DE69832069T2

DE69832069T2 - Elektrospray-anordnung zur einführung von material in zellen

Info

Publication number: DE69832069T2
Application number: DE69832069T
Authority: DE
Inventors: Y. David PUI; Da-Ren Chen
Original assignee: University of Minnesota
Current assignee: University of Minnesota
Priority date: 1997-06-12
Filing date: 1998-06-05
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2018-06-06
Also published as: US7972661B2; US20080141936A1; US6093557A; US20020150669A1; US6399362B1; EP0988370A1; WO1998056894A1; DE69832069D1; ATE307878T1; EP1616620A3; US7279322B2; US20040177807A1; EP1616620A2; EP0988370B1; US6433154B1; AU8059998A; US6746869B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Introduktion bzw. Einführung von Material in Zellen, z. B. Gentransfer. Insbesondere betrifft die Erfindung Anordnungen und Verfahren, die Elektrospray-Techniken zur Durchführung einer solchen Einführung von Material in Zellen nutzen.
Hintergrund der Erfindung
Verschiedene Vorrichtungen und Verfahren zur Verwendung bei der genetischen Transformation von Pflanzen- und Lebewesenzellen sind bisher benutzt worden, und viele andere sind bisher in verschiedenen Veröffentlichungen beschrieben worden. Beispielsweise weisen einige frühe Techniken zur Durchführung des Transports von Substanzen, z. B. DNA, in Zellen Aufnahmemechanismen, Fusionsmechanismen und Mikroinjektionsmechanismen auf. Im allgemeinen schließen Aufnahmemechanismen die Verwendung von Substanzen ein, wie beispielsweise etwa Liposomen, die Substanzen einhüllen und den Transfer von Substanzen in die Zelle durch Fusion der Liposomen mit der Zellmembran, Elektroporation, Kalziumchloridprezipitation und dgl. ermöglichen. Die Aufnahmeprotokolle sind im allgemeinen sehr einfach und ermöglichen die Behandlung großer Mengen von Zellen gleichzeitig, aber diese Technik neigt dazu, eine sehr niedrige Effizienz zu haben, das heißt, die Transformationsfrequenz ist niedrig.
Im allgemeinen beziehen Fusionsmechanismen genetisches Material dadurch in eine Zelle, daß sie eine Zelle mit einer Membran verschmelzen lassen, die mit der Zellmembran der Zelle kompatibel ist. Die Fusion zweier Zellen kann zur Einführung von Material in eine Zelle verwendet werden. Zellfusionstechnologien können bessere Effizienzen haben als Aufnahmemecha nismen, aber die Zellselektion kann komplexer sein, und die resultierenden Zellen haben normalerweise eine erhöhte Ploidie, die ihre Brauchbarkeit einschränkt.
Mikroinjektionsmechanismen verwenden normalerweise extrem feine herausgezogene Kapillarröhrchen, die mitunter Mikropipetten oder Nadeln sind. Diese Kapillarröhrchen können ausreichend klein gemacht werden und als Spritzennadeln zur direkten Injektion von Biomaterial in bestimmte Typen von Einzelzellen verwendet werden. Wenn in sehr kleine Zellen zu injizieren ist, sind sehr scharfe Kapillarröhrchen erforderlich, deren Spitzen sehr leicht brechen oder verstopfen. Hohe Drücke sind dann erforderlich, um den Volumenstrom durch die kleinen Öffnungen zu ermöglichen, und eine Regulierung dieses Stroms ist schwierig. Eine Form von Mikroinjektion, die gemeinhin als Ionophorese bezeichnet wird, wird ebenfalls verwendet. Die Ionophorese nutzt die Elektrophorese von Substanzen aus einer Mikroelektrode und in eine Zelle als Alternative zum Hochdruckvolumenstrom aus. Obwohl die Effizienz der Mikroinjektion, wie man erwarten könnte, hoch ist, erfolgt die Transformation einzelner Zellen durch Einzelzellenmanipulation, und daher ist die Massenbehandlung von Zellen schwierig.
In jüngster Zeit sind verschiedene Techniken, die eine Beschleunigung von Substanzen zur Bombardierung mit Zellen, um Gentransfer zu ermöglichen, verwendet und beschrieben worden, z. B. Genkanonen. Beispielsweise schließen solche Techniken die Verwendung eines mechanischen Aufpralls zum Herausschleudern solcher Substanzen, die Verwendung von elektrostatischer Beschleunigung der Substanzen und/oder die Verwendung von elektrostatischer Entladung zum Herausschleudern solcher Substanzen, ein. Es ist bisher festgestellt worden, daß es solche Techniken ermöglichen, daß die Substanzen eine Geschwindigkeit erreichen, die sie in Zellen eindringen lassen.
Verschiedene Formen der Beschleunigung von Substanzen sind beispielsweise in dem Genkanonen-Patent von Sanford et al., US-Patent 4 945 050 mit dem Titel "Method for Transforming Substances into Living Cells and Tissues and Apparatus Therefor" beschrieben. Wie dort beschrieben, wird beispielsweise ein mechanischer Stoß auf eine Schicht von Partikeln (z. B. Gold) ausgeübt, die beschichtet, imprägniert oder einem Biomaterial anderweitig zugeordnet sind. Der Aufprall bewirkt, daß sich die Partikel so beschleunigen, daß die Partikel auf die zu transformierenden Zellen hinter der Anordnung auftreffen, die den mechanischen Stoß bewirkt. Die Partikel durchschlagen die Zellmembran und dringen in die Zelle ein, wobei das Biomaterial in den Zellen verbleibt.
Funkenentladungstechniken zur Beschleunigung der Partikel, wie im US-Patent 5 120 657 von McCabe et al. beschrieben, schließen die Verwendung einer Funkenentladungskammer ein. Die Kammer weist Elektroden auf, die durch einen Funkenspalt beabstandet sind. Ein beweglicher Partikelträger wird bewegt, wenn eine Funkenentladung in der Kammer eine Stoßwelle erzeugt, die den beweglichen Partikelträger so beschleunigt, daß der bewegliche Partikelträger auf ein anderes Objekt auftrifft und dabei die Zellen für den Zusammenprall mit den zu transformierenden Ziel- bzw. Targetzellen beschleunigt.
Solche mechanischen Stoßtechniken haben jedoch verschiedene Nachteile. Zunächst sind die Techniken im allgemeinen Chargenverarbeitungstechniken, d. h. sie transferieren eine bestimmte Charge beschichteter oder imprägnierter Partikel. Wenn mehr Partikel als die Anzahl der Partikel einer einzelnen Charge zu transferieren sind, muß eine weitere Serie oder Charge ausgelöst werden. Dies kann beispielsweise das Nachladen oder Neubestücken eines Teils der Anordnung, der die Partikel aufnimmt, z. B. den oben beschriebenen beweglichen Partikelträger, umfassen.
Ferner können die beschichteten oder imprägnierten Partikel, wenn sie auf der Transferoberfläche, z. B. auf dem beweglichen Partikelträger, positioniert sind, agglomerieren, oder eine solche Agglomeration kann während des Transfers auftreten. Die Agglomeration der Partikel kann Schäden durch unerwünschte Vertiefungen an den Targetzellen beim Zusammenprall mit ihnen bewirken.
Außerdem ist die Herstellung von beschichteten oder imprägnierten Partikeln ein zeitaufwendiger Prozeß. Beispielsweise kann es einen oder mehrere Tage dauern, bis beschichtete oder imprägnierte Partikel aus einer Lösung, die die Träger partikel oder das zu transferierende Biomaterial enthält, abgeschieden sind.
Außerdem kann der Gesamtprozeß nicht ohne weiteres gesteuert werden. Beispielsweise gibt es normalerweise nur einen begrenzten Aufprallgeschwindigkeitsbereich, den die beschichteten oder imprägnierten Partikel erreichen können. Der Typ oder Ausgangspunkt der Zelle kann die zur Transformation notwendige Geschwindigkeit beeinflussen. Daher sind Vorrichtungen, die einen größeren Bereich von Aufprallgeschwindigkeiten erzeugen können, erwünscht. Ferner ist beispielsweise die gleichmäßige Abgabe von Partikeln an die Targetzellen nicht leicht zu steuern. Daher können Targetzellen, die sich in bestimmten Positionen befinden, leichter als diejenigen Targetzellen, die diese Positionen umgeben, beschädigt werden. Beispielsweise können Targetzellen, die sich in der Mitte einer Charge von Targetzellen befinden, leichter als diejenigen, die sich um einen Targetbereich herum befinden, zerstört oder abgetötet werden, wenn sie mit beschichteten oder imprägnierten Partikeln durch herkömmliche Chargen-Genkanonenvorrichtungen bombardiert werden. Dies kann zumindest teilweise auf die Agglomeration der Partikel zurückzuführen sein. Da der Gesamtprozeß nicht leicht gesteuert werden kann, ist die Menge des an die Targetzellen abzugebenden Biomaterials nicht ohne weiteres steuerbar.
Weitere Beschleunigungstechniken, z. B. Aerosolstrahltechnologie, elektrostatische Beschleunigungsfelder, Zentrifugaltechniken usw., wie im US-Patent 4 945 050 in der internationalen Veröffentlichung WO 91/00915 mit dem Titel "Aerosol Beam Microinjector" und in verschiedenen und zahlreichen anderen Dokumenten beschrieben, müssen nicht sämtliche Nachteile aufweisen, wie mit Bezug auf die Verwendung eines mechanischen Stoßes beschrieben. Solche Techniken mildern jedoch nicht alle diese Probleme. Beispielsweise kann die Aerosoltechnik ein kontinuierlicheres Transferverfahren im Gegensatz zu einem Chargenverarbeitungsverfahren ermöglichen, hat aber dennoch die damit verbundenen Agglomerationsnachteile.
Aus den oben genannten Gründen besteht in der Fachwelt Bedarf an Gentransferverfahren und -anordnungen, die die Aus wirkung solcher Nachteile, wie oben beschrieben, reduzieren. Die Erfindung löst die oben beschriebenen und weitere Probleme, wie sie für den Fachmann aus der nachstehenden ausführlichen Beschreibung erkennbar werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Einführung von Biomaterial in Zellen weist die Schritte auf: Bereitstellen eines oder mehrerer Targetzellen und Erzeugen eines Sprays aus im wesentlichen dispergierten Partikeln, einschließlich Biomaterial. An die im wesentlichen dispergierten Partikel wird eine elektrische Ladung angelegt, so daß ein oder mehrere der im wesentlichen dispergierten Partikel des Sprays in eine oder mehrere Targetzellen eingeführt werden.
In einer Ausführungsform des Verfahrens weist der Schritt des Erzeugens des Sprays aus im wesentlichen dispergierten Partikeln den Schritt auf: Abgeben eines Sprays von Mikrotröpfchen, die Partikel suspendieren. Die elektrische Ladung wird auf die suspendierten Partikel konzentriert, während die Mikrotröpfchen verdampfen.
In verschiedenen Ausführungsformen können die suspendierten Partikel Trägerpartikel mit den Trägerpartikeln zugeordnetem Biomaterial aufweisen, oder die suspendierten Partikel können Partikel aus Biomaterial aufweisen. Das Spray kann auch ein geladenes Spray aus pulverförmigem Biomaterial sein.
Ferner kann in noch einer weiteren Ausführungsform der Schritt des Abgebens von Spray von Mikrotröpfchen, die Partikeln suspendieren, den Schritt aufweisen: Erzeugen eines ungleichmäßigen elektrischen Feldes zwischen einer Abgabespitze, an der das Spray erzeugt wird, und einer Elektrode, die von der Abgabespitze elektrisch getrennt ist. Die im wesentlichen dispergierten Partikel können unter Verwendung der Elektrode, die von der Abgabespitze getrennt ist, auf die eine oder mehreren Targetzellen gelenkt werden.
In einer weiteren Ausführungsform ermöglicht der Raumladungseffekt der konzentrierten elektrischen Ladung der im wesentlichen dispergierten Partikel des Sprays, daß ein oder mehrere der Partikel in ein oder mehrere der Targetzellen ein geführt werden. Die elektrische Ladung, die auf ein bestimmtes Partikel konzentriert ist, ist im Bereich von etwa 80% bis etwa 95% der maximalen Ladung, die von dem Mikrotröpfchen, das das bestimmte Partikel suspendiert, gehalten werden kann.
In noch einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens weist der Schritt des Erzeugens eines Sprays aus im wesentlichen dispergierten Partikeln auf: Herstellen eines kontinuierlichen Sprays aus im wesentlichen dispergierten Partikeln.
Eine erfindungsgemäße Anordnung zum Einführen von Biomaterial in eine oder mehrere Targetzellen weist eine Biomaterialquelle auf, die zumindest Biomaterial aufweist. Die Anordnung weist ferner eine Abgabevorrichtung auf, die betriebsfähig mit der Biomaterialquelle verbunden ist, um zumindest Biomaterial aus der Biomaterialquelle aufzunehmen. Die Abgabevorrichtung weist ein Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln aus zumindest dem Biomaterial auf. Ferner wird an das Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln eine elektrische Ladung angelegt, so daß eine oder mehrere der im wesentlichen dispergierten Partikel des Sprays in eine oder mehrere der Targetzellen eingeführt werden.
In einer Ausführungsform der Anordnung weist die Biomaterialquelle eine Suspensionsquelle auf. Die Suspensionsquelle weist eine Suspension von zumindest Biomaterial auf. Ferner nimmt die Abgabevorrichtung die Suspension auf und gibt ein Spray aus Mikrotröpfchen ab, die Partikel aus zumindest Biomaterial suspendieren.
In einer weiteren Ausführungsform weist die Abgabevorrichtung eine Abgabespitze, von der das Spray von Mikrotröpfchen suspendierenden Partikeln abgegeben wird, und eine von der Abgabespitze getrennte Elektrode auf. Ein ungleichmäßiges elektrisches Feld wird zwischen der Abgabespitze und der Elektrode erzeugt. Im allgemeinen befindet sich die Elektrode, z. B. eine Ringelektrode oder eine leitfähige Targetoberfläche, in einer Position relativ zur Abgabespitze, um das Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln auf eine oder mehrere Targetzellen zu lenken. Das Target und die Dispersionsvorrichtung können relativ zueinander beweglich sein, z. B. kann ein Abstand zwischen der Abgabevorrichtung und dem Target reguliert werden.
Eine weitere erfindungsgemäße Vorrichtung zur Einführung von Biomaterial in Targetzellen weist eine Biomaterialquelle mit einer Suspension aus zumindest Biomaterial auf. Die Vorrichtung weist ferner eine Kapillarröhrchen-Elektrode auf. Die Kapillarröhrchen-Elektrode weist ein Kapillarröhrchen mit einem ersten offenen Ende und einem zweiten offenen Ende auf, wobei das Kapillarröhrchen betriebsfähig mit der Biomaterialquelle verbunden ist, um einen Strom der Suspension aus zumindest Biomaterial an ihrem ersten offenen Ende aufzunehmen. Die Anordnung weist ferner eine Elektrode auf, die von dem zweiten offenen Ende des Kapillarröhrchens getrennt, aber in dessen Nähe positioniert ist. Ein ungleichmäßiges elektrisches Feld wird zwischen der Kapillarröhrchen-Elektrode und der Elektrode erzeugt, so daß ein Spray von Mikrotröpfchen, die Partikel aus zumindest Biomaterial suspendieren, aus dem zweiten Ende des Kapillarröhrchens hervorgebracht wird. Ferner wird bei Verdampfung der Mikrotröpfchen eine elektrische Ladung auf die suspendierten Partikel konzentriert, was zu einem geladenen Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln führt, so daß ein oder mehrere der im wesentlichen dispergierten Partikel des Sprays in eine oder mehrere der Targetzellen eingeführt werden.
In einer Ausführungsform der Anordnung weist die Kapillarröhrchen-Elektrode ferner eine Umhüllung auf, die konzentrisch mit mindestens einem Abschnitt des Kapillarröhrchens zwischen seinem ersten und zweiten offenen Ende ist. Das zweite offene Ende des Kapillarröhrchens erstreckt sich um eine vorbestimmte Strecke über die Umhüllung hinaus. Die Anordnung weist ferner eine Gasquelle auf, die ein Gas bereitstellt, das zwischen dem Kapillarröhrchen und der konzentrischen Umhüllung aufzunehmen ist.
Noch eine weitere erfindungsgemäße Anordnung zur Einführung von Biomaterial in Targetzellen ist nachstehend beschrieben. Die Anordnung weist eine Biomaterialquelle mit einer Suspension aus zumindest Biomaterial und einer Elektrolytquelle zur Bereitstellung einer Lösung auf. Die Anordnung weist ferner eine Kapillarröhrchen-Elektrode mit einer Abgabespitze auf. Die Kapillarröhrchen-Elektrode weist ein erstes Kapillarröhrchen mit einem ersten offenen Ende und einem zweiten offenen Ende auf, wobei das Kapillarröhrchen betriebsfähig mit der Biomaterialquelle verbunden ist, um einen Strom der Suspension aus zumindest Biomaterial an ihrem ersten offenen Ende aufzunehmen. Die Kapillarröhrchen-Elektrode weist ferner ein zweites Kapillarröhrchen auf, das mit mindestens einem Abschnitt des ersten Kapillarröhrchens konzentrisch ist. Die Lösung wird in einer ringförmigen Öffnung aufgenommen, die zwischen dem ersten und dem zweiten konzentrischen Kapillarröhrchen gebildet wird. Noch eine weitere Anordnung weist eine Elektrode auf, die von der Abgabespitze der Kapillarröhrchen-Elektrode getrennt, aber in deren Nähe positioniert ist. Ein ungleichmäßiges elektrisches Feld wird zwischen der Kapillarröhrchen-Elektrode und der Elektrode erzeugt, so daß ein Spray von Mikrotröpfchen, die Partikel aus zumindest Biomaterial suspendieren, an der Abgabespitze bereitgestellt wird. Bei Verdampfung der Mikrotröpfchen wird eine elektrische Ladung auf die suspendierten Partikeln konzentriert, was zu einem geladenen Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln führt.
Ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren zur Einführung von Biomaterial in Targetzellen weist die Schritte auf: Bereitstellen einer oder mehrerer Targetzellen, Bereitstellen eines ersten Stroms aus einer Suspension, die zumindest Biomaterial aufweist, und Bereitstellen eines zweiten Stroms einer Elektrolytlösung. Ein Spray aus im wesentlichen dispergierten Partikeln mit zumindest Biomaterial wird aus dem ersten Strom und dem zweiten Strom erzeugt. An die im wesentlichen dispergierten Partikel wird eine elektrische Ladung angelegt, so daß ein oder mehrere der im wesentlichen dispergierten Partikel des Sprays in eine oder mehrere der Targetzellen eingeführt werden.

1. Verfahren zur Einführung von Biomaterial in Zellen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: Bereitstellen einer oder mehrerer Targetzellen; und Erzeugen eines Sprays von im wesentlichen dispergierten Partikeln, die zumindest Biomaterial aufweisen, wobei an die im wesentlichen dispergierten Partikel eine elektrische Ladung angelegt wird, so daß ein oder mehrere der im wesentlichen dispergierten Partikel des Sprays in eine oder mehrere der Targetzellen eingeführt werden.
2. Verfahren gemäß Ausführungsform 1, wobei der Schritt der Erzeugung des Sprays von im wesentlichen dispergierten Partikeln den Schritt aufweist: Abgeben eines Sprays von Mikrotröpfchen, die eine oder mehrere Partikel suspendieren, und wobei ferner die elektrische Ladung auf die in den Mikrotröpfchen suspendierten Partikel konzentriert wird, während die Mikrotröpfchen verdampfen.
3. Verfahren gemäß Ausführungsform 2, wobei die suspendierten Partikel Partikelträger und Biomaterial aufweisen.
4. Verfahren gemäß Ausführungsform 2, wobei die suspendierten Partikel Partikel aus Biomaterial sind.
5. Verfahren gemäß Ausführungsform 2, wobei der Schritt des Abgebens des Sprays von Mikrotröpfchen den Schritt aufweist: Erzeugen eines gleichmäßigen elektrischen Feldes zwischen einer Abgabespitze, an der das Spray erzeugt wird, und einer Elektrode, die von der Abgabespitze elektrisch getrennt ist.
6. Verfahren gemäß Ausführungsform 5, wobei das verfahren ferner den Schritt aufweist: Lenken des Sprays von im wesentlichen dispergierten Partikeln in Richtung der einen oder mehreren Targetzellen unter Verwendung der von der Abgabespitze getrennten Elektrode.
7. Verfahren gemäß Ausführungsform 2, wobei ein Raumladungseffekt der konzentrierten elektrischen Ladung der im wesentlichen dispergierten Partikel des Sprays ermöglicht, daß einer oder mehrere der Partikel im Bereich von etwa 80% bis etwa 95% einer maximalen Ladung ist, die von dem Mikrotröpfchen gehalten wird, das das bestimmte Partikel suspendiert.
8. Verfahren gemäß Ausführungsform 7, wobei die elektrische Ladung, die auf ein bestimmtes Partikel konzentriert ist, im Bereich von etwa 80% bis etwa 95% einer maximalen La dung ist, die von dem Mikrotröpfchen gehalten wird, das das bestimmte Partikel suspendiert.
9. Verfahren gemäß Ausführungsform 1, wobei der Schritt des Erzeugens eines Sprays von im wesentlichen dispergierten Partikeln den Schritt aufweist: Erzeugen eines kontinuierlichen Sprays von im wesentlichen dispergierten Partikeln.
10. Verfahren gemäß Ausführungsform 1, wobei der Schritt des Erzeugens eines Sprays von im wesentlichen dispergierten Partikeln den Schritt aufweist: Abgeben eines Sprays von pulverförmigem Biomaterial.
11. Anordnung zum Einführen von Biomaterial in eine oder mehrere Targetzellen, wobei die Anordnung aufweist: eine Biomaterialquelle, die zumindest Biomaterial aufweist; und eine Abgabevorrichtung, die mit der Biomaterialquelle betriebsfähig verbunden ist, um zumindest Biomaterial von der Biomaterialquelle aufzunehmen, wobei die Abgabevorrichtung ein Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln zumindest des Biomaterials bereitstellt und wobei ferner an das Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln eine elektrische Ladung angelegt wird, so daß ein oder mehrere der im wesentlichen dispergierten Partikel des Sprays in eine oder mehrere der Targetzellen eingeführt werden.
12. Anordnung gemäß Ausführungsform 11, wobei die Biomaterialquelle eine Suspensionsquelle aufweist, wobei die Suspensionsquelle eine Suspension von zumindest Biomaterial aufweist und wobei ferner die Abgabevorrichtung die Suspension aufnimmt und ein Spray von Mikrotröpfchen abgibt, die Partikel mit Biomaterial suspendieren.
13. Anordnung gemäß Ausführungsform 12, wobei die Abgabevorrichtung aufweist: eine Abgabespitze, von der das Spray von Partikel suspendierenden Mikrotröpfchen abgegeben wird; und eine Elektrode, die von der Abgabespitze getrennt ist, wobei ein ungleichmäßiges elektrisches Feld zwischen der Abgabespitze und der Elektrode erzeugt wird.
14. Anordnung gemäß Ausführungsform 13, wobei die Elektrode sich in einer Position relativ zur Abgabespitze befin det, um das Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln in Richtung der einen oder mehreren Targetzellen zu lenken.
15. Anordnung gemäß Ausführungsform 11, wobei die Anordnung ferner eine Vakuumkammer aufweist, in der sich eine oder mehrere Targetzellen befinden, und wobei ferner die Abgabevorrichtung ein Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln in die Kammer einbringt.
16. Anordnung gemäß Ausführungsform 11, wobei die Anordnung ferner ein Target mit der einen oder mehreren Targetzellen aufweist, und wobei ferner das Target relativ zur Abgabespitze positioniert ist, um die Einführung von einem oder mehreren der Partikel in eine oder mehrere der Zielzellen zu ermöglichen.
17. Anordnung gemäß Ausführungsform 16, wobei mindestens eines, das Target und/oder die Abgabevorrichtung relativ zueinander beweglich sind.
18. Anordnung gemäß Ausführungsform 11, wobei die Biomaterialquelle eine Suspension aus zumindest Biomaterial aufweist und wobei ferner die Abgabevorrichtung aufweist: eine Kapillarröhrchenelektrode, wobei die Kapillarröhrchenelektrode ein Kapillarröhrchen mit einem ersten offenen Ende und einem zweiten offenen Ende aufweist, wobei das erste Kapillarröhrchen mit der Biomaterialquelle betriebsfähig verbunden ist, um einen Strom der Suspension von zumindest Biomaterial an seinem ersten offenen Ende aufzunehmen; und eine Elektrode, die von der Abgabespitze der Kapillarröhrchen-Elektrode getrennt, aber in der Nähe derselben positioniert ist, wobei ein ungleichmäßiges elektrisches Feld zwischen der Kapillarröhrchen-Elektrode und der Elektrode erzeugt wird, so daß ein Spray von Mikrotröpfchen, die Partikel von zumindest Biomaterial suspendieren, aus dem zweiten Ende des Kapillarröhrchens hervorgebracht wird, und wobei ferner nach Verdampfung der Mikrotröpfchen eine elektrische Ladung auf die suspendierten Partikel konzentriert wird, was zu einem geladenen Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln führt, so daß einer oder mehrere der im wesentlichen dispergierten Partikel des Sprays in eine oder mehrere der Targetzellen eingeführt wird.
19. Anordnung gemäß Ausführungsform 18, wobei die Elektrode sich in einer Position relativ zum zweiten offenen Ende des Kapillarröhrchens befindet, um das Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln in Richtung der Zielzellen zu lenken.
20. Anordnung gemäß Ausführungsform 19, wobei die Elektrode ist, die einen Durchmesser hat, der größer ist als der Durchmesser des Kapillarröhrchens, und die so positioniert ist, daß eine Achse durch die Mitte der Ringelektrode mit einer Achse übereinstimmt, die sich durch das Kapillarröhrchen erstreckt.
21. Anordnung gemäß Ausführungsform 19, wobei die Elektrode ein leitfähiges Target ist, das eine oder mehrere ihm zugeordnete Zellen aufweist und vor dem zweiten offenen Ende des Kapillarröhrchens positioniert ist, wobei das leitfähige Target eine Oberfläche hat, die größer ist als die Schnittfläche des Kapillarröhrchens, senkrecht zur Längsachse, die sich durch das Kapillarröhrchen erstreckt.
22. Anordnung gemäß Ausführungsform 18, wobei wobei die Kapillarröhrchen-Elektrode ferner eine Umhüllung aufweist, die zumindest mit einem Abschnitt des Kapillarröhrchens zwischen seinem ersten und zweiten offenen Ende konzentrisch ist, wobei das zweite offene Ende des Kapillarröhrchens sich um eine vorbestimmte Strecke über die Umhüllung hinaus erstreckt und wobei ferner die Anordnung eine Gasquelle aufweist, die ein aufzunehmendes Gas zwischen dem Kapillarröhrchen und der konzentrischen Umhüllung bereitstellt.
23. Anordnung gemäß Ausführungsform 11, wobei die Biomaterialquelle eine Suspension von zumindest Biomaterial aufweist, wobei die Anordnung ferner eine Elektrolytquelle zur Bereitstellung einer Lösung aufweist und wobei ferner die Abgabevorrichtung aufweist: eine Kapillarröhrchenelektrode mit einer Abgabespitze, wobei die Kapillarröhrchenelektrode aufweist: ein erstes Kapillarröhrchen mit einem ersten offenen Ende und einem zweiten offenen Ende, wobei das erste Kapillarröhrchen mit der Biomaterialquelle betriebsfähig verbunden ist, um einen Strom der Suspension aus zumindest Biomaterial an seinem ersten offenen Ende aufzunehmen, und ein zweites Kapillarröhrchen, das zumindest mit einem Abschnitt des ersten Kapillarröhrchens konzentrisch ist, wobei die Elektrolytlösung in einer ringförmigen Öffnung aufgenommen wird, die zwischen dem ersten und zweiten Kapillarröhrchen, die konzentrisch sind, gebildet wird; und eine Elektrode, die von der Abgabespitze der Kapillarröhrchenelektrode getrennt, aber in der Nähe derselben positioniert ist, wobei ein ungleichmäßiges elektrisches Feld zwischen der Kapillarröhrchen-Elektrode und der Elektrode erzeugt wird, so daß ein Spray von Mikrotröpfchen, die Partikel von zumindest Biomaterial suspendieren, an der Abgabespitze bereitgestellt wird, und wobei ferner bei Verdampfung der Mikrotröpfchen eine elektrische Ladung auf die suspendierten Partikel konzentriert wird, was zu einem geladenen Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln führt.
24. Anordnung gemäß Ausführungsform 12, 18 oder 23, wobei die suspendierten Partikel Trägerpartikel und Biomaterial aufweisen.
25. Anordnung gemäß Ausführungsform 12, 18 oder 23, wobei die suspendierten Partikel Partikel aus Biomaterial aufweisen.
26. Anordnung gemäß Ausführungsform 18 oder 23, wobei die Biomaterialquelle eine kontinuierliche Quelle von zumindest Biomaterial an das erste offene Ende des ersten Kapillarröhrchens liefert.
27. Anordnung gemäß Ausführungsform 18 oder 23, wobei die Elektrode sich in einer Position relativ zur Kapillarröhrchenelektrode befindet, um das Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln in Richtung der Targetzellen zu lenken.
28. Anordnung gemäß Ausführungsform 18 oder 23, wobei die Elektrode eine Ringelektrode ist, die einen Durchmesser hat, der größer als der Durchmesser der ersten oder zweiten Kapillarröhre ist, und die so positioniert ist, daß eine Achse durch die Mitte der Ringelektrode mit der Längsachse übereinstimmt, die sich durch das erste Kapillarröhrchen erstreckt.
29. Anordnung gemäß Ausführungsform 18 oder 23, wobei die Elektrode ein leitfähiges Target ist, das einer oder mehreren Zellen zugeordnet ist, wobei das leitfähige Target vor dem zweiten offenen Ende des Kapillarröhrchens positioniert ist, und wobei ferner das leitfähige Target eine Oberfläche hat, die größer ist als eine Schnittfläche des ersten oder zweiten Kapillarröhrchens senkrecht zu einer Längsachse ist, die sich durch das Kapillarröhrchen erstreckt.
30. Verfahren zum Einführen von Biomaterial in Zellen, wobei das Verfahren die Schritte aufweist: Bereitstellen einer oder mehrerer Targetzellen; Bereitstellen eines ersten Stroms einer Suspension, die zumindest Biomaterial aufweist; Bereitstellen eines zweiten Stroms einer Lösung; und Erzeugen eines Sprays von im wesentlichen dispergierten Partikeln, die zumindest Biomaterial aufweisen, aus dem ersten Strom und dem zweiten Strom, wobei an die im wesentlichen dispergierten Partikel eine elektrische Ladung angelegt wird, so daß ein oder der mehrere im wesentlichen dispergierte Partikel des Sprays in eine oder mehrere der Targetzellen eingeführt werden.
31. Verfahren gemäß Ausführungsform 30, wobei der Schritt des Erzeugens des Sprays von im wesentlichen dispergierten Partikeln den Schritt aufweist: Abgeben eines Sprays von Partikel suspendierenden Mikrotröpfchen, und wobei ferner die elektrische Ladung auf die suspendierten Partikel konzentriert wird, während das Mikrotröpfchen verdampft.
32. Verfahren gemäß Ausführungsform 31, wobei die suspendierten Partikel Trägerpartikel und Biomaterial aufweisen.
33. Verfahren gemäß Ausführungsform 31, wobei die suspendierten Partikel Partikel aus Biomaterial sind.
34. Verfahren gemäß Ausführungsform 30, wobei die Lösung ein Mittel zur Förderung des Eindringens in die Targetzellen aufweist.
35. Verfahren gemäß Ausführungsform 30, wobei die Lösung ein Mittel zur Förderung des Eindringens in die Targetzellen aufweist.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1A ist ein allgemeines Blockschaltbild, das eine erfindungsgemäße Elektrospray-Anordnung zur Erzeugung eines geladenen Sprays unter Verwendung einer Biomaterialquelle darstellt.
1B ist eine allgemeine bildliche Darstellung einer erfindungsgemäßen Elektrospray-Anordnung zur Erzeugung eines geladenen Sprays unter Verwendung einer Biomaterialquelle, einschließlich einer Suspension.
1C ist eine erfindungsgemäße Ausführungsform einer Elektrospray-Anordnung gemäß 1B zur Erzeugung eines geladenen Sprays unter Verwendung einer Kapillarröhrchen-Elektrode und einer Biomaterialquelle, einschließlich einer Suspension.
2 ist eine bildliche Darstellung einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform einer Elektrospray-Anordnung gemäß 1B.
3 ist eine bildliche Darstellung einer in 2 gezeigten Anordnung mit einem zusätzlichen elektrostatischen Beschleunigungsfeld.
4 ist eine bildliche Darstellung einer Anordnung gemäß 2 mit einem Plazierungssteuerteil.
5 ist eine bildliche Darstellung einer alternativen erfindungsgemäßen Elektrospray-Anordnung, die eine Vakuumkammer verwendet.
6 ist eine weitere alternative erfindungsgemäße Elektrospray-Anordnung, die eine kontinuierliche Elektrospray-Anordnung darstellt.
7 ist eine ausführlichere Darstellung eines Abschnitts der erfindungsgemäßen Elektrospray-Anordnung mit einem Verteilerkopf mit einfachem Kapillarröhrchen.
8 ist eine ausführlichere Darstellung einer alternativen Kapillarkonfiguration zur Verwendung in der in 7 gezeigten Anordnung mit einem Verteilerkopf mit doppelten Kapillarröhrchen.
9 zeigt eine bildliche Darstellung eines Abschnitts einer erfindungsgemäßen kompakten stiftartigen Elektrospray-Anordnung.
Ausführliche Beschreibung der Ausführungsformen
Die Erfindung wird zunächst allgemein mit Bezug auf 1A bis 1C beschrieben. Verschiedene weitere Ausführungsformen der Erfindung werden dann ferner mit Bezug auf 2 bis 9 beschrieben. Der Fachmann wird unschwer erkennen, daß Elemente von einer Ausführungsform in Kombination mit Elementen der anderen Ausführungsformen verwendet werden können und daß die Erfindung nicht auf die hierin beschriebenen spezifischen Ausführungsformen, sondern nur durch die beigefügten Ansprüche beschränkt ist.
Die Erfindung betrifft Anordnungen und Verfahren zur Einführung von Biomaterialien, z. B. DNA, in Targetzellen, z. B. Zellen von Pflanzen oder Lebewesen. Wie in 1A gezeigt, verwendet die Erfindung eine Elektrospray-Anordnung 1, um ein Spray 4 geladener Partikel zu erzeugen. Die Elektrospray-Anordnung 1 weist eine Abgabevorrichtung 3 auf, die zumindest Biomaterial aus einer Biomaterialquelle 2 aufnimmt und das geladene Spray 4 vor dieser erzeugt. Der Raumladungseffekt der geladenen Partikel des Sprays 4 ermöglicht es, daß die Partikel eine solche Geschwindigkeit erreichen, daß die Partikel zwangsläufig die Targetzellen 5 berühren und vorzugsweise eindringen, wenn sie aufprallen.
Der Begriff geladenes Spray 4, wie er hier verwendet wird, bezeichnet ein Spray von Partikeln, an das eine Ladung angelegt ist und das aus einer Biomaterialquelle 2 kommend erzeugt wird. Die Biomaterialquelle kann eine Quelle für trockenes Biomaterial allein oder für Biomaterial, das Trägerpartikeln zugeordnet ist, d. h. für pulverförmiges Biomaterial, sein. Vorzugsweise ist die Biomaterialquelle 2 eine Suspension aus Biomaterial, nämlich eine Lösung, die zumindest Biomaterial aufweist. Beispielsweise kann die Biomaterialsuspension eine Suspension aus Biomaterial allein oder eine Suspension aus Biomaterial und Trägerpartikeln sein. Jede Quelle für Biomaterial, das mit einer angelegten unipolaren Ladung (d. h. Ladung mit der gleichen Polarität) versprüht werden kann, kann jedoch erfindungsgemäß verwendet werden.
Die Abgabevorrichtung 3 kann eine beliebige Vorrichtung zur Erzeugung eines Sprays von Ladungspartikeln 4 mit einer angelegten unipolaren Ladung sein, so daß der Raumladungseffekt der geladenen Partikel des Sprays 4 die Partikel eine Geschwindigkeit erreichen läßt, die es ermöglicht, daß die Partikel zwangsläufig die Targetzelle 5 berühren und vorzugsweise eindringen. Die Konfiguration der Abgabevorrichtung 3 hängt zumindest vom Typ der verwendeten Biomaterialquelle 2 ab. Wenn beispielsweise die Biomaterialquelle 2 eine Quelle für trockenes Biomaterial allein oder Trägerpartikeln zugeordnetes Biomaterial ist, z. B. pulverförmiges Biomaterial, kann die Abgabevorrichtung 3 die Form einer Sprühvorrichtung haben, die durch Koronaentladung eine unipolare Ladung an die Partikel des Sprays anlegt. Eine solche Sprühvorrichtung kann eine Struktur mit einer durchgehenden Öffnung aufweisen. Ein Strom des pulverförmigen Materials kann durch die Öffnung befördert werden, beispielsweise durch eine Druckgasquelle. Beim Austritt aus der Öffnung können die Partikel des Sprays einer schwachen Korona ausgesetzt werden, die durch um die Öffnung herum positionierte Bürsten erzeugt wird. Der Fachmann wird anerkennen, daß dies lediglich ein anschauliches Beispiel einer Vorrichtung zum Versprühen von pulverförmigem Biomaterial mit einer angelegten Ladung ist und daß die Erfindung eindeutig nicht auf diese bestimmte Ausführungsform, sondern lediglich durch die beigefügten Ansprüche beschränkt ist.
Wie der Fachmann anerkennen wird, bezeichnet der Begriff 'angelegte Ladung', wie er hier verwendet wird, das Anlegen einer unipolaren Ladung (z. B. der Ladung gleicher Polarität) an die Partikel des Sprays 4. Beispielsweise kann die Ladung durch Koronaentladung angelegt werden, wie oben mit Bezug auf das pulverförmige Biomaterial beschrieben. Ferner kann die Ladung beispielsweise durch Ladungskonzentration auf das Spray von Partikeln durch Verdampfung einer Lösung, die die Partikel suspendiert, in einem elektrischen Feld ausgeübt werden, wie ferner unten mit Bezug auf die allgemeine Darstellung in 1B beschrieben. Das heißt, die Biomaterialquelle 2 ist beispielsweise eine Biomaterialsuspension, und ein Mikrotröpfchenspray wird von der Abgabevorrichtung 3 hervorgebracht, das heißt, in Mikrotröpfchen suspendierte Partikel werden abgegeben. Die in Mikrotröpfchen suspendierten Partikel können Trägerpartikel und Biomaterial oder Biomaterial selbst ohne Verwendung von Trägerpartikeln sein. Das heißt, wenn das Spray abgegeben wird, ist es vorzugsweise ein Spray flüssiger suspendierter Partikel im Gegensatz zu einem Pulverspray. Der flüssige Anteil des Sprays suspendierter Partikel verdampft im allgemeinen, um die Ladung des flüssigen Anteils auf den Partikeln zu konzentrieren, was zu einem Spray geladener Partikel führt, wie ferner nachstehend mit Bezug auf 1B beschrieben wird.
Das durch ein Elektrosprayverfahren bereitgestellte Spray von Partikeln ermöglicht einen steuerbaren Biomaterialtransferprozeß, der nicht auf eine Chargenverarbeitung beschränkt ist. Vielmehr kann die Elektrospraytechnik kontinuierlich genutzt werden.
Der Elektrospraymechanismus 1 stellt ein geladenes Spray mit einer hohen Konzentration von geladenen Partikeln bereit. Vorzugsweise ist die Konzentration der geladenen Partikel im Spray im Bereich von etwa 10⁵ Partikel/Kubikzentimeter (Partikel/cm³) bis etwa 10¹² Partikel/cm³; besonders bevorzugt im Bereich von etwa 10⁷ Partikel/cm³ bis etwa 10¹⁰ Partikel/cm³; und noch mehr bevorzugt etwa 10⁹ Partikel/cm³. Unter etwa 10⁵ Partikel/cm³ ist die Konzentration geladener Partikel so niedrig für den Raumladungseffekt, daß die Geschwindigkeit zur Einführung in die meisten Targetzellen nicht erreicht wird. Aufgrund des Raumladungseffekts, d. h. des Effekts, der durch die Ladungsabstoßung von geladenen Partikeln entsteht, wird ein Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln mit der Ladung gleicher Polarität mit den Partikeln versehen, die im wesentlichen gleichmäßig über die Sprayfläche (z. B. die Fläche, die durch D in 1A dargestellt ist) verteilt sind, wo sich die Targetzellen befinden. Der Begriff 'im wesentlichen dispergierte Partikel', wie er hier verwendet wird, bezeichnet gleichmäßig und/oder ungleichmäßig große Partikel, die durch eine angelegte abstoßende elektrostatische Kraft getrennt sind. Der Elektrosprayprozeß ist ein beständiger und reproduzierbarer Transferprozeß. Da die geladenen Partikel des Sprays einander abstoßen, wird ferner eine Agglomeration der Partikel vermieden. Daher ermög licht die Elektrospraytechnologie eine reduzierte Beschädigung durch Vertiefungen und Stoßbeschädigung, die übliche Ergebnisse sind, wenn bei Verwendung herkömmlicher Transferverfahren Partikelagglomeration auftritt. Außerdem ermöglicht die Elektrospraytechnik, wie sie nachstehend beschrieben wird, daß der Gentransferprozeß auf verschiedene Weise gesteuert werden kann.
Aufgrund der geringen Größe der geladenen Partikel des Sprays, das im Bereich eines Targets erzeugt wird, das eine oder mehrere Zellen aufweist, stellt der Raumladungseffekt, d. h. der Effekt, der durch die Ladungsabstoßung von geladenen Partikeln entsteht, Partikel mit einer ausreichenden Geschwindigkeit bereit, um eine oder mehrere Targetzellen zwangsläufig zu berühren und vorzugsweise einzudringen. Ein solcher Raumladungseffekt erzeugt jedoch auch ein Spray geladener Partikel, das im allgemeinen nicht enthalten ist, d. h. der Partikel, die zufällig in verschiedenen Richtungen verteilt sind. Deshalb wird bevorzugt, das Spray geladener Partikel auf die eine oder mehreren Targetzellen zu beschränken oder zu lenken. Wie nachstehend dargestellt, besteht eine Technik der Durchführung einer solchen Beschränkung und/oder Lenkung für solche geladenen Partikel darin, eine Elektrode zu verwenden, die bereits erforderlich ist, um das geladene Spray zu erzeugen, wenn die Biomaterialquelle eine Suspension von zumindest Biomaterial ist. Das heißt, die Elektrode wird verwendet, um ein ungleichmäßiges elektrisches Feld zur Erzeugung eines geladenen Sprays bereitzustellen und führt die Lenkung der Partikel des geladenen Sprays durch, wie nachstehend ausführlich beschrieben wird.
1B zeigt allgemein eine bildliche Darstellung einer Elektrospray-Anordnung 6 zur Erzeugung eines geladenen Sprays 28 unter Verwendung einer Abgabevorrichtung 8, die einen Strom einer Suspension von einer Biomaterialquelle 7 aufnimmt. Die Biomaterialquelle 7 enthält eine Suspension von zumindest Biomaterial, z. B. Biomaterial allein oder Biomaterial und Trägerpartikel. Im allgemeinen weist die Abgabevorrichtung 8 eine gleitfähige Struktur 17 auf, die eine Öffnung 9 bildet (z. B. ein Kapillarröhrchen, eine Öffnung, die in einer Flut kammer ausgebildet ist usw.) zum Aufnehmen eines Stroms einer Partikel suspendierenden Lösung, z. B. Biomaterial allein oder Trägerpartikel zusammen mit Biomaterial. Beispielsweise kann die Lösung durch die Öffnung 9 an der Abgabespitze 27 der leitfähigen Struktur 17, die die Öffnung 9 bildet, gedrückt oder gesaugt werden, z. B. durch eine Pumpe gedrückt. Die leitfähige Struktur 17, die die Öffnung 9 bildet, fungiert als eine erste Elektrode der Abgabevorrichtung 8, wobei die Abgabespitze 27 der leitfähigen Struktur zur Abgabe von Mikrotröpfchen in Richtung der Targetzellen 5 positioniert ist. Ferner weist die Abgabevorrichtung 8 eine zweite Elektrodenstruktur 11 auf. Eine elektrische Potentialdifferenz wird zwischen die erste Elektrode 17 und die zweite Elektrode 11 angelegt, um ein ungleichmäßiges elektrisches Feld zwischen der ersten Elektrode 17 und der zweiten Elektrode 11 zu erzeugen. Der Fachmann wird anerkennen, daß die Elektroden unter Verwendung eines oder mehrerer leitfähiger Elemente ausgebildet sein können.
Im allgemeinen wird im Betrieb ein Strom der Suspension durch die Öffnung 9 bereitgestellt, der z. B. durch die Öffnung 9 gedrückt und/oder gesaugt wird. Ein Meniskus entsteht an der Abgabespitze 27, wo die Öffnung 9 einen Durchmesser in einem bevorzugten Bereich von etwa 6 Mikrometer bis etwa 2 Millimeter (mm) hat. Eine Potentialdifferenz wird angelegt, um ein ungleichmäßiges Feld 15 zwischen der ersten Elektrode 17 und der zweiten Elektrode 11 zu erzeugen. Beispielsweise kann eine hohe positive Spannung an die erste Elektrode 17 angelegt werden, während die zweite Elektrode 11 geerdet ist. Ferner kann beispielsweise eine Spannungsdifferenz im bevorzugten Bereich von etwa 2000 V bis etwa 6000 V angelegt werden.
Ein ungleichmäßiges elektrisches Feld, wie es hier verwendet wird, bezeichnet ein elektrisches Feld, das durch eine elektrische Potentialdifferenz zwischen zwei Elektroden entsteht. Das ungleichmäßige elektrische Feld weist mindestens einige elektrische Feldlinien auf, die an einer Elektrode in bezug auf die andere Elektrode stärker lokal konzentriert sind, z. B. an der Abgabespitze in bezug auf die zweite Elektrode stärker konzentriert. Das heißt, beispielsweise sind zu mindest einige der Feldlinien abseits der Achse relativ zu der durch die Mitte der Öffnung 9 verlaufenden Längsachse 29. Ferner ist beispielsweise die Elektrode 11 vor der Abgabespitze 27 in Richtung der Targetzellen 5 positioniert, und die Elektrode 11 hat eine Größe und/oder weist mindestens einen Abschnitt auf, der in einer Position abseits von der Längsachse 29 befindet. Ferner kann beispielsweise die Elektrode 11 eine Ringelektrode mit einem Durchmesser sein, der größer als der Durchmesser der Öffnung 9 ist, und vor der Abgabespitze 27 positioniert sein, wobei eine Achse durch die Mitte der Ringelektrode verläuft, die mit der Längsachse 29 der Öffnung 9 übereinstimmt. Ferner kann beispielsweise die Elektrode 11 eine leitfähige Targetfläche mit einer Fläche, die größer als der Querschnitt der Öffnung 9 senkrecht zur Längsachse 29 ist, und vor der Abgabespitze 27 positioniert sein.
Wenn die Biomaterialquelle 7 eine Suspension aus Biomaterial (ohne Verwendung von Trägerpartikeln) ist, wird die Suspension durch die Öffnung 9 befördert (beispielsweise gedrückt und/oder gesaugt). Im allgemeinen hat der flüssige Anteil der Suspension, der an der Öffnung 9 geliefert wird, eine elektrische Leitfähigkeit. Das Biomaterial hat eine ihm zugeordnete kleine Ladung, z. B. kann DNA eine kleine negative Ladung haben, aber die Ladung des Biomaterials ist infolge der größeren Ladung, die auf das Biomaterial konzentriert ist, belanglos, wie nachstehend beschrieben wird.
Während die Suspension durch die Öffnung strömt, entzieht die Potentialdifferenz zwischen der ersten und zweiten Elektrode, die das elektrische Feld zwischen beiden erzeugt, der Flüssigkeit eine Ladungspolarität, d. h. die negative Ladung wird entzogen, wenn eine hohe positive Spannung an die Elektrode 17 angelegt wird, wobei ein positiv geladenes Mikrotröpfchen zurückbleibt, das von der Abgabespitze 27 abzugeben ist. Beispielsweise kann der Meniskus an der Abgabespitze einen Kegelstrahl zum Abgeben eines Sprays von Biomaterial suspendierendem Mikrotröpfchen bilden, wenn die Kräfte des ungleichmäßigen Feldes 15 die Oberflächenspannung des Meniskus ausgleichen. Das Mikrotröpfchenspray wird ferner in dem ungleichmäßigen elektrischen Feld 15 positiver.
Während die Mikrotröpfchen verdampfen, konzentriert sich die Ladung der Mikrotröpfchen auf das Biomaterial, was zu einem Spray geladener Biomaterialpartikel führt. Die Ladungsmenge der Tröpfchen und somit die Ladungsmenge eines Partikels nach der Verdampfung beruht zumindest auf der Leitfähigkeit der Flüssigkeit, die verwendet wird, um die Mikrotröpfchen zu versprühen, der Oberflächenspannung der Flüssigkeit, der Dielektrizitätskonstante der Flüssigkeit und der Zuführungsdurchflußrate der Flüssigkeit. Im allgemeinen ermöglicht der Raumladungseffekt, der auf die konzentrierte elektrische Ladung der im wesentlichen dispergierten Partikel des Sprays zurückzuführen ist, daß die Partikel zwangsläufig die Targetzellen berühren und vorzugsweise eindringen. Die elektrische Ladung, die auf ein bestimmtes Partikel konzentriert ist, ist vorzugsweise im Bereich von etwa 80% bis etwa 95% einer maximalen Ladung, die von dem Mikrotröpfchen gehalten werden kann, das das bestimmte Partikel, z. B. das Biomaterialpartikel, suspendiert, ohne daß das Mikrotröpfchen zerstört oder zerrissen wird, d. h. im Bereich von etwa 80% bis etwa 95% der Rayleigh-Ladungsgrenze. Bei 100% wird die Oberflächenspannung des Mikrotröpfchens durch die elektrischen Kräfte, die die Zerstörung der Tröpfchen bewirken, beseitigt. Das ungleichmäßige elektrische Feld ermöglicht auch den Einschluß der Partikel und/oder der Richtung der Partikel, die sich andernfalls infolge des Raumladungseffekts in Zufallsrichtungen fortbewegen würden.
Wenn die Biomaterialquelle 7 eine Suspension aus Biomaterial und Trägerpartikeln ist, wird die Suspension durch die Öffnung 9 befördert (z. B. gedrückt oder gesaugt). Im allgemeinen hat der flüssige Anteil der Suspension, der zur Öffnung 9 befördert wird, eine elektrische Leitfähigkeit. Wie nachstehend beschrieben wird, kann mehr als ein Lösungsstrom verwendet werden, um das Spray zu erzeugen. Beispielsweise kann ein Materialstrom eine Suspension aus Material sein, die deionisiertes Wasser verwendet, während ein zweiter Materialstrom eine Elektrolytlösung mit einer geeigneten Leitfähigkeit aufweist. Das Biomaterial hat im allgemeinen eine kleine, aber belanglose zugeordnete Ladung. Die Trägerpartikel sind im allgemeinen neutral.
Während die Suspension durch die Öffnung strömt, entzieht die Potentialdifferenz zwischen der ersten und zweiten Elektrode, die das ungleichmäßige Feld zwischen beiden erzeugt, der Flüssigkeit eine Ladungspolarität, d. h. die negative Ladung wird entzogen, wenn eine hohe positive Spannung an die Elektrode 17 angelegt wird, wobei ein positiv geladenes Mikrotröpfchen zurückbleibt, das von der Abgabespitze 27 abzugeben ist. Ein Spray von Mikrotröpfchen, die Biomaterial und Trägerpartikel suspendieren, wird vor der Abgabespitze 27 erzeugt, wobei die Mikrotröpfchen positiv geladen sind.
Während die Mikrotröpfchen verdampfen, konzentriert sich die Ladung der Mikrotröpfchen auf das Biomaterial und die Trägerpartikeln, was zu einem Spray positiv geladener Trägerpartikel führt, die dem Biomaterial zugeordnet sind. Das Biomaterial, das die geringfügig negative Ladung haben kann, wird zu den positiv geladenen Trägerpartikeln hingezogen, was zu einer besseren Adhäsion zwischen dem Biomaterial und den Trägerpartikeln führt. Dies ist anders als bei herkömmlich hergestellten Trägerpartikeln mit zugeordnetem Biomaterial, da bei herkömmlichen Verfahren die neutralen Trägerpartikel bei dem geringfügig negativ geladenen Biomaterial keine solchen Anziehungskräfte erzeugen. Das heißt, die Erfindung ermöglicht einen besseren Beschichtungsprozeß zum Beschichten von Trägerpartikeln mit Biomaterial. Dies führt zu einer gleichmäßigeren Verteilung des Biomaterials, das an die Targetzellen zu verabreichen ist. Im allgemeinen ermöglicht der Raumladungseffekt, der auf die konzentrierte elektrische Ladung der im wesentlichen dispergierten Partikel des Sprays zurückzuführen ist, wie oben beschrieben, daß die Partikel zwangsläufig die Targetzellen berühren und vorzugsweise eindringen.
Der Fachmann wird anerkennen, daß die angelegten Spannungen umgekehrt sein können. Beispielsweise kann die erste Elektrode geerdet sein, während an die zweite Elektrode eine hohe positive Spannung angelegt wird. In einem solchen Fall wäre auf die Partikel des Sprays eine negative Ladung konzentriert. Ferner kann eine beliebige andere angelegte Spannungs konfiguration, die ein ungleichmäßiges elektrisches Feld bereitstellt, um das geladene Spray von Partikeln zu erzeugen, verwendet werden.
Ferner wird der Fachmann anerkennen, daß das Spray von Partikeln kein Biomaterial haben muß, das den Partikelträgern zugeordnet ist. Wenn beispielsweise eine positive Spannung an die zweite Elektrode 11 angelegt wird und die erste Elektrode 17 geerdet ist, dann haben die Trägerpartikel, die normalerweise in der Suspension neutral sind, eine negative Ladung, während sie versprüht werden. Wenn Biomaterial geringfügig negativ ist, können Abstoßungskräfte die Trägerpartikel von dem Biomaterial getrennt halten und somit von einer Zuordnung zu ihm fernhalten. Auf diese Weise wären die Trägerpartikel und die Biomaterialpartikel in dem Spray geladener Partikel voneinander getrennt. Die Trägerpartikel können in die Targetzellen eindringen und dabei zunächst einen Kanal in den Targetzellen bilden, so daß die Biomaterialpartikel zur Einführung in die Targetzellen ohne weiteres durch diesen hindurchgelangen können.
Eine verallgemeinerte Ausführungsform der Elektrospray-Anordnung 6, die insgesamt in 1B gezeigt ist, wird nachstehend mit Bezug auf die Elektrospray-Vorrichtung 10 beschrieben, die in 1C gezeigt ist. Im allgemeinen weist die erfindungsgemäße Elektrospray-Anordnung 10 eine Elektrospray-Abgabevorrichtung 12 auf, die zur Bereitstellung eines geladenen Sprays 28 positioniert ist. Hinter oder vor der Abgabevorrichtung 12 ist ein Target 13 mit einer oder mehreren Targetzellen 40 positioniert.
Erfindungsgemäß wird durch eine hohe positive Spannungsquelle 20, die an eine Kapillarröhrchen-Elektrode 18 eines Verteilerkopfs 19 der Elektrospray-Abgabevorrichtung 12 und die mit Erde 38 verbundene Elektrode 21 angelegt wird, eine Ladung an das Spray 28 angelegt. Das Spray 28 entsteht, wie oben beschrieben, unter Verwendung des ungleichmäßigen elektrischen Feldes, das zwischen der Abgabespitze 23 der Kapillarröhrchen-Elektrode 18 und der Elektrode 21 erzeugt wird. Das Spray 28 kann durch jede Elektrospray-Abgabevorrichtung bereitgestellt werden, die zur Bereitstellung eines Sprays 28 mit einer angelegten Ladung geeignet ist. Vorzugsweise ist die Ladung der Partikel so hoch, daß die Partikel des Sprays 28 infolge des Raumladungseffekts eine Geschwindigkeit bekommen, die so hoch ist, daß die dispergierten Partikel des Sprays 28 in Targetzellen 40 eindringen können.
Die Partikelgeschwindigkeit ist hauptsächlich eine Funktion der Partikelladung und des Raumladungseffekts. Das zwischen der Hochspannungskapillarröhrchen-Elektrode 18 und der elektrisch geerdeten Elektrode 21 gebildete ungleichmäßige elektrische Feld ermöglicht die Abgabe des Sprays 28 von der Abgabespitze 23 des Verteilerkopfs 19. Wie nachstehend beschrieben wird, können in Abhängigkeit von der Potentialdifferenz, die zwischen dem Verteilerkopf 19 mit der ersten Elektrode, z. B. der Kapillarröhrchen-Elektrode 18, und der zweiten Elektrode 21 verschiedene Spraybetriebsmodi festgelegt werden.
Das ungleichmäßige elektrische Feld kann durch verschiedene Konfigurationen bereitgestellt werden. Beispielsweise kann die zweite Elektrode 21 ein leitfähiges Material sein, das so geerdet und positioniert ist, daß die Ausbildung eines Sprays 28 an der Abgabespitze 23 des Verteilerkopfs 19 erfolgt oder die Hervorbringung eines geladenen Sprays aus dem Verteilerkopf 19 anderweitig bewirkt wird, z. B. kann die zweite Elektrode eine geerdete Ringelektrode, eine geerdete Targetoberfläche, die die Zellen hält, usw. sein. Die zweite Elektrode 21 kann sich in verschiedenen Positionen befinden, wie in 1C gezeigt. Beispielsweise kann sich die Elektrode 21 in einer Position direkt vor dem Verteilerkopf 19 befinden, oder die Elektrode 21 kann sich weiter weg vom Verteilerkopf 19 und näher an den Targetzellen 40 befinden.
Man wird anerkennen, daß die zweite Elektrode 21 eine von vielen verschiedenen Konfigurationen haben kann. Beispielsweise kann die Elektrode eine leitfähige Plattform sein, auf der die Zellen positioniert werden. Ferner kann beispielsweise die Elektrode 21 eine Ringelektrode mit einer Achse sein, die mit einer Achse des Verteilerkopfs 19 übereinstimmt usw. Damit das elektrische Feld ungleichmäßig ist, muß mindestens ein Abschnitt der Elektrode 21 außerhalb eines hypothe tischen Zylinders 25 positioniert sein, der sich vom Umfang der Kapillarröhrchen-Elektrode zum Target 13 erstreckt. Das heißt, die elektrischen Feldlinien müssen sich zu und/oder von einem Bereich außerhalb des hypothetischen Zylinders 25 erstrecken.
Die Stärke des Feldes kann durch Regulierung des Abstands zwischen der ersten Elektrode 18 und der zweiten Elektrode 21 reguliert werden. Je weiter die Elektrode 21 vom Verteilerkopf 19 entfernt ist, um so geringer ist die Feldstärke. Bei einem solchen zunehmenden Abstand wird jedoch mehr Richtwirkung für das Spray 28 erreicht. Wenn beispielsweise die zweite Elektrode 21 nahe dem Verteilerkopf 19 ist, bewirkt der Raumladungseffekt, daß sich die Partikel auf eine relativ große Fläche D verteilen. Andererseits können die Partikel zu verschiedenen Targets gelenkt werden, indem die Elektrode 21 in verschiedene Positionen verschoben wird. Beispielsweise kann die Elektrode 21, z. B. eine Ringelektrode, nahe an die Targetzellen 40 herangeschoben werden, um ein gleichmäßiges Spray 28 in dem Bereich in ihrem unmittelbarer Nähe bereitzustellen.
Die Quelle 22, die Biomaterial an die Zuführeinrichtung 24 liefert, kann eine von vielen Typen von Biomaterialquellen sein. Die Quelle 22 kann eine flüssige Suspension sein, die Biomaterial aufweist. Ferner kann die flüssige Suspension eine flüssige Suspension von Biogrundmaterial (d. h. ohne Trägerpartikel) aufweisen, kann eine flüssige Suspension aus Trägerpartikeln und Biomaterial sein oder kann eine flüssige Suspension aus Trägerpartikeln mit ihm zugeordneten Biomaterial sein, z. B. Trägerpartikel, die mit DNA beschichtet oder imprägniert sind.
Die Erfindung wird nachstehend hauptsächlich mit Bezug auf die Verwendung einer Quelle 22 beschrieben, die eine Suspension von Trägerpartikeln und Biomaterial, z. B. DNA-Goldpartikel-Suspension, ist. Obwohl sich die Beschreibung auf die Verwendung einer Trägerpartikelsuspension konzentriert, sind jedoch die Vorteile der Erfindung eindeutig anwendbar, auch wenn andere Quellen zur Bereitstellung von geladenen Sprays, wie hierin beschrieben, verwendet werden. Man wird an erkennen, daß Trägerpartikel der Suspension aus Trägerpartikeln und Biomaterial vor der Herstellung und Verwendung der Suspension nicht mit Biomaterial beschichtet werden müssen. Das heißt, eine solche Suspension wird im allgemeinen durch Vermischen der Trägerpartikel und des Biomaterials zu einer Suspensionsflüssigkeit, z. B. einer Pufferlösung, einer Elektrolytlösung, deionisiertem Wasser usw., erzeugt. Dadurch fallen im allgemeinen die im wesentlichen zeitaufwendigen herkömmlichen Herstellungsprozesse weg, die bei der Beschichtung oder Imprägnierung von Trägerpartikeln zur Verwendung bei Genkanonenvorrichtungen zur herkömmlichen Chargenverarbeitung erforderlich sind.
Die Suspension kann beliebige Flüssigkeiten aufweisen, die für eine Biomaterialverabreichung geeignet sind. Ferner kann eine Kalciumchloridkomponente in der Flüssigkeit verwendet werden. Beliebige Lösungen, die zur Züchtung von Zellen geeignet sind, z. B. Nährlösungen, können auch verwendet werden. Ferner kann beispielsweise die Flüssigkeit, die in der Suspension verwendet wird, deionisiertes Wasser sein, wenn eine zusätzliche leitfähige Flüssigkeit dabei verwendet wird oder wenn ein anderer Elektrolytlösungsstrom mit dem Suspensionsstrom verwendet wird, um das Spray von Partikeln zu erzeugen.
Wie dem Fachmann bekannt ist, können verschiedene inerte Partikel als Trägerpartikel verwendet werden. Beispielsweise können solche inerten Trägerpartikel Ferritkristalle, Gold, Wolframkugeln und andere Metallkugeln sowie Kugeln und Partikel, z. B. Glas-, Polystyrol- und Latexperlen, aufweisen. Vorzugsweise werden die Trägerpartikel nur in der Suspension mit dem Biomaterial vermischt. Solche Trägerpartikel können mit Biomaterial beschichtet oder imprägniert oder ihnen anderweitig zugeordnet werden. Beispielsweise kann Biomaterial auf die Oberfläche von Trägerpartikeln aufgebracht, aufgeklebt oder abgeschieden oder mit dem Biomaterial imprägniert werden. Wie oben beschrieben, werden die Trägerpartikel im allgemeinen dem Biomaterial zugeordnet, wenn die Suspension ein Spray ist. Die Trägerpartikel wirken als Träger zum Transportieren der Biomaterialien in die Targetzellen. Wenn ein oder mehrere Träger partikel mit ihnen zugeordnetem Biomaterial die Zellmembran der Targetzellen durchdringen, wird das Biomaterial in der Zelle dispergiert.
Biomaterialien, die mit den inerten Trägerpartikeln verwendet werden können, sind u. a., ohne darauf beschränkt zu sein: biologische Färbungsmittel, z. B. Fluoreszens- oder Markierungssonden, Viren, Organellen, Vesikel, Peptiden, Ammosäuren, Lipiden, Proteinen, z. B. Enzyme oder Hormone, Nukleinsäuren, Polynukleinsäuren mit DNA und RNA, einzelne Nukleinsäuren, kleine Moleküle, z. B. bioaktive Substanzen, Medikamente oder dgl. Das Biomaterial kann eine trockene Form haben oder eine Naßlösung sein. Die Erfindung ist jedoch eindeutig nicht auf die hierin aufgeführten Materialien beschränkt.
Obwohl bevorzugt ist, daß eine Suspension aus Trägerpartikeln und Biomaterial oder eine Suspension aus Biomaterial erfindungsgemäß verwendet wird, sind auch andere Formen von Biomaterialpartikeln, nämlich sowohl in trockener als auch in suspendierter Form, erfindungsgemäß denkbar. Beispielsweise können solche Biomaterialpartikel Biomaterial aufweisen, das gefriergetrocknet oder anderweitig als freie Partikel hergestellt ist oder anderweitig als Partikel zum Zusammenprall mit Targetzellen verwendet wird, um in solche Zellen einzudringen. Wenn die Biomaterialpartikel die Targetzellen durchdrungen haben, würde man erwarten, daß solche Biomaterialpartikel oder Teile davon unbeschädigt zu ihrem natürlichen Zustand zurückkehren oder anderweitig zu einer gewünschten biologischen Aktivität in der Targetzelle beitragen. Beispielsweise können die Biomaterialpartikel zu ihrem natürlichen Zustand durch Hydration, Auftauen oder Auflösen usw. zurückkehren.
Die Partikelsuspension von der Quelle 22 wird zu einer Zuführeinrichtung 24 befördert, die den kontinuierlichen Strom des Quellmaterials zur Elektrospray-Abgabevorrichtung 12 steuert, wenn sie betriebsfähig ist. Die Zuführeinrichtung 24 kann eine Flüssigkeitspumpe (z. B. eine Spritzenpumpe, eine Schwerkraftpumpe, ein druckreguliertes Flüssigkeitsreservoir usw.), eine Massenstromsteuereinrichtung oder eine andere Stromsteuervorrichtung sein, die zur Beförderung des Quellmaterials zur Abgabevorrichtung geeignet ist, wie dem Fachmann bekannt ist.
Der Strom einer Partikelsuspension, d. h. eine Lösung, wird durch die Abgabevorrichtung 12 zu Mikrotröpfchen zerstäubt. Die Zerstäubung kann durch eine beliebige bekannte Technik zur Herstellung von Mikrotröpfchen erfolgen, wobei Mikrotröpfchen vorzugsweise einen Nenndurchmesser von etwa 10 nm oder mehr, besonders bevorzugt etwa 20 nm bis etwa 10 μm und am meisten bevorzugt etwa 30 nm bis etwa 1 μm haben. Vorzugsweise wird eine elektrostatische Zerstäubung angewendet. Andere Zerstäubungsvorrichtungen (z. B. druckregulierte Zerstäuber, Ultraschallzerstäuber, hydraulische Düsen usw.) können eine entsprechende Zerstäubung durchführen. Wie beschrieben in den Artikeln mit den Titeln "Electrospraying of Conducting Liquids for Dispersed Aerosol Generation in the 4 nm to 1,8 μm Diameter Range", von Chen et al., J. Aerosol Sci, Vol. 26, Nr. 6, Seiten 963-977 (1995) und "Experimental Investigation of Scaling Laws for Electrospraying: Dielectric Constant Effect", von Chen et al., Aerosol Science and Technology, 27:367-380 (1997), deren Inhalt hierin durch Bezugnahme vollständig aufgenommen werden, können Mikrotröpfchen mit Nenndurchmessern im Bereich von etwa 10 nm bis etwa 2 μm durch Elektrospray erzeugt werden. Verschiede Faktoren, wie in diesen Dokumenten beschrieben, beeinflussen die erzeugte Tröpfchengröße. Beispielsweise die Kapillargröße, die Flüssigkeitszuführrate zur Abgabevorrichtung, die Eigenschaften des umgebenden Gases usw. Der Fachmann wird anerkennen, daß solche Faktoren und andere modifiziert werden können, um Mikrotröpfchen von gewünschten Größen zu erzeugen.
Durch Anwendung verschiedener elektrischer Potentialdifferenzen zwischen der Kapillarröhrchen-Elektrode 18 und der zweiten Elektrode 21 können verschiedene Betriebsmodi festgelegt werden. Beispielsweise wird eine hohe positive Spannung 20 an die Kapillarröhrchen-Elektrode 18 bei geerdeter Elektrode 21 angelegt, um das Spray 28 mit einer relativ hohen positiven Ladung bereitzustellen. Beispielsweise kann die Hochspannungsquelle 20 eine hohe positive Spannung vorzugsweise im Bereich von etwa 2000 V bis etwa 50000 V und besonders bevorzugt 2000 V bis etwa 10000 V anlegen. Die zweite Elektrode 21 kann in einem solchen Fall mit Erde 38 verbunden sein oder kann mit einer negativen Spannung verbunden sein. Wenn relativ große Potentialdifferenzen angelegt werden, wie in den oben genannten Dokumenten beschrieben, können pulsierende Betriebsmodi oder Kegelstrahl-Betriebsmodi erreicht werden. In einem Kegelstrahl-Betriebsmodus wird ein kegelförmiger Flüssigkeitsmeniskus an der Abgabespitze 23 gebildet, während im pulsierenden Modus die Form des Flüssigkeitsmeniskus zwischen einer Kegelform und einer runden Form wechselt. Dagegen tritt bei relativ niedrigen elektrischen Potentialdifferenzen, die zwischen die Kapillarröhrchen-Elektrode 18 und die zweite Elektrode 21 angelegt werden, kommt es zu einem Abtropfen von der Abgabespitze.
Der Fachmann wird anerkennen, daß eine hohe positive Spannung an die Elektrode 21 angelegt werden kann, während die Röhrenelektrode 18 geerdet ist, um eine hohe negative Ladung der Partikel des Sprays 28 zu ermöglichen. Die einzige Anforderung, die für die Potentialdifferenz notwendig ist, die zwischen der Kapillarröhrchen-Elektrode 18 des Verteilerkopfs 19 und der zweiten Elektrode 21 angelegt wird, besteht darin, daß die elektrische Potentialdifferenz ein ungleichmäßiges elektrisches Feld zur Erzeugung eines geladenen Sprays 28 ermöglicht. Die Ladung der Partikel des Sprays 28 muß so konzentriert werden, daß der Raumladungseffekt der geladenen Partikel einen Zwangskontakt mit den Targetzellen 40 ermöglicht und vorzugsweise ein Eindringen in diese Targetzellen 40 zuläßt.
Man beachte, daß die Partikelgeschwindigkeit in erster Linie durch den Raumladungseffekt bewirkt wird, der auf die konzentrierte Ladung der Partikel des Sprays zurückzuführen ist. Erst in zweiter Linie wird die Geschwindigkeit der Partikel durch die Anziehungskräfte zwischen dem geladenen Spray 28 und der zweiten Elektrode 21 verursacht. Es ist festgestellt worden, daß bei Partikeln mit relativ großer Abmessung, z. B. Partikel mit Nenndurchmessern von weniger als etwa 0,5 μm, weniger als etwa 5% der Geschwindigkeit auf das elektrische Feld zurückzuführen ist, das durch die angelegte Spannung erzeugt wird. Bei Partikeln mit relativ kleineren Größen, z. B. Partikeln mit Nenndurchmessern von weniger als etwa 0,05 μm, ist im übrigen weniger als 1% der Geschwindigkeit auf das elektrische Feld zurückzuführen, das durch die angelegte Spannung erzeugt wird. Nach Abgabe von der Abgabespitze 23, ist die Geschwindigkeit der geladenen Partikel zunächst auf das elektrische Feld zurückzuführen, das durch die angelegte Spannung erzeugt wird. Eine solche Anfangsgeschwindigkeit wird jedoch beinahe unmittelbar durch die riesige Geschwindigkeit überboten, die infolge des Raumladungseffekts der geladenen Partikel erreicht wird. Die zweite Elektrode 21 wird hauptsächlich zur Herstellung des geladenen Sprays vor der Abgabespitze 23 und ferner zur Lenkung der Partikel des Sprays und deren Einschließung verwendet.
Obwohl verschiedene Konfigurationen für die Abgabevorrichtung geeignet sein können, weist die Abgabevorrichtung 12 vorzugsweise ein Kapillarröhrchen auf, das aus einem geeigneten Material, z. B. Platin, Silika usw., zur Bereitstellung des Sprays 28 besteht. Beispielsweise kann das Kapillarröhrchen einen Außendurchmesser in dem bevorzugten Bereich von etwa 6 μm bis etwa 2,5 mm und einen Innendurchmesser in dem bevorzugten Bereich von etwa 6 μm bis etwa 2 mm haben. Ferner kann die Abgabevorrichtung 12 eine leitfähige oder nichtleitfähige Umhüllung haben, die mit dem Kapillarröhrchen konzentrisch ist und die verwendet wird, um eine Gashülle, z. B. CO₂, SF₆ usw., um das Kapillarröhrchen bereitzustellen, um die elektrostatische Durchschlagspannung für das Kapillarröhrchen zu erhöhen, um beispielsweise eine Koronaentladung zu verhindern. Die Verwendung einer solchen Gashülle ist besonders vorteilhaft, wenn das Spray unter Verwendung einer Flüssigkeit mit einer hohen Oberflächenspannung, z. B. deionisiertes Wasser, erzeugt wird. Mehrere ausführliche Konfigurationen für die Abgabevorrichtung 12 sind nachstehend ausführlicher beschrieben.
Die gewünschte Geschwindigkeit, auf die die Partikel des Sprays 28 beschleunigt werden, hängt von verschiedenen Faktoren ab. Solche Faktoren sind, ohne darauf beschränkt zu sein, beispielsweise die Ladung der Partikel, ob eine Vakuumkammer verwendet wird, die Größe und Dichte der Partikel sowie der Typ der Targetzellen 40, auf die der Aufprall erfolgt. Vorzugsweise ist die gewünschte Geschwindigkeit die minimale Geschwindigkeit, die notwendig ist, damit die Partikel die Zellmembran der Targetzellen 40 durchdringen können. Die Geschwindigkeit, die notwendig ist, um in solche Zellen einzudringen, hängt vom Typ der Targetzelle ab, die beispielsweise Bakterien, einzellige Protozoen, Pflanzenpollen, pflanzlicher Protoplast, Embryos, Kallusgewebe, Zellen von Lebewesen, einschließlich Vorläuferzellen (einschließlich pluripotente Zellen, Stammzellen, Eier, Eizellen und Embryozellen, ohne darauf beschränkt zu sein) von Lebewesen, Knochenmarkzellen und Vorläuferzellen, Muskel- oder Epidemiszellen, Epithelzellen, Blutzellen, isolierte Gewebeexplantate, verschiedene andere Pflanzenzellen von Lebewesen oder verschiedene andere Zellen von Lebewesen. Die Targetzellen können Teil eines Gewebes sein, können eine Monoschicht von Zellen, eine Vielfachschicht von Zellen, eine Suspension von Zellen sowie an einer Oberfläche angebracht sein oder können jede andere Form haben, wie dem Fachmann ohne weiteres bekannt ist.
Bei den bevorzugten Konfigurationen, wie sie hierin beschrieben sind, sind Geschwindigkeiten im Bereich von etwa 30 m/s bis etwa 600 m/s für Partikel mit einem nominalen Durchmesser im Bereich von etwa 2 nm bis etwa 1 μm möglich. Die Geschwindigkeiten am höheren Ende des Bereichs sind hauptsächlich auf die kleine Partikelgröße, die hohe Partikelladung und/oder den reduzierten Druck zurückzuführen. Ferner können Partikel unter Verwendung einer solchen Konfiguration erzeugt und an die Targetfläche mit Raten im Bereich von etwa 10⁸ Partikels bis etwa 10¹¹ Partikel/s kontinuierlich abgegeben werden. Die Partikelerzeugungsrate kann unter Verwendung mehrerer Kapillarröhrchen-Elektroden erhöht werden. Die bevorzugte Geschwindigkeit, nominal im Bereich von etwa 150 m/s bis etwa 300 m/s, ist ausreichend, um in die meisten Typen von Targetzellen einzudringen, ohne sie zu zerstören.
Das Spray von Partikeln 28, das durch die Elektrospray-Abgabevorrichtung 12 erzeugt wird, wenn die Quelle 22 eine Suspension mit Trägerpartikeln und Biomaterial ist, entsteht im allgemeinen, wie bereits hierin beschrieben, durch Abgeben von Mikrotröpfchen mit darin suspendierten Trägerpartikeln und Biomaterial. Danach verdampfen die Mikrotröpfchen, wobei die Ladung der Mikrotröpfchen auf die Trägerpartikeln und das ihnen normalerweise zugeordnete Biomaterial konzentriert wird. Ebenso entsteht das Spray von Partikeln 28, das durch die Elektrospray-Abgabevorrichtung 12 erzeugt wird, wenn die Quelle 22 eine Suspension mit Biogrundmaterial ist, im allgemeinen, wie hierin bereits beschrieben, durch Abgabe von Mikrotröpfchen mit darin suspendiertem Biomaterial. Danach wird durch Verdampfung der Mikrotröpfchen die Ladung der Mikrotröpfchen aus das Biomaterial konzentriert. Durch Steuerung verschiedener Parameter der Elektrospray-Anordnung kann die Menge des Biomaterials, das für den Zusammenprall mit den Targetzellen 40 abgegeben wird, gesteuert werden. Ferner kann auch die Geschwindigkeit solcher Partikel erhöht werden.
Verschiedene Charakteristika, die gesteuert werden können, sind u. a. die Mikrotröpfchengröße, die Konzentration des Biomaterials und die Trägerpartikelgröße der im Spray 28 suspendierten Partikel. Zunächst kann die Geschwindigkeit der Partikel durch Steuerung der Partikelgröße, d. h. der Trägerpartikelgröße, erhöht werden. Partikel mit kleineren Abmessungen können infolge des Raumladungseffekts höhere Geschwindigkeiten haben.
Ferner kann durch Steuerung der Größe der versprühten Mikrotröpfchen und der Trägerpartikelgröße die Menge des abgegebenen Biomaterials gesteuert werden, und es können höhere Geschwindigkeiten für die Partikel erreicht werden. Zunächst kann der Nenndurchmesser der Mikrotröpfchen gesteuert werden. Beispielsweise kann der Mikrotröpfchendurchmesser durch Steuerung der Kapillargröße, der Flüssigkeitszuführungsrate für Suspensionen, der elektrischen Leitfähigkeit für die Suspension usw. gesteuert werden. Der Nenndurchmesser liegt normalerweise in den Bereichen, wie bereits hierin beschrieben.
Bei Verwendung von Trägerpartikeln mit kleineren Nenndurchmessern relativ zu den Mikrotröpfchen, z. B. Partikel mit einem Nenndurchmesser im Bereich von etwa 2 nm bis etwa 1000 nm oder vorzugsweise im Bereich von etwa 10 nm bis etwa 100 nm, (oder durch Erhöhung der Größe der Mikrotröpfchen relativ zu den Partikeln), kann die Ladungsmenge, die die Trägerpartikel transportieren kann, erhöht werden. Das heißt, durch Erhöhung der Größendifferenz zwischen den Mikrotröpfchen und den Partikeln können die Trägerpartikel (z. B. Gold) nach Verdampfung eine Ladung transportieren, die viel höher ist als die Rayleigh-Grenze für normale flüssige Suspensionen. Auf diese Weise ermöglicht der Raumladungseffekt die Erreichung einer höheren Geschwindigkeit, so daß die Partikel in verschiedene Tiefen der Zellgewebe eindringen können. Ferner können unter Verwendung einer Vakuumkammer, in die die Partikel eingesprüht werden, erhöhte Geschwindigkeiten erreicht werden.
Ferner können Mikrotröpfchen mit Größen, die geringfügig größer sind als die Trägerpartikel und/oder das darin suspendierte Biomaterial erzeugt werden. Dies führt zu gleichmäßig großen Partikeln, ohne daß sich Agglomerate bilden. Der Effekt der Raumladungsabstoßung der unipolar geladenen Partikel hält sie getrennt und verhindert Partikelagglomeration im Spray und verleiht den Partikeln die Geschwindigkeit, die für einen zwangsläufigen Kontakt mit den Targetzellen, vorzugsweise zum Eindringen in die Targetzellen, notwendig ist.
Ferner ist durch Steuerung der Größe des Mikrotröpfchens und der Größe der Trägerpartikel ein Partikel pro Mikrotröpfchen erreichbar. Bei einem gesteuerten Strom und einer bekannten Konzentration des verwendeten Biomaterials in Verbindung mit den Trägerpartikeln kann die Menge des Biomaterials im Spray 28 oder des an die Sprayfläche abgegeben Biomaterials gesteuert werden und ist reproduzierbar, d. h. kann beständig wiederholt werden.
Nachdem die Mikrotröpfchen der Flüssigkeit, die die Partikel und/oder das Biomaterial suspendiert, abgegeben worden sind, beginnt das Lösemittel der Mikrotröpfchen zu verdampfen, wobei die Größe des Mikrotröpfchens abnimmt. In den Targetzellen 40 bleibt normalerweise nur das Trägerpartikel mit zugeordnetem Biomaterial (oder Biomaterial allein im Falle einer Biomaterialsuspension ohne Trägerpartikel) für den Zusammenprall mit den Targetzellen 40 übrig. Die Spraypartikelgröße kann auf immerhin wenige Nanometer im Durchmesser kleiner gemacht werden und dennoch die notwendige Geschwindigkeit unter den Auswirkungen der Raumladung erreichen. Dadurch wird es möglich, kleineren Zellen und Geweben Biomaterialien zu verabreichen.
Neben dem erfindungsgemäßen Eindringen in die Zellen als Ergebnis der Bombardierung der Zellen mit Material unter Verwendung kann die hierin beschriebene Mikrospraytechnik verwendet werden, um Liposomtröpfchen, die Biomaterial, z. B. DNA, einhüllen, zu erzeugen. Die Liposomtröpfchen können durch das elektrische Feld gelenkt und gleichmäßig über Targetzellen, wie diejenigen, die hierin beschrieben sind, verteilt werden, z. B. durch die Bewegung der Targetfläche, die Bewegung des Verteilerkopfs usw. Anders als beim Eindringen in die Zellen beim Zusammenprall erleichtern die Liposomen, die das Biomaterial einhüllen, den Transfer des Materials in die Zellen durch Fusion des Liposoms mit der Zellmembran, wie dem Fachmann bekannt ist. Die Liposomtröpfchen können verschiedene Größen haben, z. B. einen Nenndurchmesser von etwa 10 nm bis etwa 10 μm. Die Elektrospraytechnik, die verwendet wird, um die Liposomen zu den Zelle zu lenken, kann reguliert werden (z. B. der Abstand von der Düse bis zur Targetfläche, elektrisches Potential oder Stärke des Feldes usw, können reguliert werden), um die Geschwindigkeit der Liposomtröpfchen zu verändern, so daß die Liposomtröpfchen so eintreffen, daß der Fusionsmechanismus durchgeführt werden kann.
Eine erfindungsgemäße Ausführungsform einer Elektrospray-Anordnung 42 ist in 2 gezeigt. Im allgemeinen ist die Elektrospray-Abgabevorrichtung 12, die zum Einbringen eines Sprays 28 in eine Kammer 16 positioniert ist, im wesentlichen äquivalent mit derjenigen, die allgemein mit Bezug auf 1C beschrieben ist, wie durch gleiche Bezugszeichen für gleiche Elemente angegeben ist. In der Ausführungsform in 2 ist die Targetfläche 14 jedoch mit einer oder mehreren darauf angeordneten Targetzellen 40 hinter oder vor der Abgabevorrichtung 12 positioniert.
Im Spray 28 ist eine erste elektrische Ladung auf die Partikel konzentriert ist, wie bereits hierin beschrieben, und zwar nach Verdampfung der Mikrotröpfchen im elektrischen Feld, das durch die Hochspannungsquelle 20 erzeugt wird, die an die Kapillarröhrchen-Elektrode 18 und an die Erdung der Targetflä che 14 angelegt ist. Die Kapillarröhrchen-Elektrode 18 fungiert als erste Elektrode, wie mit Bezug auf 1B beschrieben, und die leitfähige Targetfläche 14 fungiert als die zweite Elektrode, die mit Bezug auf 1B beschrieben ist. Bei einer elektrischen Potentialdifferenz, die zwischen der Kapillarröhrchen-Elektrode 18 und der Targetfläche 14 erzeugt wird, wird ein ungleichmäßiges Feld von der Abgabespitze 23 bis zur Targetfläche 14 bereitgestellt, um vor der Abgabespitze 23 das Spray von Partikeln 28 zu erzeugen. Neben der Erzeugung des ungleichmäßigen elektrischen Feldes zur Erzeugung des Sprays von Partikeln 28 ermöglicht die leitfähige Targetfläche 14, die mit Erde 38 verbunden ist, den Einschluß der Partikel bis zu einer bestimmten Fläche, um einen Zwangskontakt mit den Targetzellen 40 zu ermöglichen.
Wie in 2 gezeigt, kann in Abhängigkeit von der verwendeten Abgabevorrichtung und anderen Komponenten der Anordnung die von der Quelle 22 bereitgestellte Partikelsuspension von einer Druckquelle stammen. Als Alternative kann eine Druckgasquelle 26 in Verbindung mit einer Zuführeinrichtung 24 oder einem anderen Teil der Abgabevorrichtung 12 benutzt werden, um Druck bereitzustellen, um das Spray 28 in die Kammer 16 abzugeben. Beispielsweise kann die Quelle 22 im Bereich von mehreren Zehnteln einer Atmosphäre bis zu mehreren 100 Atmosphären unter Druck gesetzt werden, oder die verwendete Druckgasquelle 26 kann ein Gas sein, z. B. Kohlendioxid, Umgebungsluft, Wasserstoff, Helium, Stickstoff oder die gleichen Drücke haben.
Die Targetfläche 14 kann jede geeignete Fläche zur Plazierung von Targetzellen sein. Beispielsweise kann die Targetfläche eine elektrisch leitfähige Fläche sein, die mit einer elektrischen Erde oder Ladung verbunden ist. Im allgemeinen können die Zellen durch natürliche Befeuchtung der Zellen oder auf eine beliebige andere Weise, z. B. Beschichtung, Nährlösungen, zur Targetfläche leitfähig gemacht werden. Die Targetfläche 14 ist eine im wesentlichen horizontale Fläche, die in der Lage ist, die Targetzellen zu stützen. Das elektrische Potential oder Erde kann an die Targetfläche angelegt werden, so daß ein Teil oder die gesamte Fläche das Spray anzieht, z. B.
werden die Partikel auf bestimmte Bereiche der Targetfläche durch das elektrische Feld gelenkt, das durch die Potentialdifferenz erzeugt wird, die zwischen dem Verteilerkopf und der Targetfläche angelegt wird. Daß das Spray auf einen bestimmten Abschnitt der Targetfläche gelenkt werden kann, ist insofern vorteilhaft, als eine übermäßige Versprühung vermieden wird. Das heißt, das Spray wird zu einem Abschnitt der Targetfläche mit einer angelegten Spannung hingezogen, z. B. ein Abschnitt, der von anderen Abschnitten isoliert ist, wo Targetzellen positioniert worden sind. Es ist sogar möglich, das elektrische Feld zwischen dem Verteilerkopf 19 und der Targetfläche 14 zu regulieren, so daß die Partikel von einer Position der Targetfläche zur anderen gelenkt werden, z. B. durch Schaltmechanismen oder angelegte alternative Spannungsquellen.
Vorzugsweise ist die Targetfläche 14 entlang der x-, y- und z-Achse beweglich, wie allgemein mit Pfeilen 33 und 34 angezeigt. Die Targetfläche 14 ist mit einem beweglichen Positionierteil (nicht dargestellt) versehen und wird von diesem unterstützt, das es ermöglicht, die Targetfläche entlang dieser Achsen zu bewegen. Beispielsweise kann die Targetfläche entweder näher heran oder weiter weg von der Elektrospray-Abgabevorrichtung 12 bewegt werden.
Der Abstand zwischen der Abgabespitze 23 des Verteilerkopfs 19 in der Kammer 16 und der Targetfläche 14 ist vorzugsweise im Bereich von etwa 5 mm bis etwa 3 cm je nach gewünschtem elektrischem Feld und gewünschter Sprayfläche (D). Dieser Abstand kann jedoch in Abhängigkeit von der spezifischen Anwendung variieren, und es ist erkennbar, daß die Sprayfläche D einen kleineren Durchmesser hat, wenn die Abgabespitze 23 des Verteilerkopfs 19 und die Targetfläche 14 näher aneinander geschoben sind.
Da alle Partikel des Sprays 28 die Ladung gleicher Polarität tragen, wenn sie in die Kammer 16 abgegeben werden, neigen die Partikel dazu, einander abzustoßen und Agglomeration zu vermeiden. Die Elektrospraytechnik kann die Sprayfläche D gleichmäßig versorgen. Man beachte, daß die Abstoßung der mit gleicher Polarität geladenen Partikel mindestens teilweise die Verbreitung des Sprays 28 bestimmt, das in die Kammer 16 abgegeben wird.
3 zeigt bildlich die Elektrospray-Anordnung 42 von 2 mit dem Zusatz eines externen elektrostatischen Feldes 50 zur weiteren Beschleunigung der geladenen Partikel des Sprays 28, das in die Kammer 16 abgegeben wird. Das externe elektrostatische Feld 50 wird unter Verwendung von Ringelektroden 52 erzeugt, mit der eine hoher negative Spannungsversorgung 54 verbunden ist und die ferner mit Masse 56 verbunden sind. Das Feld beschleunigt die geladenen Partikel, die durch die Ringelektroden in die Kammer 16 abgegeben werden. Auf diese Weise werden die Partikel weiter in Richtung der geerdeten Targetfläche 14 beschleunigt. Die an die Ringelektroden angelegte Spannung kann im bevorzugten Bereich von etwa 200 V bis etwa 5 kV liegen.
Für den Fachmann ist ohne weiteres erkennbar, daß die Beschleunigung der geladenen Partikel des Sprays 28 durch das externe elektrische Feld 50 zur Beschleunigung der Partikel auf eine gewünschte Geschwindigkeit, die zum Eindringen in bestimmte Targetzellen 40 auf der Targetfläche 14 notwendig ist, benötigt werden kann. Erfindungsgemäß ist eine solche zusätzliche Beschleunigung im allgemeinen jedoch unnötig, da der Raumladungseffekt die notwendige Geschwindigkeit für ein solches Eindringen ermöglicht.
4 stellt bildlich die Elektrospray-Anordnung 42 dar, wie sie in 2 dargestellt ist, aber weist ferner ein Plazierungssteuerteil 70 auf. Das Plazierungssteuerteil 70 weist eine Öffnung 71 auf, durch die ein Teil der Partikel des Sprays 28 zum Zusammenprall mit Targetzellen 40 hindurchgelassen wird. Auf diese Weise kann der Aufprall auf die bestimmten Targetzellen 40 gesteuert werden.
5 ist eine bildliche Darstellung einer alternativen Elektrospray-Anordnung 100, die der Elektrospray-Anordnung 42 in 2 gleicht, die jedoch mehrere zusätzliche vorteilhafte Komponenten aufweist. Die Elektrospray-Anordnung 100 weist eine Elektrospray-Abgabevorrichtung 112 auf, die mit der in 1 gezeigten identisch ist, die jedoch das Spray 128 in eine Vakuumkammer 116 abgibt, die durch eine Vakuumpumpe 142 evakuiert wird. Die Geschwindigkeit der Partikel des Sprays 128 ist aufgrund des Raumladungseffekts im allgemeinen größer, da der Druck in der Kammer 116 verringert ist. Vorzugsweise ist der Druck in der Kammer im Bereich von etwa 1 Atmosphäre bis etwa 0,1 Atmosphären.
Die Elektrospray-Anordnung 100 weist ferner eine Targetfläche 114 auf, auf der Targetzellen 140 plaziert sind und die mit Masse 138 verbunden ist. Die Targetfläche ist mittels eines motorbetriebenen Positionierungsteils 115 um eine Achse 119 drehbar. Die Targetfläche 114 kann dann gedreht werden, und eine gleichmäßigere Verteilung der Partikel des Sprays 128 an die Targetzellen 140 wird erreicht. Ferner ist die Abgabevorrichtung 112 entlang der x-, y- und z-Achse beweglich, wie allgemein durch Pfeile 131 und 132 dargestellt. Daher können Partikel zum Zusammenprall mit der Gesamtfläche der rotierenden Oberfläche 114 abgegeben werden. Beispielsweise kann die Abgabevorrichtung 112 abseits von der Achse 119 (z. B. die halbe Strecke zwischen der Achse 119 und dem Rand der drehbaren Targetfläche 114) positioniert sein. Auf diese Weise kann das Spray 128 gleichmäßig auf den Zellen auf der Targetfläche 114 verteilt werden, während sich die Targetfläche dreht.
6 stellt bildlich eine alternative Konfiguration einer Elektrospray-Anordnung 200 dar. Die Elektrospray-Anordnung 200 weist ein Transportsystem 260 auf, das relativ zur Abgabevorrichtung 212 positioniert ist. Die Abgabevorrichtung 212 gleicht einer hierin beschriebenen Elektrospray-Abgabevorrichtung. Die elektrische Potentialdifferenz zum Hervorbringen des Sprays aus der Abgabevorrichtung 212 wird durch eine Spannungsquelle 220 und durch Erdung des Transportsystems 260 angelegt. Das Transportsystem 260 weist eine Targetfläche 262 auf, die durch ein motorbetriebenes Element 264 bewegt wird. Auf diese Weise ermöglicht die kontinuierliche Bereitstellung des Sprays 228 durch kontinuierliche Bewegung der Targetfläche 262 mit darauf plazierten Targetzellen 240 ein Massenproduktionssystem zum Transfer von Biomaterial in Targetzellen.
Man kann ohne weiteres erkennen, daß die Zellen, die durch das Biomaterial zu modifizieren sind, in ihrem natürli chen Zustand sein können, z. B. in situ. Solche Zellen können behandelt werden, während sie im Körper eines Lebewesens sind, d. h. in vivo, oder wenn solche Zellen aus dem Körper entfernt sind, d. h. ex vivo. Beispielsweise sind die Gewebe, die bombardiert werden können, u. a. menschliches Gewebe oder Gewebe von anderen Lebewesen, z. B. Epidermisgewebe, Organgewebe, Tumorgewebe, Pflanzengewebe und dgl., während es sich im Körper befindet oder aus dem Körper entfernt ist. Eine tragbare Elektrospray-Anordnung kann zur Gentherapie oder für andere spezialisierte In-situ-Anwendungen, z. B. Immunisierung, verwendet werden. Beispielsweise können in einer solchen tragbaren Konfiguration die Targetzellen, die durch die geladenen Partikel zum Aufprallen gebracht werden, In-situ-Zellen sein, im Gegensatz zu Zellen, die auf einer Targetfläche plaziert sind. Eine anschauliche tragbare Elektrospray-Anordnung ist nachstehend allgemein mit Bezug auf 9 beschrieben und weist im allgemeinen Elemente oder Komponenten auf, die die gleiche Funktion haben wie bei der Konfiguration in 1C.
Für den Fachmann sollte erkennbar sein, daß die verschiedenen Elemente, die mit Bezug auf 1 bis 6 beschrieben sind, auf vielerlei Art kombiniert werden können, und jede alternative Konfiguration der Elektrospray-Anordnung, die hierin beschrieben ist, dient lediglich der Darstellung. Beispielsweise kann die mit Bezug auf 5 beschriebene Vakuumkammer 116 mit der Elektrospray-Anordnung in 4 verwendet werden, das mit Bezug auf 4 beschriebene Plazierungsteil 70 kann in der Elektrospray-Anordnung 42 in 2 verwendet werden, das Transportsystem 260, wie es mit Bezug auf 6 beschrieben ist, kann mit dem externen elektrischen Feld 50 verwendet werden, wie es mit Bezug auf 3 beschrieben ist, usw.
7 ist eine ausführliche Darstellung einer Konfiguration eines Abschnitts 300 der insgesamt in 2 dargestellten Elektrospray-Anordnung mit einer erfindungsgemäßen Abgabevorrichtung 314. Wie in 7 gezeigt, wird das Spray 328 in eine Kammer 303 gesprüht, die durch ein Gehäuse 302 mit einer durchgehenden Achse 301 gebildet wird. Das Gehäuse 302 weist ein erstes Ende 304 und ein zweites Ende 306 auf, die durch eine zylindrische Wand um die Achse 301 miteinander verbunden sind. Vorzugsweise ist das Gehäuse 302 eine Vakuumkammer, die evakuiert werden kann, wie nachstehend weiter beschrieben wird. Man wird anerkennen, daß verschiedene Konfigurationen zur Bildung des Gehäuses 302 gewählt werden können und daß die Erfindung nicht auf bestimmte Konfigurationen beschränkt ist. Das Gehäuse 302 besteht im allgemeinen aus isolierenden Materialien. Beispielsweise ist die zylindrische Wandumhausung 308 aus optischen Gründen vorzugsweise eine zylindrische Plexiglaswand, während das erste und das zweite Ende 304, 306 aus verschiedenen isolierenden Materialien bestehen können. Das erste Ende 304 kann auch aus leitfähigen Abschnitten bestehen, um das Anlegen von Spannungen oder Erde an das Kapillarröhrchen 320 zu erleichtern.
Das zweite Ende 306 des Gehäuses 302 weist ein Endelement 311 auf, das mit den zylindrischen Wänden 308 verbunden ist. Relativ zu einer oberen Fläche 370 des Endelements 311 ist eine Targetplattform 312 positioniert, auf der Targetzellen positioniert werden können. Beispielsweise kann eine Röhre, eine Schale oder eine andere Struktur, die Zellen aufweist, auf der Plattform 312 positioniert werden, oder die Zellen können auf der Plattform 312 ohne eine zusätzliche Struktur positioniert werden. Ferner ist ein drehbarer Mikrometerreguliermechanismus 310 durchgehend in einer unteren Fläche 371 des Endelements 311 zum Kontakt mit der Plattform 312 vorgesehen, so daß die Höhe der Plattform 312 verändert werden kann, z. B. kann der Abstand zwischen den Targetzellen 340 und der Abgabespitze 380 der Abgabevorrichtung 314 reguliert werden. Die Plattform 312 besteht aus einem leitfähigen Material, z. B. nichtrostendem Stahl, und kann als zweite Elektrode der Abgabevorrichtung 314 zur Erzeugung des Sprays 328 an der Abgabespitze 380 der Abgabevorrichtung 314 fungieren.
Das erste Ende 304 des Gehäuses 302 weist einen Verteilerkopf 316 auf, der sich durch dieses erstreckt und der eine Achse aufweist, die mit der Achse 301 zur Verwendung bei der Erzeugung des Sprays 328 in der Kammer 303 in Kombination mit der leitfähigen Plattform 312 übereinstimmt. Der Verteilerkopf 316 weist ein Kapillarröhrchen 320 mit einer durchgehenden Achse auf, die mit der Achse 301 übereinstimmt. Das Kapillarröhrchen 320 weist ein erstes Ende 330 auf, das in einer Öffnung 385 des ersten Endes 330 durch ein leitfähiges Dichtelement 337 in der oberen Fläche 383 des ersten Endes 304 dichtend positioniert ist. Das Kapillarröhrchen 320 weist ferner ein zweites Ende 332 auf, das zum Abgeben des Sprays 328 nach Bedarf positioniert wird. Das Kapillarröhrchen 320 kann aus einem beliebigen geeigneten Material, z. B. Platin, Silika, nichtrostender Stahl usw., bestehen und kann jede geeignete Größe haben. Beispielsweise kann das Kapillarröhrchen vorzugsweise einen Außendurchmesser in dem Bereich von etwa 8 μm bis etwa 2,5 mm und einen Innendurchmesser in dem bevorzugten Bereich von etwa 6 μm bis etwa 2 mm haben. Besonders bevorzugt ist der Innendurchmesser des Kapillarröhrchens im Bereich von etwa 10 μm bis etwa 200 μm.
Ferner weist der Verteilerkopf 316 einen Düsenabschnitt oder eine Düsenumhüllung 322 auf, die in 7 als langgestreckte, im wesentlichen zylindrische Metallumhüllung dargestellt ist, die mit dem Kapillarröhrchen 320 konzentrisch ist. Die Umhüllung 322 kann jedoch leitfähig oder nichtleitfähig sein. Ferner kann die Umhüllung 322 jede Konfiguration oder Form haben, die den Strom eines Hüllgases um das Kapillarröhrchen 320 herum ermöglicht. Zusammengenommen bilden in dieser bestimmten Ausführungsform das Kapillarröhrchen 320 und die Umhüllung 322 die Kapillarröhrchen-Elektrode des Verteilerkopfs 316 zur Verwendung bei der Einleitung des Sprays 328 in die Kammer in Verbindung mit der leitfähigen Plattform 312. Die Umhüllung oder der Düsenabschnitt 322 weist einen ersten Endabschnitt 336 auf, der sich am Abschnitt 335 zu einem schmaleren zweiten Endabschnitt 338 verjüngt. Der zweite Endabschnitt 338 erstreckt sich von dem sich verjüngenden Abschnitt 335 und ist konzentrisch mit dem zweiten Ende 332 des Kapillarröhrchens 320. Das schmale Ende des sich verjüngenden Abschnitts 335 erstreckt sich um eine bevorzugte Strecke von etwa 5 mm bis etwa 5 cm von der unteren Fläche 385 des ersten Endes 304. Der Außendurchmesser des zweiten Endabschnitts 338 ist vorzugsweise im Bereich von etwa 2 mm bis etwa 5 mm, und der Innendurchmesser des zweiten Endabschnitts 338 ist vor zugsweise im Bereich von etwa 0,1 cm bis etwa 0,2 cm. Das zweite Ende 332 des Kapillarröhrchens 320 erstreckt sich um eine Strecke von vorzugsweise etwa 2 mm bis etwa 5 mm über den zweiten Endabschnitt der Metallumhüllung oder des Düsenabschnitts 322 hinaus in Richtung der Targetzellen 340. Der Düsenabschnitt 322 besteht aus einem beliebigen geeigneten Metall oder nichtleitfähigen Material, z. B. nichtrostender Stahl, Messing, Aluminiumoxid oder ein anderes geeignetes leitfähiges oder nichtleitfähiges Material. Der Düsenabschnitt 322 ist vom Kapillarröhrchen 320 durch Abstandselemente 326 oder andere Abstandsstrukturen beabstandet. Beispielsweise kann eine Metallumhüllung 322 an bestimmten Abschnitten deformiert sein, z. B. Nadelspitzen oder Vertiefungen, um einen Hals zur Zentrierung des Kapillarröhrchens 320 in diesem zu erzeugen.
Die Kapillarröhrchen-Elektrode kann eine von vielen Konfigurationen haben. Von größter Wichtigkeit ist jedoch, daß die Kapillarröhrchen-Elektrode eine Elektrode zur Erzeugung eines ungleichmäßigen elektrischen Feldes darstellt und mindestens eine Gashülle um das Kapillarröhrchen bereitstellt, um eine Koronaentladung zu vermeiden, wenn Flüssigkeiten mit hoher Oberflächenspannung, z. B. deionisiertes Wasser, versprüht werden. Beispielsweise kann in einer Elektrospray-Anordnung, wo das Spray in einer Kammer erzeugt wird, die Kapillarröhrchen-Elektrode nur ein Kapillarröhrchen selbst aufweisen, wogegen eine Umhüllung, z. B. ein Metallumhüllung 322, erforderlich sein kann, um einen ringförmigen Raum für den Strom des Hüllgases bereitzustellen. In einer solchen Konfiguration kann die Kammer mit dem Gas zur Verhinderung einer Koronaentladung geflutet werden. Wenn Flüssigkeiten, die keine Flüssigkeiten mit hoher Oberflächenspannung sind, versprüht werden, ist das Hüllgas außerdem möglicherweise nicht erforderlich.
Ein Gaseinlaß 348 ist im ersten Ende 304 des Gehäuses 302 vorgesehen, um das Eintreten eines Stroms von elektrisch negativen Gasen zu ermöglichen, z. B. CO₂, SF₆ usw., um eine Gashülle um das Kapillarröhrchen 320 zu bilden. Der Einlaß ist zum Lenken eines Stroms eines elektronegativen Gases in eine Öffnung 350 zwischen dem konzentrischen Kapillarröhrchen 320 und dem Düsenabschnitt 322 konfiguriert. Diese Gashülle ermöglicht es, daß die angelegte Spannung ohne Koronaentladung auf höhere Werte erhöht werden kann, z. B. wird die elektrostatische Durchschlagspannung für die Kapillarröhrchen-Elektrode erhöht. Der gesamte Abschnitt des Endes 304 oder dessen Abschnitte können aus leitfähigen Materialien bestehen, um das Anlegen einer Spannung oder von Erde an die Kapillarröhrchen-Elektrode zu ermöglichen. Beispielsweise können Dichtelemente 337 nichtleitfähig sein, sind aber vorzugsweise leitfähig, um das Anlegen einer Spannung oder von Erde an das Kapillarröhrchen 320 zu ermöglichen.
Das erste Ende 304 weist ferner einen Austrittskanal 354 auf, damit Gase die Kammer 303 verlassen können. Beispielsweise kann sich der Austrittskanal 354 in eine ringförmige Kammer 389 öffnen, die im ersten Ende 304 gebildet wird, das eine untere Frontplatte 390 mit einer Serie von Löchern aufweist, zum Durchlassen des Stroms aus der Kammer 303 durch den Austrittskanal 354 nach draußen. Eine Vakuumpumpe kann mit dem Austrittskanal 354 zum Evakuieren der Kammer 303 auf einen niedrigen Druck verbunden sein. Beispielsweise ist der Druck in der Kammer vorzugsweise im Bereich von etwa 1 Atmosphäre bis etwa 0,1 Atmosphären. Ferner kann anstelle oder zusätzlich zur Bereitstellung der Gashülle zwischen dem Kapillarröhrchen 320 und dem Düsenabschnitt 322 die Kammer 303 mit einem Gas durch den Austrittskanal 354 geflutet werden, um die elektrostatische Durchschlagspannung für die Kapillarröhrchen-Elektrode zu erhöhen.
In einer Ausführungsform wird die Kammer 303 durch den Austrittskanal 354 mit dem Gas geflutet, und dann setzt sich der Strom in dem bevorzugten Bereich von etwa 5 cm³/min bis etwa 200 cm³/min durch den Austrittskanal 354 fort. Jeder in die Kammer 303 führende Kanal kann zum Austritt des Gases aus der gefluteten Kammer verwendet werden, z. B. ein Kanal, der zur Erfassung eines Drucks (nicht dargestellt) in der Kammer verfügbar ist. Wenn die Kammer 303 geflutet ist, ist die Gashülle zwischen dem Kapillarröhrchen 320 und dem Düsenabschnitt 322 möglicherweise nicht erforderlich. Daher ist das Fluten der Kammer eine Alternative zur Verwendung einer solchen Gas hülle zwischen dem Kapillarröhrchen 320 und dem Düsenabschnitt 322.
Um das Spray 328 in der Kammer 303 zu erzeugen, wird ein Biomaterial bereitgestellt, z. B. in einer Lösung suspendiert, und in das erste Ende 330 des Kapillarröhrchens 320 aufgenommen. Vorzugsweise kann die Durchflußrate der Suspension im Bereich von etwa 0,01 μl/min bis etwa 5 μl/min liegen. Vorzugsweise kann eine relativ hohe Spannung, z. B. im Bereich von etwa 2000 V bis etwa 6000 V, an die Plattform 312 relativ zum Kapillarröhrchen 320, das elektrisch geerdet ist angelegt werden (oder umgekehrt), um die Potentialdifferenz zwischen der ersten und zweiten Elektrode der Spray-Anordnung zu erzeugen. In dieser bestimmten anschaulichen Konfiguration sind das Kapillarröhrchen 320, die Metallumhüllung 322 und das Dichtelement 337 leitfähig. Das Spray 328 wird vor der Abgabespitze 380 des zweiten Endes 332 des Kapillarröhrchens 320 in einem Betriebsmodus erzeugt, wie bereits beschrieben. Die Potentialdifferenz zwischen den Elektroden erzeugt ein elektrisches Feld zwischen diesen, was zur Bildung einer kleineren Fadenkathode am Meniskus führt, der an der Abgabespitze 380 gebildet wird, während die Suspension nach unten zu den Targetzellen hingezogen wird.
8 ist eine ausführlichere Darstellung einer alternativen Kapillarelektrodenkonfiguration 400 für den Verteilerkopf 316 in 7. Gleiche Bezugszeichen in 8 werden für entsprechende gleiche Elemente in 7 verwendet, um die Beschreibung der alternativen Kapillarkonfiguration 400 zu vereinfachen. Im allgemeinen wird die alternative Kapillarelektrodenkonfiguration 400 anstelle des einfachen Kapillarröhrchens 320 der in 7 gezeigten Struktur verwendet oder ersetzt diese.
Die Kapillarelektrodenkonfiguration 400 weist ein erstes Kapillarröhrchen 412 mit einer Achse auf, die mit der Achse 301 übereinstimmt, zum Aufnehmen von Biomaterial von einer Quelle, z. B. eine Suspension aus Biomaterial. Ferner ist das zweite Kapillarröhrchen 414 konzentrisch mit dem ersten Kapillarröhrchen 412. Ein ringförmiger Raum 487 zwischen dem inneren und dem äußeren Kapillarröhrchen 412, 414 wird verwen det, um einen Strom von Elektrolytflüssigkeiten mit gesteuerten Leitfähigkeiten zur Abgabespitze 495 zu lenken, und zwar zur Verwendung bei der Erzeugung des Sprays vor dieser. Durch die Verwendung einer Elektrolytlösung, die zur Abgabespitze 495 zur Erzeugung des Sprays von Mikrotröpfchen an dieser strömt, kann die Suspension aus Biomaterial mit deionisiertem Wasser hergestellt werden, das eine Charakteristik, z. B. pH, hat, die die Biomaterialeigenschaften nicht stört. Bei Verwendung der Elektrolytlösung wird eine ausreichende Ladung in den Mikrotröpfchen erreicht, die sich danach auf die Partikel des Sprays konzentriert, damit durch Raumladungseffekte die Partikel ausreichende Geschwindigkeiten zum Eindringen in Targetzellen erreichen können. Ohne den zweiten Elektrolytlösungsstrom muß der Suspension möglicherweise eine Elektrolytlösung hinzugesetzt werden, um eine solche Ladungskonzentration zu erreichen. Ferner kann die Elektrolytlösungscharakteristik, z. B. die Leitfähigkeit, geändert werden, um die Ladung, die sich auf die Partikel konzentriert, zu regulieren, ohne daß die Suspensionscharakteristik geändert werden muß. Der Strom von Elektrolytflüssigkeiten wird in den ringförmigen Raum 487 gelenkt, so daß er mit der Suspension in unmittelbarer Nähe der Abgabespitze 495 in Kontakt kommt. Genauer gesagt, weist der Gehäuseabschnitt 430 eine Öffnung 483 auf, die sich von einem ersten Ende 480 des Gehäuseabschnitts 430 zu seinem zweiten Ende 482 erstreckt. Ein Einlaßkanal 420 öffnet sich in die Öffnung 483. Der Einlaßkanal 420 empfängt einen Strom von Elektrolytflüssigkeiten 422, um sie in den ringförmigen Raum 487 um das Kapillarröhrchen 412 herum zu lenken. Das erste Kapillarröhrchen 412 hat ein erstes Ende 413 und ein zweites Ende 415. Das Kapillarröhrchen 412 ist in der Öffnung 483 des Gehäuseabschnitts 430 mit einer im allgemeinen T-förmigen Konfiguration positioniert. Das erste Ende 413 des Kapillarröhrchens 412 ist gegen das Gehäuse 430 unter Verwendung eines leitfähigen Elements 431 am ersten Ende 480 des Gehäuseabschnitts 430 abgedichtet. Das Kapillarröhrchen 412 erstreckt sich vom zweiten Ende 482 des Gehäuseabschnitts 430 und bildet mit dem zweiten Kapillarröhrchen 414 den ringförmigen Raum 487.
Das zweite Kapillarröhrchen 414 weist ein erstes Ende 490 und ein zweites Ende 491 auf. Das zweite Kapillarröhrchen 414 ist so positioniert, daß es konzentrisch mit dem ersten Kapillarröhrchen 412 ist. Das erste Ende 490 des zweiten Kapillarröhrchens 412 ist mit dem zweiten Ende 482 des Gehäuseabschnitts 430 unter Verwendung eines leitfähigen Elements 432 gekoppelt. Ferner wird das zweite Ende 491 des zweiten Kapillarröhrchens 414 relativ zum Düsenabschnitt 322 durch Abstandselemente 326 an Ort und Stelle gehalten. Das zweite Kapillarröhrchen 414 erstreckt sich um eine vorbestimmte Strecke in der Richtung der Targetzellen von vorzugsweise etwa 0,2 mm bis etwa 1 mm über das erste Kapillarröhrchen 412 hinaus. Der Abschnitt des zweiten Kapillarröhrchens 414 an der Abgabespitze 495, der sich über das erste Kapillarröhrchen hinaus erstreckt, ist zur Erreichung eines stabilen Sprühmusters und Betriebsmodus, nämlich beständiger Sprühmuster in einem Winkel von 60° bis 75° verjüngt. Ohne die Verjüngung kann ein intermittierender Betrieb auftreten. Ferner erstreckt sich das zweite Kapillarröhrchen 414 um eine vorbestimmte Strecke (d5), vorzugsweise etwa 2 mm bis etwa 5 mm über das zweite Ende 338 des Düsenabschnitts 322 hinaus. Das erste Kapillarröhrchen 412 hat vorzugsweise einen Durchmesser wie das Kapillarröhrchen 320 in 7. Das zweite Kapillarröhrchen, das mit dem ersten Kapillarröhrchen konzentrisch ist, hat einen bevorzugten Außendurchmesser von etwa 533,4 μm bis etwa 546,1 μm und einen bevorzugten Innendurchmesser von etwa 393,7 μm bis etwa 431,8 μm. Der Spalt d6 an der Spitze des zweiten Kapillarröhrchens 414 ist vorzugsweise im Bereich von etwa 10 μm bis etwa 80 μm. Die anderen bevorzugten Konfigurationsparameter sind im wesentlichen mit denen mit Bezug auf 7 beschriebenen äquivalent.
In einer solchen Konfiguration werden zwei Ströme von Flüssigkeiten zur Erzeugung eines Sprays an der Abgabespitze 495 der Anordnung bereitgestellt, wenn eine Suspension aus Biomaterial oder eine Suspension aus Trägerpartikeln und Biomaterial verwendet wird. Dies hat die Vorteile, wie bereits beschrieben. Ferner kann auch eine Gashülle durch den Einlaßkanal 348 bereitgestellt werden, wie bereits mit Bezug auf 7 beschrieben. Doch außerdem kann sich das erste Kapillarröhrchen 412 über das Ende des zweiten Kapillarröhrchens 414 hinaus erstrecken, z. B. wird die Abgabespitze an dem Ende des ersten Kapillarröhrchens 412 gebildet, das näher an den Targetzellen ist als das Ende des zweiten Kapillarröhrchens 414. Das heißt, die Suspension kann die Elektrolytlösung kontaktieren, bevor sie aus der Abgabespitze 495 austritt, oder die Suspension kann die Elektrolytlösung beim Austreten aus dem Ende des ersten Kapillarröhrchens 412 kontaktieren. Ferner kann das zweite Kapillarröhrchen verschiedene andere Konfigurationen haben, um den Raum zur Beförderung der Elektrolytlösung zur Abgabespitze bereitzustellen, nicht notwendigerweise eine Kapillarröhrchenstruktur.
Die erste oder mittige Kapillare kann verwendet werden, um Suspensionen aus Biomaterial mit oder ohne Verwendung von Trägerpartikeln zu versprühen. Die Durchflußrate solcher Suspensionen kann variieren. Vorzugsweise ist die Durchflußrate etwa 0,01 μl/min bis etwa 2,0 μl/min. Der ringförmige Raum zwischen der inneren 412 und äußeren 414 Kapillare wird verwendet, um den Strom von Elektrolytflüssigkeiten mit gesteuerten Leitfähigkeiten zu lenken. Die Durchflußrate solcher Elektrolytflüssigkeiten kann variieren. Vorzugsweise ist die Durchflußrate etwa 0,1 bis etwa 5 μl/min. Beispielsweise können solche Elektrolytlösungen deionisiertes Wasser mit einer Spur Salpetersäure, Nährlösungen, die zum Züchten von Kulturzellen verwendet werden, oder jede andere geeignete Komponente für Biomateriallösungen oder Targetzellen aufweisen. Die elektrische Leitfähigkeit solcher Elektrolytflüssigkeiten ist vorzugsweise im Bereich von etwa 60 μΩ^-1/cm bis etwa 80000 μΩ^-1/cm.
Neben der Steuerung der Leitfähigkeit und somit der Ladung der versprühten Partikel kann ferner der Doppelstrom von Flüssigkeiten zu anderen Zwecken verwendet werden. Beispielsweise kann der Außenstrom eine Suspension von Liposomen sein, die mit einer Suspension anderer Biomaterialien, z. B. DNA, die durch die mittige Kapillare bereitgestellt wird, versprüht wird. Somit weist der äußere Strom der Suspension ein Mittel auf, z. B. Liposomen, das verwendet wird, um das Eindringen in die Targetzellen zu fördern, z. B. die Außenhäute zu lösen.
9 zeigt eine anschauliche Darstellung einer Abgabevorrichtung 500 für eine erfindungsgemäße kompakte stiftartige Elektrospray-Anordnung, die zur Einführung von Biomaterial in Zellen, z. B. In-situ-Zellen, z. B. menschliches Gewebe oder Gewebe anderer Lebewesen, z. B. Epidermisgewebe, Organgewebe, Tumorgewebe, Pflanzengewebe und dgl., verwendet werden kann. Die Abgabevorrichtung 500 weist ein Kapillarröhrchen 502 und einen Düsenabschnitt 504 auf, der im wesentlichen genauso konfiguriert ist, wie mit Bezug auf 7 beschrieben. Die Anordnung weist ferner eine Gashülle 509 auf, die zwischen dem Kapillarröhrchen 502 und dem Düsenabschnitt 504 bereitgestellt wird. Der Hauptunterschied zwischen der Anordnung, wie sie in 7 gezeigt ist, und der in 9 besteht darin, daß eine Ringelektrode 530, die zur Erzeugung des Sprays an der Abgabespitze 531 verwendet wird, am zweiten Ende 533 des zylindrischen isolierenden Mantels 514 positioniert ist, der mit dem Düsenabschnitt 504 entlang mindestens eines Abschnitts eines ersten Endes 535 des Mantels 514 konzentrisch und vorzugsweise mit diesem in Kontakt ist.
Beispiel 1
Unter Verwendung einer Anordnung, die der in 7 gezeigten und mit Bezug darauf beschriebenen Anordnung äquivalent ist und die mit dem Verteilerkopf mit doppelten Kapillarröhrchen 400 modifiziert ist, der in 8 gezeigt und mit Bezug darauf beschrieben ist, wurde ein Biomaterialtransfer erfolgreich durchgeführt. Die verwendete Anordnung war mit einem mittigen Kapillarröhrchen 413 mit einem Außendurchmesser von etwa 229 μm bis etwa 241 μm und einem Innendurchmesser von etwa 89 μm bis etwa 127 μm konfiguriert. Das zweite Kapillarröhrchen 414, das mit dem mittigen Kapillarröhrchen konzentrisch war, hatte einen Außendurchmesser von etwa 533 μm bis etwa 546 μm und einen Innendurchmesser von etwa 394 μm bis etwa 432 μm. Der in 8 gezeigte Abstand d1 von dem Ende des sich verjüngenden Teils 335 bis zu dem Ende der Metallumhüllung 322 ist etwa 2 cm. Der Durchmesser d2 des ersten Endes 336 des Düsenabschnitts oder der Metallumhüllung 322 ist etwa 0,5 cm. Der Außendurchmesser d4 des zweiten Endes 338 des Düsenabschnitts 322 ist etwa 1715 μm bis etwa 1740 μm und hat einen Innendurchmesser d3 von etwa 1333 μm bis etwa 1410 μm. Der Abstand d5 von der Spitze des zweiten Endes 338 des Düsenabschnitts 322 bis zur Spitze des Endes des zweiten Kapillarröhrchens 414 ist etwa 5 mm. Der Spalt d6 an der Spitze des zweiten Kapillarröhrchens 414 ist etwa 40 μm.
Die Abgabevorrichtung bestand aus verschiedenen Materialien. Hauptsächlich bestanden die leitfähigen Elemente aus nichtrostendem Stahl, die Kammerwand bestand aus Plexiglas, und die isolierenden Teile, z. B. Abschnitte der Enden 304 und 306 bestanden aus schwarzem Delrinkunststoffmaterial.
Die Biomaterialquelle war eine Suspension aus Plasmid und Au-Partikeln mit Durchmessern von 5 und 10 nm (vertrieben von Sigma in St. Louis, MO). Das Plasmid war ein handelsübliches Plasmid mit EGFP-Gen (Enhanced Green Fluorescent Protein von einer Qualle). Das Plasmid ist unter der Bezeichnung EGFP von Clontech in Palo Alto, CA erhältlich. Das Plasmid wurde zur Verwendung mit 0,05 μg/μl in deionisiertem Wasser mit einer Konzentration von 0,01% Au-Partikeln resuspendiert.
Die Targetzellen waren Fibroplastzellen vom afrikanischen Grünaffen (COS-1), vertrieben von American Type Culture Collection (Rockville, MD) unter der Bezeichnung ATCC CRL-1650, fibroplastartige Zellen aus einer Menschenaffenniere, die mit einem SV40-Virus transformiert waren. Die Targetzellen waren eine Monoschicht mit einer geschätzten Konzentration von etwa 800 Zellen/cm². Die Targetzellen sind in einem Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM-Hi), das 10% fötales Kälberserum und 90% deionisiertes Wasser aufweist (vertrieben von Gibco/BRL in Rockville, MD).
Das Elektrospray wurde in einem pulsierenden Modus in einer gefluteten Kammer 302 verarbeitet. Die Kammer 302 wurde mittels eines CO₂-Stroms von 50 cm³/min durch den Kanal 354 geflutet. Es war keine Gashülle um das zweite Kapillarröhrchen 414 vorgesehen. Eine Spannung von 4300 V wurde an das leitfähige Element 312 angelegt, wie in 7 gezeigt. Der Abstand von der Abgabespitze 495 des zweiten Kapillarröhrchens 414 bis zu den Targetzellen 340 war etwa 2,5 cm. Die Zellen wurden in kleinen Mulden 396 bereitgestellt (die von einer Kulturschale mit 12 Mulden abgetrennt waren, vertrieben von Corning in Cambridge, MA), die aus optisch reinem fabrikneuem Polystyrol, behandelt mit optimaler Zellhaftung, bestanden und einen Durchmesser von etwa 22 mm aufwiesen. Die Mulde 396 wurde auf der Plattform 312 des zweiten Endes 306 des Gehäuses 302 plaziert. Leitfähige Drähte 397 wurden vom Innern der Mulde 396 bis zur leitfähigen Plattform 312 bereitgestellt, um die Streuladung abzuführen und auch um das Spray zu erzeugen.
Die Hüllflüssigkeit, die in dem ringförmigen Raum 487 zwischen dem ersten und dem zweiten Kapillarröhrchen 412, 414 bereitgestellt wird, war ein deionisierter Wasserstrom von 1 μl/min plus eine Spur von Salpetersäure in einem Verhältnis von etwa (1:50) mit einer elektrischen Leitfähigkeit von etwa 300 μΩ^-1/cm. Die oben beschriebene Suspension wurde mit einer Spritzenpumpe, die unter der Bezeichnung Doppelspritzenpumpe Harvard "33" von Harvard Apparatus in Holliston, MA vertrieben wird, mit einer Rate von 1,0 μl/min bereitgestellt.
Die Zellen wurden für etwa 2 min bei einer Temperatur von 20°C und einem Druck von 1 Atmosphäre versprüht. Die Mulde, die die Targetzellen enthielt, war für 1,5 Tage bei einer Temperatur von etwa 37°C, d. h. die Zeit, die Zellen brauchen, um sich selbst zu teilen und Fluoreszenz zu exprimieren, in einem Inkubator (vertrieben von NAPCO in Landrum, SC) plaziert. Ein UV-Mikroskop, das unter der Bezeichnung Nikon Inverted Fluorescent Mikroscope von Fryer Co. in Minneapolis, MN vertrieben wird, wurde verwendet, um die Fluoreszenz zu visualisieren. Annähern 40% bis 60% der Zellen fluoreszierten. Da Fluoreszenz festgestellt wurde, war die Einführung von Biomaterial in die Zelle erfolgreich.
Beispiel 2
Es wurde der gleiche Aufbau wie in Beispiel 1 verwendet. Der einzige Unterschied bestand darin, daß der Suspension Au-Partikel hinzugesetzt wurden und die an das Element 312 angelegte Spannung 5600 V betrug, so daß die Abgabevorrichtung in einem Kegelstrahlmodus betrieben wurde. Wiederum wurde das UV-Mikroskop verwendet, um die Fluoreszenz zu visualisieren. Annähernd 40% bis 60% der Zellen fluoreszierten. Da Fluoreszenz beobachtet wurde, war die Einführung von Biomaterial in die Zelle erfolgreich.

Claims

Verfahren zur Einführung von Biomaterialien in Zellen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: Bereitstellen einer oder mehrerer Zielzellen; und Erzeugen eines Sprays von im wesentlichen dispergierten Partikeln, die zumindest Biomaterial aufweisen, wobei an die im wesentlichen dispergierten Partikel eine elektrische Ladung angelegt wird, so daß ein Raumladungseffekt, der aus der Abstoßung der elektrisch geladenen, im wesentlichen dispergierten Partikel resultiert, verwendet wird, um ein oder mehrere der im wesentlichen dispergierten Partikel des Sprays mit einer Geschwindigkeit bereitzustellen, die zur Einführung des einen oder der mehreren im wesentlichen dispergierten Partikel in eine oder mehrere der Zielzellen ausreicht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt der Erzeugung des Sprays von im wesentlichen dispergierten Partikeln den Schritt aufweist: Abgeben eines Sprays von Mikrotröpfchen, die eine oder mehrere Partikel suspendieren, und wobei ferner die elektrische Ladung an den in den Mikrotröpfchen suspendierten Partikeln konzentriert wird, während die Mikrotröpfchen verdampfen.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Schritt des Abgebens des Sprays von Mikrotröpfchen, die Partikel suspendieren, den Schritt aufweist: Erzeugen eines ungleichmäßigen elektrischen Feldes zwischen einer Abgabespitze, von der das Spray erzeugt wird, und einer Elektrode, die von der Abgabespitze elektrisch getrennt ist.
Anordnung zum Einführen von Biomaterial in eine oder mehrere Zielzellen, wobei die Vorrichtung aufweist: eine Biomaterialquelle, die zumindest Biomaterial aufweist; und eine Abgabevorrichtung, die mit der Biomaterialquelle betriebsfähig verbunden ist, um zumindest Biomaterial von der Biomaterialquelle aufzunehmen, wobei die Abgabevorrichtung ein Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln zumindest des Biomaterials bereitstellt und wobei ferner an das Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln eine elektrische Ladung angelegt wird, so daß ein Raumladungseffekt, der aus der Abstoßung der elektrisch geladenen, im wesentlichen dispergierten Partikel resultiert, verwendet wird, um ein oder mehrere der im wesentlichen dispergierten Partikel des Sprays mit einer Geschwindigkeit, die zur Einführung des einen oder der mehreren im wesentlichen dispergierten Partikel in eine oder mehrere der Zielzellen ausreicht, bereitzustellen.
Anordnung nach Anspruch 4, wobei die Biomaterialquelle eine Suspensionsquelle aufweist, wobei die Suspensionsquelle eine Suspension von zumindest Biomaterial aufweist und wobei ferner die Abgabevorrichtung die Suspension aufnimmt und ein Spray von Mikrotröpfchen abgibt, die Partikel mit Biomaterial suspendieren.
Anordnung nach Anspruch 5, wobei die Abgabevorrichtung aufweist: eine Abgabespitze, aus der das Spray von Mikrotröpfchen, die Partikel suspendieren, abgegeben wird; und eine Elektrode, die von der Abgabespitze getrennt ist, wobei ein ungleichmäßiges elektrisches Feld zwischen der Abgabespitze und der Elektrode erzeugt wird.
Anordnung nach Anspruch 4, wobei die Biomaterialquelle eine Suspension von zumindest Biomaterial aufweist und wobei ferner die Abgabevorrichtung aufweist: eine Kapillarröhrchen-Elektrode, wobei die Kapillarröhrchen-Elektrode ein Kapillarröhrchen mit einem ersten offenen Ende und einem zweiten offenen Ende aufweist, wobei das Kapillarröhrchen mit der Biomaterialquelle betriebsfähig verbunden ist, um einen Strom der Suspension von zumindest Biomaterial an ihrem ersten offenen Ende aufzunehmen; und eine Elektrode, die vom zweiten offenen Ende des Kapillarröhrchens getrennt, aber in der Nähe desselben positioniert ist, wobei ein ungleichmäßiges elektrisches Feld zwischen der Kapillarröhrchen-Elektrode und der Elektrode erzeugt wird, so daß ein Spray von Mikrotröpfchen, die Partikel von zumindest Biomaterial suspendieren, am zweiten Ende des Kapillarröhrchens bereitgestellt wird, und wobei ferner nach Verdampfung der Mikrotröpfchen eine elektrische Ladung an den suspendierten Partikeln konzentriert wird, was zu einem geladenen Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln führt.
Anordnung nach Anspruch 7, wobei die Kapillarröhrchen-Elektrode ferner ein Gehäuse aufweist, das zumindest mit einem Abschnitt des Kapillarröhrchens zwischen seinem ersten und zweiten offenen Ende konzentrisch ist, wobei das zweite offene Ende des Kapillarröhrchens sich um eine vorbestimmte Strecke über das Gehäuse hinaus erstreckt und wobei ferner die Anordnung eine Gasquelle aufweist, die ein Gas bereitstellt, das zwischen dem Kapillarröhrchen und dem konzentrischen Gehäuse aufzunehmen ist.
Anordnung nach Anspruch 4, wobei die Biomaterialquelle eine Suspension von zumindest Biomaterial aufweist, wobei die Anordnung ferner eine Elektrolytquelle zur Bereitstellung einer Lösung aufweist und wobei ferner die Abgabevorrichtung aufweist: eine Kapillarröhrchenelektrode mit einer Abgabespitze, wobei die Kapillarröhrchenelektrode aufweist: ein erstes Kapillarröhrchen mit einem ersten offenen Ende und einem zweiten offenen Ende, wobei das erste Kapillarröhrchen mit der Biomaterialquelle betriebsfähig verbunden ist, um einen Strom der Suspension von zumindest Biomaterial an seinem ersten offenen Ende aufzunehmen, und ein zweites Kapillarröhrchen, das zumindest mit einem Abschnitt des ersten Kapillarröhrchens konzentrisch ist, wobei die Elektrolytlösung in einer ringförmigen Öffnung aufgenommen wird, die zwischen dem ersten und zweiten Kapillarröhrchen, die konzentrisch sind, gebildet wird; und eine Elektrode, die von der Abgabespitze der Kapillarröhrchen-Elektrode getrennt, aber in der Nähe derselben positioniert ist, wobei ein ungleichmäßiges elektrisches Feld zwischen der Kapillarröhrchen-Elektrode und der Elektrode erzeugt wird, so daß ein Spray von Mikrotröpfchen, die Partikel von zumindest Biomaterial suspendieren, an der Abgabespitze bereitgestellt wird, und wobei ferner nach Verdampfung der Mikrotröpfchen eine elektrische Ladung an den suspendierten Partikeln konzentriert wird, was zu einem geladenen Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln führt.
Anordnung oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln ein kontinuierliches Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln aufweist.
Anordnung oder Verfahren nach Anspruch 3, 6, 7 oder 8, wobei die Elektrode verwendet wird, um das Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln auf die eine oder mehreren Zielzellen zu richten.
Anordnung oder Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Elektrode eine Ringelektrode oder ein leitendes Ziel ist, das eine oder mehrere dazu zugeordnete Zellen aufweist.
Verfahren zum Einführen von Biomaterial in Zellen, wobei das Verfahren die Schritte aufweist: Bereitstellen einer oder mehrerer Zielzellen; Bereitstellen eines ersten Stroms einer Suspension, die zumindest Biomaterial aufweist; Bereitstellen eines zweiten Stroms einer Lösung; und Erzeugen eines Sprays von im wesentlichen dispergierten Partikeln, die zumindest Biomaterial aufweisen, aus dem ersten Strom und dem zweiten Strom, wobei an die im wesentlichen dispergierten Partikel eine elektrische Ladung angelegt ist, so daß ein Raumladungseffekt, der aus der Abstoßung der elektrisch geladenen, im wesentlichen dispergierten Partikel resultiert, verwendet wird, um einen oder mehrere der im wesentlichen dispergierten Partikel des Sprays mit einer Geschwindigkeit, die zur Einführung des einen oder der mehreren im wesentlichen dispergierten Partikel in eine oder mehrere der Zielzellen ausreicht, bereitzustellen.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Schritt des Erzeugens des Sprays von im wesentlichen dispergierten Partikeln den Schritt aufweist: Abgeben eines Sprays von Mikrotröpfchen, die Partikel suspendieren, und wobei ferner die elektrische Ladung an den suspendierten Partikeln konzentriert wird, während das Mikrotröpfchen verdampft.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Lösung ein Mittel zur Förderung des Eindringens in die Zielzellen aufweist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Lösung eine Elektrolytlösung mit einer vorbestimmten elektrischen Leitfähigkeit aufweist, wobei die vorbestimmte elektrische Leitfähigkeit der Lösung gewählt wird, um den Raumladungseffekt zu steuern.
Verfahren oder Anordnung nach einem der Ansprüche 2 bis 3, 5 bis 9 und 14 bis 16, wobei die suspendierten Partikel Biomaterialpartikel oder Trägerpartikel, denen Biomaterial zugeordnet ist, aufweisen.