DE69835360T2

DE69835360T2 - EVOLUTION Prokaryotischer GANZER ZELLEN DURCH REKURSIVE SEQUENZREKOMBINATION

Info

Publication number: DE69835360T2
Application number: DE69835360T
Authority: DE
Inventors: B. Stephen Los Gatos DELCARDAYRE; B. Mathew Santa Clara TOBIN; P. Willem Los Gatos STEMMER; E. Jon Sunnyvale NESS; Jeremy Menlo Park MINSHULL; Phillip Mountain View PATTEN
Original assignee: Maxygen Inc
Current assignee: Maxygen Inc
Priority date: 1997-01-17
Filing date: 1998-01-16
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2018-01-17
Also published as: ATE334225T1; KR100568008B1; KR100570935B1; AU743305B2; EP1717322A3; US6352859B1; KR20050043983A; JP4062366B2; KR20000070258A; US6251674B1; JP2001508662A; EP1717322A2; EP1007732A1; EP1007732A4; IL130635A0; CA2276064C; ES2270505T3; DE69835360D1; AU743305C; CA2276064A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die Erfindung betrifft das technische Gebiet der molekularen Genetik, um die Genome von bakteriellen oder archaebakteriellen Zellen zu evolvieren bzw. zu entwickeln, um neue und verbesserte Eigenschaften zu erlangen.
HINTERGRUND
Zellen weisen eine Vielzahl von gut etablierten Verwendungen in der Molekularbiologie auf. Zum Beispiel werden Zellen für gewöhnlich als Wirte für das Manipulieren von DNA in Vorgängen wie Transformation und Rekombination verwendet. Zellen werden auch für die Expression von rekombinanten Proteinen, die durch DNA kodiert werden, die in die Zellen transformiert wurde, verwendet. Obwohl all diese Vorgänge jetzt Routineverfahren sind, haben sich die Genome der in diesen Vorgängen verwendeten Zellen wenig von den Genomen von natürlichen Zellen entwickelt, und insbesondere nicht in Richtung der Erlangung von neuen und verbesserten Eigenschaften für die Verwendung in den obigen Vorgängen.
Der traditionelle Ansatz für die künstliche oder erzwungene molekulare Evolution fokussiert auf die Optimierung eines einzelnen Gens mit einem diskreten bzw. getrennten und selektierbaren Phänotyp. Die Strategie ist, ein Gen zu klonieren, eine diskrete Funktion für das Gen und einen Assay, durch den es selektiert werden kann, zu identifizieren, ausgewählte Positionen in dem Gen zu mutieren (z.B. durch fehleranfällige PCR oder Kassettenmutagenese) und Varianten des Gens für die Verbesserung der bekannten Funktion des Gens zu selektieren bzw. auswählen. Eine Variante mit verbesserter Funktion kann anschließend in einem gewünschten Zelltyp exprimiert werden. Dieser Ansatz weist eine Vielzahl von Be schränkungen auf. Zunächst ist er nur auf Gene anwendbar, die isoliert und funktionell charakterisiert wurden. Zweitens ist der Ansatz für gewöhnlich nur auf Gene anwendbar, die eine diskrete Funktion aufweisen. Mit anderen Worten können multiple Gene, die kooperativ einen einzelnen Phänotyp verleihen, für gewöhnlich nicht auf diese Weise optimiert werden. Wahrscheinlich weisen die meisten Gene kooperative Funktionen auf. Schließlich kann dieser Ansatz nur eine sehr begrenzte Zahl der Gesamtzahl von Permutationen selbst für ein einzelnes Gen untersuchen. Zum Beispiel würde das Variieren selbst jeder zehnten Position in einem Protein mit jeder möglichen Aminosäure 20¹⁰ Varianten bilden, was mehr ist als durch bestehende Verfahren der Transfektion und des Screenens bearbeitet werden kann.
Angesichts dieser Beschränkungen ist der traditionelle Ansatz für das Verbessern zellulärer Genome zu vielen nützlichen Eigenschaften unzureichend. Um zum Beispiel die Kapazität einer Zelle, ein rekombinantes Protein zu exprimieren, zu verbessern kann eine Modifikation in irgendeinem oder allen einer substanziellen Zahl von Genen, die bekannt oder unbekannt sind, die Rollen in der Transkription, Translation, posttranslationalen Modifikation, Sekretion oder proteolytischen Degradation, unter anderem, spielen, erforderlich machen. Der Versuch, einzeln selbst alle der bekannten Gene mit solchen Funktionen zu optimieren, wäre eine nahezu unmögliche Aufgabe, ganz zu schweigen von der Optimierung bislang unbekannter Gene, die zu der Expression in bislang noch nicht verstandenen Weisen beitragen können.
Die vorliegende Erfindung stellt inter alia neue Verfahren zum Entwickeln des Genoms von ganzen Zellen bereit, welche die Schwierigkeiten und Beschränkungen der Verfahren des Standes der Technik überwinden.
Hopwood ("The Many Faces of Recombination" in Genetics of Industrial Microorganisms, Seiten 1–9, American Society for Microbiology, Washington, 1979) schlägt die Verwendung von Protoplasten Fusion in einem verbesserten Programm für bakterielle Stämme vor.
DEFINITIONEN
Der Begriff "verwandt" betrifft eine Gen Sequenz, die entwicklungsgeschichtlich und funktionell zwischen Spezies verwandt ist. Zum Beispiel ist in dem humanen Genom das humane CD4 Gen das verwandte Gen zu dem Maus CD4 Gen, weil die Sequenzen und Strukturen dieser zwei Gene anzeigen, dass sie stark homolog sind, und beide Gene kodieren ein Protein, das in der Signal T-Zell-Aktivierung durch MHC Klasse II-restringierte Antigen Erkennung wirkt.
Das Screenen ist im Allgemeinen ein Vorgang mit zwei Schritten, in dem der erste bestimmt, welche Zellen einen Screening Marker exprimieren und welche nicht und anschließend die Zellen mit der gewünschten Eigenschaft physisch trennt. Die Selektion ist eine Form des Screenens, in der die Identifizierung und physikalische Trennung gleichzeitig durch die Expression eines Selektionsmarkers erreicht werden, der, unter bestimmten genetischen Umständen, es Zellen, die den Marker exprimieren, erlaubt, zu überleben, während andere Zellen absterben (oder vice versa). Screening Marker schließen Luciferase, β-Galctosidase und grünes fluoreszierendes Protein ein. Selektionsmarker schließen Arzneimittel und Toxin Resistenzgene ein.
Ein exogenes DNA-Fragment ist eines, das fremd (oder heterolog) für die Zelle oder homolog für die Zelle ist, aber in einer Position innerhalb der Wirtszell Nukleinsäure, in der das Element für gewöhnlich nicht gefunden wird. Exogene DNA Segmente können exprimiert werden, um exogene Polypeptide zu erhalten.
Der Begriff "Gen" wird breit verwendet, um irgendein Segment von DNA zu bedeuten, das mit einer biologischen Funktion assoziiert ist. Somit schließen Gene kodierende Sequenzen und/oder regulatorische Sequenzen ein, die für ihre Expression benötigt werden. Gene schließen auch nicht exprimierte DNA Segmente ein, die zum Beispiel Erkennungssequenzen für andere Proteine bilden.
Die prozentuale Sequenz Identität wird berechnet durch das Vergleichen von zwei optimal ausgerichteten Sequenzen über ein Vergleichsfenster, das Bestimmen der Zahl von Positionen, an denen identische Nukleinsäure Basen in beiden Sequenzen auftreten, um die Zahl der übereinstimmenden Positionen zu erhalten, das Dividieren der Zahl von übereinstimmenden Positionen durch die Gesamtzahl von Positionen in dem Vergleichsfenster. Eine optimale Ausrichtung von Sequenzen für die Ausrichtung eines Vergleichsfensters können durch die Rechner gestützte Implementierung der Algorithmen GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA in dem Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI durchgeführt werden.
Der Begriff "natürlich vorkommend" wird verwendet, um ein Objekt zu beschreiben, das in der Natur gefunden werden kann. Zum Beispiel ist eine Polypeptid oder Polynukleotid Sequenz, die in einem Organismus (einschließlich Viren) anwesend ist, die aus einer Quelle in der Natur isoliert werden kann, und die nicht absichtlich durch den Menschen in einem Labor modifiziert wurde, natürlich vorkommend. Im Allgemeinen betrifft der Begriff "natürlich vorkommend" ein Objekt, wie es in einem nicht pathologischen (nicht erkrankten) Individuum anwesend ist, wie es für die Spezies typisch ist.
Eine asexuelle Rekombination ist eine Rekombination, die ohne die Fusion von Gameten stattfindet, um eine Zygote zu bilden.
ZUSAMMENFASSUNG DER BEANSPRUCHTEN ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft Verfahren zum Entwickeln von Bakterien oder Archaebakterien, um eine gewünschte Eigenschaft zu erlangen, wie in den Ansprüchen angegeben ist. Solche Verfahren können das Einführen von Genom Fragmenten in eine Vielzahl von Zellen mit sich bringen, wobei mindestens eines der Fragmente eine Rekombination mit einem Segment in dem Genom oder einem Episom der Zellen durchläuft, um modifizierte Zellen zu bilden. Die modifizierten Zellen werden anschließend hinsichtlich modifizierter Zellen gescreent, die sich in Richtung der Erlangung der gewünschten Funktion entwickelt haben. DNA aus den modifizierten Zellen, die sich in Richtung der gewünschten Funktion entwickelt haben, wird anschließend mit weiteren genomischen Fragmenten rekombiniert, von denen mindestens eines eine Rekombination mit einem Segment in dem Genom oder dem Episom der modifizierten Zellen durchläuft, um weitere modifizierte Zellen zu bilden. Die weiteren modifizierten Zellen werden anschließend hinsichtlich weiterer modifizierter Zellen nach weiteren modifizierten Zellen gescreent, die sich weiter in Richtung der Erlangung der gewünschten Funktion entwickelt haben. Die Schritte der Rekombination und des Screenens/der Selektion werden wie benötigt wiederholt, bis die weiter modifizierten Zellen die gewünschte Funktion erlangt haben.
In einigen Verfahren ist die gewünschte Funktion die Sekretion eines Proteins, und die Vielzahl der Zellen umfasst weiterhin ein Konstrukt, das ein Protein kodiert. Gegebenenfalls ist das Protein toxisch für die Vielzahl von Zellen, außer es wird sekregiert, und die modifizierten oder weiter modifizierten Zellen, die sich in Richtung der Erlangung der gewünschten Funktion entwickelt haben, werden durch das Propagieren der Zellen und das Gewinnen der überlebenden Zellen gescreent.
In einigen Verfahren ist die gewünschte Funktion gesteigerte Rekombination. In solchen Verfahren umfasst die Bibliothek von Fragmenten manchmal ein Cluster von Genen, die zusammen die Rekombinationskapazität verleihen. Das Screening kann erreicht werden unter Verwendung von Zellen, die weiterhin ein Gen umfassen, das einen Marker kodiert, dessen Expression durch eine Mutation, die durch Rekombination entfernbar ist, vermieden werden kann. Die Zellen werden durch ihre Expression des Markers gescreent, die von der Entfernung der Mutation durch Rekombination stammen.
Die Erfindung stellt weiterhin Verfahren zum Entwickeln einer Zelle, um eine gewünschte Funktion zu erlangen, bereit. Diese Verfahren bringen das Bereitstellen einer Population von zwei verschiedenen bakteriellen oder archaebakteriellen Zellen mit sich. Die Zellen werden unter Bedingungen kultiviert, in denen DNA zwi schen Zellen ausgetauscht wird, wodurch Zellen mit Hybrid Genomen gebildet werden. Die Zellen werden anschließend gescreent oder hinsichtlich Zellen selektiert, die sich in Richtung der Erlangung einer gewünschten Eigenschaft entwickelt haben. Der DNA Austausch und die Screening/Selektionsschritte werden wenn notwendig wiederholt, wobei die gescreenten/selektierten Zellen aus einem Zyklus die Population von verschiedenen Zellen in dem nächsten Zyklus bilden, bis eine Zelle die gewünschte Eigenschaft erlangt hat.
Gegebenenfalls umfasst das Verfahren weiterhin das Transformieren einer Bibliothek von DNA-Fragmenten in mindestens einem Zyklus.
Die beanspruchten Verfahren zum Entwickeln einer Zelle, um eine gewünschte Eigenschaft zu erlangen, werden durch Protoplasten-vermittelten Austausch von DNA zwischen Zellen bewirkt. Solche Verfahren bringen das Bilden von Protoplasten einer Population von verschiedenen Zellen mit sich. Die Protoplasten werden anschließend verschmolzen bzw. fusioniert, um hybride Protoplasten zu bilden, in denen Genome von den Protoplasten rekombinieren, um Hybrid Genome zu bilden. Die Hybrid Protoplasten werden unter Bedingungen inkubiert, welche die Regeneration von Zellen fördern. Der nächste Schritt ist das Auswählen oder Screenen, um regenerierte Zellen zu isolieren, die sich in Richtung der Erlangung der gewünschten Eigenschaft entwickelt haben. Der DNA Austausch und die Selektions-/Screeningschritte werden wenn notwendig wiederholt, wobei die regenerierten Zellen in einem Zyklus verwendet werden, um die Protoplasten in dem nächsten Zyklus zu bilden, bis die regenerierten Zellen die gewünschte Eigenschaft erlangt haben. Einige Verfahren umfassen weiterhin einen Schritt des Selektierens oder Screenens für fusionierte Protoplasten, die frei von nicht fusionierten Protoplasten der Eltern-Zellen sind. Einige Verfahren umfassen weiterhin einen Schritt des Selektierens oder Screenens für fusionierte Protoplasten mit Hybrid Genomen, die frei von Zellen mit Eltern Genome sind.
In einigen Verfahren ist die gewünschte Eigenschaft die Expression und/oder Sekretion eines Proteins oder sekundären Metaboliten, wie Taxol.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
Figuren, welche die beanspruchte Erfindung nicht betreffen, werden nur zur Darstellung bereitgestellt.
1: Schema für in vitro Shuffling von Genen.
12: (A, B, C und D) DNA Sequenzen eines Wildtyp recA Proteins (als Neu Minshall bezeichnet) und fünf hyperrekombinogene Varianten davon.
13: Aminosäuresequenz eines Wildtyp recA Proteins und fünf hyperrekombinogene Varianten davon.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
1. Allgemeines
Der basische Ansatz
Die Erfindung stellt Verfahren zum künstlichen Entwickeln von bakteriellen und archaebakteriellen Zellen bereit, um eine neue oder verbesserte Eigenschaft durch rekursive Sequenz Rekombination zu erlangen. Kurz gesagt bringt die rekursive Sequenz Rekombination aufeinanderfolgende Zyklen von Rekombination und Screenen/Selektion mit sich, um eine molekulare Diversität zu bilden. Dies bedeutet, dass eine Familie von Nukleinsäure Molekülen gebildet wird, die substanzielle Sequenz und/oder strukturelle Identität zueinander zeigen, aber sich in der Anwesenheit von Mutationen unterscheiden. Jeder Rekombinationszyklus wird von mindestens einem Zyklus des Screenens oder der Selektion nach Molekülen mit einer gewünschten Eigenschaft gefolgt. Das/die Molekül/e, das/die in einer Runde selektiert wurden, bilden die Ausgangsmaterialien für die Bildung von Diversität in der nächsten Runde.
Die zu entwickelnden Zellen sind bakteriell oder Archaebakterien und können eine homogene Zelllinie oder eine gemischte Kultur darstellen. Geeignete Zellen für die Entwicklung schließen bakterielle Zelllinien, die für gewöhnlich in der Gentechnik und Protein Expression verwendet werden, ein.
Interessant sind viele bakterielle Zelltypen, sowohl Gram-negative als auch Grampositive, wie Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. cereus, Escherichia coli, Pseudomonas, Salmonella, Actinomycetes und Erwinia. Die vollständige Genom Sequenz von E. coli und Bacillus subtilis wurden beschrieben von Blattner et al., Science 277, 1454–1462 (1977); Kunst et al., Nature 390, 249–256 (1997).
Die Entwicklung beginnt durch die Bildung einer Population von verschiedenen Zellen. Typischerweise sind die Zellen in der Population von derselben Art, aber sie stellen Varianten einer Vorläufer Zelle dar. Unter gewissen Umständen ist die Variation natürlich, wie wenn verschiedene Zellen von verschiedenen Individuen innerhalb einer Spezies erhalten werden, oder wenn sie von verschiedenen Spezies erhalten werden. Unter anderen Umständen wird die Variation durch Mutagenese einer Vorläufer Zelle induziert. Die Mutagenese kann bewirkt werden, indem die Zelle mutagenen Mitteln unterworfen wird, oder wenn die Zelle eine Mutator Zelle ist (z.B. sie weist Mutationen in Genen auf, die in der DNA Replikation, Rekombination und/oder der Reparatur eine Rolle spielen, welche die Einführung von Mutationen begünstigen), einfach durch das Vermehren der Mutator Zellen. Mutator Zellen können aus aufeinanderfolgenden Selektionen nach einfachen phänotypischen Änderungen gebildet werden (z.B. die Erlangung von Rifampicin Resistenz, anschließend Nalidixinsäure Resistenz, anschließend lac– zu lac+ (siehe Mao et al., J. Bacteriol. 179, 417–422 (1997)).
Unter anderen Umständen ist die Variation das Ergebnis des Transferierens einer Bibliothek von DNA-Fragmenten in die Zellen (z.B. durch Konjugation, Transformation, Transduktion oder natürliche Kompetenz). Mindestens eines, und für gewöhnlich viele Fragmente in der Bibliothek zeigen einige, wenn nicht eine voll ständige Sequenz oder strukturelle Identität mit einem verwandten oder allelischen Gen innerhalb der Zellen, was ausreichend ist, dass eine homologe Rekombination stattfindet. Die Bibliothek von Fragmenten kann von einer oder mehreren Quellen abgeleitet sein. Eine Quelle von Fragmenten ist eine genomische Bibliothek von Fragmenten aus einer anderen Spezies, eines anderen Zelltyps, eines anderen Organismus oder eines anderen Individuums von den Zellen, die transfiziert werden. In dieser Situation weisen viele der Fragmente in der Bibliothek ein verwandtes oder allelisches Gen in den Zellen, die transformiert werden, auf, aber unterscheiden sich von diesem Gen aufgrund der Anwesenheit von natürlich vorkommenden Spezies Variationen, Polymorphismen und Mutationen. Alternativ kann die Bibliothek von DNA von demselben Zelltyp, der transformiert wird, abgeleitet sein, nachdem diese DNA einer induzierten Mutation durch herkömmliche Verfahren, wie Bestrahlung, fehleranfällige PCR, Wachstum in einem Mutator Organismus oder Kassettenmutagenese unterzogen wurde. In jeder dieser Situationen kann die genomische Bibliothek eine vollständige genomische Bibliothek oder eine subgenomische Bibliothek sein, die zum Beispiel von einem selektierten Chromosom oder einem Teil eines Chromosoms oder einem episomalen Element innerhalb der Zelle abgeleitet ist. Ebenso wie diese oder anstelle dieser Quellen von DNA-Fragmenten kann die Bibliothek Fragmente enthalten, die natürliche oder selektierte Varianten von selektierten Genen von bekannten Funktionen (d.h. fokussierte Bibliotheken) darstellen.
Die Zahl der Fragmente in einer Bibliothek kann von einem einzelnen Fragment bis ungefähr 10¹⁰ schwanken, wobei Bibliotheken mit 10³ bis 10⁸ Fragmenten normal sind. Die Fragmente sollten ausreichend lang sein, so dass sie eine homologe Rekombination durchlaufen können, und sie sollten ausreichend kurz sein, so dass sie in eine Zelle eingeführt, und falls notwendig vor der Einführung manipuliert bzw. verändert werden können. Die Fragmentgrößen können von 10 b bis 1000 kb, wobei Größen von 500–10.000 Basen normal sind, reichen. Die Fragmente können doppel- oder einzelsträngig sein.
Die Fragmente können in Zellen als ganze Genome oder als Bestandteile von Viren, Plasmiden, YACs, HACs oder BACs eingeführt werden, oder sie können so eingeführt werden wie sie sind, wobei in diesem Fall alle oder die meisten Fragmente keinen Replikationsursprungspunkt aufweisen. Die Verwendung von viralen Fragmenten mit einzelsträngigen Genomen bietet den Vorteil, dass die Fragmente in einzelsträngiger Form verabreicht werden, was die Rekombination fördert. Die Fragmente können auch mit einem Selektionsmarker vor der Einführung verbunden werden. Der Einschluss von Fragmenten in einen Vektor mit einem Replikationsursprungspunkt benötigt einen längeren Zeitraum nach der Einführung in die Zelle, während dem die Fragmente die Rekombination mit einem verwandten Gen durchlaufen, bevor sie degradiert oder gegenselektiert werden und aus der Zelle verloren gehen, wodurch der Anteil von Zellen mit rekombinanten Genomen gesteigert wird. Gegebenenfalls ist der Vektor ein Suizid Vektor, der in der Lage ist, länger als ein isolierte DNA-Fragment zu existieren, aber der nicht in der Lage ist, dauerhaft in einer Zelllinie gehalten zu werden. Ein solcher Vektor kann transient einen Marker für einen ausreichenden Zeitraum exprimieren, um hinsichtlich einer Zelle zu screenen oder eine Zelle zu selektieren, die den Vektor trägt, aber der anschließend degradiert oder auf andere Weise unfähig gemacht wird, den Marker zu exprimieren. Die Verwendung von solchen Vektoren kann vorteilhaft sein beim Durchführen von anschließenden Rekombinationsrunden, die unten diskutiert werden. Zum Beispiel exprimieren manche Suizid Vektoren ein langlebiges Toxin, das durch ein kurzlebiges Molekül neutralisiert wird, das von demselben Vektor exprimiert wird. Die Expression des Toxins alleine wird nicht erlauben, dass der Vektor etabliert wird. Jense & Gerdes, Mol. Microbiol., 17, 205–210 (1995); Bernard et al., Gene 162, 159–160. Alternativ kann ein Vektor durch den Einbau eines fehlerhaften Replikationsursprungspunkts (d.h. temperatursensitiv) oder durch das Weglassen eines Replikationsursprungspunktes suizidal gemacht werden. Vektoren können auch durch den Einschluss von negativen Selektionsmarkern, wie sacB in vielen Bakterien, suizidal gemacht werden. Diese Gene werden nur in der Anwesenheit von spezifischen Verbindungen toxisch. Solche Vektoren können derart ausgewählt werden, dass sie einen breiten Bereich von Stabilitäten aufweisen.
Nach der Einführung in Zellen können die Fragmente mit DNA, die in dem Genom oder Episomen der Zellen anwesend ist durch homologe, nicht homologe oder seitenspezifische Rekombination rekombinieren. Für die vorliegenden Zwecke liefert die homologe Rekombination den signifikantesten Beitrag zu der Entwicklung der Zellen, weil diese Form der Rekombination die existierende Diversität zwischen der DNA der Zellen, die transfiziert wurden und den DNA-Fragmenten amplifiziert. Wenn zum Beispiel ein DNA-Fragment, das transfiziert wurde, sich von einem verwandten oder allelischen Gen an zwei Positionen unterscheidet, gibt es vier mögliche Rekombinationsprodukte, und jedes dieser Rekombinationsprodukte kann in verschiedenen Zellen in der transformierten Population gebildet werden. Somit verdoppelt die homologe Rekombination des Fragments die anfängliche Diversität in diesem Gen. Wenn viele Fragmente mit entsprechenden verwandten oder allelischen Genen rekombinieren, steigt die Diversität der Rekombinationsprodukte bezüglich der Ausgangsprodukte exponentiell mit der Zahl der Fragmente. Der Rekombination führt zu modifizierten Zellen mit modifzierten Genomen und/oder Episomen.
Die varianten Zellen, egal ob sie das Ergebnis von natürlicher Variation, Mutagenese oder Rekombination sind, werden gescreent oder selektiert, um eine Untergruppe von Zellen zu identifizieren, die sich in Richtung der Erlangung einer neuen oder verbesserten Eigenschaft entwickelt haben. Die Natur des Screens hängt selbstverständlich von der Eigenschaft ab, und verschiedene Beispiele werden unten diskutiert. Gegebenfalls wird das Screening vor dem Durchführen anschließender Rekombinationszyklen wiederholt. Die Stringenz kann in wiederholten Screening Zyklen gesteigert werden.
Die Subpopulation von Zellen, die das Screening überleben, werden einer weiteren Rekombinationsrunde unterworfen. Unter bestimmten Umständen wird die weitere Rekombinationsrunde durch das Propagieren der Zellen unter Bedingungen durchgeführt, welche den Austausch von DNA zwischen Zellen erlauben. Zum Beispiel können Protoplasten aus den Zellen gebildet werden, sie können fusionie ren, und Zellen mit rekombinanten Genomen können aus den fusionierten Protoplasten propagiert werden. Alternativ kann der Austausch von DNA durch das Propagieren von Zellen in einem elektrischen Feld gefördert werden. Bei Zellen, die einen konjugativen Transfer Apparat aufweisen, kann der Austausch von DNA einfach durch das Propagieren der Zellen gefördert werden.
In anderen Verfahren wird die weitere Rekombinationsrunde durch einen Trennungs- und Wiedervereinigungsansatz (engl.: "split and pool approach") durchgeführt. Dies bedeutet, dass die überlebenden Zellen in zwei Pools geteilt werden. DNA wird aus einem Pool isoliert und, falls notwendig, amplifiziert und anschließend in den anderen Pool transformiert. Folglich bilden DNA-Fragmente aus dem ersten Pool eine weitere Bibliothek von Fragmenten und rekombinieren mit verwandten Fragmenten in dem zweiten Pool, was zu weiterer Diversität führt.
In anderen Verfahren werden einige oder alle der Zellen, die das Screenen überleben, mit einer frischen Bibliothek von DNA-Fragmenten transfiziert, welche dieselbe oder verschieden sein kann von der Bibliothek, die in der ersten Rekombinationsrunde verwendet wurde. In dieser Situation durchlaufen die Gene der frischen Bibliothek eine Rekombination mit verwandten Genen in den überlebenden Zellen. Wenn Gene als Bestandteile eines Vektors eingeführt werden, sollte die Kompatibilität bzw. Verträglichkeit dieses Vektors mit irgendeinem Vektor, der in einer vorhergehenden Transfektionsrunde verwendet wurde, in Betracht gezogen werden. Wenn der Vektor, der in einer vorhergehenden Runde verwendet wurde, ein Suizid Vektor war, gibt es kein Inkompatibilitätsproblem. Wenn jedoch der Vektor, der in einer vorherigen Runde verwendet wurde, kein Suizid Vektor war, sollte ein Vektor mit einem unterschiedlichen Inkompatibilitätsursprungspunkt in der nachfolgenden Runde verwendet werden. In all diesen Formaten bildet die weitere Rekombination zusätzliche Diversität in dem DNA Bestandteil der Zellen, was zu weiteren modifizierten Zellen führt.
Die weiteren modifizierten Zellen werden einer anderen Screening-/Selektionsrunde denselben Prinzipien wie in der ersten Runde unterworfen. Das Screenen/die Selektion identifiziert eine Subpopulation von weiter modifizierten Zellen, die sich weiter in Richtung der Erlangung der Eigenschaft entwickelt haben. Diese Subpopulation von Zellen kann weiteren Rekombinations- und Screeningrunden gemäß denselben Prinzipien unterworfen werden, wobei gegebenenfalls die Stringenz des Screnens in jeder Runde gesteigert wird. Schließlich werden Zellen identifiziert, welche die gewünschte Eigenschaft erlangt haben.
Variationen
Positive Selektion für allelischen Austausch
Die Erfindung kann in Verbindung mit Verfahren zum Anreichern von Zellen verwendet werden, die modifizierte Gene in Bezug auf die Ausgangszellen tragen. Dies kann erreicht werden durch das Einführen einer DNA-Fragment Biliothek in einen Suizid Vektor (d.h. er weist keinen funktionellen Replikationsursprungspunkt in dem Empfänger Zelltyp auf), der sowohl positive als auch negative Selektionsmarker enthält. Gegebenenfalls können multiple Fragment Bibliotheken von verschiedenen Quellen (z.B. B. subtilis, B. licheniformis und B. cereus) in verschiedene Vektoren kloniert werden, die verschiedene Selektionsmarker tragen. Geeignete positive Selektionsmarker schließen neo^R, Kanamycin^R, hyg, hisD, gpt, ble, tet^R, hprt, ura3 und sacB ein. Geeignete negative Selektionsmarker schließen hsv-tk, hprt, gpt und Cytosindesaminase ein. Eine andere Strategie für das Anwenden einer negativen Selektion ist es, ein Wildtyp rpsL Gen (kodierendes ribosomales Protein S12) in einem Vektor für die Verwendung in Zellen mit einem mutanten rpsL Gen einzuschließen, was Streptomycin Resistenz vermittelt. Die mutante Form von rpsL ist in Zellen mit Wildtyp rpsL rezessiv. Somit selektiert die Selektion hinsichtlich SM Resistenz gegen Zellen mit einer Wildtyp Kopie von rpsL. Siehe Skorupski & Taylor, Gene 169, 47–52 (1996). Alternativ können Vektoren, die nur einen positiven Selektionsmarker tragen, für eine Selektionsrunde für Zellen verwendet werden, die den Marker exprimieren, und für eine anschließende Screening Runde für Zellen, die den Marker verloren haben (z.B. Screenen hinsichtlich Arzneimittel Sensitivität). Der Screen für Zellen, die den positiven Selektionsmar ker verloren haben, ist äquivalent zum Screenen gegen die Expression eines negativen Selektionsmarkers. Zum Beispiel kann Bacillus mit einem Vektor transformiert werden, der ein CAT Gen und eine zu integrierende Sequenz trägt, transformiert werden. Siehe Harwood & Cutting, Molecular Biological Methods for Bacillus auf S. 31–33. Die Selektion für Chloramphenicol Resistenz isoliert Zellen, die den Vektor aufgenommen haben. Nach einem geeigneten Zeitraum, um die Rekombination zu erlauben, isoliert die Selektion für CAT Sensitivität Zellen, die das CAT Gen verloren haben. Ungefähr 50 % dieser Zellen werden eine Rekombination mit der zu integrierenden Sequenz durchlaufen.
Suizid Vektoren, die einen positiven Selektionsmarker und gegebenenfalls einen negativen Selektionsmarker und ein DNA-Fragment tragen, können in die wirtschromosomale DNA durch ein einzelnes Crossover an einer Stelle in der chromosomalen DNA, die homolog zu dem Fragment ist, integrieren. Die Rekombination bildet einen integrierten Vektor, der von direkten Repetitionen der homologen Sequenz flankiert ist. In einigen Zellen führt die anschließende Rekombination zwischen den Repetitionen zu dem Ausschneiden des Vektors und entweder zu der Annahme einer gewünschten Mutation von dem Vektor durch das Genom oder die Wiederherstellung des Genoms des Wildtyps.
In den vorliegenden Verfahren, nach dem Transfer der Gen Bibliothek, die in einen geeigneten Vektor kloniert ist, wird eine positive Selektion zur Expression des positiven Selektionsmarkers angewendet. Weil nicht integrierte Kopien des Suizid Vektors schnell aus den Zellen entfernt werden, reichert diese Selektion Zellen an, die den Vektor in das Wirtschromosom integriert haben. Die Zellen, welche die positive Selektion überleben, können anschließend propagiert und einer negativen Selektion unterworfen werden, oder sie können hinsichtlich des Verlustes des positiven Selektionsmarkers gescreent werden. Die negative Selektion selektiert Gegenzellen, die den negativen Selektionsmarker exprimieren. Somit exprimieren Zellen, die den integrierten Vektor behalten haben, den negativen Marker und werden selektiv eliminiert. Die Zellen, die beide Selektionsrunden überleben, sind jene, die anfänglich den Vektor integriert und ihn anschließend eliminiert haben.
Diese Zellen werden hinsichtlich Zellen mit Genen, die durch homologe Rekombination mit dem Vektor modifiziert wurden, angereichert.
Individualisierte Optimierung von Genen
Im Allgemeinen benötigen die obigen Verfahren keine Kenntnis der Zahl von Genen, die optimiert werden sollen, ihre Kartenlage oder ihre Funktion. Jedoch können in einigen Fällen, wo diese Informationen für eines oder mehrere Gene zur Verfügung stehen, ausgenutzt werden. Wenn zum Beispiel die Eigenschaft, die durch die Entwicklung erlangt werden soll, eine gesteigerte Rekombination von Zellen ist, ist ein Gen, das wahrscheinlich wichtig ist, recA, selbst wenn viele andere Gene, die bekannt oder unbekannt sind, zusätzliche Beiträge liefern können. In dieser Situation kann das recA Gen zumindest teilweise getrennt von anderen Kandidaten Genen entwickelt werden. Das recA Gen kann durch irgendeines der Verfahren der rekursiven Rekombination, die in Abschnitt V beschrieben sind, entwickelt werden. Kurz gesagt geht dieser Ansatz mit dem Erhalten diverser Formen eines recA Gens, dem Rekombinieren der Formen, dem Selektieren von Rekombinanten mit verbesserten Eigenschaften und dem Unterwerfen der Rekombinanten in weiteren Rekombinations- und Selektionszyklen einher. Zu irgendeinem Punkt in der individualisierten Verbesserung von recA, können die diversen Formen von recA mit Fragmenten gepoolt werden, die andere Gene in einer Bibliothek kodieren, die in den allgemeinen, oben beschriebenen Verfahren verwendet werden sollen. Auf diese Weise wird die Bibliothek beimpft, dass sie einen höheren Anteil von Varianten in einem Gen enthält, von dem bekannt ist, dass es für die Eigenschaft, die erlangt werden soll, wichtig ist, als andernfalls der Fall wäre.
Ernten von DNA Substraten für das Shuffling
In einigen Shuffling Verfahren werden DNA Substrate aus natürlichen Quellen isoliert, und sie werden nicht einfach durch DNA modifizierende oder polymerisierende Enzyme aufgrund von widerspenstigen Verunreinigungen, welche enzymati sche Reaktionen vergiften, manipuliert. Solche Schwierigkeiten können durch das Verarbeiten von DNA Substraten durch einen Erntestamm vermieden werden. Der Erntestamm ist typischerweise ein bakterieller oder archaebakterieller Zelltyp mit natürlicher Kompetenz und einer Kapazität für homologe Rekombination zwischen Sequenzen mit substanzieller Diversität (z.B. Sequenzen, die nur 75 % Sequenz Identität zeigen). Der Erntestamm trägt einen Vektor, der einen negativen Selektionsmarker kodiert, flankiert von zwei Segmenten, die jeweils komplementär zu zwei Segmenten sind, die ein Gen oder eine andere interessierende Region in der DNA von einer Zielzelle flankieren. Der Erntestamm wird mit Fragmenten von DNA von der Zielzelle in Kontakt gebracht. Die Fragmente werden durch natürliche Kompetenz aufgenommen, und ein interessierendes Fragment aus dem Ziel Organismus rekombiniert mit dem Vektor des Erntestamms, was zum Verlust des negativen Selektionsmarkers führt. Die Selektion gegen den negativen Marker erlaubt die Isolierung von Zellen, welche das interessierende Fragment aufgenommen haben. Das Shuffling kann in dem Erntestamm durchgeführt werden, oder ein Vektor kann aus dem Erntestamm isoliert werden für in vitro Shuffling oder Transfer zu einem anderen Zelltyp für in vivo Shuffling. Alternativ kann der Vektor zu einem anderen Zelltyp durch Konjugation, Protoplasten Fusion oder Elektrofusion transferiert werden. Ein Beispiel eines geeigneten Erntestamms ist Acinetobacter calcoaceticus mutS. Young et al., 97. ASM Meeting, Zusammenfassungen. Dieser Stamm ist natürlich kompetent und nimmt DNA in einer nicht Sequenz spezifischen Weise auf. Außerdem ist dieser Stamm aufgrund der mutS Mutation zur homologen Rekombination von Sequenzen in der Lage, die nur 75 Sequenz Identität zeigen.
III. Anwendungen
Rekombinogenität
Ein Ziel der Evolution der gesamten Zelle ist es, bakterielle oder archaebakterielle Zellen zu bilden, die eine verbesserte Kapazität für Rekombination aufweisen. Solche Zellen sind nützlich für eine Vielzahl von Zwecken in der Molekulargenetik einschließlich den in vivo Formaten von rekursiver Sequenz Rekombination, die in Abschnitt V beschrieben ist. Nahezu dreißig Gene (z.B., recA, recB, recC, recD, recE, recF, recD, recO, recQ, recR, recT, ruvA, ruvB, ruvC, sbcB, ssb, topA, gyrA und B, lig, polA, uvrD, E, recL, mutD, mutH, mutL, mutU, helD) und DNA Stellen (z.B. chi, recN, sbcC), die in genetische Rekombination involviert sind, wurden in E. coli identifiziert, und verwandte Formen von einigen dieser Gene wurden in anderen Organismen gefunden (z.B. rad51, rad55, rad 57, Dmc1 in Hefe (siehe Kowalczykowski et al., Microbiol. Rev. 58, 401–465 (1994); Kowalczykowski & Zarling, supra), und humane Homologe von Rad51 und Dmc1 wurden identifiziert (siehe Sandler et al., Nucl. Acids Res. 24, 2125–2132 (1996)). Weiterhin erleichtern Mutationen in den Fehlpaarungsreparatur Genen, wie mutL, mutS, mutH die Homologie Voraussetzungen und erlauben die Rekombination zwischen mehr verschiedenen Sequenzen (Ryssiguier et al., Nature 342, 396–401 (1989)). Das Ausmaß der Rekombination zwischen verschiedenen Stämmen kann durch das Übertragen von Mismatch Fehlpaarungsreparatur Genen und dem Stimulieren von SOS Genen verstärkt werden. Dies kann erreicht werden durch die Verwendung von geeigneten mutanten Stämmen und/oder dem Wachstum unter Bedingungen von metabolischem Stress, von denen gefunden wurde, dass sie SOS stimulieren und Fehlpaarungsreparatur Gene inhibieren. Vulic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997).
Die Ausgangssubstrate für die Rekombination wurden gemäß dem allgemeinen, oben beschriebenen Prinzipien ausgewählt. Dies bedeutet, dass die Substrate gesamte Genome oder Fraktionen davon mit Rekombinationsgenen oder -stellen sein können. Große Bibliotheken von im Wesentlichen zufälligen Fragmenten können mit Sammlungen von Fragmenten ausgesät werden, die Varianten von einem oder mehreren bekannten Rekombinationsgenen, wie recA konstituieren. Alternativ können Bibliotheken durch Mischen von varianten Formen der verschiedenen Rekombinationsgene und -stellen gebildet werden.
Die Bibliothek von Fragmenten wird in die Empfängerzellen eingeführt, die verbessert werden sollen, und die Rekombination findet statt, was modifizierte Zellen bildet. Die Empfängerzellen enthalten vorzugsweise ein Marker Gen, dessen Expression in einer Weise verhindert wurde, die durch Rekombination korrigiert werden kann. Zum Beispiel können diese Zellen zwei Kopien eines Marker Gens enthalten, das Mutationen an verschiedenen Stellen trägt, wobei die Kopien rekombinieren können, um das Wildtyp Gen zu bilden. Ein geeignetes Marker Gen ist das grün fluoreszierende Protein. Ein Vektor kann konstruiert werden, der eine Kopie von GFP mit Stoppkodons nahe dem N-Terminus, und einer anderen Kopie von GFP mit Stoppkodons nahe dem C-Terminus des Proteins kodiert. Der Abstand zwischen den Stoppkodons an den jeweiligen Enden des Moleküls beträgt 500 bp, und ungefähr 25 % der Rekombinationsereignisse führt zu aktivem GFP. Die Expression von GFP in einer Zelle signalisiert, dass eine Zelle zur homologen Rekombination in der Lage ist, um zwischen die Stoppkodons zu rekombinieren, um eine durchgehende kodierende Sequenz zu bilden. Durch Screenen für Zellen, die GFP exprimieren, reichert man Zellen mit der höchsten Kapazität für Rekombination an. Dieselbe Art von Screen kann nach anschließenden Rekombinationsrunden verwendet werden. Außer dem Selektionsmarker, der in der/den vorherigen Runde/n verwendet wurde, der auf einem Suizid Vektor anwesend war, sollte/n die nächste/n Runde/n einen zweiten gestörten Screening Marker innerhalb eines zweiten Vektors einsetzen, der einen anderen Replikationsursprungspunkt oder einen anderen positiven Selektionsmarker im Vergleich zu den Vektoren trägt, die in den vorherigen Runden verwendet wurden.
Multigenomische Kopienzahl
Der Hauptteil der bakteriellen Zellen in Kulturen in stationärer Phase, die in Vollmedien angezogen wurden, enthalten zwei, vier oder acht Chromosomen. In Minimalmedium enthalten die Zellen ein oder zwei Chromosom/en. Die Zahl der Chromosomen pro bakterieller Zelle häng somit von der Wachstumsgeschwindigkeit der Zelle ab, wenn sie die stationäre Phase erreicht. Dies liegt daran, dass schnell wachsende Zellen multiple Replikationsgabeln enthalten, was zu mehreren Chromosomen in den Zellen nach der Termination führt. Die Zahl von Chromosomen ist Stamm abhängig, obwohl alle getesteten Stämme mehr als ein Chromo som in der stationären Phase aufweisen. Die Zahl von Chromosomen in Zellen in der stationären Phase verringert sich mit der Zeit. Dies scheint in der Fragmentierung und Degradation von gesamten Chromosomen, ähnlich zu Apoptose in Säugerzellen, begründet zu sein. Diese Fragmentierung von Genomen in Zellen mit multiplen Genom Kopien führt zu massiver Rekombination und Mutagenese. Nützliche Mutanten können Wege finden, um Energiequellen zu nutzen, die es ihnen erlauben, weiter zu wachsen.
Einige Zelltypen, wie Deinococcus radians (Daly und Minton J. Bacteriol. 177, 5495–5505 (1995)) zeigen Polyploidie über den Zell Zyklus. Dieser Zelltyp ist stark strahlungsresistenz aufgrund der Anwesenheit von vielen Kopien des Genoms. Rekombination mit hoher Frequenz zwischen den Genomen erlaubt das schnelle Entfernen von Mutationen, die durch eine Vielzahl von DNA schädigenden Mitteln induziert werden.
Ein Ziel der vorliegenden Verfahren ist es, andere Zelltypen zu entwickeln, damit sie eine gesteigerte Genom Kopienzahl ähnlich zu jener von Deinococcus radians aufweisen. Vorzugsweise wird die gesteigerte Kopienzahl während des gesamten oder des meisten Teils seines Zell Zyklus in allen oder den meisten Wachstumsbedingungen aufrecht erhalten. Die Anwesenheit von multiplen Genom Kopien in solchen Zellen führt zu einer höheren Frequenz der homologen Rekombination in diesen Zellen, sowohl zwischen Kopien eines Gens in verschiedenen Genomen innerhalb der Zelle als auch zwischen einem Genom innerhalb der Zelle und einem transfizierten Fragment. Die gesteigerte Frequenz der Rekombination erlaubt es den Zellen, sich schneller zu entwickeln, um andere nützliche Eigenschaften anzunehmen.
Die Ausgangssubstrate der Rekombination können eine vielschichtige Bibliothek von Genen sein, von denen nur einige für die genomische Kopienzahl relevant sind, eine fokussierte Bibliothek, die aus Varianten des/der Gens/e gebildet wird, von dem/denen bekannt ist, oder von dem/denen vermutet wird, dass es/sie eine Rolle in der genomischen Kopienzahl spielt/spielen, oder eine Kombination dieser beiden. Als eine allgemeine Regel würde man erwarten, dass eine gesteigerte Kopienzahl durch die Entwicklung von Genen erreicht würde, die in die Replikation und Zellteilung (engl.: cell septation) involviert sind, so dass die Zellteilung inhibiert wird, ohne dass die Replikation beeinflusst ist. Gene, die sich in der Replikation entwickelt haben, schließen tus, xerC, xerD, dif, gyrA, gyrB, parE, parC, dif, TerA, TerB, TerC, TerD, TerE, TerF und Gene, welche die Chromosomen Verteilung und Gen Kopienzahl beeinflussen, einschließlich minD, mukA (tolC), mukB, mukC, mukD, spoOJ, spoIIIE (Wake & Errington, Annu. Rev. Genet. 29, 41–67 (1995)), ein. Eine nützliche Quelle von Substraten ist das Genom eines Typs, wie Deinococcus radians, von dem bekannt ist, dass er den gewünschten Phänotyp der multigenomischen Kopienzahl aufweist. Ebenso wie oder anstelle der obigen Substrate können auch Fragmente, die ein Protein oder Antisense RNA Inhibitoren für Gene kodieren, von denen bekannt ist, dass sie in die Zellteilung involviert sind, verwendet werden.
In der Natur wäre die Existenz von multiplen genomischen Kopien in einem Zelltyp für gewöhnlich nicht vorteilhaft aufgrund des größeren Nährstoff Bedarfs, der benötigt wird, um diese Kopienzahl aufrecht zu erhalten. Jedoch kann man künstliche Bedingungen entwerfen, um hinsichtlich hoher Kopienzahl zu selektieren. Modifizierte Zellen mit rekombinanten Genomen werden in Vollmedien angezogen (unter diesen Bedingungen sollte die Multikopienzahl kein Nachteil sein) und gegenüber einem Mutagen ausgesetzt, wie ultravioletter oder gamma Bestrahlung oder einem chemischen Mutagen, z.B. Mitomycin, salpetrige Säure, fotoaktivierte Psoralene, alleine oder in Kombination, das DNA Brüche indiziert, die der Reparatur durch Rekombination zugänglich sind. Diese Bedingungen selektieren für Zellen mit Multikopienzahl aufgrund der größeren Wirksamkeit, mit der Mutationen ausgeschnitten werden können. Modifizierte Zellen, welche das Aussetzen gegenüber dem Mutagen überleben, werden für Zellen mit multiplen Genom Kopien angereichert. Falls es gewünscht ist, können ausgewählte Zellen einzeln hinsichtlich der Genom Kopienzahl analysiert werden (z.B. durch quantitative Hybridisierung mit geeigneten Kontrollen). Einige oder alle der Sammlung von Zellen, welche die Selektion überleben, stellen die Substrate für die nächste Rekombinations runde dar. Schließlich haben sich alle Zellen entwickelt, die mindestens 2, 4, 6, 8 oder 10 Kopien des Genoms während des Zell Zyklus aufweisen.
Sekretion
Die Protein (oder Metaboliten) Sekretionswege von bakteriellen Zellen können entwickelt werden, um gewünschte Moleküle wirksamer zu exportieren, wie für die Herstellung von Protein Pharmazeutika, Arzneimitteln aus kleinen Molekülen (engl.: small molecule drugs) oder Spezial Chemikalien. Die Verbesserungen in der Wirksamkeit sind insbesondere für Proteine wünschenswert, die einen Multiuntereinheiten Zusammenbau (wie Antikörper) oder extensive posttranslationale Modifikation vor der Sekretion benötigen.
Die Wirksamkeit der Sekretion kann von einer Anzahl von genetischen Sequenzen einschließlich einer Signal Peptid kodierenden Sequenz, Sequenzen, die (ein) Protein(e) kodiert/en, das/die die kodierende Sequenz spalteten oder auf andere Weise erkennt/en, und der kodierenden Sequenz des zu sekregierenden Proteins abhängen. Das zuletzt genannte kann die Faltung des Proteins und die Leichtigkeit, mit der es in Membrane integrieren oder sie überwinden kann, beeinflussen. Der bakterielle Sekretionsweg in E. coli schließt die SecA, SecB, SecE, SecD und SecE Gene ein. In Bacillus subtilis sind die Hauptgene secA, secD, secE, secF, secY, ffh, ftsY zusammen mit fünf Signal Peptidase Genen (sipS, sipT, sipU, sipV und sipW) (Kunst et al., supra). Bei Proteinen, die posttranslationale Modifikation benötigen, kann die Entwicklung von Genen, welche eine solche Modifikation bewirken, zu einer verbesserten Sekretion beitragen. Genauso können Gene mit Expressionsprodukten, die eine Rolle im Zusammenbau von Multiuntereinheiten Proteinen (z.B. Chaperoninen) spielen, auch zur verbesserten Sekretion beitragen.
Die Selektion von Substraten für die Rekombination folgt den allgemeinen, oben beschriebenen Prinzipien. In diesem Fall umfassen die fokussierten Bibliotheken, auf die oben Bezug genommen wird, Varianten der bekannten Sekretionsgene. Für die Entwicklung von prokaryonten Zellen, eukaryonte Proteine zu exprimieren, werden die anfänglichen Substrate für die Rekombination oft mindestens teilweise von eukaryonten Zellen erhalten. Hereinkommende Fragmente können eine Rekombination durchlaufen, sowohl mit chromosomaler DNA in Empfängerzellen als auch mit dem Screening Marker Konstrukt, das in solchen Zellen anwesend ist (siehe unten). Die zuletzt genannte Form der Rekombination ist wichtig für die Entwicklung der Signal kodierenden Sequenz, die in das Screening Marker Konstrukt eingebaut ist. Auf eine verbesserte Sekretion kann durch den Einschluss eines Marker Konstrukts in die zu entwickelnden Zellen gescreent werden. Das Marker Konstrukt kodiert ein Marker Gen, das funktionell mit Expressionssequenzen verbunden ist, und für gewöhnlich funktionell mit einer Signalpeptid kodierenden Sequenz verbunden ist. Das Marker Gen wird manchmal als ein Fusionsprotein mit einem rekombinanten interessierenden Protein exprimiert. Dieser Ansatz ist nützlich, wenn man die kodierende Sequenz für das rekombinante Protein zusammen mit Sekretionsgenen entwickeln möchte.
In einer Variation kodiert das Marker Gen ein Produkt, das toxisch für die Zelle ist, die das Konstrukt enthält, außer wenn das Produkt sekregiert wird. Geeignete Toxin Proteine schließen Diphtherie Toxin und Ricin Toxin ein. Die Vermehrung von modifizierten Zellen, die ein solches Konstrukt enthalten, selektiert für Zellen, die sich entwickelt haben, um die Sekretion des Toxins zu verbessern. Alternativ kann das Marker Gen einen Liganden für einen bekannten Rezeptor kodieren, und es können Zellen, die den Liganden tragen, durch FACS unter Verwendung von markiertem Rezeptor nachgewiesen werden. Gegebenenfalls kann ein Ligand funktionell mit einer Phospholipid Ankersequenz verbunden sein, die den Liganden an die Oberfläche der Zellmembran nach der Sekretion bindet (siehe die US 08/309,345, gleicher Anmelder, gleichzeitig anhängig). In einer weiteren Variation kann das sekregierte Marker Protein in der Nähe der Zelle aufrecht erhalten werden, die es sekregiert, indem einzelne Zellen in Agar Tropfen inokuliert werden. Das sekregierte Protein wird innerhalb der Agar Matrix abgegrenzt und kann z.B. durch FACS^TM nachgewiesen werden. In einer anderen Variation wird das interessierende Protein als ein Fusionsprotein mit β-Lactamase oder alkalischer Phosphatase exprimiert. Diese Enzyme metabolisieren kommerziell erhältliche chromogene Substrate (z.B. X-gal), aber sie tun dies nur nach Sekretion in das Periplasma. Das Auftreten von gefärbtem Substrat in einer Kolonie von Zellen zeigt deshalb die Kapazität, das Fusionsprotein zu sekregieren, und die Intensität der Farbe steht mit der Wirksamkeit der Sekretion in Verbindung.
Die Zellen, die durch diese Screening und Selektionsverfahren identifiziert werden, weisen die Kapazität auf, erhöhte Mengen an Protein zu sekregieren. Diese Kapazität kann einer gesteigerten Sekretion und gesteigerten Expression oder der gesteigerten Sekretion alleine zugewiesen werden.
Expression
Bakterielle und archaebakterielle Zellen können auch entwickelt werden, um eine gesteigerte Expression eines rekombinanten Proteins zu erlangen. Die Expressionsmenge ist selbstverständlich stark abhängig von dem Konstrukt, von dem das rekombinante Protein exprimiert wird und von den regulatorischen Sequenzen, wie dem Promotor, dem/den Enhancer/n und der Transkriptionsterminationsstelle, die darin enthalten ist. Die Expression kann auch durch eine große Anzahl von Wirtsgenen beeinflusst werden, die Rollen in der Transkription, der posttranslationalen Modifikation und der Translation spielen. Zusätzlich können Wirtsgene, die in die Synthese von Ribonukleotid- und Aminosäuremonomeren für die Transkription und Translation involviert sind, indirekte Wirkungen auf die Wirksamkeit der Expression ausüben. Die Selektion von Substraten für die Rekombination folgt den allgemeinen, oben diskutierten Prinzipien. In diesem Fall umfassen fokussierte Bibliotheken Varianten von Genen, von denen bekannt ist, dass sie Rollen in der Expression spielen. Für die Entwicklung von prokaryonten Zellen, eukaryonte Proteine zu exprimieren, werden die Anfangssubstrate für die Rekombination häufig, wenigstens teilweise, von eukaryonten Quellen erhalten; dies sind eukaryonte Gene, die Proteine, wie Chaperonine, kodieren, die in die Sekretion und/oder den Zusammenbau von Proteinen involviert sind. Hereinkommende Fragmente können eine Rekombination durchlaufen, sowohl mit chromsomaler DNA in den Empfän gerzellen als auch mit dem Screening Marker Konstrukt, das in solchen Zellen anwesend ist (siehe unten).
Das Screening für eine verbesserte Expression kann bewirkt werden, indem ein Reporter Konstrukt in die zu entwickelnden Zellen eingeschlossen wird. Das Reporter Konstrukt exprimiert (und sekregiert für gewöhnlich) ein Reporter Protein, wie GFP, das einfach nachgewiesen werden kann und nicht toxisch ist. Das Reporter Protein kann alleine oder zusammen mit einem interessierenden Protein als ein Fusionsprotein exprimiert werden. Wenn das Reporter Gen sekregiert wird, selektiert das Screening wirksam für Zellen mit entweder verbesserter Sekretion oder verbesserter Expression oder beidem.
Schnelle Entwicklung als ein Werkzeug der Vorhersage
Rekursive Sequenz Rekombination kann verwendet werden, um die natürliche Evolution von pathogenen Mikroorganismen als Antwort auf das Aussetzen gegenüber einem zu testenden Arzneimittel zu simulieren. Unter Verwendung der rekursiven Sequenz Rekombination schreitet die Evolution mit einer schnelleren Geschwindigkeit als bei der natürlichen Evolution fort. Eine Messmöglichkeit der Geschwindigkeit der Evolution ist die Zahl von Rekombinationszyklen und dem Screenen, das benötigt wird, bis der Mikroorganismus eine definierte Menge von Resistenz gegenüber dem Arzneimittel angenommen hat. Die Information aus dieser Analyse ist wertvoll beim Vergleichen der relativen Leistung von verschiedenen Arzneimitteln und insbesondere in der Vorhersage ihrer Langzeit Wirksamkeit bei wiederholter Verabreichung.
Die pathogenen Mikroorganismen, die in dieser Analyse verwendet werden, schließen Bakterien ein, die eine allgemeine Quelle von humanen Infektionen sind, wie Chlamydien, Bakterien in Rickettsienform, Mycobakterien, Staphylococci, Treptococci, Pneumococci, Meningococci und Conococci, Klebsiella, Proteus, Serratia, Pseudomonas, Legionella, Diphtheria, Salmonella, Bacilli, Cholera, Tetanuas, Botulinus, Anthrax, Pest, Leptospirosis und Bakterien der Lymeserkrankung.
Die Evolution wird durch Transformieren eines Isolats von Bakterien bewirkt, das sensitiv gegenüber einem zu testenden Arzneimittel ist, mit einer Bibliothek von DNA Fragmenten. Die Fragmente können eine mutierte Version des Genoms der zu entwickelnden Bakterien sein. Wenn das Ziel des Arzneimittels ein bekanntes Protein ist, kann eine fokussierte Bibliothek mit Varianten des Gens verwendet werden, die das Protein kodieren. Alternativ kann die Bibliothek von einer anderen Art von Bakterien stammen, insbesondere Bakterien, die typischerweise als Bewohner von menschlichen Geweben gefunden werden, wodurch das Quellenmaterial, das für die Rekombination in vivo zur Verfügung steht, simuliert wird. Die Bibliothek kann auch von Bakterien stammen, von denen bekannt ist, dass sie resistent gegenüber dem Arzneimittel sind. Nach der Transformation und der Vermehrung von Bakterien für einen angemessenen Zeitraum, um zu erlauben, dass die Rekombination stattfindet und rekombinante Gene exprimiert werden, werden die Bakterien gescreent, indem sie gegenüber dem zu testenden Arzneimittel ausgesetzt werden, und anschließend werden die Überlebenden gesammelt. Überlebende Bakterien werden weiteren Rekombinationsrunden unterworfen. Die anschließende Runde kann durch einen Split und Pool Ansatz bewirkt werden, indem die DNA von einer Untergruppe von überlebenden Bakterien in eine zweite Untergruppe von Bakterien eingeführt wird. Alternativ kann eine frische Bibliothek von DNA-Fragmenten in überlebende Bakterien eingeführt werden. (Eine) anschließende Selektionsrunde/n kann/können mit steigenden Konzentrationen des Arzneimittels durchgeführt werden, wodurch die Stringenz der Selektion gesteigert wird.
IV. Förderung des genetischen Austausches
(1) Allgemein
Die erfindungsgemäßen Verfahren bewirken die Rekombination von zellulärer DNA durch die Vermehrung von Zellen unter Bedingungen, welche den Austausch von DNA zwischen bakteriellen oder archaebakteriellen Zellen induzieren. Der DNA Austausch wird durch die allgemein anwendbaren Verfahren der Protoplasten Fusion gefördert.
In einigen Verfahren wird die anfängliche Diversität zwischen Zellen (d.h. vor dem Genom Austausch) durch chemische oder strahlungsinduzierte Mutagenese eines Vorläufer Zelltyps induziert, gegebenenfalls gefolgt von Screenen für einen gewünschten Phänotyp. In anderen Verfahren ist die Diversität natürlich, weil die Zellen von verschiedenen Individuen, Stämmen oder Spezies erhalten wurden.
In den beanspruchten Shuffling Verfahren wird der induzierte Austauch von DNA als das einzige Mittel verwendet, um die Rekombination in jedem Rekombinationszyklus zu bewirken. In anderen Verfahren wird der induzierte Austausch in Kombination mit natürlicher sexueller Rekombination eines anderen Organismus verwendet. In anderen Verfahren werden der induzierte Austausch und/oder die natürliche sexuelle Rekombination in Kombination mit der Einführung einer Fragment Bibliothek verwendet. Solch eine Fragment Bibliothek kann ein ganzes Genom, ein ganzes Chromosom, eine Gruppe von funktionell oder genetisch verbundenen Genen, ein Plasmid, ein Cosmid oder Fragmente von einem von diesen sein. Die DNA kann mit einem Vektor verbunden sein, oder sie kann in freier Form vorliegen. Einige Vektoren enthalten Sequenzen, welche die homologe oder nicht homologe Rekombination mit dem Wirtsgenom fördern. Einige Fragmente enthalten doppelsträngige Brüche, die durch das Scheren mit Glaskugeln, Ultraschall Behandlung oder durch chemische oder enzymatische Fragmentierung bewirkt werden, um die Rekombination zu stimulieren.
In jedem Fall kann die DNA zwischen Zellen ausgetauscht werden, nachdem sie eine Rekombination durchläuft, um Hybrid Genome zu bilden. Zellen, die Hybrid Genome tragen, werden für den gewünschten Phänotyp gescreent, und Zellen mit diesem Phänotyp werden isoliert. Diese Zellen bilden die Ausgangsmaterialien für den nächsten Rekombinationszyklus in einem rekursiven Rekombinations-/Selektionsschema.
Ein Mittel zur Förderung des Austausches von DNA zwischen Zellen ist die Protoplasten Fusion. Ein Protoplast resultiert aus der Entfernung der Zellwand einer Zelle, was eine Membran gebundene Zelle zurücklässt, die von einem isotonischen oder hypertonischen Medium zur Aufrechterhaltung ihrer Integrität abhängt. Wenn die Zellwand teilweise entfernt wird, wird die resultierende Zelle streng genommen als Sphäroplast bezeichnet, und wenn sie vollständig entfernt wird, als ein Protoplast. Jedoch schließt hier der Begriff "Protoplast" Sphäroplasten ein, außer es ist anders angegeben.
Die Protoplasten Fusion ist beschrieben von Shaffner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2163 (1980), und andere exemplarische Verfahren sind beschrieben bei Yoakum et al., US 4,608,339 , Takahashi et al., US 4,677,066 und Sambrook et al., in Kap. 16. Die Protoplasten Fusion wurde zwischen Stämmen, Spezies und Gattungen (z.B. Hefe und Hühner Erythrozyten) beschrieben.
Protoplasten können von bakteriellen Zellen durch verschiedene Mittel, einschließlich chemischer Behandlung, um die Zellwand zu entfernen, hergestellt werden. Zum Beispiel können die Zellwände durch Spaltung mit Lysozym in einem 10–20 % Sucrose, 50 mM EDTA Puffer entfernt werden. Die Umwandlung von Zellen in sphärische Protoplasten kann durch Phasenkontrast Mikroskopie überwacht werden. Die Protoplasten können auch durch Vermehrung von Zellen in Medien, die mit einem Inhibitor der Zellwand Synthese ergänzt sind, oder die Verwendung von Mutanten Stämmen, welche die Fähigkeit zur Zellwand Bildung nicht aufweisen, hergestellt werden. Gegebenenfalls können einige, aber nicht alle zu fusionierenden Protoplasten abgetötet werden und/oder ihre DNA kann durch Behandlung mit ultravioletter Bestrahlung, Hydroxylamin oder Cupferron fragmentiert werden (Reeves et al., FEMS Microbiol. Lett. 99, 193–198 (1992)). In dieser Situation werden die abgetöteten Protoplasten als Donoren bezeichnet, und die lebensfähigen Protoplasten als Akzeptoren. Die Verwendung von toten Donor Zellen kann vorteilhaft sein in der anschließenden Erkennung von fusionierten Zellen mit Hybrid Genomen, wie unten beschrieben wird. Weiterhin ist das Aufbrechen von DNA in Donor Zellen vorteilhaft für das Stimulieren der Rekombination mit Akzeptor DNA.
Gegebenenfalls können die Akzeptor- und/oder fusionieren Zellen auch kurz, aber nicht lethal, gegenüber UV Bestrahlung ausgesetzt werden, um die Rekombination zu stimulieren.
Sobald sie gebildet sind, können die Protoplasten in einer Vielzahl von Osmolyten und Verbindungen, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumphosphat, Kaliumphosphat, Sucrose, Sorbitol in der Anwesenheit von DTT stabilisiert werden. Die Kombination von Puffer, pH-Wert, Reduktionsmittel und osmotischem Stabilisator kann für verschiedene Zelltypen optimiert werden. Die Protoplasten können durch Behandlung mit einer Chemikalie, wie PEG, Calciumchlorid oder Calciumpropionat oder Elektrofusion induziert werden, um zu fusionieren (Tosneva, Acta Microbiologica Bulgaria 24, 53–59 (1989)). Ein Verfahren zur Zellfusion, das elektrische Felder einsetzt, wurde beschrieben. Siehe Chang, US 4,970,154 . Die Bedingungen können für verschiedene Stämme optimiert werden.
Die fusionierten Zellen sind Heterokaryons mit Genomen aus zwei Protoplasten Bestandteilen. Die fusionierten Zellen können von unfusionierten Ausgangszellen durch Sucrose Gradienten Sedimentation oder Zellsortierung angereichert werden. Die zwei Kerne in den Heterokaryons können fusionieren (Karyogamie), und homologe Rekombination kann zwischen den Genomen stattfinden. Die Chromosomen können auch symmetrisch sekregieren, was zu regenerierten Protoplasten führt, welche ganze Chromosomen verloren oder gewonnen haben. Die Rekombinationsfrequenz kann durch Behandlung mit ultravioletter Bestrahlung oder durch die Verwendung von Stämmen, die recA oder andere Rekombinationsgene, wie MutS oder MutL oder die Hefe rad Gene, und verwandte Varianten davon in anderen Spezies überexprimieren, gesteigert werden. Die Überexpression kann entweder das Ergebnis der Einführung von exogenen Rekombinationsgenen oder das Ergebnis von selektierten Stämmen sein, die, als ein Ergebnis von natürlicher Variation oder induzierter Mutation, endogene Rekombinationsgene überexprimieren. Die fusionierten Protoplasten werden unter Bedingungen vermehrt, welche die Regeneration von Zellwänden, die Rekombination und Sekretion von rekombinanten Genomen in Nachkommenzellen von dem Heterokaryon und die Expression von rekombinanten Genen erlauben. Nach, oder gelegentlich vor oder während der Gewinnung von fusionierten Zellen, werden die Zellen gescreent oder hinsichtlich Evolution in Richtung einer gewünschten Eigenschaft selektiert.
Danach kann eine anschließende Rekombinationsrunde durchgeführt werden, indem Protoplasten von den Zellen hergestellt werden, welche die Selektion/das Screening in der vorhergehenden Runde überlebt haben. Die Protoplasten werden fusioniert, die Rekombination findet in den fusionierten Protoplasten statt, und es werden Zellen aus den fusionierten Protoplasten regeneriert. Die Protoplasten, die regenerierten oder regenerierenden Zellen werden einer weiteren Selektion oder weiterem Screenen unterworfen.
Alternativ kann eine anschließende Rekombinationsrunde auf einer Split Pool Basis, wie oben beschrieben, durchgeführt werden. Dies bedeut, dass eine erste Subpopulation von Zellen, welche die Selektion des Screenens aus einer vorherigen Runde überlebt haben, für die Protoplasten Bildung verwendet werden. Eine zweite Subpopulation von Zellen, welche die Selektion/das Screening aus einer vorhergehenden Runde überlebt haben, werden als eine Quelle für DNA Bibliothek Herstellung verwendet. Die DNA Bibliothek aus der zweiten Subpopulation von Zellen wird anschließend in die Protoplasten aus der ersten Subpopulation transformiert. Die Bibliothek durchläuft eine Rekombination mit den Genomen der Protoplasten, um rekombinante Genome zu bilden. Es werden Zellen aus den Protoplasten regeneriert, und eine Selektion/ein Screenen wird an den regenerierenden oder regenerierten Zellen durchgeführt. In einer weiteren Variation wird eine frische Bibliothek von Nukleinsäure Fragmenten in die Protoplasten eingeführt, welche die Selektion/das Screenen aus einer vorherigen Runde überlebt haben.
(2) Selektion für Hybrid Stämme
Die Erfindung kann in Verbindung mit Selektionsstrategien verwendet werden, um Zellen zu identifizieren, die durch Fusion von Bestandteilen von Ausgangszellen mit zwei verschiedenen Subpopulationen gebildet werden. Die Selektion für Hybrid Zellen wird für gewöhnlich vor dem Selektieren oder Screenen für Zellen, die sich entwickelt haben (als ein Ergebnis von genetischem Austausch) zur Erlangung einer gewünschten Eigenschaft, durchgeführt. Eine Grundvoraussetzung der meisten solcher Selektionsschemata ist, dass zwei Ausgangssubpopulationen zwei verschiedene Marker aufweisen. Zellen mit Hybrid Genomen können somit durch Selektion für beide Marker identifiziert werden.
In einem solchen Schema trägt mindestens eine Subpopulation der Zellen einen Selektionsmarker, der an seine Zellwand angeheftet ist. Beispiele von geeigneten Membranankern schließen Biotin, Fluorescein und Rhodamin ein. Die Marker können mit Amid- oder Thiolgruppen oder durch spezifischere Derivatisierungschemie, wie Iodacetate, Iodacetamide, Maleimide, verbunden werden. Zum Beispiel kann ein Marker wie folgt angeheftet werden. Zellen oder Protoplasten werden mit einem Puffer (z.B. PBS) gewaschen, der nicht mit der chemischen Kopplung eines chemisch aktiven Liganden interferiert, der mit Aminogruppen von Lysinen oder N-terminalen Aminogruppen von Membran Proteinen reagiert. Der Ligand ist entweder selbst aminreaktiv (z.B. Isothiocyanate, Succinimidylester, Sulfonylchloride) oder er wird durch heterobifunktionelle Linker (z.B. EMCS, SIAB, SPDP, SMB) aktiviert, um aminreaktiv zu werden. Der Ligand ist ein Molekül, das einfach durch Protein derivatisierte magnetische Kugeln oder andere fangende feste Träger gebunden wird. Zum Beispiel kann der Ligand Succinimidyl aktiviertes Biotin (molekulare Sonden: B-1606, B-2603, S-1515, S-1582) sein. Dieser Linker wird mit Aminogruppen von Proteinen umgesetzt, die in oder auf der Oberfläche einer Zelle liegen. Die Zellen werden anschließend gewaschen, um überschüssiges Markierungsmittel zu entfernen, bevor sie mit Zellen aus der zweiten Subpopulation in Kontakt gebracht werden, die einen zweiten Selektionsmarker tragen.
Die zweite Subpopulation von Zellen kann auch einen Membrananker tragen, obwohl er ein unterschiedlicher Membrananker im Vergleich zu der ersten Subpopulation ist. Alternativ kann die zweite Subpopulation einen genetischen Marker tragen. Der genetische Marker kann eine selektive Eigenschaft, wie Arzneimittel Re sistenz oder eine zu screenende Eigenschaft, wie Expression des grünen fluoreszierenden Proteins verleihen.
Nach der Fusion der ersten und zweiten Subpopulation der Zellen und der Gewinnung werden die Zellen gescreent oder hinsichtlich der Anwesenheit von Markern auf beiden Ausgangssubpopulationen selektiert. Zum Beispiel werden Fusionen für eine Population durch Adsorption an spezifische Kugeln angereichert, und diese werden durch FACS^TM hinsichtlich jener, die den Marker exprimieren, sortiert. Zellen, die beide Screens hinsichtlich beider Marker überleben, sind jene, welche eine Protoplasten Fusion durchlaufen haben, und für sie ist es wahrscheinlicher, dass sie rekombinierte Genome aufweisen. Für gewöhnlich werden die Marker gescreent oder getrennt selektiert. Membran gebundene Marker, wie Biotin, können durch Affinitätsanreicherung für den Zellmembran Marker (z.B. durch das "Panning" von fusionierten Zellen auf einer Affinitätsmatrix) gescreent werden. Zum Beispiel können die Zellen für eine Biotin Membran Markierung affinitätsgereinigt werden unter Verwendung von Streptavidin beschichteten magnetischen Kugeln (Dynal). Diese Kugeln werden einige Male gewaschen, um die nicht fusionierten Wirtszellen zu entfernen. Alternativ können die Zellen gegenüber einem Antikörper gegen den Membrananker gepannt werden. In einer weiteren Variation, wenn der Membranmarker fluoreszierend ist, können die Zellen, die den Marker tragen, durch FACS^TM identifiziert werden. Die Screens für genetische Marker hängen von der Natur der Marker ab und schließen die Kapazität ein, auf Arzneimittel behandelten Medien oder FACS^TM Selektion hinsichtlich grün fluoreszierendem Protein zu wachsen. Wenn die erste und die zweite Zellpopulation fluoreszierende Marker mit verschiedenen Wellenlängen aufweisen, können beide Marker gleichzeitig durch FACS^TM Sortierung gescreent werden.
In einem weiteren Selektionsschema für Hybrid Zellen können die ersten und zweiten Populationen von Zellen fusioniert werden, um verschiedene Untereinheiten eines heteromultimeren Enzyms zu exprimieren. Für gewöhnlich weist das heteromultimere Enzym zwei verschiedene Untereinheiten auf, aber heteromultimere Enzyme mit drei, vier oder mehr verschiedenen Untereinheiten können ver wendet werden. Wenn ein Enzym mehr als zwei verschiedene Untereinheiten aufweist, kann jede Untereinheit in einer verschiedenen Subpopulation von Zellen (z.B. drei Untereinheiten in drei Subpopulationen) exprimiert werden, oder es kann mehr als eine Untereinheit in derselben Subpopulation von Zellen exprimiert werden (z.B. eine Untereinheit in einer Subpopulation, zwei Untereinheiten in einer zweiten Subpopulation).
Hybride Zellen, die eine Kombination von Genomen von ersten und zweiten subpopulationskompetenten Zellen repräsentieren, können anschließend durch einen Assay für intaktes Enzym erkannt werden. Ein solcher Assay kann ein Bindungsassay sein, aber er ist typischerweise ein funktioneller Assay (z.B. Kapazität um ein Substrat des Enzyms zu metabolisieren). Die enzymatische Aktivität kann zum Beispiel durch Verarbeiten eines Substrats in ein Produkt mit einem fluoreszierenden Mittel oder einem auf andere Weise einfach nachzuweisenden Emissionsspektrum nachgewiesen werden. Die einzelnen Untereinheiten eines heteromultimeren Enzyms, die in einem solchen Assay verwendet werden, weisen vorzugsweise keine enzymatische Aktivität in der dissoziierten Form auf, oder sie weisen signifikant weniger Aktivität in der dissoziierten Form auf als in der assoziierten Form. Vorzugsweise weisen die Zellen, die für die Fusion verwendet werden, keine endogene Form des heteromultimeren Enzyms auf, oder sie weisen mindestens eine signifikant geringere endogene Aktivität auf, die von dem heteromultimeren Enzym resultiert, das durch Fusion von Zellen gebildet wird.
Penicillinacylase Enzyme, Cephalosporinacylase und Penicillinacyltransferase sind Beispiele von geeigneten heteromultimeren Enzymen. Diese Enzyme werden durch ein einzelnes Gen kodiert, das als ein Proenzym translatiert und durch posttranslationale autokatalytische Proteolyse gespalten wird, um ein Spacer Endopeptid zu entfernen und zwei Untereinheiten zu bilden, die assoziieren, um das aktive heterodimere Enzym zu bilden. Keine Untereinheit ist aktiv in der Abwesenheit der anderen Untereinheit. Jedoch kann die Aktivität rekonstituiert werden, wenn diese getrennten Gen Abschnitte in derselben Zelle durch Kotransformation exprimiert werden. Andere Enzyme, die verwendet werden können, weisen Unter einheiten auf, die durch verschiedene Gene kodiert werden (z.B. faoA und faoB Gene kodieren 3-Oxoacyl-CoA Thiolase von Pseudomonas fragi (Biochem. J 328, 815–820 (1997)).
Ein beispielhaftes Enzym ist Penicillin G Acylase aus Escherichia coli, das zwei Untereinheiten aufweist, die durch ein einzelnes Gen kodiert werden. Fragmente des Gens, welche die zwei Untereinheiten kodieren, die funktionell mit geeigneten expressionsregulatorischen Sequenzen verknüpft sind, werden in die erste und die zweite Subpopulation von Zellen transfiziert, welche endogene Penicillinacylase Aktivität nicht aufweisen. Eine Zelle, die durch Fusion von kompetenten Zellen aus der ersten und der zweiten Subpopulation gebildet wird, exprimiert in zwei Untereinheiten, die sich zusammen lagern, um ein funktionelles Enzym, z.B. Penicillin Acylase zu bilden. Die fusionierten Zellen können anschließend auf Agar Platten mit Penicillin G selektiert werden, das durch Penicillinacylase degradiert wird.
In einer anderen Variation werden fusionierte Zellen durch die Komplementierung von auxotrophen Mutanten identifiziert. Ausgangssubpopulationen von Zellen können mit bekannten auxotrophen Mutationen selektiert werden. Alternativ können auxotrophe Mutationen in einer Ausgangspopulation von Zellen spontan durch das Aussetzen gegenüber einem mutagenen Mittel gebildet werden. Zellen mit auxotrophen Mutationen werden durch Replika Ausplattierung auf Minimal- und vollständigen Medien selektiert. Von Läsionen, die in Auxotrophie resultieren, wird angenommen, dass sie über das Genom verteilt sind, in Genen für Aminosäuren, Nukleotiden und Vitamin Biosynthese Wegen. Nach der Fusion von Ausgangszellen können Zellen, die aus der Fusion resultieren, durch ihre Fähigkeit auf Minimalmedien zu wachsen, identifiziert werden. Diese Zellen können anschließend gescreent oder hinsichtlich Evolution in Richtung einer chemischen Eigenschaft selektiert werden. Weitere Schritte von Mutagenese regenerierenden frischen auxotrophen Mutationen können in anschließende Rekombinationszyklen und Screenen/Selektion eingebaut werden.
In Variationen des obigen Verfahrens kann die de novo Bildung von auxotrophen Mutationen in jeder Runde des Shufflings durch Verwendung derselben Auxotrophen vermieden werden. Zum Beispiel können Auxotrophe durch Transposon Mutagenese unter Verwendung eines Transposons, das Selektionsmarker trägt, gebildet werden. Auxotrophe werden durch einen Screen, wie Replika Plattierung identifiziert. Auxotrophe werden vereinigt, und ein generalisiertes transduzierendes Phagenlysat wird durch Wachstum des Phagens auf einer Population von auxotrophen Zellen hergestellt. Eine getrennte Population von auxotrophen Zellen wird einem genetischen Austausch unterworfen, und die Komplementierung wird verwendet, um Zellen zu selektieren, welche eine genetische Veränderung und Rekombination durchlaufen haben. Diese Zellen werden anschließend gescreent oder hinsichtlich der Annahme einer gewünschten Eigenschaft selektiert. Die Zellen, die das Screenen oder die Selektion überleben, weisen anschließend auxotrophe Marker auf, die durch Einführen der transduzierenden Transposon Bibliothek regeneriert werden. Die neu gebildeten auxotrophen Zellen werden anschließend einem weiteren genetischen Austausch und Screenen/Selektion unterworfen.
In einer weiteren Variation werden auxotrophe Mutationen durch homologe Rekombination mit einem Zielvektor gebildet, der einen Selektionsmarker umfasst, der von Homologie Regionen mit einer biosynthetischen Region des Genoms von Zellen, die entwickelt werden sollen, flankiert wird. Die Rekombination zwischen dem Vektor und den Genom Inserts des positiven Selektionsmarkers in das Genom bewirkt eine auxotrophe Mutation. Der Vektor liegt vor der Einführung von Zellen in linearer Form vor. Gegebenenfalls kann die Frequenz der Einführung des Vektors durch Capping seiner Enden mit Selbstkomplementaritäts-Oligonukleotiden gesteigert werden, die in einer Haarnadel Bildung angeheftet sind. Der genetische Austausch und der Screening-/Selektionsvorgang sind wie oben beschrieben. In jeder Runde werden Zielvektoren erneut eingeführt, welche dieselbe Population von auxotrophen Markern regenerieren.
In anderen Variationen werden fusionierte Zellen durch Screenen hinsichtlich eines genomischen Markers, der auf einer Subpopulation der Ausgangszellen und eines episomalen Markers, der auf einer zweiten Subpopulation von Zellen anwesend ist, identifiziert.
In einer weiteren Variation wird der genetische Austausch zwischen zwei Subpopulationen von Zellen durchgeführt, von denen eine tot ist. Lebensfähige Zellen werden einschließlich hinsichtlich eines Markers gescreent, der auf der toten Ausgangssubpopulation anwesend ist.
Eine andere gewünschte Eigenschaft ist die Fähigkeit, sekundäre Metaboliten, die natürlicherweise durch filamentöse Pilze oder Bakterien gebildet werden, herzustellen. Beispiele von solchen sekundären Metaboliten sind Cyclosporin A, Taxol und Cephalosporine. Zum Beispiel kann die Taxol Herstellung unter Verwendung von Antikörpern gegen Taxol, durch Massenspektroskopie oder UV Spektrophotometrie überwacht werden. Alternativ kann die Herstellung von Zwischenprodukten in der Taxol Synthese oder Enzymen in dem Taxol synethetischen Weg überwacht werden. Concetti & Ripani, Biol. Chem. Hoppe Seyler 375, 419–23 (1994). Andere Beispiele von sekundären Metaboliten sind Polyole, Aminosäuren und Ergosterol.
V. Verfahren für rekursive Sequenz Rekombination
Einige Formate und Beispiele für rekursive Sequenz Rekombination, auf die manchmal als DNA Shuffling oder molekulare Züchtung Bezug genommen wird, wurden von den Erfindern und Mitarbeitern in gleichzeitig anhängigen Patentanmeldungen beschrieben, Anwaltsakte Nr. 16528A-014612, eingereicht am 25. März 1996, PCT/US95/02126, eingereicht am 17. Februar 1995 (veröffentlicht als WO 95/22625); Stemmer, Science 270, 1510 (1995); Stemmer et al., Gene, 164, 49–53 (1995); Stemmer, Bio/Technology, 13, 549–533 (1995); Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10747–10751 (1994); Stemmer, Nature 370, 389–391 (1994); Crameri et al., Nature Medicine, 2(1):1–3, (1996); crateri et al., Nature Biotechnology 14, 315–319 (1996).
(1) In vitro Formate
Ein Format für Shuffling in vitro wird in 1 dargestellt. Die anfänglichen Substrate für die Rekombination sind ein Pool aus verwandten Sequenzen. Die X in der 1, Panel A zeigen wo die Sequenzen voneinander abweichen. Die Sequenzen können DNA oder RNA sein, und sie können verschiedene Längen in Abhängigkeit von der Größe des Gens oder des DNA-Fragments, das rekombiniert oder neu zusammengesetzt werden soll, aufweisen. Vorzugsweise liegen die Sequenzen im Bereich von 50 bp bis 50 kb.
Der Pool von verwandten Substraten wird in überlappende Fragmente umgewandelt, z.B. von ungefähr 5 bp bis 5 kb oder mehr, wie in 1, Panel B gezeigt ist. Häufig liegt die Größe der Fragmente im Bereich von ungefähr 10 bp bis 1000 bp, und manchmal liegt die Größe der DNA-Fragmente im Bereich von ungefähr 100 bis 500 bp. Die Umwandlung kann durch eine Vielzahl von verschiedenen Verfahren durchgeführt werden, wie DNAseI oder RNAse Spaltung, zufälliges Scheren oder teilweise Restriktionsenzym Spaltung. Alternativ kann die Umwandlung von Substraten in Fragmente durch unvollständige PCR Amplifikation von Substraten oder PCR, die von einem einzelnen Primer gestartet wird, durchgeführt werden. Alternativ können geeignete einzelsträngige Fragmente auf einem Nukleinsäure Synthetisiergerät hergestellt werden. Die Konzentration von Nukleinsäure Fragmenten einer bestimmten Länge und Sequenz ist häufig geringer als 0,1 Gew.-% oder 1 Gew.-% der Gesamtnukleinsäure. Die Zahl von verschiedenen spezifischen Nukleinsäure Fragmenten in dem Gemisch beträgt für gewöhnlich mindestens ungefähr 100, 500 oder 1000.
Die gemischte Population von Nukleinsäure Fragmenten wird in mindestens teilweise einzelsträngige Form umgewandelt. Die Umwandlung kann durch Erhitzen auf ungefähr 80°C bis 100°C, weiter bevorzugt von 90°C bis 96°C, um ein zelsträngige Nukleinsäure Fragmente zu bilden, und anschließendes erneutes Anlagern durchgeführt werden. Die Umwandlung kann auch durch Behandlung mit einem Protein, das einzelsträngige DNA bindet oder dem recA Protein durchgeführt werden. Einzelsträngige Nukleinsäure Fragmente mit Regionen von Sequenz Identität mit anderen einzelsträngigen Nukleinsäure Fragmenten können anschließend erneut durch Abkühlen auf 20°C bis 75°C, und vorzugsweise von 40°C bis 65°C angelagert werden. Die Renaturierung kann durch die Zugabe von Polyethylenglykol (PEG), anderen Volumen ausschließenden Reagenzien oder Salz beschleunigt werden. Die Salzkonzentration liegt vorzugsweise im Bereich von 0 mM bis 200 mM, weiter bevorzugt liegt die Salzkonzentration im Bereich von 10 mM bis 100 mM. Das Salz kann KCl oder NaCl sein. Die Konzentration von PEG liegt vorzugsweise im Bereich von 0 % bis 20 %, weiter bevorzugt von 5 % bis 10 %. Die Fragmente, die sich erneut anlagern, können von verschiedenen Substraten stammen, wie in 1, Panel C gezeigt ist. Die angelagerten Nukleinsäure Fragmente werden in der Anwesenheit einer Nukleinsäure Polymerase, wie Taq oder Klenow oder Polymerasen mit einer Korrekturlesefunktion, wie pfu oder pwo, und dNTP's (d.h. dATP, dCTP, dGTP und dTTP) inkubiert. Wenn die Regionen der Sequenz Identität groß sind, kann Taq Polymerase mit einer Anlagerungstemperatur von zwischen 45–65°C verwendet werden. Wenn die Bereiche der Identität klein sind, kann Klenow Polymerase mit einer Anlagerungstemperatur von zwischen 20–30°C verwendet werden (Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994), supra). Die Polymerase kann zu den zufälligen Nukleinsäure Fragmenten vor der Anlagerung, gleichzeitig mit der Anlagerung oder nach der Anlagerung zugegeben werden.
Der Vorgang der Denaturierung, Renaturierung und Inkubation in der Anwesenheit von Polymerase von überlappenden Fragmenten, um eine Sammlung von Polynukleotiden mit verschiedenen Permutationen oder Fragmenten zu bilden, wird manchmal als Shuffling der Nukleinsäure in vitro bezeichnet. Dieser Zyklus wird für eine gewünschte Anzahl von Malen wiederholt. Die resultierenden Nukleinsäuren sind eine Familie von doppelsträngigen Polynukleotiden von ungefähr 50 bp bis ungefähr 100 kb, vorzugsweise von 500 bp bis 50 kb, wie in 1, Panel D gezeigt ist. Die Population repräsentiert Varianten der Ausgangssubstrate, die eine substanzielle Sequenz Identität dazu zeigen, aber die auch in verschiedenen Positionen abweichen. Die Population weist viel mehr Mitglieder auf als die Ausgangssubstrate. Die Population von Fragmenten, die von dem Shuffling resultieren, wird verwendet, um Wirtszellen zu transformieren, gegebenenfalls nach Klonierung in einen Vektor.
In einer Variation von in vitro Shuffling können Subsequenzen von Rekombinatinossubstraten durch Amplifizieren der Gesamtlängensequenzen unter Bedingungen gebildet werden, die eine substanzielle Fraktion, typischerweise mindestens 20 % oder mehr von unvollständig verlängerten Amplifikationsprodukten bilden. Die Amplifikationsprodukte, einschließlich der unvollständig verlängerten Amplifikationsprodukte, werden denaturiert und mindestens einem zusätzlichen Zyklus des erneuten Anlagerns und der Amplifikation unterworfen. Diese Variation, in der mindestens ein Zyklus des erneuten Anlagerns und der Amplifikation eine substanzielle Fraktion von unvollständig verlängerten Produkten liefert, wird als "Stuttering" bezeichnet. In der nachfolgenden Amplifikationsrunde lagern sich die unvollständig verlängerten Produkte erneut an und starten die Extension von unterschiedlichen sequenzverwandten Matrizenspezies.
In einer weiteren Variation wird ein Gemisch aus Fragmenten mit einem oder mehreren Oligonukleotiden besetzt (engl.: "spiked"). Die Oligonukleotide können derart gestaltet sein, dass sie vorher charakterisierte Mutationen einer Wildtyp Sequenz oder Stellen von natürlichen Variationen zwischen Individuen oder Spezies, einschließen. Die Oligonukleotide schließen auch eine ausreichende Sequenz oder strukturelle Homologie ein, die solche Mutationen oder Variationen flankieren, um das Anlagern an die Wildtyp Fragmente zu erlauben. Einige Oligonukleotide können zufällige Sequenzen sein. Die Anlagerungstemperaturen können in Abhängigkeit von Homologielänge eingestellt werden.
In einer weiteren Variation findet die Rekombination in mindestens einem Zyklus bei Matrizenwechsel (engl.: "template switching") statt, wie wenn ein DNA- Fragment, das von einer Matrize abgeleitet ist, an der homologen Position auf einer verwandten aber verschiedenen Matrize startet. Der Matrizenaustausch kann durch Zugabe von recA, rad51, rad55, rad57 oder anderen Polymerasen (z.B. virale Polymerasen, reverse Transkriptase) zu dem Amplifikationsgemisch induziert werden. Der Matrizenwechsel kann auch durch Steigern der DNA Matrizenkonzentration gesteigert werden.
In einer weiteren Variation kann mindestens ein Amplifikationszyklus unter Verwendung einer Sammlung von überlappenden einzelsträngigen DNA-Fragmenten von verwendeter Sequenz und unterschiedlichen Längen durchgeführt werden. Die Fragmente können unter Verwendung eines einzelsträngigen DNA Phagen, wie M13, hergestellt werden. Jedes Fragment kann an die Polynukleotid Kette hybridisieren und die Polynukleotidketten Extension eines zweiten Fragments aus der Kollektion starten, wodurch Sequenz rekombinierte Polynukleotide gebildet werden. In einer weiteren Variation können ssDNA-Fragmente von variabler Länge aus einem einzelnen Primer durch Vent oder eine andere DNA Polymerase aus einer ersten DNA Matrize gebildet werden. Die einzelsträngigen DNA Fragmente werden als Primer für eine zweite Matrize des Kunkel Typs verwendet, die aus einer Uracil enthaltenden zirkulären ssDNA besteht. Dies führt zu multiplen Substitutionen der ersten Matrize in die zweite. Siehe Levichkin et al., Mol. Biology 29, 572–577 (1995).
(2) In vivo Formate
(a) Plasmid-Plasmid Rekombination
Die anfänglichen Substrate für die Rekombination sind eine Sammlung von Polynukleotiden, die variante Formen eines Gens umfassen. Die varianten Formen zeigen häufig substanzielle Sequenz Identität zueinander, die ausreichend ist, um eine homologe Rekombination zwischen den Substraten zu erlauben. Die Diversität zwischen den Polynukleotiden kann natürlich (z.B. allelische oder Speziesvarianten), induziert (z.B. fehleranfällige PCR) oder das Ergebnis von in vitro Rekom bination sein. Die Diversität kann auch von erneut synthetisierten Genen, die natürliche Proteine mit alternativen und/oder gemischter Codon Verwendung, kodieren, stammen. Es sollte mindestens ausreichend Diversität zwischen den Substraten geben, dass die Rekombination unterschiedlichere Produkte bilden kann als sie als Ausgangsmaterialien vorliegen. Es muss mindestens zwei Substrate geben, die sich an mindestens zwei Positionen unterscheiden. Jedoch wird für gewöhnlich eine Bibliothek aus Substraten mit 10³–10⁸ Mitgliedern verwendet. Der Grad der Diversität hängt von der Länge des Substrats, das rekombiniert wird und dem Ausmaß der funktionellen Änderung, die entwickelt werden soll, ab. Die Diversität zwischen 0,1 bis 50 % der Positionen ist typisch. Die verschiedenen Substrate werden in Plasmide eingebaut. Die Plasmide sind häufig Standard Klonierungsvektoren, z.B. bakterielle Multikopien Plasmide. Jedoch schließen die Plasmide in einigen Verfahren, die unten beschrieben werden, Mobilisierungsfunktionen ein. Die Substrate können in dasselbe oder verschiedene Plasmide eingebaut werden. Häufig werden mindestens zwei verschiedene Typen von Plasmiden mit verschiedenen Typen von Selektionsmarkern verwendet, um eine Selektion für Zellen mit mindestens zwei Typen von Vektoren zu erlauben. Wenn verschiedene Typen von Plasmiden eingesetzt werden, können die verschiedenen Plasmide auch von zwei unterschiedlichen Inkompatibilitätsgruppen stammen, um eine stabile Koexistenz von zwei verschiedenen Plasmiden innerhalb der Zelle zu erlauben. Nichts desto trotz können Plasmide aus derselben Inkompatibilitätsgruppe innerhalb derselben Zelle für einen ausreichenden Zeitraum koexistieren, um zu erlauben, dass eine homologe Rekombination stattfindet.
Plasmide mit unterschiedlichen Substraten werden anfänglich in eine prokaryonte oder eukaryonte Zelle durch irgendein Transfektionsverfahren (z.B. chemische Transformation, natürliche Kompetenz, Elektroporation, virale Transduktion oder Biolistik) eingeführt. Häufig sind die Plasmide an oder nahe der sättigenden Konzentration (bezüglich der maximalen Transfektionskapazität) anwesend, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass mehr als ein Plasmid in dieselbe Zelle eintritt. Die Plasmide mit verschiedenen Substraten können gleichzeitig oder in multiplen Runden transfiziert werden. In dem zuletzt genannten Ansatz können zum Beispiel Zellen mit einem ersten Plasmid Aliquot transfiziert werden, Transfektanten können selektiert und vermehrt werden, und anschließend können sie mit einem zweiten Plasmid Aliquot infiziert werden.
Nachdem die Plasmide in die Zellen eingeführt wurden, findet eine Rekombination zwischen Substraten, um rekombinante Gene zu bilden, innerhalb der Zellen mit multiplen verschiedenen Plasmiden nur durch die Vermehrung in den Zellen statt. Zellen, die nur ein Plasmid erhalten haben, sind jedoch nicht in der Lage an der Rekombination teilzunehmen, und der mögliche Beitrag von Substraten auf solchen Plasmiden an der Evolution wird nicht vollständig ausgenutzt, obwohl diese Plasmide in gewissem Ausmaß beitragen können, wenn sie in Mutator Zellen vermehrt werden oder auf andere Weise Punktmutationen (z.B. durch ultraviolette Bestrahlungsbehandlung) anreichern. Die Evolutionsgeschwindigkeit kann dadurch erhöht werden, dass alle Substrate an der Rekombination teilnehmen. Dies kann erreicht werden, indem transfizierte Zellen einer Elektroporation unterworfen werden. Die Bedingungen für die Elektroporation sind dieselben, wie jene, die herkömmlich für das Einführen exogener DNA in Zellen (z.B. 1.000–2.500 Volt, 400 μF und eine 1–2 mM Lücke) verwendet werden. Unter diesen Bedingungen werden Plasmide zwischen Zellen ausgetauscht, was es erlaubt, dass alle Substrate an der Rekombination teilnehmen. Zusätzlich können die Rekombinationsprodukte weitere Rekombinationsrunden miteinander oder mit dem Ausgangssubstrat durchlaufen. Die Evolutionsgeschwindigkeit kann auch durch die Verwendung von konjugativem Transfer erhöht werden. Konjugative Transfersysteme sind in vielen Bakterien (E. coli, P. aeruginosa, S. pneumoniae, und H. influenzae) bekannt, und sie können auch verwendet werden, um DNA zwischen Bakterien und Hefe oder zwischen Bakterien und Säugerzellen zu transferieren.
Um den konjugativen Transfer auszunutzen, werden Substrate in Plasmide mit MOB Genen kloniert, und tra Gene werden auch in cis oder trans zu den MOB Genen bereitgestellt. Die Wirkung des konjugativen Transfers ist sehr ähnlich zur Elektroporation, dahingehend, dass er es Plasmiden erlaubt, sich zwischen den Zellen zu bewegen und es erlaubt, dass eine Regeneration zwischen irgendeinem Substrat und den Produkten der vorherigen Rekombination stattfindet, allein durch das Vermehren der Kultur. Die Details, wie konjugativer Transfer in diesen Vektoren ausgenutzt wird, werden detaillierter unten diskutiert. Die Evolutionsgeschwindigkeit kann auch durch das Fusionieren von Protoplasten von Zellen gesteigert werden, um den Austausch von Plasmiden oder Chromosomen zu induzieren. Die Fusion kann durch chemische Mittel, wie PEG, oder Viren oder virale Proteine, wie Influenza Virus Hämagglutinin, induziert werden. Die Evolutionsgeschwindigkeit kann auch durch die Verwendung von Mutator Wirtszellen (z.B. Mut L, S, D, T, H) gesteigert werden.
Der Zeitraum für den die Zellen vermehrt werden und die Rekombination stattfindet, variiert selbstverständlich mit dem Zelltyp, aber er ist im Allgemeinen nicht kritisch, weil selbst ein kleiner Rekombinationsgrad die Diversität relativ zu den Ausgangsmaterialien substanziell erhöhen kann. Zellen, die Plasmide mit rekombinierten Genen tragen, werden einem Screenen oder einer Selektion für eine gewünschte Funktion unterworfen. Wenn zum Beispiel das zu entwickelnde Substrat ein Arzneimittel Resistenzgen trägt, selektiert man hinsichtlich Arzneimittel Resistenz. Zellen, die das Screenen oder die Selektion überleben, können einer oder mehreren Screening-/Selektionsrunden gefolgt von Rekombination unterworfen werden, oder sie können direkt einer zusätzlichen Rekombinationsrunde unterworfen werden.
Die nächste Rekombinationsrunde kann durch einige verschiedene Formate erreicht werden, die unabhängig von der vorherigen Runde sind. Zum Beispiel kann eine weitere Rekombinationsrunde einfach durchgeführt werden, durch Wiederaufnahme der Elektroporation oder des konjugationsvermittelten interzellulären Transfers von Plasmiden, die oben beschrieben sind. Alternativ kann ein frisches Substrat oder frische Substrate, das gleiche oder im Vergleich zu den vorherigen Substraten verschieden ist in die Zellen, welche die Selektion/das Screenen überlebt haben, transfiziert werden. Gegebenenfalls können die neuen Substrate in Plasmid Vektoren eingeschlossen werden, die einen anderen selektiven Marker tragen und/oder von einer anderen Inkompatibilitätsgruppe als die Ausgangsplas mide abgeleitet sind. Als eine weitere Alternative können Zellen, welche die Selektion/das Screenen überlebt haben, in zwei Subpopulationen eingeteilt werden, und Plasmid DNA von einer Subpopulation kann in die andere transfiziert werden, wo die Substrate von den Plasmiden von zwei Subpopulationen eine weitere Rekombinationsrunde durchlaufen. In beiden der zuletzt. genannten zwei Optionen kann die Evolutionsgeschwindigkeit gesteigert werden, indem DNA Extraktion, Elektroporation, Konjugation oder Mutator Zellen eingesetzt werden, wie oben beschrieben ist. In noch einer weiteren Variation kann DNA aus Zellen, die das Screenen/die Selektion überlebt haben, extrahiert und einem in vitro DNA Shuffling unterworfen werden.
Nach der zweiten Rekombinationsrunde wird eine zweite Screening-/Selektionsrunde durchgeführt, vorzugsweise unter Bedingungen mit gesteigerter Stringenz. Wenn gewünscht, können weitere Rekombinationsrunden und eine weitere Selektion/ein weiteres Screening unter Verwendung derselben Strategie wie für die zweite Runde durchgeführt werden. Mit aufeinanderfolgenden Rekombinationsrunden und Selektion/Screenen entwickeln sich die überlebenden rekombinierten Substrate in Richtung der Annahme eines gewünschten Phänotyps. Typisch in diesen und anderen Verfahren der rekursiven Rekombination unterscheidet sich das Endprodukt der Rekombination, das den gewünschten Phänotyp angenommen hat, von den Ausgangssubstraten an 0,1 %–25 % der Positionen, und es hat sich mit einer Geschwindigkeit in der Größenordnung im Übermaß (z.B. mindestens 10-fach, 100-fach, 1000-fach oder 10.000-fach) der Geschwindigkeit von natürlich angenommenen Mutationen von ungefähr 1 Mutation pro 10^–9 Positionen pro Generation entwickelt (siehe Anderson & Hughes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 906–907 (1996)).
(b) Virus-Plasmid Rekombination
Die Strategie, die für Plasmid-Plasmid Rekombination verwendet wurde, kann auch für Virus-Plasmid Rekombination verwendet werden; für gewöhnlich eine Phagen-Plasmid Rekombination. Jedoch sind einige zusätzliche Kommentare ins besondere für die Verwendung von Viren angebracht. Die Ausgangssubstanzen für die Rekombination werden in sowohl Plasmid als auch virale Vektoren kloniert. Es ist für gewöhnlich nicht kritisch, welche/s Substrat/e in den viralen Vektor und welche/s in das Plasmid eingebaut werden, obwohl für gewöhnlich der virale Vektor (ein) verschiedene/s Substrat/e im Vergleich zu dem Plasmid enthalten sollte. Wie zuvor erwähnt enthält das Plasmid (und das Virus) typischerweise einen Selektionsmarker. Die Plasmid und viralen Vektoren können beide in Zellen durch Transfektion, wie oben beschrieben, eingeführt werden. Ein wirksameres Verfahren ist es jedoch, die Zellen mit Plasmid zu transfizieren, Transfektanten zu selektieren und die Transfektanten mit Virus zu infizieren. Weil die Infektionswirksamkeit von vielen Viren sich an 100 % der Zellen annähert, enthalten die meisten Zellen, die auf diese Weise transfiziert und infiziert wurden, sowohl ein Plasmid als auch ein Virus, die verschiedene Substrate tragen.
Die homologe Rekombination findet zwischen dem Plasmid und dem Virus statt, was sowohl rekombinierte Plasmide als auch rekombinierte Viren bildet. Bei einigen Viren, wie einem filamentösen Phagen, in dem die intrazelluläre DNA in sowohl doppelsträngigen als auch einzelsträngigen Formen existiert, können beide an der Rekombination teilnehmen. Vorausgesetzt, dass das Virus keines ist, das Zellen schnell abtötet, kann die Rekombination durch die Verwendung von Elektroporation oder Konjugation, um Plasmide zwischen Zellen zu transferieren, erhöht werden. Die Rekombination kann auch für einige Virustypen erhöht werden, indem es dem Nachkommen Virus von einer Zelle erlaubt wird, andere Zellen erneut zu infizieren. Für einige Virustypen zeigen Virus infizierte Zellen Resistenz gegenüber Superinfektion. Jedoch kann eine solche Resistenz durch das Infizieren mit hoher Multiplizität und/oder der Verwendung von mutanten Stämmen des Virus, in denen die Resistenz gegenüber Superinfektion verringert ist, überwunden werden.
Das Ergebnis des Infizierens von Plasmid enthaltenden Zellen mit Virus hängt von der Natur des Virus ab. Einige Viren, wie ein filamentöser Phage, existieren stabil mit einem Plasmid in der Zelle, und sie geben auch Nachkommen Phagen aus der Zelle ab. Andere Viren, wie Lambda mit einem Cosmid Genom, existieren stabil in einer Zelle wie Plasmide, ohne Nachkommen Virionen zu bilden. Andere Viren, wie der T-Phage und lytischer Lambda, durchlaufen eine Rekombination mit Plasmid aber töten schließlich die Wirtszelle und zerstören die Plasmid DNA. Für Viren, die Zellen ohne Abtöten des Wirts infizieren, können Zellen mit rekombinanten Plasmiden und Virus unter Verwendung desselben Ansatzes wie für die Plasmid-Plasmid Rekombination gescreent/selektiert werden. Nachkommen Virus, das von Zellen abgegeben wird, welche die Selektion/das Screenen überlebt haben, können auch gesammelt und als Substrate in anschließenden Rekombinationsrunden verwendet werden. Für Viren, die ihre Wirtszellen abtöten, liegen rekombinante Gene, die aus der Rekombination stammen, nur in dem Nachkommen Virus vor. Wenn der Screening oder selektive Assay die Expression von rekombinanten Genen in einer Zelle benötigt, sollten die rekombinanten Gene von dem Nachkommen Virus auf einen anderen Vektor, z.B. einem Plasmid Vektor transferiert und in Zellen erneut transfiziert werden, bevor die Selektion/das Screenen durchgeführt wird.
Bei einem filamentösen Phagen sind die Rekombinationsprodukte sowohl in Zellen, welche die Rekombination überleben als auch in dem Phagen, der aus diesen Zellen abgegeben wird, anwesend. Die doppelte Quelle von rekombinanten Produkten stellt einige zusätzliche Möglichkeiten im Vergleich zu der Plasmid-Plasmid Rekombination bereit. Zum Beispiel kann DNA aus Phagen Partikeln zur Verwendung in der Runde in vitro Rekombination isoliert werden. Alternativ kann Nachkommen Phage verwendet werden, um Zellen zu transfizieren oder zu infizieren, die eine vorherige Screening-/Selektionsrunde überlebt haben, oder frische Zellen können mit frischen Substraten für die Rekombination transfiziert werden.
(c) Virus-Virus Rekombiation
Die Prinzipen, die für Plasmid-Plasmid und Plasmid-virale Rekombination beschrieben wurden, können auf Virus-Virus Rekombination mit wenigen Modifikationen angewendet werden. Die Ausgangssubstrate für die Rekombination werden in einem viralen Vektor kloniert. Für gewöhnlich wird derselbe Vektor für alle Substrate verwendet. Vorzugsweise ist das Virus eines, das, natürlich oder als ein Ergebnis von Mutation, Zellen nicht abtötet. Nach dem Einbau können einige virale Genome in vitro verpackt werden. Die verpackten Viren werden verwendet, um Zellen mit hoher Multiplizität zu infizieren, so dass es eine hohe Wahrscheinlichkeit gibt, dass eine Zelle multiple Viren erhält, die unterschiedliche Substrate tragen.
Nach der anfänglichen Infektionsrunde hängen die nachfolgenden Schritte von der Natur der Infektion, wie in dem vorherigen Abschnitt diskutiert wurde, ab. Wenn die Viren zum Beispiel Phagemid Genome, wie Lambda Cosmide oder M13, F1 oder Fd Phagemide, aufweisen, benehmen sich die Phagemide innerhalb der Zelle wie Plasmide und durchlaufen eine Rekombination einfach durch das Vermehren der Zelle. Die Rekombination kann durch Elektroporation von Zellen erhöht werden. Nach der Selektion/dem Screenen können Cosmide mit rekombinanten Genen aus überlebenden Zellen (z.B. Hitzeinduktion einer cos^– lysogenen Wirtszelle) gewonnen, erneut in vitro verpackt und verwendet werden, um frische Zellen mit hoher Multiplizität für eine weitere Rekombinationsrunde zu infizieren.
Wenn die Viren ein filamentöser Phage sind, findet die Rekombination der replizierenden DNA Form durch das Vermehren der Kultur von infizierten Zellen statt. Die Selektion/das Screenen identifiziert Kolonien von Zellen mit viralen Vektoren mit rekombinanten Genen mit verbesserten Eigenschaften, wobei der Phage aus solchen Zellen abgegeben wird. Die nachfolgenden Möglichkeiten sind im Wesentlichen dieselben wie für die Plasmid-virale Rekombination.
(d) Chromosomen-Plasmid Rekombination
Dieses Format kann verwendet werden, um sowohl chromosomal als auch Plasmid abstammende Substrate zu entwickeln. Das Format ist insbesondere nützlich in Situationen, in denen viele chromosomale Gene zu einem Phänotyp beitragen oder man die genaue Lage auf dem/den chromosomalen Gen/en, das/die entwi ckelt werden soll/en, nicht kennt. Die anfänglichen Substrate für die Rekombination werden in einen Plasmid Vektor kloniert. Wenn das/die chromosomalen Gen/e, das/die entwickelt werden soll/en bekannt sind, bilden die Substrate eine Sequenz Familie, die einen hohen Grad an Sequenz Identität aber einige Abweichung von dem chromosomalen Gen zeigt. Wenn die chromosomalen Gene, die entwickelt werden sollen, nicht lokalisiert wurden, bilden die Ausgangssubstrate für gewöhnlich eine Bibliothek von DNA Segmenten, von denen nur eine kleine Zahl Sequenz Identität mit dem Gen oder den Genen, das/die entwickelt werden soll/en, zeigt. Ein Unterschied zwischen von Plasmid abstammendem Substrat und dem/den chromosomalen Gen/en kann durch Mutagenese eingeführt werden oder durch Erhalten der Plasmid abstammenden Substrate aus einer unterschiedlichen Spezies als jene der Zellen, die das Chromosom tragen.
Die Plasmid tragenden Substrate für die Rekombination werden in Zellen mit (einem) chromosomalen Gen/en, das/die entwickelt werden soll/en, transfiziert. Die Evolution kann einfach durch Vermehren der Kultur stattfinden, und sie kann beschleunigt werden durch Transferieren der Plasmide zwischen Zellen durch Konjugation oder Elektroporation. Die Evolution kann weiter durch die Verwendung von Mutator Wirtszellen oder durch das Aussäen einer Kultur von nicht Mutator Wirtszellen, die mit Mutator Wirtszellen entwickelt werden und dem Induzieren von interzellulärem Transfer von Plasmiden durch Elektroporation oder Konjugation beschleunigt werden. Vorzugsweise enthalten die Mutator Wirtszellen, die für das Aussäen verwendet werden, einen negativen Selektionsmarker, um die Isolierung einer reinen Kultur aus den entwickelten nicht Mutator Zellen, zu erleichtern. Die Selektion/das Screenen identifiziert Zellen, die Chromosomen tragen und/oder Plasmide, die sich in Richtung der Annahme einer gewünschten Funktion entwickelt haben.
Nachfolgende Rekombinationsrunden und Selektions-/Screeningrunden schreiten auf die gleiche Weise fort, wie jene, die für Plasmid-Plasmid Rekombination beschrieben sind. Zum Beispiel kann eine weitere Rekombination durch Vermehren der Zellen, welche die Rekombination überlebt haben, in Kombination mit Elektro poration oder konjugativem Transfer von Plasmiden bewirkt werden. Alternativ können Plasmide, die zusätzliche Substrate für die Rekombination tragen, in die überlebenden Zellen eingeführt werden. Vorzugsweise stammen diese Plasmide von einer anderen Inkompatibilitätsgruppe und tragen einen anderen Selektionsmarker als die Ausgangsplasmide, um die Selektion für Zellen mit mindestens zwei verschiedenen Plasmiden zu erlauben. Als eine weitere Alternative können Plasmid und/oder chromosomale DNA aus einer Subpopulation von überlebenden Zellen isoliert und in eine zweite Subpopulation transfiziert werden. Die chromsomale DNA kann in einem Plasmid Vektor vor der Transfektion kloniert werden.
(e) Virus-Chromosomen Rekombination
Wie in dem anderen oben beschriebenen Verfahren ist das Virus für gewöhnlich eines, das die Zellen nicht abtötet, und es ist häufig ein Phage oder ein Phagemid. Das Verfahren ist im Wesentlichen dasselbe wie für die Plasmid-Chromosomen Rekombination. Substrate für die Rekombination werden in dem Vektor kloniert. Die Vektoren, welche die Substrate einschließen, können anschließend in Zellen transfiziert oder in vitro verpackt und in Zellen durch Infektion eingeführt werden. Die viralen Genome rekombinieren mit Wirtschromosomen nur durch das Vermehren einer Kultur. Die Evolution kann beschleunigt werden, indem der interzelluläre Transfer von viralen Genomen durch Elektroporation oder die erneute Infektion von Zellen durch Nachkommen Virionen zugelassen wird. Das Screenen/Die Selektion identifiziert Zellen mit Chromosomen und/oder viralen Genomen, die sich in Richtung der Annahme einer gewünschten Funktion entwickelt haben.
Es gibt verschiedene Möglichkeiten für nachfolgende Rekombinationsrunden. Zum Beispiel können virale Genome zwischen Zellen durch Elektroporation transferiert werden, welche die Selektion/Rekombination überlebt haben. Alternativ können Viren, die von Zellen abgegeben werden, welche die Selektion/das Screenen überlebt haben, gepoolt und verwendet werden, um die Zellen mit hoher Multiplizität zu überinfizieren. Alternativ können frische Substrate für die Rekombination in die Zellen, entweder auf Plasmid oder viralen Vektoren, eingeführt werden.
BEISPIELE
Beispiele, die nicht spezifisch die beanspruchte Erfindung betreffen, sind nur für die Darstellung eingeschlossen.
1. Entwicklung von hyperrekombinogenem RecA
Das RecA Protein ist in die meisten homologen Rekombinationswege von E. coli involviert. Die meisten Mutationen in recA inhibieren die Rekombination, aber von einigen wurde berichtet, dass sie die Rekombination erhöhen (Kowalczykowski et al., Microbiol. Rev., 58, 401–465 (1994)). Das folgende Beispiel beschreibt die Evolution von RecA, um hyperrekombinogene Aktivität anzunehmen, die in in vivo Shuffling Formaten nützlich ist.
Hyperrekombinogenes RecA wurde unter Verwendung einer Modifikation eines Systems ausgewählt, das von Shen et al., Genetics 112, 441–457 (1986); Shen et al., Mol. Gen. Genet. 218, 358–360 (1989) entwickelt wurde, um die Wirkung von Substratlänge und Homologie auf die Rekombinationsfrequenz zu messen. Das System von Shen & Huang verwendete Plasmide und Bakteriophagen mit kleinen (31–430 bp) Homologie Regionen, an denen die beiden rekombinieren sollten. In einem restriktiven Wirt war nur der Phage, welcher die Plasmid Sequenz eingebaut hatte, in der Lage, Plaques zu bilden.
Für das Shuffling von von recA wurde endogenes recA und mutS aus dem Wirtsstamm MC1061 deletiert. In diesem Stamm wurde keine Rekombination zwischen Plasmid und Phage beobachtet. E. coli recA wurde anschließend in zwei der Rekombinationsvektoren (Bp221 und πMT631c18) kloniert. Die Plasmide mit kloniertem recA waren in der Lage, mit homologem Phagen zu rekombinieren: λV3 (530 bp Identität mit Bp221), λV13 (430 bp Spanne von 89 % Identität mit Bp221) und λlink H (31 bp Identität mit πMT631c18, mit Ausnahme von 1 Fehlpaarung an Position 18).
Das klonierte recA wurde anschließend in vitro unter Verwendung der Standard DNase Behandlung gefolgt von PCR basierter erneuter Zusammenlagerung geshuffelt. Die geshuffelten Plasmide wurden in den nicht rekombinierten Wirtsstamm transformiert. Diese Zellen wurden über Nacht angezogen, mit dem Phagen λVc, λV13 oder λlink H infiziert und auf NZCYM Platten in der Anwesenheit eines 10-fachen Überschusses von MC1061 ohne Plasmid ausplattiert. Umso wirksamer ein recA Allel die Rekombination zwischen Plasmid und Phage fördert, desto höher ist das Allel in der Bakteriophagen DNA repräsentiert. Das anschließende Ernten der gesamten Phagen von den Platten und das Gewinnen der recA Gene selektiert für die meisten rekombinogenen recA Allele.
Die Rekombinationsfrequenzen für Wildtyp und einen Pool von hyperrekombinogenem recA nach 3 Runden des Shufflings waren wie folgt:
Die Ergebnisse zeigen einen 50-fachen Anstieg in der Rekombination für das 430 bp Substrat und einen 5-fachen Anstieg für das 31 bp Substrat.
Die Rekombinationsfrequenz zwischen BP221 und V3 für fünf individuelle klonale Isolate sind unten gezeigt, und die DNA und Protein Sequenzen und die Anordnungen davon sind in die 12 und 13 eingeschlossen.

Wildtyp: 1,6 × 10^–4
Klon 2: 9,8 × 10^–3 (61 × Anstieg)
Klon 4: 9,9 × 10^–3 (62 × Anstieg)
Klon 5: 6,2 × 10^–3 (39 × Anstieg)
Klon 6: 8,5 × 10^–3 (53 × Anstieg)
Klon 13: 0,019 × 10^–3 (116 × Anstieg)

Die Klone 2, 4, 5, 6 und 13 können als Substrate in nachfolgenden Shuffling Runden verwendet werden, wenn eine weitere Verbesserung in recA gewünscht ist. Nicht alle der Variationen von der Wildtyp recA Sequenz tragen notwendigerweise zu dem hyperrekombinogenen Phänotyp bei. Stille Variationen können durch Rückkreuzung eliminiert werden. Alternativ können Varianten von recA, die individuelle Punkte von Variationen aus dem Wildtyp an den Codons 5, 18, 156, 190, 236, 268, 271, 283, 304, 312, 317, 345 und 353 eingebaut haben, hinsichtlich Aktivität getestet werden.
2. Evolution des Gesamtorganismus für Hyperrekombination
Die Möglichkeit der Selektion von einen E. coli Stamm mit einer gesteigerten Rekombinationsmenge war aus den Phänotypen von Wildtyp, ΔrecA, mutS und ΔrecA mutS Stämmen nach Exposition gegenüber Mitomycin C, einem Interstrang Kreuzvernetzungsmittel der DNA, angezeigt.
Das Aussetzen von E. coli gegenüber Mitomycin C verursacht Interstrang Kreuzvernetzung von DNA, wodurch die DNA Replikation blockiert wird. Die Reparatur der Interstrang DNA Überkreuzungen in E. coli verläuft über einen RecA abhängigen rekombinatorischen Reparaturweg (Friedberg et al., in DNA Repair and Mutagenesis (1995) S. 191–232). Die Verarbeitung der Überkreuzungen während der Reparatur führt zu gelegentlichen Doppelstrang DNA Brüchen, die auch durch einen RecA abhängigen rekombinatorischen Weg repariert werden. Folglich sind recA Stämme signifikant sensitiver als Wildtyp Stämme bezüglich des Aussetzens gegenüber Mitomycin C. Tatsächlich wird Mitomycin C in einfachen Disk-Sensitivitätsassays verwendet, um zwischen recA⁺ und recA^– Stämmen zu unterscheiden.
Zusätzlich zu seinen rekombinogenen Eigenschaften ist Mitomycin C ein Mutagen. Das Aussetzen gegenüber DNA schädigenden Mitteln, wie Mitomycin C, führt ty pischerweise zu der Induktion des E. coli SOS Regulons, was Produkte einschließt, die in die fehlerhafte Reparatur von DNA Schädigung involviert sind (Friedberg et al., 1995, supra, S. 465–522).
Nach der Phagen P1 vermittelten generalisierten Transduktion des Δ(recA-srl):: Tn10 Allels (einem nichtfunktionellen Allel) in Wildtyp und mutS E. coli, wurden Tetracyclin resistente Transduktanten hinsichtlich eines recA" Phänotyps unter Verwendung des Mitomycin C Sensitivitätsassays gescreent. Es wurde in LB Überschichtungen mit einer 1/4 Inch Filterscheibe, die mit 10 μg Mitomycin C gesättigt war nach 48 Stunden bei 37°C beobachtet, dass das Wachstum der Wildtyp und mutS Stämme innerhalb einer Region mit einem Radius von 10 mm von dem Zentrum der Scheibe inhibiert war. Die DNA Kreuzvernetzung bei großen Mengen von Mitomycin C sättigt die rekombinatorische Reparatur, was zu einer lethalen Blockierung von DNA Replikation führt. Beide Stämme zeigten gelegentlich Kolonie bildende Einheiten innerhalb der Inhibitionszone, obwohl die Frequenz der Kolonien ~ 10- bis 20-fach höher in den mutS Stamm war. Dies liegt wahrscheinlich an der gesteigerten Rate von spontaner Mutation in mutS Hintergründen. Ein Seite an Seite Vergleich zeigt, dass die ΔrecA und ΔrecA mutS Stämme signifikant sensitiver gegenüber Mitomycin C waren, wobei das Wachstum in einer Region, die sich über ungefähr 15 mm von dem Zentrum der Scheibe erstreckte, inhibiert war. Im Gegensatz zu den recA⁺ Stämmen wurden jedoch keine Mit Individuen innerhalb der Region der Wachstumsinhibition, nicht einmal in dem mutS Hintergrund, beobachtet. Das Auftreten von Mit Individuen in recA⁺ Hintergründen, aber nicht in ΔrecA Hintergründen, zeigt an, dass Mit von einem funktionellen recA Protein abhängig ist, und es liegt nahe, dass Mit aus einer gesteigerten Kapazität von rekombinatorischer Reparatur von Mitomycin C induziertem Schaden resultiert.
Die Mutationen, die zu einer gesteigerten Kapazität für recA vermittelte rekombinatorische Reparatur führen, können verschieden, unerwartet, unverbunden und möglicherweise synergistisch sein. Ein rekursives Protokoll, das die Selektion für Mit verändert, und chromosomales Shuffling entwickelt einzelne Zellen mit einer stark gesteigerten Kapazität für Rekombination.
Das rekursive Protokoll ist wie folgt. Nach dem Aussetzen eines mutS Stammes gegenüber Mitomycin C werden Mit Individuen vereinigt und gekreuzt (z.B. über Hfr vermitteltes chromosomales Shuffling oder Split-Pool generalisierte Transduktion). Allele, die zu Mit führen und möglicherweise zu einer gesteigerten Kapazität für rekombinatorische Reparatur führen, werden unter den Populationen in der Abwesenheit von Fehlpaarungsreparatur geshuffelt. Zusätzlich kann eine fehleranfällige Reparatur nach dem Aussetzen gegenüber Mitomycin neue Mutationen in die nächste Shuffling Runde einführen. Der Vorgang wird unter Verwendung eines steigenden stringenteren Aussetzens gegenüber Mitomycin C wiederholt. Eine Anzahl von parallelen Selektionen in der ersten Runde wird als ein Mittel des Bildens eines Vielzahl von Allelen durchgeführt. Gegebenenfalls kann die Rekombinogenität von Isolaten für Hyperrekombination unter Verwendung eines Plasmid × Plasmid Assays oder eines Chromosomen × Chromosomen Assays (z.B. jener von Konrad, J. Bacteriol. 130, 167–172 (1977)) überwacht werden.
3. Shuffling von ganzen Genomen von Streptomyces coelicolor
Um zu zeigen, dass rekursive Mutation und Rekombination eines gesamten Genoms verwendet werden können, um einen bestimmten Phänotyp zu verbessern, wurde S. coelicolor rekursiv sowohl alleine als auch mit seinen nahen Verwandten S. lividans geshuffelt, um die Gesamtproduktion des blauen Pigments γ-Actinorhodin zu verbessern. Diese Strang Verbesserungsstrategie wird mit einem ähnlichen Strang Verbesserungsprogramm verglichen, welches keine Rekombination einschließt.
Sporensuspensionen von S. coelicolor und S. lividans werden in sterilem Wasser resuspendiert und einer UV Mutagenese (600 "Energie" Einheiten) unter Verwendung eines Stratalinker (Stratagene) unterworfen, und die resultierenden Mutanten werden auf Sporulationsagar "ausgewachsen". Sporen wurden gesammelt und auf festem RG-2 Medium ausplattiert (Bystrykh et al., J. Bact. 178, 2238–2244 (1996)). Kolonien, die größere und dunklere Halos von blauen Pigment bildeten, wurden selektiert, in flüssigem RG-2 Medium angezogen, und die Menge von gebildetem γ-Actinorhodin wurde spektrophotometrisch durch das Messen der Absorption bei 650 nm von alkalischen Kulturüberständen unter Verwendung eines Mikrotiter Plattenformats gemessen. Die Pigment Konzentration und Struktur wurde weiter durch LC/MS, MS/MS und/oder NMR bestätigt. Zellen, die γ-Actinorhodin in Mengen größer als jene des Wildtyps bildeten, wurden in das Stamm Verbesserungsprogramm übertragen. Sporen, die aus jeder der Mutanten isoliert wurden, wurden entweder 1) erneut mutagenisiert und wie oben gescreent (keine Rekombinationskontrolle) oder, 2) angezogen, wie Protoplasten hergestellt und fusioniert. Die Verfahren zum Herstellen und Fusionieren von Streptomyces Protoplasten sind beschrieben in Genetic Manipulation of Streptomyces – A Laboratory Manual, (Hopwood, D.A. et al.). Die regenerierten fusionierten Protoplasten werden anschließend wie oben für Klone gescreent, welche eine Rekombination durchlaufen haben, die γ-Actinorhodin in Mengen bilden, die höher sind als in den Zellen, die fusioniert wurden. Die selektierten Klone werden einer UV Mutagenese erneut unterzogen, und das Screenen und die Rekombination werden rekursiv wiederholt, bis die gewünschte Menge der ☐-Actinorhodin Bildung erreicht ist.

Claims

In vitro-Verfahren zum Entwickeln einer bakeriellen oder archaebakteriellen Zelle, um eine gewünschte Eigenschaft zu erlangen, umfassend: (1) Bilden von Protoplasten einer Population von verschiedenen bakteriellen oder archaebakteriellen Zellen; (2) Verschmelzen bzw. Fusionieren der Protoplasten, um Hybrid-Protoplasten zu bilden, in denen Genome von den Protoplasten rekombinieren, um Hybrid-Genome zu bilden; (3) Inkubieren der Hybrid-Protoplasten unter Bedingungen, welche die Regeneration von Zellen fördern; (4) Auswählen oder Screenen, um die regenerierten Zellen zu isolieren, die sich in Richtung der Erwerbung der gewünschten Eigenschaft entwickelt haben; (5) Wiederholen der Schritte (1) bis (4) mit regenerierten Zellen in Schritt (4), welche verwendet werden, um die Protoplasten in Schritt (1) zu bilden, bis die regenerierten Zellen die gewünschte Eigenschaft erworben haben.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend den Schritt des Auswählens oder Screenens für fusionierte Protoplasten, die frei von nicht fusionierten Protoplasten der Eltern-Zellen sind.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend das Auswählen oder Screenen, um regenerierte Zellen mit Hybrid-Genomen, welche frei von Zellen mit Eltern-Genomen sind, zu isolieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine erste Subpopulation von Zellen einen ersten Marker enthält und eine zweite Subpopulation von Zellen einen zweiten Marker enthält, und das Verfahren weiter das Auswählen oder Screenen zum Identifizieren regenerierter Zellen, welche sowohl den ersten als auch den zweiten Marker exprimieren, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der erste Marker ein Membranmarker ist und der zweite Marker ein genetischer Marker ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der erste Marker eine erste Untereinheit eines heteromeren Enzyms und der zweite Marker eine zweite Untereinheit des heteromeren Enzyms ist.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend das Transformieren von Protoplasten mit einer Bibliothek von DNA-Fragmenten in mindestens einem Zyklus.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die DNA-Fragmente von einem Restriktionsenzyms begleitet werden.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend das Exponieren der Protoplasten mit ultravioletter Strahlung in mindestens einem Zyklus.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die gewünschte Eigenschaft die Expression eines Proteins oder sekundären Metabolits oder die Sekretion eines Proteins oder sekundären Metabolits ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der sekundäre Metabolit Taxol ist.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend das Exponieren der Protoplasten mit einem mutagenen Mittel in mindestens einem Zyklus.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Population der verschiedenen Zellen bakterielle Zellen sind.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die verschiedenen Zellen Zellen eines Streptomyces sp. sind.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Zellen einer Streptomyces sp. Streptomyces coelicolor oder Streptomyces lividans sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Population von verschiedenen Zellen archaebakterielle Zellen sind.