DE69829287T2

DE69829287T2 - Verbesserung der verabreichung der nukleinsäure in zellen der plurizellulären eukaryotischen organismen und kombination zur durchführung des verfahrens

Info

Publication number: DE69829287T2
Application number: DE69829287T
Authority: DE
Inventors: Michel Bureau; Lluis Mir; Daniel Scherman
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Gustave Roussy (IGR)
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Gustave Roussy (IGR)
Priority date: 1997-06-30
Filing date: 1998-06-30
Publication date: 2006-04-13
Anticipated expiration: 2018-07-01
Also published as: CZ475499A3; KR20010020570A; NO996541D0; CZ299638B6; DE69829287D1; EP0991425A1; JP4664450B2; US6528315B2; EP0991425B1; PL337584A1; CN1261808A; HUP0004728A3; NO996541L; ATE290403T1; BR9810372A; AU8444698A; NO327499B1; IL133708A0; CA2294802A1; HUP0004728A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine sehr bemerkenswerte Verbesserung des in vivo-Transfers von Nukleinsäuren in die Zellen von mehrzelligen eukaryotischen Organismen oder von Nukleinsäuren, die mit Produkten assoziiert sind, die es erlauben, die Ausbeute solcher Transfere zu erhöhen, unter Verwendung von schwachen elektrischen Feldern zwischen 1 und 600 V/cm, und auf die Kombination einer Nukleinsäure und des Transferverfahrens gemäß der Erfindung für deren Verwendung in der Gentherapie.
Der Transfer von Genen in eine gegebene Zelle ist die Grundlage der Gentherapie. Indessen besteht eines der Probleme darin, dahin zu gelangen, eine ausreichende Nukleinsäuremenge in Zellen des zu behandelnden Wirts eindringen zu lassen; tatsächlich muss diese Nukleinsäure, im Allgemeinen ein Gen von Interesse, in transfizierten Zellen exprimiert werden. Einer der in dieser Hinsicht herangezogenen Ansätze bestand in der Integration der Nukleinsäure in virale Vektoren, insbesondere in Retroviren, Adenoviren oder mit Adenoviren assoziierte Viren. Diese Systeme nutzen die von den Viren entwickelten Mechanismen für das Eindringen in Zellen aus wie auch deren Schutz gegen den Abbau. Indessen weist dieser Ansatz Nachteile auf und insbesondere ein Risiko einer Produktion von infektiösen Viruspartikeln, die in der Lage sind, sich in dem Wirtsorganismus zu verbreiten und, im Falle der retroviralen Vektoren, ein Risiko einer Insertionsmutagenese. Außerdem bleibt das Insertionsvermögen eines therapeutischen oder zu Impfzwecken verwendeten Gens in ein Virusgenom begrenzt.
In jedem Fall bedingt die Entwicklung von viralen Vektoren, die im Rahmen einer Gentherapie einsetzbar sind, auf komplexe Techniken von defekten Viren und von Komplementationszelllinien zurückzugreifen.
Ein anderer Ansatz (Wolf et al., Science 247, 1465–68, 1990; Davis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 7213–18, 1996) bestand folglich darin, in den Muskel oder in den Blutkreislauf eine Nukleinsäure von Plasmid-Natur zu verabreichen, welche assoziiert oder nicht assoziiert ist mit Verbindungen, welche dazu bestimmt sind, deren Einführung durch Transfektion zu begünstigen, wie Proteinen, Liposomen, geladenen Lipiden oder kationischen Polymeren, wie Polyethylenimin, die in vitro gute Transfektionsmittel sind (Behr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982–6, 1989; Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413–7, 1987; Boussif et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7297–301, 1995).
Was den Muskel betrifft, haben seit der anfänglichen Veröffentlichung von J. A. Wolff et al., welche das Vermögen des Muskelgewebes, in Form von freiem Plasmid injizierte DNA zu inkorpo rieren, gezeigt hat (Wolff et al., Science 247, 1465–1468, 1990), zahlreiche Autoren versucht, dieses Verfahren zu verbessern (Manthorpe et al., 1993, Human Gene Ther. 4, 419–431; Wolff et al., 1991, BioTechniques 11, 474–485). Aus diesen Versuchen ergeben sich einige Tendenzen, wie insbesondere:

• die Verwendung von mechanischen Lösungen, um den Eintritt der DNA in die Zellen zu erzwingen, indem die DNA auf Kugeln adsorbiert wird, die dann auf die Gewebe geschossen werden („gene gun") (Sanders Williams et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2726–2730; Fynan et al., 1993, BioTechniques 11, 474–485). Diese Verfahren haben sich bei Impfstrategien als wirksam erwiesen, erreichen aber lediglich die oberflächlichen Schichten der Gewebe. Im Falle des Muskels würde deren Verwendung einen chirurgischen Zugang erforderlich machen, um zu ermöglichen, zu dem Muskel zu gelangen, denn die Partikel durchdringen die kutanen Gewebe nicht;
• die Injektion von DNA nicht mehr in Form von freiem Plasmid, sondern assoziiert mit Molekülen, die in der Lage sind, als Vehikel zu dienen, welches den Eintritt der Komplexe in die Zellen erleichtert. Die kationischen Lipide, die in zahlreichen anderen Transfektionsverfahren eingesetzt werden, erweisen sich bis heute als enttäuschend, denn jene, die getestet wurden, haben sich als Inhibitoren der Transfektion erwiesen (Schwartz et al., 1996, Gene Ther. 3, 405–411). Das gleiche gilt für die kationischen Peptide und Polymere (Manthorpe et al., 1993, Human Gene Ther. 4, 419–431). Der einzige Fall einer vorteilhaften Kombination scheint die Mischung von Polyvinylalkohol oder Polyvinylpyrrolidon mit der DNA zu sein. Die Erhöhung, die aus diesen Kombinationen resultiert, stellt lediglich einen Faktor unter 10 dar bezogen auf die nackt injizierte DNA (Mumper et al., 1996, Pharmaceutical Research 13, 701–709);
• die Vorbehandlung des Gewebes, in welches die Injektion vorzunehmen ist, mit Lösungen, die dazu bestimmt sind, die Diffusion und/oder die Stabilität der DNA zu verbessern (Davis et al., 1993, Hum. Gene Ther. 4., 151–159) oder den Eintritt der Nukleinsäuren zu begünstigen, beispielsweise die Induktion von Phänomenen einer Vermehrung oder Regeneration von Zellen. Die Behandlungen haben insbesondere die Verwendung von Lokalanästhetika oder von Cardiotoxin, von Vasokonstriktoren, Endotoxin oder von anderen Molekülen betroffen (Manthorpe et al., 1993, Human Gene Ther. 4, 419–431; Danko et al., 1994, Gene Ther. 1, 114–121; Vitadello et al., 1994, Hum. Gene Ther. 5, 11–18). Diese Vorbehandlungsprotokolle sind schwierig auszuführen, wobei Bupivacain, um wirksam zu sein, insbesondere erfordert, in Dosen injiziert zu werden, die sehr nahe an den letalen Dosen sind. Die vorab erfolgende Injektion von hyperosmotischer Saccharose, welche dazu bestimmt ist, die Diffusion zu verbessern, erhöht das Niveau der Transfektion in den Muskel nicht (Davis et al., 1993).

Andere Gewebe wurden in vivo entweder unter Verwendung von Plasmid-DNA allein oder in Kombination mit synthetischen Vektoren transfiziert (in einer Übersicht zusammengefasst von Cotten und Wagner (1994), Current Opinion in Biotechnology 4, 705; Gao und Huang (1995), Gene Therapy, 2, 710; Ledley (1995), Human Gene Therapy 6, 1129). Die hauptsächlichen untersuchten Gewebe waren die Leber, das respiratorische Flimmerepithel, die Gefäßwand, das Zentralnervensystem und Tumore. In allen diesen Geweben haben sich die Expressionsniveaus der Transgene als zu gering erwiesen, um eine therapeutische Anwendung ins Auge zu fassen (beispielsweise auf dem Niveau der Leber: Chao et al. (1996) Human Gene Therapy 7, 901), obgleich bestimmte ermutigende Ergebnisse unlängst für den Transfer von Plasmid-DNA in die Gefäßwand präsentiert worden sind (lires et al. (1996) Human Gene Therapy 7, 959 und 989). Im Gehirn ist die Transferwirksamkeit sehr gering, ebenso wie bei den Tumoren (Schwartz et al., 1996, Gene Therapy 3, 405; Lu et al., 1994, Cancer Gene Therapy 1, 245; Son et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12669).
Die Elektroporation oder die Verwendung von elektrischen Feldern, um Zellen zu permeabilisieren, wird gleichfalls in vitro eingesetzt, um die Einführung von DNA in Zellen in Kultur durch Transfektion zu begünstigen. Gleichwohl wurde bis heute angenommen, dass dieses Phänomen einem Effekt entspricht, welcher von einem Schwellenwert abhängt, und dass diese Elektropermeabilisierung lediglich bei elektrischen Feldern mit einer relativen hohen Intensität, in der Größenordnung von 800 bis 1200 Volt/cm für tierische Zellen, beobachtet werden kann. Diese Technik war gleichfalls vorgeschlagen worden, um in vivo die Wirksamkeit von Antitumormitteln, wie Bleomycin, bei soliden Tumoren beim Menschen zu verbessern (amerikanisches Patent Nr. 5 468 228, L. M. Mir). Mit Impulsen von sehr kurzer Dauer (100 Mikrosekunden) sind diese elektrischen Bedingungen (800 bis 1200 Volt/cm) sehr gut für den intrazellulären Transfer von kleinen Molekülen angepasst. Diese Bedingungen (Impulse von 100 Mikrosekunden) wurden ohne Verbesserung für den Transfer von Nukleinsäuren in vivo in die Leber eingesetzt, wo sich Felder unter 1000 Volt/cm als vollständig unwirksam und sogar als inhibitorisch bezogen auf die Injektion von DNA in Abwesenheit von elektrischen Impulsen erwiesen haben (Patent WO 97/07826 und Heller et al., FEBS Letters, 389, 225–8, 1996).
Das Dokument Nishi et al. (Band 56, Cancer Res., 1996, Seiten 1050–1055) beschreibt, dass in dem beschriebenen Experiment die Anwendung des elektrischen Felds vor der Verabreichung des Plasmid-Vektors an die Tumorzelle ausgeführt wird. Nishi et al. präzisieren, dass gemäß den früheren Daten die Aufnahme durch die Membranporen hindurch durch die Zellen, welche der Elektroporation unterzogen worden sind, nicht beeinflusst wird durch die Tatsache, dass die Moleküle (Nukleinsäure) während oder nach dem Elektroporationsimpuls anwesend sind (siehe Seite 1051, linke Spalte, Abs. 2, Zeilen 19 bis 22).
Diese Technik weist überdies Anwendungsschwierigkeiten in vivo auf, denn die Verabreichung eines Felds einer solchen Intensität kann mehr oder weniger ausgedehnte Gewebeläsionen hervorrufen, die bei der Behandlung von Krebspatienten kein Problem darstellen, die aber einen Hauptnachteil für das gesunde Individuum oder für den kranken Patienten darstellen können, wenn die Nukleinsäure in andere Gewebe als die Tumorgewebe verabreicht wird.
Während alle zitierten Untersuchungen die Notwendigkeit von hohen elektrischen Feldern in der Größenordnung von 1000 Volt/cm erwähnen, um in vivo wirksam zu sein, haben die Anmelder wahrhaft unerwartet und bemerkenswert jetzt gezeigt, dass der Transfer von Nukleinsäuren in Gewebe in vivo sehr bedeutend ohne unerwünschte Wirkungen erhöht werden kann, indem das Gewebe elektrischen Impulsen geringer Intensität, beispielsweise von 100 oder von 200 Volt/cm, und einer relativ langen Dauer unterworfen wird. Außerdem haben die Anmelder festgestellt, dass die große Variabilität der Expression des Transgens, die im Stand der Technik des DNA-Transfers beobachtet wurde, durch das erfindungsgemäße Verfahren bemerkenswert verringert wird.
Aus diesem Grund betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Transfer von Nukleinsäuren in vivo, in welchem die Zellen der Gewebe mit der zu transferierenden Nukleinsäure in Kontakt gebracht werden durch direkte Verabreichung in das Gewebe oder durch topische oder systemische Verabreichung und in welchem der Transfer durch die Anwendung von einem oder mehreren elektrischen Impulsen mit einer Intensität zwischen 1 und 600 Volt/cm eingeschlossen sichergestellt wird.
Gemäß einem bevorzugten Modus findet das erfindungsgemäße Verfahren Anwendung auf Gewebe, deren Zellen besondere Geometrien haben, wie beispielsweise Zellen von großer Größe und/oder von länglicher Form und/oder welche von Natur aus auf elektrische Aktionspotentiale ansprechen und/oder eine spezifische Morphologie aufweisen.
Die Intensität des Felds liegt vorzugsweise zwischen 200 und 600 Volt/cm und die gesamte Dauer der Anwendung liegt über 10 Millisekunden. Die Anzahl von eingesetzten Impulsen beträgt beispielsweise 1 bis 100000 Impulse und die Frequenz der Impulse liegt zwischen 0,1 und 1000 Hertz. Die Frequenz der Impulse liegt vorzugsweise zwischen 0,2 und 100 Hertz. Die Impulse können auch auf unregelmäßige Weise abgegeben werden und die Funktion, die die Intensität des Felds in Abhängigkeit von der Zeit beschreibt, kann variabel sein. Als Beispiel kann das abgegebene elektrische Feld aus der Kombination von wenigstens einem Feld mit einer Intensität von > 400 Volt/cm und vorzugsweise zwischen 500 und 800 Volt/cm eingeschlossen mit einer kurzen unitären Dauer (< 1 ms), gefolgt von einem oder mehreren Impulsen von gerin gerer Intensität, beispielsweise < 400 Volt/cm und vorzugsweise < 200 Volt/cm, und von längerer unitärer Dauer (> 1 ms), resultieren. Das Integral der Funktion, welche die Variation des elektrischen Felds mit der Zeit beschreibt, liegt über 1 kV·ms/cm. Gemäß einem bevorzugten Modus der Erfindung liegt dieses Integral über oder bei 5 kV·ms/cm.
Gemäß einem bevorzugten Modus der Erfindung beträgt die Intensität des Felds bzw. die Feldstärke der Impulse ungefähr 500 Volt/cm (d.h. ±10% und vorzugsweise ±5%).
Die elektrischen Impulse werden aus den Impulsen mit Rechteckwellen, den elektrischen Feldern, welche Wellen mit exponentieller Abnahme, unipolare oszillierende Wellen von begrenzter Dauer, bipolare oszillierende Wellen von begrenzter Dauer oder andere Wellenformen erzeugen, ausgewählt. Gemäß einem bevorzugten Modus der Erfindung sind die elektrischen Impulse Impulse mit Rechteckwellen.
Die Verabreichung von elektrischen Impulsen kann durch eine jegliche Methode, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt ist, erfolgen, beispielsweise:

• System von externen Elektroden, welche auf beiden Seiten des zu behandelnden Gewebes angeordnet sind, insbesondere nicht-invasive Elektroden, die in Kontakt mit der Haut angeordnet sind,
• System von Elektroden, die in die Gewebe implantiert werden,
• System von Elektroden/Injektor, welche die gleichzeitige Verabreichung der Nukleinsäuren und des elektrischen Felds erlauben.

Im Rahmen der Erfindung müssen die Ausdrücke Transfer von DNA oder von Nukleinsäuren durch Anwendung von einem oder mehreren elektrischen Impulsen wie auch die Begriffe Elektrotransfer oder ferner Elektrotransfektion als äquivalent angesehen werden und bezeichnen den Transfer von Nukleinsäuren oder von DNA durch Anwendung oder in Anwesenheit eines elektrischen Felds.
Da die Verabreichung in vivo gefolgt, ist es manchmal notwendig, auf intermediäre Produkte zurückzugreifen, welche die elektrische Kontinuität bzw. den Stromfluss mit externen, nicht-invasiven Elektroden sicherstellen. Es wird sich beispielsweise um einen Elektrolyt in Form eines Gels handeln.
Die Nukleinsäuren können durch ein jegliches geeignetes Mittel verabreicht werden, werden aber vorzugsweise in vivo direkt in die Gewebe injiziert oder durch einen anderen, lokalen oder systemischen Weg und insbesondere mittels eines Katheters, welcher diese am Ort der An wendung des elektrischen Felds verfügbar macht, verabreicht. Die Nukleinsäuren können mit Mitteln verabreicht werden, welche den Transfer erlauben oder erleichtern, wie dies zuvor erwähnt worden ist. Insbesondere können diese Nukleinsäuren frei in Lösung oder mit synthetischen Mitteln assoziiert vorliegen oder in viralen Vektoren enthalten sein. Die synthetischen Mittel können Lipide oder Polymere, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, oder selbstverständlich ein zielgerichtetes Ansteuern des Wirkorts vermittelnde Elemente oder „Targeting"-Elemente, welche die Fixierung an der Membran der Zielgewebe erlauben, sein. Unter diesen Elementen kann man Vektoren aufführen, die Zucker, Peptide, Antikörper oder Hormonrezeptoren tragen.
Es versteht sich, dass unter diesen Bedingungen der Erfindung der Verabreichung der Nukleinsäuren die Anwendung der elektrischen Felder vorangehen, diese gleichzeitig erfolgen oder sogar folgen kann.
Aus diesem Grunde hat die Erfindung gleichfalls eine Nukleinsäure und ein ein elektrisches Feld mit einer Intensität zwischen 1 und 600 Volt/cm erzeugendes System als Kombinationsprodukt für deren gleichzeitige, getrennte und mit der Zeit gestaffelte Verabreichung an die Zellen von Säugetieren und insbesondere an humane Zellen in vivo zum Gegenstand. Die Intensität des Felds liegt vorzugsweise zwischen 200 und 600 Volt/cm und noch mehr bevorzugt liegt die Intensität des Felds bei ungefähr 500 Volt/cm.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist im Rahmen der Gentherapie, d.h. der Therapie, bei welcher die Expression eines transferierten Gens, aber gleichfalls die Modulation oder die Blockierung eines Gens erlaubt, die Behandlung einer bestimmten Pathologie sicherzustellen, einsetzbar.
Die Zellen der Gewebe werden vorzugsweise mit dem Ziel einer Gentherapie behandelt, welche erlaubt:

• entweder die Korrektur von Fehlfunktionen der Zellen selbst (beispielsweise für die Behandlung von mit genetischen Defekten verbundenen Erkrankungen, wie beispielsweise der Mukoviszidose),
• oder den Schutz und/oder die Regeneration der Vaskularisation oder der Innervation der Gewebe oder Organe durch tropische, neurotrophische und angiogenetische Faktoren, die durch das Transgen produziert werden,
• oder die Umwandlung des Gewebes in ein Organ, welches Produkte sekretiert, die zu einer therapeutischen Wirkung führen, wie das Produkt des Gens selbst (beispielsweise Regulations faktoren von Thrombosen oder der Hämostase, trophische Faktoren, Hormone) oder wie ein in dem Gewebe dank der Hinzufügung des therapeutischen Gens synthetisierter Metabolit,
• oder eine Impfanwendung oder immunstimulierende Anwendung.

Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist die Kombination der elektrischen Impulse eines Felds mit die Nukleinsäuren enthaltenden Zusammensetzungen, welche formuliert sind in Hinblick auf eine jegliche Verabreichung, welche erlaubt, zu dem Gewebe Zugang zu erhalten, auf topischem, kutanem, oralem, vaginalem, parenteralem, intranasalem, intravenösem, intramuskulärem, subkutanem, intraokularem, transdermalem u.s.w. Wege. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung enthalten vorzugsweise ein pharmazeutisch annehmbares Vehikel für eine injizierbare Formulierung, insbesondere für eine direkte Injektion auf der Ebene des gewünschten Organs, oder für eine jegliche andere Verabreichung. Es kann sich insbesondere um sterile, isotonische Lösungen oder um trockene, insbesondere lyophilisierte Zusammensetzungen handeln, die je nach Fall durch Hinzufügung von sterilisiertem Wasser oder von physiologischer Kochsalzlösung die Herstellung von injizierbaren Lösungen erlauben. Die für die Injektion eingesetzten Nukleinsäuredosen wie auch die Anzahl von Verabreichungen und das Volumen der Injektionen können abhängig von verschiedenen Parametern und insbesondere abhängig von der eingesetzten Verabreichungsweise, der betroffenen Pathologie, dem zu exprimierenden Gen oder ferner von der angestrebten Behandlungsdauer, angepasst werden.
Die Nukleinsäuren können synthetischen oder biosynthetischen Ursprungs sein oder aus einem Virus oder aus prokaryotischen Zellen oder aus eukaryotischen Zellen, die aus einzelligen (beispielsweise Hefen) oder mehrzelligen Organismen stammen, extrahiert sein. Sie können in Kombination mit der Gesamtheit oder einem Teil der Bestandteile des Herkunftsorganismus und/oder des Synthesesystems verabreicht werden.
Die Nukleinsäure kann eine Desoxyribonukleinsäure oder eine Ribonukleinsäure sein. Es kann sich um Sequenzen natürlicher oder künstlicher Herkunft und insbesondere um genomische DNA, cDNA, mRNA, tRNA und rRNA, hybride Sequenzen oder synthetische oder halbsynthetische Sequenzen von modifizierten oder nicht-modifizierten Oligonukleotiden handeln. Diese Nukleinsäuren können durch eine jegliche dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannte Technik erhalten werden und insbesondere durch Screening von Banken, durch chemische Synthese oder ferner durch gemischte Verfahren, welche die chemische oder enzymatische Modifizierung von Sequenzen, die durch ein Screening von Banken erhalten worden sind, umfassen. Sie können chemisch modifiziert sein.
Insbesondere kann die Nukleinsäure eine Sinn- oder Antisinn-DNA oder -RNA oder eine DNA oder RNA mit katalytischer Eigenschaft, wie ein Ribozym sein. Unter „Antisinn" versteht man eine Nukleinsäure mit einer Sequenz, die zu einer Zielsequenz komplementär ist, beispielsweise zu einer mRNA-Sequenz, deren Expression man durch Hybridisierung mit der Zielsequenz zu blockieren wünscht. Unter „Sinn" versteht man eine Nukleinsäure mit einer Sequenz, welche zu einer Zielsequenz homolog oder identisch ist, beispielsweise einer Sequenz, die an einen proteinartigen und an der Expression eines gegebenen Gens beteiligten Transkriptionsfaktor bindet. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsweise umfasst die Nukleinsäure ein Gen von Interesse und Elemente, die die Expression des Gens von Interesse erlauben. Vorteilhafterweise liegt das Nukleinsäurefragment in Form eines Plasmids vor.
Die Desoxyribonukleinsäuren können einzel- oder doppelsträngig sein ebenso wie kurze Oligonukleotide oder längere Sequenzen. Sie können therapeutische Gene, die Transkription oder die Replikation regulierende Sequenzen oder Bindungsregionen für andere zelluläre Bestandteile u.s.w. enthalten. Im Sinne der Erfindung versteht man unter „therapeutischem Gen" insbesondere ein jegliches Gen, welches eine RNA oder ein Proteinprodukt mit einer therapeutischen Wirkung kodiert. Das kodierte proteinartige Produkt kann ein Protein, ein Peptid u.s.w. sein. Dieses proteinartige Produkt kann gegenüber der Zielzelle homolog sein (d.h. ein Produkt, welches normalerweise in der Zielzelle exprimiert wird, wenn jene keinerlei Pathologie aufweist). In diesem Falle erlaubt die Expression des Transgens beispielsweise, eine unzureichende Expression in der Zelle oder die Expression eines aufgrund einer Modifikation inaktiven oder schwach aktiven Proteins zu beheben, oder erlaubt ferner, das Protein überzuexprimieren. Das therapeutische Gen kann auch eine Mutante eines zellulären Proteins mit einer erhöhten Stabilität, einer modifizierten Aktivität u.s.w. kodieren. Das proteinartige Produkt kann gleichfalls gegenüber der Zielzelle heterolog sein. In diesem Falle kann ein exprimiertes Protein beispielsweise eine in der Zelle defiziente Aktivität vervollständigen oder beitragen (Behandlung von enzymatischen Defizienzen) oder erlauben, eine Pathologie zu bekämpfen, oder eine Immunantwort stimulieren, beispielsweise für die Behandlung von Tumoren. Es kann sich um ein Suizidgen (Thymidinkinase des Herpes-Virus) für die Behandlung von Krebserkrankung oder der Restenose handeln.
Unter den therapeutischen Produkten im Sinne der Erfindung kann man insbesondere die Gene aufführen, die kodieren für:

– die Enzyme, wie α-1-Antitrypsin, die Proteinasen (Metalloproteinasen, Urokinase, uPA, tPA, ... Streptokinase), die Proteasen, welche Vorstufen spalten, um aktive Produkte freizusetzen (ACE, ICE ...) oder deren Antagonisten (TIMP-1, Gewebeplasminogenaktivatorinhibitor, PAI, TFPI,
– die Blutderivate, wie die an der Gerinnung beteiligten Faktoren: die Faktoren VII, VIII, IX, die Komplementfaktoren, Thrombin,
– die Hormone oder die Enzyme, die an dem Syntheseweg der Hormone beteiligt sind, oder die Faktoren, die an der Kontrolle der Synthese oder der Exkretion oder der Sekretion der Hormone beteiligt sind, wie Insulin, die Insulin nahe stehenden Faktoren (IGF), oder Wachstumshormon, ACTH, die Enzyme der Synthese der Geschlechtshormone,
– die Lymphokine und Zytokine: Interleukine, Chemokine (CXC und CC), Interferone, TNF, TGF, chemotaktische oder aktivierende Faktoren, wie MIF, MAF, PAF, MCP-1, Eotaxin, LIF u.s.w. (französisches Patent Nr. 92 03120),
– die Wachstumsfaktoren, beispielsweise die IGF, EGF, FGF, KGF, NGF, PDGF, PIGF, HGF, Proliferin,
– die angiogenetischen Faktoren, wie die VEGF oder FGF, Angiopoietin 1 oder 2, Endothelin,
– die Enzyme der Synthese von Neurotransmittem,
– die trophischen, insbesondere neurotrophischen Faktoren, für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, Traumata mit einer Schädigung des Nervensystems oder Retinadegenerationen, wie die Mitglieder der Familie der Neurotrophine, wie NGF, BDNF, NT3, NT4/5, NT6, deren Derivate und verwandte Gene – die Mitglieder der Familien des CNTF, wie CNTF, Axokin, LIF und deren Derivate -IL-6 und dessen Derivate – Cardiotrophin und dessen Derivate – GDNF und dessen Derivate – die Mitglieder der Familie der IGF, wie IGF-1, IFGF-2 und deren Derivate,
– die Mitglieder der FGF-Familie, wie FGF 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 und deren Derivate, TGFβ,
– die Knochenwachstumsfaktoren,
– die hämopoetischen Faktoren, wie Erythropoietin, die GM-CSF, M-CSF, LIF u.s.w.,
– die Proteine der zellulären Architektur, wie Dystrophin oder ein Minidystrophin (französisches Patent Nr. 91 11947), die Suizidgene (Thymidinkinase, Cytosindesaminase, Enzyme mit Zytochrom P450), die Gene von Hämoglobin oder anderen proteinartigen Transportmolekülen,
– die Gene, welche den Proteinen, die an dem Stoffwechsel der Lipide beteiligt sind, vom Typ Apolipoprotein, ausgewählt unter den Apolipoproteinen A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J und apo(a), entsprechen, die Enzyme des Stoffwechsels, wie beispielsweise die Lipasen, die Lipoproteinlipase, die hepatische Lipase, die Lecithincholesterolacyltransferase, die 7-alpha-Cholesterolhydroxylase, die saure Phosphatidylphosphatase oder ferner Transferproteine von Lipiden, wie das Transferprotein der Cholesterolester und das Transferprotein der Phospholipide, ein Bindungsprotein der HDL oder ferner ein Rezeptor, welcher beispielsweise unter den Rezeptoren der LDL, den Rezeptoren der „Chylomikronen-Remnants" und den Scavenger-Rezeptoren u.s.w. ausgewählt wird. Man kann außerdem Leptin für die Behandlung von Obesität hinzufügen,
– die Faktoren, welche den Blutdruck regulieren, wie die an dem NO-Stoffwechsel beteiligten Enzyme, Angiotensin, Bradykinin, Vasopressin, ACE, Renin, die Enzyme, welche die Mechanismen der Synthese oder der Verlängerung der Prostaglandine, von Thromboxan oder von Adenosin kodieren, die Rezeptoren von Adenosin, die Kallikreine und Kallistatine, ANP, ANF, die diuretischen oder antidiuretischen Faktoren, die an der Synthese, dem Stoffwechsel oder der Verlängerung von Vermittlersubstanzen, wie Histamin, beteiligten Faktoren, Serotonin, die Katecholamine, die Neuropeptide,
– die anti-angiogenetischen Faktoren, wie der Ligand von Tie-1 und von Tie-2, Angiostatin, der Faktor ATF, die Derivate von Plasminogen, Endothelin, die Thrombospondine 1 und 2, PF-4, Interferon α oder β, Interleukin 12, TNFα, der Rezeptor der Urokinase, flt1, KDR, PAI1, PAI2, TIMP1, das Prolactin-Fragment,
– die Faktoren, welche gegen Apoptose schützen, wie die AKT-Familie,
– die Proteine, die in der Lage sind, einen Zelltod zu induzieren, welche entweder aus sich selbst heraus aktiv sind, wie die Caspasen, oder vom Typ „pro-drug", welche eine Aktivierung durch andere Faktoren erfordern, oder die Proteine, welche „pro-drugs" zu einem Mittel, welches einen Zelltod hervorruft, aktivieren, wie die Thymidinkinase des Herpes-Virus, die Desaminase, was insbesondere erlaubt, Antikrebs-Therapien ins Auge zu fassen,
– die Proteine, die an den interzellulären Kontakten und der interzellulären Adhäsion beteiligt sind: VCAM, PECAM, ELAM, ICAM, Integrine, Cathenine,
– die Proteine der extrazellulären Matrix,
– die an der Wanderung der Zellen beteiligten Proteine,
– die Proteine vom Signaltransduktionstyp, vom Typ FAK, MEKK, p38-Kinase, Tyrosinkinasen, Serin-Threonin-Kinasen,
– die Proteine, welche an der Regulation des Zellzyklus beteiligt sind (p21, p16, Cycline ...) wie auch die mutierten oder abgeleiteten negativen dominanten Derivate, welche den Zellzyklus blockieren und gegebenenfalls die Apoptose induzieren können,
– die Transkriptionsfaktoren: jun, fos, AP1, p53 ... und die Proteine der p53-Signalisierungskaskade,
– die Zellstrukturproteine, wie die intermediären Filamente (Vimentin, Desmin, Keratine), Dystrophin, die an der muskulären Kontraktionsfähigkeit und der Kontrolle der muskulären Kontraktionsfähigkeit beteiligten Proteine, insbesondere die am Calciumstoffwechsel und dem Fluss von Calcium in die Zellen beteiligten Proteine (SERCA, ... ).

In dem Falle von Proteinen, welche durch Liganden-Rezeptoren-Systeme ihre Funktion entfalten, kann ins Auge gefasst werden, den Liganden oder den Rezeptor zu verwenden (z.B. FGF-R, VEGF-R, ...). Man kann gleichfalls Gene aufführen, die Fragmente oder Mutanten von Proteinen von Liganden oder von Rezeptoren, insbesondere der vorerwähnten Proteine, kodieren, welche entweder eine höhere Aktivität als das vollständige Protein oder eine Antagonisten-Aktivität, ja sogar vom Typ „dominant negativ" bezogen auf das Ausgangsprotein aufweisen (beispielsweise Fragmente von Rezeptoren, welche die Verfügbarkeit von zirkulierenden Proteinen hemmen, assoziiert oder nicht-assoziiert mit Sequenzen, welche eine Sekretion dieser Fragmente induzieren gegenüber einer Verankerung in der Zellmembran, oder von anderen Modifizierungssystemen des intrazellulären Verkehrs von diesen Ligand-Rezeptor-Systemen derart, dass die Vertügbarkeit von einem der Elemente unterbunden wird) oder welche sogar eine eigene Aktivität aufweisen, welche sich von jener des gesamten Proteins unterscheidet (z.B. ATF).
Unter den anderen Proteinen oder Peptiden, welche durch das Gewebe sekretiert werden können, ist es wichtig, die Antikörper, die variablen Antikörper-Einzelkettenfragmente (ScFv) oder ein jegliches anderes Antikörperfragment, welche Fähigkeiten einer Erkennung aufweisen, für deren Verwendung in der Immuntherapie, beispielsweise für die Behandlung von Infektionskrankheiten, Tumoren, Autoimmunerkrankungen, wie multiple Sklerose (Antiidiotyp-Antikörper) wie auch die ScFv, welche an die proinflammatorischen Zytokine, wie beispielsweise IL1 und TNFα, binden, für die Behandlung von rheumatoider Arthritis zu unterstreichen. Andere Proteine von Interesse sind, nicht einschränkend, lösliche Rezeptoren, wie beispielsweise der lösliche CD4-Rezeptor oder der lösliche TNF-Rezeptor für die anti-HIV-Therapie, der TNFα-Rezeptor oder der lösliche IL1-Rezeptor für die Behandlung von rheumatoider Arthritis, der lösliche Acetylcholin-Rezeptor für die Behandlung von Myasthenie; Peptid-Substrate oder -Inhibitoren von Enzymen oder ebenso Peptid-Agonisten oder -Antagonisten von Rezeptoren oder von Adhäsionsproteinen, wie beispielsweise für die Behandlung von Asthma, Thrombosen, Restenose, Metastasen oder von Entzündungen; künstliche, chimäre oder verkürzte Proteine. Unter den Hormonen von essentiellem Interesse kann man Insulin im Falle von Diabetes, Wachstumshormon und Calcitonin aufführen. Ferner kann man Proteine aufführen, die in der Lage sind, eine Antitumor-Immunität zu induzieren oder die Immunantwort zu stimulieren (IL2, GM-CSF, IL12 u.s.w.). Schließlich kann man die Zytokine, die die T_H1-Antwort verringern, wie IL10, IL4 und IL13, aufführen.
Die zahlreichen Beispiele, die vorangehen, und jene, die folgen, veranschaulichen den potentiellen Umfang des Anwendungsgebiets der Erfindung.
Die therapeutische Nukleinsäure kann gleichfalls ein Gen oder eine Antisinn-Sequenz sein, deren Expression in der Zielzelle erlaubt, die Expression von Genen oder die Transkription von zellulären mRNAs zu kontrollieren. Solche Sequenzen können beispielsweise in der Zielzelle in zu zellulären mRNAs komplementäre RNA transkribiert werden und so deren Translation in Proteine blockieren, gemäß der in dem europäischen Patent Nr. 140 308 beschriebenen Technik. Die therapeutischen Gene umfassen gleichfalls Sequenzen, die Ribozyme kodieren, die in der Lage sind, selektiv Ziel-RNAs zu zerstören (europäisches Patent Nr. 321 201).
Wie weiter oben angegeben, kann die Nukleinsäure gleichfalls ein oder mehrere Gene umfassen, welche ein antigenes Peptid, welches in der Lage ist, bei dem Menschen oder dem Tier eine Immunantwort zu erzeugen, kodieren. Bei dieser besonderen Ausführungsweise erlaubt die Erfindung folglich entweder die Herstellung von Impfstoffen oder die Realisierung von immuntherapeutischen Behandlungen, die auf den Menschen oder das Tier angewendet werden, insbesondere gegen Mikroorganismen, Viren oder Krebsarten. Es kann sich insbesondere um antigene Peptide, die für das Epstein-Barr-Virus, das HIV-Virus, das Hepatitis B-Virus (europäisches Patent Nr. 185 573), das Pseudo-Tollwutvirus, das „syncitia forming virus", andere Viren spezifisch sind, oder ferner um Antigene, die für Tumore spezifisch sind, wie die MAGE-Proteine (europäisches Patent Nr. 259 212), wie die Proteine MAGE 1, MAGE 2, oder Antigene, welche eine Antitumor-Antwort stimulieren können, wie bakterielle Hitzeschockproteine, handeln.
Die Nukleinsäure umfasst vorzugsweise gleichfalls Sequenzen, die die Expression des therapeutischen Gens und/oder des das antigene Peptid kodierenden Gens in dem Gewebe erlauben und/oder begünstigen. Es kann sich um Sequenzen handeln, die von Natur aus für die Expression des betreffenden Gens verantwortlich sind, wenn diese Sequenzen in der Lage sind, in der transfizierten Zelle zu funktionieren. Es kann sich gleichfalls um Sequenzen unterschiedlicher Herkunft handeln (welche für die Expression von anderen Proteinen verantwortlich sind oder sogar synthetisch sind). Es kann sich insbesondere um Promotorsequenzen von eukaryotischen oder viralen Genen handeln. Es kann sich beispielsweise um Promotorsequenzen handeln, die aus dem Genom der Zelle, die man zu transfizieren wünscht, stammen. Unter den eukaryotischen Promotoren kann man einen jeglichen Promotor oder eine jegliche abgeleitete Sequenz einsetzen, welcher) die Transkription eines Gens auf spezifische oder nicht-spezifische Weise, stark oder schwach stimuliert oder reprimiert. Es kann sich insbesondere um ubiquitäre Promotoren (HPRT, Vimentin, α-Aktin, Tubulin u.s.w.), um Promotoren von therapeutischen Genen (Typ MDR, CFTR u.s.w.), um gewebespezifische Promotoren (Typ Promotoren der Gene von Desmin, der Myosine, von Kreatinkinase, von Phosphoglyceratkinase) oder ferner um Promotoren, welche auf einen Stimulus ansprechen, wie Promotoren, die auf die natürlichen Hormone ansprechen (Rezeptor der Steroidhormone, Rezeptor der Retinsäure u.s.w.), oder einen Promotor, welcher durch Antibiotika (Tetracyclin, Rapamycin u.s.w.) reguliert wird, um Promotoren, welche auf einen Ernährungsplan oder eine Diät ansprechen, wie die auf die Fibrate/Faserstoffe ansprechenden Promotoren, oder um andere Promotoren, die auf andere Moleküle natürlicher oder synthetischer Herkunft ansprechen, handeln. Es kann sich ebenso um Promotorsequenzen handeln, die aus dem Genom eines Virus stammen. In dieser Hinsicht kann man beispielsweise die Promotoren der Gene E1A von Adenovirus, MLP oder Promotoren, die aus den Genomen der Viren CMV, RSV, SV40 u.s.w. stammen, aufführen. Es kann sich um induzierbare oder reprimierbare Promotoren handeln. Außerdem können diese Expressionssequenzen durch Hinzufügung von Aktivierungs- und/oder Regulationssequenzen, welche eine konditionelle Expression, transitorische Expression, eine gewebespezifische oder hauptsächliche Expression u.s.w. erlauben, modifiziert sein.
Außerdem kann die Nukleinsäure gleichfalls, insbesondere strangaufwärts von dem therapeutischen Gen, eine Signalsequenz aufweisen, welche das synthetisierte therapeutische Produkt in die Sekretionswege der Zielzelle dirigiert. Diese Signalsequenz kann die natürliche Signalsequenz des therapeutischen Produkts sein, es kann sich aber gleichfalls um eine jegliche andere funktionsfähige Signalsequenz oder um eine künstliche Signalsequenz handeln. Die Nukleinsäure kann gleichfalls eine Signalsequenz umfassen, die das synthetisierte therapeutische Produkt in Richtung eines besonderen Kompartiments der Zelle, wie beispielsweise die Peroxisomen, die Lysosomen, und die Mitochondrien, dirigiert, für die Behandlung von beispielsweise genetisch-bedingten mitochondrialen Erkrankungen.
Andere Gene, für die ein Interesse besteht, sind insbesondere von McKusick, V. A. Mendelian (Inheritance in man, catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked phenotypes, 8. Auflage, John Hopkins University Press (1988)) und in Stanbury, J. B., et al. (The metabolic basis of inherited disease, 5. Auflage. McGraw-Hill (1983)) beschrieben worden. Die Gene von Interesse umfassen die Proteine, die an dem Stoffwechsel der Aminosäuren, der Lipide und anderer Bestandteile der Zelle beteiligt sind.
Man kann so auf nicht-einschränkende Weise die Gene aufführen, die mit den Erkrankungen des Stoffwechsels der Kohlenhydrate verbunden sind, wie beispielsweise Fructose-1-phosphataldolase, Fructose-1,6-diphosphatase, Glucose-6-phosphatase, lysosomale α-1,4-Glucosidase, Amylo-1,6-glucosidase, Amylo-(1,4:1,6)-transglucosidase, muskuläre Phosphorylase, muskuläre Phosphofructokinase, Phosphorylase-b-kinase, Galactose-1-phosphat-uridyltransferase, alle Enzyme des Pyruvatdehydrogenase-Komplexes, Pyruvatcarboxylase, 2-Oxoglutaratglyoxylasecarboxylase, D-Glyceratdehydrogenase.
Man kann gleichfalls aufführen:

– die mit Erkrankungen des Stoffwechsels der Aminosäuren verbundenen Gene, wie beispielsweise Phenylalaninhydroxylase, Dihydrobiopterinsynthetase, Tyrosinaminotransferase, Tyrosi nase, Histidinase, Fumarylacetoacetase, Glutathionsynthetase, γ-Glutamylcysteinsynthetase, Ornithin-δ-aminotransferase, Carbamoylphosphatsynthetase, Omithincarbamoyltransferase, Argininosuccinatsynthetase, Argininosuccinatlyase, Arginase, L-Lysindehydrogenase, L-Lysinketoglutaratreductase, Valintransaminase, Leucin-isoleucin-transaminase, Decarboxylase der 2-Ketosäuren mit verzweigter Kette, Isovaleryl-CoA-dehydrogenase, Acyl-CoA-dehydrogenase, 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA-lyase, Acetoacetyl-CoA-3-ketothiolase, Propionyl-CoA-carboxylase, Methylmalonyl-CoA-mutase, ATP:Cobalamin-adenosyltransferase, Dihydrofolatreductase, Methylentetrahydrofolatreductase, Cystathionin-β-synthetase, den Sarcosindehydrogenase-Komplex, die zu dem System der Spaltung von Glycin gehörenden Proteine, β-Alanintransaminase, Serum-Carnosinase, zerebrale Homocamosinase.
– die mit Erkrankungen des Stoffwechsels der Fette und der Fettsäuren verbundenen Gene, wie beispielsweise Lipoproteinlipase, Apolipoprotein C-II, Apolipoprotein E, andere Apolipoproteine, Lecithincholesterolacyltransferase, Rezeptor der LDL, Sterolhydroxylase aus der Leber, „Phytansäure"-α-hydroxylase,
– die mit lysosomalen Defizienzen verbundenen Gene, wie beispielsweise lysosomale α-L-Iduronidase, lysosomale Iduronatsulfatase, lysosomale Heparan-N-sulfatase, lysosomale N-Acetyl-α-D-glucosaminidase, lysosomale Acetyl-CoA:α-glucosamin-N-acetyltransferase, lysosomale N-Acetyl-α-D-glucosamin-6-sulfatase, lysosomale Galactosamin-6-sulfatsulfatase, lysosomale β-Galactosidase, lysosomale Arylsulfatase B, lysosomale β-Glucuronidase, N-Acetylglucosaminyl-phosphotransferase, lysosomale α-D-Mannosidase, lysosomale α-Neuraminidase, lysosomale Aspartylglycosaminidase, lysosomale α-L-Fucosidase, lysosomale saure Lipase, lysosomale saure Ceramidase, lysosomale Sphingomyelinase, lysosomale Glucocerebrosidase und lysosomale Galactocerebrosidase, lysosomale Galactosylceramidase, lysosomale Arylsulfatase A, α-Galactosidase A, lysosomale saure β-Galactosidase, die α-Kette von lysosomaler Hexosaminidase A.

Man kann gleichfalls, nicht einschränkend, die mit den Erkrankungen des Stoffwechsels der Steroide und der Lipide verbundenen Gene, die mit den Erkrankungen des Stoffwechsels der Purine und der Pyrimidine verbundenen Gene, die mit den Erkrankungen des Stoffwechsels des Porphyrins und des Häms verbundenen Gene, die mit den Erkrankungen des Stoffwechsels des Bindegewebes, der s und der Knochen verbundenen Gene wie auch die mit den Erkrankungen des Bluts und der hämopoetischen Organe, der Muskeln (Myopathien), des Nervensystems (neurodegenerative Erkrankungen) oder des Kreislaufapparats (Behandlung beispielsweise von Ischämien und von Stenose) verbundenen Gene und die an den genetischbedingten mitochondrialen Erkrankungen beteiligten Gene aufführen.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Nukleinsäure kombiniert werden mit einer jeglichen Art von Vektoren oder einer jeglichen Kombination dieser Vektoren, welche erlauben, den Transfer von Genen zu verbessern, beispielsweise, nicht einschränkend, mit Vektoren, wie von Viren, synthetischen oder biosynthetischen (beispielsweise lipidartigen, polypeptidartigen, glycosidischen oder polymeren) Agentien oder ferner beschleunigten oder nicht beschleunigten Kugeln. Die Nukleinsäuren können auch in ein Gewebe injiziert werden, das einer Behandlung unterzogen worden ist, welche darauf abzielt, den Transfer von Genen zu verbessern, beispielsweise einer Behandlung von pharmakologischer Natur unter örtlicher oder systemischer Anwendung oder einer enzymatischen, permeabilisierenden (Verwendung von grenzflächenaktiven Substanzen), chirurgischen, mechanischen, thermischen oder physikalischen Behandlung.
Der Vorteil der Verwendung des Elektrotransfers im Rahmen einer Gentherapie beruht auf der Sicherheit, welche die örtliche Behandlung verbunden mit der Verwendung von lokalen und zielgerichteten elektrischen Feldern mit sich bringt.
Aufgrund der mit der Verwendung von schwachen Feldern verbundenen Sicherheit könnte die Erfindung auf der Ebene des Herzmuskels für die Behandlung von Kardiopathien Anwendung finden, beispielsweise unter Verwendung eines angepassten Defibrillators. Sie könnte auch für die Behandlung der Restenose durch die Expression von Genen, welche die Proliferation der glatten Muskelzellen hemmen, wie des GAX-Proteins, Anwendung finden.
Die auf die Gewebe in vivo angewandte Kombination von wenig intensiven Feldern und von langen Verabreichungsdauern verbessert die Transfektion durch die Nukleinsäuren, ohne bemerkenswerte Schädigungen der Gewebe nach sich zu ziehen. Diese Ergebnisse verbessern die Ausbeute der DNA-Transfers im Rahmen der Gentherapie unter Einsatz von Nukleinsäuren.
Folglich erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren zum ersten Mal, ins Auge zu fassen, durch Gentherapie ein Mittel in physiologischen und/oder therapeutischen Dosen entweder in Geweben oder sekretiert in deren Umgebung oder im Blutkreislauf oder im lymphatischen Kreislauf zu produzieren. Außerdem erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren erstmals die feine Modulation und die Kontrolle der wirksamen Menge eines exprimierten Transgens durch die Möglichkeit, das Volumen des zu transfizierenden Gewebes zu modulieren, beispielsweise mittels einer Mehrzahl von Verabreichungsstellen, oder ferner durch die Möglichkeit, die Anzahl, die Form, die Oberfläche und die Anordnung der Elektroden zu modulieren. Ein ergänzendes Kontrollelement resultiert aus der Möglichkeit, die Wirksamkeit der Transfektion durch die Variation der Feldstärke, der Anzahl, der Dauer und der Frequenz der Impulse und selbstverständlich gemäß dem Stand der Technik der Verabreichungsmenge und des Verabreichungsvolumens der Nuk leinsäuren zu modulieren. Man kann so ein auf der Ebene der gewünschten Produktion oder Sekretion geeignetes Transfektionsniveau erhalten. Das Verfahren erlaubt schließlich einen Zuwachs an Sicherheit bezogen auf die chemischen oder vitalen Methoden zum Transfer von Genen in vivo, bei welchen die Schädigung von anderen Organen als dem Zielorgan nicht vollständig ausgeschlossen und beherrscht werden kann. Tatsächlich erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren die Kontrolle der Lokalisation der transfizierten Gewebe (streng verbunden mit dem Gewebevolumen, das den lokalen elektrischen Impulsen unterworfen wird) und bringt folglich die Möglichkeit einer Rückkehr zu der anfänglichen Situation durch die vollständige oder teilweise Entfernung des Gewebes mit sich, wenn dies durch den nicht-lebenswichtigen Charakter dieses Gewebes und durch dessen Regenerationsvermögen, wie im Falle der Leber oder des Muskels, möglich gemacht wird. Diese große Anpassungsfähigkeit der Verwendung erlaubt, das Verfahren je nach der tierischen Spezies (Anwendungen bei Menschen und veterinärmedizinische Anwendungen), dem Alter des Individuums, dessen physiologischem und/oder pathologischem Zustand zu optimieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt außerdem erstmals, Nukleinsäure von großer Größe mittels Transfektion einzuführen im Gegensatz zu den viralen Methoden, die durch die Größe des Kapsids begrenzt werden. Diese Möglichkeit ist essentiell für den Transfer von Genen von sehr großer Größe, wie jenem des Dystrophins, oder von Genen mit Introns und/oder regulatorischen Elementen von großer Größe, was beispielsweise für eine physiologisch regulierte Produktion von Hormonen erforderlich ist. Diese Möglichkeit ist essentiell für den Transfer von Episomen oder von künstlichen Chromosomen aus Hefe oder von Minichromosomen.
Die folgenden Beispiele sind dazu bestimmt, die Erfindung auf nicht einschränkende Weise zu veranschaulichen.
In diesen Beispielen wird Bezug genommen auf die folgenden Figuren:
1: Auswirkungen von elektrischen Impulsen von hoher Feldstärke auf die Transfektion des tibialen kranialen Muskels bei der Maus mit pXL2774-Plasmid-DNA; Mittelwerte ± Standardabweichung.
2: Auswirkungen von elektrischen Impulsen von mittlerer Feldstärke auf die Transfektion des tibialen kranialen Muskels bei der Maus mit pXL2774-Plasmid-DNA; Mittelwerte ± Standardabweichung.
3: Auswirkungen von elektrischen Impulsen von geringer Feldstärke und von unterschiedlichen Dauern auf die Transfektion des tibialen kranialen Muskels bei der Maus mit pXL2774-Plasmid-DNA; Mittelwerte ± Standardabweichung.
4: Auswirkungen von elektrischen Impulsen von geringer Feldstärke und von unterschiedlichen Dauern auf die Transfektion des tibialen kranialen Muskels bei der Maus mit pXL2774-Plasmid-DNA; Mittelwerte ± Standardabweichung.
5: Wirksamkeit der Elektrotransfektion des tibialen kranialen Muskels der Maus mit pXL2774-Plasmid-DNA bei geringen elektrischen Feldstärken; Mittelwerte ± Standardabweichung.
6: Karte der Plasmide pXL3031 und pXL3010.
Beispiel 1: Experiment, ausgeführt unter den Bedingungen des Standes der Technik, in welchem die elektrischen Felder sich als Inhibitoren der Transfektion erweisen
Es wurden die Standard-Elektroporationsbedingungen, wie jene, die im Stand der Technik verwendet werden und die vorstehend diskutiert worden sind, getestet und sie haben sich als unwirksam erwiesen, ja sogar derart, dass sie eine inhibitorische Wirkung auf den Transfer von Nukleinsäuren (Plasmid-DNA) in den quergestreiften Muskel aufweisen.
Material und Methoden – allgemeine Verfahrensbedingungen
In diesem Beispiel wurden die folgenden Produkte eingesetzt:
pXL2774-DNA (Patent PCT/FR 96/01414) ist eine Plasmid-DNA, welche das Luciferase-Reportergen umfasst. Die anderen Produkte sind von den Lieferanten des Handels erhältlich: Ketamin, Xylazin, physiologische Kochsalzlösung (0,9% NaCl).
Es wurden ein Oszilloskop und ein Generator von elektrischen Impulsen (Rechteckwellen) des Handels (Electro-pulsateur PS15, Jouan, Frankreich) verwendet. Die eingesetzten Elektroden sind flache Elektroden aus rostfreiem Stahl mit einem Abstand von 5,3 mm.
Das Experiment wird an C57 B1/6-Mäusen ausgeführt. Die Mäuse, die aus unterschiedlichen Käfigen stammen, werden vor dem Experiment zufallsgesteuert verteilt („Randomisierung").
Die Mäuse werden durch eine Ketamin-Xylazin-Mischung anästhesiert. Die Plasmid-Lösung (30 μl einer 0,9%-igen NaCl-Lösung mit 500 μg/ml) wird längs durch die Haut hindurch in den tibialen kranialen Muskel der linken und rechten Pfoten mit Hilfe einer Hamilton-Spritze injiziert. Die beiden Elektroden werden mit einem leitfähigen Gel bestrichen und die Pfote mit der Injektion wird zwischen den Elektroden in Kontakt mit jenen platziert.
Die elektrischen Impulse werden rechtwinklig zu der Achse des Muskels mit Hilfe eines Rechteckimpulsgenerators eine Minute nach der Injektion angewendet. Ein Oszilloskop erlaubt, die Intensität in Volt (die in den Beispielen angegebenen Werte repräsentieren die maximalen Wer te), die Dauer in Millisekunden und die Frequenz in Hertz der abgegebenen Impulse, die 1 Hz beträgt, zu kontrollieren. Es werden 8 aufeinanderfolgende Impulse abgegeben.
Für die Auswertung der Transfektion des Muskels werden die Mäuse 7 Tage nach der Verabreichung des Plasmids getötet. Die tibialen kranialen Muskeln der linken und rechten Pfoten werden dann entnommen, gewogen, in Lysepuffer gegeben und zermahlen. Die erhaltene Suspension wird zentrifugiert, um einen klaren Überstand zu erhalten. Die Messung der Luciferase-Aktivität erfolgt an 10 μl Überstand mit Hilfe eine Luminometers des Handels, in welchem das Substrat automatisch zu der Lösung hinzugesetzt wird. Die Intensität der Leuchtreaktion wird in RLU („Relative Luminescence Unit") für einen Muskel unter Kenntnis des Gesamtvolumens der Suspension angegeben. Jeder experimentelle Zustand wird an 10 Stellen getestet: 5 Tiere, die beidseitig eine Injektion erhalten. Die statistischen Vergleiche erfolgen mit Hilfe von nicht-parametrischen Tests.
Ergebnisse und Diskussion
Zwei Figuren, deren Maßstab linear oder logarithmisch ist, veranschaulichen die Ergebnisse. In diesem ersten Experiment wurden die Auswirkungen eines elektrischen Felds von 800 bis 1200 Volt/cm, welches die Elektroporation von Tumoren erlaubt (Mir et al., Eur. J. Cancer 27, 68 1991), getestet.
Man stellt fest, dass nach 1 bezogen auf die Kontrollgruppe, wo die DNA ohne elektrischen Impuls injiziert wird:

• mit 8 Impulsen von 1200 Volt/cm und einer Dauer von 0,1 ms der Mittelwert der Luciferase-Aktivität viel geringer ist,
• mit Impulsen von 1200 Volt/cm und von 1 ms 3 Tiere gestorben sind und der Mittelwert der Luciferase-Aktivität viel geringer ist,
• mit Impulsen von 800 Volt/cm und 1 ms der Mittelwert der Luciferase-Aktivität ebenfalls signifikant verringert ist.

Der größte Teil der Muskeln, die der Wirkung des elektrischen Felds unterzogen wurden, ist sichtbar verändert (mürbe und von weißlichem Aussehen).
Referenzbeispiel 2: Experiment eines Elektrotransfers von Nukleinsäuren mit mittleren elektrischen Feldern
Dieses Experiment erfolgt mit C57 B1/6-Mäusen. Abgesehen von der Intensität des elektrischen Felds bzw. der elektrischen Feldstärke der Impulse und von deren Dauer sind die Ausführungsbedingungen jene des Beispiels 1.
Die Ergebnisse sind in der 2 gezeigt. Man reproduziert das Ergebnis des Beispiels 1, d.h. die inhibitorische Wirkung einer Reihe von 8 Impulsen von 800 Volt/cm mit einer Dauer von 1 ms auf die in dem Muskel detektierte Luciferase-Aktivität. Bei einem Feld von 600 V/cm beobachtet man die gleiche Inhibition und die gleiche Veränderung des Muskelgewebes. Im Gegensatz dazu erlaubt die Verringerung der Spannung auf bemerkenswerte und überraschende Weise, die Muskeln nicht mehr sichtbar zu verändern, und außerdem ist bei 400 und 200 Volt/cm das Transfektionsniveau der Muskeln im Mittel höher als jenes, welches bei den keinem Feld unterworfenen Muskeln erhalten wird. Es ist anzumerken, dass bezogen auf die Vergleichsgruppe (keinem elektrischen Feld unterworfen) die Streuung der Werte der Luciferase-Aktivität bei 200 Volt/cm verringert ist (Standardabweichung des Mittelwerts = 20,59% des Mittelwerts gegenüber 43,32% in Abwesenheit eines elektrischen Felds (2A)).
Referenzbeispiel 3: Experiment eines Elektrotransfers von Nukleinsäuren mit Impulsen von geringer Feldstärke, welches eine sehr starke Stimulation der Expression des Transgens zeigt
Dieses Experiment erfolgt mit C57 B1/6-Mäusen. Abgesehen von der Intensität des elektrischen Felds bzw. der elektrischen Feldstärke der Impulse und deren Dauer und der Tatsache, dass die Impulse 25 s nach der Injektion der DNA abgegeben werden, sind die Ausführungsbedingungen jene der vorangegangenen Beispiele.
Die Ergebnisse sind in der 3 gezeigt. Der Mittelwert der Expression des Luciferase-Transgens ist bei einer Impulsdauer von 20 ms bei 100 Volt/cm und ausgehend von einer Impulsdauer von 5 ms bei 200 Volt/cm deutlich erhöht.
Dieses Experiment zeigt auch klar, dass der Mittelwert der Luciferase-Aktivität, der durch Elektrotransfektion des Muskels mit der DNA erhalten wird, eine Funktion der Dauer der elektrischen Impulse ist, wenn man Spannungen von 200 und 100 Volt/cm einsetzt. Man stellt auch fest, dass die Streuung der Werte bei den Gruppen von elektrotransfizierten Muskeln deutlich verringert ist (3A). In Abwesenheit von elektrischen Impulsen (Kontrolle) repräsentiert die Standardabweichung 77,43% des Mittelwerts, wohingegen die Standardabweichung bezogen auf den Mittelwert auf 14% (200 Volt/cm, 5 ms), 41,27% (200 Volt/cm, 20 ms) und zwischen 30% und 48% für den Elektrotransfer bei einem elektrischen Feld von 100 Volt/cm verringert ist.
Bei der besten Bedingung dieses Experiments verbessert man die Expression des Transgens bezogen auf die Kontrolle mit einer Injektion in Abwesenheit von elektrischen Impulsen um einen Faktor von 89,7.
Referenzbeispiel 4: Experiment eines Elektrotransfers von Nukleinsäuren in den Muskel bei 200 Volt/cm, was eine Erhöhung der Expression des Transgens um einen Faktor über 200 zeigt
Dieses Experiment wird an DBA 2-Mäusen mit elektrischen Impulsen einer Feldstärke von 200 Volt/cm und von variabler Dauer ausgeführt, wobei die anderen Bedingungen dieses Experiments jene des Beispiels 3 sind.
Dieses Beispiel bestätigt, dass bei 200 Volt/cm die Transfektion mit der Luciferase-Aktivität ab einer Impulsdauer von 5 ms erhöht ist, dann bei längeren Dauern weiter zunimmt (4 und 5). Auch hier beobachtet man wieder bei der Elektrotransfektion eine Verringerung der inter-individiuellen Variabilität, angegeben durch die Standardabweichung des Mittelwerts bezogen auf die nicht-elektrotransfizierte Kontrolle (der relative Wert der Standardabweichung des Mittelwerts ist gleich 35% für die Kontrolle und 25, 22, 16, 18, 16 und 26% für Reihen von Impulsen von 1, 5, 10, 15, 20 bzw. 24 ms).
Bei der besten Bedingung dieses Experiments verbessert man die Expression des Transgens bezogen auf die Kontrolle mit einer Injektion in Abwesenheit von elektrischen Impulsen um einen Faktor von 205.
Referenzbeispiel 5: Wirksamkeit des Elektrotransfers von Nukleinsäuren in Abhängigkeit von dem Produkt „Anzahl von Impulsen x Feldstärke x Dauer von jedem Impuls"
Die 5 exemplifiziert die Bedeutung des Parameters, welcher dem Produkt „Anzahl von Impulsen x Feldstärke x Dauer von jedem Impuls" entspricht. Dieser Parameter entspricht tatsächlich dem Integral der Funktion, die die Variation des elektrischen Felds beschreibt, abhängig von der Zeit.
Die Darstellung der während der Experimente 2,3 und 4 mit elektrischen Feldstärken von 200 V/cm, 100 V/cm oder in Abwesenheit von elektrischen Feldern erhaltenen Ergebnisse in 5 zeigt, dass die Transfektionswirksamkeit in Abhängigkeit von dem Produkt der gesamten Dauer der Exposition gegenüber dem elektrischen Feld und der Feldstärke zunimmt. Bei einem Wert über 1 kV·ms/cm des Produkts „Feldstärke x gesamte Dauer der Impulse" wird ein Stimulati onseffekt erhalten. Gemäß einer bevorzugten Weise wird eine Stimulation bei einem Wert über oder gleich 5 kV·ms/cm des Produkts „Feldstärke x gesamte Dauer der Impulse" erhalten.
In den folgenden Beispielen wurde der Elektrotransfer von Nukleinsäuren mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens an verschiedenen Tumoren entweder humanen Ursprungs, implantiert in (immundefiziente) Nacktmäuse, oder von Mäuse-Ursprung, implantiert in (immunkompetente) C57B1/6-Mäuse, getestet.
Beispiel 6: Experiment eines Elektrotransfers von Nukleinsäuren in humane H1299-Lungentumore
Das Experiment erfolgt an der weiblichen Nacktmaus von 18 bis 20 g. Den Mäusen werden einseitig Transplantate von N1299-Tumoren von 20 mm³ implantiert. Die Tumore lässt man sich entwickeln, um ein Volumen von 200 bis 300 m³ zu erreichen. Die Mäuse werden abhängig von ihren Tumorgrößen eingestuft und in homogene Gruppen verteilt. Die Mäuse werden mit einer Ketamin-Xylazin-Mischung anästhesiert. Die Plasmid-Lösung (40 μl einer Lösung mit 250 μg/ml DNA in 20 mM NaCl, 5% Glucose) wird längs in das Zentrum des Tumors mit Hilfe einer Hamilton-Spritze injiziert. Die seitlichen Flächen des Tumors werden mit einem leitfähigen Gel bestrichen und der Tumor wird zwischen die beiden Elektroden platziert. Die Elektroden sind flache Elektroden aus rostfreiem Stahl mit einem Abstand von 0,45 bis 0,7 cm. Es wurden ein Oszilloskop und ein elektrischer Impulsgenerator (Rechteckimpulse) des Handels (Electro-pulsateur PS 15, Jouan, Frankreich) verwendet.
In diesem Beispiel ist das eingesetzte Plasmid das Plasmid pXL3031 (6), welches das (zytoplasmatische) Luciferase kodierende Gen umfasst. Das Plasmid pXL3031 ist ein Vektor, der von dem Vektor pXL2774 (WO 97/10343) abgeleitet ist, in welchen das die modifizierte (zytoplasmatische) Luciferase aus Photinus pyralis kodierende Gen luc+, welches aus pGL3basic (Genbank: CVU47295) stammt, unter der Kontrolle des aus der frühen Region des humanen Zytomegalievirus (hCMV IE, Genbank HS51EE) stammenden Promotors und des Polyadenylierungssignals der späten Region des SV40-Virus (Genbank SV4CG) eingeführt worden ist.
Die elektrischen Impulse werden mit Hilfe eines Rechteckimpulsgenerators 20 bis 30 s nach der Injektion angewendet. Ein Oszilloskop erlaubt, die Intensität in Volt, die Dauer in Millisekunden und die Frequenz in Hertz der Impulse, die mit 200 bis 800 Volt/cm, 20 ms und 1 Hertz abgegeben werden, zu kontrollieren.
Für die Auswertung der Tumortransfektion werden die Mäuse (10 Mäuse pro Bedingungen) 2 Tage nach der Injektion des Plasmids getötet. Die Tumore werden entnommen, gewogen und in einem Lysepuffer zermahlen. Die erhaltene Suspension wird zentrifugiert, um einen klaren Überstand zu erhalten. Die Luciferase-Aktivität wird in 10 μl Überstand mit Hilfe eines Luminometers des Handels, in welchem das Substrat automatisch zugesetzt wird, gemessen. Die Ergebnisse werden in gesamten RLU („Relative Light Unit") pro Tumor ausgedrückt.
In diesem Beispiel wurden zwei Reihen von Expermenten ausgeführt, um die Auswirkung der Intensität des elektrischen Felds auf die Wirksamkeit der Transfektion der humanen H1299-Lungentumore zu bestimmen. In einer ersten Reihe von Experimenten wurden elektrische Feldstärken von 200 bis 500 Volt/cm getestet. In einer zweiten Reihe von Experimenten wurden elektrische Feldstärken, die von 400 bis 800 Volt/cm variierten, getestet.
Tabelle 1: Auswirkung von elektrischen Impulsen von unterschiedlichen Feldstärken auf die Transfektion von humanen H1299-Tumoren (nicht-kleinzellige Lungenkarzinome) mit pXL 3031-Plasmid-DNA; Mittelwerte +/– Standardabweichung des Mittelwerts der Luciferaseaktivität in RLU pro Tumor. Bedingungen: elektrische Feldstärke V/cm, wie in der Tabelle angegeben, 8 Impulse von 20 ms, Frequenz 1 Hertz.
Man stellt fest, dass nach der Tabelle 1 bezogen auf die Kontrollgruppe, wo die DNA ohne elektrischen Impuls injiziert wird, der Gentransfer auf eine von der Intensität des elektrischen Felds von 200 bis 400 Volt/cm abhängigen Weise erhöht wird, um ein Plateau zu erreichen, welches dem Transfektionsmaximum entspricht, welches ab 500 Volt/cm erhalten wird. Bei höheren Spannungen (600 und 800 Volt/cm) werden Hautverbrennungen oder tiefer gehende Verbrennungen erhalten, ohne gleichwohl die Expression des Transgens zu verringern.
Die durch den Elektrotransfer erhaltene Verstärkung des Gentransfers liegt bei den H1299-Lungentumoren in der Größenordnung von 240- bis 320-fach.
Beispiel 7: Experiment eines Elektrotransfers von Nukleinsäuren in humane HT29-Kolontumore
Das Experiment erfolgt an der weiblichen Nacktmaus von 18 bis 20 g. Den Mäusen werden einseitig Transplantate von NT29-Tumoren von 20 mm³ implantiert. Die Tumore lässt man sich entwickeln, um ein Volumen von 200 bis 300 mm³ zu erreichen. Die Mäuse werden abhängig von ihren Tumorgrößen eingestuft und in homogene Gruppen verteilt. Abgesehen von dem eingesetzten Abstand der Elektroden (0,45 cm) sind die Ausführungsbedingungen jene des Beispiels 6. Die Ergebnisse von zwei unabhängigen Versuchsreihen sind in der Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2: Auswirkung von elektrischen Impulsen von unterschiedlichen Feldstärken auf die Transfektion von humanen HT29-Tumoren (Kolon-Adenokarzinomen) mit pXL 3031-Plasmid-DNA; Mittelwerte +/– Standardabweichung des Mittelwerts der Luciferaseaktivität in RLU pro Tumor. Bedingungen: elektrische Feldstärke V/cm, wie in der Tabelle angegeben, 8 Impulse von 20 ms, Frequenz 1 Hertz.
Verglichen mit den Kontrollgruppen ohne Elektrotransfer erlaubt die Anwendung eines elektrischen Felds mit einer Intensität von 600 Volt/cm, einen optimalen Transfektionsgrad zu erreichen unabhängig von dem Transfektionsgrundniveau ohne Elektrotransfer. Die Verbesserung der Transfektion entspricht jeweils einem Faktor des 6- bis 23-fachen und ist von 400 bis 600 Volt/cm relativ ähnlich.
Beispiel 8: Experiment eines Elektrotransfers von Nukleinsäuren in Fibrosarkome aus der Maus
Das Experiment erfolgt an der C57B1/6-Maus von 18 bis 20 g. Den Mäusen werden einseitig 1 × 10⁶ LPB-Zellen in 100 μl MEM-Medium ohne Serum implantiert. Die Tumore lässt man sich entwickeln, um ein Volumen von 100 bis 200 mm³ zu erreichen. Die Mäuse werden abhängig von ihren Tumorgrößen eingestuft und in homogene Gruppen verteilt. Die Ausführungsbedingungen des Experiments sind jene des Beispiels 6.
Die Ergebnisse von zwei unabhängigen Versuchsreihen sind in der Tabelle 3 aufgeführt.
Tabelle 3: Auswirkung von elektrischen Impulsen von unterschiedlichen Feldstärken auf die Transfektion von Fibrosarkomen aus der Maus mit pXL 3031-Plasmid-DNA; Mittelwerte +/– Standardabweichung des Mittelwerts der Luciferaseaktivität in RLU pro Tumor. Bedingungen: elektrische Feldstärke V/cm, wie in der Tabelle angegeben, 8 Impulse von 20 ms, Frequenz 1 Hertz.
Verglichen mit den Kontrollgruppen ohne Elektrotransfer erlaubt die Anwendung eines elektrischen Felds mit einer Intensität von 300 bis 600 Volt/cm, den Gentransfer um einen Faktor von 30 bis 70 unabhängig von der angewandten Spannung zu verbessern.
Beispiel 9: Experiment eines Elektrotransfers von Nukleinsäuren in B16-Melanome der Maus
Das Experiment erfolgt an der C57B1/6-Maus von 18 bis 20 g. Den Mäusen werden einseitig Transplantate von B16-Tumoren von 20 mm³ implantiert. Die Tumore lässt man sich entwickeln, um ein Volumen von 200 bis 300 mm³ zu erreichen. Die Mäuse werden abhängig von ihren Tumorgrößen eingestuft und in homogene Gruppen verteilt.
Die Ausführungsbedingungen des Experiments sind jene des Beispiels 6.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 aufgeführt.
Tabelle 4: Auswirkung von elektrischen Impulsen von unterschiedlichen Feldstärken auf die Transfektion von B16-Melanomen der Maus mit pXL 3031-Plasmid-DNA; Mittelwerte +/– Standardabweichung des Mittelwerts der Luciferaseaktivität in RLU pro Tumor. Bedingungen: elektrische Feldstärke V/cm, wie in der Tabelle angegeben, 8 Impulse von 20 ms, Frequenz 1 Hertz.
Verglichen mit der Kontrollgruppe ohne Elektrotransfer erlaubt die Anwendung eines elektrischen Felds mit einer Intensität von 500 Volt/cm, den Gentransfer um einen Faktor von 24 zu verbessern.
Beispiel 10: Experiment eines Elektrotransfers von Nukleinsäuren in 3LL-Tumore aus der Maus
Das Experiment erfolgt an der C57B1/6-Maus von 18 bis 20 g. Den Mäusen werden einseitig Transplantate von 3LL-Tumoren von 20 mm³ implantiert.
Die Größe der transfizierten Tumore, die fünf Tage nach der Implantierung erhalten werden, beträgt 30 mm³. Die Ausführungsbedingungen des Experiments sind jene des Beispiels 6. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 5 aufgeführt.
Tabelle 5: Auswirkung von elektrischen Impulsen von unterschiedlichen Feldstärken auf die Transfektion von 3LL-Lungenkarzinomen aus der Maus mit pXL 3031-Plasmid-DNA; Mittelwerte +/– Standardabweichung des Mittelwerts der Luciferaseaktivität in RLU pro Tumor. Bedingungen: elektrische Feldstärke V/cm, wie in der Tabelle angegeben, 8 Impulse von 20 ms, Frequenz 1 Hertz.
Die Anwendung eines elektrischen Felds mit einer Intensität von 500 Volt/cm erlaubt, die Expression des Transgens um einen Faktor von 3885 zu erhöhen.
Diese bemerkenswerten Ergebnisse sind in Relation zu setzen mit der Tatsache, dass diese Tumore durch DNA sehr wenig transfizierbar sind, wenn die DNA einfach ohne Elektrotransfer injiziert wird.
Beispiel 11: Experiment eines Elektrotransfers von Nukleinsäuren in humane H1299-Lungentumore, Auswirkung auf die Sekretion der sekretierten humanen alkalischen Phosphatase in das Plasma
In diesem Beispiel ist die eingesetzte pXL3010-DNA (6) eine Plasmid-DNA, welche das die sekretierte humane alkalische Phosphatase aus der Plazenta kodierende Gen umfasst.
Das Plasmid pXL3010 ist ein von ColE1 abgeleiteter Vektor, in welchen das die sekretierte alkalische Phosphatase kodierende Gen, welches aus pSEAP-basic (Clontech, Genbank: CVU09660) stammt, unter der Kontrolle des aus dem Plasmid pCDNA3 (Invitrogen, Niederlande) stammenden CMV-Promotors und des Polyadenylierungssignals der späten Region des SV40-Virus (Genbank SV4CG) eingeführt worden ist.
Das Experiment erfolgt an der Nacktmaus von 18 bis 20 g. Den Mäusen werden einseitig Transplantate von H1299-Tumoren von 20 mm³ implantiert. Man lässt die Tumore sich entwickeln, um ein Volumen von 200 bis 300 mm³ zu erreichen. Die Mäuse werden abhängig von ihren Tumorgrößen eingestuft und in homogene Gruppen verteilt.
Die Tumore werden unter den Ausführungsbedingungen des Beispiels 6 transfiziert, wobei indessen die einzige Spannungsbedingung 500 Volt/cm, 20 ms und 1 Hertz war.
Die quantitativen Bestimmungen der alkalischen Phosphatase erfolgen im Plasma mit Hilfe des Phospha-light-Kits (Tropix) am Tag d1, d2 und d8 nach der Transfektion mit oder ohne Elektrotransfer. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 6 aufgeführt.
Tabelle 6: Auswirkung von elektrischen Impulsen von unterschiedlichen Feldstärken auf die Sekretion eines exogenen Proteins: die sekretierte humane alkalische Phosphatase infolge der Transfektion von humanen H1299-Tumoren mit pXL 3010-Plasmid-DNA; Mittelwerte +/– Standardabweichung des Mittelwerts der alkalischen Phosphatase (ng/ml). Bedingungen: elektrische Feldstärke V/cm, wie in der Tabelle angegeben, 8 Impulse von 20 ms, Frequenz 1 Hertz.
Die Gesamtheit der in den Beispielen 6 bis 11 aufgeführten Ergebnisse zeigt, dass der Elektrotransfer von Nukleinsäuren unter den Bedingungen des erfindungsgemäßen Verfahrens erlaubt, das Expressionsniveau des Transgens bei verschiedenen Arten von Tumoren auf bemerkenswerte Weise zu erhöhen. Außerdem erlaubt in dem Falle eines Transgens, welches ein sekretiertes Protein kodiert, die intratumorale Verabreichung des Plasmids durch Elektrotransfer, die Plasmakonzentration des sekretierten Proteins signifikant zu erhöhen.
Beispiel 12: Auswirkung der Erhöhung der Dauer der elektrischen Impulse
Dieses Beispiel veranschaulicht, dass man die unitäre Dauer der Impulse deutlich über die in Beispiel 4 getesteten Werte erhöhen kann.
Dieses Experiment wird mit C57B1/6-Mäusen ausgeführt. Das eingesetzte Plasmid ist das Plasmid pXL2774, die verabreichte DNA-Menge beträgt 15 μg. Der Elektropulsator, der eingesetzt wird, um die elektrischen Impulse mit einer Dauer von über 20 ms abzugeben, ist ein Elektropulsator des Handels (Genetronics, Modell T 820, USA, San Diego, CA). Die elektrischen Impulse sind von der Anzahl und der Dauer her variabel, aber mit einer konstanten Feldstärke von 200 Volt/cm; die anderen Bedingungen dieses Experiments sind jene, die in Beispiel 1 beschrieben wurden. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 7 aufgeführt.
Tabelle 7: Mittelwerte +/– Standardabweichung der Luciferaseaktivität in Millionen RLU pro Muskel. N = 10 für jede Gruppe. Elektrotransferbedingungen: Feldstärke 200 V/cm, 8 oder 4 Impulse (variable unitäre Dauer), Frequenz 1 Hz.
Man stellt eine Verstärkung der Expression des Transgens mit der Verlängerung der unitären Dauer der Impulse (wenigstens bis zu 40 ms für eine Reihe von 8 Impulsen und wenigstens bis zu 50 ms für eine Reihe von 4 Impulsen mit einer Intensität von 200 Volt/cm) fest. Dieses Beispiel zeigt, dass das Optimum der Dauer der Impulse von der Anzahl von eingesetzten Impul sen abhängt und dass die unitäre Dauer der Impulse wenigstens 80 ms erreichen kann, wobei dieser Wert für die Dauer nicht einschränkend ist.
Beispiel 13: Wirksamkeit des Elektrotransfers in Abhängigkeit von der Anzahl von elektrischen Impulsen
Dieses Beispiel weist die Auswirkung der Erhöhung der Anzahl von elektrischen Impulsen auf die Wirksamkeit des Transfers von Nukleinsäuren nach.
Dieses Experiment wird mit C57B1/6-Mäusen ausgeführt. Das eingesetzte Plasmid ist das Plasmid pXL 2774, die verabreichte DNA-Menge beträgt 15 μg. Die elektrischen Impulse sind von der Anzahl her variabel. Die Dauer von jedem Impuls beträgt 20 ms. Die Feldstärke beträgt 200 Volt/cm. Die anderen Bedingungen dieses Experiments sind jene, die in Beispiel 1 beschrieben wurden. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 8 aufgeführt.
Tabelle 8: Mittelwerte +/– Standardabweichung der Luciferaseaktivität in Millionen RLU pro Muskel. N = 10 pro Gruppe. Bedingungen: Feldstärke 200 V/cm, variable Anzahl von Impulsen von 20 ms, Frequenz 1 Hz.
Man beobachtet, dass die Expression der Luciferase auf sehr bedeutende Weise ab der Anwendung eines einzigen Impulses zunimmt und dass sie fortfährt, abhängig von der Anzahl von Impulsen zuzunehmen. Es erweist sich so, dass die Variation der Anzahl von abgegebenen Impulsen ein Mittel darstellt, um die Wirksamkeit des Transfers von Nukleinsäuren zu modulieren und um das Expressionsniveau des Transgens anzupassen.
Es wird gleichfalls eine Verringerung der Variabilität der nachgewiesenen Reaktion durch die Verringerung des Werts der Standardabweichung bezogen auf den Mittelwert für alle Gruppen, die dem Elektrotransfer unterzogen worden sind, bestätigt.
Beispiel 14: Wirkung der Erhöhung der Frequenz der elektrischen Impulse
Dieses Beispiel zeigt, dass die Erhöhung der Frequenz der Impulse auf unerwartete Weise erlaubt, die Wirksamkeit der Transfektion zu verbessern. Andererseits und aus einem klinischen Blickwinkel muss die Erhöhung der Frequenz das Wohlergehen des Patienten verbessern, indem die gesamte Dauer der Behandlung verringert wird.
Dieses Experiment wird mit C57B1/6-Mäusen ausgeführt. Das eingesetzte Plasmid ist das Plasmid pXL 2774, die verabreichte DNA-Menge beträgt 15 μg. Die Frequenz der elektrischen Impulse ist variabel (von 0,1 bis 4 Hertz). Die Dauer von jedem Impuls beträgt 20 ms, die Feldstärke beträgt 200 Volt/cm, die anderen Bedingungen dieses Experiments sind jene, die in Beispiel 1 beschrieben wurden. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 9 aufgeführt.
Tabelle 9: Mittelwerte +/– Standardabweichung der Luciferaseaktivität in Millionen RLU pro Muskel. N = 10 für jede Gruppe. Bedingungen: Feldstärke 200 V/cm, 8 oder 4 Impulse von 20 ms, Frequenz variabel.
Die in dem Experiment „A", Tabelle 9, erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die höheren Frequenzen (≥ 1 Hz) wirksamer sind als die niedrigen Frequenzen, die einer längeren Dauer zwischen zwei aufeinander folgenden Impulsen entsprechen (10 Sekunden bei 0,1 Hz). Die Wirksamkeit der Transfektion nimmt mit der Frequenz im Bereich von getesteten Werten von 0,1 bis 4 Hertz für 4 Impulse und von 0,1 bis 3 Hertz für 8 Impulse zu.
Beispiel 15: Auswirkung der Anwendung eines elektrischen Felds, welches gemäß einer abnehmenden Exponentialfunktion abhängig von der Zeit variiert.
Dieses Beispiel weist die Auswirkung der Anwendung eines elektrischen Felds, welches gemäß einer abnehmenden Exponentialfunktion variiert, auf die Wirksamkeit des Transfers von Nukleinsäuren nach.
Dieses Experiment wird mit C57B1/6-Mäusen ausgeführt.
Das eingesetzte Plasmid ist das Plasmid pXL 3031. Das Plasmid pXL3031 (12) ist ein Vektor, der von dem Vektor pXL2774 (WO 97/10343) abgeleitet ist, in welchen das die modifizierte (zytoplasmatische) Luciferase aus Photinus pyralis kodierende Gen luc+, welches aus pGL3basic (Genbank: CVU47295) stammt, unter der Kontrolle des aus der frühen Region des humanen Zytomegalievirus (hCMV IE, Genbank HS51EE) stammenden Promotors und des Polyadenylierungssignals der späten Region des SV40-Virus (Genbank SV4CG) eingeführt worden ist. Die verabreichte DNA-Menge beträgt 10 μg.
Der eingesetzte elektrische Impulsgenerator erlaubt, Impulse mit einer gemäß einer abnehmenden Exponentialfunktion abhängig von der Zeit variierenden elektrischen Feldstärke abzugeben (Elektropulsator Equibio, Modell easyject T plus, Kent, Vereinigtes Königreich). Die auferlegte Spannung ist die Spannung beim Peak der Exponentialfunktion. Der zweite einstellbare Parameter ist die Kapazität (μFarad), der erlaubt, die abgegebene Energiemenge und die Zeitkonstante der Exponentialfunktion variieren zu lassen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 10 aufgeführt.
Tabelle 10: Verstärkungsfaktor der Expression (Luciferaseaktivität), erhalten durch Anwendung eines Impulses mit exponentieller Abnahme. Der Verstärkungsfaktor wird durch Bezugnahme auf die Luciferaseaktivität, die bei der Verabreichung des Plasmids pXL3031 ohne Elektrotransfer erhalten wird, berechnet (Mittelwerte des Verstärkungsfaktors, N = 4 bis 6 pro Bedingung).
Zum Vergleich war der Verstärkungsfaktor der Expression, der für den Transfer von pXL3031 in Gegenwart eines elektrischen Felds mit Impulsen von Rechteckform (Feldstärke von 200 V/cm, 8 Impulse von 20 ms bei einer Frequenz von 1 Hz) in dem gleichen Experiment erhalten wurde, 44.
Diese Ergebnisse zeigen, dass man elektrische Impulse von Rechteckform oder mit einer abhängig von der Zeit exponentiell abnehmenden Intensität einsetzen kann. Darüber hinaus kann in diesem letzteren Falle eine bedeutende Erhöhung der Expression bei einem niedrigen Wert des Felds und einer hohen Kapazität (z.B. 200 V/cm, Kapazität 3000 μFarad) oder einem hohen Wert des Felds und einer niedrigen Kapazität (z.B. 400 V/cm, Kapazität 300 μFarad) erhalten werden.
Beispiel 16: Auswirkung der Kombination eines kurzen Impulses von hoher Spannung und von mehreren langen Impulsen von niedriger Spannung
Dieses Beispiel zeigt, dass das abgegebene elektrische Feld eine Kombination von wenigstens einem Feld zwischen 500 und 800 Volt/cm während einer kurzen Dauer, beispielsweise 50 oder 100 μs und von wenigstens einem schwachen Feld (< 100 Volt/cm) während einer längeren Dauer, beispielsweise ≥ 1 ms und bis zu 90 ms in diesem Experiment sein kann.
Die Werte des schwachen elektrischen Felds sind hier 80 V/cm, angewendet in 4 Impulsen mit einer Dauer von 90 ms mit einer Frequenz von 1 Hz. Für dieses Experiment werden zwei Elektropulsatoren verwendet. Die elektrischen Impulse werden durch das eine, dann das andere Gerät angewendet, wobei der Wechsel in weniger als einer Sekunde mit Hilfe von Handbetrieb erfolgt.
Das eingesetzte Plasmid ist das Plasmid pXL3031. Die verabreichte DNA-Menge beträgt 3 μg. Die Werte des elektrischen Felds sind in der Tabelle 11 angegeben; die übrigen Bedingungen dieses Experiments sind jene, die in Beispiel 1 beschrieben wurden.
Tabelle 11: Mittelwerte +/– Standardabweichung des Mittelwertes der Luciferaseaktivität in Millionen RLU pro Muskel. N = 10 pro Gruppe.
Die Tabelle 11, welche die für zwei Reihen von Experimenten erhaltenen Ergebnisse zusammenfasst, zeigt, dass ein kurzer Impuls von hoher Spannung oder dass vier aufeinanderfolgende lange Impulse und von niedriger Spannung die Transfektion bezogen auf die Kontrollgruppe, welche eine Injektion von pXL3031 erhalten hat, aber keinem elektrischen Feld unterzogen worden ist, wenig verbessern. Das gleiche gilt, wenn die Impulse mit schwachem Feld vor dem Impuls mit hohem Feld angewendet werden.
Im Gegensatz dazu erhöht in den beiden Reihen von Experimenten die Kombination eines kurzen Impulses mit hoher Spannung, gefolgt von vier aufeinanderfolgenden langen Impulsen und mit niedriger Spannung die Wirksamkeit des Transfers der DNA sehr deutlich.
Die in den Beispielen 1 und 2 erhaltenen Ergebnisse haben gezeigt, dass 8 Impulse von 600, 800 oder 1200 Volt/cm mit einer unitären Dauer von 1 ms bei 1 Hz Läsionen hervorriefen und die Transfektion hemmten. Die in Beispiel 16 erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass unter besonderen Bedingungen es möglich ist, hohe Feldstärken der Spannung auf nicht Läsionen hervorrufende Weise einzusetzen; tatsächlich sind aus makroskopischer Sicht die Muskeln niemals sichtbar verändert. Die Verwendung von hohen elektrischen Feldern von kurzer Dauer kombiniert mit schwachen Feldern von längerer Dauer erscheint als ein ergänzendes Mittel, um die Wirksamkeit des Transfers der DNA zu modulieren.
Beispiel 17: Auswirkung des Zeitpunkts der Injektion der Nukleinsäure bezogen auf die Anwendung des elektrischen Felds
Dieses Beispiel veranschaulicht die Tatsache, dass die Nukleinsäure wenigstens 30 min und sogar wenigstens eine Stunde vor der Anwendung des elektrischen Felds verabreicht werden kann.
Dieses Experiment wird mit C57B1/6-Mäusen ausgeführt. Das eingesetzte Plasmid ist das Plasmid pXL 2774. Die verabreichte DNA-Menge beträgt 15 μg oder 1,5 μg. Der Injektion der DNA folgt oder geht voran die Anwendung eines elektrischen Felds unter den folgenden Bedingungen: Intensität 200 V/cm, 8 Impulse von 20 ms, Frequenz 1 Hz. Die anderen Bedingungen dieses Experiments sind jene, die in Beispiel 1 beschrieben wurden. Eine Kontrollgruppe wird aus Tieren gebildet, die eine Injektion des Plasmids erhalten haben, die aber keinen elektrischen Impulsen unterzogen worden ist. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 12 aufgeführt.
Tabelle 12 A: DNA-Injektion in Abwesenheit eines elektrischen Felds
Tabelle 12 B: DNA-Injektion vor der Anwendung des elektrischen Felds
Tabelle 12 C: DNA-Injektion nach der Anwendung des elektrischen Felds
Tabelle 12: Mittelwerte +/– Standardabweichung des Mittelwerts der Luciferaseaktivität in Millionen RLU pro Muskel. N = 10 Muskeln pro Gruppe.
Die Anwesenheit der DNA im Moment der Anwendung des elektrischen Felds ist eine Bedingung für die Wirksamkeit der Elektrotransfektion. Bemerkenswerterweise wird beobachtet, dass die Injektion des Plasmids wenigstens 30 min und sogar 1 h (Experimente 4 und 5) vor der Anwendung des elektrischen Felds ausgeführt werden kann und dies ohne bemerkenswerte Modifizierung des Expressionsniveaus. Ein ähnliches Ergebnis wird gleichermaßen mit einer Dosis von 15 μg Plasmid pro Muskel wie mit einer zehnfach geringeren Dosis von 1,5 μg erhalten.
Diese Beobachtungen erlauben insbesondere, eine Mehrzahl von Injektionen des gleichen Plasmids zu variablen Zeitpunkten oder von verschiedenen Plasmiden in den Muskel vor der Anwendung des elektrischen Felds ins Auge zu fassen. Es ist gleichfalls möglich, eine Mehrzahl von Injektionen in einer ausgedehnten Zone des Muskels vorzunehmen, dann eine Reihe von elektrischen Impulsen an der Gesamtheit des zu behandelnden Gebiets, in welchem die Injektionen vorgenommen worden sind, anzuwenden.
Beispiel 18: Transfer eines Gens, welches Erythropoietin (EPO) kodiert
Erwachsene C57B1/6-Mäuse erhielten in den tibialen kranialen Muskel und einseitig eine Injektion von Plasmid pXL3348. Das Plasmid pXL 3348 (16) ist ein Vektor, der von dem Plasmid pXL 2774 abgeleitet ist, in welchen das Gen des Erythropoietins aus der Maus (NCBI: 193086) unter der Kontrolle des aus der frühen Region des humanen Zytomegalievirus (hCMV IE) stammenden Promotors und des Polyadenylierungssignals der späten Region des SV40-Virus (Genbank SV4CG) eingeführt worden ist.
Die Elektrotransferbedingungen sind die folgenden: elektrische Feldstärke 200 V/cm, 8 Impulse von 20 ms, Frequenz 1 Hz. Das elektrische Feld wird unverzüglich nach der Injektion der Plasmid-DNA angewendet.
Tabelle 13: Mittelwerte ± Standardabweichung des Mittelwerts. N = 4 bis 5.
Man beobachtet mit dem Elektrotransfer eine sehr deutliche Erhöhung der Erythropoietinmenge im Blut am Tag 7 und Tag 24 bei der Verabreichung von 10 μg pXL3348. Außerdem ist die physiologische Wirkung der Erythropoietin-Erhöhung, die durch eine Erhöhung des Hämatokrits zum Ausdruck kommt, sehr bedeutend (85%) ab Tag 7 und dies sogar bei einer sehr geringen Plasmidmenge (1 μg).
Beispiel 19: Auswirkung des Elektrotransfers auf die Expression von Impf-Transgenen.
Dieses Beispiel weist nach, dass das erfindungsgemäße Verfahren gleichfalls auf den Transfer von Genen, welche Polypeptide von Interesse im Rahmen einer Impfung kodieren, anwendbar ist.
Das Experiment wird an weiblichen Balb/c-Mäusen im Alter von 9 Wochen ausgeführt. Die eingesetzten Elektroden sind flache Elektroden aus rostfreiem Stahl mit einem Abstand von 5 mm. VR-HA ist eine Plasmid-DNA, welche das Gen des Hämagglutinins des Grippevirus (Stamm A/PR/8/34) umfasst. VR-gB ist eine Plasmid-DNA, welche das Gen des Glycoproteins B (gB) des humanen Zytomegalievirus (Stamm Towne) umfasst.
Die Plasmid-Lösung (50 μl einer Lösung mit 20 μg/ml oder 200 μg/ml in 0,9%-iger NaCl-Lösung) wird längs durch die Haut hindurch in den tibialen kranialen Muskel einseitig injiziert. Die elektrischen Impulse werden 20 s nach der Verabreichung des Plasmids senkrecht zu der Achse des Muskels mit Hilfe eines Rechteckimpulsgenerators (elektrische Feldstärke 200 V/cm, 8 aufeinanderfolgende Impulse mit einer Dauer von 20 ms, Frequenz 1 Hz) angewendet.

Für die Auswertung der Stimulation der Immunantwort wurde dem folgenden Immunisierungsprotokoll gefolgt:

Tag 0	Entnahme des Vorimmunserums
Tag 1	Primäre Injektion, plus oder minus Elektrotransfer
Tag 2	Entnahme des Immunserums
Tag 2	Wiederholungsinjektion, plus oder minus Elektrotransfer
Tag 42	Entnahme von Immunserum
Tag 63	Entnahme von Immunserum

Die Blutentnahmen erfolgen auf der Ebene des retroorbitalen Sinus. Die quantitativen Bestimmungen der spezifischen Antikörper erfolgen durch ELISA. Jede Versuchsbedingung wird an 10 Tieren, die einseitig Injektionen erhalten haben, getestet.
Die Ergebnisse bezüglich der Titer von Antikörpern, die gegen das Hämagglutinin des Grippevirus gerichtet sind, sind in der Tabelle 14A aufgeführt.
Tabelle 14-a: Titer von Antikörpern, die gegen das Hämagglutinin des Grippevirus gerichtet sind, erhalten nach der Injektion von 1 oder 10 μg DNA (VR-HA) in Abwesenheit oder in Anwesenheit von elektrischen Impulsen. Die Ergebnisse sind die geometrischen Mittelwerte von 10 Tieren (8 Tiere für die Gruppe, welcher 1 μg DNA in Gegenwart von elektrischen Impulsen injiziert worden ist, und bei welchen die Blutentnahme am Tag 63 stattfand) ± Standardabweichung. Der Wert von p wurde durch Vergleich von jeweils zwei der Gruppen, welche die Injektionen in Gegenwart und in Abwesenheit von elektrischen Impulsen erhalten hatten, unter Verwendung des nicht-parametrischen Man-Whitney-Tests erhalten.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Titer von Antikörpern, die gegen das Hämagglutinin des Grippevirus gerichtet sind, in den Gruppen, die den elektrischen Impulsen unterzogen worden sind, um einen Faktor von ungefähr 10 erhöht sind. So weisen die Mäuse, die 1 μg DNA in Gegenwart von elektrischen Impulsen erhalten haben, einen mittleren Antikörpertiter auf, der leicht höher ist als jener der Mäuse, die 10 μg DNA in Abwesenheit von elektrischen Impulsen erhalten haben.
Die Ergebnisse bezüglich der Titer von Antikörpern, die gegen das Glycoprotein B des humanen Zytomegalievirus gerichtet sind, sind in der Tabelle 14B aufgeführt.
Tabelle 14 B: Titer von Antikörpern, die gegen das Glycoprotein B (gB) des humanen Zytomegalievirus gerichtet sind, erhalten nach der Injektion von 10 μg DNA (VR-gB) in Abwesenheit oder in Anwesenheit von elektrischen Impulsen. Die Ergebnisse sind die geometrischen Mittelwerte von 10 Tieren (9 Tiere für die Gruppe, welche die Injektionen in Gegenwart von elektrischen Impulsen erhalten hat) ± Standardabweichung. Der Wert von p wurde durch Vergleich von jeweils zwei der Gruppen, welche die Injektionen in Gegenwart und in Abwesenheit von elektrischen Impulsen erhalten hatten, unter Verwendung des nicht-parametrischen Man-Whitney-Tests erhalten.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Titer von Antikörpern, die gegen das Glycoprotein B des humanen Zytomegalievirus gerichtet sind, in der Gruppe, die den elektrischen Impulsen unterzogen worden ist, am Tag 42 um einen Faktor von 4 erhöht sind. Man stellt gleichfalls fest, dass der Variationskoeffizient bei den Gruppen von Tieren, die den elektrischen Impulsen unterzogen worden sind, im Mittel dreimal niedriger ist.

Claims

Verwendung von Nukleinsäure für die Herstellung einer Zusammensetzung, welche dazu bestimmt ist, in vivo in Tumore transferiert zu werden, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung mit den Zellen oder Geweben in Kontakt gebracht werden soll, dann durch Anwendung von einem oder mehreren elektrischen Impulsen) mit einer Intensität zwischen 1 und 600 Volt/cm eingeschlossen auf die Zellen oder Gewebe transferiert werden soll.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung für die Behandlung durch Gentherapie bestimmt ist.
Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung für eine Impfanwendung oder immunstimulierende Anwendung bestimmt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Inkontaktbringen durch direkte Verabreichung in die Zellen oder die Gewebe oder durch topische oder systemische Verabreichung erfolgt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen der Gewebe besondere Geometrien haben, wie Zellen von großer Größe und/oder von länglicher Form und/oder welche von Natur aus auf elektrische Aktionspotentiale ansprechen und/oder welche eine spezifische Morphologie aufweisen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Feldstärke zwischen 4 und 400 Volt/cm eingeschlossen liegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Feldstärke zwischen 200 und 600 Volt/cm eingeschlossen liegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Feldstärke ungefähr 500 Volt/cm beträgt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die gesamte Anwendungsdauer des elektrischen Felds über 10 Millisekunden liegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Anwendung des elektrischen Felds auf das Gewebe einen oder mehrere Impulse von regelmäßiger Frequenz umfasst.
Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Anwendung des elektrischen Felds auf das Gewebe zwischen 1 und 100000 Impulse mit einer Frequenz zwischen 0,1 und 1000 Hertz umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrischen Impulse auf unregelmäßige Weise bezogen aufeinander abgegeben werden und dass die Funktion, welche die Stärke des elektrischen Felds abhängig von dem Zeitpunkt eines Impulses beschreibt, variabel ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Integral der Funktion, welche die Variation des elektrischen Felds mit der Zeit beschreibt, über 1 kV·ms/cm liegt.
Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Integral größer oder gleich 5 kV·ms/cm beträgt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrischen Impulse ausgewählt werden aus den Impulsen mit unipolaren Wellen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrischen Impulse ausgewählt werden aus den Impulsen mit Rechteckwellen, den elektrischen Feldern, welche Wellen mit exponentieller Abnahme, unipolare oszillierende Wellen von begrenzter Dauer, bipolare oszillierende Wellen von begrenzter Dauer oder andere Wellenformen erzeugen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrischen Impulse Impulse mit Rechteckwellen umfassen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrischen Impulse anzuwenden sind mit Elektroden, welche auf beiden Seiten des zu behandelnden Gewebes angeordnet sind oder in Kontakt mit der Haut angeordnet sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrischen Impulse anzuwenden sind mit Elektroden, die in das Innere des zu behandelnden Gewebes eingeführt sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure in das Gewebe zu injizieren ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure systemisch zu injizieren ist.
Verwendung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure auf intraarteriellem oder intravenösem Wege zu injizieren ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure auf topischem, kutanem, oralem, vaginalem, intranasalem, subkutanem oder intraokularem Wege zu verabreichen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure in einer Zusammensetzung vorliegt, welche außerdem pharmazeutisch annehmbare Vehikel für die verschiedenen Verabreichungsweisen enthält.
Verwendung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung für die parenterale Verabreichung angepasst ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine Desoxyribonukleinsäure ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine Ribonukleinsäure ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure synthetischen oder biosynthetischen Ursprungs ist oder aus einem Virus oder einem prokaryotischen oder eukaryotischen, einzelligen oder mehrzelligen Organismus extrahiert wird.
Verwendung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die verabreichte Nukleinsäure in Kombination mit der Gesamtheit oder einem Teil der Bestandteile des Herkunftsorganismus und/oder des Synthesesystems vorliegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine RNA oder ein Protein von Interesse kodiert.
Verwendung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die RNA eine katalytische oder Antisinn-RNA ist.
Verwendung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure ein Protein kodiert, welches ausgewählt wird aus den Enzymen, den Blutderivaten, den Hormonen, den Lymphokinen, den Zytokinen, den Wachstumsfaktoren, den trophischen Faktoren, den Angiogenese-Faktoren, den neurotrophen Faktoren, den Knochenwachstumsfaktoren, den hämopoetischen Faktoren, den Gerinnungsfaktoren, den Antigenen und den Proteinen, welche an dem Stoffwechsel der Aminosäuren, der Lipide und anderer essentieller Bestandteile der Zelle beteiligt sind.
Verwendung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure die Angiogenese-Faktoren VEGF und FGF, die neurotrophen Faktoren BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, NT3, NT5, das Protein Gax, Wachstumshormon, α-1-Antitrypsin, Calcitonin, Leptin und die Apolipoproteine, die Enzyme der Biosynthese der Vitamine, der Hormone und der Neuromediatoren kodiert.
Verwendung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure einen Antikörper, ein einzelkettiges Fragment der variablen Regionen („Fragment variable") eines Antikörpers (ScFv; „single-chain FV") oder ein jegliches anderes Antikörperfragment, welches Fähigkeiten zur Erkennung in einem Immuntherapie-Kontext aufweist, kodiert oder einen löslichen Rezeptor, ein Agonisten- oder Antagonistenpeptid hinsichtlich eines Rezeptors oder eines Adhäsionsproteins, ein künstliches, chimäres oder verkürztes Protein kodiert.
Verwendung nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure einen Antiidiotyp-Antikörper, ein lösliches Fragment des CD4-Rezeptors oder des TNFa-Rezeptors oder des Acetylcholinrezeptors kodiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 32 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine Vorstufe eines therapeutischen Proteins kodiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure in Form eines Plasmids vorliegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure ein Gen von großer Größe und/oder Introns und/oder regulatorische Elemente von kleiner oder großer Größe enthält.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine episomale DNA oder ein künstliches Hefe-Chromosom oder ein Minichromosom ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 39, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure Sequenzen enthält, welche die Expression des Transgens in dem Gewebe erlauben und/oder begünstigen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 40, dadurch gekennzeichnet, dass die Säure in Kombination mit einer jeglichen Art von Vektoren oder mit einer jeglichen Kombination von Vektoren, welche erlauben, den Transfer von Nukleinsäure zu verbessern, wie Viren, synthetischen oder biosynthetischen Mitteln, oder ferner mit zu beschleunigenden oder nicht zu beschleunigenden Kugeln vorliegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 41, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebe einer Behandlung, die darauf abzielt, den Gentransfer zu verbessern, einer Behandlung von pharmakologischer Natur unter örtlicher oder systemischer Anwendung oder einer enzymatischen, permeabilisierenden, chirurgischen, mechanischen, thermischen oder physikalischen Behandlung unterworfen wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 41, dadurch gekennzeichnet, dass sie erlaubt, durch das Gewebe ein Mittel in physiologischen und/oder therapeutischen Dosen entweder in den Muskelzellen, oder welches sekretiert wird, produzieren zu lassen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 43, dadurch gekennzeichnet, dass sie erlaubt, die exprimierte Menge von Transgen durch Modulation des Volumens von transfiziertem Gewebe zu modulieren.
Verwendung nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, dass sie erlaubt, das Volumen von transfiziertem Gewebe durch Verwendung einer Mehrzahl von Verabreichungsstellen zu modulieren.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 45, dadurch gekennzeichnet, dass sie erlaubt, die exprimierte Menge von Transgen zu modulieren, indem die Anzahl, die Form, die Oberfläche und die Anordnung der Elektroden moduliert und indem die Feldstärke, die Anzahl, die Dauer, die Frequenz und die Form der Impulse wie auch die Verabreichungsmenge und das Verabreichungsvolumen der Nukleinsäure variiert werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 46, dadurch gekennzeichnet, dass sie erlaubt, die Lokalisierung der zu transfizierenden Gewebe durch das Gewebevolumen, welches den örtlichen elektrischen Impulsen unterworfen wird, zu kontrollieren.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 47, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Rückkehr zu der anfänglichen Situation durch operative Entfernung der Zone von transfiziertem Gewebe erlaubt.
Nukleinsäure und ein System, welches ein elektrisches Feld mit einer Intensität zwischen 1 und 600 Volt/cm eingeschlossen erzeugt, als Kombinationsprodukt für deren getrennte oder zeitlich gestaffelte Verabreichung in vivo an einen Tumor und für die Gentherapie, welche auf der Elektrotransfektion in vivo von Geweben nach der Verabreichung der Nukleinsäure beruht.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 49, dadurch gekennzeichnet, dass die Feldstärke zwischen 200 und 600 Volt/cm eingeschlossen liegt.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 49, dadurch gekennzeichnet, dass die Feldstärke ungefähr 500 Volt/cm beträgt.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 49 bis 51, dadurch gekennzeichnet, dass die gesamte Anwendungsdauer des elektrischen Felds über 10 Millisekunden liegt.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 49 bis 52, dadurch gekennzeichnet, dass die Anwendung des elektrischen Felds auf das Gewebe einen oder mehrere Impulse von regelmäßiger Frequenz umfasst.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 53, dadurch gekennzeichnet, dass die Anwendung des elektrischen Felds auf das Gewebe zwischen 1 und 100000 Impulse mit einer Frequenz zwischen 0,1 und 1000 Hertz umfasst.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 49 bis 52, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrischen Impulse auf unregelmäßige Weise bezogen aufeinander abgegeben werden und dass die Funktion, welche die Stärke des elektrischen Felds abhängig von dem Zeitpunkt eines Impulses beschreibt, variabel ist.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 49 bis 55, dadurch gekennzeichnet, dass das Integral der Funktion, welche die Variation des elektrischen Felds mit der Zeit beschreibt, über 1 kV·ms/cm liegt.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 56, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Integral größer oder gleich 5 kV·ms/cm beträgt.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 49 bis 57, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrischen Impulse ausgewählt werden aus den Impulsen mit Rechteckwellen, den elektrischen Feldern, welche Wellen mit exponentieller Abnahme, unipolare oszillierende Wellen von begrenzter Dauer, bipolare oszillierende Wellen von begrenzter Dauer oder andere Wellenformen erzeugen.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 49 bis 58, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrischen Impulse Impulse mit Rechteckwellen umfassen.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 49 bis 59, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrischen Impulse äußerlich anzuwenden sind.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 49 bis 59, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrischen Impulse im Inneren des Gewebes anzuwenden sind.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 49 bis 61, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuren in das Gewebe zu injizieren ist.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 49 bis 61, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure systemisch zu injizieren ist.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 63, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure auf intraarteriellem oder intravenösem Wege zu injizieren ist.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 49 bis 61, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure auf topischem, kutanem, oralem, vaginalem, intranasalem, intramuskulärem, subkutanem oder intraokularem Wege zu verabreichen ist.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 49 bis 65, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure in einer Zusammensetzung vorliegt, welche außerdem pharmazeutisch annehmbare Vehikel für die verschiedenen Verabreichungsweisen enthält.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 66, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung für die parenterale Verabreichung angepasst ist.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 49 bis 67, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine Desoxyribonukleinsäure ist.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 49 bis 67, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine Ribonukleinsäure ist.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 49 bis 69, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure synthetischen oder biosynthetischen Ursprungs ist oder aus einem Virus oder einem prokaryotischen oder eukaryotischen, einzelligen oder mehrzelligen Organismus extrahiert wird.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 70, dadurch gekennzeichnet, dass die verabreichte Nukleinsäure in Kombination mit der Gesamtheit oder einem Teil der Bestandteile des Herkunftsorganismus und/oder des Synthesesystems vorliegt.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 49 bis 71, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine RNA oder ein Protein von Interesse kodiert.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 72, dadurch gekennzeichnet, dass die RNA eine katalytische oder Antisinn-RNA ist.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 72, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure ein Protein kodiert, welches ausgewählt wird aus den Enzymen, den Blutderivaten, den Hormonen, den Lymphokinen, den Wachstumsfaktoren, den trophischen Faktoren, den Angiogenese-Faktoren, den neurotrophen Faktoren, den Knochenwachstumsfaktoren, den hämopoetischen Faktoren, den Gerinnungsfaktoren, den Antigenen und den Proteinen, welche an dem Stoffwechsel der Aminosäuren, der Lipide und anderer essentieller Bestandteile der Zelle beteiligt sind.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 74, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure die Angiogenese-Faktoren VEGF und FGF, die neurotrophen Faktoren BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, NT3, NT5, das Protein Gax, Wachstumshormon, ein Zytokin, α-1-Antitrypsin, Calcitonin, Leptin und die Apolipoproteine, die Enzyme der Biosynthese der Vitamine, der Hormone und der Neuromediatoren kodiert.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 72, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure einen Antikörper, ein einzelkettiges Fragment der variablen Regionen („Fragment variable") eines Antikörpers (ScFv; „single-chain FV") oder ein jegliches anderes Antikörperfragment, welches Fähigkeiten zur Erkennung in einem Immuntherapie-Kontext aufweist, kodiert oder einen löslichen Rezeptor, ein Agonisten- oder Antagonistenpeptid hinsichtlich eines Rezeptors oder eines Adhäsionsproteins, ein künstliches, chimäres oder verkürztes Protein kodiert.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 76, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure einen Antiidiotyp-Antikörper, ein lösliches Fragment des CD4-Rezeptors oder des TNFa-Rezeptors oder des Acetylcholinrezeptors kodiert.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 74 bis 77, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine Vorstufe eines therapeutischen Proteins kodiert.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 49 bis 78, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure in Form eines Plasmids vorliegt.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 49 bis 78, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure ein Gen von großer Größe und/oder Introns und/oder regulatorische Elemente von kleiner oder großer Größe enthält.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 49 bis 78, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine episomale DNA oder ein künstliches Hefe-Chromosom oder ein Minichromosom ist.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 49 bis 81, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure Sequenzen enthält, welche die Expression des Transgens in dem Gewebe erlauben und/oder begünstigen.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 49 bis 82, dadurch gekennzeichnet, dass die Säure in Kombination mit einer jeglichen Art von Vektoren oder einer jeglichen Kombination von Vektoren, welche erlauben, den Transfer von Nukleinsäure zu verbessern, wie Viren, synthetischen oder biosynthetischen Mitteln, oder ferner mit zu beschleunigenden oder nicht zu beschleunigenden Kugeln vorliegt.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 49 bis 83, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebe einer Behandlung, die darauf abzielt, den Gentransfer zu verbessern, einer Behandlung von pharmakologischer Natur unter örtlicher oder systemischer Anwendung oder einer enzymatischen, permeabilisierenden, chirurgischen, mechanischen, thermischen oder physikalischen Behandlung unterworfen wird.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 49 bis 84, dadurch gekennzeichnet, dass es erlaubt, durch das Gewebe ein Mittel in physiologischen und/oder therapeutischen Dosen entweder in den Zellen des Gewebes, oder welches sekretiert wird, produzieren zu lassen.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 49 bis 84, dadurch gekennzeichnet, dass es erlaubt, die exprimierte Menge von Transgen durch Modulation des Volumens von transfiziertem Gewebe zu modulieren.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 86, dadurch gekennzeichnet, dass es erlaubt, das Volumen von transfiziertem Gewebe durch Verwendung einer Mehrzahl von Verabreichungsstellen zu modulieren.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 49 bis 87, dadurch gekennzeichnet, dass es erlaubt, die exprimierte Menge von Transgen zu modulieren, indem die Anzahl, die Form, die Oberfläche und die Anordnung der Elektroden moduliert und indem die Feldstärke, die Anzahl, die Dauer, die Frequenz und die Form der Impulse wie auch die Verabreichungsmenge und das Verabreichungsvolumen der Nukleinsäure variiert werden.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 49 bis 88, dadurch gekennzeichnet, dass es erlaubt, die Lokalisierung der transfizierten Gewebe durch das Gewebevolumen, welches den örtlichen elektrischen Impulsen unterworfen wird, zu kontrollieren.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 49 bis 89, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Rückkehr zu der anfänglichen Situation durch operative Entfernung der Zone von transfiziertem Gewebe erlaubt.