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TECHNISCHES
GEBIET
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Die
Erfindung betrifft das technische Gebiet der molekularen Genetik,
um die Genome von bakteriellen oder archaebakteriellen Zellen zu
evolvieren bzw. zu entwickeln, um neue und verbesserte Eigenschaften
zu erlangen.
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HINTERGRUND
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Zellen
weisen eine Vielzahl von gut etablierten Verwendungen in der Molekularbiologie
auf. Zum Beispiel werden Zellen für gewöhnlich als Wirte für das Manipulieren
von DNA in Vorgängen
wie Transformation und Rekombination verwendet. Zellen werden auch
für die
Expression von rekombinanten Proteinen, die durch DNA kodiert werden,
die in die Zellen transformiert wurde, verwendet. Obwohl all diese
Vorgänge
jetzt Routineverfahren sind, haben sich die Genome der in diesen
Vorgängen
verwendeten Zellen wenig von den Genomen von natürlichen Zellen entwickelt,
und insbesondere nicht in Richtung der Erlangung von neuen und verbesserten
Eigenschaften für
die Verwendung in den obigen Vorgängen.
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Der
traditionelle Ansatz für
die künstliche
oder erzwungene molekulare Evolution fokussiert auf die Optimierung
eines einzelnen Gens mit einem diskreten bzw. getrennten und selektierbaren
Phänotyp.
Die Strategie ist, ein Gen zu klonieren, eine diskrete Funktion
für das
Gen und einen Assay, durch den es selektiert werden kann, zu identifizieren,
ausgewählte
Positionen in dem Gen zu mutieren (z.B. durch fehleranfällige PCR
oder Kassettenmutagenese) und Varianten des Gens für die Verbesserung
der bekannten Funktion des Gens zu selektieren bzw. auswählen. Eine
Variante mit verbesserter Funktion kann anschließend in einem gewünschten
Zelltyp exprimiert werden. Dieser Ansatz weist eine Vielzahl von
Be schränkungen
auf. Zunächst
ist er nur auf Gene anwendbar, die isoliert und funktionell charakterisiert
wurden. Zweitens ist der Ansatz für gewöhnlich nur auf Gene anwendbar,
die eine diskrete Funktion aufweisen. Mit anderen Worten können multiple Gene,
die kooperativ einen einzelnen Phänotyp verleihen, für gewöhnlich nicht
auf diese Weise optimiert werden. Wahrscheinlich weisen die meisten
Gene kooperative Funktionen auf. Schließlich kann dieser Ansatz nur eine
sehr begrenzte Zahl der Gesamtzahl von Permutationen selbst für ein einzelnes
Gen untersuchen. Zum Beispiel würde
das Variieren selbst jeder zehnten Position in einem Protein mit
jeder möglichen
Aminosäure 2010 Varianten bilden, was mehr ist als durch
bestehende Verfahren der Transfektion und des Screenens bearbeitet
werden kann.
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Angesichts
dieser Beschränkungen
ist der traditionelle Ansatz für
das Verbessern zellulärer
Genome zu vielen nützlichen
Eigenschaften unzureichend. Um zum Beispiel die Kapazität einer
Zelle, ein rekombinantes Protein zu exprimieren, zu verbessern kann
eine Modifikation in irgendeinem oder allen einer substanziellen
Zahl von Genen, die bekannt oder unbekannt sind, die Rollen in der
Transkription, Translation, posttranslationalen Modifikation, Sekretion
oder proteolytischen Degradation, unter anderem, spielen, erforderlich
machen. Der Versuch, einzeln selbst alle der bekannten Gene mit
solchen Funktionen zu optimieren, wäre eine nahezu unmögliche Aufgabe,
ganz zu schweigen von der Optimierung bislang unbekannter Gene,
die zu der Expression in bislang noch nicht verstandenen Weisen
beitragen können.
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Die
vorliegende Erfindung stellt inter alia neue Verfahren zum Entwickeln
des Genoms von ganzen Zellen bereit, welche die Schwierigkeiten
und Beschränkungen
der Verfahren des Standes der Technik überwinden.
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Hopwood
("The Many Faces
of Recombination" in
Genetics of Industrial Microorganisms, Seiten 1–9, American Society for Microbiology,
Washington, 1979) schlägt
die Verwendung von Protoplasten Fusion in einem verbesserten Programm
für bakterielle
Stämme
vor.
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DEFINITIONEN
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Der
Begriff "verwandt" betrifft eine Gen
Sequenz, die entwicklungsgeschichtlich und funktionell zwischen
Spezies verwandt ist. Zum Beispiel ist in dem humanen Genom das
humane CD4 Gen das verwandte Gen zu dem Maus CD4 Gen, weil die Sequenzen
und Strukturen dieser zwei Gene anzeigen, dass sie stark homolog
sind, und beide Gene kodieren ein Protein, das in der Signal T-Zell-Aktivierung
durch MHC Klasse II-restringierte Antigen Erkennung wirkt.
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Das
Screenen ist im Allgemeinen ein Vorgang mit zwei Schritten, in dem
der erste bestimmt, welche Zellen einen Screening Marker exprimieren
und welche nicht und anschließend
die Zellen mit der gewünschten Eigenschaft
physisch trennt. Die Selektion ist eine Form des Screenens, in der
die Identifizierung und physikalische Trennung gleichzeitig durch
die Expression eines Selektionsmarkers erreicht werden, der, unter
bestimmten genetischen Umständen,
es Zellen, die den Marker exprimieren, erlaubt, zu überleben,
während
andere Zellen absterben (oder vice versa). Screening Marker schließen Luciferase, β-Galctosidase
und grünes fluoreszierendes
Protein ein. Selektionsmarker schließen Arzneimittel und Toxin
Resistenzgene ein.
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Ein
exogenes DNA-Fragment ist eines, das fremd (oder heterolog) für die Zelle
oder homolog für
die Zelle ist, aber in einer Position innerhalb der Wirtszell Nukleinsäure, in
der das Element für
gewöhnlich
nicht gefunden wird. Exogene DNA Segmente können exprimiert werden, um
exogene Polypeptide zu erhalten.
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Der
Begriff "Gen" wird breit verwendet,
um irgendein Segment von DNA zu bedeuten, das mit einer biologischen
Funktion assoziiert ist. Somit schließen Gene kodierende Sequenzen
und/oder regulatorische Sequenzen ein, die für ihre Expression benötigt werden.
Gene schließen
auch nicht exprimierte DNA Segmente ein, die zum Beispiel Erkennungssequenzen
für andere
Proteine bilden.
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Die
prozentuale Sequenz Identität
wird berechnet durch das Vergleichen von zwei optimal ausgerichteten
Sequenzen über
ein Vergleichsfenster, das Bestimmen der Zahl von Positionen, an
denen identische Nukleinsäure
Basen in beiden Sequenzen auftreten, um die Zahl der übereinstimmenden
Positionen zu erhalten, das Dividieren der Zahl von übereinstimmenden
Positionen durch die Gesamtzahl von Positionen in dem Vergleichsfenster.
Eine optimale Ausrichtung von Sequenzen für die Ausrichtung eines Vergleichsfensters
können durch
die Rechner gestützte
Implementierung der Algorithmen GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA in
dem Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer
Group, 575 Science Dr., Madison, WI durchgeführt werden.
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Der
Begriff "natürlich vorkommend" wird verwendet,
um ein Objekt zu beschreiben, das in der Natur gefunden werden kann.
Zum Beispiel ist eine Polypeptid oder Polynukleotid Sequenz, die
in einem Organismus (einschließlich
Viren) anwesend ist, die aus einer Quelle in der Natur isoliert
werden kann, und die nicht absichtlich durch den Menschen in einem
Labor modifiziert wurde, natürlich
vorkommend. Im Allgemeinen betrifft der Begriff "natürlich
vorkommend" ein
Objekt, wie es in einem nicht pathologischen (nicht erkrankten)
Individuum anwesend ist, wie es für die Spezies typisch ist.
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Eine
asexuelle Rekombination ist eine Rekombination, die ohne die Fusion
von Gameten stattfindet, um eine Zygote zu bilden.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER BEANSPRUCHTEN ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft Verfahren zum Entwickeln von Bakterien oder Archaebakterien,
um eine gewünschte
Eigenschaft zu erlangen, wie in den Ansprüchen angegeben ist. Solche
Verfahren können
das Einführen
von Genom Fragmenten in eine Vielzahl von Zellen mit sich bringen,
wobei mindestens eines der Fragmente eine Rekombination mit einem
Segment in dem Genom oder einem Episom der Zellen durchläuft, um modifizierte
Zellen zu bilden. Die modifizierten Zellen werden anschließend hinsichtlich
modifizierter Zellen gescreent, die sich in Richtung der Erlangung
der gewünschten
Funktion entwickelt haben. DNA aus den modifizierten Zellen, die
sich in Richtung der gewünschten
Funktion entwickelt haben, wird anschließend mit weiteren genomischen
Fragmenten rekombiniert, von denen mindestens eines eine Rekombination
mit einem Segment in dem Genom oder dem Episom der modifizierten
Zellen durchläuft,
um weitere modifizierte Zellen zu bilden. Die weiteren modifizierten
Zellen werden anschließend
hinsichtlich weiterer modifizierter Zellen nach weiteren modifizierten
Zellen gescreent, die sich weiter in Richtung der Erlangung der
gewünschten
Funktion entwickelt haben. Die Schritte der Rekombination und des
Screenens/der Selektion werden wie benötigt wiederholt, bis die weiter
modifizierten Zellen die gewünschte
Funktion erlangt haben.
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In
einigen Verfahren ist die gewünschte
Funktion die Sekretion eines Proteins, und die Vielzahl der Zellen
umfasst weiterhin ein Konstrukt, das ein Protein kodiert. Gegebenenfalls
ist das Protein toxisch für
die Vielzahl von Zellen, außer
es wird sekregiert, und die modifizierten oder weiter modifizierten
Zellen, die sich in Richtung der Erlangung der gewünschten
Funktion entwickelt haben, werden durch das Propagieren der Zellen
und das Gewinnen der überlebenden
Zellen gescreent.
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In
einigen Verfahren ist die gewünschte
Funktion gesteigerte Rekombination. In solchen Verfahren umfasst
die Bibliothek von Fragmenten manchmal ein Cluster von Genen, die
zusammen die Rekombinationskapazität verleihen. Das Screening
kann erreicht werden unter Verwendung von Zellen, die weiterhin
ein Gen umfassen, das einen Marker kodiert, dessen Expression durch
eine Mutation, die durch Rekombination entfernbar ist, vermieden
werden kann. Die Zellen werden durch ihre Expression des Markers
gescreent, die von der Entfernung der Mutation durch Rekombination
stammen.
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Die
Erfindung stellt weiterhin Verfahren zum Entwickeln einer Zelle,
um eine gewünschte
Funktion zu erlangen, bereit. Diese Verfahren bringen das Bereitstellen
einer Population von zwei verschiedenen bakteriellen oder archaebakteriellen
Zellen mit sich. Die Zellen werden unter Bedingungen kultiviert,
in denen DNA zwi schen Zellen ausgetauscht wird, wodurch Zellen mit
Hybrid Genomen gebildet werden. Die Zellen werden anschließend gescreent
oder hinsichtlich Zellen selektiert, die sich in Richtung der Erlangung
einer gewünschten
Eigenschaft entwickelt haben. Der DNA Austausch und die Screening/Selektionsschritte
werden wenn notwendig wiederholt, wobei die gescreenten/selektierten
Zellen aus einem Zyklus die Population von verschiedenen Zellen
in dem nächsten
Zyklus bilden, bis eine Zelle die gewünschte Eigenschaft erlangt
hat.
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Gegebenenfalls
umfasst das Verfahren weiterhin das Transformieren einer Bibliothek
von DNA-Fragmenten in mindestens einem Zyklus.
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Die
beanspruchten Verfahren zum Entwickeln einer Zelle, um eine gewünschte Eigenschaft
zu erlangen, werden durch Protoplasten-vermittelten Austausch von
DNA zwischen Zellen bewirkt. Solche Verfahren bringen das Bilden
von Protoplasten einer Population von verschiedenen Zellen mit sich.
Die Protoplasten werden anschließend verschmolzen bzw. fusioniert,
um hybride Protoplasten zu bilden, in denen Genome von den Protoplasten
rekombinieren, um Hybrid Genome zu bilden. Die Hybrid Protoplasten
werden unter Bedingungen inkubiert, welche die Regeneration von
Zellen fördern.
Der nächste
Schritt ist das Auswählen
oder Screenen, um regenerierte Zellen zu isolieren, die sich in
Richtung der Erlangung der gewünschten
Eigenschaft entwickelt haben. Der DNA Austausch und die Selektions-/Screeningschritte
werden wenn notwendig wiederholt, wobei die regenerierten Zellen
in einem Zyklus verwendet werden, um die Protoplasten in dem nächsten Zyklus
zu bilden, bis die regenerierten Zellen die gewünschte Eigenschaft erlangt
haben. Einige Verfahren umfassen weiterhin einen Schritt des Selektierens
oder Screenens für
fusionierte Protoplasten, die frei von nicht fusionierten Protoplasten
der Eltern-Zellen sind. Einige Verfahren umfassen weiterhin einen
Schritt des Selektierens oder Screenens für fusionierte Protoplasten
mit Hybrid Genomen, die frei von Zellen mit Eltern Genome sind.
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In
einigen Verfahren ist die gewünschte
Eigenschaft die Expression und/oder Sekretion eines Proteins oder
sekundären
Metaboliten, wie Taxol.
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KURZBESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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Figuren,
welche die beanspruchte Erfindung nicht betreffen, werden nur zur
Darstellung bereitgestellt.
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1:
Schema für
in vitro Shuffling von Genen.
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12: (A, B, C und D) DNA Sequenzen eines
Wildtyp recA Proteins (als Neu Minshall bezeichnet) und fünf hyperrekombinogene
Varianten davon.
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13:
Aminosäuresequenz
eines Wildtyp recA Proteins und fünf hyperrekombinogene Varianten
davon.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG
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1. Allgemeines
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Der basische
Ansatz
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Die
Erfindung stellt Verfahren zum künstlichen
Entwickeln von bakteriellen und archaebakteriellen Zellen bereit,
um eine neue oder verbesserte Eigenschaft durch rekursive Sequenz
Rekombination zu erlangen. Kurz gesagt bringt die rekursive Sequenz
Rekombination aufeinanderfolgende Zyklen von Rekombination und Screenen/Selektion
mit sich, um eine molekulare Diversität zu bilden. Dies bedeutet,
dass eine Familie von Nukleinsäure
Molekülen
gebildet wird, die substanzielle Sequenz und/oder strukturelle Identität zueinander zeigen,
aber sich in der Anwesenheit von Mutationen unterscheiden. Jeder
Rekombinationszyklus wird von mindestens einem Zyklus des Screenens
oder der Selektion nach Molekülen
mit einer gewünschten
Eigenschaft gefolgt. Das/die Molekül/e, das/die in einer Runde
selektiert wurden, bilden die Ausgangsmaterialien für die Bildung
von Diversität
in der nächsten
Runde.
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Die
zu entwickelnden Zellen sind bakteriell oder Archaebakterien und
können
eine homogene Zelllinie oder eine gemischte Kultur darstellen. Geeignete
Zellen für
die Entwicklung schließen
bakterielle Zelllinien, die für
gewöhnlich
in der Gentechnik und Protein Expression verwendet werden, ein.
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Interessant
sind viele bakterielle Zelltypen, sowohl Gram-negative als auch
Grampositive, wie Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. cereus,
Escherichia coli, Pseudomonas, Salmonella, Actinomycetes und Erwinia. Die
vollständige
Genom Sequenz von E. coli und Bacillus subtilis wurden beschrieben
von Blattner et al., Science 277, 1454–1462 (1977); Kunst et al.,
Nature 390, 249–256
(1997).
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Die
Entwicklung beginnt durch die Bildung einer Population von verschiedenen
Zellen. Typischerweise sind die Zellen in der Population von derselben
Art, aber sie stellen Varianten einer Vorläufer Zelle dar. Unter gewissen
Umständen
ist die Variation natürlich,
wie wenn verschiedene Zellen von verschiedenen Individuen innerhalb
einer Spezies erhalten werden, oder wenn sie von verschiedenen Spezies
erhalten werden. Unter anderen Umständen wird die Variation durch
Mutagenese einer Vorläufer
Zelle induziert. Die Mutagenese kann bewirkt werden, indem die Zelle
mutagenen Mitteln unterworfen wird, oder wenn die Zelle eine Mutator
Zelle ist (z.B. sie weist Mutationen in Genen auf, die in der DNA
Replikation, Rekombination und/oder der Reparatur eine Rolle spielen,
welche die Einführung
von Mutationen begünstigen),
einfach durch das Vermehren der Mutator Zellen. Mutator Zellen können aus
aufeinanderfolgenden Selektionen nach einfachen phänotypischen Änderungen
gebildet werden (z.B. die Erlangung von Rifampicin Resistenz, anschließend Nalidixinsäure Resistenz,
anschließend
lac– zu
lac+ (siehe Mao et al., J. Bacteriol. 179, 417–422 (1997)).
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Unter
anderen Umständen
ist die Variation das Ergebnis des Transferierens einer Bibliothek
von DNA-Fragmenten in die Zellen (z.B. durch Konjugation, Transformation,
Transduktion oder natürliche
Kompetenz). Mindestens eines, und für gewöhnlich viele Fragmente in der
Bibliothek zeigen einige, wenn nicht eine voll ständige Sequenz oder strukturelle
Identität
mit einem verwandten oder allelischen Gen innerhalb der Zellen,
was ausreichend ist, dass eine homologe Rekombination stattfindet.
Die Bibliothek von Fragmenten kann von einer oder mehreren Quellen
abgeleitet sein. Eine Quelle von Fragmenten ist eine genomische
Bibliothek von Fragmenten aus einer anderen Spezies, eines anderen
Zelltyps, eines anderen Organismus oder eines anderen Individuums
von den Zellen, die transfiziert werden. In dieser Situation weisen
viele der Fragmente in der Bibliothek ein verwandtes oder allelisches
Gen in den Zellen, die transformiert werden, auf, aber unterscheiden
sich von diesem Gen aufgrund der Anwesenheit von natürlich vorkommenden
Spezies Variationen, Polymorphismen und Mutationen. Alternativ kann
die Bibliothek von DNA von demselben Zelltyp, der transformiert
wird, abgeleitet sein, nachdem diese DNA einer induzierten Mutation
durch herkömmliche
Verfahren, wie Bestrahlung, fehleranfällige PCR, Wachstum in einem
Mutator Organismus oder Kassettenmutagenese unterzogen wurde. In
jeder dieser Situationen kann die genomische Bibliothek eine vollständige genomische
Bibliothek oder eine subgenomische Bibliothek sein, die zum Beispiel
von einem selektierten Chromosom oder einem Teil eines Chromosoms
oder einem episomalen Element innerhalb der Zelle abgeleitet ist.
Ebenso wie diese oder anstelle dieser Quellen von DNA-Fragmenten
kann die Bibliothek Fragmente enthalten, die natürliche oder selektierte Varianten
von selektierten Genen von bekannten Funktionen (d.h. fokussierte
Bibliotheken) darstellen.
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Die
Zahl der Fragmente in einer Bibliothek kann von einem einzelnen
Fragment bis ungefähr
1010 schwanken, wobei Bibliotheken mit 103 bis 108 Fragmenten
normal sind. Die Fragmente sollten ausreichend lang sein, so dass
sie eine homologe Rekombination durchlaufen können, und sie sollten ausreichend
kurz sein, so dass sie in eine Zelle eingeführt, und falls notwendig vor
der Einführung
manipuliert bzw. verändert werden
können.
Die Fragmentgrößen können von
10 b bis 1000 kb, wobei Größen von
500–10.000
Basen normal sind, reichen. Die Fragmente können doppel- oder einzelsträngig sein.
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Die
Fragmente können
in Zellen als ganze Genome oder als Bestandteile von Viren, Plasmiden,
YACs, HACs oder BACs eingeführt
werden, oder sie können
so eingeführt
werden wie sie sind, wobei in diesem Fall alle oder die meisten
Fragmente keinen Replikationsursprungspunkt aufweisen. Die Verwendung
von viralen Fragmenten mit einzelsträngigen Genomen bietet den Vorteil,
dass die Fragmente in einzelsträngiger
Form verabreicht werden, was die Rekombination fördert. Die Fragmente können auch
mit einem Selektionsmarker vor der Einführung verbunden werden. Der
Einschluss von Fragmenten in einen Vektor mit einem Replikationsursprungspunkt
benötigt
einen längeren
Zeitraum nach der Einführung
in die Zelle, während
dem die Fragmente die Rekombination mit einem verwandten Gen durchlaufen,
bevor sie degradiert oder gegenselektiert werden und aus der Zelle
verloren gehen, wodurch der Anteil von Zellen mit rekombinanten
Genomen gesteigert wird. Gegebenenfalls ist der Vektor ein Suizid
Vektor, der in der Lage ist, länger
als ein isolierte DNA-Fragment zu existieren, aber der nicht in
der Lage ist, dauerhaft in einer Zelllinie gehalten zu werden. Ein
solcher Vektor kann transient einen Marker für einen ausreichenden Zeitraum
exprimieren, um hinsichtlich einer Zelle zu screenen oder eine Zelle
zu selektieren, die den Vektor trägt, aber der anschließend degradiert
oder auf andere Weise unfähig
gemacht wird, den Marker zu exprimieren. Die Verwendung von solchen
Vektoren kann vorteilhaft sein beim Durchführen von anschließenden Rekombinationsrunden,
die unten diskutiert werden. Zum Beispiel exprimieren manche Suizid
Vektoren ein langlebiges Toxin, das durch ein kurzlebiges Molekül neutralisiert
wird, das von demselben Vektor exprimiert wird. Die Expression des
Toxins alleine wird nicht erlauben, dass der Vektor etabliert wird.
Jense & Gerdes,
Mol. Microbiol., 17, 205–210
(1995); Bernard et al., Gene 162, 159–160. Alternativ kann ein Vektor
durch den Einbau eines fehlerhaften Replikationsursprungspunkts
(d.h. temperatursensitiv) oder durch das Weglassen eines Replikationsursprungspunktes
suizidal gemacht werden. Vektoren können auch durch den Einschluss
von negativen Selektionsmarkern, wie sacB in vielen Bakterien, suizidal
gemacht werden. Diese Gene werden nur in der Anwesenheit von spezifischen
Verbindungen toxisch. Solche Vektoren können derart ausgewählt werden,
dass sie einen breiten Bereich von Stabilitäten aufweisen.
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Nach
der Einführung
in Zellen können
die Fragmente mit DNA, die in dem Genom oder Episomen der Zellen
anwesend ist durch homologe, nicht homologe oder seitenspezifische
Rekombination rekombinieren. Für
die vorliegenden Zwecke liefert die homologe Rekombination den signifikantesten
Beitrag zu der Entwicklung der Zellen, weil diese Form der Rekombination
die existierende Diversität
zwischen der DNA der Zellen, die transfiziert wurden und den DNA-Fragmenten
amplifiziert. Wenn zum Beispiel ein DNA-Fragment, das transfiziert
wurde, sich von einem verwandten oder allelischen Gen an zwei Positionen
unterscheidet, gibt es vier mögliche
Rekombinationsprodukte, und jedes dieser Rekombinationsprodukte
kann in verschiedenen Zellen in der transformierten Population gebildet
werden. Somit verdoppelt die homologe Rekombination des Fragments
die anfängliche
Diversität
in diesem Gen. Wenn viele Fragmente mit entsprechenden verwandten oder
allelischen Genen rekombinieren, steigt die Diversität der Rekombinationsprodukte
bezüglich
der Ausgangsprodukte exponentiell mit der Zahl der Fragmente. Der
Rekombination führt
zu modifizierten Zellen mit modifzierten Genomen und/oder Episomen.
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Die
varianten Zellen, egal ob sie das Ergebnis von natürlicher
Variation, Mutagenese oder Rekombination sind, werden gescreent
oder selektiert, um eine Untergruppe von Zellen zu identifizieren,
die sich in Richtung der Erlangung einer neuen oder verbesserten
Eigenschaft entwickelt haben. Die Natur des Screens hängt selbstverständlich von
der Eigenschaft ab, und verschiedene Beispiele werden unten diskutiert.
Gegebenfalls wird das Screening vor dem Durchführen anschließender Rekombinationszyklen
wiederholt. Die Stringenz kann in wiederholten Screening Zyklen
gesteigert werden.
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Die
Subpopulation von Zellen, die das Screening überleben, werden einer weiteren
Rekombinationsrunde unterworfen. Unter bestimmten Umständen wird
die weitere Rekombinationsrunde durch das Propagieren der Zellen
unter Bedingungen durchgeführt,
welche den Austausch von DNA zwischen Zellen erlauben. Zum Beispiel
können
Protoplasten aus den Zellen gebildet werden, sie können fusionie ren,
und Zellen mit rekombinanten Genomen können aus den fusionierten Protoplasten
propagiert werden. Alternativ kann der Austausch von DNA durch das
Propagieren von Zellen in einem elektrischen Feld gefördert werden.
Bei Zellen, die einen konjugativen Transfer Apparat aufweisen, kann
der Austausch von DNA einfach durch das Propagieren der Zellen gefördert werden.
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In
anderen Verfahren wird die weitere Rekombinationsrunde durch einen
Trennungs- und Wiedervereinigungsansatz (engl.: "split and pool approach") durchgeführt. Dies
bedeutet, dass die überlebenden
Zellen in zwei Pools geteilt werden. DNA wird aus einem Pool isoliert
und, falls notwendig, amplifiziert und anschließend in den anderen Pool transformiert.
Folglich bilden DNA-Fragmente aus dem ersten Pool eine weitere Bibliothek
von Fragmenten und rekombinieren mit verwandten Fragmenten in dem
zweiten Pool, was zu weiterer Diversität führt.
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In
anderen Verfahren werden einige oder alle der Zellen, die das Screenen überleben,
mit einer frischen Bibliothek von DNA-Fragmenten transfiziert, welche
dieselbe oder verschieden sein kann von der Bibliothek, die in der
ersten Rekombinationsrunde verwendet wurde. In dieser Situation
durchlaufen die Gene der frischen Bibliothek eine Rekombination
mit verwandten Genen in den überlebenden
Zellen. Wenn Gene als Bestandteile eines Vektors eingeführt werden,
sollte die Kompatibilität
bzw. Verträglichkeit
dieses Vektors mit irgendeinem Vektor, der in einer vorhergehenden
Transfektionsrunde verwendet wurde, in Betracht gezogen werden.
Wenn der Vektor, der in einer vorhergehenden Runde verwendet wurde,
ein Suizid Vektor war, gibt es kein Inkompatibilitätsproblem.
Wenn jedoch der Vektor, der in einer vorherigen Runde verwendet
wurde, kein Suizid Vektor war, sollte ein Vektor mit einem unterschiedlichen
Inkompatibilitätsursprungspunkt
in der nachfolgenden Runde verwendet werden. In all diesen Formaten
bildet die weitere Rekombination zusätzliche Diversität in dem
DNA Bestandteil der Zellen, was zu weiteren modifizierten Zellen
führt.
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Die
weiteren modifizierten Zellen werden einer anderen Screening-/Selektionsrunde
denselben Prinzipien wie in der ersten Runde unterworfen. Das Screenen/die
Selektion identifiziert eine Subpopulation von weiter modifizierten
Zellen, die sich weiter in Richtung der Erlangung der Eigenschaft
entwickelt haben. Diese Subpopulation von Zellen kann weiteren Rekombinations-
und Screeningrunden gemäß denselben
Prinzipien unterworfen werden, wobei gegebenenfalls die Stringenz
des Screnens in jeder Runde gesteigert wird. Schließlich werden
Zellen identifiziert, welche die gewünschte Eigenschaft erlangt
haben.
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Variationen
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Positive Selektion
für allelischen
Austausch
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Die
Erfindung kann in Verbindung mit Verfahren zum Anreichern von Zellen
verwendet werden, die modifizierte Gene in Bezug auf die Ausgangszellen
tragen. Dies kann erreicht werden durch das Einführen einer DNA-Fragment Biliothek
in einen Suizid Vektor (d.h. er weist keinen funktionellen Replikationsursprungspunkt
in dem Empfänger
Zelltyp auf), der sowohl positive als auch negative Selektionsmarker
enthält.
Gegebenenfalls können
multiple Fragment Bibliotheken von verschiedenen Quellen (z.B. B.
subtilis, B. licheniformis und B. cereus) in verschiedene Vektoren
kloniert werden, die verschiedene Selektionsmarker tragen. Geeignete
positive Selektionsmarker schließen neoR,
KanamycinR, hyg, hisD, gpt, ble, tetR, hprt, ura3 und sacB ein. Geeignete negative
Selektionsmarker schließen
hsv-tk, hprt, gpt und Cytosindesaminase ein. Eine andere Strategie
für das
Anwenden einer negativen Selektion ist es, ein Wildtyp rpsL Gen
(kodierendes ribosomales Protein S12) in einem Vektor für die Verwendung
in Zellen mit einem mutanten rpsL Gen einzuschließen, was Streptomycin
Resistenz vermittelt. Die mutante Form von rpsL ist in Zellen mit
Wildtyp rpsL rezessiv. Somit selektiert die Selektion hinsichtlich
SM Resistenz gegen Zellen mit einer Wildtyp Kopie von rpsL. Siehe Skorupski & Taylor, Gene
169, 47–52
(1996). Alternativ können
Vektoren, die nur einen positiven Selektionsmarker tragen, für eine Selektionsrunde
für Zellen
verwendet werden, die den Marker exprimieren, und für eine anschließende Screening
Runde für
Zellen, die den Marker verloren haben (z.B. Screenen hinsichtlich
Arzneimittel Sensitivität).
Der Screen für
Zellen, die den positiven Selektionsmar ker verloren haben, ist äquivalent zum
Screenen gegen die Expression eines negativen Selektionsmarkers.
Zum Beispiel kann Bacillus mit einem Vektor transformiert werden,
der ein CAT Gen und eine zu integrierende Sequenz trägt, transformiert
werden. Siehe Harwood & Cutting,
Molecular Biological Methods for Bacillus auf S. 31–33. Die
Selektion für
Chloramphenicol Resistenz isoliert Zellen, die den Vektor aufgenommen
haben. Nach einem geeigneten Zeitraum, um die Rekombination zu erlauben,
isoliert die Selektion für
CAT Sensitivität
Zellen, die das CAT Gen verloren haben. Ungefähr 50 % dieser Zellen werden
eine Rekombination mit der zu integrierenden Sequenz durchlaufen.
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Suizid
Vektoren, die einen positiven Selektionsmarker und gegebenenfalls
einen negativen Selektionsmarker und ein DNA-Fragment tragen, können in
die wirtschromosomale DNA durch ein einzelnes Crossover an einer
Stelle in der chromosomalen DNA, die homolog zu dem Fragment ist,
integrieren. Die Rekombination bildet einen integrierten Vektor,
der von direkten Repetitionen der homologen Sequenz flankiert ist.
In einigen Zellen führt
die anschließende
Rekombination zwischen den Repetitionen zu dem Ausschneiden des Vektors
und entweder zu der Annahme einer gewünschten Mutation von dem Vektor
durch das Genom oder die Wiederherstellung des Genoms des Wildtyps.
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In
den vorliegenden Verfahren, nach dem Transfer der Gen Bibliothek,
die in einen geeigneten Vektor kloniert ist, wird eine positive
Selektion zur Expression des positiven Selektionsmarkers angewendet.
Weil nicht integrierte Kopien des Suizid Vektors schnell aus den
Zellen entfernt werden, reichert diese Selektion Zellen an, die
den Vektor in das Wirtschromosom integriert haben. Die Zellen, welche
die positive Selektion überleben,
können
anschließend
propagiert und einer negativen Selektion unterworfen werden, oder
sie können hinsichtlich
des Verlustes des positiven Selektionsmarkers gescreent werden.
Die negative Selektion selektiert Gegenzellen, die den negativen
Selektionsmarker exprimieren. Somit exprimieren Zellen, die den
integrierten Vektor behalten haben, den negativen Marker und werden
selektiv eliminiert. Die Zellen, die beide Selektionsrunden überleben,
sind jene, die anfänglich
den Vektor integriert und ihn anschließend eliminiert haben.
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Diese
Zellen werden hinsichtlich Zellen mit Genen, die durch homologe
Rekombination mit dem Vektor modifiziert wurden, angereichert.
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Individualisierte
Optimierung von Genen
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Im
Allgemeinen benötigen
die obigen Verfahren keine Kenntnis der Zahl von Genen, die optimiert
werden sollen, ihre Kartenlage oder ihre Funktion. Jedoch können in
einigen Fällen,
wo diese Informationen für eines
oder mehrere Gene zur Verfügung
stehen, ausgenutzt werden. Wenn zum Beispiel die Eigenschaft, die durch
die Entwicklung erlangt werden soll, eine gesteigerte Rekombination
von Zellen ist, ist ein Gen, das wahrscheinlich wichtig ist, recA,
selbst wenn viele andere Gene, die bekannt oder unbekannt sind,
zusätzliche Beiträge liefern
können.
In dieser Situation kann das recA Gen zumindest teilweise getrennt
von anderen Kandidaten Genen entwickelt werden. Das recA Gen kann
durch irgendeines der Verfahren der rekursiven Rekombination, die
in Abschnitt V beschrieben sind, entwickelt werden. Kurz gesagt
geht dieser Ansatz mit dem Erhalten diverser Formen eines recA Gens,
dem Rekombinieren der Formen, dem Selektieren von Rekombinanten
mit verbesserten Eigenschaften und dem Unterwerfen der Rekombinanten
in weiteren Rekombinations- und Selektionszyklen einher. Zu irgendeinem
Punkt in der individualisierten Verbesserung von recA, können die
diversen Formen von recA mit Fragmenten gepoolt werden, die andere
Gene in einer Bibliothek kodieren, die in den allgemeinen, oben
beschriebenen Verfahren verwendet werden sollen. Auf diese Weise
wird die Bibliothek beimpft, dass sie einen höheren Anteil von Varianten
in einem Gen enthält,
von dem bekannt ist, dass es für
die Eigenschaft, die erlangt werden soll, wichtig ist, als andernfalls
der Fall wäre.
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Ernten von
DNA Substraten für
das Shuffling
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In
einigen Shuffling Verfahren werden DNA Substrate aus natürlichen
Quellen isoliert, und sie werden nicht einfach durch DNA modifizierende
oder polymerisierende Enzyme aufgrund von widerspenstigen Verunreinigungen,
welche enzymati sche Reaktionen vergiften, manipuliert. Solche Schwierigkeiten
können
durch das Verarbeiten von DNA Substraten durch einen Erntestamm
vermieden werden. Der Erntestamm ist typischerweise ein bakterieller
oder archaebakterieller Zelltyp mit natürlicher Kompetenz und einer
Kapazität
für homologe
Rekombination zwischen Sequenzen mit substanzieller Diversität (z.B.
Sequenzen, die nur 75 % Sequenz Identität zeigen). Der Erntestamm trägt einen
Vektor, der einen negativen Selektionsmarker kodiert, flankiert
von zwei Segmenten, die jeweils komplementär zu zwei Segmenten sind, die
ein Gen oder eine andere interessierende Region in der DNA von einer
Zielzelle flankieren. Der Erntestamm wird mit Fragmenten von DNA
von der Zielzelle in Kontakt gebracht. Die Fragmente werden durch
natürliche
Kompetenz aufgenommen, und ein interessierendes Fragment aus dem
Ziel Organismus rekombiniert mit dem Vektor des Erntestamms, was
zum Verlust des negativen Selektionsmarkers führt. Die Selektion gegen den
negativen Marker erlaubt die Isolierung von Zellen, welche das interessierende
Fragment aufgenommen haben. Das Shuffling kann in dem Erntestamm
durchgeführt
werden, oder ein Vektor kann aus dem Erntestamm isoliert werden
für in
vitro Shuffling oder Transfer zu einem anderen Zelltyp für in vivo
Shuffling. Alternativ kann der Vektor zu einem anderen Zelltyp durch
Konjugation, Protoplasten Fusion oder Elektrofusion transferiert
werden. Ein Beispiel eines geeigneten Erntestamms ist Acinetobacter
calcoaceticus mutS. Young et al., 97. ASM Meeting, Zusammenfassungen.
Dieser Stamm ist natürlich
kompetent und nimmt DNA in einer nicht Sequenz spezifischen Weise
auf. Außerdem
ist dieser Stamm aufgrund der mutS Mutation zur homologen Rekombination
von Sequenzen in der Lage, die nur 75 Sequenz Identität zeigen.
-
III. Anwendungen
-
Rekombinogenität
-
Ein
Ziel der Evolution der gesamten Zelle ist es, bakterielle oder archaebakterielle
Zellen zu bilden, die eine verbesserte Kapazität für Rekombination aufweisen.
Solche Zellen sind nützlich
für eine
Vielzahl von Zwecken in der Molekulargenetik einschließlich den
in vivo Formaten von rekursiver Sequenz Rekombination, die in Abschnitt
V beschrieben ist. Nahezu dreißig
Gene (z.B., recA, recB, recC, recD, recE, recF, recD, recO, recQ,
recR, recT, ruvA, ruvB, ruvC, sbcB, ssb, topA, gyrA und B, lig,
polA, uvrD, E, recL, mutD, mutH, mutL, mutU, helD) und DNA Stellen
(z.B. chi, recN, sbcC), die in genetische Rekombination involviert
sind, wurden in E. coli identifiziert, und verwandte Formen von
einigen dieser Gene wurden in anderen Organismen gefunden (z.B.
rad51, rad55, rad 57, Dmc1 in Hefe (siehe Kowalczykowski et al.,
Microbiol. Rev. 58, 401–465
(1994); Kowalczykowski & Zarling,
supra), und humane Homologe von Rad51 und Dmc1 wurden identifiziert
(siehe Sandler et al., Nucl. Acids Res. 24, 2125–2132 (1996)). Weiterhin erleichtern
Mutationen in den Fehlpaarungsreparatur Genen, wie mutL, mutS, mutH
die Homologie Voraussetzungen und erlauben die Rekombination zwischen
mehr verschiedenen Sequenzen (Ryssiguier et al., Nature 342, 396–401 (1989)).
Das Ausmaß der Rekombination
zwischen verschiedenen Stämmen
kann durch das Übertragen
von Mismatch Fehlpaarungsreparatur Genen und dem Stimulieren von
SOS Genen verstärkt
werden. Dies kann erreicht werden durch die Verwendung von geeigneten
mutanten Stämmen
und/oder dem Wachstum unter Bedingungen von metabolischem Stress,
von denen gefunden wurde, dass sie SOS stimulieren und Fehlpaarungsreparatur
Gene inhibieren. Vulic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997).
-
Die
Ausgangssubstrate für
die Rekombination wurden gemäß dem allgemeinen,
oben beschriebenen Prinzipien ausgewählt. Dies bedeutet, dass die
Substrate gesamte Genome oder Fraktionen davon mit Rekombinationsgenen
oder -stellen sein können.
Große
Bibliotheken von im Wesentlichen zufälligen Fragmenten können mit
Sammlungen von Fragmenten ausgesät
werden, die Varianten von einem oder mehreren bekannten Rekombinationsgenen,
wie recA konstituieren. Alternativ können Bibliotheken durch Mischen
von varianten Formen der verschiedenen Rekombinationsgene und -stellen
gebildet werden.
-
Die
Bibliothek von Fragmenten wird in die Empfängerzellen eingeführt, die
verbessert werden sollen, und die Rekombination findet statt, was
modifizierte Zellen bildet. Die Empfängerzellen enthalten vorzugsweise
ein Marker Gen, dessen Expression in einer Weise verhindert wurde,
die durch Rekombination korrigiert werden kann. Zum Beispiel können diese
Zellen zwei Kopien eines Marker Gens enthalten, das Mutationen an verschiedenen
Stellen trägt,
wobei die Kopien rekombinieren können,
um das Wildtyp Gen zu bilden. Ein geeignetes Marker Gen ist das
grün fluoreszierende
Protein. Ein Vektor kann konstruiert werden, der eine Kopie von
GFP mit Stoppkodons nahe dem N-Terminus, und einer anderen Kopie
von GFP mit Stoppkodons nahe dem C-Terminus des Proteins kodiert.
Der Abstand zwischen den Stoppkodons an den jeweiligen Enden des Moleküls beträgt 500 bp,
und ungefähr
25 % der Rekombinationsereignisse führt zu aktivem GFP. Die Expression
von GFP in einer Zelle signalisiert, dass eine Zelle zur homologen
Rekombination in der Lage ist, um zwischen die Stoppkodons zu rekombinieren,
um eine durchgehende kodierende Sequenz zu bilden. Durch Screenen
für Zellen,
die GFP exprimieren, reichert man Zellen mit der höchsten Kapazität für Rekombination an.
Dieselbe Art von Screen kann nach anschließenden Rekombinationsrunden
verwendet werden. Außer dem
Selektionsmarker, der in der/den vorherigen Runde/n verwendet wurde,
der auf einem Suizid Vektor anwesend war, sollte/n die nächste/n
Runde/n einen zweiten gestörten
Screening Marker innerhalb eines zweiten Vektors einsetzen, der
einen anderen Replikationsursprungspunkt oder einen anderen positiven
Selektionsmarker im Vergleich zu den Vektoren trägt, die in den vorherigen Runden
verwendet wurden.
-
Multigenomische
Kopienzahl
-
Der
Hauptteil der bakteriellen Zellen in Kulturen in stationärer Phase,
die in Vollmedien angezogen wurden, enthalten zwei, vier oder acht
Chromosomen. In Minimalmedium enthalten die Zellen ein oder zwei Chromosom/en.
Die Zahl der Chromosomen pro bakterieller Zelle häng somit
von der Wachstumsgeschwindigkeit der Zelle ab, wenn sie die stationäre Phase
erreicht. Dies liegt daran, dass schnell wachsende Zellen multiple
Replikationsgabeln enthalten, was zu mehreren Chromosomen in den
Zellen nach der Termination führt.
Die Zahl von Chromosomen ist Stamm abhängig, obwohl alle getesteten
Stämme
mehr als ein Chromo som in der stationären Phase aufweisen. Die Zahl
von Chromosomen in Zellen in der stationären Phase verringert sich mit
der Zeit. Dies scheint in der Fragmentierung und Degradation von
gesamten Chromosomen, ähnlich
zu Apoptose in Säugerzellen,
begründet
zu sein. Diese Fragmentierung von Genomen in Zellen mit multiplen
Genom Kopien führt
zu massiver Rekombination und Mutagenese. Nützliche Mutanten können Wege
finden, um Energiequellen zu nutzen, die es ihnen erlauben, weiter
zu wachsen.
-
Einige
Zelltypen, wie Deinococcus radians (Daly und Minton J. Bacteriol.
177, 5495–5505
(1995)) zeigen Polyploidie über
den Zell Zyklus. Dieser Zelltyp ist stark strahlungsresistenz aufgrund
der Anwesenheit von vielen Kopien des Genoms. Rekombination mit
hoher Frequenz zwischen den Genomen erlaubt das schnelle Entfernen
von Mutationen, die durch eine Vielzahl von DNA schädigenden
Mitteln induziert werden.
-
Ein
Ziel der vorliegenden Verfahren ist es, andere Zelltypen zu entwickeln,
damit sie eine gesteigerte Genom Kopienzahl ähnlich zu jener von Deinococcus
radians aufweisen. Vorzugsweise wird die gesteigerte Kopienzahl
während
des gesamten oder des meisten Teils seines Zell Zyklus in allen
oder den meisten Wachstumsbedingungen aufrecht erhalten. Die Anwesenheit
von multiplen Genom Kopien in solchen Zellen führt zu einer höheren Frequenz
der homologen Rekombination in diesen Zellen, sowohl zwischen Kopien
eines Gens in verschiedenen Genomen innerhalb der Zelle als auch
zwischen einem Genom innerhalb der Zelle und einem transfizierten
Fragment. Die gesteigerte Frequenz der Rekombination erlaubt es
den Zellen, sich schneller zu entwickeln, um andere nützliche
Eigenschaften anzunehmen.
-
Die
Ausgangssubstrate der Rekombination können eine vielschichtige Bibliothek
von Genen sein, von denen nur einige für die genomische Kopienzahl
relevant sind, eine fokussierte Bibliothek, die aus Varianten des/der
Gens/e gebildet wird, von dem/denen bekannt ist, oder von dem/denen
vermutet wird, dass es/sie eine Rolle in der genomischen Kopienzahl
spielt/spielen, oder eine Kombination dieser beiden. Als eine allgemeine Regel
würde man
erwarten, dass eine gesteigerte Kopienzahl durch die Entwicklung
von Genen erreicht würde,
die in die Replikation und Zellteilung (engl.: cell septation) involviert
sind, so dass die Zellteilung inhibiert wird, ohne dass die Replikation
beeinflusst ist. Gene, die sich in der Replikation entwickelt haben,
schließen tus,
xerC, xerD, dif, gyrA, gyrB, parE, parC, dif, TerA, TerB, TerC,
TerD, TerE, TerF und Gene, welche die Chromosomen Verteilung und
Gen Kopienzahl beeinflussen, einschließlich minD, mukA (tolC), mukB,
mukC, mukD, spoOJ, spoIIIE (Wake & Errington,
Annu. Rev. Genet. 29, 41–67
(1995)), ein. Eine nützliche
Quelle von Substraten ist das Genom eines Typs, wie Deinococcus
radians, von dem bekannt ist, dass er den gewünschten Phänotyp der multigenomischen
Kopienzahl aufweist. Ebenso wie oder anstelle der obigen Substrate
können
auch Fragmente, die ein Protein oder Antisense RNA Inhibitoren für Gene kodieren,
von denen bekannt ist, dass sie in die Zellteilung involviert sind,
verwendet werden.
-
In
der Natur wäre
die Existenz von multiplen genomischen Kopien in einem Zelltyp für gewöhnlich nicht vorteilhaft
aufgrund des größeren Nährstoff
Bedarfs, der benötigt
wird, um diese Kopienzahl aufrecht zu erhalten. Jedoch kann man
künstliche
Bedingungen entwerfen, um hinsichtlich hoher Kopienzahl zu selektieren. Modifizierte
Zellen mit rekombinanten Genomen werden in Vollmedien angezogen
(unter diesen Bedingungen sollte die Multikopienzahl kein Nachteil
sein) und gegenüber
einem Mutagen ausgesetzt, wie ultravioletter oder gamma Bestrahlung
oder einem chemischen Mutagen, z.B. Mitomycin, salpetrige Säure, fotoaktivierte
Psoralene, alleine oder in Kombination, das DNA Brüche indiziert,
die der Reparatur durch Rekombination zugänglich sind. Diese Bedingungen
selektieren für
Zellen mit Multikopienzahl aufgrund der größeren Wirksamkeit, mit der
Mutationen ausgeschnitten werden können. Modifizierte Zellen,
welche das Aussetzen gegenüber
dem Mutagen überleben,
werden für
Zellen mit multiplen Genom Kopien angereichert. Falls es gewünscht ist,
können
ausgewählte
Zellen einzeln hinsichtlich der Genom Kopienzahl analysiert werden
(z.B. durch quantitative Hybridisierung mit geeigneten Kontrollen).
Einige oder alle der Sammlung von Zellen, welche die Selektion überleben,
stellen die Substrate für
die nächste
Rekombinations runde dar. Schließlich
haben sich alle Zellen entwickelt, die mindestens 2, 4, 6, 8 oder
10 Kopien des Genoms während
des Zell Zyklus aufweisen.
-
Sekretion
-
Die
Protein (oder Metaboliten) Sekretionswege von bakteriellen Zellen
können
entwickelt werden, um gewünschte
Moleküle
wirksamer zu exportieren, wie für
die Herstellung von Protein Pharmazeutika, Arzneimitteln aus kleinen
Molekülen
(engl.: small molecule drugs) oder Spezial Chemikalien. Die Verbesserungen
in der Wirksamkeit sind insbesondere für Proteine wünschenswert,
die einen Multiuntereinheiten Zusammenbau (wie Antikörper) oder
extensive posttranslationale Modifikation vor der Sekretion benötigen.
-
Die
Wirksamkeit der Sekretion kann von einer Anzahl von genetischen
Sequenzen einschließlich
einer Signal Peptid kodierenden Sequenz, Sequenzen, die (ein) Protein(e)
kodiert/en, das/die die kodierende Sequenz spalteten oder auf andere
Weise erkennt/en, und der kodierenden Sequenz des zu sekregierenden
Proteins abhängen.
Das zuletzt genannte kann die Faltung des Proteins und die Leichtigkeit,
mit der es in Membrane integrieren oder sie überwinden kann, beeinflussen.
Der bakterielle Sekretionsweg in E. coli schließt die SecA, SecB, SecE, SecD
und SecE Gene ein. In Bacillus subtilis sind die Hauptgene secA,
secD, secE, secF, secY, ffh, ftsY zusammen mit fünf Signal Peptidase Genen (sipS,
sipT, sipU, sipV und sipW) (Kunst et al., supra). Bei Proteinen,
die posttranslationale Modifikation benötigen, kann die Entwicklung
von Genen, welche eine solche Modifikation bewirken, zu einer verbesserten
Sekretion beitragen. Genauso können
Gene mit Expressionsprodukten, die eine Rolle im Zusammenbau von
Multiuntereinheiten Proteinen (z.B. Chaperoninen) spielen, auch
zur verbesserten Sekretion beitragen.
-
Die
Selektion von Substraten für
die Rekombination folgt den allgemeinen, oben beschriebenen Prinzipien.
In diesem Fall umfassen die fokussierten Bibliotheken, auf die oben
Bezug genommen wird, Varianten der bekannten Sekretionsgene. Für die Entwicklung
von prokaryonten Zellen, eukaryonte Proteine zu exprimieren, werden
die anfänglichen
Substrate für
die Rekombination oft mindestens teilweise von eukaryonten Zellen
erhalten. Hereinkommende Fragmente können eine Rekombination durchlaufen,
sowohl mit chromosomaler DNA in Empfängerzellen als auch mit dem
Screening Marker Konstrukt, das in solchen Zellen anwesend ist (siehe
unten). Die zuletzt genannte Form der Rekombination ist wichtig
für die
Entwicklung der Signal kodierenden Sequenz, die in das Screening
Marker Konstrukt eingebaut ist. Auf eine verbesserte Sekretion kann durch
den Einschluss eines Marker Konstrukts in die zu entwickelnden Zellen
gescreent werden. Das Marker Konstrukt kodiert ein Marker Gen, das
funktionell mit Expressionssequenzen verbunden ist, und für gewöhnlich funktionell
mit einer Signalpeptid kodierenden Sequenz verbunden ist. Das Marker
Gen wird manchmal als ein Fusionsprotein mit einem rekombinanten
interessierenden Protein exprimiert. Dieser Ansatz ist nützlich,
wenn man die kodierende Sequenz für das rekombinante Protein
zusammen mit Sekretionsgenen entwickeln möchte.
-
In
einer Variation kodiert das Marker Gen ein Produkt, das toxisch
für die
Zelle ist, die das Konstrukt enthält, außer wenn das Produkt sekregiert
wird. Geeignete Toxin Proteine schließen Diphtherie Toxin und Ricin
Toxin ein. Die Vermehrung von modifizierten Zellen, die ein solches
Konstrukt enthalten, selektiert für Zellen, die sich entwickelt
haben, um die Sekretion des Toxins zu verbessern. Alternativ kann
das Marker Gen einen Liganden für
einen bekannten Rezeptor kodieren, und es können Zellen, die den Liganden
tragen, durch FACS unter Verwendung von markiertem Rezeptor nachgewiesen
werden. Gegebenenfalls kann ein Ligand funktionell mit einer Phospholipid
Ankersequenz verbunden sein, die den Liganden an die Oberfläche der
Zellmembran nach der Sekretion bindet (siehe die US 08/309,345,
gleicher Anmelder, gleichzeitig anhängig). In einer weiteren Variation
kann das sekregierte Marker Protein in der Nähe der Zelle aufrecht erhalten
werden, die es sekregiert, indem einzelne Zellen in Agar Tropfen
inokuliert werden. Das sekregierte Protein wird innerhalb der Agar
Matrix abgegrenzt und kann z.B. durch FACSTM nachgewiesen
werden. In einer anderen Variation wird das interessierende Protein
als ein Fusionsprotein mit β-Lactamase
oder alkalischer Phosphatase exprimiert. Diese Enzyme metabolisieren
kommerziell erhältliche chromogene
Substrate (z.B. X-gal), aber sie tun dies nur nach Sekretion in
das Periplasma. Das Auftreten von gefärbtem Substrat in einer Kolonie
von Zellen zeigt deshalb die Kapazität, das Fusionsprotein zu sekregieren,
und die Intensität
der Farbe steht mit der Wirksamkeit der Sekretion in Verbindung.
-
Die
Zellen, die durch diese Screening und Selektionsverfahren identifiziert
werden, weisen die Kapazität
auf, erhöhte
Mengen an Protein zu sekregieren. Diese Kapazität kann einer gesteigerten Sekretion
und gesteigerten Expression oder der gesteigerten Sekretion alleine
zugewiesen werden.
-
Expression
-
Bakterielle
und archaebakterielle Zellen können
auch entwickelt werden, um eine gesteigerte Expression eines rekombinanten
Proteins zu erlangen. Die Expressionsmenge ist selbstverständlich stark
abhängig von
dem Konstrukt, von dem das rekombinante Protein exprimiert wird
und von den regulatorischen Sequenzen, wie dem Promotor, dem/den
Enhancer/n und der Transkriptionsterminationsstelle, die darin enthalten
ist. Die Expression kann auch durch eine große Anzahl von Wirtsgenen beeinflusst
werden, die Rollen in der Transkription, der posttranslationalen
Modifikation und der Translation spielen. Zusätzlich können Wirtsgene, die in die
Synthese von Ribonukleotid- und Aminosäuremonomeren für die Transkription
und Translation involviert sind, indirekte Wirkungen auf die Wirksamkeit
der Expression ausüben.
Die Selektion von Substraten für
die Rekombination folgt den allgemeinen, oben diskutierten Prinzipien.
In diesem Fall umfassen fokussierte Bibliotheken Varianten von Genen,
von denen bekannt ist, dass sie Rollen in der Expression spielen.
Für die
Entwicklung von prokaryonten Zellen, eukaryonte Proteine zu exprimieren,
werden die Anfangssubstrate für
die Rekombination häufig,
wenigstens teilweise, von eukaryonten Quellen erhalten; dies sind
eukaryonte Gene, die Proteine, wie Chaperonine, kodieren, die in
die Sekretion und/oder den Zusammenbau von Proteinen involviert
sind. Hereinkommende Fragmente können
eine Rekombination durchlaufen, sowohl mit chromsomaler DNA in den
Empfän gerzellen
als auch mit dem Screening Marker Konstrukt, das in solchen Zellen
anwesend ist (siehe unten).
-
Das
Screening für
eine verbesserte Expression kann bewirkt werden, indem ein Reporter
Konstrukt in die zu entwickelnden Zellen eingeschlossen wird. Das
Reporter Konstrukt exprimiert (und sekregiert für gewöhnlich) ein Reporter Protein,
wie GFP, das einfach nachgewiesen werden kann und nicht toxisch
ist. Das Reporter Protein kann alleine oder zusammen mit einem interessierenden
Protein als ein Fusionsprotein exprimiert werden. Wenn das Reporter
Gen sekregiert wird, selektiert das Screening wirksam für Zellen
mit entweder verbesserter Sekretion oder verbesserter Expression
oder beidem.
-
Schnelle Entwicklung
als ein Werkzeug der Vorhersage
-
Rekursive
Sequenz Rekombination kann verwendet werden, um die natürliche Evolution
von pathogenen Mikroorganismen als Antwort auf das Aussetzen gegenüber einem
zu testenden Arzneimittel zu simulieren. Unter Verwendung der rekursiven
Sequenz Rekombination schreitet die Evolution mit einer schnelleren Geschwindigkeit
als bei der natürlichen
Evolution fort. Eine Messmöglichkeit
der Geschwindigkeit der Evolution ist die Zahl von Rekombinationszyklen
und dem Screenen, das benötigt
wird, bis der Mikroorganismus eine definierte Menge von Resistenz
gegenüber
dem Arzneimittel angenommen hat. Die Information aus dieser Analyse
ist wertvoll beim Vergleichen der relativen Leistung von verschiedenen
Arzneimitteln und insbesondere in der Vorhersage ihrer Langzeit
Wirksamkeit bei wiederholter Verabreichung.
-
Die
pathogenen Mikroorganismen, die in dieser Analyse verwendet werden,
schließen
Bakterien ein, die eine allgemeine Quelle von humanen Infektionen
sind, wie Chlamydien, Bakterien in Rickettsienform, Mycobakterien,
Staphylococci, Treptococci, Pneumococci, Meningococci und Conococci,
Klebsiella, Proteus, Serratia, Pseudomonas, Legionella, Diphtheria,
Salmonella, Bacilli, Cholera, Tetanuas, Botulinus, Anthrax, Pest,
Leptospirosis und Bakterien der Lymeserkrankung.
-
Die
Evolution wird durch Transformieren eines Isolats von Bakterien
bewirkt, das sensitiv gegenüber einem
zu testenden Arzneimittel ist, mit einer Bibliothek von DNA Fragmenten.
Die Fragmente können
eine mutierte Version des Genoms der zu entwickelnden Bakterien
sein. Wenn das Ziel des Arzneimittels ein bekanntes Protein ist,
kann eine fokussierte Bibliothek mit Varianten des Gens verwendet
werden, die das Protein kodieren. Alternativ kann die Bibliothek
von einer anderen Art von Bakterien stammen, insbesondere Bakterien,
die typischerweise als Bewohner von menschlichen Geweben gefunden
werden, wodurch das Quellenmaterial, das für die Rekombination in vivo
zur Verfügung
steht, simuliert wird. Die Bibliothek kann auch von Bakterien stammen,
von denen bekannt ist, dass sie resistent gegenüber dem Arzneimittel sind.
Nach der Transformation und der Vermehrung von Bakterien für einen
angemessenen Zeitraum, um zu erlauben, dass die Rekombination stattfindet
und rekombinante Gene exprimiert werden, werden die Bakterien gescreent,
indem sie gegenüber
dem zu testenden Arzneimittel ausgesetzt werden, und anschließend werden
die Überlebenden gesammelt. Überlebende
Bakterien werden weiteren Rekombinationsrunden unterworfen. Die
anschließende Runde
kann durch einen Split und Pool Ansatz bewirkt werden, indem die
DNA von einer Untergruppe von überlebenden
Bakterien in eine zweite Untergruppe von Bakterien eingeführt wird.
Alternativ kann eine frische Bibliothek von DNA-Fragmenten in überlebende
Bakterien eingeführt
werden. (Eine) anschließende
Selektionsrunde/n kann/können
mit steigenden Konzentrationen des Arzneimittels durchgeführt werden,
wodurch die Stringenz der Selektion gesteigert wird.
-
IV. Förderung des genetischen Austausches
-
(1) Allgemein
-
Die
erfindungsgemäßen Verfahren
bewirken die Rekombination von zellulärer DNA durch die Vermehrung
von Zellen unter Bedingungen, welche den Austausch von DNA zwischen
bakteriellen oder archaebakteriellen Zellen induzieren. Der DNA
Austausch wird durch die allgemein anwendbaren Verfahren der Protoplasten
Fusion gefördert.
-
In
einigen Verfahren wird die anfängliche
Diversität
zwischen Zellen (d.h. vor dem Genom Austausch) durch chemische oder
strahlungsinduzierte Mutagenese eines Vorläufer Zelltyps induziert, gegebenenfalls
gefolgt von Screenen für
einen gewünschten
Phänotyp.
In anderen Verfahren ist die Diversität natürlich, weil die Zellen von
verschiedenen Individuen, Stämmen
oder Spezies erhalten wurden.
-
In
den beanspruchten Shuffling Verfahren wird der induzierte Austauch
von DNA als das einzige Mittel verwendet, um die Rekombination in
jedem Rekombinationszyklus zu bewirken. In anderen Verfahren wird
der induzierte Austausch in Kombination mit natürlicher sexueller Rekombination
eines anderen Organismus verwendet. In anderen Verfahren werden
der induzierte Austausch und/oder die natürliche sexuelle Rekombination
in Kombination mit der Einführung
einer Fragment Bibliothek verwendet. Solch eine Fragment Bibliothek kann
ein ganzes Genom, ein ganzes Chromosom, eine Gruppe von funktionell
oder genetisch verbundenen Genen, ein Plasmid, ein Cosmid oder Fragmente
von einem von diesen sein. Die DNA kann mit einem Vektor verbunden
sein, oder sie kann in freier Form vorliegen. Einige Vektoren enthalten
Sequenzen, welche die homologe oder nicht homologe Rekombination
mit dem Wirtsgenom fördern.
Einige Fragmente enthalten doppelsträngige Brüche, die durch das Scheren
mit Glaskugeln, Ultraschall Behandlung oder durch chemische oder
enzymatische Fragmentierung bewirkt werden, um die Rekombination
zu stimulieren.
-
In
jedem Fall kann die DNA zwischen Zellen ausgetauscht werden, nachdem
sie eine Rekombination durchläuft,
um Hybrid Genome zu bilden. Zellen, die Hybrid Genome tragen, werden
für den
gewünschten
Phänotyp
gescreent, und Zellen mit diesem Phänotyp werden isoliert. Diese
Zellen bilden die Ausgangsmaterialien für den nächsten Rekombinationszyklus
in einem rekursiven Rekombinations-/Selektionsschema.
-
Ein
Mittel zur Förderung
des Austausches von DNA zwischen Zellen ist die Protoplasten Fusion.
Ein Protoplast resultiert aus der Entfernung der Zellwand einer
Zelle, was eine Membran gebundene Zelle zurücklässt, die von einem isotonischen
oder hypertonischen Medium zur Aufrechterhaltung ihrer Integrität abhängt. Wenn
die Zellwand teilweise entfernt wird, wird die resultierende Zelle
streng genommen als Sphäroplast
bezeichnet, und wenn sie vollständig
entfernt wird, als ein Protoplast. Jedoch schließt hier der Begriff "Protoplast" Sphäroplasten
ein, außer
es ist anders angegeben.
-
Die
Protoplasten Fusion ist beschrieben von Shaffner et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 77, 2163 (1980), und andere exemplarische Verfahren
sind beschrieben bei Yoakum et al.,
US
4,608,339 , Takahashi et al.,
US
4,677,066 und Sambrook et al., in Kap. 16. Die Protoplasten
Fusion wurde zwischen Stämmen,
Spezies und Gattungen (z.B. Hefe und Hühner Erythrozyten) beschrieben.
-
Protoplasten
können
von bakteriellen Zellen durch verschiedene Mittel, einschließlich chemischer
Behandlung, um die Zellwand zu entfernen, hergestellt werden. Zum
Beispiel können
die Zellwände
durch Spaltung mit Lysozym in einem 10–20 % Sucrose, 50 mM EDTA Puffer
entfernt werden. Die Umwandlung von Zellen in sphärische Protoplasten
kann durch Phasenkontrast Mikroskopie überwacht werden. Die Protoplasten können auch
durch Vermehrung von Zellen in Medien, die mit einem Inhibitor der
Zellwand Synthese ergänzt sind,
oder die Verwendung von Mutanten Stämmen, welche die Fähigkeit
zur Zellwand Bildung nicht aufweisen, hergestellt werden. Gegebenenfalls
können
einige, aber nicht alle zu fusionierenden Protoplasten abgetötet werden
und/oder ihre DNA kann durch Behandlung mit ultravioletter Bestrahlung,
Hydroxylamin oder Cupferron fragmentiert werden (Reeves et al.,
FEMS Microbiol. Lett. 99, 193–198
(1992)). In dieser Situation werden die abgetöteten Protoplasten als Donoren
bezeichnet, und die lebensfähigen
Protoplasten als Akzeptoren. Die Verwendung von toten Donor Zellen
kann vorteilhaft sein in der anschließenden Erkennung von fusionierten
Zellen mit Hybrid Genomen, wie unten beschrieben wird. Weiterhin
ist das Aufbrechen von DNA in Donor Zellen vorteilhaft für das Stimulieren
der Rekombination mit Akzeptor DNA.
-
Gegebenenfalls
können
die Akzeptor- und/oder fusionieren Zellen auch kurz, aber nicht
lethal, gegenüber
UV Bestrahlung ausgesetzt werden, um die Rekombination zu stimulieren.
-
Sobald
sie gebildet sind, können
die Protoplasten in einer Vielzahl von Osmolyten und Verbindungen, wie
Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumphosphat, Kaliumphosphat,
Sucrose, Sorbitol in der Anwesenheit von DTT stabilisiert werden.
Die Kombination von Puffer, pH-Wert, Reduktionsmittel und osmotischem
Stabilisator kann für
verschiedene Zelltypen optimiert werden. Die Protoplasten können durch
Behandlung mit einer Chemikalie, wie PEG, Calciumchlorid oder Calciumpropionat
oder Elektrofusion induziert werden, um zu fusionieren (Tosneva,
Acta Microbiologica Bulgaria 24, 53–59 (1989)). Ein Verfahren
zur Zellfusion, das elektrische Felder einsetzt, wurde beschrieben.
Siehe Chang,
US 4,970,154 .
Die Bedingungen können
für verschiedene Stämme optimiert
werden.
-
Die
fusionierten Zellen sind Heterokaryons mit Genomen aus zwei Protoplasten
Bestandteilen. Die fusionierten Zellen können von unfusionierten Ausgangszellen
durch Sucrose Gradienten Sedimentation oder Zellsortierung angereichert
werden. Die zwei Kerne in den Heterokaryons können fusionieren (Karyogamie), und
homologe Rekombination kann zwischen den Genomen stattfinden. Die
Chromosomen können
auch symmetrisch sekregieren, was zu regenerierten Protoplasten
führt,
welche ganze Chromosomen verloren oder gewonnen haben. Die Rekombinationsfrequenz
kann durch Behandlung mit ultravioletter Bestrahlung oder durch die
Verwendung von Stämmen,
die recA oder andere Rekombinationsgene, wie MutS oder MutL oder
die Hefe rad Gene, und verwandte Varianten davon in anderen Spezies überexprimieren,
gesteigert werden. Die Überexpression
kann entweder das Ergebnis der Einführung von exogenen Rekombinationsgenen
oder das Ergebnis von selektierten Stämmen sein, die, als ein Ergebnis
von natürlicher
Variation oder induzierter Mutation, endogene Rekombinationsgene überexprimieren.
Die fusionierten Protoplasten werden unter Bedingungen vermehrt,
welche die Regeneration von Zellwänden, die Rekombination und
Sekretion von rekombinanten Genomen in Nachkommenzellen von dem
Heterokaryon und die Expression von rekombinanten Genen erlauben. Nach,
oder gelegentlich vor oder während
der Gewinnung von fusionierten Zellen, werden die Zellen gescreent oder
hinsichtlich Evolution in Richtung einer gewünschten Eigenschaft selektiert.
-
Danach
kann eine anschließende
Rekombinationsrunde durchgeführt
werden, indem Protoplasten von den Zellen hergestellt werden, welche
die Selektion/das Screening in der vorhergehenden Runde überlebt haben.
Die Protoplasten werden fusioniert, die Rekombination findet in
den fusionierten Protoplasten statt, und es werden Zellen aus den
fusionierten Protoplasten regeneriert. Die Protoplasten, die regenerierten
oder regenerierenden Zellen werden einer weiteren Selektion oder
weiterem Screenen unterworfen.
-
Alternativ
kann eine anschließende
Rekombinationsrunde auf einer Split Pool Basis, wie oben beschrieben,
durchgeführt
werden. Dies bedeut, dass eine erste Subpopulation von Zellen, welche
die Selektion des Screenens aus einer vorherigen Runde überlebt
haben, für
die Protoplasten Bildung verwendet werden. Eine zweite Subpopulation
von Zellen, welche die Selektion/das Screening aus einer vorhergehenden
Runde überlebt
haben, werden als eine Quelle für
DNA Bibliothek Herstellung verwendet. Die DNA Bibliothek aus der zweiten
Subpopulation von Zellen wird anschließend in die Protoplasten aus
der ersten Subpopulation transformiert. Die Bibliothek durchläuft eine
Rekombination mit den Genomen der Protoplasten, um rekombinante Genome
zu bilden. Es werden Zellen aus den Protoplasten regeneriert, und
eine Selektion/ein Screenen wird an den regenerierenden oder regenerierten
Zellen durchgeführt.
In einer weiteren Variation wird eine frische Bibliothek von Nukleinsäure Fragmenten
in die Protoplasten eingeführt,
welche die Selektion/das Screenen aus einer vorherigen Runde überlebt
haben.
-
(2) Selektion für Hybrid
Stämme
-
Die
Erfindung kann in Verbindung mit Selektionsstrategien verwendet
werden, um Zellen zu identifizieren, die durch Fusion von Bestandteilen
von Ausgangszellen mit zwei verschiedenen Subpopulationen gebildet
werden. Die Selektion für
Hybrid Zellen wird für
gewöhnlich
vor dem Selektieren oder Screenen für Zellen, die sich entwickelt
haben (als ein Ergebnis von genetischem Austausch) zur Erlangung
einer gewünschten Eigenschaft,
durchgeführt.
Eine Grundvoraussetzung der meisten solcher Selektionsschemata ist,
dass zwei Ausgangssubpopulationen zwei verschiedene Marker aufweisen.
Zellen mit Hybrid Genomen können
somit durch Selektion für
beide Marker identifiziert werden.
-
In
einem solchen Schema trägt
mindestens eine Subpopulation der Zellen einen Selektionsmarker,
der an seine Zellwand angeheftet ist. Beispiele von geeigneten Membranankern
schließen
Biotin, Fluorescein und Rhodamin ein. Die Marker können mit
Amid- oder Thiolgruppen oder durch spezifischere Derivatisierungschemie,
wie Iodacetate, Iodacetamide, Maleimide, verbunden werden. Zum Beispiel
kann ein Marker wie folgt angeheftet werden. Zellen oder Protoplasten
werden mit einem Puffer (z.B. PBS) gewaschen, der nicht mit der chemischen
Kopplung eines chemisch aktiven Liganden interferiert, der mit Aminogruppen
von Lysinen oder N-terminalen Aminogruppen von Membran Proteinen
reagiert. Der Ligand ist entweder selbst aminreaktiv (z.B. Isothiocyanate,
Succinimidylester, Sulfonylchloride) oder er wird durch heterobifunktionelle
Linker (z.B. EMCS, SIAB, SPDP, SMB) aktiviert, um aminreaktiv zu
werden. Der Ligand ist ein Molekül,
das einfach durch Protein derivatisierte magnetische Kugeln oder
andere fangende feste Träger
gebunden wird. Zum Beispiel kann der Ligand Succinimidyl aktiviertes
Biotin (molekulare Sonden: B-1606, B-2603, S-1515, S-1582) sein.
Dieser Linker wird mit Aminogruppen von Proteinen umgesetzt, die
in oder auf der Oberfläche
einer Zelle liegen. Die Zellen werden anschließend gewaschen, um überschüssiges Markierungsmittel
zu entfernen, bevor sie mit Zellen aus der zweiten Subpopulation
in Kontakt gebracht werden, die einen zweiten Selektionsmarker tragen.
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Die
zweite Subpopulation von Zellen kann auch einen Membrananker tragen,
obwohl er ein unterschiedlicher Membrananker im Vergleich zu der
ersten Subpopulation ist. Alternativ kann die zweite Subpopulation
einen genetischen Marker tragen. Der genetische Marker kann eine
selektive Eigenschaft, wie Arzneimittel Re sistenz oder eine zu screenende
Eigenschaft, wie Expression des grünen fluoreszierenden Proteins verleihen.
-
Nach
der Fusion der ersten und zweiten Subpopulation der Zellen und der
Gewinnung werden die Zellen gescreent oder hinsichtlich der Anwesenheit
von Markern auf beiden Ausgangssubpopulationen selektiert. Zum Beispiel
werden Fusionen für
eine Population durch Adsorption an spezifische Kugeln angereichert,
und diese werden durch FACSTM hinsichtlich
jener, die den Marker exprimieren, sortiert. Zellen, die beide Screens hinsichtlich
beider Marker überleben,
sind jene, welche eine Protoplasten Fusion durchlaufen haben, und
für sie
ist es wahrscheinlicher, dass sie rekombinierte Genome aufweisen.
Für gewöhnlich werden
die Marker gescreent oder getrennt selektiert. Membran gebundene
Marker, wie Biotin, können
durch Affinitätsanreicherung für den Zellmembran
Marker (z.B. durch das "Panning" von fusionierten
Zellen auf einer Affinitätsmatrix)
gescreent werden. Zum Beispiel können
die Zellen für
eine Biotin Membran Markierung affinitätsgereinigt werden unter Verwendung
von Streptavidin beschichteten magnetischen Kugeln (Dynal). Diese
Kugeln werden einige Male gewaschen, um die nicht fusionierten Wirtszellen
zu entfernen. Alternativ können
die Zellen gegenüber einem
Antikörper
gegen den Membrananker gepannt werden. In einer weiteren Variation,
wenn der Membranmarker fluoreszierend ist, können die Zellen, die den Marker
tragen, durch FACSTM identifiziert werden.
Die Screens für
genetische Marker hängen
von der Natur der Marker ab und schließen die Kapazität ein, auf
Arzneimittel behandelten Medien oder FACSTM Selektion
hinsichtlich grün
fluoreszierendem Protein zu wachsen. Wenn die erste und die zweite
Zellpopulation fluoreszierende Marker mit verschiedenen Wellenlängen aufweisen,
können
beide Marker gleichzeitig durch FACSTM Sortierung
gescreent werden.
-
In
einem weiteren Selektionsschema für Hybrid Zellen können die
ersten und zweiten Populationen von Zellen fusioniert werden, um
verschiedene Untereinheiten eines heteromultimeren Enzyms zu exprimieren.
Für gewöhnlich weist
das heteromultimere Enzym zwei verschiedene Untereinheiten auf,
aber heteromultimere Enzyme mit drei, vier oder mehr verschiedenen
Untereinheiten können
ver wendet werden. Wenn ein Enzym mehr als zwei verschiedene Untereinheiten
aufweist, kann jede Untereinheit in einer verschiedenen Subpopulation
von Zellen (z.B. drei Untereinheiten in drei Subpopulationen) exprimiert
werden, oder es kann mehr als eine Untereinheit in derselben Subpopulation
von Zellen exprimiert werden (z.B. eine Untereinheit in einer Subpopulation,
zwei Untereinheiten in einer zweiten Subpopulation).
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Hybride
Zellen, die eine Kombination von Genomen von ersten und zweiten
subpopulationskompetenten Zellen repräsentieren, können anschließend durch
einen Assay für
intaktes Enzym erkannt werden. Ein solcher Assay kann ein Bindungsassay
sein, aber er ist typischerweise ein funktioneller Assay (z.B. Kapazität um ein
Substrat des Enzyms zu metabolisieren). Die enzymatische Aktivität kann zum
Beispiel durch Verarbeiten eines Substrats in ein Produkt mit einem
fluoreszierenden Mittel oder einem auf andere Weise einfach nachzuweisenden
Emissionsspektrum nachgewiesen werden. Die einzelnen Untereinheiten
eines heteromultimeren Enzyms, die in einem solchen Assay verwendet
werden, weisen vorzugsweise keine enzymatische Aktivität in der
dissoziierten Form auf, oder sie weisen signifikant weniger Aktivität in der
dissoziierten Form auf als in der assoziierten Form. Vorzugsweise
weisen die Zellen, die für
die Fusion verwendet werden, keine endogene Form des heteromultimeren
Enzyms auf, oder sie weisen mindestens eine signifikant geringere
endogene Aktivität
auf, die von dem heteromultimeren Enzym resultiert, das durch Fusion
von Zellen gebildet wird.
-
Penicillinacylase
Enzyme, Cephalosporinacylase und Penicillinacyltransferase sind
Beispiele von geeigneten heteromultimeren Enzymen. Diese Enzyme
werden durch ein einzelnes Gen kodiert, das als ein Proenzym translatiert
und durch posttranslationale autokatalytische Proteolyse gespalten
wird, um ein Spacer Endopeptid zu entfernen und zwei Untereinheiten
zu bilden, die assoziieren, um das aktive heterodimere Enzym zu
bilden. Keine Untereinheit ist aktiv in der Abwesenheit der anderen
Untereinheit. Jedoch kann die Aktivität rekonstituiert werden, wenn
diese getrennten Gen Abschnitte in derselben Zelle durch Kotransformation
exprimiert werden. Andere Enzyme, die verwendet werden können, weisen
Unter einheiten auf, die durch verschiedene Gene kodiert werden (z.B.
faoA und faoB Gene kodieren 3-Oxoacyl-CoA Thiolase von Pseudomonas
fragi (Biochem. J 328, 815–820
(1997)).
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Ein
beispielhaftes Enzym ist Penicillin G Acylase aus Escherichia coli,
das zwei Untereinheiten aufweist, die durch ein einzelnes Gen kodiert
werden. Fragmente des Gens, welche die zwei Untereinheiten kodieren,
die funktionell mit geeigneten expressionsregulatorischen Sequenzen
verknüpft
sind, werden in die erste und die zweite Subpopulation von Zellen
transfiziert, welche endogene Penicillinacylase Aktivität nicht aufweisen.
Eine Zelle, die durch Fusion von kompetenten Zellen aus der ersten
und der zweiten Subpopulation gebildet wird, exprimiert in zwei
Untereinheiten, die sich zusammen lagern, um ein funktionelles Enzym,
z.B. Penicillin Acylase zu bilden. Die fusionierten Zellen können anschließend auf
Agar Platten mit Penicillin G selektiert werden, das durch Penicillinacylase
degradiert wird.
-
In
einer anderen Variation werden fusionierte Zellen durch die Komplementierung
von auxotrophen Mutanten identifiziert. Ausgangssubpopulationen
von Zellen können
mit bekannten auxotrophen Mutationen selektiert werden. Alternativ
können
auxotrophe Mutationen in einer Ausgangspopulation von Zellen spontan durch
das Aussetzen gegenüber
einem mutagenen Mittel gebildet werden. Zellen mit auxotrophen Mutationen werden
durch Replika Ausplattierung auf Minimal- und vollständigen Medien
selektiert. Von Läsionen,
die in Auxotrophie resultieren, wird angenommen, dass sie über das
Genom verteilt sind, in Genen für
Aminosäuren, Nukleotiden
und Vitamin Biosynthese Wegen. Nach der Fusion von Ausgangszellen
können
Zellen, die aus der Fusion resultieren, durch ihre Fähigkeit
auf Minimalmedien zu wachsen, identifiziert werden. Diese Zellen können anschließend gescreent
oder hinsichtlich Evolution in Richtung einer chemischen Eigenschaft
selektiert werden. Weitere Schritte von Mutagenese regenerierenden
frischen auxotrophen Mutationen können in anschließende Rekombinationszyklen
und Screenen/Selektion eingebaut werden.
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In
Variationen des obigen Verfahrens kann die de novo Bildung von auxotrophen
Mutationen in jeder Runde des Shufflings durch Verwendung derselben
Auxotrophen vermieden werden. Zum Beispiel können Auxotrophe durch Transposon
Mutagenese unter Verwendung eines Transposons, das Selektionsmarker
trägt, gebildet
werden. Auxotrophe werden durch einen Screen, wie Replika Plattierung
identifiziert. Auxotrophe werden vereinigt, und ein generalisiertes
transduzierendes Phagenlysat wird durch Wachstum des Phagens auf einer
Population von auxotrophen Zellen hergestellt. Eine getrennte Population
von auxotrophen Zellen wird einem genetischen Austausch unterworfen,
und die Komplementierung wird verwendet, um Zellen zu selektieren,
welche eine genetische Veränderung
und Rekombination durchlaufen haben. Diese Zellen werden anschließend gescreent
oder hinsichtlich der Annahme einer gewünschten Eigenschaft selektiert.
Die Zellen, die das Screenen oder die Selektion überleben, weisen anschließend auxotrophe
Marker auf, die durch Einführen der
transduzierenden Transposon Bibliothek regeneriert werden. Die neu
gebildeten auxotrophen Zellen werden anschließend einem weiteren genetischen
Austausch und Screenen/Selektion unterworfen.
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In
einer weiteren Variation werden auxotrophe Mutationen durch homologe
Rekombination mit einem Zielvektor gebildet, der einen Selektionsmarker
umfasst, der von Homologie Regionen mit einer biosynthetischen Region
des Genoms von Zellen, die entwickelt werden sollen, flankiert wird.
Die Rekombination zwischen dem Vektor und den Genom Inserts des
positiven Selektionsmarkers in das Genom bewirkt eine auxotrophe
Mutation. Der Vektor liegt vor der Einführung von Zellen in linearer
Form vor. Gegebenenfalls kann die Frequenz der Einführung des
Vektors durch Capping seiner Enden mit Selbstkomplementaritäts-Oligonukleotiden
gesteigert werden, die in einer Haarnadel Bildung angeheftet sind.
Der genetische Austausch und der Screening-/Selektionsvorgang sind
wie oben beschrieben. In jeder Runde werden Zielvektoren erneut
eingeführt,
welche dieselbe Population von auxotrophen Markern regenerieren.
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In
anderen Variationen werden fusionierte Zellen durch Screenen hinsichtlich
eines genomischen Markers, der auf einer Subpopulation der Ausgangszellen
und eines episomalen Markers, der auf einer zweiten Subpopulation
von Zellen anwesend ist, identifiziert.
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In
einer weiteren Variation wird der genetische Austausch zwischen
zwei Subpopulationen von Zellen durchgeführt, von denen eine tot ist.
Lebensfähige
Zellen werden einschließlich
hinsichtlich eines Markers gescreent, der auf der toten Ausgangssubpopulation
anwesend ist.
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Eine
andere gewünschte
Eigenschaft ist die Fähigkeit,
sekundäre
Metaboliten, die natürlicherweise durch
filamentöse
Pilze oder Bakterien gebildet werden, herzustellen. Beispiele von
solchen sekundären
Metaboliten sind Cyclosporin A, Taxol und Cephalosporine. Zum Beispiel
kann die Taxol Herstellung unter Verwendung von Antikörpern gegen
Taxol, durch Massenspektroskopie oder UV Spektrophotometrie überwacht werden.
Alternativ kann die Herstellung von Zwischenprodukten in der Taxol
Synthese oder Enzymen in dem Taxol synethetischen Weg überwacht
werden. Concetti & Ripani,
Biol. Chem. Hoppe Seyler 375, 419–23 (1994). Andere Beispiele
von sekundären
Metaboliten sind Polyole, Aminosäuren
und Ergosterol.
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V. Verfahren für rekursive
Sequenz Rekombination
-
Einige
Formate und Beispiele für
rekursive Sequenz Rekombination, auf die manchmal als DNA Shuffling
oder molekulare Züchtung
Bezug genommen wird, wurden von den Erfindern und Mitarbeitern in
gleichzeitig anhängigen
Patentanmeldungen beschrieben, Anwaltsakte Nr. 16528A-014612, eingereicht
am 25. März
1996, PCT/US95/02126, eingereicht am 17. Februar 1995 (veröffentlicht
als WO 95/22625); Stemmer, Science 270, 1510 (1995); Stemmer et
al., Gene, 164, 49–53
(1995); Stemmer, Bio/Technology, 13, 549–533 (1995); Stemmer, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 91, 10747–10751
(1994); Stemmer, Nature 370, 389–391 (1994); Crameri et al.,
Nature Medicine, 2(1):1–3,
(1996); crateri et al., Nature Biotechnology 14, 315–319 (1996).
-
(1) In vitro Formate
-
Ein
Format für
Shuffling in vitro wird in 1 dargestellt.
Die anfänglichen
Substrate für
die Rekombination sind ein Pool aus verwandten Sequenzen. Die X
in der 1, Panel A zeigen wo die Sequenzen voneinander
abweichen. Die Sequenzen können
DNA oder RNA sein, und sie können
verschiedene Längen
in Abhängigkeit
von der Größe des Gens
oder des DNA-Fragments, das rekombiniert oder neu zusammengesetzt
werden soll, aufweisen. Vorzugsweise liegen die Sequenzen im Bereich
von 50 bp bis 50 kb.
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Der
Pool von verwandten Substraten wird in überlappende Fragmente umgewandelt,
z.B. von ungefähr
5 bp bis 5 kb oder mehr, wie in 1, Panel
B gezeigt ist. Häufig
liegt die Größe der Fragmente
im Bereich von ungefähr
10 bp bis 1000 bp, und manchmal liegt die Größe der DNA-Fragmente im Bereich
von ungefähr 100
bis 500 bp. Die Umwandlung kann durch eine Vielzahl von verschiedenen
Verfahren durchgeführt
werden, wie DNAseI oder RNAse Spaltung, zufälliges Scheren oder teilweise
Restriktionsenzym Spaltung. Alternativ kann die Umwandlung von Substraten
in Fragmente durch unvollständige
PCR Amplifikation von Substraten oder PCR, die von einem einzelnen
Primer gestartet wird, durchgeführt
werden. Alternativ können
geeignete einzelsträngige
Fragmente auf einem Nukleinsäure
Synthetisiergerät
hergestellt werden. Die Konzentration von Nukleinsäure Fragmenten
einer bestimmten Länge
und Sequenz ist häufig
geringer als 0,1 Gew.-% oder 1 Gew.-% der Gesamtnukleinsäure. Die
Zahl von verschiedenen spezifischen Nukleinsäure Fragmenten in dem Gemisch
beträgt
für gewöhnlich mindestens
ungefähr
100, 500 oder 1000.
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Die
gemischte Population von Nukleinsäure Fragmenten wird in mindestens
teilweise einzelsträngige Form
umgewandelt. Die Umwandlung kann durch Erhitzen auf ungefähr 80°C bis 100°C, weiter
bevorzugt von 90°C
bis 96°C,
um ein zelsträngige
Nukleinsäure
Fragmente zu bilden, und anschließendes erneutes Anlagern durchgeführt werden.
Die Umwandlung kann auch durch Behandlung mit einem Protein, das
einzelsträngige DNA
bindet oder dem recA Protein durchgeführt werden. Einzelsträngige Nukleinsäure Fragmente
mit Regionen von Sequenz Identität
mit anderen einzelsträngigen
Nukleinsäure
Fragmenten können
anschließend
erneut durch Abkühlen
auf 20°C
bis 75°C,
und vorzugsweise von 40°C
bis 65°C
angelagert werden. Die Renaturierung kann durch die Zugabe von Polyethylenglykol
(PEG), anderen Volumen ausschließenden Reagenzien oder Salz
beschleunigt werden. Die Salzkonzentration liegt vorzugsweise im
Bereich von 0 mM bis 200 mM, weiter bevorzugt liegt die Salzkonzentration
im Bereich von 10 mM bis 100 mM. Das Salz kann KCl oder NaCl sein.
Die Konzentration von PEG liegt vorzugsweise im Bereich von 0 %
bis 20 %, weiter bevorzugt von 5 % bis 10 %. Die Fragmente, die
sich erneut anlagern, können
von verschiedenen Substraten stammen, wie in 1, Panel
C gezeigt ist. Die angelagerten Nukleinsäure Fragmente werden in der
Anwesenheit einer Nukleinsäure
Polymerase, wie Taq oder Klenow oder Polymerasen mit einer Korrekturlesefunktion,
wie pfu oder pwo, und dNTP's
(d.h. dATP, dCTP, dGTP und dTTP) inkubiert. Wenn die Regionen der
Sequenz Identität
groß sind,
kann Taq Polymerase mit einer Anlagerungstemperatur von zwischen
45–65°C verwendet
werden. Wenn die Bereiche der Identität klein sind, kann Klenow Polymerase
mit einer Anlagerungstemperatur von zwischen 20–30°C verwendet werden (Stemmer,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994), supra). Die Polymerase kann zu
den zufälligen
Nukleinsäure
Fragmenten vor der Anlagerung, gleichzeitig mit der Anlagerung oder
nach der Anlagerung zugegeben werden.
-
Der
Vorgang der Denaturierung, Renaturierung und Inkubation in der Anwesenheit
von Polymerase von überlappenden
Fragmenten, um eine Sammlung von Polynukleotiden mit verschiedenen
Permutationen oder Fragmenten zu bilden, wird manchmal als Shuffling
der Nukleinsäure
in vitro bezeichnet. Dieser Zyklus wird für eine gewünschte Anzahl von Malen wiederholt.
Die resultierenden Nukleinsäuren
sind eine Familie von doppelsträngigen
Polynukleotiden von ungefähr
50 bp bis ungefähr
100 kb, vorzugsweise von 500 bp bis 50 kb, wie in 1,
Panel D gezeigt ist. Die Population repräsentiert Varianten der Ausgangssubstrate,
die eine substanzielle Sequenz Identität dazu zeigen, aber die auch
in verschiedenen Positionen abweichen. Die Population weist viel
mehr Mitglieder auf als die Ausgangssubstrate. Die Population von
Fragmenten, die von dem Shuffling resultieren, wird verwendet, um
Wirtszellen zu transformieren, gegebenenfalls nach Klonierung in
einen Vektor.
-
In
einer Variation von in vitro Shuffling können Subsequenzen von Rekombinatinossubstraten
durch Amplifizieren der Gesamtlängensequenzen
unter Bedingungen gebildet werden, die eine substanzielle Fraktion,
typischerweise mindestens 20 % oder mehr von unvollständig verlängerten
Amplifikationsprodukten bilden. Die Amplifikationsprodukte, einschließlich der
unvollständig
verlängerten
Amplifikationsprodukte, werden denaturiert und mindestens einem
zusätzlichen
Zyklus des erneuten Anlagerns und der Amplifikation unterworfen.
Diese Variation, in der mindestens ein Zyklus des erneuten Anlagerns
und der Amplifikation eine substanzielle Fraktion von unvollständig verlängerten
Produkten liefert, wird als "Stuttering" bezeichnet. In der
nachfolgenden Amplifikationsrunde lagern sich die unvollständig verlängerten
Produkte erneut an und starten die Extension von unterschiedlichen
sequenzverwandten Matrizenspezies.
-
In
einer weiteren Variation wird ein Gemisch aus Fragmenten mit einem
oder mehreren Oligonukleotiden besetzt (engl.: "spiked"). Die Oligonukleotide können derart
gestaltet sein, dass sie vorher charakterisierte Mutationen einer
Wildtyp Sequenz oder Stellen von natürlichen Variationen zwischen
Individuen oder Spezies, einschließen. Die Oligonukleotide schließen auch
eine ausreichende Sequenz oder strukturelle Homologie ein, die solche
Mutationen oder Variationen flankieren, um das Anlagern an die Wildtyp
Fragmente zu erlauben. Einige Oligonukleotide können zufällige Sequenzen sein. Die Anlagerungstemperaturen
können
in Abhängigkeit
von Homologielänge
eingestellt werden.
-
In
einer weiteren Variation findet die Rekombination in mindestens
einem Zyklus bei Matrizenwechsel (engl.: "template switching") statt, wie wenn ein DNA- Fragment, das von
einer Matrize abgeleitet ist, an der homologen Position auf einer
verwandten aber verschiedenen Matrize startet. Der Matrizenaustausch
kann durch Zugabe von recA, rad51, rad55, rad57 oder anderen Polymerasen
(z.B. virale Polymerasen, reverse Transkriptase) zu dem Amplifikationsgemisch
induziert werden. Der Matrizenwechsel kann auch durch Steigern der
DNA Matrizenkonzentration gesteigert werden.
-
In
einer weiteren Variation kann mindestens ein Amplifikationszyklus
unter Verwendung einer Sammlung von überlappenden einzelsträngigen DNA-Fragmenten
von verwendeter Sequenz und unterschiedlichen Längen durchgeführt werden.
Die Fragmente können
unter Verwendung eines einzelsträngigen
DNA Phagen, wie M13, hergestellt werden. Jedes Fragment kann an
die Polynukleotid Kette hybridisieren und die Polynukleotidketten
Extension eines zweiten Fragments aus der Kollektion starten, wodurch
Sequenz rekombinierte Polynukleotide gebildet werden. In einer weiteren
Variation können
ssDNA-Fragmente von variabler Länge
aus einem einzelnen Primer durch Vent oder eine andere DNA Polymerase
aus einer ersten DNA Matrize gebildet werden. Die einzelsträngigen DNA
Fragmente werden als Primer für
eine zweite Matrize des Kunkel Typs verwendet, die aus einer Uracil
enthaltenden zirkulären
ssDNA besteht. Dies führt
zu multiplen Substitutionen der ersten Matrize in die zweite. Siehe
Levichkin et al., Mol. Biology 29, 572–577 (1995).
-
(2) In vivo Formate
-
(a) Plasmid-Plasmid Rekombination
-
Die
anfänglichen
Substrate für
die Rekombination sind eine Sammlung von Polynukleotiden, die variante
Formen eines Gens umfassen. Die varianten Formen zeigen häufig substanzielle
Sequenz Identität
zueinander, die ausreichend ist, um eine homologe Rekombination
zwischen den Substraten zu erlauben. Die Diversität zwischen
den Polynukleotiden kann natürlich
(z.B. allelische oder Speziesvarianten), induziert (z.B. fehleranfällige PCR)
oder das Ergebnis von in vitro Rekom bination sein. Die Diversität kann auch
von erneut synthetisierten Genen, die natürliche Proteine mit alternativen
und/oder gemischter Codon Verwendung, kodieren, stammen. Es sollte
mindestens ausreichend Diversität
zwischen den Substraten geben, dass die Rekombination unterschiedlichere
Produkte bilden kann als sie als Ausgangsmaterialien vorliegen.
Es muss mindestens zwei Substrate geben, die sich an mindestens
zwei Positionen unterscheiden. Jedoch wird für gewöhnlich eine Bibliothek aus
Substraten mit 103–108 Mitgliedern
verwendet. Der Grad der Diversität
hängt von der
Länge des
Substrats, das rekombiniert wird und dem Ausmaß der funktionellen Änderung,
die entwickelt werden soll, ab. Die Diversität zwischen 0,1 bis 50 % der
Positionen ist typisch. Die verschiedenen Substrate werden in Plasmide
eingebaut. Die Plasmide sind häufig
Standard Klonierungsvektoren, z.B. bakterielle Multikopien Plasmide.
Jedoch schließen
die Plasmide in einigen Verfahren, die unten beschrieben werden,
Mobilisierungsfunktionen ein. Die Substrate können in dasselbe oder verschiedene
Plasmide eingebaut werden. Häufig
werden mindestens zwei verschiedene Typen von Plasmiden mit verschiedenen
Typen von Selektionsmarkern verwendet, um eine Selektion für Zellen
mit mindestens zwei Typen von Vektoren zu erlauben. Wenn verschiedene
Typen von Plasmiden eingesetzt werden, können die verschiedenen Plasmide
auch von zwei unterschiedlichen Inkompatibilitätsgruppen stammen, um eine
stabile Koexistenz von zwei verschiedenen Plasmiden innerhalb der
Zelle zu erlauben. Nichts desto trotz können Plasmide aus derselben
Inkompatibilitätsgruppe
innerhalb derselben Zelle für
einen ausreichenden Zeitraum koexistieren, um zu erlauben, dass eine
homologe Rekombination stattfindet.
-
Plasmide
mit unterschiedlichen Substraten werden anfänglich in eine prokaryonte
oder eukaryonte Zelle durch irgendein Transfektionsverfahren (z.B.
chemische Transformation, natürliche
Kompetenz, Elektroporation, virale Transduktion oder Biolistik)
eingeführt.
Häufig
sind die Plasmide an oder nahe der sättigenden Konzentration (bezüglich der
maximalen Transfektionskapazität)
anwesend, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass mehr als ein Plasmid
in dieselbe Zelle eintritt. Die Plasmide mit verschiedenen Substraten
können gleichzeitig
oder in multiplen Runden transfiziert werden. In dem zuletzt genannten
Ansatz können
zum Beispiel Zellen mit einem ersten Plasmid Aliquot transfiziert
werden, Transfektanten können
selektiert und vermehrt werden, und anschließend können sie mit einem zweiten
Plasmid Aliquot infiziert werden.
-
Nachdem
die Plasmide in die Zellen eingeführt wurden, findet eine Rekombination
zwischen Substraten, um rekombinante Gene zu bilden, innerhalb der
Zellen mit multiplen verschiedenen Plasmiden nur durch die Vermehrung
in den Zellen statt. Zellen, die nur ein Plasmid erhalten haben,
sind jedoch nicht in der Lage an der Rekombination teilzunehmen,
und der mögliche
Beitrag von Substraten auf solchen Plasmiden an der Evolution wird
nicht vollständig
ausgenutzt, obwohl diese Plasmide in gewissem Ausmaß beitragen
können, wenn
sie in Mutator Zellen vermehrt werden oder auf andere Weise Punktmutationen
(z.B. durch ultraviolette Bestrahlungsbehandlung) anreichern. Die
Evolutionsgeschwindigkeit kann dadurch erhöht werden, dass alle Substrate
an der Rekombination teilnehmen. Dies kann erreicht werden, indem
transfizierte Zellen einer Elektroporation unterworfen werden. Die
Bedingungen für
die Elektroporation sind dieselben, wie jene, die herkömmlich für das Einführen exogener
DNA in Zellen (z.B. 1.000–2.500
Volt, 400 μF
und eine 1–2
mM Lücke) verwendet
werden. Unter diesen Bedingungen werden Plasmide zwischen Zellen
ausgetauscht, was es erlaubt, dass alle Substrate an der Rekombination
teilnehmen. Zusätzlich
können
die Rekombinationsprodukte weitere Rekombinationsrunden miteinander
oder mit dem Ausgangssubstrat durchlaufen. Die Evolutionsgeschwindigkeit
kann auch durch die Verwendung von konjugativem Transfer erhöht werden.
Konjugative Transfersysteme sind in vielen Bakterien (E. coli, P.
aeruginosa, S. pneumoniae, und H. influenzae) bekannt, und sie können auch
verwendet werden, um DNA zwischen Bakterien und Hefe oder zwischen
Bakterien und Säugerzellen
zu transferieren.
-
Um
den konjugativen Transfer auszunutzen, werden Substrate in Plasmide
mit MOB Genen kloniert, und tra Gene werden auch in cis oder trans
zu den MOB Genen bereitgestellt. Die Wirkung des konjugativen Transfers
ist sehr ähnlich
zur Elektroporation, dahingehend, dass er es Plasmiden erlaubt,
sich zwischen den Zellen zu bewegen und es erlaubt, dass eine Regeneration
zwischen irgendeinem Substrat und den Produkten der vorherigen Rekombination
stattfindet, allein durch das Vermehren der Kultur. Die Details,
wie konjugativer Transfer in diesen Vektoren ausgenutzt wird, werden
detaillierter unten diskutiert. Die Evolutionsgeschwindigkeit kann
auch durch das Fusionieren von Protoplasten von Zellen gesteigert
werden, um den Austausch von Plasmiden oder Chromosomen zu induzieren.
Die Fusion kann durch chemische Mittel, wie PEG, oder Viren oder
virale Proteine, wie Influenza Virus Hämagglutinin, induziert werden.
Die Evolutionsgeschwindigkeit kann auch durch die Verwendung von
Mutator Wirtszellen (z.B. Mut L, S, D, T, H) gesteigert werden.
-
Der
Zeitraum für
den die Zellen vermehrt werden und die Rekombination stattfindet,
variiert selbstverständlich
mit dem Zelltyp, aber er ist im Allgemeinen nicht kritisch, weil
selbst ein kleiner Rekombinationsgrad die Diversität relativ
zu den Ausgangsmaterialien substanziell erhöhen kann. Zellen, die Plasmide
mit rekombinierten Genen tragen, werden einem Screenen oder einer
Selektion für
eine gewünschte
Funktion unterworfen. Wenn zum Beispiel das zu entwickelnde Substrat
ein Arzneimittel Resistenzgen trägt,
selektiert man hinsichtlich Arzneimittel Resistenz. Zellen, die
das Screenen oder die Selektion überleben,
können
einer oder mehreren Screening-/Selektionsrunden gefolgt von Rekombination
unterworfen werden, oder sie können
direkt einer zusätzlichen
Rekombinationsrunde unterworfen werden.
-
Die
nächste
Rekombinationsrunde kann durch einige verschiedene Formate erreicht
werden, die unabhängig
von der vorherigen Runde sind. Zum Beispiel kann eine weitere Rekombinationsrunde
einfach durchgeführt
werden, durch Wiederaufnahme der Elektroporation oder des konjugationsvermittelten
interzellulären
Transfers von Plasmiden, die oben beschrieben sind. Alternativ kann
ein frisches Substrat oder frische Substrate, das gleiche oder im
Vergleich zu den vorherigen Substraten verschieden ist in die Zellen,
welche die Selektion/das Screenen überlebt haben, transfiziert
werden. Gegebenenfalls können
die neuen Substrate in Plasmid Vektoren eingeschlossen werden, die
einen anderen selektiven Marker tragen und/oder von einer anderen
Inkompatibilitätsgruppe
als die Ausgangsplas mide abgeleitet sind. Als eine weitere Alternative
können
Zellen, welche die Selektion/das Screenen überlebt haben, in zwei Subpopulationen
eingeteilt werden, und Plasmid DNA von einer Subpopulation kann
in die andere transfiziert werden, wo die Substrate von den Plasmiden
von zwei Subpopulationen eine weitere Rekombinationsrunde durchlaufen.
In beiden der zuletzt. genannten zwei Optionen kann die Evolutionsgeschwindigkeit
gesteigert werden, indem DNA Extraktion, Elektroporation, Konjugation
oder Mutator Zellen eingesetzt werden, wie oben beschrieben ist.
In noch einer weiteren Variation kann DNA aus Zellen, die das Screenen/die
Selektion überlebt
haben, extrahiert und einem in vitro DNA Shuffling unterworfen werden.
-
Nach
der zweiten Rekombinationsrunde wird eine zweite Screening-/Selektionsrunde
durchgeführt, vorzugsweise
unter Bedingungen mit gesteigerter Stringenz. Wenn gewünscht, können weitere
Rekombinationsrunden und eine weitere Selektion/ein weiteres Screening
unter Verwendung derselben Strategie wie für die zweite Runde durchgeführt werden.
Mit aufeinanderfolgenden Rekombinationsrunden und Selektion/Screenen
entwickeln sich die überlebenden
rekombinierten Substrate in Richtung der Annahme eines gewünschten
Phänotyps.
Typisch in diesen und anderen Verfahren der rekursiven Rekombination
unterscheidet sich das Endprodukt der Rekombination, das den gewünschten
Phänotyp
angenommen hat, von den Ausgangssubstraten an 0,1 %–25 % der
Positionen, und es hat sich mit einer Geschwindigkeit in der Größenordnung
im Übermaß (z.B.
mindestens 10-fach, 100-fach, 1000-fach oder 10.000-fach) der Geschwindigkeit
von natürlich
angenommenen Mutationen von ungefähr 1 Mutation pro 10–9 Positionen
pro Generation entwickelt (siehe Anderson & Hughes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93, 906–907
(1996)).
-
(b) Virus-Plasmid Rekombination
-
Die
Strategie, die für
Plasmid-Plasmid Rekombination verwendet wurde, kann auch für Virus-Plasmid Rekombination
verwendet werden; für
gewöhnlich
eine Phagen-Plasmid Rekombination. Jedoch sind einige zusätzliche
Kommentare ins besondere für
die Verwendung von Viren angebracht. Die Ausgangssubstanzen für die Rekombination
werden in sowohl Plasmid als auch virale Vektoren kloniert. Es ist
für gewöhnlich nicht kritisch,
welche/s Substrat/e in den viralen Vektor und welche/s in das Plasmid
eingebaut werden, obwohl für gewöhnlich der
virale Vektor (ein) verschiedene/s Substrat/e im Vergleich zu dem
Plasmid enthalten sollte. Wie zuvor erwähnt enthält das Plasmid (und das Virus)
typischerweise einen Selektionsmarker. Die Plasmid und viralen Vektoren
können
beide in Zellen durch Transfektion, wie oben beschrieben, eingeführt werden.
Ein wirksameres Verfahren ist es jedoch, die Zellen mit Plasmid
zu transfizieren, Transfektanten zu selektieren und die Transfektanten
mit Virus zu infizieren. Weil die Infektionswirksamkeit von vielen
Viren sich an 100 % der Zellen annähert, enthalten die meisten
Zellen, die auf diese Weise transfiziert und infiziert wurden, sowohl
ein Plasmid als auch ein Virus, die verschiedene Substrate tragen.
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Die
homologe Rekombination findet zwischen dem Plasmid und dem Virus
statt, was sowohl rekombinierte Plasmide als auch rekombinierte
Viren bildet. Bei einigen Viren, wie einem filamentösen Phagen,
in dem die intrazelluläre
DNA in sowohl doppelsträngigen
als auch einzelsträngigen
Formen existiert, können
beide an der Rekombination teilnehmen. Vorausgesetzt, dass das Virus
keines ist, das Zellen schnell abtötet, kann die Rekombination
durch die Verwendung von Elektroporation oder Konjugation, um Plasmide
zwischen Zellen zu transferieren, erhöht werden. Die Rekombination
kann auch für
einige Virustypen erhöht
werden, indem es dem Nachkommen Virus von einer Zelle erlaubt wird,
andere Zellen erneut zu infizieren. Für einige Virustypen zeigen
Virus infizierte Zellen Resistenz gegenüber Superinfektion. Jedoch
kann eine solche Resistenz durch das Infizieren mit hoher Multiplizität und/oder
der Verwendung von mutanten Stämmen
des Virus, in denen die Resistenz gegenüber Superinfektion verringert
ist, überwunden
werden.
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Das
Ergebnis des Infizierens von Plasmid enthaltenden Zellen mit Virus
hängt von
der Natur des Virus ab. Einige Viren, wie ein filamentöser Phage,
existieren stabil mit einem Plasmid in der Zelle, und sie geben auch
Nachkommen Phagen aus der Zelle ab. Andere Viren, wie Lambda mit
einem Cosmid Genom, existieren stabil in einer Zelle wie Plasmide,
ohne Nachkommen Virionen zu bilden. Andere Viren, wie der T-Phage
und lytischer Lambda, durchlaufen eine Rekombination mit Plasmid
aber töten
schließlich
die Wirtszelle und zerstören
die Plasmid DNA. Für
Viren, die Zellen ohne Abtöten
des Wirts infizieren, können
Zellen mit rekombinanten Plasmiden und Virus unter Verwendung desselben
Ansatzes wie für
die Plasmid-Plasmid Rekombination gescreent/selektiert werden. Nachkommen
Virus, das von Zellen abgegeben wird, welche die Selektion/das Screenen überlebt
haben, können
auch gesammelt und als Substrate in anschließenden Rekombinationsrunden
verwendet werden. Für
Viren, die ihre Wirtszellen abtöten,
liegen rekombinante Gene, die aus der Rekombination stammen, nur
in dem Nachkommen Virus vor. Wenn der Screening oder selektive Assay
die Expression von rekombinanten Genen in einer Zelle benötigt, sollten
die rekombinanten Gene von dem Nachkommen Virus auf einen anderen
Vektor, z.B. einem Plasmid Vektor transferiert und in Zellen erneut
transfiziert werden, bevor die Selektion/das Screenen durchgeführt wird.
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Bei
einem filamentösen
Phagen sind die Rekombinationsprodukte sowohl in Zellen, welche
die Rekombination überleben
als auch in dem Phagen, der aus diesen Zellen abgegeben wird, anwesend.
Die doppelte Quelle von rekombinanten Produkten stellt einige zusätzliche
Möglichkeiten
im Vergleich zu der Plasmid-Plasmid Rekombination bereit. Zum Beispiel
kann DNA aus Phagen Partikeln zur Verwendung in der Runde in vitro
Rekombination isoliert werden. Alternativ kann Nachkommen Phage
verwendet werden, um Zellen zu transfizieren oder zu infizieren,
die eine vorherige Screening-/Selektionsrunde überlebt haben, oder frische Zellen
können
mit frischen Substraten für
die Rekombination transfiziert werden.
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(c) Virus-Virus Rekombiation
-
Die
Prinzipen, die für
Plasmid-Plasmid und Plasmid-virale Rekombination beschrieben wurden,
können
auf Virus-Virus Rekombination mit wenigen Modifikationen angewendet
werden. Die Ausgangssubstrate für
die Rekombination werden in einem viralen Vektor kloniert. Für gewöhnlich wird
derselbe Vektor für
alle Substrate verwendet. Vorzugsweise ist das Virus eines, das,
natürlich
oder als ein Ergebnis von Mutation, Zellen nicht abtötet. Nach
dem Einbau können
einige virale Genome in vitro verpackt werden. Die verpackten Viren
werden verwendet, um Zellen mit hoher Multiplizität zu infizieren,
so dass es eine hohe Wahrscheinlichkeit gibt, dass eine Zelle multiple
Viren erhält,
die unterschiedliche Substrate tragen.
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Nach
der anfänglichen
Infektionsrunde hängen
die nachfolgenden Schritte von der Natur der Infektion, wie in dem
vorherigen Abschnitt diskutiert wurde, ab. Wenn die Viren zum Beispiel
Phagemid Genome, wie Lambda Cosmide oder M13, F1 oder Fd Phagemide,
aufweisen, benehmen sich die Phagemide innerhalb der Zelle wie Plasmide
und durchlaufen eine Rekombination einfach durch das Vermehren der
Zelle. Die Rekombination kann durch Elektroporation von Zellen erhöht werden.
Nach der Selektion/dem Screenen können Cosmide mit rekombinanten
Genen aus überlebenden
Zellen (z.B. Hitzeinduktion einer cos– lysogenen
Wirtszelle) gewonnen, erneut in vitro verpackt und verwendet werden,
um frische Zellen mit hoher Multiplizität für eine weitere Rekombinationsrunde
zu infizieren.
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Wenn
die Viren ein filamentöser
Phage sind, findet die Rekombination der replizierenden DNA Form durch
das Vermehren der Kultur von infizierten Zellen statt. Die Selektion/das
Screenen identifiziert Kolonien von Zellen mit viralen Vektoren
mit rekombinanten Genen mit verbesserten Eigenschaften, wobei der
Phage aus solchen Zellen abgegeben wird. Die nachfolgenden Möglichkeiten
sind im Wesentlichen dieselben wie für die Plasmid-virale Rekombination.
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(d) Chromosomen-Plasmid
Rekombination
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Dieses
Format kann verwendet werden, um sowohl chromosomal als auch Plasmid
abstammende Substrate zu entwickeln. Das Format ist insbesondere
nützlich
in Situationen, in denen viele chromosomale Gene zu einem Phänotyp beitragen
oder man die genaue Lage auf dem/den chromosomalen Gen/en, das/die entwi ckelt
werden soll/en, nicht kennt. Die anfänglichen Substrate für die Rekombination
werden in einen Plasmid Vektor kloniert. Wenn das/die chromosomalen
Gen/e, das/die entwickelt werden soll/en bekannt sind, bilden die
Substrate eine Sequenz Familie, die einen hohen Grad an Sequenz
Identität
aber einige Abweichung von dem chromosomalen Gen zeigt. Wenn die
chromosomalen Gene, die entwickelt werden sollen, nicht lokalisiert
wurden, bilden die Ausgangssubstrate für gewöhnlich eine Bibliothek von
DNA Segmenten, von denen nur eine kleine Zahl Sequenz Identität mit dem
Gen oder den Genen, das/die entwickelt werden soll/en, zeigt. Ein
Unterschied zwischen von Plasmid abstammendem Substrat und dem/den
chromosomalen Gen/en kann durch Mutagenese eingeführt werden
oder durch Erhalten der Plasmid abstammenden Substrate aus einer
unterschiedlichen Spezies als jene der Zellen, die das Chromosom
tragen.
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Die
Plasmid tragenden Substrate für
die Rekombination werden in Zellen mit (einem) chromosomalen Gen/en,
das/die entwickelt werden soll/en, transfiziert. Die Evolution kann
einfach durch Vermehren der Kultur stattfinden, und sie kann beschleunigt
werden durch Transferieren der Plasmide zwischen Zellen durch Konjugation
oder Elektroporation. Die Evolution kann weiter durch die Verwendung
von Mutator Wirtszellen oder durch das Aussäen einer Kultur von nicht Mutator
Wirtszellen, die mit Mutator Wirtszellen entwickelt werden und dem
Induzieren von interzellulärem
Transfer von Plasmiden durch Elektroporation oder Konjugation beschleunigt
werden. Vorzugsweise enthalten die Mutator Wirtszellen, die für das Aussäen verwendet
werden, einen negativen Selektionsmarker, um die Isolierung einer
reinen Kultur aus den entwickelten nicht Mutator Zellen, zu erleichtern.
Die Selektion/das Screenen identifiziert Zellen, die Chromosomen
tragen und/oder Plasmide, die sich in Richtung der Annahme einer
gewünschten
Funktion entwickelt haben.
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Nachfolgende
Rekombinationsrunden und Selektions-/Screeningrunden schreiten auf
die gleiche Weise fort, wie jene, die für Plasmid-Plasmid Rekombination
beschrieben sind. Zum Beispiel kann eine weitere Rekombination durch
Vermehren der Zellen, welche die Rekombination überlebt haben, in Kombination
mit Elektro poration oder konjugativem Transfer von Plasmiden bewirkt
werden. Alternativ können
Plasmide, die zusätzliche
Substrate für
die Rekombination tragen, in die überlebenden Zellen eingeführt werden.
Vorzugsweise stammen diese Plasmide von einer anderen Inkompatibilitätsgruppe
und tragen einen anderen Selektionsmarker als die Ausgangsplasmide,
um die Selektion für
Zellen mit mindestens zwei verschiedenen Plasmiden zu erlauben.
Als eine weitere Alternative können
Plasmid und/oder chromosomale DNA aus einer Subpopulation von überlebenden
Zellen isoliert und in eine zweite Subpopulation transfiziert werden.
Die chromsomale DNA kann in einem Plasmid Vektor vor der Transfektion
kloniert werden.
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(e) Virus-Chromosomen
Rekombination
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Wie
in dem anderen oben beschriebenen Verfahren ist das Virus für gewöhnlich eines,
das die Zellen nicht abtötet,
und es ist häufig
ein Phage oder ein Phagemid. Das Verfahren ist im Wesentlichen dasselbe
wie für
die Plasmid-Chromosomen Rekombination. Substrate für die Rekombination
werden in dem Vektor kloniert. Die Vektoren, welche die Substrate
einschließen,
können
anschließend
in Zellen transfiziert oder in vitro verpackt und in Zellen durch
Infektion eingeführt
werden. Die viralen Genome rekombinieren mit Wirtschromosomen nur
durch das Vermehren einer Kultur. Die Evolution kann beschleunigt
werden, indem der interzelluläre Transfer
von viralen Genomen durch Elektroporation oder die erneute Infektion
von Zellen durch Nachkommen Virionen zugelassen wird. Das Screenen/Die
Selektion identifiziert Zellen mit Chromosomen und/oder viralen Genomen,
die sich in Richtung der Annahme einer gewünschten Funktion entwickelt
haben.
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Es
gibt verschiedene Möglichkeiten
für nachfolgende
Rekombinationsrunden. Zum Beispiel können virale Genome zwischen
Zellen durch Elektroporation transferiert werden, welche die Selektion/Rekombination überlebt
haben. Alternativ können
Viren, die von Zellen abgegeben werden, welche die Selektion/das
Screenen überlebt
haben, gepoolt und verwendet werden, um die Zellen mit hoher Multiplizität zu überinfizieren.
Alternativ können
frische Substrate für
die Rekombination in die Zellen, entweder auf Plasmid oder viralen
Vektoren, eingeführt
werden.
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BEISPIELE
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Beispiele,
die nicht spezifisch die beanspruchte Erfindung betreffen, sind
nur für
die Darstellung eingeschlossen.
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1. Entwicklung von hyperrekombinogenem
RecA
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Das
RecA Protein ist in die meisten homologen Rekombinationswege von
E. coli involviert. Die meisten Mutationen in recA inhibieren die
Rekombination, aber von einigen wurde berichtet, dass sie die Rekombination
erhöhen
(Kowalczykowski et al., Microbiol. Rev., 58, 401–465 (1994)). Das folgende
Beispiel beschreibt die Evolution von RecA, um hyperrekombinogene
Aktivität
anzunehmen, die in in vivo Shuffling Formaten nützlich ist.
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Hyperrekombinogenes
RecA wurde unter Verwendung einer Modifikation eines Systems ausgewählt, das
von Shen et al., Genetics 112, 441–457 (1986); Shen et al., Mol.
Gen. Genet. 218, 358–360
(1989) entwickelt wurde, um die Wirkung von Substratlänge und
Homologie auf die Rekombinationsfrequenz zu messen. Das System von
Shen & Huang
verwendete Plasmide und Bakteriophagen mit kleinen (31–430 bp)
Homologie Regionen, an denen die beiden rekombinieren sollten. In
einem restriktiven Wirt war nur der Phage, welcher die Plasmid Sequenz
eingebaut hatte, in der Lage, Plaques zu bilden.
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Für das Shuffling
von von recA wurde endogenes recA und mutS aus dem Wirtsstamm MC1061
deletiert. In diesem Stamm wurde keine Rekombination zwischen Plasmid
und Phage beobachtet. E. coli recA wurde anschließend in
zwei der Rekombinationsvektoren (Bp221 und πMT631c18) kloniert. Die Plasmide
mit kloniertem recA waren in der Lage, mit homologem Phagen zu rekombinieren: λV3 (530 bp
Identität
mit Bp221), λV13
(430 bp Spanne von 89 % Identität
mit Bp221) und λlink
H (31 bp Identität
mit πMT631c18,
mit Ausnahme von 1 Fehlpaarung an Position 18).
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Das
klonierte recA wurde anschließend
in vitro unter Verwendung der Standard DNase Behandlung gefolgt
von PCR basierter erneuter Zusammenlagerung geshuffelt. Die geshuffelten
Plasmide wurden in den nicht rekombinierten Wirtsstamm transformiert.
Diese Zellen wurden über
Nacht angezogen, mit dem Phagen λVc, λV13 oder λlink H infiziert
und auf NZCYM Platten in der Anwesenheit eines 10-fachen Überschusses
von MC1061 ohne Plasmid ausplattiert. Umso wirksamer ein recA Allel
die Rekombination zwischen Plasmid und Phage fördert, desto höher ist
das Allel in der Bakteriophagen DNA repräsentiert. Das anschließende Ernten der
gesamten Phagen von den Platten und das Gewinnen der recA Gene selektiert
für die
meisten rekombinogenen recA Allele.
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Die
Rekombinationsfrequenzen für
Wildtyp und einen Pool von hyperrekombinogenem recA nach 3 Runden
des Shufflings waren wie folgt:
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Die
Ergebnisse zeigen einen 50-fachen Anstieg in der Rekombination für das 430
bp Substrat und einen 5-fachen Anstieg für das 31 bp Substrat.
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Die
Rekombinationsfrequenz zwischen BP221 und V3 für fünf individuelle klonale Isolate
sind unten gezeigt, und die DNA und Protein Sequenzen und die Anordnungen
davon sind in die 12 und 13 eingeschlossen.
- Wildtyp: 1,6 × 10–4
- Klon 2: 9,8 × 10–3 (61 × Anstieg)
- Klon 4: 9,9 × 10–3 (62 × Anstieg)
- Klon 5: 6,2 × 10–3 (39 × Anstieg)
- Klon 6: 8,5 × 10–3 (53 × Anstieg)
- Klon 13: 0,019 × 10–3 (116 × Anstieg)
-
Die
Klone 2, 4, 5, 6 und 13 können
als Substrate in nachfolgenden Shuffling Runden verwendet werden,
wenn eine weitere Verbesserung in recA gewünscht ist. Nicht alle der Variationen
von der Wildtyp recA Sequenz tragen notwendigerweise zu dem hyperrekombinogenen
Phänotyp
bei. Stille Variationen können durch
Rückkreuzung
eliminiert werden. Alternativ können
Varianten von recA, die individuelle Punkte von Variationen aus
dem Wildtyp an den Codons 5, 18, 156, 190, 236, 268, 271, 283, 304,
312, 317, 345 und 353 eingebaut haben, hinsichtlich Aktivität getestet
werden.
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2. Evolution des Gesamtorganismus
für Hyperrekombination
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Die
Möglichkeit
der Selektion von einen E. coli Stamm mit einer gesteigerten Rekombinationsmenge war
aus den Phänotypen
von Wildtyp, ΔrecA,
mutS und ΔrecA
mutS Stämmen
nach Exposition gegenüber
Mitomycin C, einem Interstrang Kreuzvernetzungsmittel der DNA, angezeigt.
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Das
Aussetzen von E. coli gegenüber
Mitomycin C verursacht Interstrang Kreuzvernetzung von DNA, wodurch
die DNA Replikation blockiert wird. Die Reparatur der Interstrang
DNA Überkreuzungen
in E. coli verläuft über einen
RecA abhängigen
rekombinatorischen Reparaturweg (Friedberg et al., in DNA Repair
and Mutagenesis (1995) S. 191–232).
Die Verarbeitung der Überkreuzungen
während
der Reparatur führt
zu gelegentlichen Doppelstrang DNA Brüchen, die auch durch einen
RecA abhängigen
rekombinatorischen Weg repariert werden. Folglich sind recA Stämme signifikant
sensitiver als Wildtyp Stämme
bezüglich
des Aussetzens gegenüber
Mitomycin C. Tatsächlich
wird Mitomycin C in einfachen Disk-Sensitivitätsassays verwendet, um zwischen
recA+ und recA– Stämmen zu
unterscheiden.
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Zusätzlich zu
seinen rekombinogenen Eigenschaften ist Mitomycin C ein Mutagen.
Das Aussetzen gegenüber
DNA schädigenden
Mitteln, wie Mitomycin C, führt
ty pischerweise zu der Induktion des E. coli SOS Regulons, was Produkte
einschließt,
die in die fehlerhafte Reparatur von DNA Schädigung involviert sind (Friedberg
et al., 1995, supra, S. 465–522).
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Nach
der Phagen P1 vermittelten generalisierten Transduktion des Δ(recA-srl)::
Tn10 Allels (einem nichtfunktionellen Allel) in Wildtyp und mutS
E. coli, wurden Tetracyclin resistente Transduktanten hinsichtlich eines
recA" Phänotyps unter
Verwendung des Mitomycin C Sensitivitätsassays gescreent. Es wurde
in LB Überschichtungen
mit einer 1/4 Inch Filterscheibe, die mit 10 μg Mitomycin C gesättigt war
nach 48 Stunden bei 37°C
beobachtet, dass das Wachstum der Wildtyp und mutS Stämme innerhalb
einer Region mit einem Radius von 10 mm von dem Zentrum der Scheibe
inhibiert war. Die DNA Kreuzvernetzung bei großen Mengen von Mitomycin C
sättigt
die rekombinatorische Reparatur, was zu einer lethalen Blockierung
von DNA Replikation führt.
Beide Stämme
zeigten gelegentlich Kolonie bildende Einheiten innerhalb der Inhibitionszone,
obwohl die Frequenz der Kolonien ~ 10- bis 20-fach höher in den
mutS Stamm war. Dies liegt wahrscheinlich an der gesteigerten Rate
von spontaner Mutation in mutS Hintergründen. Ein Seite an Seite Vergleich
zeigt, dass die ΔrecA
und ΔrecA
mutS Stämme
signifikant sensitiver gegenüber
Mitomycin C waren, wobei das Wachstum in einer Region, die sich über ungefähr 15 mm
von dem Zentrum der Scheibe erstreckte, inhibiert war. Im Gegensatz
zu den recA+ Stämmen wurden jedoch keine Mit
Individuen innerhalb der Region der Wachstumsinhibition, nicht einmal
in dem mutS Hintergrund, beobachtet. Das Auftreten von Mit Individuen
in recA+ Hintergründen, aber nicht in ΔrecA Hintergründen, zeigt
an, dass Mit von einem funktionellen recA Protein abhängig ist, und
es liegt nahe, dass Mit aus einer gesteigerten Kapazität von rekombinatorischer
Reparatur von Mitomycin C induziertem Schaden resultiert.
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Die
Mutationen, die zu einer gesteigerten Kapazität für recA vermittelte rekombinatorische
Reparatur führen,
können
verschieden, unerwartet, unverbunden und möglicherweise synergistisch
sein. Ein rekursives Protokoll, das die Selektion für Mit verändert, und
chromosomales Shuffling entwickelt einzelne Zellen mit einer stark
gesteigerten Kapazität
für Rekombination.
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Das
rekursive Protokoll ist wie folgt. Nach dem Aussetzen eines mutS
Stammes gegenüber
Mitomycin C werden Mit Individuen vereinigt und gekreuzt (z.B. über Hfr
vermitteltes chromosomales Shuffling oder Split-Pool generalisierte
Transduktion). Allele, die zu Mit führen und möglicherweise zu einer gesteigerten
Kapazität
für rekombinatorische
Reparatur führen,
werden unter den Populationen in der Abwesenheit von Fehlpaarungsreparatur
geshuffelt. Zusätzlich
kann eine fehleranfällige
Reparatur nach dem Aussetzen gegenüber Mitomycin neue Mutationen
in die nächste
Shuffling Runde einführen.
Der Vorgang wird unter Verwendung eines steigenden stringenteren
Aussetzens gegenüber
Mitomycin C wiederholt. Eine Anzahl von parallelen Selektionen in
der ersten Runde wird als ein Mittel des Bildens eines Vielzahl
von Allelen durchgeführt.
Gegebenenfalls kann die Rekombinogenität von Isolaten für Hyperrekombination
unter Verwendung eines Plasmid × Plasmid
Assays oder eines Chromosomen × Chromosomen
Assays (z.B. jener von Konrad, J. Bacteriol. 130, 167–172 (1977)) überwacht
werden.
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3. Shuffling von ganzen
Genomen von Streptomyces coelicolor
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Um
zu zeigen, dass rekursive Mutation und Rekombination eines gesamten
Genoms verwendet werden können,
um einen bestimmten Phänotyp
zu verbessern, wurde S. coelicolor rekursiv sowohl alleine als auch
mit seinen nahen Verwandten S. lividans geshuffelt, um die Gesamtproduktion
des blauen Pigments γ-Actinorhodin zu verbessern.
Diese Strang Verbesserungsstrategie wird mit einem ähnlichen
Strang Verbesserungsprogramm verglichen, welches keine Rekombination
einschließt.
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Sporensuspensionen
von S. coelicolor und S. lividans werden in sterilem Wasser resuspendiert
und einer UV Mutagenese (600 "Energie" Einheiten) unter
Verwendung eines Stratalinker (Stratagene) unterworfen, und die
resultierenden Mutanten werden auf Sporulationsagar "ausgewachsen". Sporen wurden gesammelt
und auf festem RG-2 Medium ausplattiert (Bystrykh et al., J. Bact.
178, 2238–2244
(1996)). Kolonien, die größere und
dunklere Halos von blauen Pigment bildeten, wurden selektiert, in
flüssigem
RG-2 Medium angezogen, und die Menge von gebildetem γ-Actinorhodin
wurde spektrophotometrisch durch das Messen der Absorption bei 650
nm von alkalischen Kulturüberständen unter
Verwendung eines Mikrotiter Plattenformats gemessen. Die Pigment
Konzentration und Struktur wurde weiter durch LC/MS, MS/MS und/oder
NMR bestätigt. Zellen,
die γ-Actinorhodin
in Mengen größer als
jene des Wildtyps bildeten, wurden in das Stamm Verbesserungsprogramm übertragen.
Sporen, die aus jeder der Mutanten isoliert wurden, wurden entweder
1) erneut mutagenisiert und wie oben gescreent (keine Rekombinationskontrolle)
oder, 2) angezogen, wie Protoplasten hergestellt und fusioniert.
Die Verfahren zum Herstellen und Fusionieren von Streptomyces Protoplasten
sind beschrieben in Genetic Manipulation of Streptomyces – A Laboratory
Manual, (Hopwood, D.A. et al.). Die regenerierten fusionierten Protoplasten
werden anschließend
wie oben für
Klone gescreent, welche eine Rekombination durchlaufen haben, die γ-Actinorhodin
in Mengen bilden, die höher
sind als in den Zellen, die fusioniert wurden. Die selektierten
Klone werden einer UV Mutagenese erneut unterzogen, und das Screenen
und die Rekombination werden rekursiv wiederholt, bis die gewünschte Menge
der ☐-Actinorhodin Bildung erreicht ist.