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Diese
Anmeldung ist eine Continuation-in-part der U.S. Application Serial
No. 08/843,342, eingereicht am 15. April 1997, die eine Continuation-in-part
der U.S. Application Serial No. 08/631,326, eingereicht am 12. April
1996, ist.
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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung ist auf ein wirksames Arzneistoff-Zufuhrvehikel
gerichtet, welches den Einschluss eines therapeutischen Mittels
in einem Hydrogel beinhaltet, wobei das Hydrogel dann an ein Substrat gebunden
wird. Die Substrate der vorliegenden Erfindung umfassen irgendeine)
medizinisches) Dauervorrichtung oder -implantat, Wundverbände, Wundverschlüsse und
dergleichen. Die vorliegende Erfindung stellt weiter Mittel zur
Compoundierung derartiger Hydrogele und zum Anbringen derartiger
Hydrogele an einem Substrat bereit.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Die
Bekämpfung
von Infektion, die in einer klinischen Umgebung erworben wurde,
ist ein großes
und signifikantes Gesundheitfürsorgeproblem.
Es ist geschätzt
worden, dass Infektionen, die während
einer Patientenbehandlung innerhalb von Gesundheitsfürsorgeeinrichtungen
erworben wurden, zu neunzigtausend (90.000) Todesfällen beitragen
und jährlich
12 Milliarden US$ Behandlung kosten.
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Nosokomiale
Bakteriurie ist die häufigste
Infektion, die in Langzeit-Gesundheitseinrichtungen erworben wird,
und ist gewöhnlich
mit einer Katheterisierung verbunden. Der Zustand ist praktisch
immer bei Patienten nach dreißigtägiger Katheterisierung
vorhanden. Komplikationen schließen Fieber, akute und chronische
Pyelonephritis, Bakteriämie
und Nierensteine ein. Die außerhalb
des Lumens liegende Oberfläche
des Katheters kann mit Bakterien besiedelt werden und als Leitung
für einen
Bakterieneintritt in die Blase wirken. Die beste Verhütungsmaßnahme ist
es, die Verwendung von Langzeit-Dauerkathetern zu beschränken; dies ist
häufig
nicht möglich.
J. W. Ward, "Management
of patients in long-term care facilities with catheter-associated
bateriuria" Infect.
Urol. 9, 147–152
(1996). Jedoch entwickeln alle Patienten eine Bakteriurie, wenn
sie über eine
genügend
lange Zeitspanne katheterisiert werden.
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Eine
mit Katheter in Verbindung stehende Septikämie tritt bei etwa 400.000
der schätzungsweise
fünf Millionen
Amerikaner auf, die jedes Jahr katheterisiert werden. Die Behandlung
für ein
einziges Auftreten von mit Katheter in Beziehung stehender Septikämie bei
einem kritisch kranken Patienten fügt etwa 6,5 Tage Aufenthalt
in einer Intensivstation hinzu und kostet etwa $ 29.000. I. R. Raad
und R. O. Darouchie, "Catheter-related
septicemia: risk reduction." Infect.
Med. 13: 807–812,
815–816,
823 (1996). In der Tat stellt die mit Katheter in Beziehung stehende
Septikämie
die üblichste
lebensbedrohende Komplikation dar, die mit intravaskulären Kathetern
verbunden ist. Es gibt eine starke Beziehung zwischen einer Entzündung am
Katheter-Ort und der Gewinnung von Bakterien von der Oberfläche der
Vorrichtung. In situ wird die Katheteroberfläche durch opportunistische
mikrobielle Pathogene besiedelt, und diese Kolonien werden die Quelle
von Infektionen.
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Eine übliche Quelle
für eine
Katheter-Besiedelung und mit Katheter in Beziehung stehende Sepsis
ist die Haut-Einführungsstelle.
In der Tat ist die Hautoberfläche
die üblichste
Quelle für
eine Kurzzelt-Katheter-Besiedelung und anschließende Infektion. Mit Katheter
in Beziehung stehende Infektionen bleiben ein signifikantes Problem
in Gesundheitsfürsorgeeinrichtungen.
Es ist allgemein akzeptiert, dass bis jetzt kein Verfahren für eine ausreichende
und zufriedenstellende Beherrschung der mit Katheter in Beziehung
stehenden Infektion entwickelt wurde.
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Die
Anhaftung von Mikroorganismen an der Katheteroberfläche steht
mit der Wechselwirkung des Wirts, der Mikroorganismen und des Kathetermaterials
in Beziehung. Das Wirtsgewebe reagiert auf das Kathetermaterial
als Fremdkörper
und scheidet einen Thrombin-Überzug über dem
Material ab, der mit Mikroben besiedelt wird, oft innerhalb von
24 Stunden; dieser Überzug
aus Protein und Mikroorganismen wird als Biofilm bezeichnet. In
dem Biofilm finden Mikroben eine geeignete Nische für eine fortgesetzte
Vermehrung sowie für den
Schutz vor Antibiotika, phagozytischen Neutrophilen, Makrophagen
und Antikörpern.
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Es
gab zahllose Versuche, biomedizinische Produkte zu erzeugen, die
eine Infektion behindern oder verhüten. Biomedizinische Produkte,
die für
eine Infektionsbekämpfung
Silber-Verbindungen enthalten oder freisetzen, sind seit vielen
Jahre untersucht worden. Jedoch haben klinische Studien dieser Produkte,
einschließlich
Kathetern, nur geringe Verbesserungen bei der Infektionsbekämpfung gezeigt.
Es wurde beschrieben, dass die Vorrichtungen eine Resistenz gegen
Infektion zeigen, aber in der praktischen Anwendung versagen, eine
Infektion ausreichend zu hemmen.
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Ciresi
et al. 1996 (Am. Surg. 62: 641–646)
verglichen das Auftreten von mit Katheter in Beziehung stehender
Infektion und mit Katheter in Beziehung stehender Sepsis zwischen
einem Standard-Katheter und dem kürzlich auf den Markt gekommenen
ArrowgardTM-Katheter in einem klinischen
Versuch mit 191 Patienten, die eine vollständige parenterale Ernährung erhielten.
Der ArrowgardTM-Katheter enthält eine Kombination von Silbersulfadiazin
und Chlorhexidin, von der man annimmt, dass sie die Katheter-Oberfläche gegen
eine Bakterienbesiedelung und anschließende Sepsis resistent macht.
Die Autoren schlossen, dass die Beschichtung der Zentralvenen-Katheter
mit Sulfadiazin und Chlorhexidin die Rate der mit Katheter in Beziehung
stehenden Infektion oder Katheter-Sepsis im Vergleich zum Standard-Zentralvenen-Katheter
bei Patienten, die eine vollständige
parenterale Ernährung
erhalten, nicht verringert.
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Hasaniya
et al. 1996 (Chest 109: 1030–1032)
fanden, dass die Verwendung einer anbringbaren subkutanen Silber-imprägnierten
Manschette nicht das Auftreten von mit Zentralvenen-Katheter in
Beziehung stehender Infektion und Sepsis verringerte.
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Im
U.S. Patent Nr. 4,442,133 ist ein Verfahren für vaskuläre Prothesen mit einem kationischen
Tensid, z.B. Tridodecylmethylammoniumchlorid (TDMAC) offenbart,
um die Stellen für
eine Antibiotika-Bindung zu vermehren. Bevor die Prothesen verwendet
werden, werden sie in eine Lösung
von TDMAC getaucht oder damit beschichtet, um das Antibiotikum zu
adsorbieren.
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Stickler
et al. 1994 (Cells and Materials 4: 387–398) schlossen, dass die Vorbehandlung
durch eine hinzukommende Beschichtung von Kathetern mit Ciprofloxacin
(einem Antibiotikum) wahrscheinlich eine bakterielle Biofilmbildung
auf Silicon- oder Silicon-beschichteten Langzeit-Latex-Dauerharnröhrenkathetern
nicht verhindert.
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Das
U.S. Patent Nr. 4,749,585 stellt ein Verfahren zur Beschichtung
einer Prothese mit einem ionisch geladenen Tensid und einer in Phospholipid-Vesikel
eingekapselten Antibiotikum-Verbindung bereit, wobei die Vesikel
eine Oberflächenladung
aufweisen, die entgegengesetzt zu jener des Tensids ist. Der Nachteil
dieses Systems ist, dass die Liposomenmenge, die auf der Oberfläche aufgetragen
ist, im Allgemeinen gering ist, was nicht ermöglicht, dass eine therapeutische
Arzneistoffdosis über
Zeitspannen, die erforderlich sind, um die Infektion zu unterdrücken oder
zu mildern, auf der Vorrichtung zurückgehalten wird. Zweitens erwartet
man bei der Einführung
der so behandelten Vorrichtung, wie eines Katheters, dass die Oberflächenbeschichtung
von ionisch gebundenen Liposomen aus dem Bereich abgeschert wird,
an dem die Liposomen vorliegen sollten.
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Das
U.S. Patent Nr. 5,575,815 betrifft ein Verfahren zur in-vivo-Bereitstellung
einer synthetischen Barriere, die aus biokompatiblen polymeren Materialien
hergestellt ist. Das Material kann auf mit Gewebe in Kontakt stehenden
Oberflächen
von implantierbaren medizinischen Vorrichtungen aufgetragen werden
und kann ein bioaktives Mittel enthalten, das in Zufuhreinrichtungen,
wie Mikrokapseln, Mikrokügelchen
und Liposomen, eingekapselt sein kann. Diese Druckschrift offenbart
keine Liposomen-haltige Hydrogel-Matrix, die kovalent mit einem
Polymer-Substrat verbunden ist.
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Oloffs
et al. 1994; Biomaterials 15: 753–758, beschreiben die Biokompatibilität von Silber-beschichteten
Polyurethan-Kathetern und Silber-beschichtetem Dacron®-Material, um eine
Infektion zu hemmen. Diese hemmen nicht eine mit Katheter in Beziehung
stehende bakterielle Infektion an der Infektionsstelle (siehe oben).
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Schierholz,
J. et al. 1994; Biomaterials 15: 996–1000, offenbaren die Einverleibung
von Antibiotikum in einen Silicon-Ventrikelkatheter, um eine Bypass-Infektion
zu verhindern. Das Antibiotikum (Rifampicin) wurde zu der durch
Quellung aktivierten Polydimethylsiloxan-Matrix gegeben und diffundierte
aus der Matrix.
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Wachol-Drewek
et al. 1996, Biomaterials 17: 1733–1738, offenbaren die Verwendung
von Kollagen-Implantaten verschiedener Strukturen und eines Gelatine-Schwammes,
welche in Antibiotikum-Lösungen gegeben
wurden, wobei man sie die Verbindungen absorbieren ließ. Sie schlossen: "Wenn ein Implantat,
das eine Schutzwirkung gegen Wundinfektionen aufweist, über eine
Zeitspanne von 24–48
h erforderlich ist, sind die hierin beschriebenen Materialien geeignet.
Wenn jedoch die Behandlung in infizierten Bereichen eine Antibiotikumbedeckung
für 5–10 d[Tage]
sicherstellen sollte, sind weder Kollagenmaterialien, die in Antibiotika eingetaucht
worden sind, noch Kollagen-Schwämme,
die Gentamicin enthalten, geeignet".
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Mehrere
Studien haben eine photoaktivierte Oberflächenmodifikation in Versuchen
verwendet, die Biokompatibilität
von biomedizinischen Vorrichtungen zu verbessern. Die Synthese von
Phenylazido-derivatisierten Substanzen und die photochemische Oberflächenimmobilisierung
von funktionellen Gruppen wird von Sugawara und Matsuda (J. Biomed.
Mater. Res. 32: 157–164)
dargelegt.
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Die
Oberflächenmodifikation
von Silicon durch Korona-Entladung für die Immobilisierung von verschiedenen
Proteinen wird von Okada et al. 1987 (Biomaterials and Clinical
Applications, S. 465–470,
Pizzoferrato, A., Marchetti, P. G., Ravglioli, A. und Lee, A. J.
C. Elsevier Scientific Publishers, Amsterdam) offenbart.
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Eine
photoreaktive Oberflächenmodifikation
von gefertigten Vorrichtungen wird in Matsuda und Inoue 1990 (Trans.
Am. Soc. Artif. Intern. Organs, Poster Session 1, Biomaterials,
S. M161–M164)
beschrieben. Nakayama und Matsuda 1992 (ASA/O Journal 38: M421–424) beschreiben
die Einverleibung von Heparin, das als thromboresistentes Molekül nützlich ist,
in ein hydrophiles Copolymer von Poly-(N,N-dimethylacrylamid)poly(2-cinnamoylethylmethylacrylat),
das unter Verwendung eines photochemischen Verfahrens an eine Polyethylenterephthalat-Oberfläche geknüpft wird;
Poly(m-azidostyrol) wurde anfänglich
auf die Polyethylenterephthalat-Oberfläche aufgetragen, um eine reaktive
Grenzfläche
bereitzustellen. Das Verfahren erzeugt eine vernetzte Matrix, in
der Heparin zurückgehalten
wird. Sigrist et al. (Optical Eng. (1995) 34: 2339–2347) beschreiben
die Oberflächenimmobilisierung
von Biomolekülen
mittels Licht. Aldenhoff und Koole (J. Biomed. Mater. Res. (1995)
29: 917–928)
beschreiben ein Verfahren für
die Photoimmobilisierung von Protein an Polyurethan-Oberflächen.
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Es
verbleibt das klinische Problem, dass die mit Katheter in Beziehung
stehende, Biofilm-vermittelte Infektion nur durch einen chirurgischen
Eingriff und eine Entfernung der bakterienbeladenen Vorrichtung,
gefolgt von einer Antibiotikum-Therapie
und chirurgischen Wiedereinführung
einer neuen medizinischen Vorrichtung zu einem späteren Zeitpunkt,
ausreichend behandelt werden kann. Die Unannehmlichkeit für Patienten und
die hohen Kosten dieser Verfahren sind offensichtlich.
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Die
Behandlung von Biofilm-vermittelter Infektion auf der Oberfläche von
medizinischen Vorrichtungen ist derzeit äußerst schwierig, und weder
eine medizinische Vorrichtung noch ein Arzneimittel, die derzeit
verfügbar
sind, beherrschen ausreichend eine Infektion, die mit einer Flüssigkeitsstrom-Leitung
in Beziehung steht. Deshalb gibt es einen dringenden Bedarf an einem
Verfahren zur ununterbrochenen Bereitstellung von ausreichenden
Antibiotikum-Dosen auf der Oberfläche von medizinischen Dauervorrichtungen
auf gezielte Weise, so dass Bakterien nicht in der Lage sind, während der
ersten fünf
bis zehn oder mehr Tage nach Einführung der medizinischen Vorrichtung
oder Anbringung von Verbänden,
Nahtmaterial, Nadeln, Klammern und anderen medizinischen Vorrichtungen
einen Biofilm zu bilden. Es bleibt ein Bedarf an der Entwicklung
eines brauchbaren Verfahrens zur Verhinderung einer mikrobiellen
Biofilmentwicklung auf der Oberfläche von Kathetern und anderen
medizinischen Dauervorrichtungen, die in Kontakt mit Gewebe stehen,
so dass die mit der Vorrichtung in Beziehung stehenden Infektionen
signifikant verringert werden.
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Es
ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine biokompatible Hydrogel-Matrix
bereitzustellen, die ein liposomales Antibiotikum enthält, das
auf der Oberfläche
von biomedizinischen Dauervorrichtungen aufgetragen werden kann.
Es ist ein weiteres Ziel, Verfahren zur Formulierung derartiger
Hydrogel-Matrix-Zusammensetzungen bereitzustellen; und es ist noch
ein weiteres Ziel, Verfahren bereitzustellen, um das Hydrogel kovalent
an der Oberfläche
von Substraten, wie Kathetern, anzubringen. Die Art von Arzneistoff,
die der Hydrogel-Formulierung einverleibt wird, ist nicht auf irgendein
einziges Antibiotikum oder eine einzige Kombination von einem oder
mehreren derselben beschränkt. Ähnlich könnte die
Hydrogel-Zusammensetzung eine Vielfalt von Wirkstoffen umfassen,
einschließlich
Antibiotika, Hormonen, Wachstumsfaktoren und anderer Faktoren, die
für den
zu behandelnden Zustand gemäß einer
vernünftigen
medizinischen Beurteilung vorteilhaft sind.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung bedient sich der Verwendung von Antibiotikumbeladenen
Liposomen, die in ein biokompatiblen Hydrogels eingeschlossen sind,
das auf der Oberfläche
der biomedizinischen Vorrichtung, z.B. eines Katheters, festgehalten
wird. Liposomen, Mikrokügelchen,
Nanokügelchen,
bioabbaubare Polymere und andere Systeme sind ausgezeichnete Arzneistoff-Zufuhrvehikel;
und die Verfahren zur Herstellung und die Arzneistoff-Beladungsverfahren
für Liposomen
und die anderen sind in der Technik wohlbekannt. Liposomen können sowohl
unpolare als auch polare Verbindungen über Wechselwirkungen mit der
biokompatiblen und bioabbaubaren Lipid-Doppelschicht bzw. durch
Kompartimentierung innerhalb des wässrigen Kerns speichern.
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Ein
Verfahren zur Erzeugung einer Biofilm-resistenten Oberfläche könnte das
Binden von Antibiotikum-haltigen Liposomen direkt an der Oberfläche beinhalten.
Theoretische Berechnungen zeigen jedoch, dass, wenn eine Oberfläche mit
Arzneistoff-tragenden Liposomen gesättigt würde, nur etwa 150 ng des Antibiotikums
Ciprofloxacin pro Quadratzentimeter Oberfläche angeordnet werden könnten. Es
ist unwahrscheinlich, dass Nanogramm-Mengen von Ciprofloxacin einen
Schutz vor Mikroben über
wesentliche Zeitspannen, z.B. mehrere Tage oder mehr, bereitstellen.
Wir haben ein Mittel ersonnen, um den Raum über der Oberfläche des
Katheters wirksam auszunutzen, um die Oberflächenkonzentration von gebundenem
liposomalem Antibiotikum signifikant zu erhöhen. Eine spezielle Formulierung
der Liposomen-Doppelschicht ermöglicht
die Arzneistoff-Freisetzung über
eine Zeitspanne im Bereich von Tagen bis Wochen. Siehe z.B. R. Nicholov,
V. DiTizio und F. DiCosmo, "Interactions
of paclitaxel with phospholipid bilayers", J. Lipo. Res., 5, 503–522 (1995).
M. S. Webb, T. O. Harasym, D. Masin, M. B. Bally und L. D. Mayer, "Sphingomyelin-cholesterol
liposomes significantly enhance the pharmacokinetic and therapeutic
properties of vincristine in murine and human tumour models", Br. J. Cancer,
72, 896–904
(1995). Weiter stellt die Biokompatibilität von Liposomen sicher, dass
sie sicher abgebaut und vom Wirt assimiliert werden, nachdem ihr
Arzneistoffvorrat nach sechs Tagen oder mehr erschöpft ist.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt die kovalente Bindung
von Liposomen an ein Substrat, wie ein Katheter oder eine andere
Flüssigkeitssstrom-Leitung oder andere
Vorrichtung, wie einen Wundverband, bereit. Das Verfahren nutzt
die Oberfläche
der Vorrichtung sowie das Volumen aus, das von der an die Oberfläche gebundenen
Hydrogel-Matrix eingenommen wird. Das Volumen der Gel-Matrix kann
große
Mengen an Arzneistoff-beladenen Liposomen, Mikrokügelchen,
Nanokügelchen
oder einem anderen Arzneistoff-Träger unterbringen, und dementsprechend
können
relativ hohe Dosen eines therapeutischen Arzneistoffs an spezifischen
Orten abgeschieden werden. Die Hydrogel-Matrix ist biokompatibel
und bioabbaubar (d.h. setzt nicht potentiell toxische Abbauprodukte
frei) und stellt einen Schutz der Liposomen vor Membran-zerstörenden Scherkräften, auf
die man bei der Handhabung und Einführung der Vorrichtung trifft,
und vor dem raschen Abbau der Liposomen in vivo bereit. Der Einschluss
der Liposomen in die Gel-Matrix schafft auch eine Möglichkeit,
Arzneistoff-Diffusionsgeschwindigkeiten
zu steuern, wodurch ein Langzeit-Arzneistoffausstrom gewährleistet
wird.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst demgemäß ein Verfahren zum Laden wirksamer
Mengen eines liposomalen therapeutischen Mittels auf eine medizinische
Vorrichtung, indem man das liposomale therapeutische Mittel mit
einem Hydrogel mischt und das Hydrogel kovalent an eine vorgebildete
polymere Oberfläche einer
medizinischen Vorrichtung bindet. Mit vorgeformter polymerer Oberfläche ist
gemeint, dass das polymere Material, das bei der Herstellung der
medizinischen Vorrichtung verwendet wird, vor dem kovalenten Anknüpfen des
Hydrogels gebildet oder hergestellt wird. Wie nachstehend vollständiger erörtert, kann
das kovalente Verknüpfen
des Hydrogels mit dem polymeren Material durch die Verwendung eines
bifunktionellen Linker-Moleküls
bewirkt werden, das bevorzugt eine funktionelle Azid-Gruppe umfasst.
Bevorzugt ist die vorgebildete polymere Oberfläche ein Siliconkautschuk.
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Eine
derartige Ausführungsform
ist ein Silicon-Katheter, das mit einer kovalent gebundenen Polyethylenglycol-Gelatine-Matrix
beladen ist, die eine liposomale Antibiotikum-Trägerbeschichtung enthält, um mit
Katheter in Beziehung stehende Infektionen, wie Bakteriurie und
Septikämie,
zu bekämpfen.
Medizinische Vorrichtungen, bei denen die Beschichtung verwendet
werden kann, umfassen Katheter, Wundverbände, chirurgische Verbände, vorübergehende
orthopädische
Implantate und andere.
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Das
liposomale Hydrogel der vorliegenden Erfindung umfasst eine Vielfalt
von Hydrogel-Arzneistoff-Kombinationen. Im Allgemeinen wird die
Auswahl der Paarung des Hydrogels und des Arzneistoffs lediglich
durch die gewünschte Anwendung
und die jeweilige Indikation festgelegt. Das heißt, jedes aktive Mittel kann
in Liposomen, Mikrokügelchen,
Nanokügelchen
oder andere geeignete Einkapselungsvehikel compoundiert werden,
kann in die Hydrogel-Matrizes der vorliegenden Erfindung eingeschlossen
werden, um die therapeutischen Hydrogele der vorliegenden Erfindung
zu schaffen. Diese Hydrogele können
an einem Substrat, wie der Oberfläche eines Katheters oder einer
anderen Dauerflüssigkeitsleitung,
oder dem Substrat oder der Matrix eines Wundverschlusses oder eines
Wundverbandmaterials angebracht werden.
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Eine
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Abscheidung und kovalente
Verknüpfung
einer Polyethylenglycol-Gelatine-Matrixschicht auf bzw. mit der
Oberfläche
von biomedizinischen Dauer-Implantaten (z.B. Kathetern, Stents,
intravenösen
Rohren, Dialyserohren, orthopädischen
Implantaten, chirurgischen Schwämmen
und Wundverbänden
usw.) und den Einschluss oder die kovalente Anbringung von Liposomen
an den Bestandteilen der Matrix. Die Liposomen enthalten ein Therapeutikum.
Die Matrix stellt so ein Vehikel für den Einschluss von hohen
Konzentrationen von therapeutischem Mittel, wie einem oder mehreren
Antibiotika, Hormonen, Steroiden, Wachstumsfaktoren, Antihistaminen,
Koloniestimulierenden Faktoren, Interleukinen und dergleichen und/oder
Kombinationen derselben, dar. Die therapeutischen Hydrogele der
vorliegenden Erfindung können
bei der Bekämpfung
von Gewebe- und mit Biomaterial in Verbindung stehender Infektion
verwendet werden. Bei der Matrix kann es sich um ein Hydrogel (z.B.
Gelatine, Pektin usw.), ein Protein (z.B. Kollagen, Hämoglobin
usw.) oder ein anderes Hilfsmittel handeln. Bevorzugt weist die
Matrix einen gewissen strukturellen Zusammenhalt, wie durch Vernetzung
oder eine ähnliche
strukturelle Stütze,
auf, um eine Beständigkeit
gegen Scherkräfte
zu verleihen, welche die Folge der Einführung der Vorrichtung sind.
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Deshalb
stellt die vorliegende Erfindung eine medizinische Vorrichtung mit
einem polymeren Substrat; einem Matrix-Material, das kovalent an
das Substrat gebunden ist; und einem liposomalem therapeutischem Mittel,
das in dem Matrix-Material
eingeschlossen ist, bereit. Das Matrix-Material kann ein Hydrogel,
ein Protein oder ein anderes geeignetes Hilfsmittel sein. Das Matrix-Material
ist bevorzugt ein vernetztes Material. Ein Beispiel ist Gelatine,
die mit Polyethylenglycol vernetzt ist, wie durch Umsetzung von
Gelatine mit Bis(amin)-PEG.
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Das
Matrix-Material kann durch eine Anzahl von Mitteln kovalent an ein
Substrat gebunden werden. Zum Beispiel kann ein Protein, wie Gelatine,
mit einem bifunktionellen Linker-Molekül, wie 4-Azido-2,3,5,6-tetrafluorbenzoesäure, derivatisiert
werden. Das heißt,
der Carbonyl-Kohlenstoff der Benzoesäure-Gruppe kann dazu gebracht werden, mit
einem freien Amin eines Proteins unter Bildung eines Amids zu reagieren;
die Azido-Funktionalität
kann dazu gebracht werden, mit einem Methylen-Kohlenstoff des Silicon-Kautschuks
zu reagieren. Auf diese Weise ist das Matrix-Material kovalent an
das Substrat gebunden.
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Die
therapeutischen Hydrogele der vorliegenden Erfindung dienen als
Stützmaterial
für eine
Vielfalt von liposomalen Therapeutika. Jedes therapeutische Mittel,
das für
eine Einkapselung in ein Liposom, Mikrokügelchen, Nanokügelchen
oder dergleichen geeignet ist, kann in der vorliegenden Erfindung
verwendet werden. Zum Beispiel umfassen in der vorliegenden Erfindung
nützliche
therapeutische Mittel Antibiotika, Antihistamine, Hormone, Steroide,
therapeutische Proteine und dergleichen.
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Der
Fachmann wird anerkennen, dass die gewünschte Konzentration des aktiven
Mittels in einem Hydrogel, das auf ein Substrat geladen ist, abhängig von
den Merkmalen des gewählten
Wirkstoffs variieren wird. Beispielsweise wird, wie zwischen einem
Antibiotikum und einem therapeutischen Protein, die erforderliche Konzentration
an Antibiotikum, das im Allgemeinen im Mikrogramm-Bereich aktiv
ist, höher
sein als die Konzentration eines therapeutischen Proteins, von denen
viele im Nanogramm-Bereich aktiv sind. Andere Standard-Dosierungskriterien
werden ebenfalls bei der Auswahl der Konzentrationsbereiche des
Wirkstoffs, der auf das Substrat geladen wird, gemäß der Standard-Praxis
auf diesem Gebiet berücksichtigt
werden.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist ein Gelatine-Hydrogel, das mit Polyethylenglycol
(PEG) vernetzt ist; und in dem Hydrogel ist ein liposomales Antibiotikum,
wie Ciprofloxacin, dispergiert. Es wurde gezeigt, dass Ciprofloxacin
eine gute Wirkung gegen ein breites Spektrum von Bakterien zeigt,
insbesondere jene, die mit Harntrakt-Infektionen verbunden sind.
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Derartige
Ausführungsformen
stellen dramatisch verbesserte medizinische Dauervorrichtungen bereit.
Medizinische Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung können mit
so viel wie 1000 μg/cm2 Ciprofloxacin beladen werden. Bevorzugte
Ausführungsformen
weisen etwa 10–300 μg/cm2 auf; und noch bevorzugter Ausführungsformen
weisen etwa 25–200 μg/cm2 auf. So bedient sich die vorliegende Erfindung
der langsamen Langzeit-Freisetzung eines Anti-Infektions-Wirkstoffs aus einer medizinischen
Dauervorrichtung und verringert dramatisch die Häufigkeit, mit der derartige
medizinische Dauervorrichtungen entfernt und ersetzt werden müssen.
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Die
PEG-Gelatine-Liposomen-Mischung kann wirksam auf die Oberfläche eines
Silicon-Foley-Katheters aufgebracht werden, das mit Phenylazido-modifizierter
Gelatine vorbehandelt worden ist. Verfahren zur Immobilisierung
von photoreaktiver Gelatine auf der Oberfläche des Katheters werden hierin
angegeben. Die Verwendung von Silicon-Vorrichtungen ist kein beschränkendes
Merkmal, da jede derartige polymere Vorrichtung behandelt werden
kann, um ein Hydrogel unterzubringen, in dem die Liposomen oder
andere Arzneistoff-Träger
eingeschlossen sind.
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Spezieller
stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Assoziierung
beträchtlicher
Mengen an Antibiotikum-freisetzenden Liposomen mit einem Silicon-Foley-Katheter
durch deren Einschluss in eine Oberflächen-Beschichtung aus PEG-Gelatine-Hydrogel
bereit, welches kovalent an die Silicon-Oberfläche gebunden ist, und das Antibiotikum
wurde aus dem umgebenen Bereich über
eine Zeitspanne von mehr als fünf
Tagen freigesetzt. Modifikationen der Technik sollten ermöglichen,
dass es auch auf andere medizinische Vorrichtungen aufgebracht wird,
wie intraperitoneale Katheter, Gelenk- und Gefäß-Prothesen und rekonstruktive Implantate.
Ein attraktives Merkmal dieses Systems ist die Möglichkeit einer verlängerten
Freisetzung von Verbindungen mit einem Bereich von chemischen Eigenschaften,
wie Antibiotika, Enzymen, Wachstumsfaktoren, Human-Hormonen, Antikoagulantien
usw. Die Oberflächenmerkmale
des PEG-Gelatine-Hydrogels
verbessern auch die Biokompatibilität der Vorrichtung, da Hydrogel-beschichtete
Katheter dazu tendieren, die Entzündung zu minimieren, die mit
der Anwesenheit jedes Fremdköpers
im Körper
verbunden ist. J. N. Nacey und B. Delahunt, "Toxicity study of first and second generation
hydrogel-coated latex urinary catheters", Br. J. Urol., 67: 314–316 (1991).
Der Einschluss von Gelatine in unser Hydrogel-System führt zu einem
letztendlichen Abbau in vivo, was eine kovalent gebundene Oberflächenschicht
aus AFB-Gelatine zurücklässt, die
gegen einen weiteren Protease-Verdau relativ beständig sein
sollte. T. Okada und Y Ikada, "In
vitro and in vivo digestion of collagen covalently immobilized onto
the silicone surface",
J. Biomed. Mater. Res., 26: 1569–1581 (1992). Es ist möglich, dass
die verbleibenden Gelatineschichten eine bessere Integration des
Katheters in das umgebende Gewebe erleichtern.
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Die
liposomalen Matrix-Materialien der vorliegenden Erfindung können verwendet
werden, um Patienten zu schützen
oder zu behandeln, die ein Risiko für eine Biofilm-vermittelte
Infektion oder andere Formen von Infektion aufweisen, welche mit
medizinischen Dauervorrichtungen, Wundverschlüssen und dergleichen verbunden
sind, oder daran leiden. Das Verfahren umfasst das Einführen einer
medizinischen Vorrichtung der vorliegenden Erfindung in den Patienten,
wobei die medizinische Vorrichtung ein Substrat, wie zum Beispiel ein
Siliconkautschuk-Substrat,
umfasst, und an das Substrat kovalent ein Hydrogel gebunden ist,
in dem ein liposomales therapeutisches Material, wie ein Antibiotikum,
dispergiert ist. Gleichermaßen
umfasst das Verfahren den Ersatz von infizierten medizinischen Vorrichtungen
durch die medizinischen Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung.
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Definitionen:
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Mit
Hydrogel oder Gel ist jedes Material gemeint, dass zu variierenden
Graden ein gelartiges Produkt bildet, wenn es in einem Lösungsmittel,
typisch Wasser oder polaren Lösungsmitteln,
suspendiert wird. Bei diesen Gelen kann es sich um Proteine, wie
Kollagen oder Hämoglobin,
herkömmlichere
Gele, wie Gelatine, Pektin, und Fraktionen und Derivate derselben
handeln.
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Mit
liposomalen therapeutischen Mitteln ist jede physikalische Struktur
gemeint, die ein therapeutisches Mittel, wie einen Arzneistoff,
umgibt oder einkapselt. So schließen liposomale therapeutische
Mittel verschiedene Arzneistoffe oder biologisch aktive Mittel,
wie Antibiotika, Antihistamine, Hormone, Steroide, Wachstumsfaktoren,
Kolonie-stimulierende Faktoren, Interleukine und dergleichen, ein,
welche in einer Struktur wie einem Liposom, entweder mit unilamellarer
oder Doppelschicht-Struktur, oder Mikrokügelchen oder Nanokügelchen
oder dergleichen eingeschlossen oder eingekapselt sind.
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Ein
bifunktionelles Linker-Molekül
ist jedes Molekül,
das mindestens zwei funktionelle Gruppen besitzt, die chemisch mit
kovalenten Bindungen reagieren können
und diese mit anderen funktionellen Gruppen oder chemischen Substituenten,
wie den freien Aminen von Proteinen und dergleichen, ausbilden können. Bevorzugt
weist der bifunktionelle Linker eine Arylamin-Funktionalität, wie eine
Aroylazid-Gruppe, und eine Carbonyl-Funktionalität, wie in einer Carbonsäure-Gruppe,
auf.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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AFB-Gelatine-Herstellung
und Substitutionsgrad
-
NHS-AFB
wurde unter Verwendung des Kupplungsmittels DCC hergestellt, wie
in J. F. W. Keana und S. X. Cai, "New reagents for photoaffinity labeling
and photolysis of functionalized perfluorophenyl azides", J. Org. Chem.,
55: 3640–3647
(1990) beschrieben. AFB-Gelatine mit variierenden Substitutionsgraden
wurde durch Zugabe von NHS-AFB in Methanol zu einer Lösung von
Gelatine (0,5–1,0%-ig)
in 50 mM Borat-Puffer (pH 8,6) synthetisiert. Die Mischung wurde über Nacht
bei Raumtemperatur unter Rühren
inkubiert. Nach Filtration durch 0,22 μm-Millex GS-Spritzenfilter (Millipore, Bedford,
MA) wurde die Lösung
24 Stunden bei 4°C mit drei
Auswechslungen von Wasser (pH = 4,6, wenn die Dialyse beendet ist)
dialysiert. Die benzoylierte Gelatine fiel unter diesen Bedingungen
aus und wurde durch Zentrifugation (10.000 × g über 10 Minuten) gesammelt.
Der Niederschlag wurde 2 Stunden im Vakuum getrocknet. Alle Verfahren,
an denen AFB beteiligt war, wurden im Dunkeln oder unter gedämpften Lichtbedingungen
durchgeführt.
-
Der
Ausmaß,
zu dem die Aminogruppen der Gelatine mit NHS-AFB reagiert hatten,
wurde bestimmt. Kurz gesagt, wurden 20 μg Gelatine oder AFB-Gelatine
in 1,5 ml 50 mM Na2PO4-Puffer
(pH 8,0) verwendet. Während
des Mischens der Proteinlösung
unter Verwendung eines Vortex-Mischers wurden 0,5 ml Fluorescamin
in Dioxan (1,1 mM) dazugegeben, und das Mischen wurde 15 Sekunden
fortgesetzt. Die Fluoreszenzintensität bei 475 nm wurde gemessen
(390 nm Anregungswellenlänge
und 8 nm Schlitzbreiten) und verwendet, um den Substitutionsgrad α gemäß der Gleichung α = Fp – Fs/(Fp + 0,078·Fs) zu berechnen, worin Fp =
Fluoreszenz von Gelatine, Fs = Fluoreszenz
von AFB-modifizierter
Gelatine und 0,078·Fs den Korrekturfaktor darstellt, der der
Zunahme des Molekulargewichts von Gelatine Rechnung trägt, die
vollständig
mit AFB substituiert ist.
-
Bestimmung der Menge von
Gelatine, die an eine Silicon-Oberfläche gebunden ist
-
Gelatine
wurde unter Verwendung von Iodo Beads (Pierce, Rockford, IL) gemäß den Anwendungen des
Lieferanten iodiert. Kurz gesagt, wurden 100 μg Gelatine (500 μl Gelatine,
0,2 mg/ml, in Hepes-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4 (HBS)) in ein
Fläschchen
gegeben, das 4 Iodo Beads in 2 ml HBS enthielt. Na125I
(1 mCi von Amersham Canada, Oakville, ON) wurde in das Reaktionsfläschchen
gegeben und 15 Minuten reagieren gelassen. Die Überführung des Proteins in ein zweites
Fläschchen
beendete die Reaktion. Das Reaktionsfläschchen wurde mit drei 0,5
ml-Aliquoten (200 μg/ml)
von markierter Gelatine gewaschen. Die Protein-Lösung
(etwa 400 μg
in 2,1 ml HBS) wurde in 200 ml Puffer dialysiert, bis das Dialysat
minimal radioaktiv war (etwa 48 h mit 5 Auswechslungen des Mediums).
-
Die
spezifische Aktivität
der iodierten Gelatine wurde durch eine Technik bestimmt, welche
die Unlöslichkeit
des zwischen Gelatine und dem Farbstoff Siriusrot gebildeten Komplexes
in Essigsäure
ausnützt.
Vier 50 μl-Aliquoten
wurden aus der iodierten Protein-Lösung entfernt und in 1,5 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen gegeben,
gefolgt von der Zugabe von 50 μl
HBS und 1 ml Siriusrot (50 μM)
in 0,5 M Essigsäure.
Die Röhrchen
wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend 30
Minuten bei 12.000 × g
zentrifugiert. Der Überstand
wurde entfernt, und eine Portion (0,5 ml) wurde für die quantitative
Protein-Bestimmung über
die Abnahme der Extinktion (540 nm) des in Lösung verbleibenden Farbstoffes
verwendet. Das Protein/Farbstoff-Pellet wurde in drei 150 μl-Waschlösungen aus
0,2 N NaOH resuspendiert, welches 2 mg/ml Gelatine enthielt. Die
Radioaktivität
des Eluats wurde in einem Flüssigkeitsszintillationszähler gemessen.
Kontrollexperimente zeigten an, dass die Anwesenheit von Siriusrot
in der Szintillationsflüssigkeit
die Bestimmung der 125I-Radioaktivität nicht
störte.
Verbleibendes adsorbiertes Protein wurde gemessen, indem man die
Zentrifugenröhrchen
in Viertel schnitt und sie zum Zählen
in Szintillationsfläschchen
gab. Die spezifische Aktivität
wurde zu 0,12 ± 0,01 μCi/μg berechnet.
Dieser Markierungsgrad steht mit der geringen Zahl an Tyrosin- und
Histidin-Resten in Gelatine in Einklang.
-
Photoimmobilisierungs-Wirkungsgrad
von AFB-(125I)Gelatine
-
Radioiodierte
Gelatine wurde mit ABF modifiziert, wie oben beschrieben, jedoch
bestanden die Kupplungslösung
und das Dialysemedium aus HBS (pH 8,0 bzw. 7,4). Das Verhältnis von
NHS-AFB zu Gelatine in der Kupplungslösung betrug 1:4 (Gew./Gew.).
Nach Dialyse wurde das Volumen der AFB-(125I)Gelatine-Lösung auf
5 ml eingestellt, und die Proteinkonzentration wurde zu 3,9 ± 0,6 mg/μl bestimmt.
Aliquoten (jeweils 10 μl)
von radioiodierter AFB-Gelatine wurden auf der Seite von Silicon-Rechtecken
aufgetragen, welche der Außenoberfläche des
Original-Katheters
entsprachen. Alle Abschnitte (insgesamt 12) wurden 90 Minuten unter
Vakuum getrocknet. Ein Satz von vier Katheterstücken wurde dann sofort zum
Zählen
in Szintillationsflüssigkeit
gegeben (äußere Oberfläche nach
oben weisend). Ein weiterer Satz wurde 3 Minuten kurzwelligem (254
nm) UV-Licht (Minerallight Lamp, UVP, San Gabriel, CA) bei einer
Entfernung von 2 cm ausgesetzt. Dieser Satz von vier Abschnitten
plus die verbleibenden vier Abschnitte wurden anschließend 30
Minuten bei 80°C in
1%-iger SDS-Lösung
mit einem Austausch des Mediums nach 15 Minuten gewaschen. Die Abschnitte
wurden in destilliertem Wasser gespült und zum Zählen in
Szintillationsfläschchen
gegeben.
-
Liposomen-
und PEG-Gelatine-Gel-Herstellung
-
Die
Liposomen waren aus DPPC/Cholesterol/PEG-DSPE/Rhodamin-DPPE im Verhältnis 1:1:0,05:0,001
zusammengesetzt. Die zu verwendende Formulierung ist nicht beschränkend, und
irgendein Zahl von Verhältnissen
von Lipid zu anderen Bestandteilen kann verwendet werden, um wirksam
die Ausführungsformen
dieser Erfindung zu erzielen. Die Lipide wurden in 4 ml Chloroform
gelöst,
und das Lösungsmittel wurde
im Vakuum entfernt. Der resultierende Lipid-Film wurde zwei Stunden
unter Vakuum gegeben und anschließend mit 1 ml 250 mM Ammoniumsulfat
(pH 2,5) bei 45°C
hydratisiert. Die Liposomen wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren
und in einem Wasserbad bei 45°C
aufgetaut (5 ×),
gefolgt von Hochdruck-Extrusion durch 100 nm-Poren-Membranen (10 ×). Es war
gezeigt worden, dass dieses Verfahren unilamellare Liposomen mit
einem durchschnittlichen Durchmesser von 100 nm und einer gleichen
Verteilung an gelösten
Stoffen zwischen dem Äußeren und
dem Inneren der Liposomen-Membran
erzeugte. M. J. Hope, M. B. Bally, G. Webb und P. R. Cullis, "Production of large
unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization
of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane
potential", Biochim.
Biophys. Acta, 812: 55–65
(1985); L. D. Mayer, M. J. Hope, P. R. Cullis und A. S. Janoff, "Solute distributions
and trapping efficiencies observed in freezedthawed multilamellar
vesicles", Biochim.
Biophys. Acta, 817: 193–196
(1986). Äußeres Ammoniumsulfat
wurde entfernt, indem man die Suspension durch eine G-50-Säule (1 × 10 cm)
leitete und mit einer 10%-igen Saccharose-Lösung (pH 4,0) eluierte.
-
Die
PEG-Gelatine-Lösungen
bestanden aus 10% Gelatine, 6% NP-PEG und 10% Saccharose bei pH 4,0.
Falls Liposomen erforderlich waren, wurden sie aus einer reinen
Liposomen-Suspension zugesetzt. Die Liposomen-Konzentration in den
PEG-Gelatine-Lösungen
betrug 15 mM bezüglich
DPPC. Alle Lösungen
wurden 15 min bei 45°C
erwärmt,
um die Gelatine zu lösen.
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Vernetzung
der Gelatine-Matrix
-
Die
PEG-Gelatine-Matrix wurde durch die Bildung von Amid-Bindungen zwischen
Bis(amin)-PEG und den freien Carboxylgruppen von Gelatine auch vernetzt.
In diesem Verfahren wird die Silicon-Katheteroberfläche in eine
Lösung
von wässrigem
löslichem
Carbodiimid (2 mg/ml) eingetaucht und 30 min bei Raumtemperatur
inkubiert. Die Reaktion der aktivierten Carboxylgruppen mit PEG
und Gelatine-Aminoeinheiten wird durch Eintauchen des Silicon-Materials
in Borat-Puffer (200 mM, pH 8,5) initiiert. Die Inkubation in dem
alkalischen Puffer verläuft über 2 h.
Anschließend
wird die Silicon-Oberfläche
6 h in eine 10%-ige Saccharose-Lösung
gegeben, mit dreimaligen Austausch des Mediums, um nicht vernetztes
Material zu entfernen. Diese Behandlung hat ein vernetztes PEG-Gelatine-Gel zum
Ergebnis, das seinen Zusammenhalt beibehält und mindestens sieben Tage
an dem Katheter befestigt bleibt, wenn es in eine Lösung von
10% Saccharose bei 37°C
gegeben wird. Die Vernetzungschemie ist in 4 umrissen.
-
Herstellung
von Katheterabschnitten
-
In
der bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird Katheter-Material, das mit PEG-Gelatine-Gel zu
beschichten ist, zuerst mit 10 μl
AFB-Gelatine (5 mg/ml; α =
55%) schleuderbeschichtet und 1 Stunde unter Vakuum getrocknet.
Alle Abschnitte, einschließlich
unbehandelter Kontrollen, wurden 3 Minuten UV-Licht (254 nm) ausgesetzt
und mit Wasser gespült.
Anschließend
wurden Katheterstücke
mit 60 μl
fluider PEG-Gelatine oder einer fluiden PEG-Gelatine-Liposomen-Mischung
schleuderbeschichtet und 15 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Inkubation
kann bei Temperaturen von 4–10°C stattfinden.
Die Gele wurden durch 1-stündiges
Eintauchen der Katheter-Abschnitte in 200 mM Borat-Puffer (pH 8,5)
polymerisiert. Rückständiges p-Nitrophenol
wurde durch 12-stündige
Inkubation bei Raumtemperatur in 10%-iger Saccharose (pH 4,0) mit
viermaligem Austausch des Mediums aus den Gelen ausgelaugt. Die
Abwesenheit von p-Nitrophenol wurde durch eine vernachlässigbare
Extinktion des Dialysats bei 410 nm bestätigt.
-
Liposomen
in Suspension und jene, die innerhalb PEG-Gelatine-Gelen eingeschlossen
waren, wurden mit Ciprofloxacin (Bayer, Leverkusen, Deutschland)
gemäß dem Remote-Loading-Verfahren
beladen, das in Y. K. Oh, D. E. Nix und R. M. Straubinger, "Formulation and efficiacy
of liposomeencapsulated antibiotics for therapy of intracellular
Mycobacterium avium infection",
Antimicrob. Agents Chemother., 39: 2104–2111 (1995) beschrieben wird.
Die Katheterstücke
wurden in 10%-iger Saccharose-Lösung
(pH 7,5) gegeben, die 2 mM Ciprofloxacin enthielt, während bei
Liposomen in Suspension eine geeignete Arzneistoffmenge zugesetzt
wurde, um die Suspension bezüglich
Ciprofloxacin 2 mM zu machen. Die Inkubation fand in beiden Fällen 1 Stunde
lang bei 45°C
statt. Die Liposomen-Suspension wurde 5 Minuten bei 3000 × g zentrifugiert,
um Arzneistoff-Kristalle zu pelletieren, und der Überstand
wurde dann auf eine G-50-Säule
(1 × 10
cm) aufgetragen, um nicht eingeschlossenes Ciprofloxacin zu entfernen.
-
Dehydratisierte
Hydrogele wurden durch 2,5-stündiges
Trocknen von beschichteten Katheter-Abschnitten in einem Ofen bei
35°C hergestellt.
Die getrockneten Gele wurden dann in Tris-Puffer (10 mM Tris, 110
mM NaCl, pH 7,4) oder in konzentrierter Ciprofloxacin-HCl-Lösung (25
mg/ml), wie erforderlich, rehydratisiert. Die Temperatur während des
Rehydratisierungsprozesses wurde bei 45°C aufrechterhalten. TABELLE
I
Laden von Ciprofloxacin in Liposomen und PEG-Gelatine-Gel
- a Auf der Grundlage der Auftragung von
60 μl PEG
(6%)-Gelatine (10%)-Gel auf einen 1 cm-Abschnitt eines Silicon-Katheters
mit einem Durchmesser von 0,3 cm. Liposomen-haltige Gele waren bezüglich Dipalmitoylphosphatidylcholin
15 mM, n = 4.
- b Da 1 cm3 = 1 ml, würden 1000 μl Gel 1 cm3 einnehmen,
und diese Menge an PEG-Gelatine-Liposomen-Gel würde 185 ± 16 μg·(1000 μl/60 μl) = 3083 ± 267 μg Ciprofloxacin einschließen.
- c Diese Proben wurden getrocknet, bevor sie in einer konzentrierten
Ciprofloxacin-Lösung
(25 mg/ml) rehydratisiert wurden.
-
Die
Menge an therapeutischem Mittel, die auf das Substrat geladen wird,
kann über
größere Bereiche als
die in Tabelle I gezeigten erhöht
oder verringert werden. Größere Konzentrationen
an therapeutischem Mittel können
durch Erhöhen
der Menge an eingekapseltem und in das Hydrogel eingemischtem Arzneistoff
aufgeladen werden. Zum Beispiel erwarten wir, dass Konzentrationen
bis zu etwa 1.000 μg
(1,0 mg) pro cm2 oder mehr eines antibiotischen
Wirkstoffs mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung auf Substrate
geladen werden können;
und dass Konzentrationen bis zu etwa 10.000 μg/cm3 oder
mehr auf Substrate geladen werden können. Ein bevorzugter Konzentrationsbereich
von auf derartige Substrate geladenem Antibiotikum beträgt etwa
10–1.000 μg/cm2. Ein bevorzugter Bereich für Ciprofloxacin
beträgt
etwa 10–200 μg/cm2.
-
Ähnlich können die
Mengen des therapeutischen Mittels durch Erhöhen der Menge an auf der Oberfläche des
Substrats immobilisiertem Gel erhöht werden. Im Allgemeinen können Hydrogel-Schichten
mit einer Dicke von etwa 0,5–10
mm auf Substrate geladen werden, um die gewünschte Arzneistoffzufuhr und
die gewünschten
therapeutischen Ergebnisse zu bewirken; bevorzugte Schichten liegen
im Bereich von etwa 1–5 mm;
und besonders bevorzugte Schichten betragen etwa 2–4 mm.
-
So
erkennt ein Fachmann, dass die vorliegenden Verfahren und Vorrichtungen
ein äußerst vielseitiges Mittel
zum Laden von hohen Konzentrationen an Antiinfektionsmitteln und
zum Variieren der Konzentration derartiger Mittel auf einem) Substrat
oder auf einen bzw. einem spezifischen Bereich eines Substrats liefern.
-
Bestimmung
der Arzneistoff-Ausströmungskinetik
-
Das
Freisetzungsexperiment wurde initiiert, indem man jeden Katheterabschnitt
oder jede Dialysemembran (der bzw. die eine Liposomen-Suspension
enthielt, die 2,7 mM bezüglich
DPPC war) in getrennte Flüssigkeitsszintillationsfläschchen
gab, die mit 15 ml Tris-Puffer gefüllt waren. Zu ausgewählten Zeitintervallen
wurden 3 ml aus jedem Fläschchen
für die
Ciprofloxacin-Quantifizierung über
einen Fluoreszenz-Assay unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von
324 nm, einer Emissionswellenlänge
von 450 nm und Schlitzbreiten von 5 nm entfernt. Die Menge an vorhandenem
Ciprofloxacin wurde durch Vergleich mit einer Standardkurve bestimmt.
Die verbleibende Lösung
in den Fläschchen
wurde ausgeleert und durch 15 ml Puffer ersetzt. Die Proben wurden
im ganzen Experiment bei 37°C
inkubiert.
-
Bakterien-Biofilmbildungs-Assay
-
Ein
klinisches Isolat von Pseudomonas aeruginosa, das von einem Patienten
mit Peritonitis erhalten wurde, wurde für alle Bakterientest-Assays
verwendet. Eine 18-stündige
Nährbrühenkultur
wurde aus einem primären
Isolat hergestellt, das bei –70°C in einer
Lösung
aus 50% (Vol./Vol.) Glycerol-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS)
gehalten wurde.
-
Katheterabschnitte
wurden aseptisch in 100 ml sterile Nährbrühe (Difco, Detroit, MI) gegeben,
die in einem 250 ml-Becherglas enthalten war. Zwölf Katheterabschnitte von jeder
Beschichtungsformulierung wurden zu einzelnen Bechergläsern gegeben.
Die P. aeruginosa-Kultur wurde 3-mal in PBS-Lösung, pH 7,1, gewaschen, dann
in jeden der Becher eingeimpft. Die Inokulum-Größe war ausreichend, um 1,5 ± 0,5 × 107 CFU/ml in dem 100 ml-Volumen zu liefern.
Die geimpften Katheter-Suspensionen wurden in einen bei 37°C gehaltenen
Inkubator gegeben und mit einer Geschwindigkeit von 100 U/min gerührt. Eine
Hälfte
des 100 ml-Volumens wurde täglich
aseptisch aus jedem Becherglas entfernt und durch ein gleiches Volumen
an steriler Nährbrühe ersetzt.
In 1-, 3-, 5- und 7-tägigen Zeitabständen wurden
drei Katheterabschnitte aus jedem der Bechergläser entfernt, und die lebensfähigen Bakterien
wurden von den Katheteroberflächen
gewonnen, wie nachstehend beschrieben. Die Zahl der lebensfähigen Bakterien
in Nährbrühe-Proben
wurde ebenfalls bestimmt.
-
Die
Katheterabschnitte wurden aus den Bakterien-Suspensionen entfernt
und einzeln mit einem 10 ml-Volumen steriler PBS gespült, die über eine
Gravitationszufuhr aus einer 10 ml-Pipette zugeführt wurde. Die gespülten Abschnitte
wurden in 20 ml-Kunststoff-Reagenzgläser gegeben, die 5 ml-Volumina
sterile PBS und Glasperlen von 3 mm Durchmesser enthielten. Nach
30-sekündiger Beschallung
in einem eiskalten Beschallungsbad (Bransonic, Danbury, CT) wurden
die Katheterabschnitte 1 Minute mit hoher Geschwindigkeit gevortext.
Das Beschallungs- und Vortex-Verfahren wurde dreimal wiederholt.
Aliquoten wurden dann aus jeder der Suspensionen entfernt und auf
Nähragar
plattiert. Die Platten wurden 48 h bei 37°C inkubiert.
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Substitutionsgrad
von AFB-Gelatine
-
Die
Modifikation der Silicon-Katheter-Oberfläche in diesem Beispiel verwendete
das photoreaktive Molekül
4-Azido-2,3,5,6-tetrafluorbenzoesäure (AFB). Diese kann über eine
N-Hydroxysuccinimid(NHS)-Chemie an die Aminogruppen von Gelatine
geknüpft
werden. Auf der Grundlage der Aminosäure-Zusammensetzung von Rinderhaut-Gelatine
(J. E. Eastoe und A. A. Leach, "Chemical
constitution of gelatin",
in Science and Technology of Gelatin, A. G. Ward und A. Courts (Hg.),
Academic Press, New York, 1977, S. 73–107) enthält das typische Gelatine-Molekül (MG 75.000)
etwa 25 ε-Aminogruppen,
die von Lysin und Hydroxylysin abstammen. Die Reaktivität dieser
Gruppen gegenüber
NHS-AFB wurde durch Variieren des Verhältnisses von Gelatine zu NHS-AFB
bestimmt. Tabelle 1 zeigt, dass ein 1:9-Verhältnis von ε-Aminogruppen zu NHS-AFB zu
einer nahezu vollständigen
(99%-igen) Substitution von verfügbaren
Aminogruppen führt.
Ein 1:0,75-Verhältnis
hat eine etwa 55%-ige Substitution zum Ergebnis. 55 Substitution
stellen den optimalen Wert für
die Modifikation von Gelatine mit AFB dar, da sie sowohl die Bindung
an die Oberfläche über die
Azid-Einheit als auch das Anbringen an die PEG-Gelatine-Beschichtung
durch Bindung an die Carbonatgruppe von NP-PEG ermöglicht. Jedoch
können
niedrigere und höhere
Substitutionen verwendet werden, um eine gewünschte Wirkung zu erzielen.
-
Bindung von
AFB-Gelatine an Silicon
-
Die
hohe Reaktivität
von Arylaziden wird in der Biochemie seit einiger Zeit mittels der
Verwendung von Photoaffinitäts-Liganden
ausgenützt.
Derartiger Azide liefern aufgrund von konkurrierenden Nebenreaktionen, zum
Beispiel einer Ringerweiterung, typisch schlechte Kohlenstoff-Wasserstoff(C-H)-Insertionswirkungsgrade. A.
K. Shrock und G. B. Schuster, "Photochemistry
of phenyl azide: chemical properties of the transient intermediates", J. Am. Chem. Soc.,
106: 5228-(1984).
Die Fluorierung des Benzolrings fördert die Stabilität des angeregten
Zustands und hat verbesserte Insertionswirkungsgrade zum Ergebnis.
E. Leyva, M. J. T. Young und M. S. Platz, "High yields of formal CH insertion products
in the reactions of polyfluorinated aromatic nitrenes", J. Am. Chem. Soc.,
108: 8307 (1996). Es wurde gezeigt, dass das für die vorliegende Erfindung
verwendete fluorierte Arylazid (AFB) in der Lage ist, an verschiedene
Atome in gewöhnlich
inerten chemischen Gruppen zu binden, wie den Kohlenstoff in Methylgruppen.
Ein mögliches
Reaktionsschema für
die AFB-Gelatine-Verknüpfung
mit Polydimethylsiloxan (PDMS) über
C-H-Insertion ist in 1B dargestellt.
-
Es
sind mit Bezug auf die Fähigkeit
von AFB, in ein Netzwerk auf PDMS-Basis (Siliconkautschuk) zu inserieren,
keine Daten veröffentlicht
worden.
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Um
zu verifizieren, dass sich AFB-Gelatine kovalent an die Oberfläche eines
Silicon-Katheters bindet, wurde ein kleines Volumen einer verdünnten Lösung von
radioiodierter AFB-Gelatine auf Katheterabschnitte gegeben, unter
Vakuum getrocknet, UV-Licht ausgesetzt und bei hoher Temperatur
heftig in Detergens-Lösung gewaschen.
Die Radioaktivität,
die in den UV-Licht ausgesetzten Proben gemessen wurde, minus der
Radioaktivität,
die in nicht ausgesetzten Proben nachgewiesen wurde, wurde als Maß der Menge
an Gelatine genommen, die kovalent an das Silicon gebunden war.
Es wurde gefunden, dass UV-bestrahlte Proben etwa 32 mal mehr AFB-Gelatine
banden als nicht bestrahlte Proben (etwa 5,1 ng gegenüber 0,16
ng). Eine Schätzung des
Bindungswirkungsgrads wurde aus der Division der Radioaktivität, die mit
UV ausgesetzten Proben nachgewiesen wurde, durch die Radioaktivität, die in
Proben gemessen wurde, die sofort nach dem anfänglichen Trocknungsschritt
in Szintillationsflüssigkeit
gegeben worden waren, erhalten. Der Bindungswirkungsgrad wurde als
27 ± 5
gemessen. Dieser Wert ist eine ungefähr obere Grenze, da die verwendete
AFB-Gelatine einen α-Wert von
93% aufwies. Die Daten legen nahe, dass AFB-Gelatine kovalente Bindungen zur Oberfläche des Silicon-Katheters
ausbildet.
-
Ciprofloxacin-Ausströmungs-Studien
-
Ciprofloxacin-Freisetzungsgeschwindigkeiten
wurden bei den folgenden Proben bestimmt: nur Liposomen, nur PEG-Gelatine-Hydrogel,
einem liposomalen PEG-Gelatine-Hydrogel
und einem Arzneistoff-haltigen liposomalen Hydrogel, das luftgetrocknet
und dann mit Tris-Puffer, pH 7,4, rehydratisiert wurde. Alle in
dieser Studie verwendeten Liposomen enthielten DPPC und Cholesterol.
PEG-Lipid wurde ebenfalls eingeschlossen, um eine Gelatine-induzierte
Destablisierung der Doppelschicht zu vermeiden und die Immobilisierung
der Liposomen innerhalb der Hydrogel-Matrix über sterische Wechselwirkungen
zu erhöhen.
Die Ergebnisse des Experiments sind in 2 zusammengefasst.
Die Menge an Ciprofloxacin, die zu einem gegebenen Zeitpunkt freigesetzt
war, ist als Prozentsatz der in dem ganzen Experiment freigesetzten
Gesamtmenge ausgedrückt. Es
gibt zwei bemerkenswerte Trends. Die Behandlung mit Hydrogel allein
und rehydratisiertem liposomalem Hydrogel war nicht erfolgreich,
Ciprofloxacin über
eine verlängerte
Zeitspanne zurückzuhalten;
nahezu der ganze anfänglich
einverleibte Arzneistoff wurde innerhalb der ersten zwei Stunden
freigesetzt.
-
Überraschend
dauerte es länger
als 6,8 Tage (oder 163 h), damit mehr als 99 des anfänglich einverleibten
Arzneistoffs aus Liposomen und dem liposomalen Hydrogel, das nicht
dehydratisiert wurde, freigesetzt wurden. Die Ähnlichkeit der Ergebnisse der
letzten zwei Behandlungen zeigt, dass in Hydrogel eingebettete Liposomen
ihre Unversehrtheit während
des Auftragungsverfahrens und während
der ganzen experimentellen Zeitspanne beibehalten. Es sollte bemerkt
werden, dass alle Hydrogele mindestens sieben Tage an der Katheter-Oberfläche fixiert
blieben. Dies ist eine brauchbare Lösung bei der Zufuhr von Antibiotikum
oder einem anderen Arzneistoff an die Infektionsstelle bzw. einen
anderen Gewebebereich, die bzw. der einer Behandlung für eine Zeit
von mehr als fünf
oder mehr Tagen bedarf.
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Die
Anwesenheit von Rhodamin-DPPE in der Membran von Liposomen versah
liposomale Hydrogele mit einer rosaroten Farbe, deren Intensität ebenfalls
im ganzen Verlauf des Experiments nicht merklich abnahm, was anzeigt,
dass die Liposomen in dem Hydrogel eingebettet blieben und nicht
aus den vorgesehenen Stellen herauswanderten.
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Es
wurde gefunden, dass das getrocknete liposomale Hydrogel, d.h.,
vor dem Beladen mit Antibiotikum getrocknet, nach Rehydratisierung
seine Eigenschaften der verzögerten
Freisetzung beibehielt, was eine wichtige Überlegung für die klinische Anwendung des
Systems ist. Ein wirksames Trocknungs- und Rehydratisierungsverfahren
verwendet das getrocknete liposomale Hydrogel, das in einer 25 mg
Ciprofloxacin enthaltenden Lösung
rehydratisiert wird. Als Kontrolle wurde ein getrocknetes Hydrogel,
das keine Liposomen enthielt, in einer 25 mg/ml Ciprofloxacin-Lösung hydratisiert.
Die durchschnittliche Gesamtmenge an Antibiotikum, die in diesen
Hydrogelen eingeschlossen wurde, ist in Tabelle 2 aufgeführt, und
für die
gleichen Zwecke ist auch der gesamte eingeschlossene Arzneistoff
eingeschlossen. Die Hydrogele, die in einer konzentrierten Ciprofloxacin-Lösung (25
mg/ml) rehydratisiert wurden, hielten eine sehr große Antibiotikummenge
(etwa 1,4 mg/1 cm Katheterabschnitt) zurück. Nahezu alles (> 99%) Hydrogel-assoziierte
Ciprofloxacin wurde nach den ersten vier Stunden Inkubation freigesetzt,
wie aus einer Analyse des Standes der Technik erwartet.
-
Die
Freisetzungskinetik von Ciprofloxacin aus ausgewählten Hydrogel-Behandlungen kann
durch Analyse der Daten in Tabelle 3 verfolgt werden. Trotz der
großen
anfänglichen
Antibiotikum-Freisetzung ist es offensichtlich, dass es immer nur
eine kleine, aber anhaltende Freisetzung von Ciprofloxacin aus den
getrockneten liposomalen Hydrogelen gab, die in konzentrierter Ciprofloxacin-Lösung rehydratisiert worden
waren. Im Vergleich war die Freisetzung von Ciprofloxacin aus der
Behandlung mit getrocknetem Hydrogel allein nach 20,5 Stunden und
länger
vernachlässigbar.
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Ciprofloxacin
wurde getrockneten liposomalen Hydrogelen während des Rehydratisierungsschrittes einverleibt,
da unsere Daten anzeigten, dass vorbeladene Liposomen, die in einem
Hydrogel eingebettet waren, durch Dehydratisierung destabilisiert
wurden. In der Tat wurde Antibiotikum in die Liposomen eingekapselt,
als sie sich während
der Rehydratisierung des PEG-Gelatine-Films
wieder bildeten. Unsere Berechnungen zeigen, dass der Einkapselungswirkungsgrad
für Ciprofloxacin
in Liposomen, die in situ erzeugt wurden, 7% relativ zu der Menge
an Ciprofloxacin in vorgebildeten Liposomen war. Der Abweichung
kann durch die verschiedenen verwendeten Beladungstechniken Rechnung
getragen werden. Im Allgemeinen werden Verbindungen wirksamer innerhalb
von Liposomen konzentriert, wenn ein Remote-Loading-Verfahren verwendet wird,
das den pH- und Ammoniumsulfat-Gradienten
ausnutzt, als wenn ein Lipidfilm-Hydratisierungsverfahren verwendet
wird.
-
Das
optimale Ausströmungsprofil
bezüglich
einer verlängerten
Freisetzung von wesentlichen Antibiotikum-Mengen wurde aus liposomalen
Hydrogel-Proben erhalten, die nicht dehydratisiert wurden. Es wurde gezeigt,
dass das Hydrogel-System
wesentliche Arzneistoffmengen bis zu 7 Tage freisetzen konnte. Es
ist möglich,
die Menge und Dauer der Freisetzung durch Erhöhung der Liposomen-Konzentration in
dem Hydrogel zu verbessern; dieser Aspekt ist nicht beschränkend. Zum
Beispiel kann die Konzentration verdoppelt werden, ohne die Hydrogel-Stabilität zu beeinflussen.
Die Erhöhung
der Liposomen-Konzentration gestattet, dass das luftgetrocknete
liposomale Hydrogel-System eine brauchbare Alternative wird, da
dies die Verringerung des Arzneistoff-Einkapselungswirkungsgrades
ausgleicht, der mit der in-situ-Erzeugung von Liposomen verbunden
ist. Alternativ kann ein getrocknetes liposomales Hydrogel mit geeigneten
Eigenschaften der verzögerten
Freisetzung, wie hier dargestellt, durch die Entwicklung eines Lyophilisierungsprotokolls
erhalten werden. Zahlreiche Untersuchungen haben gezeigt, dass Liposomen,
die in Anwesenheit von Zuckern, wie Saccharose oder Trehalose, gefriergetrocknet
werden, ohne wesentlichen Verlust ihres Inhalts rehydratisiert werden
können.
L. M. Crowe, J. H. Crowe, A. Rudolph, C. Womersley und L. Appel, "Preservation of freeze-dried
liposomes by trehalose",
Arch. Biochem. Biophys., 242: 240–247 (1985); W. Q. Sun, A.
C. Leopold, L. M. Crowe, J. H. Crowe, "Stability of dry liposomes in sugar
glasses", Biophys.
J., 70: 1769–1776
(1996).
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Bakterien-Biofilmbildungs-Assay
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Ein
praktisches Ziel dieser Erfindung ist auf ein Katheter oder irgendeine
polymere biomedizinische Vorrichtung gerichtet, die einer Besiedelung
durch Bakterien und einer anschließenden Infektion in vivo und während der
Anwendung widerstehen kann. Zu diesem Zweck wurden unbehandelte,
mit PEG-Gelatine beschichtete und Ciprofloxacin-haltige liposomale
Hydrogel-Katheterabschnitte mit einem klinischen Stamm von P. aeruginosa
infiziert, von dem bekannt ist, dass er auf Silicon-Kathetern Biofilme
bildet. Die Hydrogel-Beschichtung, die Antibiotikum-Liposomen enthielt,
war wirksam, um zu verhindern, dass Zellen anhaften und lebensfähig bleiben.
Die Zahl von lebensfähigen
Bakterien in der Brühe,
welche diese Abschnitte enthielt, betrug am Ende des Experiments
etwa 6,7 × 102 CFU/ml. Dies legt nahe, dass die Abwesenheit
von lebensfähigen Zellen
auf der Katheter-Oberfläche
nicht einfach auf der Gesamtbeseitigung des anfänglichen Inokulums beruhte,
welche die Folge der Freisetzung des Arzneistoffs während der
ersten wenigen Stunden war. Es ist wahrscheinlich, dass die fortgesetzte
Freisetzung von Ciprofloxacin über
eine Zeitspanne von mehr als fünf Tagen
signifikant zu der nahezu vollständigen
Verhütung
der Anhaftung von lebensfähigen
Bakterien und der Eliminierung des potentiellen Biofilms beitrug.
Ein weiterer beitragender Faktor kann die Anwesenheit von PEG im
Hydrogel gewesen sein. Frühere
Untersuchungen haben gezeigt, dass Polymere, die mit Polyoxyethylen-Ketten
beschichtet sind, eine Bakterienzellen-Anhaftung verhindern oder
verlangsamen können.
Es waren im Vergleich zu unbehandelten Proben weniger Bakterien
in der Lage, an Katheterabschnitten anzuhaften, die mit PEG-Gelatine-Gel
beschichtet waren. Die Abnahme der Bakterienzellen-Anhaftung von etwa
zwei Größenordnungen
kann weiter durch Erhöhen
der PEG-Konzentration
im Hydrogel verbessert werden.
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Allgemeines
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Die
Phospholipide Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) und PEG-Distearoylphosphatidylethanolamin
(PEG-DSPE) wurden von Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL) erhalten.
Rhodamindipalmitoylphosphatidylethanolamin (Rhodamin-DPPE) und 4-Azido-2,3,5,6-tetrafluorbenzoesäure (AFB)
wurden von Molecular Probes (Eugene, OR) erworben. Schweine-Gelatine-a
(MG 50.000–100.000),
Polyoxyethylenbis(p-nitrophenylcarbonat) (NP-PEG) und Cholesterol
wurden von Sigma (St. Louis, MO) erhalten. Fluorescamin, 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid
(DCC), N-Hydroxysuccinimid (NHS) und Siriusrot wurden von Aldrich
(Milwaukee, WI) erworben. Alle Reagenzien und Lösungsmittel waren von analytischer
Güte und
wurden ohne weitere Reinigung verwendet.
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Deionisiertes
Wasser (Milli-Q, Millipore, Bedford, MA), das durch eine 0,22 μm-Membran filtriert
wurde, wurde in allen Experimenten verwendet. Ciprofloxacin (Bayer,
Deutschland) wurde in einem Perkin Elmer LS-50-Fluorimeter analysiert.
Siriusrot und p-Nitrophenol wurden unter Verwendung eines Hewlett-Packard 8450-Spektrophotometers
quantitativ bestimmt.
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Silicon-Foley-Katheter
(Sherwood Medical, St. Louis, MO) wurden für den Gebrauch präpariert,
indem man sie in Zylinder (3 mm Durchmesser und 10 mm Länge) zerschnitt.
Die offenen Enden der Abschnitte wurden mit Siliconkautschuk (RTV
108, GE, Pickering, ON) verschlossen. Gelegentlich wurden zylindrische
Abschnitte weiter in rechteckige Stücke (5 mm × 3 mm) unterteilt. Die Silicon-Abschnitte wurden
vor jedem Experiment durch sechsstündiges Refluxieren in Methanol
gereinigt.
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Zwei
pädiatrische
Silicon-Foley-Katheter wurden unter aseptischen Bedingungen mit
einer PEG-Gelatine-Liposomen-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung,
wie hierin beschrieben, beschichtet. Die Katheter wurden in die
Harnröhre
von zwei männlichen
weißen
Neuseeland-Kaninchen eingeführt.
Nach zehn Minuten wurden die Katheter entfernt; und die Katheter
und die ausgeschnittene Harnröhre
wurden überprüft. Es wurde
keine Zerstörung
des Gels auf dem Katheter beobachtet, und in der Harnröhre wurden
keine Gelfragmente nachgewiesen. Tabelle
2. Der Substitutionsgrad von Gelatine mit AFB als Funktion des anfänglichen
Verhältnisses
von ε-Aminogruppen
zu NHS-AFB.
ε-NH2/NHS-AFB | Substitutionsgrad
(%) |
9 | 99 ± 4 |
2 | 93 ± 4 |
1 | 71 ± 5 |
0,75 | 55 ± 2 |
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Tabelle
3. Freisetzung von Ciprofloxacin aus Liposomen allein, konstant
hydratisiertem liposomalem PEG-Gelatine-Hydrogel (LipoGel), getrocknetem
liposomalem PEG-Gelatine-Gel, das mit 25 mg/ml Ciprofloxacin-Lösung rehydratisiert
wurde (DryLipoGel) (25 mg)) und getrocknetem PEG-Gelatine-Gel, das
in 25 mg/ml Ciprofloxacin-Lösung
rehydratisiert wurde (DryGel (25 mg)).
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Bindung von
Polyacrylsäure
an Polydimethylsiloxan
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Swanson
und Opperman (M. J. Swanson und G. W. Opperman, "Photochemical surface modification of
polymers for improved adhesion",
J. Adhesion Sci. Technol. 9: 385–391 (1995)) lehren, dass die
Oberflächen von
organischen Polymeren für
eine verbesserte Bindung durch Photoaktivierung eines Benzophenon-Derivats
mit geeigneter Bestrahlung modifiziert werden können.
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Weiter
mit Bezug auf die obige Erfindung kann die Oberfläche von
Polydimethylsiloxan(PDMS)-Polymeren und Polymeren wie Isobutylen,
cis-1,4-Isopren, trans-1,4-Isopren, Polyethylen und dergleichen
photochemisch modifiziert werden. Das Verfahren verwendet das photoreaktive
Molekül
Benzoylbenzoesäure (BBA),
Acrylsäure
und PDMS. In Anwesenheit von langwelligem Ultraviolettlicht, 320–380 nm,
wird BBA in ein hoch reaktives freies Radikal überführt. Das freie Radikal kann,
wenn es in Nachbarschaft zu einem Polymer, wie PDMS, vorliegt, ein Wasserstoffatom
aus der Methylengruppe von PDMS abstrahieren, ohne die Volumeneigenschaften
des Polymers zu ändern,
und ein Methylenradikal unter Umbildung von BBA erzeugen. In Anwesenheit
von Acrylsäure
(AA) induziert das Methylenradikal des Pfropfen von AA auf das PDMS
und die Polymerisation von AA-Einheiten, was so PDMS liefert, das
mit Polyacrylsäure
gepfropft ist (PDMS-g-AA).
Die Technik kann auf Vinyl-Monomere angewendet werden; so kann Polyvinylacetat
auf PDMS oder ein anderes Material gepfropft werden, das einen Methylen-Wasserstoff
enthält.
Siehe Beispiel 1.
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Gelatine-Gele
könne mit
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC) vernetzt werden,
was ein Gel produziert, das bis zu mindestens 50°C stabil ist. Vor der Vernetzung
können
diese Gelatine-Gele homogen mit einer Liposomen-Suspension gemischt werden, um als Arzneistoff-Reservoirs
zu wirken. Die Vernetzungschemie beinhaltet die Aktivierung der
Gelatine-Carboxylgruppen durch EDAC. Die EDAC-Gelatine-Bindung ist
für eine
Aminolyse durch die ε-Amino-Einheiten der
Gelatine-Lysin-Reste empfänglich,
was eine Vernetzung der Gelatine-Moleküle zum Ergebnis hat. Diese
Reaktion ist auf alle Moleküle
anwendbar, die Carboxyl- und Aminogruppen enthalten. So können Gelatine-Gele
mit Poly-AA und/oder Polyethylenglycol vernetzt werden, die bzw.
das mit Amino- oder
Carboxyl-Einheiten als Endgruppen versehen ist. Siehe Beispiel 2.
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Beispiel 1.
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Pfropfen von
Acrylsäure
auf das Polydimethylsiloxan
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Eine
Portion PDMS wird in einer Methanol-Lösung von 100 mM BBA 1 Stunde
inkubiert. Die PDMS-Probe wird aus der Lösung entfernt und 1 Stunde
bei 40°C
luftgetrocknet. Das BBA-beschichtete Polymer wird anschließend in
eine gesättigte
wässrige
BBA-Lösung
gegeben, die 50 mg/ml frisch destilliertes AA enthält; Stickstoffgas
wird 20 Minuten lang durch die Lösung
geleitet, und dann wird diese 2 Stunden mit langwelligem Ultraviolettlicht
bei 350 nm bestrahlt, aber 320–380
nm können
verwendet werden, um die Ausführungsform
des Verfahrens zu erzielen. Die bestrahlte Probe wird erschöpfend mit
einer 50:50 (Vol./Vol.) Wasser:Ethanol-Lösung gewaschen und mit destilliertem
Wasser gespült.
Die Behandlung erzeugt PDMS, das mit AA gepfropft ist (PDMS-g-AA).
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Beispiel 2.
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Vernetzung von Liposomen-Gelatine-Gel
mit 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDAC)
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Gelatine-Gele
werden hergestellt, wie in der CIP beschrieben. Gelatine-Gele, die
Liposomen, 40 mg CPPC/ml 10%-ige Gelatine-Lösung, enthalten, werden 15
Minuten bei 4°C
verfestigt und 30 Minuten bei Raumtemperatur (20–25°C) in eine EDAC-Lösung (10
mg/ml), pH 4,5, gegeben, welche eine geringe Menge (1/15 Molenbruch
der EDAC-Lösung,
um den Wirkungsgrad der Carboxylgruppen-Aktivierung zu erhöhen) N-Hydroxysuccinimid enthält. Die
Gele werden dann in einer Borat-Puffer-Lösung, pH 9,0, 1 Stunde vernetzt.