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Gebiet der
Erfindung
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Die
Erfindung betrifft Elektrodenvorrichtungen, welche in der Lage sind,
kleine Volumina von Proben aufzunehmen, und deren Verwendung in
einem Testverfahren für
die Ermittlung und quantitative Bestimmung einer Testspezies, die
in einem kleinen Volumen vorhanden ist.
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Hintergrund
der Erfindung
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Es
sind viele Vorrichtungen offenbart worden, die in der Lage sind,
kleine Volumina eines Probenmaterials aufzunehmen und die es ermöglichen, in
der Probe vorhandene Analyten abzufragen, sei es durch einen optischen
oder einen elektrischen Analysevorgang. Insbesondere die Verwendung
und der Aufbau von Probenkammern, die durch Kapillarwirkung gefüllt werden,
ist sowohl in der Patentwie auch in der wissenschaftlichen Literatur
beschrieben worden. Siehe zum Beispiel EP-A-0170375 und US-A-5141868.
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Solche
bekannten Vorrichtungen können
auf einem nicht leitenden Substrat abgeschiedene Elektroden umfassen,
die mit einem für
den interessierenden Analyten spezifischen Reagenzsystem beschichtet
sind und innerhalb eines Hohlraums untergebracht sind, dessen Abmessungen
ausreichend klein sind, das Einführen
einer Probe durch Kapillarwirkung zu gestatten. Die Probe wird in
enger Nachbarschaft zu den Elektroden gehalten, und die Elektroden
sind in einer solchen Weise konfiguriert, dass die Messung von spezifischen
elektrischen Eigenschaften der Probe erleichtert wird.
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Solche
Vorrichtungen leiden unter zahlreichen Mängeln, insbesondere der Notwendigkeit,
die Abmessungen des Hohlraums innerhalb sehr eng definierter Grenzen
zu steuern. Wenn diese Herstellungstoleranzen überschritten werden, wird die
Probe daran gehindert, durch Kapillarwirkung in den Hohlraum einzutreten.
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Wenn
ferner viskose Probenflüssigkeiten
wie Blut in den Hohlraum eingeführt
werden, füllt
sich die Kammer verhältnismäßig langsam
mit Probe, und auf diese Weise wird der zur Vervollständigung
der Analyse benötigte
Zeitraum verlängert.
Schwankungen der Probenviskosität
und damit der Oberflächenspannungseigenschaften
der Probe haben Schwankungen der Füllzeit zur Folge; dies verschlechtert nicht
nur die Gesamtdauer der Analyse, sondern führt auch zu Ungenauigkeit des
Analyseergebnisses, was noch wichtiger ist, da der Zeitraum, über den
hinweg die Probe dem Analyt-spezifischen Reagenz ausgesetzt ist,
Schwankungen unterworfen ist.
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WO-A-9730344
offenbart eine Elektrodenvorrichtung, welche eine Polyestergaze
umfasst, die dazu angepasst ist, die Probe zu der Bezugselektrode
zu leiten. Diese Vorrichtung macht erforderlich, dass das Reagenz
einen Füllstoff
beinhaltet, der sowohl hydrophobe als auch hydrophile Oberflächenbereiche
aufweist, um mit Schwankungen bei der Probenbehandlung verbundene
Probleme zu vermeiden und für
die Glucoseprüfung
unabhängig
von dem Hämokriten
der Probe zu sein.
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Die
Druckschrift US-A-5 628 890 offenbart eine Vorrichtung zur Verwendung
bei der elektrochemischen Analyse eines Analyten in einer flüssigen Probe
und umfasst:
ein nicht leitfähiges Substrat;
eine leitfähige Schicht,
abgeschieden auf dem Substrat in zwei Teilen, die dazwischen einen
nicht leitenden Spalt definieren;
ein Analyt-spezifisches Reagenz,
beschichtet auf die leitfähige
Schicht an einer Seite des Spaltes;
eine Abstandshalterschicht,
abgeschieden über
der leitfähigen
Schicht;
eine Monofilamentgaze, beschichtet mit einem Tensid,
wobei die Gaze über
das Reagenz, die Bezugselektrode und die Abstandshalterschicht gelegt
ist; und
eine zweite, nicht leitfähige Schicht, gebunden an die Gazeschicht,
aber nicht flächengleich
damit, wodurch eine Probenaufbringungsfläche bereitgestellt wird.
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Erfindung
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung umfasst eine Vorrichtung, die in der Lage ist, die Mengen
von in einem kleinen Volumen einer flüssigen Probe vorhandenen Analyten
elektrochemisch zu messen, eine leitfähige Schicht, die mit einem
Analytspezifischen Reagenz beschichtet ist und auf einem nicht leitenden
Substrat abgeschieden ist, eine auf der leitfähigen Schicht mittels Dickfilmdrucken
abgeschiedene Abstandshalterschicht, ein Monofilamentgazematerial,
beschichtet mit einem Tensid und/oder einem chaotropen Mittel, wobei
die Gaze über
die Abstandshalterschicht gelegt ist und eine zweite, nicht leitfähige Schicht
an die Gazeschicht gebunden ist. Die Vorrichtung hat also einen
mehrschichtigen Aufbau und umfasst zwei Schichten, die durch eine
gedruckte Abstandshalterschicht getrennt sind und einen Hohlraum
oder eine Fläche
bilden, welche an einem Ende für
das Einbringen der Probe offen ist. Dieser Hohlraum oder diese Fläche ist
mit einem Gazematerial gefüllt,
welches sich unter dem zweiten Substrat erstreckt und an einem Rand
der Gaze eine Probenaufbringungsfläche bildet.
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Eine
Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung
kann hergestellt und verwendet werden mittels der Schritte:
- (a) Abscheiden einer leitenden Schicht aus
Kohlenstoff und Graphit in einem Polymer-Bindemittel auf einem ersten,
nicht leitenden Substrat.
- (b) Abscheiden einer zweiten leitenden Schicht, bestehend aus
Silber/Silberchlorid, um als eine Bezugs/Gegenelektrode zu dienen,
die benachbart, aber nicht deckungsgleich mit der ersten leitfähigen Schicht
ist;
- (c) Beschichten der Oberfläche
der ersten leitfähigen
Schicht mit einem Reagenz oder Mischungen von Reagenzien, welche
mit einem Analyten oder mehreren Analyten in einem Probenmaterial
spezifisch reagieren;
- (d) Erzeigen einer Abstandshalterschicht durch Dickfilmdrucken über dem
ersten nicht leitenden Substrat und über der ersten leitenden Schicht, wobei
ein Teil von jeweils der ersten und der zweiten leitenden Schicht
freigelegt bleibt;
- (e) Verbringen eines beschichteten Gazematerials über die
Abstandshalterschicht und dessen permanentes Befestigen an der Abstandshalterschicht;
- (f) Verbringen eines zweiten nicht leitenden Substrates über das
Gazematerial und dessen permanentes Befestigen auf eine solche Weise,
dass eine verlängerte Fläche von
Gaze freigelegt bleibt;
- (g) Aufbringen einer Probe auf die verlängerte Gazefläche, um
das Sensorgebiet der Vorrichtung zu füllen oder zu überfluten,
indem die Gaze mit Probe benetzt wird; und
- (h) quantitatives Bestimmen des Analyten in der Probe durch
Umsetzung mit dem Reagenz auf der ersten leitenden Schicht.
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Die
Elektrodenvorrichtung erlaubt das Aufbringen eines kleinen Volumens
der Probe (typischer Weise weniger als 2 μL) auf die Gaze-Verlängerung. Daraufhin
folgt die Überflutung
des Sensorgebietes mit Probe, wodurch diese in engen Kontakt mit
den Messelektroden gebracht wird. Der Hohlraum kann gefüllt werden,
indem entweder ein Tropfen Probenflüssigkeit über die freiliegende Gaze an
dem Rand des Hohlraums verbracht wird oder indem der Rand des Hohlraums
mit der Probe kontaktiert wird.
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Beschreibung
der Erfindung
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Die
begleitenden Zeichnungen werden lediglich zum Zweck der Veranschaulichung
geboten. In den Zeichnungen ist:
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1A eine
schematische Seitenansicht einer Sensorvorrichtung, welche die vorliegende
Erfindung verkörpert;
und
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1B eine
Grundrissansicht eines Teils der in 1A gezeigten
Ausführungsform.
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In
mehr Einzelheiten zeigen die Zeichnungen eine nicht leitende Folie 1 und
eine darauf in zwei Teilen 2a, 2b abgeschiedene
leitende Elektrode. Der Teil 2a trägt eine Bezugs/Gegenelektrode 3 und
der Teil 2b trägt
eine Reagenzschicht 5. Die Teile 2a, 2b tragen
auch eine Abstandshalterschicht 4 (diese und andere nachstehend
beschriebene Komponenten werden nicht in 1B gezeigt,
welche lediglich geboten wird, um die elektrische Konfiguration
zu zeigen). Ein Gazematerial 6 ist über die Elektrode 3,
die Abstandshalterschicht 4 und die Reagenzschicht 5 gelegt. Über dem
Gazematerial 6 wird ein Band 7 bereitgestellt.
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Zwischen
den betreffenden Teilen der leitenden Schicht und auf diese Weise
zwischen dem Reagenz und der Bezugselektrode wird eine Sensorfläche 8 der
Vorrichtung definiert. Das Gazematerial ist nicht flächengleich
mit dem Band 7, wodurch eine Probenaufbringungsfläche 9 definiert
wird. Bei der Verwendung wird auf die Fläche 9 aufgebrachte
Probe durch die Gaze 6 getragen, so dass sie die Flächen 3, 5 und 8 überflutet.
Das Vorhandensein eines Analyten in der Probe kann jetzt elektrochemisch
bestimmt werden.
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Beschreibung
der Erfindung
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Das
Gazematerial ist zwischen der Abstandshalterschicht (auf dem ersten
Substrat) und dem zweiten Substrat eingeschaltet, und dient dazu, die
Oberflächenspannung
und/oder die Viskosität
der Probe kraft des auf seine Oberfläche beschichteten Benetzungsmittels
zu verringern. Aufbringung der Probe auf den verlängerten
Abschnitt der Gaze hat Auflösung
des Beschichtungsmaterials der Gaze in die Probe hinein zur Folge,
wodurch die Oberflächenspannung
der Probe verringert wird und der Probe gestattet wird, in den Hohlraum
der Vorrichtung zu fließen.
In der Abwesenheit eines auf die Gaze beschichteten Benetzungsmittels
tritt Probe nicht in den Hohlraum der Vorrichtung ein. Alternativ
kann bei komplizierten Proben, wie Blut, bei denen die Messung eines
spezifischen Analyten durch die Anwesenheit ganzer Zellen nachteilig
beeinflusst wird, indem zum Beispiel eine Elektrodenoberfläche vergiftet
wird, die Gaze mit einem Mittel beschichtet werden, welches die
Zellen bei Kontakt auflöst;
dies hat den zusätzlichen
Vorteil, gleichzeitig die Viskosität der Probe zu erniedrigen,
während
die Störung
durch ganze Zellen beseitigt wird.
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Das
System kann als eine einzige Elektrode, eine Mikroelektrode oder
als eine Reihe von Mikroelektroden abgeschieden werden. Die Elektrode
kann in Verbindung mit Bezugs/Gegenelektroden, die auf dem selben
Substrat abgeschieden sind, verwendet werden.
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Das
nicht leitende Substratmaterial kann eine Folie aus zum Beispiel
Polyester, Polycarbonat, Polyvinylchlorid, Polyethylen von hoher
Dichte oder Polyethylen von niedriger Dichte sein. In einer bevorzugten
Ausführungsform
wird ein Polyesterfolienmaterial vor der Aufbringung der leitenden
Schichten wärmestabilisiert,
um dem Polyestermaterial vor der Verarbeitung Dimensionsstabilität zu verleihen.
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Die
leitende Schicht enthält
vorzugsweise Graphit, Kohlenstoff und ein Polymerbindemittel. Zum
Beispiel hat die Graphitkomponente eine mittlere Teilchengröße von bis
zu 20 μm,
zum Beispiel 1–20 μm, eine typische
spezifische Oberfläche
von bis zu 50 m2/g, zum Beispiel 1–50 m2/g. Sie ist eigenleitfähig; sie kann entweder aus
natürlichen
Quellen abgeleitet sein oder synthetisch hergestellt sein. Die Kohlenstoffkomponente
hat vorzugsweise eine mittlere Teilchengröße von weniger als 1 μm, zum Beispiel
5–70 nm,
und eine typische spezifische Oberfläche von weniger als 150 m2/g. Ebenso wie die Graphitkomponente ist
sie eigenleitfähig.
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Das
Polymerbindemittel kann entweder wärmegehärtet oder thermoplastisch sein.
Es kann von irgendeiner aus unterschiedlichen Polymerfamilien abgeleitet
sein, einschließlich
Vinylchlorid, Vinylacetat, Vinylalkohol (und Copolymeren von Vinylchlorid, -acetat
und -alkohol), Kohlenwasserstoffen, Ethyl- und Methylcellulosen,
Epoxyharzen, Polyestern, Alkyden und Polymeren, die reaktive funktionelle
Gruppen wie Carboxyl-, Hydroxyl-, Amin-, Thiol-, Ester-, Epoxid-
und Amidgruppen enthalten, welche es dem Polymer gestatten, vernetzt
zu werden.
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Das
leitfähige
Elektrodenmaterial kann mittels eines herkömmlichen Druckverfahrens auf
dem nicht leitenden Substrat abgeschieden werden, zum Beispiel Dickfilmdrucken
(auch als Siebdrucken bekannt), Lithographie, Buchdruck, Dampfabscheidung,
Sprühbeschichten,
Tintenstrahldruck, Laserstrahldruck, Walzenbeschichtung oder Vakuumabscheidung.
Nach der Abscheidung des leitfähigen Elektrodenmaterials
kann das Polymerbindemittel durch eine Anzahl von herkömmlichen
Verfahren stabilisiert oder gehärtet
werden, einschließlich
Umlufttrocknung, Umlufttrocknung bei erhöhten Temperaturen, Infrarotbestrahlung,
Ultraviolettbestrahlung, Ionenstrahlbestrahlung oder Gammabestrahlung.
All diese Verfahren haben in unterschiedlichem Ausmaß die Vernetzung
einzelner Moleküle
des Polymerbindemittels zur Folge. Die Verwendung von Ultraviolettstrahlung
macht den Einschluss eines photosensibilisierenden Mittels in dem
leitfähigen
Elektrodenmaterial erforderlich, um die Reaktion der Polymervernetzung
zu starten.
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Das über der
ersten leitfähigen
Schicht befindliche Reagenz ist dadurch gekennzeichnet, dass es
alle Komponenten in einem festen Zustand enthält, die zum Messen der Konzentration
des Analyten in einer Probe notwendig sind. Solche Komponenten beinhalten
Enzyme, Enzym-Cofaktoren, Coenzyme, Cosubstrate, Antikörper oder
andere Analyt-bindende Partner, DNA oder RNA, Redoxpartner, Puffer,
Ionophore und Salze.
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Das
Reagenz kann auch Einbettungsmassen (Matrices), Bindemittel und
Stabilisatoren für
die anderen Komponenten tragen. Zum Beispiel beinhalten geeignete
Einbettungsmassen Teilchen von Graphit, Kohlenstoff, Siliciumdioxid,
Glas, Latex oder Polyvinylchlorid. Geeignete Bindemittel beinhalten
Polyvinylalkohol, Polyvinylacetat, Polyvinylpyrrolidin, Proteine,
Cellulose und Celluloseacetat. Geeignete Stabilisatoren beinhalten
Alkohole, Ester, Proteine, Proteinhydrolysate und sowohl einfache
wie auch komplexe Kohlenhydrate.
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Das
Reagenz kann eine Anzahl von einzeln aufgetragenen Schichten umfassen,
die jeweils spezifische Komponenten enthalten. Seine Zusammensetzung
ist derart, dass es mindestens teilweise Auflösung erfährt, wenn es mit der flüssigen Probe
kontaktiert wird.
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Das
Reagenz kann mit einem herkömmlichen
Abscheidungsverfahren auf der ersten leitfähigen Schicht abgeschieden
werden, zum Beispiel Dickfilmdrucken (auch als Siebdrucken bekannt),
Lithographie, Buchdruck, Dampfabscheidung, Sprühbeschichten, Tintenstrahldruck,
Laserstrahldruck, Walzenbeschichtung oder Vakuumabscheidung. Es können Kombinationen
von diesen Abscheidungsverfahren verwendet werden, um eine Mehrschicht aufzubauen.
Nach der Abscheidung von dem Reagenz (oder nach Abscheidung jeder
einzelnen Schicht) kann die Schicht mittels einer Anzahl herkömmlicher
Verfahren, einschließlich
der vorstehend beschriebenen, stabilisiert oder gehärtet werden,
um Vernetzung von einzelnen Molekülen des Polymer-Bindemittels
zu erreichen.
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Die
Abstandshalterschicht kann auf dem ersten nicht leitenden Substrat
durch herkömmliches Dickfilmdrucken
abgeschieden werden und kann mittels einer Anzahl herkömmlicher
Verfahren, einschließlich
der vorstehend beschriebenen, stabilisiert oder gehärtet werden,
um einzelne Moleküle
des Polymer-Bindemittels zu vernetzen. Die Dicke der Abstandshalterschicht
kann durch eine Anzahl von Parametern gesteuert werden, einschließlich der
Bedingungen beim Drucken (Druck, Geschwindigkeit, Siebspannung und
Emulsionsdicke) und Eigenschaften der Druckfarbe wie Feststoffgehalt
und Viskosität.
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Die
Gazeschicht ist vorzugsweise ein synthetisches, monofilamentäres gewobenes
Material. Es kann aus Polyester oder Nylon hergestellt werden. Die
Gaze ist mit einem Tensidmaterial, einem Detergens oder einem benetzenden
oder auflösenden
Mittel beschichtet. Beispiele beinhalten Fluortenside, nicht-ionische
Tenside, ionische Tenside, zwitterionische Tenside, Saponin und
Natriumcholat.
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Elektroden
der vorliegenden Erfindung haben mehrere wünschenswerte Merkmale. Zum
Beispiel benötigen
die Vorrichtungen ein sehr kleines Volumen, typischer Weise weniger
als 2 μl,
von einer Probe wie ganzes Blut, Plasma, Serum, interstitielle Flüssigkeit,
Schweiß oder
Speichel. Wenn die Probe den Probenhohlraum füllt, wird ein sehr dünner Film aus
der Probe über
die Oberfläche
von dem abgeschiedenen Reagenz gespreitet, was den Kontakt mit dem
Reagenz maximiert und es ermöglicht,
dass Reagenz schnell in der Probe aufgelöst wird. Dies ermöglicht das
schnelle Erreichen des stationären
Zustandes.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Vorrichtung befindet sich der Hohlraum an dem Ende des Randes
der Vorrichtung. Diese Vorrichtung kann leicht mit der Probe gefüllt werden,
indem der Rand des Teststreifens mit der Probe kontaktiert wird.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann sich der Hohlraum
0–2 mm
von dem Rand der Vorrichtung entfernt befinden, sodass auf diese
Weise eine Fläche
des Teststreifens freigelegt ist, welche entlang einer Oberfläche gestrichen
werden kann (wie einer Fläche
der Haut, in die ein Loch gestochen ist), um die Probe aufzusammeln.
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Elektroden
der Erfindung können
für die
Analyse von Analyten/Spezies verwendet werden, welche durch die
Entfernung oder den Zusatz von Elektronen an einer Elektrode direkt
oxidiert oder reduziert werden können;
von Analyten/Spezies, welche durch ein Enzym oder eine Reihe von
Enzymen leicht in ein Produkt umgewandelt werden können, welches durch
die Entfernung oder den Zusatz von Elektronen an einer Elektrode
direkt oxidiert oder reduziert werden kann; von Analyten/Spezies,
welche durch ein Enzym mit einher gehender Oxidation oder Reduktion
eines Enzym-Cofaktors in ein Produkt umgewandelt werden können, wobei
der Cofaktor sodann durch die Entfernung oder den Zusatz von Elektronen direkt
oxidiert oder reduziert werden kann; und von Analyten/Spezies, welche
durch ein Enzym, welches in engem Kontakt mit der Elektrodenoberfläche ist,
in ein Produkt umgewandelt werden können, so dass das Enzym in
der Lage ist, direkt von der Elektrodenoberfläche Elektronen aufzunehmen
oder an sie abzugeben. Die neuartige Vorrichtung ist besonders geeignet
zur Verwendung als ein Glucosesensor. In diesem Fall ist das Reagenz
vorzugsweise Glucosedehydrogenase; diese kann einen Glucose-Messwert
bereitstellen, der im Wesentlichen unabhängig von dem Hämokriten
der Probe ist.
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Das
folgende Beispiel veranschaulicht die Erfindung.
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Beispiel
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Ein
leitfähiges
Druckfarbenmaterial wird mittels eines Siebdruckverfahrens auf ein
nicht leitendes Polyester-Folienmaterial (Dicke 125 μm) gedruckt. Das
leitfähige
Druckfarbenmaterial besteht aus einer Mischung von Graphitteilchen
(mittlere Teilchengröße 1 μm, mit einer
spezifischen Oberfläche
von 15 m2/g), leitfähigen Kohlenstoffteilchen (mittlere
Teilchengröße 40 nm,
spezifische Oberfläche
100 m2/g), und einem Bindemittel aus Vinylchlorid/acetat-Copolymer
in einem organischen Lösungsmittel.
Nach dem Abscheiden der leitfähigen
Druckfarbe werden die Lösungsmittel
in einem Umluftofen entfernt, während
die Anwendung erhöhter
Temperatur die chemische Vernetzung des Polymer-Bindemittels durch das
bifunktionelle Amin in Gang setzt.
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Eine
durch Siebdrucken hergestellte Silber/Silberchlorid Bezugs/Gegenelektrode
befindet sich angrenzend an die leitfähige Kohlenstoffschicht auf
dem Polyesterträger.
Dann wird eine Abstandshalterschicht derart mittels Siebdruck hergestellt, dass
sie einen Teil der leitfähigen
Kohlenstoffelektrode und die gesamte Bezugs/Gegenelektrode freigelegt
lässt.
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Es
wird eine für
die Messung von Glucose spezifische Mehrschicht-Reagenzmischung hergestellt. Sie umfasst
2,6-Dichlorphenolindophenol, Nilblau, Meldolablau oder irgend einen
anderen geeigneten Überträger für das Enzym
Cofaktor NADH, das auf der freigelegten Kohlenstoff/Graphit-Schicht
aus wässriger
Lösung
durch Pipetieren abgeschieden und getrocknet worden ist, um einen
auf die leitfähige Kohlenstoff/Graphit-Schicht
aufbeschichteten Film aus Überträgersubstanz
zu hinterlassen. Eine zweite Schicht wird mittels Dickfilmdrucken
abgeschieden, bestehend aus einer Mischung von Graphit, NAD+, Puffersalzen, Tensiden, Stabilisatoren
und Rheologie-Modifikatoren. Diese wird dann getrocknet. Eine dritte
Schicht wird durch Pipetieren abgeschieden, bestehend aus einer
wässrigen
Lösung
von Glucosedehydrogenase (NAD-abhängig), Puffersalzen und Stabilisatoren.
Diese wird dann ebenfalls getrocknet.
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Ein
Tensid-beschichtetes Monofilament-Gazematerial befindet sich über der
Abstandshalterschicht und ist durch Dickfilmabscheidung einer zweiten
Abstandshalterschicht befestigt. Eine zweite nicht leitende Schicht,
umfassend ein 75 μm
dickes Polyesterbandmaterial, das auf einer Seite mit einem druckempfindlichen
Kleber beschichtet ist, wird derart über der Monofilamentgaze angebracht,
dass es eine verlängerte
Fläche
der Gaze freiliegen lässt.
Die verlängert
Fläche
dient als eine Probenaufbringungszone.
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Wenn
zwischen die Elektrode aus leitfähigem
Kohlenstoff und die Silberchlorid-Bezugselektrode eine geeignete Potentialdifferenz
angelegt wird, kann die Elektrodenvorrichtung zur Messung von Glucose
in einer Probe aus Blut verwendet werden, wobei elektrochemische
Standardverfahren wie Chronoamperometrie verwendet werden. Glucose wird
zu Gluconolacton umgewandelt, bei gleichzeitiger Umwandlung von
NAD+ zu NADH durch die Wirkung der NAD+-abhängigen
Glucosedehydrogenase, und NADH wird durch die Überträgerverbindung wieder zu NAD+ oxidiert. Die Überträgerverbindung wird ihrerseits
an der Elektrodenoberfläche
wieder oxidiert, und der dadurch entstehende Strom ist proportional
zu der Konzentration von Glucose in der Probe.