DE69830598T2

DE69830598T2 - Optische vorrichtung und methode

Info

Publication number: DE69830598T2
Application number: DE69830598T
Authority: DE
Inventors: Johnathan Sharpe; Niven Peter SCHAARE
Original assignee: Horticulture and Food Research Institute of New Zealand Ltd
Current assignee: XY LLC
Priority date: 1997-01-31
Filing date: 1998-02-02
Publication date: 2006-05-18
Anticipated expiration: 2018-02-03
Also published as: EP2264427A3; JP2007183655A; JP2014112108A; EP2264428A3; JP4727595B2; US8975035B2; EP1562035B1; WO1998034094A1; EP1562035A2; EP1562035A3; DE69830598D1; EP2264427B1; US7221453B2; EP1017987A4; EP2264428A2; EP2264428B1; US20100007880A1; JP4323571B2; JP2011180144A; AU752985B2

Description

TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung bezieht sich auf eine optische Vorrichtung. Insbesondere, wenn auch nicht ausschließlich, findet diese Erfindung Anwendung auf dem Gebiet der Durchflusszytometrie. Allerdings finden selbstverständlich mehrere der erfindungsgemäßen Aspekte über die Durchflusszytometrie hinaus Anwendung, wobei sie breite Anwendung auf dem Gebiet der Optik im Allgemeinen finden können. Beispielsweise können verschiedene Aspekte der Erfindung in der Photometrie oder in optischen Vorrichtungen zur Erfassung von Partikeln verwendet werden.
STAND DER TECHNIK
Im Allgemeinen wird, wenn ein Partikel oder ein Objekt zur Analyse beleuchtet wird, die Lichtquelle aus einer einzelnen Richtung auf das Partikel gerichtet. Es kann eine Analyse des von dem Partikel reflektierten oder erzeugten Lichts, z. B. der Fluoreszenz, vorgenommen werden, um bestimmte Eigenschaften des Partikels aufzudecken. Der besondere Abschnitt des Partikels, der beleuchtet wird, hängt von der Orientierung des Partikels in Bezug auf die Lichtquelle ab. Wo das Partikel oder das Objekt asymmetrisch ist, variieren die Lichtmessungen abhängig davon, welcher Abschnitt beleuchtet wird, was es schwierig macht, das Partikel oder das Objekt als Ganzes zu analysieren.
Derartige Schwierigkeiten treten bei der Durchflusszytometrie auf, da die zu analysierenden Partikel, z. B. Säugetierspermien, gewöhnlich asymmetrisch sind.
Durchfluss-Zytometer werden oft verwendet, um die Eigenschaften von Zellen oder Partikeln zu messen, die in einem Fluidstrom transportiert werden. Der Strom umfasst im Allgemeinen ein Mantelfluid, in dessen Mitte eine eingeengte wässrige Suspension von Zellen/Partikel eingespritzt ist. Das Mantelfluid fokussiert die Probenzellen/Probenpartikel in einer Reihe hintereinander. Der die Partikel/Zellen enthaltende Strom verläuft durch einen Prüfpunkt, der der Brennpunkt eines intensiven Lichtstrahls ist. Die Partikel/Zellen können mit einem lichtempfindlichen Farbstoff gefärbt sein, der das auftreffende Licht absorbiert und fluoresziert, wenn er beleuchtet wird. Das Licht streut von den Partikeln und/oder bewirkt alternativ Fluoreszenz. Dieses Streu- oder Fluoreszenzlicht wird hierauf von einem Detektor gemessen, der mit im Allgemeinen dem auftreffenden Strahl ausgerichtet ist. Die Kenndaten des erfassten Signals bzw. der erfassten Signale wie etwa die Peakintensität, die Peakfläche oder weitere Kenndaten von Interesse können nun verwendet werden, um Eigenschaften des Partikels, z. B. die Größe, abzuleiten.
In einem Durchfluss-Zytometer mit Sortiermöglichkeit (im Gegensatz zu einem rein analytischen Messgerät) kann das erfasste Signal bzw. können die erfassten Signale verwendet werden, um Sortiermittel, die zum Umleiten von Tröpfchen aus dem Fluidstrom programmiert werden können, zu triggern. Das Sortierkriterium richtet sich nach der Anwendung, wobei die Sortierung z. B. entsprechend der Größe oder im Fall von Spermien entsprechend des DNA-Inhalts der Zelle durchgeführt werden kann.
Ein Problem mit herkömmlichen Durchfluss-Zytometern ist, dass eine Partikelasymmetrie oft das Messen der optischen Eigenschaften erschwert. Beispielsweise kann ein flaches Partikel mit einer zufälligen Orientierung durch den Prüfpunkt gehen. Folglich kann sich die Intensität des resultierenden Streu- oder Fluoreszenzlichts entsprechend der Partikelorientierung ändern, wobei die Detektoren verschiedene Lichtintensitäten an verschiedenen Orten messen.
Somit kann eine Partikelasymmetrie zu einer verringerten Messauflösung für die Partikel führen. Daraus folgt, dass diese verringerte Auflösung in der Messung der Partikel bei Zytometern mit einer Sortiermöglichkeit eine verminderte Fähigkeit zur genauen Trennung von Zellpopulationen mit verschiedenen optischen Eigenschaften zur Folge hat. Ein solches Problem tritt bei der Trennung von männlichem und weiblichem Säugetiersperma auf.
Bei Säugetieren trägt das Sperma die das Geschlecht bestimmenden Chromosomen, wobei der im männlichen bzw. im weiblichen Sperma gefundene DNA-Gesamtinhalt verschieden sein kann. Beispielsweise beträgt bei Rindern der Unterschied im DNA-Inhalt zwischen männlichem und weiblichem Sperma etwa 4 %. Dieser Unterschied bei der DNA stellt ein Mittel breit, durch das Sperma in einem Durchfluss-Zytometer mit Sortierung getrennt werden kann, was eine Vorherbestimmung des Geschlechts der Nachkommenschaft möglich macht, wenn eine künstliche Fortpflanzung von Tieren durchgeführt wird. Die Verwendung einer solchen Technik bei der künstlichen Fortpflanzung von Tieren bietet beträchtliche ökonomische Vorteile im Viehmanagement, wird aber momentan durch die asymmetrische Geometrie des flachen Spermienkopfs erschwert. Beispielsweise besteht Bullensperma aus flachen Zellen mit Kopfabmessungen von etwa 10 Mikrometer mal 4 Mikrometer mal 1 Mikrometer, die mit einer Geißel von 40 Mikrometer verbunden sind. Die asymmetrischen Eigenschaften des Bullenspermienkopfs führen sowohl bei einer Streulicht- als auch einer Fluoreszenzlichtemission zu einer hohen Änderung mit der Spermienorientierung. Insbesondere ändert sich die Fluoreszenzemission mit der Spermienorientierung um einen Faktor zwei (siehe DNA Contention Measurements of Mammalian Sperm, CYTOMETRY 3:1–9 [1982]), was die Änderung in der Intensität von 4 % wegen des Geschlechts des Spermas wirksam verdeckt.
Eine Anzahl von durchflusszytometrischen Systemen sind in einem Bestreben entwickelt worden, die bei der Analysierung asymmetrischer Partikel wie etwa Spermazellen auftretenden Probleme zu überwinden.
Ein durchflusszytometrisches System, das in einem Bestreben, dieses Problem zu überwinden, entwickelt worden ist, führt asymmetrische Zellen, die in einem sich langsam bewegenden Strom transportiert werden, der Mitte eines schnell strömenden Mantelstroms zu. Die Hydrodynamik führt nun dazu, dass die asymmetrischen Zellen mit ihrer langen Achse parallel zur Richtung des schnell strömenden Mantelstroms ausgerichtet werden.
Während dieser Zugang zu einer Verringerung der vertikalen Änderung der Lichtintensität von asymmetrischen Partikeln führt, verbleibt die radiale Änderung. Dieses System ist ferner verfeinert worden, um die orientierungsbezogene Änderung in der erfassten Lichtintensität von Partikeln weiter zu verringern.
Das von Pinkel u. a. entwickelte System (siehe Flow Cytometry in Mammalian Sperm: Progress Morphology and DNA Measurement, THE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY 24:353–358 [1979]) zeigte, dass die Orientierung von Bullensperma durch Abschrägen des Endes der Röhre, die den Probenstrom (d. h. den, der das Sperma enthält) in die Mantelströmung einspritzt, weiter ausgerichtet werden kann.
Das System in Bezug auf die Trennung von Bullensperma nach dem Geschlecht, das darauf abzielt, die Probleme der durchflusszytometrischen Analyse von asymmetrischen Zellen zu überwinden, ist das von Johnson beschriebene (siehe Sex Preselection by Flow Cytometric Separation of X AND Y Chromosome Bearing Sperm Based on DNA Difference: A review, REPRODUCTIVE FERTILITY DEVELOPMENTS 7:893–903 [1995]). Der Zugang von Johnson verwendet zwei Detektoren; einen in Reihe mit dem Beleuchtungslaserstrahl (der 0°-Detektor) und einen rechtwinklig zu dem Strahl (der 90°-Detektor). Sperma emittiert Fluoreszenz vorzugsweise über seine schmalen Ränder. Johnson ermittelte durch Erfassen der starken Emission von seinen Rändern, welches Sperma mit dem Rand auf den 90°-Detektor ausgerichtet war, und verwendete den 0°-Detektor zur Messung der flachseitigen Emission von lediglich dem ausgerichteten Sperma.
Allerdings hat dieses System immer noch eine Anzahl von Nachteilen. Ein Nachteil ist, dass es eine Voraussetzung für dieses System ist, dass sich die Probeströmung in Bezug auf die Mantelströmung langsam bewegt, wodurch der Probendurchsatz verringert wird. Ein weiterer Nachteil ist, dass es eine gute Ausrichtung lediglich bei sehr niedrigen Durchflussmengen erzeugt. Bei der optimalen Durchflussmenge, die die größte Anzahl ausgerichteter Zellen pro Sekunde erzeugt, sind lediglich 40 % der Zellen ausgerichtet. Folglich ist die Anzahl ausgerichteter Zellen von 10 % auf 40 % vergrößert worden, wobei jedoch etwa 60 % der Zellen nicht ausgerichtet bleiben und es ferner wegen der Forderung einer niedrigen Durchflussmenge eine Verringerung im Systemdurchsatz gibt.
Es ist klar, dass die Aussortierung nicht ausgerichteter Zellen wiederum die Verarbeitungsgeschwindigkeit dieses Systems verringert und unnötig Spermazellen verschwendet.
Ein System, dass zur Sammlung radialen Lichts verschoben ist, ist der el lipsoidförmige Kollektor, der von Skogen-Hagenson u. a. beschrieben ist (siehe A High Efficiency Flow Cytometer, CYTOCHEMISTRY 25:784–789 [1977]), die ein Lichtsammelsystem auf der Grundlage eines "eiförmigen" Hohlreflektors aus Messing entwickelt haben. Die Reflektoroberfläche ist im Querschnitt elliptisch, wobei Licht vom Prüfpunkt in einem Brennpunkt in dem zweiten Brennpunkt gesammelt wird. Es wurde gezeigt, dass dieses System die Fähigkeit besitzt, die mit Bullensperma beobachtete Orientierungsabhängigkeit zu verringern.
Allerdings besitzt es noch immer eine orientierungsabhängige Beleuchtung (d. h., die Lichtquelle kommt aus einer einzigen Richtung). Ein weiteres Problem mit diesem System ist, dass es keine Sortierfunktion für Partikel (d. h. entsprechend dem Spermiengeschlecht) bereitstellen kann.
Ein weiteres System, das sowohl eine symmetrische Beleuchtung als auch eine symmetrische Lichtsammlung implementiert, ist das von Garner u. a. beschriebene Auflichtbeleuchtungssystem (siehe Quantification of the X and Y Chromosome Bearing Spermatozoa of Domestic Animals by Flow Cytometry, BIOLOGY OF REPRODUCTION 28:312–321 [1983]). In diesem System wird der Probenstrom direkt zu einer Mikroskopobjektivlinse mit hohem Brechzahlindex transportiert, wobei er seitwärts umgeleitet wird, nachdem der Strom durch den Brennpunkt der Linse gegangen ist. Die Beleuchtung wird durch die Linse geliefert, wobei das Licht durch die Linse zurückgesammelt wird.
Während dieses System ebenso eine gute Eignung zur Beseitigung die Orientierungsabhängigkeiten von Bullensperma zeigt, kann es auch nicht für eine Sortierung mit hoher Geschwindigkeit modifiziert werden. Dies liegt an seiner seitlichen Umleitung des Spermas unmittelbar nach dem Durchgang durch den Brennpunkt.
Frühere Systeme stützen sich außerdem wegen der Intensität von Laserlichtquellen auf Laserlicht. Leider können solche Lasersysteme sehr kostspielig sein, wobei sie lediglich zu den Kosten von Vorrichtungen wie etwa Durchfluss-Zytometern hinzukommen. Weil Laser typischerweise eine einzige Lichtwellenlänge liefern, hat die Verwendung von Lasern es außerdem er schwert, eine einzelne Lichtquelle zu verwenden, um eine Vielzahl von Lichtwellenlängen, beispielsweise in Verbindung mit Filtern, die alle Wellenlängen außer die gewünschten herausfiltern, bereitzustellen.
Abgesehen davon setzten vorhergehende Systeme oft die genaue Einstellung der Optik voraus, um eine genaue Ausgabe elektromagnetischer Strahlung auf die Zelle bei der Analysierung oder der Sammlung der von der Zelle emittierten Fluoreszenz zu erreichen. Dies kann ein langwieriger Vorgang sein, der zu den Kosten der Analysemessgeräte hinzukommt. Daher gibt es einen Bedarf für ein System, z. B. in der Durchflusszytometrie, bei dem die Optik, die elektromagnetische Strahlung zu Messzwecken fokussiert und sammelt, schnell und leicht in ihre richtige Orientierung eingerichtet ist.
US 3909749 (D2) offenbart ein Verfahren zur Schaffung eines ringförmigen Laserenergiestrahls und insbesondere einer verbesserten Fokussierbarkeit des ringförmigen Laserenergiestrahls.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die oben genannten Nachteile der bekannten optischen Vorrichtung mit besonderer Anwendung auf Durchfluss-Zytometer zu überwinden. Es ist außerdem eine Aufgabe der Erfindung, der Öffentlichkeit eine praktische Auswahl zu liefern.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein erster Aspekt der Erfindung stellt eine optische Vorrichtung bereit, die umfasst: eine optische Konfiguration, die einen ringförmigen Strahl elektromagnetischer Strahlung mit einer Mittelachse oder mehrere Strahlen elektromagnetischer Strahlung, die von einer Mittelachse gleichmäßig beabstandet sind, erzeugen kann; und einen Fokussierungsreflektor, der eine innere reflektierende Oberfläche mit einer optischen Achse und einem oder mehreren Brennpunkten besitzt, wobei der Reflektor so orientiert ist, dass er auf seiner reflektierenden Oberfläche den ringförmigen Strahl oder die mehreren Strahlen elektromagnetischer Strahlung empfängt.
Beispielsweise kann das optische Element sowohl irgendwelche bekannten reflektierenden Axicone als auch die oben beschriebenen besonderen Prismen, die in einigen Fällen ebenso Axicone sind, umfassen. Zum Beispiel kann das Axicon einen inneren konischen Spiegel mit vorwärts reflektierenden Oberflächen, der von einem äußeren konischen Spiegel mit vorwärts reflektierenden Oberflächen umgeben ist, umfassen, wobei die optischen Achsen der beiden Spiegel ausgerichtet sind. Die reflektierenden Oberflächen bilden den Buchstaben "W", woraus sich die Bezeichnung W-Axicon oder Waxicon ergibt.
Vorzugsweise hat der Fokussierungsreflektor eine innere reflektierende Oberfläche, die paraboloidförmig ist. Der Gebrauch des Ausdrucks "paraboloidförmiger Reflektor", der in der gesamten Beschreibung sowie in den Ansprüchen verwendet wird, meint selbstverständlich "einen Reflektor, der der Form eines Rotationsparaboloids entspricht". Der Ausdruck steht selbstverständlich ferner für "einen Abschnitt eines Rotationsvollparaboloids". Ähnlich kann in Bezug auf die optische Achse eines Paraboloids eine solche Achse als parabolische Achse oder Mittelachse des Paraboloids betrachtet werden.
Die Vorrichtung kann in ein Durchfluss-Zytometer integriert sein, das eine Strömungsquelle für die Erzeugung einer Strömung aus zu analysierenden Partikeln umfasst, wobei die Strömungsquelle die Partikelströmung im Wesentlichen durch einen der Brennpunkte der reflektierenden Oberfläche lenken kann. Zweckmäßig kann die Strömungsquelle die Strömung im Wesentlichen mit der optischen Achse der reflektierenden Oberfläche ausrichten. Außerdem kann eine Öffnung in dem Fokussierungsreflektor vorgesehen sein, die dem Durchgang der Strömung durch ihn hindurch dient.
Es ist wünschenswert, dass die vorliegende Erfindung in einem Durchfluss-Zytometer verwendet wird, das eine Sortierfunktion enthält. Folglich können die Strömungsmittel eine Düse enthalten und das Durchfluss-Zytometer kann unter der Öffnung im Fokussierungsreflektor eine elektrostatische Tröpfchenablenkungs-Sortiervorrichtung aufweisen.
In Übereinstimmung mit einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein optisches Verfahren bereitgestellt, das umfasst: Vorsehen eines Prismas, das einen pyramidenförmigen Abschnitt mit einer geraden Anzahl geneigter Flächen, die sich an einem Scheitelpunkt an einem vorderen Ende des Prismas treffen, eine Mittelachse, die durch den Scheitelpunkt verläuft, und eine hinter dem Scheitelpunkt des Prismas vorgesehene reflektierende Oberfläche, die einen auftreffenden Strahl elektromagnetischer Strahlung auf den Scheitelpunkt des pyramidenförmigen Abschnitts in einer auf die Mittelachse des pyramidenförmigen Abschnitts im Wesentlichen ausgerichteten Richtung lenkt, umfasst, um parallele Strahlen elektromagnetischer Strahlung, die von dem vorderen Ende des Prismas austreten, zu erzeugen.
Selbstverständlich ist der Gebrauch des Begriffs "Beleuchtung" oder "beleuchten" nicht bloß auf sichtbare Beleuchtung beschränkt, da ebenso nicht sichtbare Wellenlängen verwendet werden können. Wie zuvor erwähnt ist, kann bei bestimmten Anwendungen ultraviolette Strahlung verwendet werden. Abgesehen davon kann der Bezug auf elektromagnetische Strahlung, die von dem Partikel "erzeugt" wird, irgendeine Fluoreszenz, die im Ergebnis der auftreffenden Beleuchtung erzeugt wird, und/oder irgendwelches Licht, das durch die Partikel gestreut wird, einschließen. Außerdem soll "anstrahlen" selbstverständlich die gleiche Bedeutung wie "beleuchten" haben.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden klar aus der folgenden Beschreibung, die lediglich beispielhaft und anhand der beigefügten Zeichnung gegeben wird, in der:
1(a) eine Querschnittsansicht einer Ausführungsform einer optischen Vorrichtung ist, die einen ringförmigen Strahl elektromagnetischer Strahlung erzeugen kann;
1(b) ein Schnitt durch den Strahl von 1 ist;
1(d) eine perspektivische Ansicht einer Ausführungsform eines Prismas zur Verwendung in der optischen Vorrichtung von 1(a) ist;
1(e) eine perspektivische Ansicht einer alternativen Form eines Prismas zur Verwendung in der optischen Vorrichtung von 1(a) ist;
1(f) eine perspektivische Ansicht einer alternativen Prismenanordnung zur Verwendung in der optischen Vorrichtung von 1(a) ist;
1(g) eine perspektivische Ansicht einer alternativen Prismenanordnung zur Verwendung in der optischen Vorrichtung von 1(a) ist;
2 eine Schnittansicht eines paraboloidförmigen Reflektors ist;
3 verschiedene Ansichten durch einen Reflektor zeigt, der durchlassende und reflektierende Oberflächen aufweist;
4 eine Querschnittsansicht einer möglichen Ausführungsform für eine Reflektorvorrichtung ist;
5 eine Querschnittsansicht einer möglichen Ausführungsform für eine Reflektorvorrichtung ist;
6 eine Querschnittsansicht einer bevorzugten Ausführungsform eines Durchfluss-Zytometers in Übereinstimmung mit einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist;
7 eine Querschnittsansicht einer zweiten Ausführungsform eines Durchfluss-Zytometers in Übereinstimmung mit einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist;
8 eine Querschnittsansicht eines Durchfluss-Zytometers ist, das nicht Teil der Erfindung ist;
9 eine Querschnittsansicht eines Durchfluss-Zytometers ist, das nicht Teil der Erfindung ist;
10 eine Querschnittsansicht einer dritten Ausführungsform eines Durchfluss-Zytometers in Übereinstimmung mit einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist;
11 eine Querschnittsansicht einer vierten Ausführungsform eines Durchfluss-Zytometers in Übereinstimmung mit einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist;
12 eine Querschnittsansicht eines Reflektors ist, der in eine Durchflussdüsenkonstruktion gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung integriert ist;
13 eine Querschnittsansicht einer fünften Ausführungsform eines Durchfluss-Zytometers in Übereinstimmung mit einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist;
14 eine Querschnittsansicht einer sechsten Ausführungsform eines Durchfluss-Zytometers in Übereinstimmung mit einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist; und
15 eine Querschnittsansicht eines Durchfluss-Zytometers ist, das nicht Teil der Erfindung ist.
BESTE ARTEN DER AUSFÜHRUNG DER EFINDUNG
Einige Ausführungsformen der Erfindung sind erläutert in "A New Optical Configuration for Flow Cytometric Sorting of Aspherical Cells", Int. Soc. Optical Engr., Proc. Of Adv. Tech. Analytical Cytology, 1997, von John C. Sharpe, Peter N. Schaare und Rainer Kunnemeyer; "Radially Symmetric Excitation and Collection Optics for Flow Cytometric Sorting of Aspherical Cells", Cytometry 29:363–370 (1997) von John C. Sharpe, Peter N. Schaare, und Rainer Kunnemeyer; und "A New Optical Configuration for Flow Cytometric Sorting of Bovine Spermatozoa by Sex", einer von Johnathan Charles Sharpe an der Universität von Waikato eingereichten Dissertation für den Doktorgrad der Philosophie in Physik.
1(a) veranschaulicht eine optische Vorrichtung, die ein Prisma 1 enthält. Das Prisma 1 besitzt einen Scheitelpunkt 2 an einem vorderen Ende des Prismas, einen geraden konischen Abschnitt mit einer konischen Fläche 2 und einen an den konischen Abschnitt angrenzenden geraden zylindrischen Basisabschnitt. Der Basisabschnitt besitzt ein kreisförmiges hinteres Ende 4 mit einer reflektierenden Beschichtung. Es ist eine optische Anordnung geschaf fen, um einfallende elektromagnetische Strahlung 5 wie etwa ultraviolettes Licht von einer Laserlichtquelle bereitzustellen. Das UV-Licht 5 wird über einen zweiten Reflektor in Form eines Spiegels 6, der in einem Winkel von 45° in Bezug auf das einfallende Licht 5 und die Mittelachse des Prismas 1 angeordnet ist, in eine Richtung gelenkt, die mit der Mittelachse des Prismas 1 auf den Scheitelpunkt 2 des Prismas 1 ausgerichtet ist. Da das einfallende Licht 5 über den Scheitelpunkt 2 in das Prisma 1 eintritt, wird es vom Prisma 1 gebrochen und divergiert in einen Kegel, wobei es vom hinteren Ende 4 der Linse 1 reflektiert wird. Das reflektierte Licht verlässt das Prisma 1 durch seine konische Fläche 3 und wird als ein ringförmiger Strahl aus dem vorderen Ende des Prismas projiziert. Der Strahl definiert ein geschlossenes zylindrisches Lichtband mit einer Längsachse, die mit der Mittelachse des Prismas 1 zusammenfällt. 1(b) zeigt einen Querschnitt durch das geschlossene Lichtband. Die Erzeugung eines zylindrischen Lichtbands kann überall auf dem Gebiet der Optik von großem Nutzen sein. 1(e) veranschaulicht das Prisma 1 in einer perspektivischen Ansicht.
1(d) veranschaulicht eine alternative Form eines Prismas 22. Das Prisma 22 besitzt einen geraden pyramidenförmigen Abschnitt mit vier geneigten Flächen, die sich in einem Scheitelpunkt treffen. Es ist ferner ein Basisabschnitt vorgesehen, der im Querschnitt, der dem Querschnitt der Basis des pyramidenförmigen Abschnitts entspricht, quadratisch ist. Das Prisma kann auf dieselbe Weise wie das Prisma 1 verwendet werden, indem auftreffendes Licht in Übereinstimmung mit der Mittelachse des Prismas auf den Scheitelpunkt des Prismas gelenkt wird. Allerdings ergibt sich in dieser Ausführungsform das projizierte Licht als vier parallele Strahlen, die gleichmäßig von der Mittelachse beabstandet sind. Die Anzahl der geneigten Flächen des pyramidenförmigen Abschnitts kann sich ändern, vorausgesetzt, dass eine gerade Anzahl beibehalten wird.
1(f) veranschaulicht eine alternative Prismenanordnung, bei der eine reflektierende Oberfläche von dem hinteren Ende des in 1(e) gezeigten konischen Prismas oder des in 1(d) gezeigten pyramidenförmigen Prismas beabstandet sein kann. Der Abstand der reflektierenden Oberfläche 27 vom Prisma kann verstellbar sein.
1(g) veranschaulicht eine alternative Prismenanordnung, die als ein W-Axicon oder Waxicon bekannt ist. Das Waxicon 28 umfasst ein inneres konisches Axicon, das von einem ringförmigen Axicon konzentrisch mit dem inneren Axicon umgeben ist. Die reflektierenden Oberflächen definieren ein W, woraus sich die Bezeichnung Waxicon ergibt.
2 zeigt einen paraboloidförmigen Reflektor 20 in Form eines Spiegels mit einer paraboloidförmigen, inneren reflektierenden Oberfläche. Die paraboloidförmige, innere reflektierende Oberfläche besitzt einen Brennpunkt und eine optische Achse, die durch den Brennpunkt verläuft. Selbstverständlich kann die paraboloidförmige reflektierende Oberfläche die Eigenschaft aufweisen, durch die irgendwelches Licht, das den Brennpunkt des paraboloidförmigen Reflektors verlässt und auf die Oberfläche des Reflektors auftrifft, parallel zur optischen Achse aus dem Reflektor 20 reflektiert wird. Wenn Licht, das parallel zur optischen Achse reflektiert wird, eintritt und die reflektierende Oberfläche trifft wird es gleichermaßen zum und durch den Brennpunkt projiziert. Eine Öffnung 21 ist mittig in dem paraboloidförmigen Reflektor 20 in Übereinstimmung mit der optischen Achse angeordnet.
Folglich kann der paraboloidförmige Reflektor 20 verwendet werden, um eine allseitige Beleuchtung eines Objekts zur Analyse oder Prüfung zu erzielen. Durch das Positionieren des Objekts im Brennpunkt des paraboloidförmigen Reflektors 20 und das Bereitstellen von Licht, das auf die Oberfläche des Reflektors 20 und parallel zu der optischen Achse des Reflektors 20 auftrifft, kann das auftreffende Licht zu dem Objekt im Brennpunkt reflektiert werden. Falls weiterhin das einfallende parallele Licht in Bezug auf die optische Achse gleichmäßig beabstandet ist, ist die Beleuchtung des Objekts im Brennpunkt mit Licht radialsymmetrisch. Der paraboloidförmige Reflektor 20 kann somit mit der in 1 gezeigten optischen Vorrichtung in einer Weise zusammengebracht werden, in der der paraboloidförmige Reflektor 20 so orientiert ist, dass er das Licht empfängt, das von dem vorderen Ende des Prismas 1 mit der Mittelachse des Prismas 1, die mit der optischen Achse des paraboloidförmigen Reflektors 20 ausgerichtet ist, projiziert wird. Diese besondere Anordnung ist ferner in Zusammenhang mit dem in den 6, 7, 9, 10, 11, 13 gezeigtem Durchfluss-Zytometer erläutert. Allerdings ist der paraboloidförmige Reflektor nicht in seiner Verwendung in Verbindung mit der in 1 gezeigten opti schen Vorrichtung eingeschränkt.
Die 3(a) (i) und (ii) sind Draufsichten einer weiteren Ausführungsform des zweiten Reflektors von 1, der allgemein durch das Bezugszeichen 30 angegeben ist. Der Spiegel 30 weist reflektierende Oberflächen 31 und 32 auf. Der Spiegel 30 enthält außerdem einen Durchlassabschnitt, der die Form eines Rings 33 mit kreisförmigem Querschnitt aufweist. Es ist klar, dass der Durchlassabschnitt 33 in einigen Ausführungsformen in Form einer Öffnung, die sich durch den Spiegel 30 erstreckt, vorkommen kann. Allerdings kann der Durchlassabschnitt 33 in anderen Ausführungsformen wie etwa der, die in 3(b) klarer gezeigt ist, in Form eines durchsichtigen Materials wie etwa Glas 34, das nicht mit einer reflektierenden Oberfläche 35 abgedeckt worden ist, vorkommen. Wie 3(b) zeigt, wird alles einfallende Licht 36, das auf die reflektierende Oberfläche 35 stößt, reflektiert, wohingegen einfallendes Licht, das auf den Durchlassabschnitt 33 stößt, sich im Wesentlichen in derselben Richtung weiter fortpflanzen kann. Der Durchlassabschnitt 33 dient dazu, wenn er in einem Winkel von 45° angeordnet ist, aus dem er in Draufsicht in 3(a) (i) betrachtet ist, den Durchgang des von dem vorderen Ende des Prismas projizierten ringförmigen Lichtstrahls zu ermöglichen. 3(a) (ii) zeigt eine Draufsicht des zweiten Reflektors mit einem eiförmigen Durchlassabschnitt 33, der nötig ist, um den ringförmigen Durchlassabschnitt 33 zu erzielen, wenn er in 45° orientiert ist.
4 zeigt eine allgemein durch das Bezugszeichen 40 angezeigte alternative Reflektorvorrichtung, die verwendet werden kann, um von dem paraboloidförmigen Reflektor 20 in 2 reflektierte Beleuchtung zu sammeln. Die Reflektorvorrichtung 40 weist einen Körper 46 mit einer Anzahl reflektierender Oberflächen 41, 42 und 43 auf, die in Bezug auf die Detektorvorrichtung 40 so angeordnet sind, dass sie alles Licht reflektieren können, das sie in verschiedenen Richtungen und/oder in verschiedenen Winkeln empfangen.
Die Reflektorvorrichtung 40 weist in ihrem Körper 46 außerdem Gebiete 44 und 45 auf (die beide durch gestrichelte Linien abgegrenzt sind), die die Transmission von Licht 47 durch die Reflektorvorrichtung 40 zulassen. Es ist klar, dass die Gebiete 44 und 45 die Form von Öffnungen durch den Körper 46 aufweisen oder alternativ aus einer durchsichtigen Substanz bzw. einem durchsichtigen Material, die bzw. das die Transmission von Licht ermöglichen kann, hergestellt sein können. In Ausführungsformen, in denen die Gebiete 44 und 45 aus einer durchsichtigen Substanz bzw. einem durchsichtigen Material hergestellt sind, ist es normalerweise erwünscht, dass die Gebiete dieselbe Länge besitzen, wie durch den mit zwei Spitzen versehenen Pfeil x gezeigt ist, um sicherzustellen, dass der zurückgelegte Abstand und die Brechung des Lichts 47 in beiden Gebieten im Wesentlichen völlig gleich sind.
Die reflektierenden Oberflächen 41, 42 und 43 können die verschiedenen Lichttypen A, B, und C, die von der Reflektorvorrichtung 40 empfangen werden können, unterscheiden, indem sie sie in verschiedene Richtungen und/oder in verschiedenen Winkeln reflektieren. Folglich können die verschiedenen Lichttypen A, B und C zur Bestimmung der Kenndaten jedes Lichttyps zu geeigneten Lichtdetektoren (nicht gezeigt) reflektiert werden.
5 veranschaulicht eine allgemein durch das Bezugszeichen 50 angezeigte Detektorvorrichtung, die ebenso verwendet werden kann, um die Beleuchtung von dem in 2 gezeigten paraboloidförmigen Reflektor zu sammeln. In dieser Ausführungsform kann die Detektorvorrichtung 50 außerdem in einer zu der oben in Zusammenhang mit den 3 und 4 beschriebenen ähnlichen Weise für die Transmission von Licht 51 von einer Lichtquelle (nicht gezeigt) beschaffen sein. Die Detektorvorrichtung 50 kann ferner eine Anzahl von Lichtdetektoren 52, 53 und 54 aufweisen, die räumlich so angeordnet sind, dass sie die verschiedenen auf der Reflektorvorrichtung 50 auftreffenden Lichttypen A, B und C empfangen können. Somit ermöglicht die räumliche Orientierung der Lichtdetektoren 52, 53 und 54 auf der Detektorvorrichtung 50 die Unterscheidung zwischen verschiedenen Lichttypen. Dagegen kann dort, wo die Messung von bestimmtem Licht, z. B. bloß von der Lichtquelle reflektiertes Licht, nicht erwünscht ist, ermöglicht werden, dass sich solches Licht durch den bzw. die Durchlassabschnitte 51 der Detektorvorrichtung fortpflanzt.
6 veranschaulicht eine erste bevorzugte Ausführungsform eines allgemein durch das Bezugzeichen 70 angezeigten Durchfluss-Zytometers. Das Durchfluss-Zytometer 70 enthält die im Wesentlichen in 1 gezeigte optische Vorrichtung. Die optische Vorrichtung enthält eine eine Lichtquelle 71 und einen Spiegel 72 aufweisende optische Anordnung. Die Lichtquelle 71 erzeugt gebündeltes ultraviolettes Laserlicht 73, das über den Spiegel 72 zu einem Prisma 74, das eine Mittelachse besitzt, gelenkt. Das Prisma 74 ist so konfiguriert, dass ein Lichtzylinder 75 mit einer Längsachse, die mit der Mittelachse des Prismas zusammenfällt, erzeugt wird. Das Prisma kann das gleiche wie das in 1(a) oder (e) der Zeichnung angegebene sein. Alternativ kann das Prisma eine pyramidenförmige Fläche wie etwa die in 1(d) gezeigte aufweisen, so dass parallele Lichtstrahlen, die von der Mittelachse des Prismas gleichmäßig beabstandet sind, erzeugt werden. Das projizierte Licht 75 geht durch einen ringförmigen Spalt 76 in einem zweiten Reflektor 77, so dass es auf dem 45°-Punkt eines paraboloidförmigen Reflektors/Kollektors 78 auftrifft. In der folgenden Erläuterung wird ersichtlich, dass der Reflektor auch als ein Kollektor dient. Zur einfachen Bezugnahme wird der paraboloidförmige Reflektor/Kollektor 78 einfach als der paraboloidförmige Reflektor 78 bezeichnet. Der paraboloidförmige Reflektor 78 besitzt eine optische Achse, die mit der Mittelachse des Prismas ausgerichtet ist, und einen Brennpunkt F, der auf der optischen Achse liegt.
Innerhalb des paraboloidförmigen Reflektors 78 befindet sich eine Düsenbaueinheit 79, die einen Partikelstrom 80, z. B. Spermazellen, liefert, der im Wesentlichen mit der optischen Achse des paraboloidförmigen Reflektors ausgerichtet ist und durch eine Prüfzone verläuft, die im Brennpunkt F angeordnet ist. Die Düsenbaueinheit 79 liefert die Spermazellen in einer Mantelsalzlösung, wobei sie irgendeine der bekannten Strahl-in-Luft-Techniken (jet-in-air) verwenden kann, um einen Partikelstrom mit laminarer Strömung zu erzeugen, wobei das Sperma hintereinander aufgereiht durch die Prüfzone in F fließt.
Der paraboloidförmige Reflektor 78 ist mit zwei zu beachtenden Kriterien konstruiert. Erstens soll der Reflektor 78 der korrodierenden Umgebung widerstehen können, die durch das Milieu der Mantelsalzlösung eingebracht wird. Zweitens soll der Reflektor so konstruiert sein, dass der Reflexionsgrad von Licht der UV-Frequenz maximiert wird. Es wurde ermittelt, dass sowohl eine reflektierende Rhodiumbeschichtung als auch eine reflektierende AlSiO₂-Beschichtung auf einem Nickelsubstrat wirksam sind.
Die Effekt des an einem 45°-Punkt des paraboloidförmigen Spiegels 78 auf treffenden Lichtzylinders 75 ist, dass er in 90° reflektiert wird, so dass eine im Wesentlichen koplanare Lichtscheibe ausgebildet wird, die im Brennpunkt F des paraboloidförmigen Reflektors konvergent ist. Somit kann die Lichtscheibe mit dem Partikelstrom 80 in Wechselwirkung treten und die Partikel innerhalb des Stroms mit einer im Wesentlichen radialsymmetrischen Beleuchtung beleuchten.
Falls die Partikel mit einem lichtempfindlichen Farbstoff gefärbt worden sind, fluoreszieren die Partikel, wenn sie beleuchtet werden. Die Verwendung von Farbstoffen ist eine anerkannte Technik bei der Geschlechtsbestimmung von Sperma, da die Anzahl gebundener Farbstoffmoleküle zu der Anzahl der DNA-Moleküle äquivalent ist. Dieser Unterschied in der Aufnahme bringt einen Unterschied in der Anzahl von Zellen hervor, die für eine Anregung und Fluoreszenz verfügbar sind. Der Unterschied im DNA-Inhalt zwischen X- und Y-Sperma ergibt einen entsprechenden messbaren Unterschied im Fluoreszenzlicht. Es kann irgendeiner der bekannten momentan zur Geschlechtsbestimmung von Sperma verwendeten Farbstoffe verwendet werden. Insbesondere ist gezeigt worden, dass Hoechst 33342 aus der unten gezeigten Bisbenzimidazol-Familie die notwendige X-Y-Differenzauflösung erzielt.
Folglich wird Licht, das mit den Partikeln in Wechselwirkung tritt, gestreut und/oder fluoresziert. Dieses gestreute und/oder fluoreszierte Licht wird daraufhin durch den paraboloidförmigen Reflektor/Kollektor 78 gesammelt und parallel zur optischen Achse des paraboloidförmigen Reflektors 78 reflektiert. Der zweite Reflektor 77 ist im Wesentlichen in einem Winkel von 45° positioniert, um das gestreute und/oder fluoreszierte Licht zu einem Lichtdetektor in Form einer Photovervielfacherröhre 82 zu reflektieren. Der zweite Reflektor 77 kann passend die in den 3–5 veranschaulichten Formen umfassen.
Für die spezifische Anwendung der vorliegenden Erfindung bei der Geschlechtsbestimmung von Sperma ist das Fluoreszenzlicht von Interesse, wäh rend das von dem Sperma im Probenstrom lediglich gestreute Licht von geringem oder keinem Interesse sein kann. Das Fluoreszenzlicht ist von verschiedener Frequenz, wobei die Trennung der zwei Frequenzen durch die Verwendung eines Hochpassfilters 200 erreicht werden kann, der vor der Photovervielfacherröhre 82 positioniert ist. Alternativ kann die Trennung von Frequenzen durch die Verwendung eines frequenzselektiven Spiegels, um lediglich die interessierenden Frequenzen zu reflektieren, erreicht werden. Beispielsweise kann der frequenzselektive Spiegel in den zweiten Reflektor 77 integriert sein. Falls es allerdings bei bestimmten Anwendungen erwünscht ist, das gestreute Licht zu messen, ist kein Filter notwendig.
Es ist klar, dass anstelle des gezeigten einzelnen Messdetektors 82 eine Anordnung von Messdetektoren mit einer passenden Anordnung von Filtern versehen werden kann, um verschiedener Formen von Licht zu messen. Zum Beispiel gestattet die Verwendung eines zweiten Reflektors der Form, wie sie in 4 gezeigt ist, die Trennung von Licht von verschiedenen Teilen des paraboloidförmigen Reflektors, wobei es möglich ist, verschiedene Filter auf jeden der getrennten Lichtanteile anzuwenden.
Nicht mit den Partikeln in Wechselwirkung getretenes Licht kann durch das Medium, das den Probenstrom 80 bildet, gebrochen werden und strahlt als eine Scheibe in der dem einfallenden Licht entgegengesetzten Richtung ab. Da der Partikelstrom im Allgemeinen einen kleinen Durchmesser hat, ist die sich durch das Medium ergebende Lichtbrechung nicht groß. Folglich geht dieses Licht denselben Weg des beleuchtenden Lichtzylinders zurück und tritt durch den ringförmigen Spalt 76 in dem zweiten Reflektor 77 aus. Dies erzeugt einen einfachen aber wirksamen Strahlauffänger.
Es ist klar, dass die unterstützenden Strukturen der Komponenten des Durchfluss-Zytometers 70 einschließlich der Probendurchflussröhren für die Düsenbaueinheit Teile des Wegs für den Lichtzylinder 75 verdecken können. Allerdings ist irgendeine sich ergebende Asymmetrie in der Lichtscheibe im Allgemeinen vernachlässigbar, wobei der Lichtzylinder deshalb immer noch als zylindrisch angesehen wird. Die Optik kann sogar so beschaffen sein, dass ein auftreffender Strahl um Hindernisse gebrochen wird.
Die von der Photovervielfacherröhre gemessene Lichtmenge wird zu einem Prozessor, z. B. ein Computer (nicht gezeigt), geschickt, um vorgegebene Informationen wie etwa eine Zuordnung zwischen der gemessenen Lichtmenge und einer Eigenschaft der Zelle von jedem der wenigstens einigen Partikel in der Strömung abzuleiten. Diese Informationen werden daraufhin von einem Korrelator wie etwa ein Computer mit dem entsprechenden Partikel auf der Ausgangsseite der Prüfzone korreliert, um eine Sortierung des Partikels abhängig davon sicherzustellen, ob er bestimmte Auswahlkriterien erfüllt. Beispielsweise kann männliches und weibliches Sperma nach dem Geschlecht sortiert werden.
Die Durchflusssortiertechnik verwendet die Elektrostatik, um ein eine Zelle enthaltendes Tröpfchen aufzuladen und abzulenken, während es durch ein elektrisches Feld hindurchgeht. Das Tröpfchen wird durch eine mechanische Schwingung erzeugt, die durch einen piezoelektrischen Wandler zugeführt wird, wobei folglich der Probenstrom gestört wird, während er aus der Düse 79 austritt. Jedes einzelne Tröpfchen kann je nach den Merkmalen seines enthaltenen Partikels kurz vor dem Abbrechen durch das Anlegen einer Spannung an das Trägerfluid aufgeladen werden. Abhängig von seiner Ladung wird das Tröpfchen durch entgegengesetzt geladene Platten 83 von seiner normalen Gravitationstrajektorie abgelenkt. Um eine Tröpfchensortierung zu integrieren, kann es notwendig sein, Mittel vorzusehen, mit denen der Strom zu betrachten ist, um die Anzahl von Tröpfchenabständen zwischen dem Prüfpunkt (d. h. dem Brennpunkt F) und dem Abbruchpunkt der Tröpfchen zu zählen. Dies kann normalerweise durch Einschieben eines kleinen Periskops durch die Öffnung 84 an der Basis des parabelförmigen Reflektors 78 erfolgen. Tröpfchen, die nicht elektrostatisch von dem Mittelweg abgelenkt werden, werden direkt darunter gesammelt und zum Ablauf.
In 7 ist ein allgemein durch das Bezugszeichen 100 angezeigtes alternatives Durchfluss-Zytometer bereitgestellt, wobei dieses Durchfluss-Zytometer dem in 6 gezeigtem Durchfluss-Zytometer 70 im Wesentlichen ähnelt. Für eine einfache Bezugnahme sind daher ähnliche Bezugszeichen verwendet worden, um die in dieser Ausführungsform verwendeten Komponenten zu veranschaulichen.
Der Hauptunterschied bei dieser in 7 gezeigten Ausführungsform ist, dass lediglich Licht 101, das von den oberen Gebieten des paraboloidförmigen Reflektors gesammelt wird, von den Photovervielfachern 102 empfangen wird. Dementsprechend braucht der zweite Reflektor 77 nicht von dem Typ zu sein, der bei der vorherigen Ausführungsform erläutert ist. Stattdessen braucht nur ein in dem zylindrischen Strahl 75 eingeschlossener lückenloser Spiegel verwendet zu werden, um das vorwärts gestreute und/oder fluoreszierte Licht 103 nach außen zu reflektieren.
Dagegen ist leicht erkennbar, dass, wo es lediglich erwünscht ist, vorwärts gestreutes und/oder fluoresziertes Licht zu berücksichtigen, Lichtmessdetektoren geeignet positioniert werden können, so dass sie lediglich dieses Licht empfangen.
Während des Experimentierens wurde gefunden, dass eine Erhöhung im Proben-Mantel-Differenzdruck eine erhöhte Lageunbestimmtheit der Partikel über den Brennpunkt zur Folge hat, was zu einem Unterschied in der Beleuchtung und daher bei der Fluoreszenzemission führt. Es gibt eine Anzahl möglicher Lösungen, die entweder einzeln der in Kombination verwendet werden können, um den Brennpunkt um den Probenstrom zu verbreitern.
Die radiale Optik liefert eine konvergente Scheibe von Licht in der Anregungswellenlänge an den Prüfpunkt. Die Einstellung der vertikalen Abmessung des radialen Brennpunkts ist relativ einfach, falls ein konkaves oder konvexes Element vor dem Axicon im Laserstrahl positioniert ist. Allerdings ist das laterale Verbreitern des Brennpunkts, wobei gleichzeitig eine ausreichende Lichtintensität im Brennpunkt für die Farbstoffanregung und Farbstofffluoreszenz aufrechterhalten wird, nicht trivial ist.
Das laterale Verbreitern oder Defokussieren des radialen Brennpunkts erfordert, dass der Beleuchtungslichtzylinder geändert wird, um eine Divergenz tangential um seinen kreisförmigen Querschnitt zu bewirken. Dies führt zu einer lateralen Verstellung der einfallenden Lichtscheibe, wodurch die Intensitätsverteilung der Fläche des Brennpunkts verbreitert wird. Es wurden einige optische Elemente für die Durchführung dieser Funktion vorgeschlagen. Das erste optische Element hat die Form eines radial geätzten Beugungsgitters. Ein solches Element erreicht mit Erfolg das Ziel einer lateralen Verstellung mit einer minimalen streuenden Wirkung im vertikalen Profil des Brennpunkts. Das zweite optische Element ist ein Lichtformungs-Diffuserelement. Die Implementierung dieses Elements in die Konstruktion der radialen Optik führt sowohl zu einer vertikalen als auch einer lateralen Brennpunktverbreiterung. Weitere Optionen enthalten einen Diffraktor oder eine Zylinderlinse, die bewirken, dass der Strahl seitwärts gebeugt und der Brennpunkt verbreitert wird.
Ein weiterer Zugang ist die Verwendung der Fokussierungseigenschaften des Laserstrahls, der ein Gaußscher Strahl ist, bei dem die Schärfentiefe 1 proportional zur Brennweite f und umgekehrt proportional zum Strahldurchmesser D ist. Die Variable L ist definiert als halbhohe Breite des Flussdichteprofils längs der optischen Achse. Somit bewirkt eine Vergrößerung der Brennweite des paraboloidförmigen Reflektors eine Vergrößerung in d. Ferner verursacht einer Verkleinerung des Durchmessers des beleuchtenden Laserstrahls eine Vergrößerung in d.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können paraboloidförmige und ellipsoidförmige Konfigurationen des Reflektors verwendet werden, um eine Beleuchtung der Prüfzone einer linearen Partikelströmung zu erzielen. Ein deutlicher Vorteil dieses Systemtyps ist die Fähigkeit, eine kostengünstige Bogenlampe zu verwenden, um den kostspieligeren Laser, der häufig in Messgeräten dieses Typs verwendet wird, zu ersetzen. Laser werden in einigen Vorrichtungen wegen der Lichtintensität, die sie liefern können, bevorzugt. Allerdings haben sie den Nachteil, dass sie lediglich eine spezifische Wellenlänge elektromagnetischer Strahlung bereitstellen. Bogenlampen jedoch sind weniger kostspielig und können viele verschiedene Wellenlängen elektromagnetischer Strahlung in ihren Emissionen bereitstellen. Die richtige Wellenlänge kann dann durch die Verwendung eines preiswerten Filters, das die unerwünschten Wellenlängen elektromagnetischer Strahlung herausfiltert, ausgewählt werden.
Nunmehr in 8 ist eine ellipsoidförmige Ausführungsform, die nicht Teil der Erfindung ist, zu sehen. 8 zeigt ein Analysemessgerät 201 wie etwa ein Durchfluss-Zytometer, in dem ein erster Reflektor 200 mit einer Teilellipsoid-Form über einer Strömungsquelle angeordnet ist, die eine Strömung 237 von zu analysierenden Partikeln erzeugt. Der Reflektor kann als ein teilellipsoidförmiger Reflektor bezeichnet werden, da er im Wesentlichen ein halbes Ellipsoid ist. Dennoch ist er angesichts der Kontur seiner Oberfläche selbstverständlich als ellipsoidförmig oder ähnlich eine Teilellipsoid-Form besitzend zu erkennen. Der erste Reflektor 200 besitzt sowohl einen nahen Brennpunkt 202, der in der Nähe der Oberseite des in 8 gezeigten Ellipsoids angeordnet ist, und einen fernen Brennpunkt 204, der unter der Teilellipsoid-Form in 8 angeordnet ist. Eine Mittelachse 208 der Teilellipsoid-Form ist durch diese beiden Brennpunkte definiert.
Ein zweiter Reflektor 216 kann unter dem ersten Reflektor angeordnet oder orientiert sein. Der zweite Reflektor kann wiederum eine Teilellipsoid-Form besitzen. Überdies kann die Teilellipsoid-Form einen nahen Brennpunkt 220, der in der Nähe der Unterseite von 8 angeordnet ist, und einen fernen Brennpunkt 224, der mit dem fernen Brennpunkt 204 des ersten Reflektors überlappend oder zusammenfallend angeordnet ist, besitzen. Außerdem kann die Teilellipsoid-Form des zweiten Reflektors eine Mittelachse 228 besitzen, die durch ihren nahen und ihren fernen Brennpunkt definiert ist. Vorzugsweise ist die Mittelachse 208 des ersten Reflektors im Wesentlichen mit der Mittelachse 228 des zweiten Reflektors ausgerichtet.
Eine Quelle elektromagnetischer Strahlung wie etwa eine Bogenlampe 212 kann im nahen Brennpunkt des ersten Reflektors 200 angeordnet sein. Wegen der Eigenschaften eines Ellipsoids kann elektromagnetische Strahlung, die von der Quelle elektromagnetischer Strahlung vom nahen Brennpunkt 202 ausgestrahlt wird und auf dem ersten Reflektor 200 auftrifft, zum fernen Brennpunkt des ersten Reflektors zurückreflektiert werden. Wenn der ferne Brennpunkt 204 des ersten Reflektors und der ferne Brennpunkt 224 des zweiten Reflektors zusammenfallen und die Mittelachse 208 des ersten Reflektors und die Mittelachse 228 des zweiten Reflektors kollinear sind, kann dieses reflektierte Licht auf einem Weg so weiterlaufen, dass es auf dem zweiten Reflektor 216 auftrifft. Der zweite Reflektor 216 kann hierauf das Licht reflektieren, das durch den fernen Brennpunkt 224 des zweiten Reflektors zum nahen Brennpunkt 220 des zweiten Reflektors übertragen wird. Auf diese Weise wird ein reelles Bild der Quelle elektromagnetischer Strahlung, die sich im nahen Brennpunkt 212 des ersten Reflektors befindet, im nahen Brennpunkt 220 des zweiten Reflektors 216 erzeugt. Daher kann eine sehr intensive Lichtquelle auf die Prüfzone 236 der linearen Partikelströmung konzentriert werden, wenn sich die Prüfzone im nahen Brennpunkt 220 des zweiten Reflektors befindet. Dies erlaubt zudem eine Bogenlampe zu verwenden, da eine Quelle mit gebündelten Strahlen wie etwa ein Laser wegen der Fähigkeit des Reflektors, ein reelles Bild der Quelle der elektromagnetischen Strahlung zu erzeugen, unnötig ist. Und außerdem kann ein Filter wie etwa ein frequenzselektives Filter 240 verwendet werden, um irgendwelche Wellenlängen unerwünschter elektromagnetischer Strahlung herauszufiltern.
Wenn beleuchtete Partikel fluoreszieren, kann die Fluoreszenz 215 durch den zweiten Reflektor zu einer reflektierenden Oberfläche wie etwa das frequenzselektive Filter 240, dass die Fluoreszenz zur Erfassung zum Detektorgehäuse 244 reflektiert, zurückreflektiert werden. Wegen der ellipsoidförmigen Geometrie wird ein konvergierender Strahlensatz erzeugt, wobei folglich keine Notwendigkeit für die Optik besteht, die Fluoreszenz auf den Detektor zu fokussieren. 8 zeigt ferner, dass ein Zellenstrom zum Sortieren oder Analysieren abgelenkt werden kann, während die Zellen durch eine Öffnung im zweiten Reflektor 216 fallen.
In 8 sind der erste Reflektor und der zweite Reflektor mit Brennweiten f1 bzw. f2 gezeigt. Wenn diese Brennweiten äquivalent sind und die fernen Brennpunkte zusammenfallen und die Mittelachsen ausgerichtet sind, wie gezeigt ist, hat das reelle Bild der Bogenlampe die gleiche Größe wie die wirkliche Bogenlampe. Allerdings ist es in einigen Fällen erwünscht, die Größe des reellen Bilds der Bogenquelle zu schrumpfen. Dies ist der Fall, wenn eine Möglichkeit besteht, dass zwei Zellen in der Prüfzone sehr eng beieinander liegen. In solch einem Fall kann es wichtig sein, ein reelles Bild zu verkleinern, so dass auftreffende Strahlung lediglich auf der zu analysierenden Zelle und nicht der zweiten nahe gelegenen Zelle auftrifft. Dies verhindert die Fluoreszenz von einer zweiten Zelle, die eine fehlerhafte Analyse verursachen kann. Es ist wahrscheinlicher, dass die Zellen dicht beieinander sind, wenn der Durchsatz des Analysegeräts erhöht ist.
Die Anordnung von 8 kann mit lediglich dem unteren Reflektor und einer alternativen Lichtquelle zum Beleuchten der Partikelströmung verwendet werden. Dies kann einen Laser betreffen, der auf die Partikelströmung oder von der reflektierenden Oberfläche des ellipsoidförmigen Reflektors 216 gelenkt wird. Dies ist eine einzigartige Anordnung in der Durchflusszytometrie, weil die Partikelströmung koaxial mit der Mittelachse des ellipsoidförmigen Reflektors 216 ausgerichtet ist, so dass sie durch den nahen Brennpunkt des ellipsoidförmigen Reflektors 216 verläuft. Nachdem die Partikelströmung durch den Brennpunkt gegangen ist, in dem die Partikel mit elektromagnetischer Strahlung für das Analysieren bestrahlt wurden, können sie auf Grund ihres kennzeichnenden Verhaltens sortiert werden. Elektrostatische Platten können unter der Öffnung in der ellipsoidförmigen reflektierenden Oberfläche vorgesehen und angeordnet sein, um die Partikel abzulenken, während sie in der Nähe der elektrostatischen Platten oder zwischen ihnen durchgehen. Diese Ausführungsform ist insbesondere kennzeichnend für Durchfluss-Zytometer des Strahl-in-Luft-Typs.
In 9 ist eine ähnliche Anordnung zu der in 8 gezeigten zu sehen, wobei der Hauptunterschied darin besteht, dass Paraboloid-Formen für die Reflektoren verwendet sind. Ein erster Reflektor 200 besitzt eine Teilparaboloid-Form, wobei ein Brennpunkt (oder Fokus) 302 so angeordnet ist, dass die elektromagnetische Strahlung aus einer Quelle elektromagnetischer Strahlung wie etwa eine Bogenlampe 312 reflektiert wird. Die Quelle elektromagnetischer Strahlung kann im Brennpunkt des Paraboloids positioniert sein, so dass alle Emissionen, die vom Brennpunkt ausgehen und auf dem Teilparaboloid auftreffen, als gebündelte Strahlen 313 zu einem zweiten Reflektor 316 reflektiert werden. Der erste Reflektor 300 und der zweite Reflektor 316 besitzen jeder eine parabolische Achse 308 bzw. 338. Diese Achsen können so ausgerichtet sein, dass sich ein reelles Bild der elektromagnetischen Quelle im Brennpunkt (oder Fokus) 320 des zweiten Reflektors 316 ergibt. Eine Strömungsquelle 332 kann eine Partikelströmung 337 bereitstellen, die durch den Brennpunkt 320 des zweiten Reflektors 316 fließt. Der Abschnitt der Partikelströmung, der durch den Brennpunkt fließt, kann als Prüfzone 336 bezeichnet werden, auf den die elektromagnetische Strahlung fokussiert ist, um eine Zelle zu analysieren, die durch die Prüfzone fällt.
Wenn die auftreffende elektromagnetische Strahlung auf eine Zelle in der Prüfzone auftrifft, kann die gefärbte Zelle zum Fluoreszieren veranlasst wer den. Diese Fluoreszenz 315 kann daraufhin von dem zweiten Reflektor 316 zu einem Reflektor wie etwa ein frequenzselektiver Spiegel 340, der die Fluoreszenz zu einer optischen Vorrichtung 345 lenkt, die die Fluoreszenz auf einen Detektor 344 fokussiert, reflektiert werden.
Abermals schafft die Auswahl äquivalenter Brennweiten f1 und f2 für den ersten Reflektor bzw. den zweiten Reflektor ein reelles Bild der Bogenlampe der gleichen Größe im Brennpunkt des zweiten Reflektors. Ähnlich führt die Auswahl einer Brennweite für den zweiten Reflektor, die kleiner als die Brennweite des ersten Reflektors ist, zu einem kleineren Bild, das hilft; einen Fehler zu vermeiden, wenn ein hoher Durchsatz von Zellen erwünscht ist und folglich die Zellen in der Prüfzone näher beieinander liegen.
In den 8 und 9 ist ersichtlich, dass Platten bereitgestellt sein können, um die Zellen zu sortieren, wenn sie die Ellipsoid-Form oder die Paraboloid-Form verlassen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann eine Düse 400 mit einem Reflektor versehen sein, der an die Düse selbst gekoppelt ist. Tatsächlich kann der Reflektor sogar einteilig mit der Düse ausgebildet sein. Dies bietet dem Nutzer der Analysevorrichtung einen erheblichen Vorteil, da es keine Notwendigkeit zur Ausrichtung der Komponenten gibt, da ja die Kopplung diese Aufgabe erfüllen kann. Anhand der 10, 11, 12 und 13 ist ersichtlich, wie verschiedene Ausführungsformen einer solchen Düse implementiert werden können. In 10 ist eine paraboloidförmige Düse gezeigt. Die Düse kann aus einem Material wie etwa Glas, das die Transmission elektromagnetischer Strahlung wie etwa sichtbares Licht erlaubt, gefertigt sein. Auftreffende Strahlen elektromagnetischer Strahlung aus einer Quelle elektromagnetischer Strahlung wie etwa eine Laserquelle 520 in 11 verlaufen durch den Düsenkörper und treffen auf einem Reflektor 402 auf. Der Reflektor 402 ist an die Düse selbst gekoppelt, anstatt getrennt von der Düse vorhanden zu sein. Eine Öffnung 404 kann in der Düse vorgesehen sein, so dass eine Partikelströmung 408 hindurchfließen kann. Der Reflektor 402 kann so orientiert sein, dass die auftreffende elektromagnetische Strahlung auf die Partikelströmung 408 reflektiert wird.
Ein Paraboloid und ein Ellipsoid sind zwei mögliche Formen, die für die reflektierende Oberfläche des Reflektors verwendet werden können. In 10 ist eine paraboloidförmige reflektierende Oberfläche 412 gezeigt, während in 11 eine ellipsoidförmige reflektierende Oberfläche 512 gezeigt ist. Wie anderweitig erläutert ist, kann sich eine Prüfzone 416 mit einem Brennpunkt bzw. mit Brennpunkten der reflektierenden Oberfläche wie etwa der Brennpunkt 420 des Paraboloids von 10 überlappen, um die erwünschten Reflexionsmuster zu erzeugen.
Die Düse kann mit einer Quelle elektromagnetischer Strahlung wie etwa eine Laserquelle 520 verwendet werden, wie in 11 gezeigt ist. Allerdings ist es ebenso vorstellbar, dass eine Bogenlampe oder auch eine andere Quelle verwendet werden kann. Die Quelle elektromagnetischer Strahlung emittiert Strahlen 450, die auf die reflektierende Oberfläche gelenkt werden können. Wenn die elektromagnetische Strahlung auf eine in der Analyse befindliche Zelle auftrifft, wird Fluoreszenz erzeugt, wie durch Strahlen 451 gezeigt ist.
Zur Erzeugung der reflektierenden Oberfläche ist eine Vielzahl von Formgebungen möglich. Zunächst kann dem Düsenkörper eine Paraboloid-Form oder eine Ellipsoid-Form verliehen werden, woraufhin er mit einem reflektierenden Material 428, das auf die Oberfläche der Düse aufgebracht wird, beschichtet werden kann. Außerdem kann ein Reflektor wie etwa ein Metallreflektor 424 in den Düsenkörper eingesetzt oder eingelassen sein, wie in 12 gezeigt ist. Es ist auch möglich, sich auf reflektierende Eigenschaften zu stützen, die eine innere Reflexion oder sogar eine innere Totalreflexion bewirken.
In 13 ist eine Ausführungsform gezeigt, bei der die Düse so geformt ist, dass der Brennpunkt 420 der reflektierenden Oberfläche außerhalb der Düse liegt. Außerhalb soll auf der Außenseite des Düsenkörpers oder von ihm weg bedeuten. In solch einer Ausführungsform kann elektromagnetische Strahlung in den Brennpunkt gelenkt werden, ohne dass sie den Düsenkörper durchqueren muss.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist in 14 zu sehen. In 14 kann die Konfiguration der radialen Optik für ein Durchfluss-Zytometer 500 eine radiale 360°-Beleuchtung mit einer radialsymmetrischen Sammlung von Fluoreszenz von Partikeln oder Zellen, während sie durch die Prüfzone hindurchgehen, verbinden. Es können ein Glaskegel 516 und ein paraboloidförmiger Reflektor 528 verwendet werden. Der optische Strahl eines Lasers 508 kann auf die Spitze des Glaskegels gelenkt werden. Der Strahl kann daraufhin in einen divergenten Lichtkegel gebrochen werden, der rückreflektiert wird, um einen Laserlichtzylinder zu erzeugen, der den Eingangsstrahl umschließt und antiparallel zu ihm ist. Dieser Lichtzylinder kann nun von einem elliptischen 45°-Ringspiegel 512 reflektiert und parallel zu der optischen Achse des paraboloidförmigen Reflektors 528 ausgerichtet werden. Der Einfallswinkel des zylindrischen Strahls am Reflektor beträgt 45° und bewirkt, dass der Strahl eine koplanare konvergente Scheibe senkrecht zum Probenstrom und auf ihn fokussiert ausbildet.
Gefärbte Zellen können von dem Probenstrom durch den radialen Anregungsbrennpunkt getragen und zum Fluoreszieren veranlasst werden. Ein großer Teil der Fluoreszenz kann von dem paraboloidförmigen Reflektor gesammelt und in einem gebündelten Strahl nach außen auf eine asphärische Feldlinse 504 projiziert werden. Die Linse kann das Fluoreszenzlicht zu einem Punkt fokussieren, der von einem Mikroskopobjektiv 520 in eine Photovervielfacherröhre (PMT) 501 und ein Filtergehäuse abgebildet wird. Die optische Ausrichtung von Proben, die durch das Brennpunktgebiet des paraboloidförmigen Reflektors fließen, kann erreicht werden, indem die Durchflusszellenposition so eingestellt wird, dass Fluoreszenzsignale von Eichmikrokugeln maximiert werden. Der paraboloidförmige Reflektor kann in der Basis ein Loch oder eine Öffnung aufweisen, durch das der Probenstrom austreten kann und wo sich eine Strahlbeobachtungskamera und ein Tröpfchensortiermechanismus 532 befinden kann.
In 15 ist eine vereinfachte Version der Geometrie von 14 gezeigt. Die Fluoreszenzsammelelemente können beibehalten werden, um eine radialsymmetrische Erfassung von Zellen zu erzielen, während sie durch den Prüfpunkt des Durchfluss-Zytometers gehen. Die Anregung von Zellen kann durchgeführt werden, indem ein Laserstrahl 608 in einem Einfallswinkel, der zu einer Strahlzuführung aus einer Richtung ähnlich der Beleuchtung eines normalen Durchfluss-Zytometers führt, auf den paraboloidförmigen Reflektor 628 gelenkt wird. Dies kann erreicht werden, indem der Strahl von einem Spiegel 612 reflektiert wird. Die Erfassung von Zellen kann durch eine Kombination eines paraboloidförmigen Reflektors und einer asphärischen Linse durchgeführt werden. Eine einzelne PMT, beispielsweise mit einem LP-Filter 400, kann so positioniert werden, dass das ganze von der asphärischen Linse fokussierte Licht gesammelt wird. Es kann ferner ein zusätzliches neutralgraues Filter (ND = 1,3) verwendet werden, um eine Sättigung des Detektors auch bei niedrigen PMT-Verstärkerspannungen zu verhindern.
Die Vorrichtung in 15 ist besonders nützlich, da sie keine so kostspielige Ausrichtung der Optik erfordert, wie sie bei den anderen Ausführungsformen erforderlich ist. Ein ellipsoidförmiger Kollektor kann ferner verwendet werden, um das Laserlicht zu liefern, das von einem Justierspiegel 612 reflektiert wird, und um Fluoreszenz zu reflektieren, so dass sie in der PMT gesammelt wird. Die Ausführungsformen in 15 und 16 sind wegen der einfachen im Wesentlichen koaxialen Ausrichtung des Reflektors mit dem Detektor besonders vorteilhaft.
Es ist klar, dass sich die in dieser Beschreibung beschriebenen Ausführungsformen auf physikalische Anordnungen stützen, die wegen physikalischer Beschränkungen der Spiegel, der Optik sowie der physikalischen Orientierung der Ausrüstung keine vollständige oder perfekte Sammlung, Transmission, Symmetrie, Reflexion, Ausrichtung usw. ermöglichen können. Im Hinblick auf diese Grenzen können solche Eigenschaften wenigstens immer noch als wesentlich angesehen werden.
Die Aspekte der vorliegenden Erfindung sind lediglich beispielhaft beschrieben worden, wobei klar ist, dass Änderungen und Zusätze an ihr vorgenommen werden können, ohne von ihrem Umfang abzuweichen.

Claims

Optische Vorrichtung, die umfasst: eine optische Konfiguration, die einen ringförmigen Strahl (7, 24) elektromagnetischer Strahlung mit einer Mittelachse oder mehrere Strahlen (7; 22) elektromagnetischer Strahlung, die von einer Mittelachse gleichmäßig beabstandet sind, erzeugen kann; und einen Fokussierungsreflektor (78), der eine innere reflektierende Oberfläche mit einer optischen Achse und einem oder mehreren Brennpunkten besitzt, wobei der Reflektor so orientiert ist, dass er auf seiner reflektierenden Oberfläche den ringförmigen Strahl oder die mehreren Strahlen elektromagnetischer Strahlung (75) im Wesentlichen empfängt.
Optische Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der die optische Konfiguration ein reflektierendes Axicon umfasst.
Optische Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der die optische Konfiguration ein Waxicon umfasst.
Optische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der die innere reflektierende Oberfläche paraboloidförmig ist.
Optische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei der die optische Achse der reflektierenden Oberfläche auf die Mittelachse im Wesentlichen ausgerichtet ist.
Optische Vorrichtung nach Anspruch 11, bei der die optische Konfiguration ein Prisma (24) umfasst, das einen konischen Abschnitt mit einem Scheitelpunkt an einem vorderen Ende des Prismas sowie eine durch den Scheitelpunkt des Prismas eintretende Mittelachse besitzt.
Durchfluss-Zytometer (70), das die Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 enthält und eine Strömungsquelle für die Erzeugung einer Strömung aus zu analysierenden Partikeln umfasst, wobei die Strömungsquelle die Partikelströmung im Wesentlichen durch den Brennpunkt oder einen der Brennpunkte der reflektierenden Oberfläche lenken kann.
Durchfluss-Zytometer (70) nach Anspruch 7, bei dem die Strömungsquelle die Strömung im Wesentlichen auf die optische Achse der reflektierenden Oberfläche ausrichten kann.
Durchfluss-Zytometer (70) nach Anspruch 7 oder nach Anspruch 8, bei dem eine Öffnung (84) in dem Fokussierungsreflektor vorgesehen ist, die dem Durchgang der Strömung durch den paraboloidförmigen Reflektor dient.
Durchfluss-Zytometer (70) nach Anspruch 9, bei dem die Strömungsquelle eine Düse (79) enthält und bei dem unter der Öffnung im Fokussierungsreflektor eine elektrostatische Tröpfchenablenkungs-Sortiervorrichtung (83) vorgesehen ist.
Durchfluss-Zytometer nach einem der Ansprüche 7 bis 10, bei der die Quelle elektromagnetischer Strahlung ultraviolettes Licht bereitstellt.
Optisches Verfahren, das umfasst: Vorsehen eines Prismas (22), das einen pyramidenförmigen Abschnitt mit einer geraden Anzahl geneigter Flächen, die sich an einem Scheitelpunkt (2) an einem vorderen Ende des Prismas treffen, eine Mittelachse, die durch den Scheitelpunkt verläuft, und eine hinter dem Scheitelpunkt des Prismas (22) vorgesehene reflektierende Oberfläche, die einen auftreffenden Strahl (5) elektromagnetischer Strahlung auf den Scheitelpunkt (2) des pyramidenförmigen Abschnitts in einer auf die Mittelachse des pyramidenförmigen Abschnitts im Wesentlichen ausgerichteten Richtung lenkt, umfasst, um parallele Strahlen (7) elektromagnetischer Strahlung, die von dem vorderen Ende des Prismas (22) austreten, zu erzeugen.
Optisches Verfahren nach Anspruch 12, das ferner das Verwenden eines paraboloidförmigen Reflektors (78), der eine innere reflektierende Oberfläche mit Paraboloid-Form besitzt, wobei die reflektierende Oberfläche eine optische Achse und einen Brennpunkt hat; und das Orientieren des paraboloidförmigen Reflektors, derart, dass er auf seiner reflektierenden Oberfläche die aus dem vorderen Ende des Prismas (22) austretenden parallelen Strahlen (75) elektromagnetischer Strahlung empfängt, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13, das ferner umfasst: im Wesentlichen Ausrichten der optischen Achse der reflektierenden Oberfläche auf die Mittelachse des Prismas (22).
Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, das ferner umfasst: Lenken einer Strömung aus zu analysierenden Partikeln (80) durch den Brennpunkt des paraboloidförmigen Reflektors (78).
Verfahren nach Anspruch 15, das ferner umfasst: im Wesentlichen Ausrichten der Strömung auf die optische Achse der reflektierenden Oberfläche.