasmide, die Anzeichen eines funktionellen HAS-Gens zeigen, weiter mit Hilfe einer Reihe von Methoden der Sequenzanalyse charakterisiert, die der Fachwelt bekannt sind.
B. Quelle und Wirtszellenkulturen und Vektoren
In der Regel werden für das erste Klonen von DNA-Sequenzen und die Konstruktion der in der Erfindung verwendbaren Vektoren Prokaryoten verwendet. Es wird angenommen, dass eine geeignete Quelle Gram-positive Zellen sein können und speziell solche, die von Streptokokken-Stämmen der Gruppe C abgeleitet sind. Bakterien mit einer einzigen Membran und jedoch mit einer dicken Zellwand, wie beispielsweise Staphylococci und Streptococci, sind Gram-positiv. Gram-negative Bakterien, wie beispielsweise E. coli, enthalten zwei diskrete Membranen anstatt nur eine, die die Zelle umgibt. Gram-negative Organismen haben in der Regel dünnere Zellwände. Die Einzelmembran der Gram-positiven Organismen ist analog zu der inneren Plasmamembran von Gram-negativen Bakterien. Die bevorzugten Wirtszellen sind Streptococcus-Stämme, die mutiert sind, um Hyaluronidase-negativ zu werden oder ansonsten gehemmt zu werden ( EP144019 , EP266578 , EP244757 ).
Streptococcus-Stämme, die besonders nützlich gewesen sind, schließen S. equisimilis und S. zooepidemicus ein.
Ebenfalls können für die Expression Prokaryoten verwendet werden. Bei der Expression von HA-Synthase in einer Form, die höchstwahrscheinlich hochmolekulare HA-Synthase aufnimmt, wird man Streptococcus-Spezies einsetzen wollen, wie beispielsweise S. equisimilis oder S. zooepidemicus. Die vorgenannten Stämme sowie E. coli W3110 (F-, Lambda-, prototrophisch, ATCC Nr. 273325), Bazillen, wie beispielsweise Bacillus subtilis, oder andere Enterobakterien, wie beispielsweise Serratia marcescens, ließen sich zur Erzeugung eines "Super"-HAS enthaltenden Wirtes nutzen.
In der Regel werden in Verbindung mit diesen Wirten Plasmidvektoren verwendet, die Quellen für Replikations- und Kontrollsequenzen enthalten, die von Spezies abgeleitet sind, die mit der Wirtszelle kompatibel sind. Der Vektor führt ursprünglich eine Quelle für die Replikation sowie auch Markierungssequenzen, die in der Lage sind, eine phänotypische Auswahl transformierter Zellen zu gewähren. Beispielsweise wird E. coli typischerweise unter Verwendung von pBR322 transformiert, ein von einer E. coli-Spezies abgeleitetes Plasmid. pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und bietet daher eine leichte Möglichkeit zur Identifikation transformierter Zellen. Ein pBR-Plasmid oder ein pUC-Plasmid oder anderes mikrobielles Plasmid oder Phage müssen außerdem Promotoren enthalten oder so modifiziert sein, dass sie diese enthalten, die durch den mikrobiellen Organismus zur Expression ihrer eigenen Proteine verwendet werden können.
Solche Promotoren, die in der Konstruktion rekombinanter DAN am häufigsten verwendet werden, schließen ein: lacZ-Promotor, tac-Promotor, den T7 Bacteriophagen-Promotor und Tryptophan (trp)-Promotorsystem. Während diese die am häufigsten verwendeten sind, sind andere mikrobielle Promotoren entdeckt und genutzt worden und Einzelheiten in Verbindung mit ihren Nucleotidsequenzen veröffentlicht worden, die dem Fachmann die Möglichkeit bieten, diese funktionell mit Plasmidvektoren zu ligieren. In der Anwendung der vorliegenden Erfindung kann man ebenfalls Integrationsvektoren nutzen.
Zusätzlich zu Prokaryoten können auch eukaryotische Mikroben, wie beispielsweise Hefekulturen, angewendet werden. Unter den eukaryotischen Mikroorganismen sind Saccharomyces cerevisiae oder gemeine Bäckerhefen die am häufigsten verwendeten, obgleich eine Reihe anderer Stämme im Allgemeinen verfügbar sind. Bei Expression in Saccharomyces wird beispielsweise häufig das Plasmid YRp7 verwendet. Dieses Plasmid enthält bereits das trp1-Gen, das einen Selektionsmarker für einen Mutantenstamm der Hefe bereitstellt, der die Fähigkeit zum Wachsen oder Tryptophan fehlt, beispielsweise ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1. Das Vorhandensein der trp1-Läsion als ein Charakteristikum des Hefewirtszellen-Genoms bietet dann eine wirksame Umgebung zum Nachweis der Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan. Geeignete förderliche Sequenzen in Hefevektoren schließen die Promotoren für die Galactose-Anwendungsgene ein, die 3-Phosphoglycerat-Kinase oder andere glykolytische Enzyme, wie beispielsweise Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglycerat-mutase, Pyruvatkinase, Triosephosphat-isomerase, Phosphoglucose-isomerase und Glucokinase.
Bei der Konstruktion geeigneter Expressionsplasmide werden die mit diesen Genen assoziierten Terminationssequenzen ebenfalls in den Expressionsvektor 3' der Sequenz ligiert, die exprimiert werden soll, um der mRNA Polyadenylierung zu vermitteln und Termination. Andere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil einer Transkription haben, die durch Wachstumsbedingungen gesteuert wird, sind die Promotorregion für Alkoholdehydrogenase-2, Cytochrom-C, saure Phosphatase, degradative Enzyme in Verbindung mit Stickstoff-Metabolismus und die vorgenannten Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase sowie Enzyme, die für die Maltose- und Galactose-Nutzung zuständig sind. Jeder Plasmidvektor, der einen hefekompatiblen Promotor enthält und als Quelle für Replikations- und Terminationssequenzen sind geeignet.
Zusätzlich zu den Mikroorganismen lassen sich als Wirte auch Kulturen von Zellen verwenden, die von multizellularen Organismen abgeleitet sind. Im Prinzip funktioniert jede dieser Zellkulturen unabhängig davon, ob sie von einer Vertebratenkultur oder einer Invertebratenkultur kommt. Am größten war jedoch das Interesse für Vertebraten-Zellen, wobei die Propagierung von Vertebraten-Zellen in Kultur zu einer Routineprozedur in den letzten Jahren geworden ist. Beispiele für derartige verwendbare Wirtszelllinien sind VERO und HeLa-Zellen, Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) und Zelllinien von WI38, BHK, COS und MDCK.
Bei der Verwendung in Säuger-Zellen werden die Kontrollfunktionen auf den Expressionsvektoren oftmals durch virales Material bereitgestellt. Beispielsweise werden häufig verwendete Promotoren von Polyom, Adenovirus 2, Rinder-Papillomvirus und am häufigsten Simianvirus 40 (SV40) abgeleitet. Die ersteren und letzteren Promotoren von SV40-Virus sind besonders nützlich, da sich beide leicht aus dem Virus als ein Fragment erhalten lassen, das auch den SV40 viralen Ausgangspunkt der Replikation enthält. Größere oder kleinere SV40-Fragmente können ebenfalls verwendet werden unter der Voraussetzung, dass die näherungsweise 250 bp-Sequenz einbezogen ist, die sich von der Hind III-Stelle bis zu der Bg1 I-Stelle erstreckt, die sich in dem viralen Ursprung der Replikation befindet.
Außerdem ist es möglich und oftmals wünschenswert, Promotor- oder Kontrollsequenzen zu nutzen, die normalerweise in Verbindung mit der gewünschten Gensequenz stehen, sofern solche Kontrollsequenzen mit den Wirtszellsystemen kompatibel sind. Ein Ursprung für die Replikation kann entweder durch Konstruktion des Vektors unter Einbeziehung eines exogenen Ursprunges bereitgestellt werden, wie er sich beispielsweise vom SV40 oder von anderen viralen Ursprüngen (z.B. Polyom, Adeno, BPV) ableiten lässt, oder kann über einen chromosomalen Replikationsmechanismus der Wirtszelle bereitgestellt werden. Wenn der Vektor in das Wirtszell-Chromosom integriert ist, ist der letztere Mechanismus oftmals ausreichend.
C. Isolation eines bona fide HA-Synthasegens aus einem stark verkapselten Stamm von Gruppe C Streptococcus equisimilis
Das codierte Protein das als seHAS bezeichnet wird, hat 417 Aminosäuren (berechnete relative Molekülmasse 47.778 und pl 9,1) und ist der kleinste Vertreter der HAS-Familie, der bisher identifiziert wurde (2). Außerdem migriert seHAS unnormal schnell in SDS-PAGE (M_r etwa 42 kDa) (5 und 8).
8 ist eine graphische Darstellung einer Western Blot-Analyse von rekombinanter seHAS unter Verwendung spezifischer Antikörper. Gruppe C (C; Spur 1) oder Gruppe A (A; Spur 4)-Streptokokkenmembranen und E. coli-Membranen (9 mg/Spur), die rekombinante seHAS enthalten (E; Spuren 2, 7 und 9) oder spHAS (P; Spuren 3, 6, 8 und 10), wurden durch reduzierende SDS-PAGE fraktioniert und zu Nitrocellulose elektrotransferiert. Streifen von Nitrocellulose wurden mit Sonden geprüft und entsprechend der Beschreibung in der Anmeldung unter Verwendung von gereinigten IgG-Fraktionen entwickelt, die bis zu den folgenden Bereichen der spHAS hochstiegen: zentrales Domänenpeptid E¹⁴⁷-T¹⁶¹ (Spuren 1 bis 4); C-Terminuspeptid (Spuren 5 bis 6); das komplette Protein (Spuren 7 und 8); rekombinante Zentraldomäne (Spuren 9 und 10). Nicht immunes IgG oder Membranen von Zellen, die mit Vektor allein transformiert wurden, lieferten keine Anfärbung wie in Spur 5.
Die seHAS- und spHAS-Protein (bereits identifiziert in der US-Patentschrift 08/899 940) codierenden Sequenzen sind zu 72% identisch. Die deduzierte Proteinsequenz von seHAS wurde anhand der Reaktivität mit einem synthetischen Peptid-Antikörper (8) bestätigt. Rekombinante seHAS, die in E. coli exprimiert war, wurde in Membranen als ein Hauptprotein gewonnen (5) und synthetisierte HA mit sehr großem Molekulargewicht in Gegenwart von UDP-GlcNAc und UDP-GlcA in vitro (9).
9 zeigt eine kinetische Analyse der HA-Größenverteilungen, die durch seHAS und spHAS erzeugt werden. E. coli-Membranen, die gleiche Mengen an seHAS- oder spHAS-Protein enthalten, wurden bei 37°C mit 1,35 mM UDP-[¹⁴C]GlcA (1,3 × 10³ dpm/nM) und 3,0 mM UDP-GlcNAc entsprechend der Beschreibung in der Anmeldung inkubiert. Diese Substratkonzentrationen sind um das 15-fache größer als die entsprechenden Km-Werte. Die nach 0,5, 1,0 und 60 min genommenen Proben wurden mit SDS behandelt und über Sephacryl S400 HR chromatographiert. Die HA-Profile in dem Fraktionierungsbereich der Säule (Fraktionen 12 bis 24) wurden auf den Prozentanteil an Gesamt-HA in jeder Fraktion normiert. Die Werte oberhalb der Pfeile im oberen Bereich sind die MW-Werte (in Millionen) von HA, die direkt in einem separaten Versuch unter Anwendung eines Mehrwinkel-Laserlichtstreuungsinstrument nach Dawn (Wyatt Technology Corp.) bestimmt wurden. Die Größenverteilungen von HA, die synthetisiert wurde von seHAS (⦁,
)und spHAS (o, ⧠), bei 0,5 min (o, ⦁), 1,0 min (⧠,
)und 60 min (_,
)entsprachen den Angaben in der Darstellung. Die Analyse zeigte, dass die seHAS und spHAS im Wesentlichen in der Größenverteilung der HA-Ketten, die sie synthetisieren (9), identisch sind. In ihrer Fähigkeit zur Erzeugung von HA ist die seHAS zwei Mal so schnell wie spHAS.
C.1 Bakterielle Stämme und Vektoren
Die Mucoid-Gruppe C Stamm D181 (Streptococcus equisimilis) wurde von der Rockefeller University Collection erhalten. Die E. coli-Wirtsstämme Sure und XL1-Blue MRF' wurden von Stratagene erhalten und der Stamm Top10 F' von Invitrogen. Sofern nicht anders angegeben, wurden Streptokokken in THY und E. coli-Stämme in LB-Medium aufgezogen. Der pKK-223-Expressionsvektor kam von Pharmacia, PCR 2.1-Klonierungsvektor kam von Invitrogen und der vordigerierte λ Zap-Express TM Bam H1/CIAP-Vektor kam von Stratagene.
C. 2 Rekombinante DNA und Klonen
Hochmolekulare genomische DNA von Streptococcus equisimilis, die mit Hilfe der Methode von Caparon und Scott isoliert wurde (in der Fachwelt bekannt), wurde teilweise mit Sau3A1 bis zu einer mittleren Größe von 2 bis 12 kb digeriert. Die digerierte DNA wurde mit Ethanol ausgefällt, gewaschen und an den Bam HI/CIAPλ Zap-Express-Vektor ligiert. Die ligierte DNA wurde in Phagen mit einem von der Promega erhaltenen Extrakt Packagene^TM gepackt. Der Titer der gepackten Phagen-Genbank wurde unter Verwendung von XL1-Blue MRF'-E. coli als Wirt kontrolliert.
C.3 Degenerat-PCR-Amplifikation
Degenerierte Oligonucleotide wurden auf der Grundlage konservativer Sequenzen unter spHAS (Streptococcus pyrogenes), DG42 (Xenopus laevis HAS; 19) und nodC (ein Rhizobium meliloti-Knöllchenbildungsfaktor; 20) aufgebaut und für die PCR-Amplifikation mit D181-genomischer DNA als eine Matrize verwendet. Die Amplifikationsbedingungen waren 34 Zyklen bei: 94°C für 1 min, 44°C für 1 min, 72°C für 1,5 min gefolgt von einer abschließenden Verlängerung bei 72°C für 10 min. Das Oligonucleotid HADRF1. 5'-GAY MGA YRT YTX ACX AAT TAY GCT ATH GAY TTR GG-3' (SEQ ID NO:20; Sense-Strang) entsprach der Sequenz D²⁵⁹RCLTNYAIDL (SEQ ID NO:9; spHAS). Das Oligonucleotid HACTRI, 5'-ACG WGT WCC CCA NTC XGY ATT TTT NAD XGT RCA-3' (SEQ ID NO:21; Antisense-Strang) entsprach der Region C⁴⁰⁴TIKNTEWGTR (SEQ ID NO:10, spHAS). Die Degeneration der Basen an bestimmten Stellen wird durch die Nomenklatur dargestellt, die von der IUPAC in ihren Code für degenerierte Basen übernommen wurden und in Tabelle IV zusammengestellt sind.
Tabelle IV
IUPAC Code – degenerierte Basen
Die International Union for Pure and Applied Chemistry (IUPAC) hat einen Standard für die Einbuchstaben-Kennzeichnung degenerierter Basen aufgestellt. Diese sind:
B=C+G+T
D=A+G+T
H=A+C+T
K=T+G
M=A+C
N=A+C+G+T
R=A+G
S=G+C
W=A+T
V=A+C+G
X=kleinere Basen (anderswo angegeben)
Y=C+T
Diese zwei Oligonucleotide ergaben ein 459 bp-PCR-Produkt, das von einem Agarosegel abgetrennt und unter Verwendung des Kits BIO-101 Geneclean gereinigt wurde. Das Fragment wurde sodann in dem PCR2.1-Vektor geklont, indem TOP 10 F'-Zellen als Wirt nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wurden. Es wurde doppelsträngige Plasmid-DNA von E. coli (Top 10 F') unter Verwendung des Kits QIAfilter Plasmid Midi Kit (Qiagen) gereinigt. Zwei andere degenerierte Senseprimer wurden ebenfalls synthetisiert: HAVAF1, 5'-GTN GCT GCT GTW RTX CCW WSX TWT AAY GAR GA-3' (SEQ ID NO:22, entsprechend der Region V⁶⁶AAVIPSYNE (SEQ ID NO:11) von spHAS) und HAVDF1, 5'-GTX RWT GAY GGN WSX WSN RAX GAT GAX GC-3' (SEQ ID NO:23, auf der Grundlage von V¹⁰⁰DDGSSNTD (SEQ ID NO:12) von spHAS). Zwei eindeutige Antisense-Primer wurden auf der Grundlage der Sequenz des 459 bp-PCR-Produktes synthetisiert. Diese waren: D181.2, 5'-GAA GGA CTT GTT CCA GCG GT-3' (SEQ ID NO:13) und D181.4, 5'-TGA ATG TTC CGA CAC AGG GC-3' (SEQ ID NO:14). Jeder der zwei degenerierten Senseprimer wurde sodann entweder mit D181.2 oder D181.4 zum Amplifizieren von D181-genomischer DNA verwendet und lieferte PCR-Produkte mit erwarteter Größe. Die vier PCR-Produkte wurden geklont und unter Anwendung der gleichen Strategie sequenziert, wie sie vorstehend ausgeführt wurde. Für jedes PCR-Produkt wurden Sequenzen von 6 verschiedenen Klonen erhalten und verglichen, um eine Consensus-Sequenz zu erhalten. Damit haben wir eine 1042 bp-Sequenz mit kontinuierlicher ORF mit großer Homologie zu spHAS erhalten.
C.4 Screening einer Genombank
Zum Screenen der Genombank wurden zwei Molekularsonden verwendet, das geklonte 459 bp PCR-Produkt und das Oligonucleotid D181.5 (5'-GCTTGATAGGTCACCAGTGTCACG-3' (SEQ ID NO:15); deriviert von der 1042 by Sequenz). Das 459 bp-PCR-Produkt wurde unter Verwendung des Kits zum Markieren von Random-Primer "Prime-It 11" (Stratagene) nach den Anweisungen der Hersteller radiomarkiert. Die Oligonucleotide wurden mit Hilfe des Kits Kinace-It Kinasing (Stratagene) unter Verwendung von [γ³²P]ATP markiert. Radiomarkierte Produkte wurden von dem nicht markierten Material auf NucTrap-Push-Säulen (Stratagene) abgetrennt. Die Oligoprobe hybridisierte speziell mit einem D181-genomischen Digest auf Southern-Blots. Zum Screenen der λ Phagen-Bank wurde XLBLUE MRF' als ein Wirt (3.000 Plaque/Platte) auf Nitrocellulosemembranen verwendet, die adsorbierte Phagen enthielten und bei 60°C vorhybridisiert und mit 5'-Ende-markiertem Oligonucleotid, D181.5 in einer QuikHyb-Hybridisationssäule (Stratagene) bei 80°C nach den Anweisungen hybridisiert.
Die Membranen wurden anschließend 2 Mal mit SSC-Puffer und 0,1 (Gewicht/Volumen) SDS bei Raumtemperatur für 15 min bei 60°C mit 0,1 × SSC-Puffer und 0,1% SDS (Gewicht/Volumen) für 30 min gewaschen, getrocknet und sodann über Nacht bei -70°C auf dem Bio-Max MS-Film exponiert. Die positiven Plaques wurden erneut auf Platte gezogen und zwei Mal erneut gescreent. Die reinen positiven Phagen wurden mit SM-Puffer gesichert. PCR auf diesen Phagen mit Vektorprimern ergab 3 verschiedene Insertgrößen.
PCR mit einer Kombination von Vektorprimern und Primern von unterschiedlichen Regionen der geklonten 1042 by Sequenz ergab, dass lediglich eines der drei verschiedenen Phagen das komplette HAS-Gen hatte. Die Insertgröße in diesen Phagen betrug 6,5 kb. Versuche, den Insert in die Plasmidform mit Hilfe der Autoexzision aus dem ausgewählten Klon der Phagen schlugen fehl. Daher wurde wiederum auf die reine positive Phagen-DNA eine PCR-Strategie angewandt, um das 5'- und 3'-Ende des ORF zu erhalten. Die Oligonucleotidprimer D181.3 (5'-GCCCTGTGTCGGAACATTCA-3' (SEQ ID NO:16)) und T3 (Vektorprimer) amplifizierten ein 3 kb-Produkt und Oligonucleoide D181.5 und T7 (Vektorprimer) amplifizierten ein 2,5 kb-Produkt. Die 5'- und 3'-Endsequenzen des ORF wurden erhalten, indem diese zwei vorgenannten Produkte sequenziert wurden. Die Analyse sämtlicher Sequenzen des PCR-Produktes ermöglichten uns die Rekonstruktion des ORF des 1254-bp-seHAS-Gens.
C.5 Expressionsklonierung der seHAS
Es wurden an den Regionen des Startcodons und Stopcodons der seHAS Primer aufgebaut, damit diese eine EcoR1-Restriktionsstelle in dem Sense-Oligonucleotid (5'-AGGATCCGAATTCATGAGAACAtTAAAAACCTC-3' (SEQ ID NO:17)) und eine Pst1-Stelle in dem Antisense-Oligonucleotid (5'-AGAATTCTGCAGTTATAATAATTTTTTACGTGT-3' (SEQ ID NO:18)) enthalten. Diese Primer amplifizierten ein 1,2 kb PCR-Produkt von der D181-genomischen DNA sowie aus dem reinen Hybridisations-positiven Phagen. Das 1,2 kb-Produkt wurde mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese gereinigt, mit Pst1 und EcoR1 digeriert und direkt in den Pst1- und EcoR1-digerierten pKK223-Vektor geklont. Der ligierte Vektor wurde in E. coli-SURE-Zellen transformiert, die bei 30°C aufgezogen wurden. Dieser Schritt war von praktischer Bedeutung, da andere Wirtszellen oder höhere Temperaturen zu Löschungen des geklonten Inserts führten. Es wurden Kolonien isoliert und deren pDNA gereinigt. Von 6 Kolonien (bezeichnet als: a, b, c, d, e und f) hatten 5 ein Insert mit korrekter Größe, während eines keinen Insert hatte.
C.6 HA-Synthaseaktivität
Die HA-Synthaseaktivität wurde in Membranen assayiert, die aus den 5 vorgenannten Klonen präpariert wurden. Es wurden frische log-Phasenzellen mit 3.000 g geerntet, bei 4°C mit PBS gewaschen und Membranen mit Hilfe der Modifikation einer Protoplast-Methode isoliert, die der Fachwelt bekannt sind. Die Membranpräparate von Streptococcus pyrogenes und Streptococcus equisimilis wurden ebenfalls durch Modifikation einer anderen Protoplast-Prozedur erhalten. Die Membranen wurden bei 37°C in 50 mM Natrium- und Kaliumphosphat, pH 7,0, mit 20 mM MgCl₂, 1 mM DTE, 120 μM UDP-GlcA und 300 μM UDP-GlcNAc inkubiert. Der Einbau von Zucker wurde unter Verwendung von UDP-[¹⁴C]GlcA (318 mCi/mM; ICN) und/oder UDP-[³H]GlcNAc (29,2 Ci/mM NEN) überwacht. Die Reaktionen wurden durch Zusatz von SDS zu einer Endkonzentration von 2% (Gewicht/Volumen) abgebrochen. Das Produkt HA wurde von den Präkursoren mit Hilfe der absteigenden Papierchromatographie separiert und durch Bestimmung der eingebauten Radioaktivität im Ursprung gemessen.
C.7 Gelfiltrationsanalyse
Die in vitro mit Hilfe der rekombinanten seHAS oder phHAS enthaltenden Membranen erzeugte radiomarkierte HA wurde mit Hilfe der Chromatographie auf einer Säule (0,9 × 40 cm) von Sephacryl S500 HR (Pharmacia Biotech Inc.) analysiert. Es wurden Proben (0,4 ml in 200 mM NaCl, 5 mM Tris-HCl, pH 8,0, plus 0,5% SDS) mit 200 mM, NaCl, 5 mM Tris-HCl und pH 8,0 eluiert und 0,5 ml Fraktionen auf ¹⁴C- und/oder ³H-Radioaktivität untersucht. Die Authentizität des HA-Polysaccharids wurde durch Behandlung einer separaten identischen Probe mit der HA-spezifischen Hyaluronatlyase von Streptomyces hyalurolyticus (EC 4.2.2.1) bei 37°C für 3 Stunden bewertet. Das digerierte Gemisch wurde sodann einer Gelfiltration unterzogen.
C.8 SDS-PAGE und Western-Blotting
Es wurde nach der Methode von Laemmli eine SDS-PAGE ausgeführt. Die Elektronentransfers auf Nitrocellulose wurden im Standard-Blotting-Puffer mit 20% Methanol unter Verwendung einer Mini-Transblot-Vorrichtung von Bio-Rad vorgenommen. Die Blots wurden mit 2% BSA in TBS geblockt. Zum Nachweis wurde Protein A/G-alkalische Phosphatase als Konjugat (Pierce) und p-Nitroblau-Tetrazolium/5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat-p-toluidin-Salz verwendet.
C.9 DNA-Sequenz und Analyse
Es wurden auf beiden Strängen unter Verwendung von Fluoreszensmarkierten Vektorprimern Plasmide sequenziert. Die Sequenzierungsreaktionen wurden unter Verwendung eines Kits "Thermosequenase^TM" für fluoreszente, markierte Primer (mit 7-deazaG) ausgeführt. Es wurden Proben auf einem ALF Express-DNA-Sequenzer von Pharmacia einer Elektrophorese unterworfen und die Daten mit Hilfe der ALF Manager Software v3.02 analysiert. Die inneren Regionen der Inserte wurden mit internen Primern unter Verwendung des ABI Prism 377 (Software-Version 2.1.1) sequenziert. Uneindeutige Bereiche wurden manuell unter Verwendung von Sequenase^TM-7-deaza-DNA-Polymerase, 7-deaza-GTP-Mastermischung (USB) und [α-³⁵S] dATP (Amersham Life Sciences) sequenziert. Die erhaltenen Sequenzen wurden unter Verwendung von DNASIS, v2.1 (Hitachi Software Engineering Co., Ltd.) kompiliert und analysiert. Die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen wurden mit anderen Sequenzen in der Genbank und anderen Datenbasen verglichen.
C.10 Identifikation von seHAS
Die Identifikation von seHAS wurde unter Anwendung eines PCR-Vorgehens mit Oligonucleotidprimern auf Basis mehrerer Regionen hoher Dichte unter spHAS, DG42 (jetzt bekanntermaßen als entwicklungsregulierte X. laevis HAS und bezeichnet als x1HAS) und NodC (eine Rhizobium β-GlcNAc-Transferase) erreicht. Die x1HAS- und NodC-Proteine sind zu etwa 50% bzw. etwa 10% mit spHAS identisch. Diese Strategie lieferte ein 459 bp-PCR-Produkt, dessen Sequenz zu 66,4% mit spHAS identisch war, was zeigt, dass ein Gruppe C-Homolog (seHAS) der Gruppe A (spHAS)-HA-Synthasegen identifiziert worden war. Die komplette Kodierungsregion des Gens wurde sodann unter Anwendung einer ähnlichen, auf PCR basierenden Strategie rekonstruiert. Der fertige Satz von PCR-Primern wurde dann verwendet, um komplettes ORF aus genomischer DNA zu amplifizieren. Wenn dieses 1,2 kb PCR-Fragment in den Expressionsvektor pKK223 eingebaut und in E. coli SURE-Zellen transformiert wurde, wurde in den isolierten Membranen von 5 der 5 getesteten Kolonien HA-Syntheseaktivität nachgewiesen.
Das ORF des rekonstruierten Gens codiert ein neuartiges vorhergesagtes Protein aus 417 Aminosäuren, das sich nicht in der Datenbasis befand und das um 2 Aminosäuren kürzer ist als spHAS. Die zwei Bakterienproteine sind zu 72% identisch und die Nucleinsäuresequenzen sind zu 70% identisch. Die vorhergesagte Molmasse des seHAS-Proteins beträgt 47.778 und der vorhergesagte isoelektrische Punkt liegt bei pH 9,1. Die drei neuerlich identifizierten Säuger-HAS's (muHAS1, muHAS2, muHAS3, 2) sind den Bakterienproteinen ähnlich. Die Gesamtidentität zwischen den zwei Gruppen beträgt etwa 28 bis 31% und darüber hinaus sind viele der Aminosäuren in seHAS mit denen der eukaryotischen HAS's (z.B. K/R- oder D/E-Substitutionen) konservativ. A98R, die PBCY-1-HAS, ist zu 28 bis 33% identisch mit den Säuger-HAS und soll, wie vorhergesagt wird, in der Lipidmembran eine ähnliche Topologie haben.
Innerhalb der Säugerspezies sind die gleichen Vertreter einer Familie zumeist vollständig identisch (z.B. muHAS1 und huHAS1 sind zu 95% identisch; muHAS2 und huHAS2 sind zu 98% identisch). Wie jedoch in 3 gezeigt ist, sind sogar innerhalb der gleichen Spezies die unterschiedlichen Vertreter der HAS-Familie stärker divergent (z.B. muHAS1 und muHAS2 sind zu 53% identisch; muHAS1 und muHAS3 sind 57% identisch; muHAS2 und muHAS3 sind zu 71% identisch).
10 zeigt Hydropathie-Diagramme für die Topologie der seHAS und der vorhergesagten Membran. Die Hydrophilie-Diagramme für die Streptococcen-Gruppe C HAS wurde mit Hilfe der Methode nach Kyte und Doolittle (J. Mol. Bio. 157, 105, 1982) unter Anwendung von DNAsis erzeugt. Von dem Protein wird vorhergesagt, dass es ein integrales Membranprotein ist.
11 zeigt ein Modell für die topologische Organisation von seHAS in der Membran. Die vorgeschlagene Topologie für das Protein entspricht der "Charge-in"-Regel und setzt die große Zentraldomäne nach innen. Diese Domäne enthält wahrscheinlich die meisten Funktionen der Substratbindung und katalytischen Funktionen des Systems. In der zentralen Domäne sind Cys²²⁶ in seHAS, das in allen Vertretern der HAS-Familie konservativ ist, sowie die anderen drei Cysteine, gezeigt. Der entscheidende Rest ist Cys²⁸¹, dessen Veränderung die Größenverteilung des durch das Enzym synthetisierten HA-Produktes dramatisch verändern kann.
Die für die seHAS vorhergesagte Membran-Gesamttopologie ist identisch derjenigen von spHAS und den eukaryotischen HAS's, soweit diese veröffentlicht wurden. Das Protein besitzt 2 vermutliche Transmembrandomänen an dem Aminoterminus und den 2 bis 3 membranassoziierten oder Transmembrandomänen am Carboxylende. Die Hydropathie-Diagramme für die zwei Streptokokkenenzyme sind nahezu identisch und veranschaulichen die Schwierigkeit der Vorhersage der Topologie des extrem hydrophoben Bereichs von etwa 90 Resten bei K³¹³-R⁴⁰⁶ in seHAS (K³¹³-K⁴⁰⁵ in spHAS).
In E. coli-Zellen wurde seHAS wirksam exprimiert. Ungefähr 10% des Membran-Gesamtproteins war nach der Bewertung mit Hilfe des Anfärbens von SDS-PAGE-Gels (5) seHAS. Das hervorstechende seHAS-Band bei 42 kD fehlt in der Kontrollspur mit nur einem Vektor vollständig. Dieses ungewöhnlich hohe Maß der Expression für ein Membranprotein wird auch bei spHAS angetroffen, wenn man den gleichen Vektor in SURE-Zellen verwendet. In E. coli-SURE-Zellen sind etwa 8% des Membranproteins spHAS. Im Gegensatz dazu beträgt die Menge von seHAS in Gruppe C-Membranen nicht mehr als 1% des Membrangesamtproteins. Die spHAS in Gruppe A-Membranen ist kaum nachweisbar. Die in E. coli-SURE-Zellen exprimierte rekombinante seHAS synthetisiert keine HA in vivo, da diesen Zellen UDP-GlcA fehlt, bei der es sich um eines der erforderlichen Substrate handelt. Membranen allerdings, denen das rekombinante seHAS-Protein fehlt, synthetisieren HA, wenn sie mit den Substraten UDP-GlcNAc und UDP-GlcA (12) ausgestattet ist.
12 zeigt die Synthese von authentischer HA durch rekombinante seHAS. Die aus Zellen präparierten E. coli-Membranen (69 μg), die rekombinante seHAS oder Vektor allein enthielten, wurden für 1 Stunde bei 37°C mit 700 μM UDP-[³H]GlcNAC (2,78 ×10² dpm/nM;⧠,
und 300 μM UDP-[¹⁴C]GlcA (3,83 × 10³ dpm/nM; o, ⦁) in einem Endvolumen von 200 μl entsprechend der Beschreibung hierin inkubiert. Die Enzymreaktion wurde durch Zugabe von EDTA zu einer Endkonzentration von 25 mM angehalten. Die Hälfte des Reaktionsgemisches wurde mit Streptomyces-Hyaluronidase bei 37°C für 3 Stunden ehandelt. Den mit Hyaluronidase behandelten (o, ⧠) und unbehandelten (⦁,
Proben wurde SDS (2%, Gewicht/Volumen) zugesetzt, die dann für 1 min bei 90°C erhitzt wurden. Die Proben wurden mit Säulenpuffer (5 mM Tris, 0,2 M NaCl, pH 8,0) bis 500 μl verdünnt, durch Zentrifugation geklärt und 200 μl auf eine Sephacryl S-500-HR-Säule gespritzt. Es wurden Fraktionen (1 ml) aufgenommen und die Radioaktivität bestimmt. BD ist die Peak-Position der Elution von Blau-Dextran (etwa 2 × 10⁶ DA; Pharmacia). V₀ kennzeichnet das ausgeschlossene Volumen und V_i das eingeschlossene Volumen. Das Verhältnis von [¹⁴C]GlcA:[³H]GlcNAc, das in die Gesamtmenge der HA, die auf der Säule fraktioniert wurde, eingebaut wurde, betrug 1,4, was identisch mit dem Verhältnis der spezifischen Aktivitäten der zwei Substrate ist. Damit betrugen die Molverhältnisse der in das Produkt eingebauten Zucker 1:1 entsprechend der Vorhersage für authentische HA. Die Membranen von Zellen, die mit Vektor allein transformiert wurden, synthetisierten kein HA.
Unter Verwendung von 120 μM UDP-GlcA und 300 μM UDP-GlcNAc verlief die HA-Synthese linear mit dem Membranprotein (bei ≤ 0,2 μg) und über mindestens 1 Stunde. Ebenfalls hatten Membranen, die aus nicht transformierten Zellen oder aus Zellen hergestellt wurden, die mit Vektor allein transformiert wurden, keine nachweisbare HAS-Aktivität. Die HA-Synthese ist vernachlässigbar, wenn Mg⁺² mit EDTA komplexiert wird (< 5% der Kontrolle) oder wenn beide der zwei Substrate weggelassen werden (etwa 2% der Kontrolle). Rekombinante seHAS zeigte außerdem die erwartete Spezifität auf Zuckernucleotidsubstrate und ist unfähig entweder mit UDP-Ga1A, UDP-Glc oder UDP-GalNAc mit einem der zwei normalen Substrate zu copolymerisieren (Tabelle II).
Auf der Basis der Analyse mit Hilfe der Gelfiltration betrug die mittlere Masse der durch seHAS in isolierten Membranen synthetisierten HA (5 bis 10) × 10⁶ Da. Das Produkt der rekombinanten seHAS wurde als authentische HA auf der Basis eines äquimolaren Einbaus von beiden Zuckern und seiner Empfindlichkeit gegenüber dem Abbau durch die spezielle Streptomyces-Hyaluronidase (12) bewertet. Obgleich die Bedingungen für die Gesamt-HA-Synthese nicht optimal waren (da etwa 90% des einen Substrats in das Produkt eingebaut waren), erzeugte das Enzym eine breite Verteilung von HA-Kettenlängen. Die Peak-Fraktion entspricht einer HA-Masse von 7,5 × 10⁶ Da, die ein Polymer ist, das näherungsweise 36.000 monomere Zucker enthält. Die Verteilung der HA-Größen, die auf dieser Säule aufgelöst wurde, lag im Bereich von (2 bis 20) × 10⁶ Da.
Die deduzierte Proteinsequenz von seHAS wurde anhand der Fähigkeit der Antikörper zu dem spHAS-Protein zum Vernetzen mit dem Protein der Gruppe C (8) bestätigt. Polyklonale Antikörper zu dem spHAS-Gesamtprotein oder nur zu der zentralen Domäne von spHAS reagierten mit dem seHAS-Protein. Antipeptid-Antikörper zu dem C-Terminus von spHAS zeigte keine Kreuzreaktion mit diesem etwas divergenten Bereich in dem seHAS-Protein. Allerdings erkannte Antipeptid-Antikörper, der gegen die spHAS-Sequenz E¹⁴⁷-T¹⁶¹ gerichtet ist, die gleiche vorhergesagte Sequenz in seHAS. Der Antipeptid-Antikörper reagiert auch mit den nativen seHAS- und sp-HAS-Proteinen in Streptokokkenmembranen und bestätigt, dass native und rekombinante Enzyme von beiden Spezies von identischer Größe sind. Wie das spHAS-Protein migriert das seHAS anomal schnell auf SDS-PAGE. Obgleich die berechnete Masse 47.778 Da beträgt ist die M_r anhand der SDS-PAGE übereinstimmend mit etwa 42 kDa.
Aufgrund der Sequenzidentität im Inneren ihrer zentralen Domänenbereiche und der insgesamt identischen Struktur, die für die zwei Bakterienenzyme vorhergesagt wird, können der peptidspezifische Antikörper gegen die Region E¹⁴⁷-T¹⁶¹ verwendet werden, um auf HAS-Proteinexpression in Membranen zu normieren, die aus Zellen hergestellt sind, die mit Genen für die zwei verschiedenen Enzyme transformiert sind. Unter Anwendung dieser Vorgehensweise wurden Membranen mit weitgehend identischen Mengen an rekombinanter spHAS oder seHAS im Bezug auf die Anfangsgeschwindigkeit der HA-Synthese und der Verteilung der HA-Produktgröße verglichen.
Wie für spHAS gezeigt wurde, ist die Synthese von HA-Ketten durch seHAS progressiv. Die Enzyme scheinen mit einer wachsenden HA-Kette assoziiert zu bleiben, bis sie als ein Endprodukt freigesetzt sind. Daher ist es möglich, die Geschwindigkeiten der HA-Verlängerung mit Hilfe von seHAS und spHAS durch Beobachtung der Größenverteilung von HA-Ketten zu vergleichen, die zu frühen Zeitpunkten während der ersten Runde der HA-Kettensynthese erzeugt werden: Auf der Grundlage einer Gelfiltrationsanalyse der HA-Produktgrößen zu verschiedenen Zeiten haben wir geschätzt, dass die mittlere Geschwindigkeit der Verlängerung durch seHAS etwa 9.000 Monosaccharide/min bei 37°C beträgt (9). In 5 min kann das Enzym eine HA-Kette von (5 bis 10) × 10⁶ Da polymerisieren. Während einer Inkubation von 60 min kann daher jedes Enzymmolekül potentiell in der Größenordnung von 5 bis 8 solche großen HA-Moleküle initiieren, fertigstellen und freisetzen. Zu den frühen Zeitpunkten (z.B. ≤ 1 min), die die Verlängerung der ersten HA-Ketten repräsentieren, wurde die Größenverteilung der HA, die durch seHAS erzeugt wurde, im Vergleich zu spHAS zu größeren Spezies verschoben. Nach 60 min waren die zwei Verteilungen der HA-Produktgrößen nicht unterscheidbar.
Die geklonte seHAS repräsentiert die authentische Gruppe C HA-Synthase. Die früher veröffentlichten oder offenbarten "Gruppe C"-Proteine sind daher nicht die wahre Gruppe C-HAS. Das seHAS-Protein ist homolog zu neun gegenwärtig bekannten HA-Synthasen von Bakterien, Vertebraten und einem Virus, die jetzt eine rasch wachsende Familie der HA-Synthese umfassen. Diese Homologie ist speziell in 2 gezeigt. Bei den Säugern sind drei Gene, bezeichnet als HAS1, HAS2 und HAS3, identifiziert und zu den drei verschiedenen Chromosomen sowohl im Menschen als auch in der Maus kartiert worden. Bei den Amphibien ist das einzige HAS-Protein, das bisher identifiziert wurde, das entwicklungsregulierte DG42, das 1988 geklont wurde und dem erst in neuerer Zeit gezeigt wurde, dass es die HA-Synthaseaktivität codiert, und zwar mit Hilfe der Analyse von rekombinantem Protein in Hefemembranen. Wahrscheinlich werden alsbald weitere X. laevus-HAS-Gene identifiziert werden.
Ein divergentes Evolutionsmodell legt nahe, dass ein primitiver bakterieller HAS-Präkursor in der anfänglichen Vertebratenentwicklung usurpiert worden ist, oder die bakteriell-pathogene Strategie der Erzeugung einer HA-Kapsel entwickelt wurde, als ein primitives Bakterium in einer ursprünglichen HAS gefangen wurde. Eine konvergente Evolution bakterieller und eukaryotischer HAS-Enzyme zu einer gemeinsamen strukturellen Lösung erscheint unwahrscheinlich, kann es aber gegeben haben.
Keines der drei Säuger-Isozyme für HAS ist bis jetzt enzymatisch im Bezug auf deren HA-Produktgröße charakterisiert worden. Von mindestens 10 identifizierten HAS-Proteinen ist vorhergesagt worden, dass sie Membranproteine mit einer ähnlichen Topologie sind. Die HA-Synthese erfolgt an der Plasmamembran und die HA wird entweder in das Medium ausgeschüttet oder bleibt zellassoziiert, um die Bakterienkapsel oder einen eukaryotischen, perizellulären Überzug zu bilden. Die Zuckernucleotidsubstrate in dem Zytoplasma werden zum Zusammenfügen von HA-Ketten genutzt, die durch die Membran hindurch in den äußeren Raum gestoßen werden.
Die Proteintopologie in dem stark hydrophoben Carboxylabschnitt des HAS-Proteins scheint für das Verständnis wichtig zu sein, wie die Enzyme das Wachstum der HA-Kette ausdehnen, wenn sie gleichzeitig durch die Membran gestoßen wird. So kann die beispiellose enzymatische Aktivität ungewöhnliche und komplexe Wechselwirkungen des Proteins mit der Lipid-Doppelschicht erfordern. Vorläufige Ergebnisse auf der Basis der Analyse von spHAS-alkalischer Phosphatase-Fusionsproteine zeigen, dass die Aminosäure- und Carboxyl-Enden und die großen Zentraldomänen alle intrazellulär sind, wie in 10 und 11 gezeigt wird. Das seHAS-Protein enthält außerdem eine große Zentraldomäne (etwa 63% des Gesamtproteins), die die zwei Substrat-bindenden Stellen und die zwei Glykosyltransferaseaktivitäten zu enthalten scheint, die für die HA-Synthese erforderlich sind. Obgleich mit den gegenwärtigen Software-Programmen nicht zuverlässig die Zahl oder die Beschaffenheit von membranassoziierten Domänen im Inneren der langen, C-terminalen, hydrophoben Strecke vorhergesagt werden können, steht die vorgeschlagene topologische Anordnung in Übereinstimmung mit dem gegenwärtigen Beweis und gilt genausogut für die eukaryotischen Enzyme, die um etwa 40% größer sind, was auf die Verlängerung des C-terminalen Endes des Proteins mit zwei zusätzlichen vorhergesagten Transmembrandomänen zurückzuführen ist.
Vier der sechs Cys-Reste in spHAS sind mit seHAS konservativ. Lediglich Cys225 ist in beiden bakteriellen Enzymen konservativ in allen Vertretern der HAS-Familie. Da Sulfhydryl-reaktive Mittel, wie beispielsweise p-Mercurobenzoat oder NEM die HAS-Aktivität stark hemmen, ist es wahrscheinlich, dass diese konservative Cys für die Enzymaktivität erforderlich oder von Bedeutung ist. Erste Ergebnisse von Untersuchungen der ortsspezifischen Mutagenese zeigen jedoch, dass ein C225S-Mutant von spHAS nicht inaktiv ist, es bewahrt 5 bis 10% von der Wildtyp-Aktivität.
Die Erkennung von Nucleinsäuresequenzen, die lediglich seHAS, lediglich spHAS oder sowohl seHAS als auch spHAS unter Verwendung spezifischer Oligonucleotide codieren, ist in 13 gezeigt. Auf der Basis von SEQ ID NO:1 und der Codierungssequenz spHAS wurden drei Paare von Sense/Antisense-Oligonucleotiden aufgebaut. Die auf seHAS basierenden Nucleinsäuresegmente (se1-se2 und sesp1-sesp2) sind in 14 gezeigt. Diese drei Oligonucleotidpaare wurden unter typischen PCR-Reaktionen mit genomischer DNA entweder aus der Gruppe C (seHAS) (Spuren 2, 4 und 6) oder Gruppe A (spHAS) (Spuren 3, 5 und 7)-Streptokokken hybridisiert. Die Spuren 1 und 8 zeigen die Stellen von MW-Standards in kb (Kilobasen). Die PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung von Taq DNA-Polymerase (von Promega) für 25 Zyklen wie folgt ausgeführt: 94°C für 1 min, um eine DNA-Denaturierung zu erreichen; 48°C (42°C für die kleineren gemeinsamen se-sp-Primer) für 1 min, um eine Hybridisierung zu ermöglichen; und 72°C für 1,5 min für die DNA-Synthese. Die PCR-Reaktionsmischungen wurden sodann mit Hilfe der Elektrophorese auf einem 1%-Agarosegel separiert.
Das se1-se2-Primerpaar wurde so konzipiert, dass es eindeutig spezifisch auf die Gruppe C-HAS (seHAS) ist. Das sp1-sp2-Primerpaar wurde so konzipiert, dass es eindeutig spezifisch auf die Gruppe A-HAS (spHAS) ist. Das sesp1-sesp2-Primerpaar wurde so konzipiert, dass es sowohl die Gruppe A- als auch Gruppe C-HAS-Nucleinsäuresequenzen hybridisiert. Alle drei Primerpaare verhielten sich wie erwartet, was die entsprechende Fähigkeit zum Kreuzhybridisieren und zum Stützen der Generation der PCR-Produkte zeigt, die spezifisch und/oder eindeutig waren.
Die für die spezifische PCR oder Hybridisierung verwendeten Oligonucleotide sind in 14 gezeigt. Die synthetischen Oligonucleotide von SEQ ID NOS:3, 4, 5 und 6 sind in den entsprechenden Regionen der SEQ ID NO:1 angegeben. Diese Regionen sind in Fettdruck bzw. markiert als die Primer se1, se2, sesp1 und sesp2 ausgeführt. Das #1 zeigt Primer in der Sense-Richtung, während das #2 einen Primer in der Antisense-Richtung zeigt. Jedes der vier Oligonucleotide wird spezifisch mit der seHAS-Sequenz hybridisiert und die entsprechenden Paare von Sense/Antisense-Primern sind zur Verwendung in der Polymerase-Kettenreaktion entsprechend der Darstellung in 13 geeignet.
7 zeigt eine Gelfiltrationsanalyse von Hyaluronsäure, die durch rekombinante HAS synthetisiert wird, die in Hefemembranen exprimiert ist. Es wurde ein DNA-Fragment, das das Translationsraster von 419 Aminosäure-Resten entsprechend der spHAS codiert (mit dem ursprünglichen Val-Codon umgeschaltet zu Met) mit Hilfe von Standardmethoden in dem pYES2-Hefeexpressionsvektor (von Invitrogen) unter Erzeugung von pYES/HA subkloniert. Membranen aus Zellen mit diesem Konstrukt wurden durch Bewegung mit Glasperlen hergestellt. Die von pYES/HA-Konstrukten abgeleiteten Proben enthielten erhebliche HA-Synthaseaktivität und es wurde das "42 kDa"-HAS-Protein mit Hilfe der Westernanalyse unter Verwendung spezifischer Antikörper nachgewiesen; wobei Membranen von Zellen mit Vektor allein weder über Aktivität verfügten noch über das immunreaktive Band (nicht gezeigt). Es wurden zuerst Membranen (315 μg Protein) mit trägerfreiem UDP-[¹⁴C]GlcA (1 μCi¹⁴C) und 900 μM unmarkierter UDP-GlcNAc in 50 mM Tris, pH 7,20 mM MgCl₂, 1 mM DTT und 0,05 M NaCl (450 μl Reaktionsvolumen) bei 30°C für 1,5 min inkubiert. Nach dieser Impuls-Markierungsperiode wurde sodann nicht radiomarkiertes UDP-GlcA zu Endkonzentrationen von 900 μM zugegeben. Nach einer Impulsdauer von 1,5 min (dunkler Kreis) wurden Proben (100 μl) und nach 15 min (schwarzes Quadrat) sowie 45 min (schwarzes Dreieck) nach dem "Chase" genommen. Die Reaktionen wurden durch den Zusatz von SDS bis 2% und Erhitzen bei 95°C für 1 min abgebrochen. Die Proben wurden mit Hilfe der Zentrifugation (10.000 g, 5 min) vor dem Aufspritzen der Hälfte der Probe auf die Sephacryl S-500HR-Gelfiltrationssäule (Pharmacia, 1 × 50 cm), equilibriert mit 0,2 M NaCl, 5 mM Tris, pH 8, geklärt.
Die Säule wurde mit 0,5 ml/min eluiert und die Radioaktivität in den Fraktionen (1 ml) quantitativ mit Hilfe der Flüssigszintillationszählung nach Zusatz eines BioSafell-Cocktails (4,5 ml, Research Products Intl.) gemessen. Das Hohlvolumen und das eingeschlossene Gesamtvolumen betrugen bei den Elutionsvolumina 14 ml bzw. 35,5 ml. Das Peak von Blau-Dextran (mittel 2 × 10⁶ Da) eluierte bei 25 bis 27 ml. Die rekombinante HAS, die in den eukaryotischen Hefezellen exprimiert war, erzeugte hochmolekulare Hyaluronsäure in vitro.
Damit sollte offensichtlich sein, dass gemäß der vorliegenden Erfindung ein gereinigtes Nucleinsäuresegment gewährt wird, das über eine Codierungssequenz verfügt, die enzymatisch aktive HAS codiert; das Verfahren zum Erzeugen von Hyaluronsäure aus dem seHAS-Gen gewährt wird sowie die Verwendung von Hyaluronsäure, die aus durch das seHAS-Gen codierter HAS erzeugt wird, die den Aufgaben und Vorteilen, wie sie vorstehend ausgeführt wurden, voll genügen. Obgleich die Erfindung in Verbindung mit speziellen Ausführungsformen davon beschrieben worden ist, gilt als selbstverständlich, dass zahlreiche Alternativen, Modifikationen und Variationen für den Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sind. Dementsprechend sollen alle diese Alternativen, Modifikationen und Variationen als einbezogen gelten, die in den breiten Schutzbereich der beigefügten Ansprüche fallen.
LISTE DER SEQUENZEN

Claims

Isolierte, enzymatisch aktive Hyaluronansynthase, die von einer Nucleinsäuresequenz kodiert ist, die über eine Identität von mindestens 80% mit SEQ ID No:1 verfügt.
Isolierte, enzymatisch aktive Hyaluronansynthase nach Anspruch 1, die von einer Nucleinsäuresequenz kodiert ist, die über eine Identität zwischen 80% und 90% mit SEQ ID No:1 verfügt.
Isolierte, enzymatisch aktive Hyaluronansynthase nach Anspruch 1, die von einer Nucleinsäuresequenz kodiert ist, die über eine Identität zwischen 90% und 99% mit SEQ ID No:1 verfügt.
Isolierte, enzymatisch aktive Hyaluronansynthase nach Anspruch 1, welche die Nucleinsäuresequenz SEQ ID No:2 aufweist.
Isolierte, enzymatisch aktive Hyaluronansynthase nach Anspruch 1, die aus der Nucleinsäuresequenz SEQ ID No:2 besteht.
Isolierte, enzymatisch aktive Hyaluronansynthase nach einem der Ansprüche 1 bis 5, die ein Streptococcus-Polypeptid ist.
Isolierte, enzymatisch aktive Hyaluronansynthase nach einem der Ansprüche 1 bis 6, die ein Streptococcus equisimilis-Polypeptid ist.
Isoliertes Nucleinsäuresegment, das die enzymatisch aktive Hyaluronansynthase nach einem der Ansprüche 1 bis 7 codiert.
Nucleinsäuresegment nach Anspruch 8, welches die Sequenz von SEQ ID No:1 hat.
Rekombinanter Vektor, aufweisend das Nucleinsäuresegment nach Anspruch 8 oder 9, wobei der rekombinanter Vektor ein Plasmid ist.
Rekombinanter Vektor, aufweisend das Nucleinsäuresegment nach Anspruch 8 oder 9, wobei der rekombinanter Vektor ein replizierendes oder Integrationsplasmid, Cosmid, ein Phage oder ein Virusvektor ist.
Rekombinante Wirtszelle, aufweisend den rekombinanten Vektor nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Wirtszelle Hyaluronsäure erzeugt.
Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 12, ferner aufweisend mindestens ein Präkursor-Gen, das im Biosynthese-Stoffwechselweg der Hyaluronsäure angetroffen wird.
Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 12 oder 13, worin die Wirtszelle ein Bacillus-, E. coli-, Lactococcus-, Streptococcus- oder Enterococcus-Wirt ist.
Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 12 oder 13, worin die Wirtszelle Bacillus subtilis ist.
Verfahren zum Herstellen eines Hyaluronsäure-Polymers, umfassend: (a) Aufziehen einer rekombinanten Wirtszelle nach einem der Ansprüche 12 bis 15 in einem Medium, um Hyaluronsäure abzuscheiden; und (b) Gewinnen der Hyaluronsäure.
Verfahren nach Anspruch 16, worin der Schritt der Gewinnung der Hyaluronsäure ferner den Schritt des Extahierens der abgeschiedenen Hyaluronsäure von dem Medium umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17, ferner umfassend den Schritt des Reinigens der Hyaluronsäure.