DE69828665T2

DE69828665T2 - Verfahren zur Herstellung von vernetztem Material auf Kollagenbasis und daraus hergestellte bioprothetische Vorrichtungen

Info

Publication number: DE69828665T2
Application number: DE69828665T
Authority: DE
Inventors: Marc Hendriks; Michel Verhoeven; Patrick T. Cahalan; Raymond Zeeman; Piet J. Dijkstra; Jan Feijen
Original assignee: Medtronic Inc
Current assignee: Medtronic Inc
Priority date: 1997-08-18
Filing date: 1998-08-18
Publication date: 2006-01-12
Anticipated expiration: 2018-08-19
Also published as: EP0898973B1; EP0898973A3; DE69828665D1; EP0898973A2; US6117979A

Description

Prothetische Implantate, die aus natürlichen oder synthetischen Materialien hergestellt werden, umfassen beispielsweise Herzklappen, vaskuläre Transplantate, Harnblaseprothesen und Sehnenprothesen. Bioprothesen (d.h. Prothesen, die von natürlichem Gewebe stammen) werden typischerweise gegenüber synthetischen oder mechanischen Prothesen bevorzugt. Beispielsweise werden Naturgewebeklappen gegenüber mechanischen Klappen bevorzugt, weil Gewebeklappen den natürlichen Fluss des Blutes besser als mechanische Klappen stimulieren. Auch sind bei Verwendung von Naturgewebeklappen keine Blutantikoagulantien nötig.
Herzklappen-Prothesen aus Gewebe werden typischerweise aus Schweine-Aortenklappen oder Rinder-Pericard gemacht. Solche Klappen werden typischerweise durch Vorbehandlung des Gewebes mit Glutaraldehyd oder einer anderen Crosslinking-Substanz und der Vernähung des Gewebes in eine flexible metallische Legierung oder einen polymeren Stent hergestellt. Solche tierischen Geweben bestehen hauptsächlich aus Kollagen und Elastin. Diese Komponente versorgen das Geweben, insbesondere Herzklappen, mit der notwendigen mechanischen Stärke und Flexibilität.
Kollagen-basierte Materialien, eingeschlossen das gesamte Gewebe, finden verstärkt Gebrauch bei der Herstellung biomedizinischer Vorrichtungen, wie prothetische Implantate.
Dies trifft besonders für Herzklappen zu. Kollagen ist ein natürlich vorkommendes Protein, das eine gute Biokompatibilität hat. Es ist die wesentliche strukturelle Komponente von Wirbeltieren, die extrazellulare Fasern oder Netzwerke in praktisch allen Geweben des Körpers bildet, einschließlich Haut, Knochen, Knorpel und Blutgefäße. In medizinischen Vorrichtungen bietet Kollagen eine eher physiologische, isotropische Umgebung, für die gezeigt wurde, dass sie das Wachstum und die Funktion verschiedener Zelltypen fördert, was das schnelle Überwachsen von Wirtsgeweben nach der Implantation erleichtert.
Im wesentlichen können drei Typen Kollagen-basierter Materialien identifiziert werden. Diese basieren auf den Unterschieden in Reinheit und Integrität des Kollagenfaserbündelnetzwerks, das anfänglich im Material vorhanden ist. Der erste Typ umfasst das gesamte Gewebe eingeschlossen nicht-kollagene Substanzen oder Zellen. Als Ergebnis der Verwendung des ganzen Gewebes wurde die natürlich vorkommende Zusammensetzung und die ursprüngliche Stärke und Struktur des Kollagenfaserbündelnetzwerkes erhalten. Fremdtransplantate aus ganzem Gewebe wurden für die Entwicklung von Herzklappenprothesen und auch für vaskuläre Prothesen verwendet. Jedoch kann das Vorliegen von löslichen Proteinen, Glykoproteinen, Glykosaminoglykanen und zellulären Komponenten in solchen Fremdimplantaten aus ganzem Gewebe eine immunologische Antwort des Wirtsorganismus auf das Implantat auslösen.
Der zweiten Typ von Kollagen-basierten Materialien umfasst nur die Kollagenmatrix ohne die nicht-kollagenen Substanzen. Die natürlich vorkommende Struktur des Kollagenfaserbündelnetzwerkes ist auf diese Weise erhalten, aber die Antigenität des Materials ist reduziert. Das fibröse Kollagenmaterial, das durch die Entfernung der antigenen nicht- kollagenen Substanzen erhalten wird, wird im allgemeinen geeignete mechanische Eigenschaften haben.
Der dritten Typ von Kollagen-basiertem Material ist gereinigtes fibröses Kollagen. Gereinigtes Kollagen wird aus ganzem Gewebe gewonnen, über zunächst Auflösen oder in Lösung bringen des ganzen Gewebes durch entweder mechanische oder enzymatische Einwirkung. Die Kollagendispersion oder – lösung wird dann entweder durch Lufttrocknung, Lyophilisierung oder Ausfällen des Kollagens rekonstituiert. Eine Vielfalt geometrischer Formen wie Blätter, Röhrchen, Schwämme oder Fasern kann auf diese Weise aus dem Kollagen erhalten werden. Jedoch hat das resultierende Material nicht die mechanische Stärke der natürlich vorkommenden Faserkollagenstruktur.
Ein Hauptproblem bei der Verwendung von Kollagen-basierten Materialien bei Implantationen, und besonders bei Fremdtransplantaten aus ganzem Gewebe, bei dem Spender und Empfänger phylogenetisch voneinander entfernt sind, ist, dass diese Materialien zur hyperakuten Abstoßung neigen. Dies ist eine schnelle und brutale Abstoßungsreaktion, die zu der Zerstörung des Fremdtransplantats führt. Die hyperakute Abstoßung scheint durch Komponente der natürlichen Immunität ausgelöst zu werden, vor allem natürliche Antikörper und Komplementsystem.
Um die Kollagen-basierten Materialien für die Herstellung medizinischer Vorrichtungen, insbesondere bioprothetische Implantate, verwenden zu können, müssen deren Haltbarkeit und in-vivo Leistung typischerweise verbessert werden. Dies kann durch Crosslinking (Vernetzung) des Materials erreicht werden. Das Crosslinking der Kollagen-basierten Materialien wird für die Unterdrückung der Antigenität des Materials verwendet, um so die hyperakute Abstoßungsreaktion zu ver meiden. Zusätzlich wird das Crosslinking verwendet, um die mechanischen Eigenschaften zu verbessern und die Resistenz gegen Abbau zu erhöhen.
Das Crosslinking kann mittels physikalischer Methoden durchgeführt werden, einschließlich beispielsweise W-Strahlung und dehydrothermale Vernetzung. Diese Methoden führen zu einem direkten aber meist niedrig dichten Crosslinking. Mehrere chemische Crosslinking-Methoden für Kollagen-basierte Materialien sind bekannt. Diese Methoden umfassen die Reaktion eines bifunktionalen Reagens mit den Amingruppen von Lysin- oder Hydroxylysinresten auf unterschiedlichen Polypeptidketten oder die Aktivierung von Carboxylgruppen von Glutamin- und Asparaginsäureresten gefolgt von der Reaktion einer Amingruppe einer anderen Polypeptidkette, um eine Aminbindung zu erhalten.
Verglichen mit anderen bekannten Methoden, liefert das Crosslinking von Kollagen mit Glutaraldehyd (GA) Material mit dem höchsten Vernetzungsgrad. Es ist zur Zeit das am meisten verwendete chemische Crosslinking-Reagens für Kollagen-basierte Materialien. Glutaraldehyd ist ein aliphatisches Moleküle mit fünf Kohlenstoffen und mit einem Aldehyd an beide Enden der Kette, was es bifunktional macht. Das Aldehyd kann chemisch mit Aminogruppen des Kollagens interagieren, um chemische Bindungen zu bilden. Dieses Crosslinking-Reagens ist leicht verfügbar, nicht teuer und bildet wässrige Lösungen, die effektiv Gewebe in einer relativ kurzen Zeit vernetzen können. Durch die Verwendung des GA-Crosslinkings können eine erhöhte Resistent gegen Biodegradation, eine reduzierte Antigenität und verbesserte mechanische Eigenschaften des Kollagen-basierten Materials erreicht werden. Trotz einer verbesserten Wirtsakzeptanz, wurde gezeigt, dass das Crosslinking Kollagen-basierten Materials unter Verwendung von GA zytotoxische Charakteristi ka hat, sowohl in-vitro als auch in-vivo. Auch tendiert das Crosslinking Kollagen-basierten Materials unter Verwendung von GA zu einer Versteifung des Materials und Verkalkung.
Das Crosslinking kann auch mit Diisocyanaten vollendet werden, durch Überbrückung von Amingruppen auf zwei angrenzenden Polypeptidketten. Im ersten Schritt tritt die Reaktion der Isocyanatgruppe mit einer (Hydroxy)Lysin-Amingruppe auf, was in der Bildung einer Harnstoffbindung resultiert. Danach wird durch die Reaktion der zweiten Isocyanatgruppe mit einer anderen Amingruppe ein Crosslink gebildet. Diisocyanate zeigen keine Kondensationsreaktionen, wie bei der GA-Crosslinking beobachtet. Auch verbleiben keine Reagensrückstände im Material. Ein Nachteil ist wie auch immer die Toxizität der Diisocyanate und die begrenzte Wasserlöslichkeit der meisten Diisocyanate.
Eine andere Methode von Crosslinking umfasst die Bildung eines Acylazids. Die Acylazid-Methode beinhaltet die Aktivierung von Carboxylgruppen in der Polypeptidkette. Die aktivierten Gruppen bilden Crosslinks durch die Reaktion mit Kollagen-Amingruppen einer anderen Kette. Zuerst werden die Carboxylgruppen durch Reaktion mit einem Alkohol verestert. Dieser Ester wird dann durch Reaktion mit Hydrazin (H₂N-NH₂) in ein Hydrazid umgewandelt. Acylazidgruppen werden durch Reaktion mit einer sauren Lösung von Natriumnitrit gebildet. Bei niedrigen Temperaturen und basischen pH-Werten reagiert die Acylazidgruppe mit einer primären Amingruppe, um Aminbindungen zu erhalten. Diese mehrschrittige Reaktion führt zu guten Materialeigenschaften; jedoch sind lange Reaktionszeiten (z.B. 7 Tage) notwendig. Alternativ ist kürzlich eine Methode entwickelt worden, die den Esterifizierungsschritt oder die Verwendung von Hydrazin nicht benötigt. Bei dieser Methode wird eine Carboxylgruppe in einer Acylazidgruppe in einem einzigen Schritt durch Reak tion mit Diphenylphosphorylazid (DPPA) umgewandelt. Dies erhöht die Reaktionsrate signifikant; jedoch wird die Reaktion in einem organischen Lösungsmittel (z.B. DMF) durchgeführt, was unerwünscht ist.
Auch können wasserlösliche Carbodiimide verwendet werden, um die freien Carboxylgruppen von Glutamin- und Asparaginsäureresten in Kollagen zu aktivieren. Die Aktivierung von Carboxylgruppen mit Carbodiimiden, wie 1-Ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide·HCl (EDC), ergibt O-Acylisoharnstoffgruppen. Eine Kondensationsreaktion durch nukleophilen Angriff einer freien Amingruppe eines (Hydroxy)Lysin-Restes mit Harnstoff als abgehende Gruppe, resultiert in der Bildung eines Amin-Crosslinks. O-Acylisoharnstoff kann auch zu einem N-Acylharnstoff hydrolisiert oder umorganisiert werden, der viel stabiler ist und nicht zur Bildung eines Crosslinks reagieren wird. Der Zusatz von N-Hydroxysuccinimid (NHS) verhindert jedoch die Umorganisation. Bei Anwesenheit von NHS kann der O-Acylisoharnstoff zu einer durch NHS aktivierten Carboxylgruppe umgewandelt werden, die auch mit einer freien Amingruppe reagieren kann, um ein Crosslink zu bilden. NHS-Zusatz erhöht die Reaktionsrate. Crosslinking mit EDC und NHS stellt auch Kollagen-Material mit einem hohen Grad von Crosslinking zur Verfügung; jedoch resultiert es auch in Material mit einer niedrigen Zugfestigkeit.
Noch eine andere Crosslinking-Methode verwendet Epoxidverbindungen, um Kollagen zu crosslinken. Siehe beispielsweise U.S. Pat. Nr. 4.806.595 (Noishiki u.a.) und 5.080.670 (Imamura u.a.). Epoxidverbindungen (d.h. Epoxide) können unter den geeigneten Bedingungen sowohl säurekatalysierte als auch basenkatalysierte Reaktionen mit einer Vielzahl von funktionellen Gruppen durchlaufen, einschließlich Amingruppen und Carboxylgruppen. Typischerweise wird jedoch das Crosslinking von Kollagen bei basischem pH (d.h. pH 8–10) ausgeführt, mit dem Ergebnis, dass das Crosslinking über die freien Amingruppen von Kollagen auftritt. Obwohl ein solches Material allgemein stabil gegenüber Hydrolyse und enzymatischem Abbau ist, hat es allgemein dürftige mechanische Eigenschaften (z.B. niedrigen Zugfestigkeit).
So existiert immer noch ein Bedarf an Crosslinking-Methoden für Kollagen-basierte Materialien, die sowohl gute mechanische Eigenschaften als auch Stabilität gegenüber Hydrolyse und enzymatischem Abbau haben.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren bereit, um eine bioprothetische Vorrichtung herzustellen (typischerweise ein Implantat oder eine implantierbare Vorrichtung), die Kollagen-basiertes Material umfasst. Die Verfahren schließen das Crosslinking des Kollagen-basierten Materials ein. Bezeichnenderweise ergeben die Verfahren der vorliegenden Erfindung ein Material mit einem allgemein hohen Grad an Crosslinking (Quervernetzung) und einer allgemein hohen Resistenz gegenüber einer enzymatischen Verdauung, während das Material einen relativ hohen Grad an Flexibilität behält, ohne wesentliche Versteifung über die Zeit. Dieses Material ist bevorzugt auch hoch hydrophil, wovon man annimmt, dass es die Biokompatibilität des Materials erhöht. Die erfindungsgemäßen Verfahren sind besonders für Crosslinking von kardiovaskulären Bioprothesen, wie Herklappen und vaskuläre Transplantate, geeignet.
Folglich wird ein Verfahren zur Herstellung einer bioprothetischen Vorrichtung bereitgestellt, die aus Kollagen-basiertem Material gemachten ist, das Kollagen-Amingruppen und Kollagen-Carboxylgruppen enthält. Das Verfahren umfasst die Kombination einer epoxidfunktionalisierten Crosslinkingsubstanz mit dem Kollagen-basierten Material in einem wässrigen Medium bei saurem pH, damit zumindest ein Teil der Kollagen-Carboxylgruppen mit der epoxidfunktionalisierten Crosslinkingsubstanz reagiert, um vernetztes Kollagen-basiertes Material zu bilden, das übergebliebene Kollagen-Carboxylgruppen umfasst und weiter einen zusätzlichen Crosslinking-Schritt umfasst, wobei Crosslinks entweder zwischen zwei Amingrupen oder zwischen einer freien Amingruppe und einer übergebliebenen Carboxylgruppe gebildet werden. Vorzugsweise werden die restlichen Kollagen-Carboxylgruppen mit den Kollagen-Amingruppen zur Reaktion gebracht, um Null-Längen-Crosslinks zu bilden.
Ein neues Verfahren für das Crosslinking Kollagen-basierten Materials, das Kollagen-Amingruppen und Kollagen-Carboxylgruppen hat, wird auch bereitgestellt und stellt einen weiteren Aspekt der Erfindung dar. Die Methode umfasst: Kombinieren einer Diepoxy-Crosslinkingsubstanz mit dem Kollagen-basierten Material in einem wässrigen Medium bei saurem pH, um zumindest einen Teil der Kollagen-Carboxylgruppen mit der Diepoxy-Crosslinkingsubstanz reagieren zu lassen, um vernetztes Kollagen-basiertes Material zu bilden, das die restlichen Kollagen-Carboxylgruppen umfasst; und Reagieren-Lassen eines Teils der restlichen Kollagen-Caboxylgruppen mit einer aktivierte Substanz in Anwesenheit einer stabilisierenden Substanz, um aktivierte Carboxylgruppen zu bilden, die in der Lage sind, mit Carboxylamingruppen zu reagieren und weiterhin einen zusätzlichen Crosslinking-Schritt, wobei Crosslinks entweder zwischen zwei Amingruppen oder zwischen einer freien Amingruppe und einer übergebliebenen Carboxylgruppe gebildet werden.
Vorzugsweise wird die aktivierte Substanz aus der Gruppe ausgewählt von einem Carbodiimid, einer Säure, 1,1'-Carbonyldiimidazol, N,N'-Disuccinimidylcarbonat, 2-Ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydroquinolin und 1,2-Benzisoxazol-3- yl-diphenylphosphat, N-Ethyl-5-phenylisoxazolium-s'-sulfonat sowie Mischungen davon. Eine besonders bevorzugte aktivierende Substanz ist das teils wasserlösliche Carbodiimid, 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid·HCl. Um die Stabilität der reaktiven Zwischenstadien zu vergrößern, besonders wenn ein Carboiimid die aktivierende Substanz ist, umfasst der Aktivierungsschritt vorzugsweise die Reaktion der Kollagen-Carboxylgruppen mit einer aktivierenden Substanz in Anwesenheit von einer stabilisierten Substanz, wie N-Hydroxysuccinimid.
Die epoxidfunktionalisierte Crosslinkingsubstanz, die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist vorzugsweise eine polyepoxidische hydrophile Crosslinkingsubstanz, und noch besser ein Diepoxid. Eine bevorzugte Klasse solcher Crosslinkingsubstanzen sind Polyolpolyglycidylether, wie, aber sind nicht darauf beschränkt, Glycoldiglycidylether, Glycerindiglycidylether, Glycerintriglycidylether und Butanedioldiglycidylether. Eine besonders bevorzugte diepoxische (d.h. Diepoxid) Crosslinkingsubstanz hat die folgende Formel:
wobei R irgendein Substituent sein kann, der nicht mit dem Crosslinkingprozess interferiert und/oder nicht die Wasserlöslichkeit der Crosslinkingsubstanz in wässeriger Lösungen verringert; und wobei n = 1–6, vorzugsweise n = 1–4.
Weiterhin können solche Crosslinkingsubstanzen aus der Gruppe der Polyglycidylether-funktionalen Moleküle von Polyethlyenglycol, Polypropylenglycol und Polyethylenpropylenglycol ausgewählt werden, für die das Diglycidylether- Derivat durch die folgende allgemeine Formel dargestellt werden kann:
wobei x + z = 0 – 70 und y = 0 – 90.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung auch eine bioprothetische Vorrichtung bereit, die Kollagen-basiertes Material umfasst, das mit einer epoxidfunktionalisierten Corsslinkingsubstanz crossgelinkt wurde über einen Teil der Kollagen-Carboxylgruppen, und weiter durch Kollagen-Carboxylgruppen crossgelinkt wurde, die direkt an Kollagen-Amingruppen gebunden sind und weiterhin einen zusätzlichen Crosslinking-Schritt, wobei Crosslinks entweder zwischen zwei Amingruppen oder zwischen einer freien Amingruppe und einer übergebliebenen Carboxylgruppe gebildet werden.
Die Erfindung stellt gemäß einem weiteren Aspekt Kollagen-basiertes Material bereit, das Kollagen-Amingruppen hat und Kollagen-Carboxylgruppen, die mit einer epoxidfunktionalisierten Crosslinkingsubstanz über einen Teil der Kollagen-Carboxylgruppen crossgelinkt sind und weiterhin einen zusätzlichen Crosslinking-Schritt, wobei Crosslinks entweder zwischen zwei Amingruppen oder zwischen einer freien Amingruppe und einer übergebliebenen Carboxylgruppe gebildet werden.
Die Erfindung ist weiter beschrieben mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen:
1 zeigt eine schematische Darstellung, die eine Übersicht von in der vorliegenden Erfindung bekannt gegebenen möglichen Crosslinkingtechniken wiedergibt.
2 zeigt einen Graphen der Gewichtsveränderung (in des Anfangsgewichts) als einer Funktion der Pronaseabbauzeit (in Stunden).
3 zeigt einen Graphen der Gewichtsveränderung (in des Anfangsgewichts) als einer Funktion der Kollagenaseabbauzeit (in Stunden).
4 zeigt eine typische Stressbelastungskurve von Kollagen, die vier charakteristische Regionen darstellt, die in Zusammenhang mit verschiedenen Phänomenen stehen, die in Kollagen-Material stattfinden, wenn Stress angewendet wird.
5 zeigt Stressbelastungskurven von nicht-vernetztem und vernetztem dermalen Kollagen vom Schaf.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren bereit, um eine bioprothetische Vorrichtung herzustellen, die ganz oder in Teilen von natürlichen Geweben abstammt, die Kollagen-basiertes Material enthalten, sowie die resultierenden Produkte. Solche bioprothetischen Vorrichtungen schließen beispielsweise Herzklappen und andere Herzkomponenten, vaskulären Ersatz oder Transplantate, Harnweg- und Harnblasenaustausch, Darm- und Gewebesektionen, Sehnenaustausch und ähnliches ein. Solche Kollagen-basierten Materialien schließen ganze Gewebe (d.h. Gewebe, das kollagene und nicht-kollagene Substanzen oder Zellen enthält) ein, nur die Kollagenmatrix ohne die nicht-kollagenen Substanzen und gereinigtes fibröses Kollagen. Typischerweise und vorzugs weise werden jedoch ganze Gewebe für die Erstellung bioprothetischer Implantate verwendet.
Die vorhandene Erfindung stellt ausdrücklich ein Verfahren zur Herstellung von aus Kollagen-basiertem Material gemachten bioprothetischen Vorrichtungen bereit, so wie eine Herzklappe, indem das Kollagen-basierte Material primär über Kollagen-Carboxylgruppen mit einer epoxidfunktionalisierten Crosslinkingsubstanz vernetzt wird. Obwohl Epoxidverbindungen auch reaktiv gegenüber Amingruppen sind, besonders unter basischen Bedingungen, ist der pH der Vernetzungsreaktion der vorhandenen Erfindung so kontrolliert, dass die Reaktion der Epoxidverbindungen mit Kollagen-Carboxylgruppen relativ zu der Reaktion mit Amingruppen verstärkt ist. Das heißt, obwohl bekannt ist, dass es Kollagen-basierte Materialien (hierin oft einfach darauf bezogen als "Kollagen") bei Verwendung von Epoxidverbindungen crosslinkt, tritt solches Crosslinking typischerweise bei basischem pH auf, was in einem Crosslinking über die Kollagen-Amingruppen resultiert. Im Gegensatz dazu umfassen die Methoden der vorliegenden Erfindung das Crosslinking Kollagen-basierter Materialien mit Epoxidverbindungen bei saurem pH, was zu Crosslinking primär über die Kollagen-Carboxylgruppen führt. Dies erlaubt den Kollagen-Amingruppen für Blockierungsreaktionen, zusätzliche Crosslinking-Reaktionen oder der Kopplung bioaktiver Moleküle verfügbar zu sein.
Ein bevorzugtes Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst zuerst die Kombination des Kollagen-basierten Materials mit einer oder mehreren epoxyfunktionalisierten Crosslinkingsubstanzen bei saurem pH, um das Kollagen über einen Teil der Kollagen-Carboxylgruppen zu vernetzen, und anschließend dieses teilweise vernetzte Kollagen mit einer aktivierenden Substanz zu kombinieren, die mindestens einen Teil der verbleibenden freien Carboxylgruppen (d.h. die restlichen Carboxylgruppen) gegenüber den Kollagen-Amingruppen aktiviert, um das Kollagens durch ein Null-Längen-Crosslink (d.h. Reaktion von aktivierten Carboxyl-Kollagengruppen mit freien Kollagen-Amingruppe) weiter zu vernetzen. Dies ist unerwartet, weil eine große Zahl von Null-Längen-Crosslinks das kollagene Material steif und brüchig macht, was typischerweise im Gegensatz zu den gewünschten mechanischen Eigenschaften der bioprothetischen Vorrichtung steht. Durch die Kombination dieser zwei Crosslinkingtypen gleicht dieses Verfahren jedoch die Menge der Null-Längen-Crosslinks aus und stellt signifikante Vorteile bereit, besonders in Hinsicht auf das Konstruieren gewünschter Eigenschaften.
Crosslinking mittels der Carboxylgruppen unter Verwendung einer epoxidfunktionalisierte Crosslinkingsubstanz bietet eine Menge von Vorteilen gegenüber dem Crosslinking über Amingruppen. Erstens haben Kollagen-basierte Materialien, die über Kollagen-Carboxylgruppen vernetzt wurden, typischerweise überragende mechanische Eigenschaften. Beispielsweise fühlt sich ein solches Material nach der Lyophilisierung sehr biegsam und locker an, verglichen mit Kollagen-basierten Materialien, die mit einer expoxidfunktionalisierten Crosslinkingsubstanz über Kollagen-Amingruppen vernetzt wurden, die starrer und verdichteter (kondensierter) sind. Beim Vergleich mit Materialien, die mit epoxidfunktionalisierten Crosslinkingsubstanzen über Amingruppen vernetzt wurden, zeigt der (unidirektionale) mechanische Test von Materialien, die mit epoxidfunktionalisierten Crosslinkingsubstanzen über Carboxylgruppen vernetzt wurde, eine allgemein höhere endgültige Zugfestigkeit, einen allgemein höheren Anteil an Verlängerung bei Bruch und eine allgemein höhere Stärke, die zum Produzieren einer spezifischen Dehnung notwendig ist. Die letztere Beobachtung ist besonders signifikant, weil es zeigt, dass mit erhöhter Be lastung Kollagen-basierte Materialien, die mit epoxidfunktionalisierten Crosslinkingsubstanzen über Carboxylgruppen vernetzt wurden, resistenter gegenüber weiterer Dehnung wurden. Dies ist ähnlich zu dem mechanischen Verhalten vaskulären Gewebes.
Zweitens hält das Crosslinking mit epoxidfunktionalisierten Crosslinkingsubstanzen über die Carboxylgruppen die Kollagen-Amingruppen frei für weitere chemische Modifikationen. Solche Modfikationen können beispielsweise einschließen blockierenden Reaktionen, zusätzlichen Crosslinkingreaktionen oder die Kopplung von bioaktiven Molekülen sein.
Die Blockierung der Kollagen-freien Amingruppen kann die Antigenität des Materials signifikant reduzieren, so wie es das Glytaraldehyd-Crosslinling tut, das über die Kollagen-Amingruppen vernetzt. Die Blockierung kann vor oder nach dem Epoxid-Crosslinking über die Kollagen-Carboxylgruppen auftreten. Eine große Vielzahl von Blockierungstechniken kann in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die Kollagen-freien Amingruppen werden verwendet, um die Crosslinkingdichte zu erhöhen, entweder zwischen zwei Amingruppen oder zwischen einer freien Amingruppe und einer verbliebenen Carboxylgruppe. Solch ein zusätzliches Crosslinking erlaubt die weitere Konstruktion der mechanischen Eigenschaften des Materials. Es stellt auch eine erweiterte Resistenz gegenüber Biodegradation des Kollagen-basierten Materials zur Verfügung. Eine große Vielfalt von bekannten Crosslinkingtechniken kann in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Vorzugsweise wird jedoch das direkte Crosslinking zwischen verbliebenen Kollagen-Carboxylgruppen und freien Kollagen-Amingruppen, Null-Längen Crosslinks zu bildend, durch die Verwendung von Car boxylgruppe-aktivierenden Substanzen, wie Carbodiimid, gefördert.
Die Kollagen-freien Amingruppen können auch verwendet werden, um bioaktive Moleküle an die Kollagenmatrix zu koppeln. Als Ergebnis kann ein Material hergestellt werden, das aktiv an der Wirt-Material-Wechselwirkung teilnimmt und dadurch die Akzeptanz und Leistungstärke des Materials verbessert. Eine große Vielfalt von bekannten Biomoleküle kann in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Beispiele umfassen, aber sind nicht darauf beschränkt, angiogene Faktoren, Wachstumsfaktoren, antimikrobielle Substanzen, antithrombotische Substanzen und Antiverkalkungssubstanzen.
Die Kollagen-Carboxylgruppen lässt man mit einer polyfunktionalen, vorzugsweise einer bifunctionalen, epoxidfunktionalisierten, Crosslinkingsubstanz reagieren, um das kollagenbasierte Material teilweise zu vernetzen. Man nimmt an, dass die Einführung von solchen Crosslinkingsubstanzen die Bildung von Crosslinks ermöglicht, die nicht nur die Entfernung zwischen zwei benachbarten Kollagenfasern oder Faserbündeln überbrücken, sondern auch zusätzliche Flexibilität in die ganze Matrix bringen. Die epoxidfunktionalisierten Moleküle sind im wesentlichen hydrophiler Natur, löslich in wässrigen Lösungen, mit reaktiven Resten, die sich vorzugsweise in den jeweiligen Enden der längsten molekularen Kette befinden. Sie können geradekettige oder verzweigtkettige Gruppen mit einer Vielfalt von möglichen Substitutionen einschließen, obwohl Substitutionen in der Kette nicht in dem Crosslinkingprozess interferiert und/oder die Löslichkeit von Crosslinkingsubstanzen in wässrigen Lösungen vermindern sollten. Man nimmt an, dass Hydrophilität vom epoxidfunktionalisierten Crosslinkingsubstanzen vorteilhaft ist, da dies die Infiltration und Diffusion von Gewebeflüssigkeit durch die bioprothetische Matrix bewirken kann.
Geeignete hydrophile epoxidfunktionalisierte Crosslinkingsubstanzen umfassen beispielsweise Polyolpolyglycidylether, so wie, aber nicht darauf beschränkt, Glykoldiglycidylether, Glycerindiglycidylether, Glycerintriglycidylether und Butanediglycidylether. Vorzugsweise ist die epoxidfunktionalisierte Crosslinkingsubstanz eine Diepoxy Crosslinkingsubstanz. Eine bevorzugte Klasse hydrophiler Diepoxy Crosslinkingsubstanzen schließt jene der folgenden allgemeinen Formel ein:
wobei R irgendeine Substituent sein kann, der nicht mit dem Crosslinkingprozess interferiert und/oder nicht die Wasserlöslichkeit der Crosslinkingsubstanz in wässrigen Lösungen verringert; und wobei n = 1–6, vorzugsweise n = 1–4.
Zusätzlich können solche Crosslinkingsubstanzen ausgewählt werden aus der Gruppe der Polyglycidylether-funktionalen Moleküle von Polyethlyenglycol, Polypropylenglycol und Polyethylenpropylenglycol, für welche das Diglycidylether-Derivat durch die folgende Formel dargestellt werden kann:
wobei x + z = 0 – 70 und y = 0 – 90. Solche Crosslinkingsubstanzen sind aus einer Vielzahl kommerzieller Quellen, wie Fluka Chemikal, Buchs, Schweiz, verfügbar.
Die Verwendung der hydrophilen epoxidfunktionalisierten Crosslinkingsubstanz kann vorteilhafterweise das vernetzte Material hydrophil machen. Wie oben genannt ist, nimmt man an, dass dies eine ordentliche Infiltration und Diffusion von Gewebeflüssigkeit durch die bioprothetische Matrix bewirkt. Dies stellt eine Versorgung mit Sauerstoff, Nährsubstanzen und Elektrolyten ins Gewebe bereit, genauso wie eine Entwässerung metabolisierter Substanzen aus dem Gewebe. Als Ergebnis wird das Wachstum von kapillaren Blutgefäßen und Zellen gefördert, und somit eine gute Heilantwort auf das implantierte Material.
Außerdem nimmt man an, dass Crosslinkingsubstanzen, die eine hochflexible, langkettige Struktur haben, Crosslinking zwischen angrenzenden Fasern und Faserbündeln bewirken, was eine vorteilhafte Wirkung auf die mechanischen Eigenschaften des resultierenden vernetzten Materials haben wird.
Die epoxidfunktionalisierte(n) Crosslinkingsubstanz(en) werden in Menge verwendet, die wirksam sind, um einen gewünschte Anzahl der Carboxylgruppen zu vernetzen. Vorzugsweise umfasst diese Menge ein molares Verhältnis der epoxidfunktionalisierende(n) Crosslinkingsubstanz(en) relativ zur Anzahl der aktivierten Carboxylsäuregruppe von etwa 1:1 zu etwa 25:1, noch besser etwa 4:1 zu etwa 20:1 und am besten etwa 8:1 zu etwa 16:1.
Die Crosslinkingreaktion wird in einer sauren wässrigen Lösung ausgeführt. Unter sauren Bedingungen werden die Epoxidgruppen protoniert, die Gegenstand eines nucleophilen Angriffes durch carboxylate Anionen sind und dadurch Ester verbindungen bilden. Vorzugsweise hat die Lösung einen pH-Wert von etwa 3 bis etwa 7, noch besser etwa 4 bis etwa 6,5 und am besten etwa 4,5 bis etwa 6. Die Temperatur dieser Reaktion sollte unterhalb derer sein, bei der das kollagenbasierte Material denaturiert wird. Obwohl erhöhte Temperaturen Reaktionsraten steigern, ist dadurch ein effektives Crosslinking eine Sache von Tagen. Der Maximalwert der Einlauftemperatur (T_S), ein Maß für die Wirksamkeit des Crosslinkings, verändert sich kaum mit der Reaktionstemperatur. Deshalb werden Reaktionen vorzugsweise bei Zimmertemperatur (d.h. etwa 20–25°C) und noch besser bei etwa 21°C durchgeführt.
Nachdem das kollagenbasierte Material mit Epoxidverbindungen über Kollagen-Carboxylgruppe vernetzt wurde, können die freien (d.h. restlichen) Kollagen-Amingruppen vernetzt werden. Dies kann getan werden, indem zuerst zumindest ein Teil der restlichen Kollagen-Carboxylgruppen aktiviert wird (d.h. jene Kollagen-Carboxylgruppe, die nicht mit Epoxid Crosslinkingsubstanzmolekülen reagiert haben). Diese restlichen Carboxylgruppen können durch eine Vielzahl von Methoden aktiviert werden Carbodiimid-Reagenzien sind wohl bekannte aktivierenden Substanzen und werden traditionell am häufigsten verwendet. Die Reaktion zwischen einer Carboxylgruppe und einem Carbodiimid liefert das reaktive Zwischenstadium O-Acylisoharnstoff; dieses Zwischenstadium ist anfällig für einen nukleophilen Angriff in einem nachfolgenden Schritt. Zusätzlich könnte eine intramolekulare Umstellungsreaktion passieren, bei der O-Acylisoharnstoff sich zu dem stabileren aber viel weniger reaktiven N-Acylharnstoff umstellt. Bei typischen Reaktionsbedingungen ist die Halbwertszeit dieser Zwischenstadien im Bereich von Sekunden bis Minuten.
Der reaktive O-Acylisoharnstoff kann durch die Verwendung eines Succinimids oder anderer stabilisierender Reagenzien stabilisiert werden. Durch die Verwendung einer stabilisierenden Substanz zusätzlich zu der aktivierenden Substanz kann die Halbwertszeit des O-Acylisoharnstoffs auf 30–40 Minuten unter typischen Bedingungen erhöht werden. Auch wird die intramolekulare Umstellungsreaktion signifikant unterdrückt. Typischerweise sind diese stabilisierenden Substanzen selbst auch dazu fähig, die Carboxylgruppen zu aktivieren, obwohl viel weniger effektiv als in der Kombination mit Carbodiimiden.
Beispiele anderer aktivierender Substanzen als Carbodiimid schließen solche ein, sind aber nicht darauf beschränkt, die typischerweise bei der Peptidsynthese verwendet werden. Beispiele schließen ein 1.1'-Carbonyldiimidazol (CDI), N, N'-Disuccinimidylcarbonat (DSC), 2-Ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydroquinolin (EEDQ) und 1,2-Benzisoxazol-3-yldiphenylphosphat (BDP) und N-Ethyl-5-phenylisoxazolium-s-Sulfonat (Woodwards Reagens K). Solche aktivierende Substanzen sind wenigstens teilweise in Wasser löslich. Obwohl aktivierende Subtanzen, die nicht in Wasser wenigstens teilweise löslich sind, so wie Azide (z.B. Diphenylphophorylazid wie in U.S. Pat. Nr. 5.264.551 (Petite u.a.) veröffentlich), bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind sie nicht besonders wünschenswert. Mischungen von aktivierenden Substanzen können verwendet werden.
Vorzugsweise werden die restlichen Kollagen-Carboxylgruppen durch die Reaktion mit einem Carbodiimid aktiviert, das in Wasser wenigstens teilweise löslich ist. Ein besonders bevorzugtes wasserlösliches Carbodiimid, geeignet für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung, ist 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-Carbodiimid-HCl (EDC). Andere geeigne te Carbodiimide umfassen beispielsweise Cyanamide und N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), N,N'-Diisopropylcarbodiimid (DIC) und 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)-carbodiimid-metho-p-toluenesulfonat (CMC).
Wie oben genannt ist, wenn ein Carbodiimid verwendet wird, um die Carboxylgruppen zu aktivieren, so werden O-Acylisoharnstof-Gruppen gebildet, die sich zu weniger reaktiven N-Acylharnstoff-Gruppen umstellen können. Der Zusatz von N-Hydroxysuccinimid (NHS) ist bekannt dafür, die Tendenz für die Umstellung zu verringern. Anderen stabilisierende Substanzen, wie N-Hydroxybenzotriazol (HOBt), N-Hydroxy-5-norbornene-endo-2,3- dicarboximid (HONB), 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) und die Sulfoderivate von N-Hydroxysuccinimid, sind auch in der Lage, dies zu erreichen. Mischungen von solchen stabilisierenden Substanzen können verwendet werden. Bei besonders bevorzugten Verfahren der vorliegenden Erfindung werden die Kollagen-Carboxylgruppen durch Verwendung einer Mischung eines Carbodiimids (bevorzugt EDC) und NHS aktiviert.
Verschiedene Mischungen aus den oben genannten aktivierenden Substanzen und optionale stabilisierende Substanzen können bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die aktivierende(n) Substanz oder Substanzen werden in Menge verwendet, die effektiv sind, um mindestens ein Teil, und vorzugsweise eine Mehrheit (d.h. größer als etwa 50%), der restlichen Kollagen-Carboxylgruppe zu aktivieren. Noch besser werden die aktivierende(n) Substanz oder Substanzen in einem molaren Überschuss relativ zur Anzahl der restlichen Kollagen-Carboxylgruppe verwendet. Die stabilisierende(n) Substanz oder Substanzen werden in Menge verwendet, die effektiv sind, um eine Mehrheit der aktivierten Carboxylgruppen zu stabilisieren. Vorzugsweise werden die stabilisierende(n) Substanz oder Substanzen in ei ner Menge verwendet, die mindestens dem Niveau der Anzahl restlicher Kollagen-Carboxylgruppen gleicht. Noch besser werden die stabilisierende(n) Substanz oder Substanzen in einem molaren Überschuss verwendet, der relativ zu der Menge der restlichen Kollagen-Carboxylgruppen ist, aber vorzugsweise ohne das molare Niveau der aktivierenden Substanz oder Substanzen zu überschreiten.
Die aktivierende Reaktion wird vorzugsweise in einer wässrigen Lösung, noch besser einer gepufferten wässrigen Lösung mit einem pH-Wert von etwa 4 bis etwa 9 (vorzugsweise etwa 5 bis etwa 7, und noch besser etwa 5 bis etwa 6) durchgeführt.
Obwohl die Verwendung einer Carbodiimid-Crosslinkingtechnik, um Null-Längen-Crosslinks zu bilden, dem Crosslinking Kollagen-basierten Materials mit den epoxidfunktionalisierten Crosslinkingsubstanzen nachfolgend besonders bevorzugt ist, können anderen Crosslinkingtechniken verwendet werden. Beispielsweise können Dicarboxylinsäure Abstandhalter während der Carbodiimid-Crosslinkingtechnik verwendet werden. Diese Abstandhalter sind vorzugsweise hydrophiler Natur, so wie Dicarboxylsäure funktionelles Polyethylenglycol, Polypropylenglycol oder Polyethylenglycolpolypropylenglycol Polymere. Die Verwendung dieser Abstandhalter während des Carbodiimid-Crosslinkings würde die Einführung von Crosslinks zwischen den freien Amingruppen von Kollagen begünstigen. Es ist auch möglich, Abstandhalter zu verwenden, die funktionelle Gruppen haben, die in der Lage sind, direkt an die freien Amingruppen des Kollagens zu koppeln, dem Bedürfnis zur Verwendung von Carbodiimiden vorbeugend. Beispiele sind Dialdehyd funktionelle Abstandhalter oder Disuccinimidyl funktionelle Abstandhalter. Nochmals, die Abstandhalter sind vorzugsweise von hydrophilen Natur, so wie Dialdehyd funktionelles Polyethyleneglycol oder das Disuccinimidyl-Derivat von Polypropylenglycol.
Die freie Amingruppen der teilweise vernetzten Kollagen-basierten Materialien können, wenn gewünscht, von verschiedenen Arten chemischer Reagenzien blockiert werden. Weiterhin können solche Blockierungstechniken auch verwendet werden, bevor ein Teil der Carboxylgruppen mit den Epoxidverbindungen (d.h. bevor das Crosslinking mit dem epoxidfuntkionalisierteb Crosslinker) reagiert. Die vier Hauptarten von Reaktionen, durch die die Blockierung von freien Aminen erreicht werden kann, sind: (1) Amylierungsreaktion; (2) Aminiserungsreaktion, vorzugsweise einschließend reduktiver Aminierung unter Verwendung von Aldehyde oder Ketone; (3) Aminierungsreaktion unter Verwendung von Epoxiden; und (4) Aminierungsreaktion mit Sulphonyl oder Sulphonsäure Derivaten. Vorzugsweise werden kleine Blockierungssubstanzen verwendet, d.h. solche, die ungefähr zwei bis sechs Kohlenstoffatome in der Länge haben, um einer signifikanten Störung der Dreifach-Helix-Struktur des Kollagens vorzubeugen. Obwohl solche Reaktionen, welche die Verwendung kleiner Blockierungssubstanzen einschließen, bevorzugt werden, können biologisch aktive Verbindungen auch verwendet werden, um die freien Amingruppen zu blockieren.
Es gibt zahlreiche Acylierungssubstanzen für die Verwendung bei der Blockierung der Amingruppen, die Acylierungsreaktion verwendend. Von beonderer Wichtigkeit sind die Isocyanate, Isothiocyanate, Säurehalide, Säureanhydride, activierten Ester (d.h. solche, die eine gute Abgangsgruppe haben, die bei der Reaktion mit einem Amin leicht freigegeben wird) so wie N-Hydroxysuccinimidester und Imidoester. Bevorzugte acylierende Substanzen schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf: N-Hydroxysuccinimidesters (NHS), so wie Essigäure N-Hydroxysuccinimidester, Sulfo-NHS-Acetat und Propionsäure N-Hydroxysuccinimidester; p-Nitrophenylester so wie p-Nitrophenylformat, p-Nitrophenylacetat und p-Nitrophenylbutyrat; 1-Acetylimidazol; und Citraconisches Anhydrid (reversibler Blocker).
Es gibt zahlreiche Aminierungssubstanzen (z.B. Alkylierungssubstanzen) für die Verwendung bei der Blockierung der Amingruppen, die Acylierungsreaktion verwendend. Besonders bevorzugt sind Aldehyde und Ketone. Die Reaktion eines freien Amins mit einem Aldehyd oder Keton ergibt ein Imin (oder Schiff'sche Base), das recht stabil ist (besonders wenn eine Arylgruppe vorhanden ist). Wenn notwendig kann das gebildete Imin jedoch weiter stabilisiert werden durch eine Reduktion mit reduzierenden Substanzen wie Natriumcyanoborohydrid, Natriumborohydrid, oder Boran-Reagenzien so wie Dimethylaminboran, Trimethylaminboran oder Morpholinboran.
Aldehyde sind bevorzugte aminierende Substanzen, weil Ketone allgemein langsamer reagieren und öfter höhere Temperaturen und längere Reaktionszeiten benötigen. Eine breite Vielfalt an Aldehyden kann verwendet werden. Vorzugsweise sind die Aldehyde monofunktionale Aldehyde. Beispiele monofunktionaler Aldehyde schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Propanal, Butanal und Hexanal (Caproaldehyd).
Monofunktionale Epoxide können auch als aminierende Substanz verwendet werden, um die Amingruppen zu blockieren. Ein monofunktionales Epoxid bildet ein sekundäres Amin; es wird jedoch vorausgesetzt, dass solche Gruppen ausreichend sterisch behindert werden, damit unter typischen Reaktionsbedingungen kein Crosslinking auftritt. Geeignete monofunktionale Epoxide umfassen beispielsweise Isopropylglycidether und n-Butylglycidylether.
Sulphonyl oder Sulphonsäure Derivate sind eine weitere Gruppe aminierender Substanzen, die verwendet werden können, um freie Amingruppen zu blockieren. Vorzugsweise ist das Sulphonyl oder Sulphonsäure Derivat monofuntkional. Ein beispielhaftes Reagens ist 2,4,6-Trinitrobenzensulfonsäure.
Eine breite Vielfalt biologisch aktiver Derivate solcher Verbindungen (d.h. solche, die einen passenden reaktiven Rest enthalten, so wie beispielsweise ein Ester oder Keton) kann verwendet werden, um die freien Amingruppen zu blockieren. Als Ergebnis können wünschenswerte biologische Funktionen in die kollagene Matrix eingeschlossen sein, welche die Biokompatibilität und Gesamtleistung verbessern können. Ein Beispiel ist ein Aldehyd-funktionales Heparin, das entweder durch Periodatoxidierung (Periodat-Heparin) oder Salpetersäureabbau (NAD-Heparin) erhalten wird.
Eine Mischung der obigen Blockierungssubstanzen kann bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Blockierungssubstanz (oder Mischung von Blockierungssubstanzen) wird in einer Menge verwendet, die effektiv ist, zumindest einen Teil, vorzugsweise die Mehrheit (d.h. mehr als ungefähr 50%), der freien Amingruppen zu blockieren. Noch besser wird bzw. werden die blockierende(n) Substanz(en) in einem signifikanten molaren Überschuss relativ zur Anzahl der freien Amingruppen verwendet.
Die Blockierungsreaktion wird vorzugsweise in einer wässrigen Lösung und noch besser in einer gepufferten wässrigen Lösung bei einem pH von ungefähr 6 bis ungefähr 7 durchgeführt.
Vorzugsweise sind solche Blockierungssubstanzen in der Lage mindestens 75% der freien Kollagen-Amingruppen zu blockieren, noch besser mindestens 80% und am besten mindestens 90% der freien Kollagen-Amingruppen. Typischerweise bietet die Blockierung der Amingruppen eine Verbesserung der Biokompatibilität des Kollagen-basierten Materials, weil von freien Amingruppen behauptet wird, dass sie an der Immunantwort beteiligt sind.
Das Crosslinking Kollagen-basierten Materials in Übereinstimmung mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung ergibt ein Material mit einem allgemein hohen Grad an Crosslinking (Quervernetzung) und einer allgemein hohen Resistenz gegenüber einer enzymatischen Verdauung, während das Material einen relativ hohen Grad an Flexibilität behält, ohne substantielle Versteifung über die Zeit. Dieses Material ist auch bevorzugt hoch hydrophil, wovon man annimmt, dass es die Biokompatibilität des Materials erhöht. Die große Reduktion der freien Amingruppen trägt auch zu einer besseren Biokompatibilität bei, durch Erniedrigung des antigenen Potenzials des Materials. Wie vorstehend diskutiert, kann die Biokompatibilität dieses Materials auch verbessert werden durch Blockierung der Amingruppen mit geeigneten biologisch aktiven Molekülen, so wie beispielsweise das sehr blutkompatible Molekül Heparin, anstatt kleine biologisch inaktive Moleküle zu verwenden. Diese Eigenschaften machen die Methoden in Übereinstimmung mit der vorliegende Erfindung besonders für Crosslinking von kardiovaskulären Bioprothesen, wie Herklappen und vaskuläre Transplantate, geeignet.
Die Erfindung wird weitergehend beschrieben durch Bezugnahme auf die folgenden nichtbegrenzenden Beispiele. Diese Beispiele werden angeboten, um einige spezifische und erläuternde Ausführungsformen und Techniken weiter darzustellen.
Versuchsbeispiele
Materialien und Methoden
Vorbereitung des DSC. Dermales Schafskollagen (DSC) wurde als Model für Schweine-Aortenherzklappen verwendet, weil dieses Material einen Gewebematrix-ähnliche Struktur bietet, wobei es ein reines Kollagenmaterial ist. Das letztere erlaubt eine präzisere Untersuchung und Charakterisierung des Materials nach Anwendung des Crosslinkingprozesses. Als solches wird ein besseres Verständnis des Verhältnisses zwischen der Crosslinkingchemie und dem folgenden Materialverhalten, mechanisch und biologisch, erhalten. Das Material kam von der Zuid-Nederlandse Zeemlederfabriek (Oosterhout, Niederlande). DSC wurde in einem Prozess vorbereitet, bei dem die Haut zuerst enthaart und in eine Kalk-Natriumsulfat-Lösung eingetaucht wurde, um die Epidermis zu entfernen. Nicht-kollagene Substanzen wurden mit proteolytischen Enzymen entfernt, wonach die Haut gespalten wurde, um die dermale Schicht zu erhalten. Das verbleibende fibröse Kollagennetzwerk wurde vor der Gefriertrocknung ausgiebig mit Wasser (4-mal), mit Azeton (2-mal) und mit deionisiertem Wasser (2-mal) gewaschen. Dieser Prozess lieferte nicht-vernetztes DSC (NDSC).
Crosslinking mit einem Diepoxid. Ein 1 Gramm (g) Bogen von NDSC wurde in 100 ml einer gepufferte Lösung eingetaucht, die 4% (des Gewichts) 1,4-Butandioldiglycidylether (BDDGE; Fluka Chemical, Buchs, Schweiz) enthielt. Die Lösung wurde entweder mit 0,05 Molar (M) 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES; Merck, Darmstadt, Deutschland) auf pH 4,5 oder mit 0,025 M Na₂B₄O₇·10H₂O (Natriumtetraboratdecahydrat) auf pH 9,0 gepuffert. Die Reaktion wurde für 7 Tage bei Zimmertemperatur fortgesetzt. Nach der Reaktion wurde die Probe mit Leitungswasser und dann mit deionisiertem Wasser vor dem Gefriertrocknung gespült. Dieser Prozess lieferte DSC mit BDDGE vernetzt bei pH 4,5 (BD45) oder pH 9,0 (BD90).
Crosslinking mit EDC und NHS. Ein 1 g Bogen von BD45 wurde in 100 ml einer 0,05 M MES gepufferte Lösung eingetaucht (pH = 5,5), die 1,15 g 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid·HCl (EDC; Aldrich, Zwijndrecht, Niederlande) und 0,276 g N-Hydroxysuccinimid (NHS; Aldrich, Zwijndrecht, Niederlande) enthielt. Die Reaktion wurde für 2 Stunden bei Zimmertempertaur fortgesetzt. Nach der Reaktion wurde das DSC 2 Stunden mit 0,1 M NaH₂PO₄ und dann mit deionisiertem Wasser vor der Gefriertrocknung gewaschen. Dieser Prozess lieferte DSC vernetzt mit BDDGE bei pH 4,5 und Null-Längen-Crosslinks (BD45EN).
Crosslinking mit Glutaraldehyd. Ein 1 g Bogen von NDSC wurde für eine Stunde bei Zimmertemperatur in 100 ml einer 0,5 wt-% Glutaraldehydlösung (GA destilliert, Siedepunkt 85-86°C, 18 mm Hg) in einem Phosphatpuffer (0,054 M Na₂HPO₄, 0,13 M NaH₂PO₄, pH 7,4) eingetaucht. Nach dem Crsosslinking wurde die Probe mit Leitungswasser für 15 Minuten gespült, mit 4 M NaCl (je 2 × für 30 Minuten) und deionisiertem Wasser (je 4 × für 30 Minuten) vor der Gefriertrocknung gewaschen. Dieser Prozess lieferte Glutaraldehyd vernetzten DSC (GDSC).
Blockieren der freien Amingruppen – Acylierungssprozess. Die Acylierungssubstanz Essigsäure N-Hydroxysuccinimidester (HAc-NHS; Sigma, Zwijndrecht, Niederlande) wurde verwendet, um die freien Amingruppen des mit BDDGE bei pH 4,5 vernetzten Kollagens zu blockieren. Ein 1 Gramm (g) Blatt von BD45 wurde in einer 0,05 M MES (Fluka, Buchs, Schweiz) gepufferte Lösung (pH = 6,8), die 2,6 g HAc-NHS enthielt, eingetaucht; das molare Verhältnis der HAc-NHS zu den freien Amingruppen des Kollagens war ungefähr 25:1. Die Reaktion wurde für circa 16 Stunden bei Zimmertemperatur fortgesetzt. Nach der Reaktion wurde das DSC je 3 Mal für 15 Minuten mit deionisiertem Wasser gewaschen und gefriergetrocknet. Dieser Prozess lieferte HAc-NHS blockiertes DSC vernetzt mit BDDGE bei pH 4,5 (BD45HAC).
Gehalt an freien Amingruppen. Der primäre Gehalt vernetzter DSC-Proben an freien Amingruppen, ausgedrückt als Anzahl vorhandener freier Amingruppen pro 1000 Aminosäuren (n/1000) oder als Prozentsatz des NDSC (%), wurde mit einem 2,4,6-Trinitrobenzensulfonsäure (TNBS; 1,0 M Lösung in Wasser, Fluka, Buchs, Schweiz) kolorimetrischen Assay bestimmt. Zu einer Probe von 2-4 Milligramm (mg) von DSC wurde 1 ml einer 4 % (Gewichts/Volumen) wässrigen NaHCO₃ (pH 9,0; Aldrich, Bornem, Belgien) Lösung und 1 ml einer frisch präparierten 0,5% (Gewichts/Volumen) wässrigen TNBS-Lösung hinzugefügt. Nach einer Reaktion für 2 Stunden bei 40°C, wurde 3,0 ml von 6 M HCl (Merck, Darmstadt, Deutschland) hinzugefügt in die Temperatur wurde auf 60°C erhöht. Als die vollständige Solubilisierung des DSC erreicht worden war (ungefähr 90 Minuten nach Zusatz von HCl), wurde die resultierende Lösung mit 15 ml deionisiertem Wasser verdünnt und die Absorbierung wurde mit einem Hewlett-Packard HP8452A UV/VIS Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 345 nm gemessen. Eine Kontrolle wurde vorbereitet, indem derselbe Prozess angewendet wurde, ausgenommen, dass HCl vor dem Zusatz von TNBS hinzugefügt wurde. Der Gehalt an freien Amingruppen wurde mit einem molaren Absorbierungskoeffizienten von 14600 l·mol-1cm-1 für Trinitrophenyllysin berechnet [Wang C.L., et al., Biochim. Biophys. Acta, 544, 555–567, (1978)].
Grad der Vernetzung. Eine differenzielle Rasterkalorimetrie wurde verwendet, um die Effizienz der verschiedenen Crosslinkingverfahren zu studieren. Aufheizen (vernetzten) Kol lagens wird einen struktureller Übergang von der ursprünglichen Dreifach-Helix-Struktur (Triplehelix) bei einer bestimmten Temperatur abhängig von der Art und dem Grad des Crosslinkings hervorrufen. Die Einführung von kovalenten Crosslinks wird die Stabilität der Dreifach-Helix erhöhen, so die Denaturierungstemperatur erhöhen. Auf die Temperatur, bei der die Denaturierung stattfindet, wird sich auch oft bezogen als Schrumpfungstemperatur (T_S), da die Schrumpfung die makroskopische Manifestation der Umwandlung der ursprünglichen Dreifach-Helix-Struktur zur Zufallswicklunganordnung ist.
Behandelte und nicht-behandelte Kollagenproben wurden mit einem Perkin Elmer DSC7 Serie charakterisiert. Bei einem typischen Lauf wurden 5-8 Milligramm (mg) Kollagen in einen 50 Mikroliter (μl) Aluminium-Probentiegel (2 bar maximaler interner Druck) plaziert, wonach 5 μl/mg 0,1 M Phosphatpuffer (pH = 6,88; 0,05 M Na₂HPO₄, 0,05 M NaH₂PO₄ – beide Merck, Darmstadt, Deutschland) hinzugefügt wurden, um das Kollagen zu hydratisieren. Der Probentiegel war mit einer geeigneten Bedeckung versehen und das Ganze wurde quetschgepresst. Ein leerer Probentiegel wurde als Referenz verwendet. Typischerweise wurde einen Lauf mit 20°C (Beladungstemperatur) gestartet; nach 2 Minuten wurden die Proben bei 100°C erhitzt, eine Heizrate von 2°C/Minute anwendend. Um die Datensammlung zu optimieren und typische Eigenschaften zu kalkulieren wurde die Gerätesoftware verwendet.
Pronaseverdauungsassay. Die Verdauung des behandelten und nicht-behandelten DSC wurde durchgeführt durch das Eintauchen einer Kollagenscheibe von 15 mg in 5 ml einer vorgewärmten (T = 37°C) Lösung von 0,1 M Tris(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid (TRIS-HCl, pH 7,4; Aldrich, Bornem, Belgien), die 5 mM CaCl₂ (Janssen Chimica, Geel, Belgien), 0,05 mg/ml NaN₃ (Merck, Darmstadt, Deutschland) und 20 U/ml Pronase (aus Streptomyces grisseus, 7000 U/g Lyphilisat, Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland) enthielt. Der Abbau wurde durch Zusatz von 0,5 ml 0,25 M EDTA (Janssen Chimica, Geel, Belgien) zum gewünschten Zeitintervall unterbrochen, wonach die Lösungen auf Eis gekühlt wurden. Die Pronaselösung wurde abgegossen, wonach die Scheibe 3-mal für 15 Minuten in 0,1 M TRIS-HCl Puffer (pH = 7,4) gewaschen wurde, 3-mal für 15 Minuten in deionisiertem Wasser, und gefriergetrocknet. Der verbleibende Gewichtsanteil (d.h. Änderung des Gewichts als Prozentsatz des ursprünglichen Gewicht) wurde gravimetrisch bestimmt und als ein Maß für die Resistenz gegenüber enzymatischer Verdauung verwendet.
Kollagenaseverdauungsassay. Die Verdauung des behandelten und nicht-behandelten DSC wurde durchgeführt durch Eintauchen einer Kollagenscheibe von 6-10 mg in 0,5 ml einer vorgewärmten (T = 37°C) Lösung von 0,1 M TRIS-HCl Puffer (pH 7,4; Aldrich, Bornem, Belgien), die 5 mM CaCl₂ (Janssen Chimica, Geel, Belgien), 0,05 mg/ml NaN₃ (Merck, Darmstadt, Deutschland) enthielt. Nach einer Stunde wurde 0,5 ml einer vorgewärmten (T = 37°C) Lösung von 0,1 M TRIS-HCl Puffer (pH 7,4) und 20 U/ml Pronase Kollagenase (aus Clostridium Histolyticum, 315 U/mg, Sigma, St. Louis, MO) hinzugefügt. Der Abbau wurde durch Zusatz von 0,1 ml 0,25 M EDTA (Titriplex III, PA, Merck, Darmstadt, Deutschland) zu dem gewünschten Zeitintervall unterbrochen, wonach die Lösungen auf Eis gekühlt wurden. Die Kollagenaselösung wurde abgegossen wonach die Scheibe 3-mal für 15 Minuten in 0,1 M TRIS-HCl Puffer (pH = 7,4) gewaschen wurde, 3-mal für 15 Minuten in deionisiertem Wasser, und gefriergetrocknet. Der verbleibenden Gewichtsanteil (d.h. Änderung des Gewichts als Prozentsatz des ursprünglichen Gewichts) wurde gravimetrisch bestimmt und als ein Maß für die Resistenz gegenüber enzymatische Verdauung verwendet.
Mechanische Eigenschaften. Stressbelastungsskurven von DSC-Proben wurden durch uniaxiale Messungen mit einem Zwick mechanischen Tester bestimmt. Weil es Variationen bei den mechanischen Eigenschaften der verschiedenen Teilen der Schafshaut gab, wurden nur Proben (vernetzt, verändert oder nicht-vernetzt) aus dem IUP/2 Probenbereich (IUP/2, J. Soc. Leather Trades' Chemists, 44, (1960)) parallel zum Rückgrat entnommen. Dehnbare Streifen (40,0 mm × 4,0 mm × 1,4 mm) wurden mit einem hantelförmigen Messer geschnitten und wurden mindestens eine Stunde in PBS bei Raumtemperatur hydratisiert. Die Dicke der Proben wurden dreifach mit einem federbeladenen Mikrometer (Mitutoyo, Tokyo, Japan) gemessen. Eine anfängliche Maßlänge von 10 mm wurde verwendet und eine Kreuzkopfgeschwindigkeit von 5 mm/Minute wurde bis zum Reißen des Testexemplars angewendet. Eine Vorbeladung von 0,05 N wurde angewendet, um das Exemplar vor der tatsächlichen Messung vorzustrecken. Die Zugfestigkeit, die Dehnung beim Einrichten, die Dehnung beim Bruch, der Niedrigbelastungsbetrag und der Hochbelastungsbetrag der Probe wurden aus fünf unabhängigen Messung berechnet.
Ergebnisse
Crosslinking. Bezugnehmend auf 1 umfasst das Diglycidylether verwendende Crosslinking von dermalem Schafskollagen (I) eine Reaktion zwischen zwei Aminresten (Lysine), wenn alkalische Bedingungen verwendet wurden (II), oder zu einer Reaktion zwischen zwei Carboxylsäurereste (Asparagin- oder Glutaminsäure), wenn das Crosslinking unter sauren Bedingungen durchgeführt wurde (III). Es könnte sein, dass nur eine Seite der BDDGE-Molekül reagiert hat, was zu einer modifizierte Amingruppe und zur Einführung einer Anhänger-Epoxidgruppe führte. Acetylierung der freien Amingruppen von (III) führt zu Struktur (IV). Es wurden während diese Reaktion keine weiteren Crosslinks gebildet.
EDC/NHS Crosslinking von (III) resultiert in zusätzlichen Crosslinks. EDC/NHS Crosslinking bringt die Aktivierung der restlichen Carboxylgruppen durch EDC mit sich, was zu einer O-Acylisoharnstof Gruppe führt. Bei Anwesenheit von NHS kann diese Gruppe in eine NHS aktivierte Carboxylsäuregruppe umgewandelt werden, die sehr reaktiv gegenüber Amingruppen unter Bildung einer Peptidbildung (Null-Länge-Crosslink) ist.
Die Schrumpfungstemperatur (T_S) und der Anteil freier Amine wurden bestimmt, um einen Hinweis über den Grad der Reaktion nach den verschiedenen Crosslinkingverfahren zu bekommen.
Tabelle 1: Anfängliche Eigenschaften
Alle vernetzte Materialien zeigen eine beträchtliche Erhöhung der Schrumpfungstemperatur (16–36°C), was darauf hinweißt, dass das Kollagen vernetzt wurde. Es ist deutlich, dass verschiedene Werte von T_S abhängig vom Crosslinkingverfahren erhalten wurden. GA-Crosslinking umfasst die Reaktion mit den freien Amingruppe, was zu einer sehr komplex Reaktion führt. BDDGE-Crosslinking führte zu einer Er höhung von T_S. in Kombination mit einer Abnahme an freien Amingruppen. Fast der gleiche Crosslinkinggrad wie GA kann erhalten werden, wenn das Crosslinking bei alkalinen Bedingungen (BD90) durchgeführt wurde. Saures Crosslinking resultierte in einer leicht niedrigeren T_S und in nur einer kleine Abnahme der Amine (12 %), was darauf hinweist, dass das Crosslinking hauptsächlich über die Carboxylgruppen auftritt.
Die Acetylierung der restlichen Amingruppen resultiert in einer tiefen Abnahme der Amine (87 % bis 33 %) und in einer leichten Abnahme der T_S. Letzlich zeigte ein zweiter Crosslinkingschritt, der ein wasserlösliches Carbodiimid (EDC) in Kombination mit NHS verwendete, eine sehr hohe T_S kombiniert mit eine gemäßigten Menge von verbliebenen Amingruppen (56 %).
DSC-Messungen der verschiedenen Materialien wurden durchgeführt, um mehr Information über den Übergang und sein Thermodynamiken als eine Funktion des Crosslinkingverfahrens zu bekommen.
Tabelle 2: Die Thermodynamik des Schrumpfungsüberganges von DSC
Tabelle 2 zeigt die kalorimetrischen Ergebnissen der nicht-vernetzten DSC-Bögen. Crosslinking wird nicht nur die T_S erhöhen, sondern wird einen engeren Übergang und eine Veränderung in der Übergangsenthalpie zeigen. Saures Crosslinking von DSC resultiert in einer symmetrisch geformten, engen Übergangsspitze, was darauf hinweist, dass die Crosslinks homogen im Material verteilt wurden.
Makroskopisches Erscheinungsbild. Es gab einige offensichtliche Unterschiede im makroskopischen Erscheinungsbild. Sie wurden in der unten stehenden Tabelle zusammengefasst.
Tabelle 3: Makroskopische Eigenschaften von (nicht) vernetztem DSC.
Diese Tabelle zeigt, dass das Crosslinking über die Carboxylgruppen (BD45) in völlig unterschiedlichen makroskopischen Eigenschaften resultierte, weiche und lockere Struktur, verglichen mit aminvernetztem Material (GA, BD90), das eine ziemlich steife, kompakte Struktur aufwies.
Die Hydrolyserate von BD45 ist wegen den hydrolytisch instabilen Esterkopplungen viel höher als die von GA und BD90. Nichtsdestotrotz verstärkt ein zweiter zusätzlicher Crosslinkingschritt von BD45 die Stabilität und erhielt die weiche und lockere Struktur.
Degradationsstudien. N-DSC wurde innerhalb von 30 Minuten in Pronase-Lösung (2) und innerhalb von 5 Stunden in einer Kollagenase-Lösung abgebaut (3). Beide Figuren zeigen die ausgezeichnete Resistenz von BD90 und BD45EN gegen enzymatischen Angriff. Diese Materialien zeigten kaum Veränderungen beim Gewicht, wenn sie in einer dieser Enzymlösungen inkubiert wurden. Dies weist darauf hin, dass das Material hoch vernetzt war, was dazu führt, dass alle Schnittstellen blockiert waren, oder, dass alle geschnittenen Fragmente immer noch mit der DSC-Matrix verbunden waren.
Das BDDGE-Crosslinking bei sauren Bedingungen (BD45) ist geringer verglichen mit dem Amin-Crosslinking, aber es zeigt immer noch interessante Eigenschaften. Wenn Amingruppen nach dem BDDGE-Crosslinking acetyliert wurden, wurden sehr niedrige Stabilitäten erhalten, sicherlich weil Modifikationen die Dreifach-Helix-Struktur (Triplehelix) destabilisierten und das Material anfälliger für enzymatischen Angriff war. G-DSC zeigt eine ziemlich dürftige Stabilität, obwohl ein normaler Grad des Crosslinkings erreicht wurde (t_Schrumpfung = 69°C; 12 Amingruppen sind übrig).
Mechanische Tests. Der Einfluss des Crosslinkings auf die abschließenden mechanischen Eigenschaften ist in Tabelle 5 abgebildet. Das Crosslinking erhöht die Zugfestigkeit und sowohl den Niedrigbelastungs- als auch den Hochbelastungsbetrag und erniedrigt die Dehnung bei Bruch und die Dehnung beim Einrichten. Ausnahmen sind die hohe Bruchdehnung von GA vernetztem DSC und die Zugfestigkeit von BD90, welche während des Crosslinkings nicht beeinträchtigt war.
Der Unterschied zwischen dem BDDGE-Crosslinking bei sauren Bedingungen (BD45) und bei alkalischen Bedingungen (BD90) wird in der 5 gezeigt. Crosslinking über Carboxylgruppen zeigte eine viel höherer Zugfestigkeit (9,39 MPa gegenüber 2,64 MPa) kombiniert mit einer höheren Dehnung bei Bruch (143 % gegenüber 85 %) für BD45. Sowohl der Niedrigbelastungs- als auch der Hochbelastungsbetrag von BD45 zeigten ebenfalls höhere Werte.
Ein zweiter Behandlungsschritt von BD45 veränderte die mechanischen Eigenschaften nicht so sehr. Wurden die restlichen Amingruppen mit HAc-NHS acetyliert, dann wurden nur die Zugfestigkeit und der Hochbelastungsbetrag erniedrigt. EDC/NHS-Crosslinking von BD45 erhielt die guten mechanischen Eigenschaften von BD45, ausgenommen einer Reduzierung (143 % auf 101 %) der Dehnung bei Bruch.
Tabelle 5: Mechanische Eigenschaften von (nicht) vernetztem DSC
Diskussion
Kollagen-basierte Biomaterialien werden häufig mit Glutaraldehyde (GA) vernetzt, um die mechanischen Eigenschaften zu steigern und um die enzymatische Resistenz zu verbessern. Die Chemie des GA-Crosslinkings ist nicht vollständig verstanden, aber es ist eindeutig, dass die Amingruppen des Kollagens während der Crosslinkingreaktion beteiligt sind, weil nach dem Crosslinking eine Abnahme der freien Lysinreste in Kombination mit einer Erhöhung der Schrumpfungstemperatur beobachtet wird. Es wird in der Literatur berichtet, dass GA vernetzte Biomaterialien zytotoxisch waren, möglicherweise abhängig von der Freisetung monomerer GA-Moleküle. GA resultiert auch in einer höheren Steifheit des Biomaterials und ruft während der Implantation eine Verkalkung hervor, die ungünstig für bioprothetische Herzklappen und vaskuläre Transplantate ist.
Um das Problem, dass die Verwendung von GA Crosslinker mit sich bringt, zu überwinden, wurden alternative Reagenzien getestet, die das Biomaterial genügend vernetzen würden, aber welche besser mechanische Eigenschaften, weniger Verkalkung und weniger Zytotoxizität zeigen.
Polyepoxidverbindungen haben während der letzten Jahre als Crosslinker an Aufmerksamkeit gewonnen. Diese Berichte zeigten, dass diese Reagenzien effektive Crosslinker sind, die in stabilisierten Biomaterialien mit guten mechanischen Eigenschaften resultieren und welche weniger Verkalkung bei in-vivo Studien zeigten.
Weil Epoxidgruppen auch zur Reaktion mit Carboxylgruppen neigen, resultierte das Crosslinking in mehr saurer Lösung in Crosslinking über die Carboxylgruppen. Bei sauren Bedingungen vernetztes DSC zeigte völlig anderen makroskopische Eigenschaften (weich, locker, flexibel) als bei alkalischen Bedingungen vernetztes DSC (steif, kompakt). Die thermale Stabilität war etwas niedriger (62°C gegenüber 67°C), aber die mechanischen Eigenschaften waren überlegen (viel höhere Zugfestigkeit und höhere Dehnung bei Bruch). Die enzymatische Resistenz gegen bakterielle Kollagenase und Pronase war jedoch niedriger. Um die günstigen makroskopischen Ei genschaften des bei sauren Bedingungen vernetzten DSC zu erhalten aber um seine enzymatische Resistenz zu verbessern, wurde ein zweiter, zusätzlicher Crosslinkingschritt (EDC/NHS) durchgeführt. Der Einfluss der Modifizierung der übrigen Amingruppen nach dem BDDGE-Crosslingingschritt wurde ebenfalls untersucht.
DSC-Crosslinking, ein wasserlösliches Carbodiimid (1-Ethyl-3-(3- demethyl aminopropyl) carbodiimid·HCl (EDC) in Kombination mit N-Hydroxysuccinimid verwendend, wurde ausgiebig untersucht. Dieses Crosslinkingverfahren umfasst die Aktivierung der Carbxylgruppen durch EDC, um O-Acylisoharnstoffgruppen zu erhalten. NHS wird diese O-Acylisoharnstoffgruppe in eine NHS aktivierte Carboxylsäuregruppe umwandeln. Crosslinking wird durch die Reaktion dieser Gruppe mit einer angrenzenden freien Amingruppe erreicht. EDC/NHS vernetztes DSC zeigte sehr gute mechanische Eigenschaften und enzymatische Resistenz. Die Modifikation der freien Amingruppe, einen NHS-Esther der Essigsäure während eines zweiten Schrittes verwendend, zeigte im Vergleich zu BD45 eine Abnahme der thermalen Stabilität und eine negative Veränderung der enzymatischen Resistenz.
Crosslinking, das GA verwendet, resultierte in einer Erhöhung von T_S (45,9°C auf 69,2°C) in Kombination mit einer Erniedrigung des Anteils von freien Amingruppen (38,3 %). Ungefähr der gleiche Grad an Crosslinking wurden erhalten, wenn BDDGE bei pH 9,0 verwendet wurde (T_S = 67,0°C und 46,5 % freie Amine). BDDGE-Crosslinking bei saurem pH bezieht Carboxylgruppen (BD45) mit ein, wie durch den hohe Prozentsatz der freien Aminn nach dem Crosslinkingprozess (87,4 %) nachgewiesen werden kann. Eine leicht niedrigere T_S wurde beobachtet (63,5°C).
Die Behandlung von BD45 mit einem NHS Ester der Essigsäure resultierte in der Modifizierung von freien Aminen, wie durch eine Abnahme des Prozentsatzes freier Amine von 87,4 % auf 33.6 % gezeigt werden kann. Die Schrumpfungstemperatur war leicht erhöht, was durch die Destabilisierung der Dreifach-Helix-Konformation der Kollagenmoleküle erklärt werden kann.
EDC/NHS-Crosslinking erhöht die T_S von 67°C auf 81°C. Diese Menge von freien Amine ist erniedrigt von 87 % auf 56,6 %, was bedeutet, dass ungefähr 30 % oder 9 Amingruppen pro 1.000 Aminosäuren reagiert haben. Dies weist darauf hin, dass zusätzliche Crosslinks gebildet wurden und dass zwei verschiedenen Typen von Brücken in der Kollagenmatrix vorhanden waren.
Die differentiellen Raster-Kalorimeter-Messungen (DSC) zeigten den Einfluss des Crosslinkingschritts auf die Übergangseigenschaften. Crosslinking im allgemeinen resultiert in einer engeren Übergangsspitze, was zeigt, dass das Material nach dem Crosslinkingverfahren homogener war. Diese Spitze war symmetrischer, was darauf hinweist, dass die Crosslinks homogen in der Kollagenmatrix verteilt waren. Crosslinking über die Carboxylgruppen zeigte eine symmetrisch-ähnliche Spitze, während Crosslinking über die Amine eine nicht-symmetrische Spitze zeigte. Dies kann darauf deuten, dass das Crosslinking über die Amine in einer weniger homogenen Verteilung der Crosslinks resultiert.
Eine zweite Behandlung (HAc-NHS oder EDC/NHS) veränderte die Übergangsspitze nicht. Saures Crosslinking führten zu einer Erhöhung der Übergangsenthalpie, was darauf deuten lässt, dass das Crosslinking zu einer besser organisierten Organisation der Kollagenmoleküle führte. Im Gegensatz dazu zeigte Amin-Crosslinking eine Senkung der Enthalpie.
BD45EN zeigte die höchste Enthalpie (19,3 Joules/Gramm), was bedeutet, dass beide Netzwerke zu einer besseren Organisation der Kollagenmoleküle beitragen.
Der Unterschied im makroskopischen Aussehen wird in Tabelle 2 präsentiert. Diese Tabelle zeigt, dass insbesondere das Crosslinking über die Amingruppen (GA, BD90) in einem steiferen Material resultiert. Die lockere und weiche Matrix, die nach dem Crosslinking bei saurem pH erhalten wurde, wurde nicht durch die zweite Behandlung beeinträchtigt. BD45 zeigte eine ziemlich niedrige hydrolytische Stabilität, was durch die Ester-Bindungen erklärt werden kann, die während des Crosslinkings gebildet wurden (Schema 1) EDC/NHS-Crosslinking verbesserte die Resistenz gegen Hydrolyse, während die Acetylierung der Amingruppen die Stabilität nicht beeinträchtigte.
Das Abbauverhalten von Kollagen-basierten Biomaterialien wird häufig durch chemisches Crosslinking kontrolliert. Die Resistenz vernetzter Materialien gegen Abbau wird oft invitro durch Verwendung von Enzymen wie Kollagenase und Pronase untersucht und wird über Änderungen des Gewichtes als einer Funktion der Verdauungszeit überwacht.
Bakterielle Kollagenase aus Clostridium histolicum ist in der Lage, innerhalb der Triple-Helix-Struktur Peptidbindungen zu spalten, und besitzt eine Spezifität für die Pro-X-Gly-Pro-Y Region, zwischen X und Gly schneidend. Diese Region wird ungefähr 40-mal in einer α-Kette gefunden. Pronase (das eine Mischung aus unspezifischen Endo- und Extoproteasen ist) aus Streptomyces grisseus besitzt die Spezifität, Bindungen an nicht spiralenförmigen Enden und Region der Matrix zu spalten Studien haben gezeigt, dass die meisten Proteasen, wie Pepsin und Trypsin, nicht in der Lage waren, die ursprüngliche Kollagenstruktur zu durchbrechen, aber sie waren in der Lage nicht-kollagene Peptide aus Tropokollagen freizusetzen. Sie können das Material am Kettenende, die sogenannten Telopeptide, abspalten. Die Pronaseverdauung führte zu ein bißchen Kürzen des spiralförmige Teils des Tropokollagens (bis zu einem Maximum von 25 %). Die Peptide, die durch die Pronase freigesetzt wurden, unterschieden sich vom Kollagen darin, dass sie weniger Glycin und Prolin und wenig oder kein Hydroxyprolin beinhalteten. Diese Peptide waren sauer und reich an Tyrosin.
Eine Kombination aus beiden Degradationstests kann eine zusätzliche Information über die Stabilität des Kollagen-basierten Materials und dem Ort der gebildeten Crosslinks liefern. 5 zeigt deutlich, dass das Crosslinking die Stabilität des Kollagen-basierten Materials erhöht, was bedeutet, dass die Schnittstellen durch die Crosslinks blockiert oder geschützt sind oder dass die gespaltenen Fragmenten durch chemische Crosslinks zusammen gehalten werden. N-DSC war innerhalb von 4 Stunden komplett abgebaut, während beim vernetzten Material immer noch etwas Material in der Lösung vorhanden war. Bemerkenswert war, dass GA vernetztes Material eine schnellere Abbaurate als das BDDGE vernetzte Material zeigte. BDDGE Crosslinking über Amine zeigte nach 24 Stunden keinen Abbau, während BD45 einen Abbau von circa 10 % zeigte. Der Destabilisierungseffekt des zweiten Modifizierungsschrittes (BD45HAc) wurde während der Kollagenaseverdauung beobachtet (20% des Material war noch vorhanden). Die Modifizierung der Amingruppen kann zu einer Blockierung oder einem Abschirmen der Schnittstellen führen, aber es scheint, dass die Kollagenase immer noch durch die Fasern dringen und die Peptidbindungen spalten kann. Von diesem Punkt kann man schließen dass das Crosslinking nicht nur zu einer Blockierung und Abschirmung der spezifischen Schnittstellen führt, sondern auch zur Bildung eines engen Netzwerkes zwischen den Fasern und den Spiralen. Die ses enge Netzwerk verhindert, dass die Matrix aufgelöst wird und hält die Fragmenten zusammen. Es mag sein, dass die mechanischen Eigenschaften abnehmen, auch wenn das verbleibenden Gewicht 100 % ist. Zusätzliches EDC/NHS Crosslinking von BD45 resultiert in einem Material, welches die gleiche überragende enzymatische Resistenz wie BD90 besitzt.
Crosslinking verbessert auch die Resistenz gegen den Pronaseabbau. N-DSC war innerhalb von 30 Minuten abgebaut. GA vernetztes DSC zeigte ein ziemlich dürftige Resistenz gegen Pronase und war innerhalb von 25 Stunden abgebaut. BD90, das fast den gleichen Crosslinkinggrad hatte, zeigte beinahe keinen Abbau innerhalb von 48 Stunden. Weil Pronase das Material mehr in den nicht-spiralförmigen Regionen der Matrix spaltet, scheint es, dass BDDGE Crosslinkes in den spiralförmigen aber auch in den nicht-spiralförmigen Regionen gebildet wurden. BD45 zeigte weniger Resistenz gegen den Abbau (35 % des ursprünglichen Gewicht war vorhanden), aber diese Resistenz war nach EDC/NHS Crosslinking verbessert. Wie erwartet, führte die HAc-NHS Modifizierung zu einer Erhöhung der Abbaurate. Die Figuren zeigen, dass der Kollagenasenabbau von Kollagen mehr oder weniger ein lineares Verhalten als Funktion der Zeit aufweist. Das bedeutet, dass ein Oberflächenabbauprozess stattgefunden hat. Pronaseverdauung zeigte während der erste Stufe eine schnellere Abbaurate, was darauf hinweist, dass mehr Abbauprozessen stattgefunden haben.
Crosslinking wird auch die mechanischen Eigenschaften des Materials beeinflussen. Ein uniaxiales Experiment kann durchgeführt werden, um die Stressbelastungskurve zu erhalten. Wie in 4 gezeigt, kann die Stressbelastungskurve in vier unterscheidbare Teile unterteilt werden. Anfänglich sind die Faserbündeln zufällig orientiert und nur kleine Stresse sind notwendig, um die Bündeln gerade zu machen (Teil I, niedriger Belastungsbetrag). Die ursprüngliche Orientierung der Faserbündeln kann als Dehnung bei Einrichtung ausgedrückt werden. Wenn mehr und mehr Bündeln straffer werden, wird eine Erhöhung des Betrages beobachtet (Teil II). Der lineare Teil der Kurve bei Hochbelastung (III) wird Hochbelastungsbetrag genannt. Bei ausreichender Spannung beginnt das Material, nachzugeben, und bricht schließlich (IV).
Das Crosslinking von DSC verbesserte die mechanischen Eigenschaften des Materials, was in Tabelle 4 gezeigt wird. Mehreren andere Artikeln zeigten, dass das Crosslinking von Aortensegeln und Rinder-Pericard in einer Erhöhung der Dehnung bei Bruch nach dem Crosslinking resultierte. Dies kann auf das Zusammenheften des Faserbündelnetzwerkes während des Crosslinkings zurückgeführt werden, das den Winkel des Gewebes der Faserbündeln erhöht, was in einer höheren Dehnung bei Einrichtung und in einer höheren Dehnung bei Bruch resultiert.
Außer GA Vernetzung, die eine Erhöhung der Dehnung bei Bruch zeigte, erniedrigten Crosslinkingprozesse die Dehnung bei Bruch. Dies kann durch die Einführung chemischer Brücken in der Matrix erklärt werden. Diese Brücken beugen vor, dass sich die Fibrillen und Fasern in Zugrichtung orientieren, was in einer niedrigeren Dehnung bei Bruch resultiert. Dies wird auch durch Vergleichen des Hochbelastungsbetrages von N-DSC (2,39 MPa) mit den Werten des vernetzten DSC (4,3 MPa–9,51 MPa) bestätigt. Dies bedeutet, dass eine höhere Kraft notwendig ist, um ein bestimmte Dehnung zu erreichen.
Wie in 5 gezeigt, wurde die Erhöhung der Zugfestigkeit (2,61 MPa bis 9,4 MPa) nach dem Crosslinking mit BDDGE bei sauren Bedingungen beobachtet. Es scheint, dass das chemische Crosslinking verhindert, dass das Material bei relativ niedriger Spannung bricht, so können mehr Fasern die Last tragen, was zu einer höheren Zugfestigkeit führt. Die beobachtete Abnahme der Dehnung bei Einrichtung kennzeichnet die Tatsache, dass das Crosslinking die anfängliche Orientierung der Fasern verhindert, wenn eine Belastung angewendet ist. Dies bedeutet wiederum, dass insbesondere das BDGGE vernetzte DSC molekularen Brücke umfasst, die zwischen den Fasern gebildet sind. Die Einführung eines Netzwerkes zwischen die Fibrillen und Fasern verursacht auch einen erhöhten Niedrigbelastungsbetrag (0,78 MPa bis 1,79–2,89 MPa).
Der Unterschied zwischen BDDGE-Crosslinking bei saueren (BD45) und alkalischen Bedingungen (BD90) ist bemerkenswert. Saures Crosslinking zeigte viel bessere Eigenschaften (höhere Dehnung bei Bruch und Zugfestigkeit). Crosslinking über die Amine führte zu einem starren Netzwerk, das einen mehr oder weniger spröden Charakter hat (niedrige Dehnung bei Bruch; 85 %). Es wurde gezeigt, dass die Anwendung eines zweiten Crosslinkingschrittes (EDC/NHS) nach dem Epoxidcrosslinking bei sauren Bedingungen (BD45EN) die günstigen mechanischen Eigenschaften erhält. Die Zugfestigkeit und die Dehnung bei Bruch nahmen etwas ab, wahrscheinlich verursacht durch die Einführung von mehr internen Spannung wegen des Null-Länge-Crosslinking, aber die mechanischen Eigenschaften blieben besser als bei BD90. Eine Modifizierung der Amine nach dem sauren Crosslinking (BD45Ac) zeigte, dass nur die Zugfestigkeit und der Hochbelastungsbetrag negativ beeinträchtigt waren. Als Fazit haben beide zusätzlichen Schritten die besseren mechanischen Eigenschaften von BD45 nicht signifikant beeinflusst.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines quervernetzten auf Kollagen basierenden Materials, das Kollagenamingruppen und Kollagencarboxylgruppen aufweist, wobei das Verfahren das Kombinieren eines funktionalisierten Epoxy quervernetzenden Agens mit dem auf Kollagen basierenden Material in einem wässrigen Medium bei einem sauren pH-Wert umfasst, um einen Teil der Kollagencarboxylgruppen mit dem funktionalisierten Epoxy quervernetzenden Agens in Reaktion zu bringen, um quervernetztes, auf Kollagen basierendes Material mit Kollagencarboxylrestgruppen herzustellen, und das Verfahren weiter einen zusätzlichen quervernetzenden Schritt umfasst, wobei Quervernetzungen zwischen zwei Aminogruppen oder zwischen einer freien Aminogruppe und einem Carboxylrest hergestellt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, das zusätzlich einen Schritt des Blockierens von zumindest einem Teil der Kollagenaminogruppen mit einem blockierenden Agens umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Schritt des Blockierens von zumindest einem Teil der Kollagenamingruppen vor dem Schritt des Kombinierens des funktionalisierten Epoxy quervernetzenden Agens mit dem auf Kollagen basierenden Material durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei das blockierende Agens ausgewählt ist aus einem acylierenden Agens, einem aminierenden Agens und einem biologischen aktiven Derivat davon.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das acylierende Agens ausgewählt ist aus N-Hydroxy Succinimidesther, einem p-Nitrophenyl-Esther, 1-Acetylimidazol und Zitrakonitischem Anhydrid.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das aminierende Agens aus einem Aldehyd und einem Keton ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das auf Kollagen basierende Material Gesamtgewebe umfasst.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, das zusätzlich einen Schritt des Aktivierens von zumindest einem Teil der Kollagencarboxylrestgruppen umfasst, um aktivierte Carboxylgruppen herzustellen, die in der Lage sind, mit Kollagenamingruppen zu reagieren.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Schritt des Aktivierens das In-Reaktion-bringen von zumindest einem Teil der Kollagencarboxylrestgruppen mit einem aktivierenden Agens umfasst, das ausgewählt ist aus Carbodiimid, einem Azid, 1,1'-Carbonyldiimidazol, N,N'-Disuccinimidylcarbonat, 2-Ethoxy-1-Ethoxycarbonyl-1,2-Dihydroquinolin und 1,2-Benzisoxazol-3-yl-Diphenylphosphat, N-Ethyl-5-Phenylisoxazolium-s'-Sulfonat und Mischungen davon.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das aktivierende Agens Carbodiimid ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Carbodiimid zumindest teilweise wasserlöslich ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Carbodiimid ausgewählt ist aus 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) Carbodiimid·HCl, Cyanamid, N,N'-Dizyklohexylcarbodiimid, N,N'-Diisopropylcarbodiimid, 1-Zyklohexyl-3-(2-Morpholinoethyl) Carbodiimid Metho-p-Toluensulfonat und Mischungen davon.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Carbodiimid 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) Carbodiimid·HCl ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 13, wobei der Schritt des Aktivierens das In-Kontakt-bringen der Kollegencarboxylrestgruppen mit einem aktivierenden Agens in Anwesenheit eines stabilisierenden Agens umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das stabilisierende Agens ausgewählt ist aus N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxybenzotriazol, N-Hydroxy-5-Norbornen-Endo-2,3-Dicarboximid, 4-Dimethylaminopyridin, den Sulfoderivaten von N-Hydroxysuccinimid und Mischungen davon.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Schritt des Aktivierens das In-Kontakt-bringen der Kollagencarboxylgruppen mit einem Carbodiimid und N-Hydroxysuccinimid umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 16, wobei der Schritt des Aktivierens das In-Kontakt-bringen der Kollagencarboxylrestgruppen mit einem aktivierenden Agens in Anwesenheit eines Spacers umfasst.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das funktionalisierte Epoxy quervernetzende Agens ein Polyolpolyglycidether ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das funktionalisierte Epoxy quervernetzende Agens ausgewählt ist aus Glycoldiglycidylether, Glyceroldiglycidylether, Glyceroltriglycidylether und Butandiglycidylther.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das funktionalisierte Epoxy quervernetzenden Agens die folgende Formel aufweist:
wobei R ein Substituent sein kann, der nicht mit dem Quervernetzungsprozess interferiert und/oder die Löslichkeit des quervernetzenden Agens in wässriger Lösung herabsetzt und n = 1–6 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei das funktionalisierte Epoxy quervernetzende Agens ausgewählt ist aus Polyglycidethylether-funktionellen Molekülen, aus Polyethylenglykol, Polypropylenglykol und Polyethylen-Propylenglykol für die das Diglycidyletherderivat durch die folgende allgemeine Formel dargestellt werden kann:
wobei x + z = 0 – 70 und y = 0 – 90 ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das funktionalisierte Epoxy quervernetzende Agens ein Polyepoxy quervernetzendes Agens ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Epoxy quervernetzende Agens ein hydrophiles Diepoxid ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der pH-Wert des wässrigen Mediums pH 4,5 bis pH 6 ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der zusätzliche quervernetzende Schritt das Reagieren der Kollagencarboxylrestgruppen mit den Kollagenamingruppen umfasst, um Nulllängen-Querverbindungen zu erzeugen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei der zusätzliche quervernetzende Schritt das Kombinieren eines Spacers mit dem quervernetzten, auf Kollagen basierenden Material mit Kollagencarboxylrestgruppen umfasst, um Quervernetzungen zwischen den Kollagenamingruppen zu erzeugen.
Bioprothetische Vorrichtung mit einem quervernetzten auf Kollagen basierenden Material, das nach einem der Ansprüche 1 bis 26 hergestellt wurde.
Bioprothetische Vorrichtung mit auf Kollagen basierendem Material, das Kollagenamingruppen und Kollagencarboxylgruppen aufweist, die in einem Teil der Kollagencarboxylgruppen mit einem funktionalisierten Epoxy quervernetzenden Agens quervernetzt sind, und das weiter zusätzliche Querverbindungen umfasst, die zwischen den zwei Amingruppen oder zwischen den freien Amingruppen und den Carboxylrestgruppen gebildet werden.
Vorrichtung nach Anspruch 28, wobei das funktionalisierte Epoxy quervernetzende Agens ein Agens wie in einem der Ansprüche 18 bis 23 definiert ist.
Auf Kollagen basierendes Material, das Kollagen amingruppen und Kollagencarboxylgruppen aufweist, die in einem Teil der Kollagencarboxylgruppen mit einem funktionalisierten Epoxy quervernetzenden Agens quervernetzt sind, und das weiter zusätzliche Querverbindungen umfasst, die zwischen den zwei Amingruppen oder zwischen den freien Amingruppen und den Carboxylrestgruppen gebildet werden.
Vorrichtung oder Material nach einem der Ansprüche 28 bis 30, wobei die zusätzlichen Querverbindungen durch Kollagencarboxylgruppen, die direkt an die Kollagenamingruppen gebunden sind, hergestellt werden.
Bioprothetische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27, 28, 29 oder 31, wobei die Vorrichtung eine Herzklappe ist.