DE69832616T2

DE69832616T2 - Verwendung von hyaluonsäurederivaten zur herstellung von biomaterial

Info

Publication number: DE69832616T2
Application number: DE69832616T
Authority: DE
Inventors: Alberto Rivarossa; Daniele Pressato
Original assignee: Fidia Advanced Biopolymers SRL
Current assignee: Anika Therapeutics SRL
Priority date: 1997-07-28
Filing date: 1998-07-28
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2018-07-29
Also published as: EP0999859A2; AU9255598A; AU749627B2; ES2253827T3; WO1999004828A3; IL134140A0; US7202230B2; IT1294797B1; US20030060448A1; CA2298733C; ITPD970170A1; EP0999859B1; CA2298733A1; WO1999004828A2; ATE311208T1; JP2001510713A; HK1028210A1; DE69832616D1; DK0999859T3; JP4417547B2

Description

GEGENSTAND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beschreibt die Verwendung von Hyaluronsäurederivaten zur Herstellung von biokompatiblen und biologisch abbaubaren Biomaterialien mit absorbierenden Eigenschaften für Körperflüssigkeiten und physikalischer hämostatischer Aktivität zur Verwendung bei der Anastomose und zur Verhinderung der Bildung einer post-chirurgischen Adhärenz der Gefäße mit den umgebenden Narbenbildungsgeweben.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Anastomose bedeutet im Allgemeinen die chirurgische Verbindung einer Öffnung, die sich zwischen Gefäßen oder Organen gebildet hat. Dies umfaßt die venöse und arterielle Anastomose von Blutgefäßen (venös und arteriell), die Darmanastomose (einschließlich der Verbindung von Segmenten des Verdauungstrakts nach partieller oder totaler Kolonresektion), die chirurgische Implantation von Kathetern und bei endoskopischen chirurgischen Verfahren.
Die vaskuläre Anastomose bedeutet die chirurgische Verbindung der beiden Enden eines durchtrennten Blutgefäßes durch Vernähen nach der Entfernung einer Länge des Gefäßes wegen Thrombose oder Arteriosklerose oder die Verbindung zweier separater Gefäße zu Zwecken der Revaskularisierung (Bypass und freie Lappen).
Wenn das Blut nach dem Vernähen wieder durch das Gefäß fließen darf, ist ein Problem, das sich ergeben kann, das Aussickern von Blut zwischen den Stichen, insbesondere wenn antithrombotische Mittel verwendet wurden.
Wenn der Blutverlust anhält, wird sich um die Anastomose oder in der Gefäßwand ein Hämatom bilden und dies übt einen äußeren Druck aus, der hämokoagulative Phänomene anstößt, die wiederum durch Freisetzung von thrombogenem Material eine intravaskuläre Thrombose verursachen können. Darüber hinaus fördern Hämatome eine Infektion.
Die "Vaskuläre Cuff-Technik" wird bei der Mikrochirurgie für die vaskuläre Anastomose mit den folgenden Zielen verwendet:

– zur Stärkung der vaskulären Anastomose und um das Verdrehen oder Knicken oder die Kompression des Gefäßes zu verhindern (T. H. Robbins, "Microvascular anastomosis: vascular cuff technique", Plastic and Reconstruvtive Surgery, 87, 567–568);
– zum Erreichen eines hämostatischen Effekts (N. B. Hart, British Journal of Plastic Surgery, 1987, 40, 300–304);
– um die Zahl der für das Vernähen erforderlichen Stiche zu reduzieren (L. K. Hung et al., "Comparative study of artery cuff and fat wrap in microvascular anastomosis in the rat", British Journal of Plastic Surgery, 41, 278–283); und
– um eine geeignete Umgebung um die Anastomose zu schaffen, die die Adhäsion mit dem umgebenden Gewebe verhindert (T. H. Robbins, "Microvascular anastomosis: vascular cuff technique", Plastic and Reconstructive Surgery, 87, 567–568).

Bisher haben die Chirurgen versucht, das Problem des Blutens durch Verwendung vom Biomaterialien zu lösen, die hämostatische Mittel enthalten (N. B. Hart, British Journal of Plastic Surgery, 1987, 40, 300–304). Aber obwohl diese die Blutungszeit reduzieren, haben sie auch unerwünschte Negenwirkungen:

– eine geringe Durchgängigkeit der Anastomose;
– ein erhöhtes Auftreten von perivaskulärer Fibrose und Adhäsionen.

Da darüber hinaus Venen weniger durchgängig sind als Arterien, ist es sehr gefährlich, wegen der Gefahr einer intravaskulären Thrombose auf venöser Basis starke hämostatische Mittel zu verwenden.
Viele Autoren raten nicht zur Verwendung von Biomaterialien, weil sie die natürliche Heilung des bei der Anastomose betroffenen Gewebes behindern. Statt dessen wird die Verwendung von autologen Geweben favorisiert, die aus einem Segment eines Blutgefäßes bestehen, das um die Anastomose gewickelt wird (Plastic and Reconstructive Surgery, Bd. 87, Nr. 3, März 1991, Seiten 567–568).
Obwohl die Verwendung von Biomaterialien, die aus Esterderivaten ( EP0216453 ) und auto-vernetzten Hyaluronsäurederivaten ( EP0341745 ) bestehen, bei der Verhinderung der post-chirurgischen Adhäsion (WO97/07833) schon bekannt ist, hat bisher niemand beobachtet, daß sie eine physikalische hämostatische Aktivität besitzen, die die Notwendigkeit der Verwendung von hämostatischen Mitteln mit einer biochemischen Aktivität auf die Koagulationsfaktoren, die eine intravaskuläre Thrombose verursachen können, ersetzt.
Ein anderer Vorteil dieser Biomaterialien ist ihre Fähigkeit zur Verhinderung der Adhäsion der Gefäße an die umgebenden Gewebe und überraschenderweise zur Erzeugung einer geeigneten Umgebung, um die korrekte Geweberegeneration zu begünstigen, im Gegensatz zu anderen Arten von Biomaterialien, die bei dieser Art von Chirurgie verwendet werden.
Die WO95/25751 beschreibt die Verwendung von sulfatisierter Hyaluronsäure bei der Herstellung von antithrombotischen und antikoagulierenden Fäden, Gelen usw. als anti-adhärente Mittel bei der Chirurgie und zur Herstellung von Biomaterialien wie Beipässen und Shunts.
Die WO96/35720 beschreibt Schwermetallsalze von Hyaluronsäure-Bernsteinsäure-Hemiestern als Arzneimittel (Gele, Salben) bei der Behandlung von Wunden, die auf der antimikrobiellen, antibakteriellen und desinfizierenden Wirkung dieser Schwermetallsalze basieren.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das Ziel der Erfindung ist in den Ansprüchen definiert. Die vorliegende Erfindung beschreibt die Verwendung von biokompatiblen und biologisch abbaubaren Biomaterialien, die auf Derivaten von Hyaluronsäure basieren, die wegen ihrer unerwarteten physikalischen hämostatischen Eigenschaften vorteilhaft bei der Anastomose, vorzugsweise der vaskulären, und bei der Verhinderung der post-chirurgischen Adhäsion von Gefäßen an die umgebenden Geweben verwendet werden können. Die folgenden Polysaccharid-Hyaluronsäurederivate werden bevorzugt:

– Hyaluronsäureester, wobei die Carboxylfunktionen teilweise oder vollständig verestert sind mit Alkoholen der aliphatischen, aromatischen, arylaliphatischen, cycloaliphatischen, heterocyclischen Reihen ( EP 0216453 );
– Hyaluronsäureester, wobei die Carboxylfunktionen teilweise verestert sind mit Alkoholen der aralaphatischen Reihen und ein zweiter Teil der Carboxylgruppen derivatisiert sind mit langkettigen aliphatischen Gruppen (WO 98/08876);
– autovernetzte Ester von Hyaluronsäure, wobei die Carboxylgruppen teilweise oder vollständig verestert sind mit den alkoholischen Funktionen derselben Polysaccharidkette oder von anderen Ketten ( EP 0341745 );
– vernetzte Hyaluronsäureverbindungen, wobei die Carboxylgruppen teilweise oder vollständig verestert sind mit Polyalkoholen der aliphatischen, aromatischen, arylaliphatischen, cycloaliphatischen, heterocyclischen Reihen, wobei die Vernetzung durch Abstandshalter-Ketten bewirkt wird ( EP 0265116 B1 );
– Hemiester der Bernsteinsäure oder Schwermetallsalze des Hemiesters der Bernsteinsäure mit Hyaluronsäure oder mit teilweisen oder vollständigen Estern der Hyaluronsäure (WO 96/35720);
– Amidderivate der Hyaluronsäure.

Der Hemiester der Bernsteinsäure mit Hyaluronsäure oder mit einem vollständigen oder teilweisen Ester der Hyaluronsäure, der bei der vorliegenden Erfindung von Nutzen ist, ist dadurch gekennzeichnet, daß er die folgende, sich wiederholende Einheit hat (I):
wobei R₁, R₂ und R₃, die gleich oder unterschiedlich sind, H oder CO(CH₂)₂COOY sind, wobei Y eine negative Ladung oder H ist, und R ist OH, O^– oder ein alkoholischer Rest.
Die Schwermetallsalze des Hemiesters der Bernsteinsäure mit Hyaluronsäure oder mit einem vollständigen oder teilweisen Ester der Hyaluronsäure sind dadurch gekennzeichnet, daß sie die folgende, sich wiederholende Einheit haben (II):
wobei R₁, R₂ und R₃, die gleich oder unterschiedlich sind, H oder CO(CH₂)₂COO^– sind, R O^– oder ein alkoholischer Rest ist, (X^z+) ein Kation eines Schwermetalls ist, wobei z eine Zahl zwischen 1 und 6 ist, p eine ganze Zahl oder eine Dezimalzahl zwischen 0,1 und 5 ist, unter der Maßgabe, daß p(X^z+) gleich der Zahl an anionischen Gruppen COO^– ist, die in der besagten, sich wiederholenden Einheit vorhanden sind.
Hemiester der Bernsteinsäure oder Schwermetallsalze des Hemiesters der Bernsteinsäure mit Hyaluronsäure oder mit teilweisen oder vollständigen Estern der Hyaluronsäure können gemäß der folgenden Schritte hergestellt werden:

a) Umwandlung des Natriumsalzes der Hyaluronsäure in ein Salz, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Pyridinium-, Tetraalkylammonium-, Tetraarylammonium-, Tetraalkylphosphonium-, Tetraarylphosphoniumsalz in der Gegenwart von Wasser und einem aprotischen Lösungsmittel,
b) Behandlung der Lösung, die von Schritt (a) kommt, mit Bernsteinsäureanhydrid in der Gegenwart einer organischen Base als Katalysator, Entfernung des Pyridinium-, Tetraalkylammonium-, Tetraarylammonium-, Tetraalkylphosphonium-, Tetraarylphosphoniumkations durch Dialyse, wobei man den Hemiester der Bernsteinsäure erhält, der die sich wiederholende Einheit (I) hat, unter der Maßgabe, daß mindestens eine der sich wiederholenden Einheiten (I) R= OH oder O^– hat, und gegebenenfalls Gewinnung des erhaltenen Produkts mittels Gefriertrocknung.
c) Behandlung der Lösung, die direkt von dem vorhergehenden Schritt kommt, oder einer wäßrigen Lösung des gewonnenen festen Produkts, das von dem vorhergehenden Schritt kommt, mit einer wäßrigen Lösung eines anorganischen Salzes des Schwermetalls und Gewinnung des Produkts durch Filtration und Vakuumtrocknung.

Im Falle der Herstellung des Schwermetallsalzes mit dem Bernsteinsäure-Hemiester des vollständigen Esters der Hyaluronsäure kann das folgende Verfahren verwendet werden:

b') Behandlung des Hyaluronsäureesters, der in einem Gemisch aus Wasser und einem aprotischen Lösungsmittel gelöst oder suspendiert ist, mit Bernsteinsäureanhydrid in der Gegenwart einer organischen Base als Katalysator, wobei der Bernsteinsäure-Hemiester erhalten wird, der die sich wiederholende Einheit (I) hat, wobei R der Rest eines Alkohols ist, und gegebenenfalls Gewinnung des erhaltenen Produkts mittels Gefriertrocknung.
c') Behandlung der Lösung, die direkt von dem vorhergehenden Schritt kommt, oder einer wäßrigen Lösung des gewonnenen festen Produkts, das von dem vorhergehenden Schritt kommt, mit einer wäßrigen Lösung eines anorganischen Salzes des Schwermetalls und Gewinnung des Produkts durch Filtration und Vakuumtrocknung.

Der Ausdruck "Schwermetall" umfaßt jedes pharmazeutisch aktive Metall in der Periode 4, 5 oder 6 des Periodensystems.
Die bevorzugten Schwermetallsalze gemäß der vorliegenden Erfindung sind diejenigen, deren Kation Zink-, Silber-, Kupfer-, Gold-, Cer- und Wolframsalze von Bernsteinsäurederivaten von Hyaluronsäure sind.
Hyaluronsäure oder Hyaluronsäureester jedes Molekulargewichts können zur Herstellung ihrer Bernsteinsäurederivate verwendet werden. Bei den folgenden Beispielen wurden Proben von Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht von zwischen 30.000 und 760.000 Dalton verwendet, dieser Bereich ist aber nicht kritisch.
Die bevorzugten Bernsteinsäure-Hemiester von Hyaluronsäure oder Hyaluronsäureestern sind diejenigen, die in der sich wiederholenden Einheit (I) R₁ = R₂ = R₃ = H haben und die entsprechenden Schwermetallsalze, wobei bei der sich wiederholenden Einheit (II) X ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus: Silber, Kupfer und Zink und z ist 1 bis 3 und p ist 0,3 bis 2.
Eine andere Klasse von bevorzugten Bernsteinsäure-Hemiestern mit Hyaluronsäure oder Hyaluronsäureestern sind diejenigen, die mindestens eine sich wiederholende Einheit (I) haben, wobei R₁ = R₃ = H und R₂ = CO(CH₂)₂COOY, und mindestens eine sich wiederholenden Einheit (I), wobei R₂ = R₃ = H, und R₁ = CO(CH₂)₂COOY die vorstehend erwähnten Bedeutungen hat, und die entsprechenden Schwermetallsalze haben mindestens eine sich wiederholende Einheit (II), wobei R₁ = R₃ = H und R₂ = CO(CH₂)₂COO^–, und mindestens eine sich wiederholende Einheit (II), wobei R₂ = R₃ = H, R₁ = CO(CH₂)₂COO^–, X ist ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus: Silber, Gold, Kupfer und Zink, z ist 1 bis 3 und p ist 0,6 bis 3.
Bei dem vorstehenden Schritt (a) wird die Hyaluronsäure vorzugsweise in das entsprechende Pyridiniumsalz umgewandelt. Insbesondere umfaßt diese Umwandlung eine vorhergehende Auflösung des Natriumsalzes der Hyaluronsäure in einem Gemisch aus Wasser und Dimethylformamid und eine Behandlung mit einem Kationenaustauscherharz zur Gewinnung der entsprechenden freien Hyaluronsäure. Nach der Entfernung des Harzes wird die Lösung mit Pyridin neutralisiert und so wird das Pyridiniumsalz erhalten.
Beim Schritt (b) oder (b') in beiden Verfahren ist die Menge an Bernsteinsäureanhydrid nicht kritisch, obwohl es bevorzugt ist, einen großen Überschuß bezüglich der Hyaluronsäure zuzugeben. In der Tat werden die besten Resultate erhalten, wenn das molare Verhältnis Bernsteinsäureanhydrid/freie OH-Gruppen, die in der sich wiederholenden Einheit (III)
der Ausgangs-Hyaluronsäure oder des teilweisen Hyaluronsäureesters vorhanden sind, sich zwischen 15 und 90 bewegt, wobei R die vorstehend erwähnten Bedeutungen hat. Obwohl die Temperatur nicht kritisch ist, werden die besten Resultate erhalten, wenn Schritt (b) oder (b') der beiden Verfahren bei 70°C durchgeführt wird. Die bevorzugte organische Base, die bei den Schritten (b) oder (b') der beiden Verfahren als Katalysator verwendet wird, wird ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 4-Dimethylaminopyridin, Pyridin oder Gemischen daraus. Bei Verwendung großer Mengen von 4-Dimethylaminopyridin wird ein Bernsteinsäure-Hemiester mit Hyaluronsäure oder einem Hyaluronsäureester mit einem hohen Grad an Veresterung mit Bernsteinsäure erhalten. Bei Verwendung von Pyridin allein oder unter Beimischung von kleinen Mengen an 4-Dimethylaminopyridin wird ein Bernsteinsäure-Hemiester mit Hyaluronsäure mit einem niedrigen Grad an Veresterung mit Bernsteinsäure erhalten. Je stärker die Reaktionsbedingungen sind, wie Temperatur, Reaktionszeiten usw., desto höher ist das Maß an Veresterung der gebildeten Derivate.
Für die Herstellung des Ag-Salzes des Bernsteinsäure-Hemiesters mit Hyaluronsäure oder einem Hyaluronsäureester in Schritt (c) oder (c') wird der Bernsteinsäure-Hemiesters mit Hyaluronsäure oder Bernsteinsäure-Hemiester mit Hyaluronsäureester vorzugsweise mit einer wäßrigen Lösung von Silbernitrat behandelt, um das Silbersalz des Bernsteinsäure-Hemiesters mit Hyaluronsäure oder Hyaluronsäureester zu bilden. Das Ag-Salz fällt aus der Lösung aus und wird mittels Filtration oder Zentrifugation gewonnen. Der Niederschlag wird dann mit Ethanol gewaschen und bei 40°C im Vakuum getrocknet. Die Silberverbindungen der Succinylderivate werden in vollkommener Dunkelheit hergestellt. Alle Handhabungen zur Herstellung der Silbernitratlösungen und zur Herstellung der Succinyl-Silber-Hyaluronate wurden in Dunkelheit durchgeführt und die resultierenden Produkte wurden entfernt von Lichtquellen aufbewahrt.
Für die Herstellung der Cu-Salze des Bernsteinsäure-Hemiesters mit Hyaluronsäure oder einem Hyaluronsäureester in Schritt (c) oder (c') von beiden Verfahren wird der Bernsteinsäure-Hemiester mit Hyaluronsäure oder der Bernsteinsäure-Hemiester mit Hyaluronsäureester vorzugsweise mit einer wäßrigen Lösung von CuCl₂ behandelt, um das Cu-Salz des Bernsteinsäure-Hemiesters mit Hyaluronsäure oder Hyaluronsäureester zu bilden.
Für die Herstellung der Zn-Salze des Bernsteinsäure-Hemiesters mit Hyaluronsäure oder einem Hyaluronsäureester in Schritt (c) oder (c') von beiden Verfahren wird der Bernsteinsäure-Hemiesters mit Hyaluronsäure oder der Bernsteinsäure-Hemiester mit Hyaluronsäureester vorzugsweise mit einer wäßrigen Lösung von ZnCl₂ behandelt, um die Zn-Salze des Bernsteinsäure-Hemiesters mit Hyaluronsäure oder Hyaluronsäureester zu bilden.
Für die Herstellung der Au-Salze des Bernsteinsäure-Hemiesters mit Hyaluronsäure oder einem Hyaluronsäureester in Schritt (c) oder (c') von beiden Verfahren wird der Bernsteinsäure-Hemiesters mit Hyaluronsäure oder der Bernsteinsäure-Hemiester mit Hyaluronsäureester vorzugsweise mit einer wäßrigen Lösung von HAuCl₄ behandelt, um die Au-Salz des Bernsteinsäure-Hemiesters mit Hyaluronsäure oder Hyaluronsäureester zu bilden.
Spezifische Beispiele von Hemiestern von Bernsteinsäurederivaten mit Hyaluronsäure und Hyaluronsäureestern umfassen die folgenden:
a) Beispiel für die Herstellung von Bernsteinsäure-Hemiester mit Hyaluronsäure, der die sich wiederholende Einheit (I) hat
Beispiel 1:
Eine Lösung von Natriumhyaluronat (HA-Na, 1 g, MG 160.000) in destilliertem Wasser (35 ml) und N,N-Dimethylformamid (DMF, 100 ml) wurde in der Gegenwart von Ionenaustauscherharz (3 g, IR 120 H +) zehn Minuten gerührt, wonach das Harz nach einer weiteren Verdünnung mit DMF (100 ml) durch Filtration entfernt wurde. Die Lösung wurde dann mit einem Überschuß an Pyridin (10 ml) neutralisiert, um das Pyridinsalz von Hyaluronsäure zu ergeben (HA-Py). Die viskose Lösung wurde dann sorgfältig in einem Vakuum evaporiert, um das anwesende Wasser zu entfernen, wobei darauf geachtet wurde, daß das Gesamtvolumen der Lösung nicht unter 100 ml abfiel. Dieses Verfahren wurde dreimal wiederholt, wobei jedesmal DMF (20 ml) zugegeben wurde. Die Lösung wurde dann unter Rühren bei Raumtemperatur 24 Stunden mit Bernsteinsäureanhydrid (3 g) und Pyridin (10 ml) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde dann konzentriert, in destilliertem Wasser (20 ml) aufgenommen, gegen destilliertes Wasser dialysiert (3 mal, 750 ml) und gefriergetrocknet, um Hyaluronsäure-Bernsteinsäureester zu ergeben (930 mg).
Die Tabelle 1 zeigt die Zuordnung der Werte der chemischen Verschiebung des ¹³C-NMR (50,3 MHz)-Spektrums von Probe 1.
TABELLE 1
Die NMR-Analyse zeigt ein Maß der Reaktion mit Bernsteinsäure am Kohlenstoff 6 von N-Acetylglucosamin (N·6) von 0,2 (Mol Bernsteinsäure/Mol an sich wiederholender Einheit des Polymeren).
Beispiel 2:
Eine Lösung von Natriumhyaluronat (HA-Na, 1 g, MG 30.000) in destilliertem Wasser (35 ml) und N,N-Dimethylformamid (DMF, 100 ml) wurde in der Gegenwart von Ionenaustauscherharz (3 g, IR 120 H +) zehn Minuten gerührt, wonach das Harz nach einer weiteren Verdünnung mit DMF (100 ml) durch Filtration entfernt wurde. Die Lösung wurde dann mit einem Überschuß an Pyridin (10 ml) neutralisiert, um das Pyridinsalz von Hyaluronsäure zu ergeben (HA-Py). Die viskose Lösung wurde dann sorgfältig in einem Vakuum evaporiert, um das anwesende Wasser zu entfernen, wobei darauf geachtet wurde, daß das Gesamtvolumen der Lösung nicht unter 100 ml abfiel. Dieses das Wasser entfernende Verfahren wurde dreimal wiederholt, wobei jedesmal DMF (20 ml) zugegeben wurde. Die Lösung wurde dann unter Rühren bei 70°C 24 Stunden mit Bernsteinsäureanhydrid (3 g) und Pyridin (10 ml) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde dann konzentriert, in destilliertem Wasser (20 ml) aufgenommen, gegen destilliertes Wasser dialysiert (3 mal 750 ml) und gefriergetrocknet, um Hyaluronsäure-Bernsteinsäureester zu ergeben (900 mg).
Die Tabelle 2 zeigt die Zuordnung der Werte der chemischen Verschiebung des ¹³C-NMR (50,3 MHz)-Spektrums von Probe 2.
Tabelle 2
Die NMR-Analyse zeigt ein Maß der Reaktion mit Bernsteinsäure am Kohlenstoff 6 von N-Acetylglucosamin (N·6) von 0,45 (Mol Bernsteinsäure/Mol an sich wiederholender Einheit).
Beispiel 3:
Eine Lösung von Natriumhyaluronat (HA-Na, 0,5 g, MG 160.000) in destilliertem Wasser (35 ml) und N,N-Dimethylformamid (DMF, 100 ml) wurde in der Gegenwart von Ionenaustauscherharz (3 g, IR 120 H +) 10 Minuten gerührt, wonach das Harz nach einer weiteren Verdünnung mit DMF (75 ml) durch Filtration entfernt wurde. Die Lösung wurde dann mit einem Überschuß an Pyridin (6 ml) neutralisiert, um das Pyridinsalz von Hyaluronsäure zu ergeben (HA-Py), die viskose Lösung wurde dann sorgfältig in einem Vakuum evaporiert, um das anwesende Wasser zu entfernen, wobei darauf geachtet wurde, daß das Gesamtvolumen der Lösung nicht unter 50 ml abfiel. Dieses das Wasser entfernende Verfahren wurde dreimal wiederholt, wobei jedesmal DMF (10 ml) zugegeben wurde. Die Lösung wurde dann unter Rühren bei 70°C 48 Stunden mit Bernsteinsäureanhydrid (2 g), 4-Dimethylaminopyridin (10 mg) und Pyridin (10 ml) behandelt. Weitere Mengen an Bernsteinsäureanhydrid (1 g) und Pyridin (2,5 ml) wurden zugegeben und das Gemisch noch einmal 24 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann konzentriert, in destilliertem Wasser (20 ml) aufgenommen, gegen destilliertes Wasser dialysiert (3 mal, 750 ml) und gefriergetrocknet, um Hyaluronsäure-Bernsteinsäureester zu ergeben (450 mg). Das Produkt war durch ein hohes Maß an Viskosität charakterisiert, wenn es in Wasser gelöst war. Das NMR-Spektrum war wegen des hohen Maßes an Viskosität der Probe insbesondere durch breite Banden charakterisiert. Das Maß an Modifikation wurde durch einen potentiometrischen Test bewertet und mit 1,8 festgestellt (Mol Bernsteinsäure/Mol an sich wiederholender Einheit).
Beispiel 4:
Eine Lösung von Natriumhyaluronat (HA-Na, 0,5 g, MG 240.000) in destilliertem Wasser (60 ml) und N,N-Dimethylformamid (DMF, 60 ml) wurde in der Gegenwart von Ionenaustauscherharz (1 g, IR 120 H +) 10 Minuten gerührt, wonach das Harz nach einer weiteren Verdünnung mit DMF (50 ml) durch Filtration entfernt wurde. Die Lösung wurde dann mit einem Überschuß an Pyridin (6 l) neutralisiert, um das Pyridinsalz von Hyaluronsäure zu ergeben (HA-Py). Die viskose Lösung wurde dann sorgfältig in einem Vakuum evaporiert, um das anwesende Wasser zu entfernen, wobei darauf geachtet wurde, daß das Gesamtvolumen der Lösung nicht unter 100 ml abfiel. Dieses das Wasser entfernende Verfahren wurde dreimal wiederholt, wobei jedesmal DMF (20 ml) zugegeben wurde. Die Gelatine-ähnliche Lösung wurde dann unter Rühren bei 70°C 18 Stunden mit Bernsteinsäureanhydrid (2 g) und Pyridin (5 ml) behandelt. Weitere Mengen an Bernsteinsäureanhydrid (2,5 g) und 4-Dimethylaminopyridin (200 mg) wurden zugegeben und das Gemisch noch einmal 24 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann konzentriert, in destilliertem Wasser (20 ml) aufgenommen und gefriergetrocknet, um Hyaluronsäure-Bernsteinsäureester zu ergeben (450 mg). Das Produkt war durch ein hohes Maß an Viskosität charakterisiert, wenn es in Wasser gelöst war. Das NMR-Spektrum war wegen des hohen Maßes an Viskosität der Probe insbesondere durch breite Banden charakterisiert. Das Maß an Modifikation wurde durch einen potentiometrischen Test bewertet und das Resultat war 2,5 (Mol Bernsteinsäure/Mol an sich wiederholender Einheit).
Beispiel 5:
Eine Lösung von Natriumhyaluronat (HA-Na, 1 g, MG 40.000) in destilliertem Wasser (60 ml) und N,N-Dimethylformamid (DMF, 60 ml) wurde in der Gegenwart von Ionenaustauscherharz (1 g, IR 120 H +) 10 Minuten gerührt, wonach das Harz nach einer weiteren Verdünnung mit DMF (50 ml) durch Filtration entfernt wurde. Die Lösung wurde dann mit einem Überschuß an Pyridin (10 ml) neutralisiert, um das Pyridinsalz von Hyaluronsäure zu ergeben (HA-Py). Die viskose Lösung wurde dann sorgfältig in einem Vakuum evaporiert, um das anwesende Wasser zu entfernen, wobei darauf geachtet wurde, daß das Gesamtvolumen der Lösung nicht unter 50 ml abfiel. Dieses das Wasser entfernende Verfahren wurde dreimal wiederholt, wobei jedesmal DMF (20 ml) zugegeben wurde. Die Lösung wurde dann unter Rühren bei 70°C 18 Stunden mit Bernsteinsäureanhydrid (3 g) und Pyridin (10 ml) behandelt. Weitere Mengen an Bernsteinsäureanhydrid (2,5 g) und 4-Dimethylaminopyridin (200 mg) wurden zugegeben und das Gemisch noch einmal 24 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch, das von brauner Farbe war, wurde dann konzentriert, in destilliertem Wasser (20 ml) aufgenommen, gegen destilliertes Wasser dialysiert (3 mal 750 ml) und gefriergetrocknet, um Hyaluronsäure-Bernsteinsäureester zu ergeben (850 mg). Das Maß an Veresterung mit Bernsteinsäure wurde durch einen potentiometrischen Test bewertet und das Resultat war 3,5 (Mol Bernsteinsäure/Mol an sich wiederholender Einheit).
Beispiel 6:
Eine Lösung von Natriumhyaluronat (HA-Na, 0,5 g, MG 760.000) in destilliertem Wasser (60 ml) und N,N-Dimethylformamid (DMF, 60 ml) wurde in der Gegenwart von Ionenaustauscherharz (1 g, IR 120 H +) 10 Minuten gerührt, wonach das Harz nach einer weiteren Verdünnung mit DMF (50 ml) durch Filtration entfernt wurde. Die Lösung wurde dann mit einem Überschuß an Pyridin (6 ml) neutralisiert, um das Pyridinsalz von Hyaluronsäure zu ergeben (HA-Py). Die viskose Lösung wurde dann sorgfältig evaporiert, um das anwesende Wasser zu entfernen, wobei darauf geachtet wurde, daß das Gesamtvolumen der Lösung nicht unter 50 ml abfiel. Dieses Verfahren wurde dreimal wiederholt, wobei jedesmal DMF (20 ml) zugegeben wurde. Die Gelatine-ähnliche Lösung wurde dann mit Bernsteinsäureanhydrid (2 g) und 4-Dimethylaminopyridin (200 mg) behandelt und das Gemisch noch einmal 24 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann konzentriert, in destilliertem Wasser (20 ml) aufgenommen, gegen destilliertes Wasser dialysiert (3 mal 750 ml) und gefriergetrocknet, um Hyaluronsäure-Bernsteinsäureester zu ergeben (430 mg). Das Produkt war durch ein hohes Maß an Viskosität charakterisiert, wenn es in Wasser gelöst war. Das NMR-Spektrum war wegen des hoch viskosen Charakters der Proben insbesondere durch breite Banden charakterisiert. Das Maß an Modifikation wurde durch einen potentiometrischen Test bewertet und war 2,5 (Mol Bernsteinsäure/Mol an sich wiederholender Einheit).
b) Beispiele für die Herstellung von Silbersalzen von O-Bernsteinsäure-Hyaluronat
Beispiel 7
100 mg O-Bernsteinsäure-Hyaluronat, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden in 10 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die Polymerlösung wurde dann mit 10 ml einer Lösung von 1N AgNO₃ ergänzt. Der so gebildete weiße Niederschlag wurde unter konstantem Rühren zwei Stunden in Suspension gehalten und dann mittels Filtration durch einen Buchner-Trichter gesammelt, mehrmals mit Ethanol gewaschen und in einem Vakuumofen getrocknet, der auf 40°C eingestellt war. Alle diese Handhabungen wurden im Dunkeln durchgeführt, um die Bildung von Silberoxid zu vermeiden. Die Atomabsorptionsanalyse zeigte einen Silbergehalt von 23,5 Gew.-%, was 87 % des theoretischen stöchiometrischen Werts entspricht.
Beispiel 8
70 mg Hyaluronsäure-Bernsteinsäureester, hergestellt wie in Beispiel 3 beschrieben, wurden in 14 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die Polymerlösung, die hoch viskos war, wurde mit 14 ml einer Lösung von 1N AgNO₃ ergänzt. Es bildete sich sofort ein grauer Niederschlag und wurde unter konstantem Rühren zwei Stunden in Suspension gehalten, wonach er mittels Filtration durch einen Buchner-Trichter gesammelt wurde. Er wurde mehrmals mit Ethanol gewaschen und in einem Vakuumofen getrocknet, der auf 40°C eingestellt war. Alle diese Handhabungen wurden im Dunkeln durchgeführt, um die Bildung von Silberoxid zu vermeiden. Die Atomabsorptionsanalyse zeigte einen Silbergehalt von 27 Gew.-%, was 71 % des theoretischen stöchiometrischen Werts entspricht.
Beispiel 9
100 mg Hyaluronsäure-Bernsteinsäureester, hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben, wurden in 20 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die Polymerlösung, die hoch viskos war, wurde mit 20 ml einer Lösung von 2N AgNO₃ ergänzt. Es bildete sich sofort ein weißer Niederschlag und wurde unter konstantem Rühren zwei Stunden in Suspension gehalten. Dann wurde er mittels Filtration durch einen Buchner-Trichter gesammelt, mehrmals mit Ethanol gewaschen und in einem Vakuumofen getrocknet, der auf 40°C eingestellt war. Alle diese Handhabungen wurden im Dunkeln durchgeführt, um die Bildung von Silberoxid zu vermeiden. Die Atomabsorptionsanalyse zeigte einen Silbergehalt von 28,8 Gew.-%, was 70,5 % des theoretischen stöchiometrischen Werts entspricht.
Beispiel 10
100 mg Hyaluronsäure-Bernsteinsäureester, hergestellt wie in Beispiel 5 beschrieben, wurden in 10 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die Polymerlösung, die hoch viskos war, wurde mit 10 ml einer Lösung von 1N AgNO₃ ergänzt. Es bildete sich sofort ein bräunlicher Niederschlag, der unter konstantem Rühren zwei Stunden in Suspension gehalten wurde, wonach er mittels Filtration durch einen Buchner-Trichter gesammelt, mehrmals mit Ethanol gewaschen und in einem Vakuumofen getrocknet wurde, der auf 40°C eingestellt war. Alle diese Handhabungen wurden im Dunkeln durchgeführt, um die Bildung von Silberoxid zu vermeiden. Die Atomabsorptionsanalyse zeigte einen Silbergehalt von 31 %, was 70,2 % des theoretischen stöchiometrischen Werts entspricht.
Beispiel 11
100 mg Hyaluronsäure-Bernsteinsäureester, hergestellt wie in Beispiel 6 beschrieben, wurden in 10 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die Polymerlösung, die hoch viskos war, wurde mit 10 ml einer Lösung von 1N AgNO₃ ergänzt. Es bildete sich sofort ein bräunlicher Niederschlag, der unter konstantem Rühren zwei Stunden in Suspension gehalten wurde, wonach er mittels Filtration durch einen Buchner-Trichter gesammelt, mehrmals mit Ethanol gewaschen und in einem Vakuumofen getrocknet wurde, der auf 40°C eingestellt war. Alle diese Handhabungen wurden im Dunkeln durchgeführt, um die Bildung von Silberoxid zu vermeiden. Die Atomabsorptionsanalyse zeigte einen Silbergehalt von 27 Gew.-%, was 71 % des theoretischen stöchiometrischen Werts entspricht.
c) Beispiele für die Herstellung von Zinksalzen von Hyaluronsäure-Bernsteinsäureester
Beispiel 12:
100 mg Hyaluronsäure-Bernsteinsäureester, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden in 10 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die Polymerlösung wurde dann mit 10 ml einer Lösung von 0,2 N ZnCl₂ ergänzt. Die Lösung wurde 2 Stunden konstant gerührt, wonach 3 Volumina Ethanol zugegeben wurden, um das lösliche Zinksalz auszufällen. Der Niederschlag wurde durch 15 Minuten Zentrifugation bei 3.000 U/Min gewonnen, mehrmals mit Ethanol gewaschen und in einem Vakuumofen getrocknet, der auf 40°C eingestellt war. Die Atomabsorptionsanalyse zeigte einen Zinkgehalt von 10 %, was 101 % des theoretischen stöchiometrischen Werts entspricht.
Beispiel 13:
100 mg Hyaluronsäure-Bernsteinsäureester, hergestellt wie in Beispiel 3 beschrieben, wurden in 20 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die Polymerlösung, die hoch viskos war, wurde mit 20 ml einer Lösung von 2 N ZnCl₂ ergänzt. Nach der Zugabe des Zinksalzes bildete sich ein pulveriger Niederschlag, der durch 15 Minuten Zentrifugation bei 3.000 U/Min gewonnen, mehrmals mit Ethanol gewaschen und in einem Vakuumofen getrocknet wurde, der auf 40°C eingestellt war. Die Atomabsorptionsanalyse zeigte einen Zinkgehalt in der Probe von 15,3 %, was 105 des theoretischen stöchiometrischen Werts entspricht.
Beispiel 14:
100 mg Hyaluronsäure-Bernsteinsäureester, hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben, wurden in 20 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die Polymerlösung, die hoch viskos war, wurde mit 20 ml einer Lösung von 2 N ZnCl₂ ergänzt. Nach der Zugabe des Zinksalzes bildete sich ein pulveriger Niederschlag, der durch 15 Minuten Zentrifugation bei 3.000 U/Min gewonnen, mehrmals mit Ethanol gewaschen und in einem Vakuumofen getrocknet wurde, der auf 40°C eingestellt war. Die Atomabsorptionsanalyse zeigte einen Zinkgehalt in der Probe von 17,7 %, was 105 des theoretischen stöchiometrischen Werts entspricht.
d) Beispiel der Herstellung des Kupfersalzes von Hyaluronsäure-Bernsteinsäureester
Beispiel 15:
100 mg Hyaluronsäure-Bernsteinsäureester, hergestellt wie in Beispiel 5 beschrieben, wurden in 10 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die Polymerlösung wurde mit 10 ml einer Lösung von 2 N CuCl₂ ergänzt ergänzt. Nach der Zugabe des Kupfersalzes bildete sich ein blauer Niederschlag, der durch 15 Minuten Zentrifugation bei 3.000 U/Min gewonnen, mehrmals mit Ethanol gewaschen und in einem Vakuumofen bei 40°C getrocknet wurde. Die Atomabsorptionsanalyse zeigte einen Kupfergehalt in der Probe von 21,4 %, was 110 % des theoretischen stöchiometrischen Werts entspricht. Es ist daher wahrscheinlich, daß eine kleine Menge an Kupfersalz während des Ausfällens des Derivats durch das Polymer eingebaut wird.
e) Beispiel der Herstellung des Goldsalzes von Hyaluronsäure-Bernsteinsäureester
Beispiel 16:
100 mg Hyaluronsäure-Bernsteinsäureester, hergestellt wie in Beispiel 3 beschrieben, wurden in 20 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die Polymerlösung, die hoch viskos war, wurde mit 20 ml einer Lösung von 0,5 N HAuCl₄ ergänzt. Nach der Zugabe des Goldsalzes bildete sich ein Niederschlag, der durch 15 Minuten Zentrifugation bei 3.000 U/Min gewonnen, mehrmals mit Ethanol gewaschen und in einem Vakuumofen bei 40°C getrocknet wurde. Der Goldgehalt in der Probe stellte sich mit 13 Gew.-% heraus, was 44 % des theoretischen stöchiometrischen Werts entspricht.
Die Hyaluronsäurederivate können allein oder in Verbindung miteinander oder mit natürlichen, semisynthetischen oder synthetischen Polymeren verwendet werden. Einige natürliche Polymere, die verwendet werden können, sind zum Beispiel Kollagen, Co-Präzipitate von Kollagen und Glycosaminoglycanen, Cellulose, Polysaccharide in Form von Gelen wie Chitin, Chitosan, Pektin oder Pektinsäure, Agar, Agarose, Xanthan, Gellan-Gummi, Alginsäure oder Alginate, Polymannan oder Polyglycane, Stärke, natürliche Gummis. Die semisynthetischen Polymere können zum Beispiel ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Kollagen, vernetzt mit Wirkstoffen wie Aldehyden oder Aldehydvorläufern, Dicarbonsäuren oder ihren Halogeniden, Diaminen, Derivaten der Cellulose, Chitin oder Chitosan, Gellan-Gummi, Xanthan, Pektin oder Pektinsäure, Polyglycane, Polymannan, Agar, Agarose, natürliche Gummis, Glycosaminoglycane. Letztlich sind Beispiele von synthetischen Polymeren, die verwendet werden können, wie folgt: Polymilchsäure, Polyglycolsäure oder Copolymere derselben oder ihrer Derivate, Polydioxane, Polyphosphazen, Polysulphonharze, Polyurethanharze, PTFE.
Von den Hyaluronsäureestern, die bei der vorliegenden Patentanmeldung verwendet werden können, wird es bevorzugt, die Benzylester, Ethylester oder Propylester zu verwenden, wobei 50–100 % der Carboxygruppen verestert sind, vorzugsweise 60–100 %; mehr bevorzugt 75–100 % der Carboxygruppen verestert. Besonders bevorzugt sind die Benzylester mit 75 bis 100 % ihrer Carboxygruppen verestert und der verbleibende Prozentsatz in der Salzform mit Alkali- und Erdalkalimetallen, bevorzugt Natrium. Ebenfalls bevorzugt sind Esterderivate von Hyaluronsäure, worin ein Teil der Carboxygruppen mit einem araliphatischen Alkohol verestert sind und ein zweiter Teil der Carboxygruppen mit einem geraden aliphatischen Alkohol von 10–22 Kohlenstoffatomen verestert sind. Von solchen Esterderivaten sind die folgenden Verbindungen besonders bevorzugt:

• Hyaluronsäure, verestert mit Benzylalkohol (75 %) und Dodecylalkohol (25 %)
• Hyaluronsäure, verestert mit Benzylalkohol (75 %) und Hexadecylalkohol (25 %)
• Hyaluronsäure, verestert mit Benzylalkohol (75 %) und Octadecylalkohol (25 %)
• Hyaluronsäure, verestert mit Benzylalkohol (75 %), Eicosanylalkohol (20 %) und in der Salzform mit Natrium (5 %); und
• Hyaluronsäure, verestert mit Benzylalkohol (75 %), Docosanylalkohol (15 %) und in der Salzform mit Natrium (10 %)

Die bevorzugten vernetzten Derivate der vorliegenden Erfindung sind diejenigen mit zwischen 0,5 % und 50 % Vernetzung; vorzugsweise zwischen 0,5 und 20 % und mehr bevorzugt zwischen 3 % und 10 %.
Die besagten Biomaterialien können in der Form von Filmen, Gelen, Schwämmen, Gazen, Vliesstoffen, Membranen, Microspheren, Microkapseln und Führungskanälen gemäß den Verfahren hergestellt werden, die in den Patenten Nr. EP 0216453 , EP 0341745 , US 5,520,916 , EP 0517565 , EP 0571415 , WO 94/03212 beschrieben sind.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Polysaccharidderivate in der Form von Fäden hergestellt. Von besonderem Interesse sind Fäden, die aus Esterderivaten von Hyaluronsäure gemacht wurden, bei denen ein erster Teil der Carboxygruppen mit einem araliphatischen Alkohol wie Benzylalkohol verestert ist und ein zweiter Teil der Carboxygruppen mit einem langkettigen, geraden aliphatischen Alkohol von 10–22 Kohlenstoffatomen derivatisiert ist, wie diejenigen, die in der Internationalen Patentanmeldung Nr. WO 98/08876 offenbart sind.
Die Fäden können gegebenenfalls auch andere biokompatible Polymere enthalten, wie Polycaprolacton, Polyglycolsäure, Polymilchsäure, PTFE und Polyhydroxybutyrat. Die Fäden, die aus Hyaluronsäurederivaten gemacht wurden, können als Fäden zum Vernähen bei Anastomose verwendet werden, insbesondere auf dem kardiovaskulären Gebiet, oder die Fäden können zur Herstellung von Schlingen, gestricktem Material, Vliesstoffen, Röhren oder anderen Materialien verwendet werden, die um ein Gefäß oder andere Organe herum verwendet werden können, bei denen eine Anastomose stattgefunden hat.
Darüber hinaus können diese Biomaterialien durch Assoziationen von Derivaten von Hyaluronsäure, Gellan oder Alginat in verschiedenen anderen Formen gebildet werden und können pharmakologisch aktive Substanzen wie hämostatische und entzündungshemmende Mittel, Antibiotika, antithrombotische Mittel, Faktoren, die Plasminogen aktivieren können, und/oder Wachstumsfaktoren enthalten.
Von besonderem Interesse ist der Einbau von hämostatischen Mitteln in den Biomaterialien. Beispiele für hämostatische Mittel, die enthalten sein können, sind Adrenalon, Adrenochrom, Aminochrom, Batroxobin, Carbazochrom-Salicylat, Carbazochrom-Natriumsulfonat, Cephaline, Cotarnin, Ethamsylat, die Faktoren VIII, IX, XII, Fibrinogen, 1,2-Naphthochinon, 1-Naphthylamin-4-sulfonsäure, Oxamarin, oxidierte Cellulose, styptisches Collodion, Sulmarin, Thrombin, Thromboplastin, Toloniumchlorid, tranexamische Säure, Vasopressin und die Vitamine K2, K5 und KS(II).
Es kann von besonderem Interesse sein, die Biomaterialien gemäß der vorliegenden Erfindung allein oder in Assoziation miteinander, möglichst mit den vorstehend erwähnten Derivaten, bei der Chirurgie wie der kardiovaskulären und peritonealen Chirurgie unter Verwendung ihrer Fähigkeit der Absorption von Körperflüssigkeiten und damit der Reduktion der Ansammlung an Stellen, die von der chirurgischen Operation betroffen sind, zu verwenden.
Der besagte Effekt der Absorption von Körperflüssigkeiten kann vorteilhaft bei der Anastomose-Chirurgie verwendet werden, wo eine solche Ansammlung vermieden werden sollte.
BEISPIELHAFTE AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
Beispiel 1
Bewertung der Reaktion von vaskulärem und perivaskulärem Gewebe in der Ratte auf Biomaterialien, die einen Benzylester der Hyaluronsäure mit 80 Veresterung in der Form eines Films und ein zu 5 % autovernetztes Derivat der Hyaluronsäure in der Form eines Gels enthalten.
Materialien und Methoden
Die vorläufige Analyse von 8 Ratten bestätigte, daß die bevorzugte Form des Biomaterials für die post-anastomotische Behandlung von Venen eine Gelform ist, während im Falle der post-anastomotischen Behandlung von Arterien die bevorzugte Behandlung ein Film ist, oder ein Gel, wenn die Blutung gering ist.
Gele sind bevorzugt bei der post-anastomotische Behandlung von Venen, weil die Anwendung von einem Film bei Venen eine übermäßige Konstriktion des Gefäßes verursachen kann. Gele verursachen keine solche Konstriktion und die adhärenten Eigenschaften eines Gels erlauben die Versiegelung der Verbindungsstelle und verhindern das Bluten durch die Stiche.
Weil der Blutdruck in Arterien sehr hoch ist, ist es geeigneter, einen Film zu verwenden, oder im Falle von nur geringem Bluten kann ein Gel geeignet sein.
48 erwachsene männliche Sprague Dawley-Ratten mit einem durchschnittlichen Gewicht von 370 g (zwischen 295 g und 480 g) wurden verwendet.
Die Ratten wurden zunächst mit Ether betäubt, wonach sie über den intraperitonealen Weg 40 mg/kg Pentothal erhielten und eine Sektion der Oberschenkelgefäße erlitten.
Die Durchmesser der Gefäße wurden mit Millimeterpapier gemessen, bevor die Zirkulation mit Klammern unterbunden und das Gefäß durchschnitten wurde.
Die Tiere wurden in zwei Gruppen von 24 Ratten aufgeteilt.
Erste Gruppe – 24 Ratten
Jede Ratte erfuhr eine venöse Anastomose in beiden Hinterläufen.
In dieser Gruppe erfuhren zunächst die Venen von beiden Hinterläufen eine Anastomose mit zwischen 8 und 10 Vernähungsstichen, wonach einer mit Gel von autovernetztem Material behandelt wurde, das um die Vernähungslinie aufgebracht wurde, bevor der Blutfluß wieder hergestellt wurde, während die Vene in dem anderen Lauf nicht mit dem Biomaterial behandelt wurde und deshalb die Kontrolle darstellte.
Zweite Gruppe – 24 Ratten
Jede Ratte erfuhr eine venöse Anastomose in einem Hinterlauf und eine arterielle Anastomose in dem anderen Hinterlauf.
Die Venen wurden mit Gel von autovernetztem Material bedeckt und die Arterien mit dem Film von Hyaluronsäurebenzylester.
Jede Gruppe wurde in 4 Untergruppen von je 6 Ratten unterteilt und ihre Anastomose nach der Aufbringung des Biomaterial nach 10, 15, 25 und 45 Tagen betrachtet und die Proben wurden histologisch untersucht.
Eine klinische Bewertung der Durchgängigkeit der Gefäße wurde mit dem Durchgängigkeitstest gemäß O'Brien, B. McC. (1997, "Microvascular Reconstructive Surgery", Edinburgh: Churchill Livingstone) durchgeführt.
Proben an perivaskulärem Gewebe wurden betrachtet, um das Auftreten von Fibrose und Adhäsionen zu bewerten.
Resultate:
Die Resultate der Tests sind in den Tabellen 1 und 2 zusammengestellt.
15 Oberschenkelvenen stellten sich als verschlossen heraus und 57 als durchgängig (Durchgängigkeitsrate 79,17 %).
Tabelle 1

Venen + Gel Venen, behandelt mit Gel mit autovernetzter Hyaluronsäure
Arterien + Film Arterien, behandelt mit einem Film von Hyaluronsäurebenzylester

Tabelle 2
Die Resultate zeigten eine Reduktion bei der mittleren Blutungszeit, vor allem im Fall der mit Gel behandelten Venen, das aus autovernetzter Verbindung gemacht wurde, weniger Fibrose und eine reduzierte Bildung von Narbengewebe um das behandelte Gefäß.
Die histologische Analyse der Proben, die an etwa 20 Gefäßen durchgeführt wurde, die zufällig aus der ersten und zweiten Gruppe nach verschiedenen Tagen ausgewählt wurden, zeigte, daß die Venen und Arterien im Allgemeinen durchlässig waren, obwohl sie in einigen Fällen durch geringe fibröse Verdickung der Intima leicht verengt waren. Es gab nur einen Fall eines kleinen Thrombus, der an der Gefäßwand hängend beobachtet werden konnte.
Das Endothel war nicht hypertroph, es hatte keine sichtbare Fibrose oder Adhärenz und erschien insgesamt fein und gleichmäßig. Die Färbung mit Hämatoxylin/Eosin zeigte keinerlei anderen strukturellen Veränderungen der vaskulären Wände neben sporadischen Gebieten von Fibrose, die den vernarbenden Effekten der Chirurgie zuzuschreiben sind.
Das chirurgische Material, das für die Operation verwendet wurde und das unter dem Mikroskop als amorphes, fremdes, doppelt brechendes Material erschien, war umgeben von Flecken einer granulomatösen Reaktion, die durch die Anwesenheit von Lymphocyten, Plasmazellen und vielkernigen Histocyten charakterisiert war.
Es gab keine Anzeichen einer Entzündung vom Granulocyten-Typus.
Bei der so beschriebenen Erfindung ist es klar, daß diese Verfahren auf vielerlei Art modifiziert werden können. Solche Modifikationen sind nicht als abweichend vom Zweck der Erfindung zu betrachten und jede Modifikation, die einem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet offensichtlich erscheint, ist als im Umfang der folgenden Ansprüche liegend zu betrachten.

Claims

Verwendung von Biomaterialien, umfassend mindestens ein Hyaluronsäurederivat, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hyaluronsäureester, Hemiester der Bernsteinsäure mit Hyaluronsäure und Amidderivaten der Hyaluronsäure, gegebenenfalls in Verbindung mit natürlichen, semisynthetischen oder synthetischen Polymeren und/oder mit pharmazeutisch aktiven Stoffen mit physikalischen hämostatischen Eigenschaften für die Herstellung eines Biomaterials zum Einbetten einer Operationsstelle während einer anastomotischen Operation, wodurch Hämostase bewirkt wird.
Verwendung von Biomaterialien nach Anspruch 1, wobei das Hyaluronsäurederivat ein Hyaluronsäureester ist, wobei die Carboxylfunktionen teilweise oder vollständig verestert sind mit Alkoholen der aliphatischen, aromatischen, arylaliphatischen, cycloaliphatischen, heterocyclischen Reihen.
Verwendung von Biomaterialien nach Anspruch 1, wobei das Hyaluronsäurederivat ein selbstvernetzter Ester der Hyaluronsäure ist, wobei die Carboxygruppen teilweise oder vollständig verestert sind mit alkoholischen Funktionen der selben Polysaccharidkette oder anderer Ketten.
Verwendung von Biomaterialien nach Anspruch 1, wobei das Hyaluronsäurederivat eine vernetzte Verbindung der Hyaluronsäure ist, wobei die Carboxygruppen teilweise oder vollständig verestert sind mit Polyalkoholen der aliphatischen, aromatischen, arylaliphatischen, cycloaliphatischen, heterocyclischen Reihen, wobei die Vernetzung durch Abstandhalter-Ketten bewirkt wird.
Verwendung von Biomaterialien nach Anspruch 1, wobei das Hyaluronsäurederivat eine Hyaluronsäureverbindung ist, in der ein Teil der Carboxygruppen mit einem araliphatischem Alkohol verestert ist und ein zweiter Teil der Carboxygruppen mit geraden, aliphatischen Alkoholen von 10–22 Kohlenstoffatomen derivatisiert ist.
Verwendung von Biomaterialien nach Anspruch 1, wobei das Hyaluronsäurederivat ein Hemiester der Bernsteinsäure oder Schwermetallsalze des Hemiesters der Bernsteinsäure mit Hyaluronsäure oder mit Teil- oder vollständigen Estern der Hyaluronsäure sind.
Verwendung von Biomaterialien nach Anspruch 1, wobei die natürlichen Polymere ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Kollagen, Co-Präzipitaten von Kollagen und Glycosaminglykanen, Cellulose, Polysacchariden in Form von Gelen wie Chitin, Chitosan, Pektin oder Pektinsäure, Agar, Agarose, Xanthan, Gellan-Gummi, Alginsäure oder Alginaten, Polymannan oder Polyglykanen, Stärke, natürlichen Gummis.
Verwendung von Biomaterialien nach Anspruch 1, wobei die semisynthetischen Polymere ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Kollagen vernetzt mit Wirkstoffen wie Aldehyden oder Aldehydvorläufern, Dicarbonsäuren oder ihren Halogeniden, Diaminen, Derivaten der Cellulose, Hyaluronsäure, Chitin, Chitosan, Gellan-Gummi, Xanthan, Pektin oder Pektinsäure, Polyglykanen, Polymannan, Agar, Agarose, natürlichen Gummis, Glycosaminglykanen.
Verwendung von Biomaterialien nach Anspruch 1, wobei die synthetischen Polymere ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Polymilchsäure, Polyglycolsäure oder Copolymeren der Polyglycolsäure oder Derivaten davon, Polydioxan, Polyphosphazen, Polysulphonharzen, Polyurethanharzen, PTFE.
Verwendung von Biomaterialien nach Anspruch 2, wobei die Esterderivate der Hyaluronsäure zu 60 bis 100% verestert sind.
Verwendung von Biomaterialien nach Anspruch 3, wobei die selbstvernetzten Derivate der Hyaluronsäure zu 0,5 bis 20%, vorzugsweise zwischen 3% und 10%, selbstvernetzt sind.
Verwendung von Biomaterialien nach einem der Ansprüche 1 bis 11 in Form von Filmen, Gelen, Schwämmen, Gazen, Vliesstoff, Membranen, Microspheren, Microkapseln, Fäden, Führungskanälen und Kombinationen davon.
Verwendung von Biomaterialien nach Anspruch 1, wobei die pharmakologisch aktiven Stoffe ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus entzündungshemmenden oder hämostatischen Wirkstoffen, Antibiotika, Antithrombotika, Faktoren, welche Plasminogen aktivieren können, und Wachstumsfaktoren.
Verwendung von Biomaterialien nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die pharmakologisch aktiven Stoffe Fibrinogen und Thrombin sind.
Verwendung von Biomaterialien nach einem der Ansprüche 1 bis 14 bei kardiovaskulären und Peritonealoperationen.