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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein neues Mitglied der Tumornekrosefaktor-Familie
von Rezeptoren. Genauer werden isolierte Nucleinsäuremoleküle, die
den menschlichen „Death
Domain"-enthaltenden
Rezeptor 4, hier manchmal „DR4" genannt, codieren,
bereitgestellt. DR4-Polypeptide werden ebenfalls bereitgestellt, genauso
wie Vektoren, Wirtszellen und rekombinante Verfahren zur Herstellung
derselben. Die Erfindung betrifft des Weiteren Durchmusterungsverfahren
zur Identifizierung von Agonisten und Antagonisten der DR4-Aktivität.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Viele
biologische Aktivitäten
wie beispielsweise die Antwort auf bestimmte Reize und natürliche biologische
Prozesse, werden durch Faktoren wie Cytokine kontrolliert. Viele
Cytokine wirken über
Rezeptoren indem der Rezeptor aktiviert wird und erzeugen eine intrazelluläre Antwort.
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Zum
Beispiel sind der Tumornekrosefaktor (TNF) alpha und beta Cytokine,
die über
TNF-Rezeptoren wirken, um zahlreiche biologische Prozesse zu regulieren,
dazu gehören
der Schutz vor Infektion und das Einleiten eines Schocks und entzündlicher
Erkrankungen: Die TNF-Moleküle
gehören
zu der „TNF-Ligand"-Superfamilie und
wirken zusammen mit ihren Rezeptoren oder Gegen-Liganden, der „TNF-Rezeptor"-Superfamilie. Bis jetzt sind neun Mitglieder
der TNF-Ligand-Superfamilie identifiziert und zehn Mitglieder der
TNF-Rezeptor-Familie charakterisiert worden.
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Unter
den Liganden sind TNF-α,
Lymphotoxin-α (LT-α, auch bekannt
als TNF-β),
LT-β (im heterotrimeren
LT-α2-β Komplex
gefunden), FasL, CD40L, CD27L, CD30L, 4-1BBL, OX40L und der Nervenwachstumsfaktor
(NGF) eingeschlossen. Die Superfamilie der TNF-Rezeptoren umfasst
den p55TNF-Rezeptor, p75TNF-Rezeptor,
TNF-Rezeptor-verwandtes Protein, Fas-Antigen oder APO-1, CD40, CD27,
CD30, 4-1BB, OX40, gering-affines p75 und NGF-Rezeptor (Meager,
A., Biologicals, 22:291–295
(1994)).
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Viele
Mitglieder der TNF-Ligand Superfamilie werden von aktivierten T-Zellen
exprimiert, was bedeutet, dass sie nötig sind für die T-Zellinteraktionen mit
anderen Zelltypen, denen die Zellontogenese und -funktionen unterliegen
(Meager, A., vorstehend).
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Entscheidende
Einblicke in die grundlegenden Funktionen mehrerer Mitglieder der
TNF-Rezeptor-Familie sind durch die Identifizierung und Herstellung
von Mutanten, bei denen die Expression dieser Proteine aufgehoben
ist, gewonnen worden. Zum Beispiel verursachen natürlich vorkommende
Mutationen im Fas-Antigen und seinen Liganden lymphoproliferative
Erkrankungen (Watanabe-Fukunaga, R., et al., Nature 356:314 (1992))
und spiegeln vielleicht ein Ausbleiben des programmierten Zelltods
wider. Mutationen des CD40-Liganden verursachen einen X-gekoppelte
Immundefizienzstatus, der gekennzeichnet ist durch hohe Spiegel
an Immunglobulin M und geringe Spiegel an Immunglobulin G im Plasma,
was auf eine fehlerhafte T-Zell-abhängige B-Zellaktivierung
hinweist (Allen, R.C. et al., Science 259:990 (1993)). Gezielte
Mutationen des gering-affinen Nervenwachstumsfaktor-Rezeptors verursachen
eine Erkrankung, die durch eine fehlerhafte sensorische Erneuerung
peripherer Strukturen gekennzeichnet ist (Lee, K.F. et al., Cell
69:737 (1992)).
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TNF
und LT-α sind
in der Lage an zwei TNF-Rezeptoren (die 55- und 75-kd TNF-Rezeptoren) zu binden.
Eine große
Anzahl biologischer Effekte, die von TNF und LT-α ausgelöst werden,
wirken über
ihre Rezeptoren und umfassen: hämorrhagische
Nekrose von transplantierten Tumoren, Cytotoxizität, eine
Rolle beim endotoxischen Schock, bei Entzündung, Immunregulation, Proliferation
und antiviralen Antworten, genauso wie beim Schutz gegen die schädlichen
Wirkungen ionisierender Strahlung. TNF und LT-α sind in die Pathogenese einer
weiten Bandbreite von Krankheiten wie endotoxischer Schock, zerebraler
Malaria, Tumore, Autoimmunkrankheiten, AIDS und Transplantat/Empfänger-Abstoßung eingebunden
(Beutler, B. und Von Huffel, C., Science 264:667–668 (1994)). Mutationen im
p55-Rezeptor verursachen erhöhte
Anfälligkeit
gegenüber
einer mikrobiellen Infektion. Darüber hinaus wurde eine etwa
80 Aminosäuren-Domäne, nahe
des C-Terminus von TNFR1 (p55) und Fas als „Death Domain" veröffentlicht.
Sie ist verantwortlich für
die Transduktion von Signalen für
den programmierten Zelltod (Tartaglia et al., Cell 74:845 (1993)).
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Apoptose,
oder der programmierter Zelltod, ist ein physiologischer Prozess,
der notwendig ist für
die normale Entwicklung und Homöostase
vielzelliger Organismen (Steller, H., Science 267:1445–1449 (1995)). Die
Störung
der Apoptose trägt
zur Pathogenese mehrerer menschlicher Erkrankungen, einschließlich Krebs, neurodegenerativer
Erkrankungen und dem erworbenen Immundefizienzsyndrom, bei (Thompson,
C.B., Science 267:1456–1462
(1995)). Kürzlich
ist viel Aufmerksamkeit auf die Signaltransduktion und biologische Funktion
von zwei Zelloberflächen „Death"-Rezeptoren, Fas/APO-1
und TNFR-1, gerichtet worden (Cleveland, J.L. et al., Cell 81:479–482 (1995);
Fraser, A. et al, Cell 85:781–784
(1996); Nagata, S. et al., Science 267:1449–56 (1995)). Beide sind Mitglieder
der TNF-Rezeptor-Familie, die ebenso TNFR-2, den gering-affinen NGFR;
CD40 und CD30 unter anderen, einschließt (Smith, C.A. et al., Science
248:1019–23
(1990); Tewari, M. et al., in Modular Texts in Molecular and Cell
Biology M. Purton, Heldin, Carl, Hrsg. (Chapman und Hall, London,
1995)). Während
die Mitglieder der Familie über
die Anwesenheit Cystein-reicher Wiederholungen in ihren extrazellulären Domänen definiert
sind, weisen Fas/APO-1 und TNFR-1 eine gemeinsame Region intrazellulärer Homologie
auf, treffend als „Death
Domain" bezeichnet,
die entfernt mit dem Drosophila Suizid-Gen reaper verwandt ist (Golstein,
P. et al., Cell 81:185–6
(1995); White, K. et al., Science 264:677–83 (1994)). Diese gemeinsame „Death
Domain" legt nahe,
dass beide Rezeptoren mit einem Set von verwandten Signaltransduktionsmolekülen interagieren,
die bis vor kurzem nichtidentifiziert waren. Die Aktivierung von
Fas/APO-1 rekrutiert das „Death
Domain"-enthaltende
Adaptermolekül
FADD/MORT1 (Chinnaiyan, A.M. et al., Cell 81:505–12 (1995); Boldin, M.P. et
al., J. Biol. Chem. 270:7795–8
(1995); Kischkel, F.C. et al., EMBO 14:5579–5588 (1995)), welches wiederum
an FLICE/MACH1, ein Mitglied der ICE/CED-3 Familie pro-apoptotischer
Proteasen, bindet und vermutlich aktiviert (Muzio, M. et al., Cell
85:817–827
(1996); Boldin, M.P. et al., Cell 85:803–815 (1996)).
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Während es
die zentrale Rolle von Fas/APO-1 ist, den Zelltod auszulösen, kann
TNFR-1 eine ganze Reihe verschiedener biologischer Aktivitäten signalisieren,
viele davon beruhen auf seiner Fähigkeit
NF-κB zu aktivieren
(Tartaglia, L.A. et al., Immunol Today 13:151–3 (1992)). Dementsprechend
rekrutiert TNFR-1 das multivalente Adaptermolekül TRADD, welches wie FADD auch
eine „Death
Domain" enthält (Hsu,
H. et al., Cell 81:495–504
(1995); Hsu, H. et al., Cell 84:299–308 (1996)). Durch die große Anzahl
von Signalmolekülen
mit denen es Bindungen eingeht, einschließlich FADD, TRAF2 und RIP,
kann TRADD sowohl Apoptose als auch NF-κB-Aktivierung signalisieren
(Hsu, H. et al., Cell 84:299–308
(1996); Hsu, H. et al., Immunity 4:387–396 (1996)).
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Kürzlich wurde
ein neuer Apoptose-induzierender Ligand entdeckt. Wiley, S.R. et
al., bezeichnen das neue Molekül
als TNF-verwandten Apoptose-induzierenden Liganden oder „TRAIL" (Immunity 3:673–682 (1995)).
Pitti, R.M. et al. bezeichnen das neue Molekül als Apo-2 Ligand oder „Apo-2L". Dieses Molekül wurde auch
in der co-anhängigen einstweiligen
US Patentanmeldung Serien-Nr. 60/013405 beschrieben.
Der Einfachheit halber wird es hier als TRAIL bezeichnet.
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Anders
als der Fas-Ligand, dessen Transkripte weitgehend auf stimulierte
T-Zellen beschränkt
zu sein scheinen, werden von TRAIL signifikante Spiegel in vielen
Geweben gefunden und es wird von einigen Zelllinien konstitutiv
transkribiert. Es wurde gezeigt, dass TRAIL unabhängig vom
Fas-Liganden wirkt (Wiley, S.R., et al. (1995), vorstehend). Studien
von Marsters, S.A. et al. haben darauf hingewiesen, dass TRAIL die
Apoptose rasch aktiviert, innerhalb eines Zeitrahmens der ähnlich ist
zur „Death"-Signalgebung durch
FAS/Apo-1L, allerdings viel schneller als die TNF-induzierte Apoptose
(Current Biology, 6:750–752
(1996)). Alle bisherigen Arbeiten legen nahe, dass der Rezeptor
für TRAIL
keiner der vielen bekannten TNF-Rezeptoren
ist.
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Die
Wirkungen der Liganden und Rezeptoren der TNF-Familie sind unterschiedlich
und beeinflussen eine Vielzahl von Funktionen, sowohl normal als
auch abnormal, in biologischen Prozessen des Säugersystems. Es besteht eine
klare Notwendigkeit dafür
solche Rezeptoren und Liganden, welche die biologische Aktivität beeinflussen,
zu identifizieren und zu charakterisieren, sowohl im normalen als
auch im Krankheitszustand. Insbesondere besteht die Notwendigkeit
den Rezeptor für
den neu entdeckten TRAIL-Liganden zu isolieren und zu charakterisieren.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung liefert isolierte Nucleinsäuremoleküle und umfasst Nucleinsäuresequenzen, welche
die Aminosäuresequenz
codieren, die in 1 (SEQ ID NR. 2)
gezeigt ist, oder die Aminosäuresequenz,
die den cDNA-Clon codiert, der unter der ATCC-Hinterlegungsnr. 97853
am 21. Januar 1997 hinterlegt wurde.
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Die
vorliegende Erfindung liefert Vektoren und Wirtszellen für die rekombinante
Expression von hier beschriebenen Nucleinsäuremolekülen, genauso wie Verfahren
zur Herstellung solcher Vektoren und Wirtszellen und für deren
Verwendung zur Herstellung von DR4-Polypeptiden oder -Peptiden durch
Rekombinationstechniken. Des Weiteren liefert die Erfindung ein
isoliertes DR4-Polypetptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch ein hier
beschriebenes Polynucleotid codiert wird. Die vorliegende Erfindung
liefert auch diagnostische Tests wie beispielsweise quantitative
und diagnostische Tests, um DR4-Proteinspiegel nachzuweisen. Daher
kann zum Beispiel ein erfindungsgemäßer diagnostischer Test zum
Nachweis der Überexpression
von DR4 oder einer löslichen
Form davon, im Vergleich mit normalen Kontrollgewebeproben verwendet
werden, um das Vorkommen eines Tumors nachzuweisen.
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Liganden
der Tumornekrosefaktor (TNF)-Familie sind bekannt dafür unter
den am meisten pleiotropen Cytokinen zu sein, die eine große Anzahl
von zellulären
Antworten induzieren. Dazu gehören
Cytotoxizität,
antivirale Aktivität,
immunregulatorische Aktivitäten
und transkriptionelle Regulation mehrerer Gene. Die zelluläre Antwort
auf Liganden der TNF-Familie schließt nicht nur normale physiologische
Antworten, sondern auch Krankheiten, die mit erhöhter Apoptose oder der Hemmung
der Apoptose verbunden sind, ein. Der Apoptose-programmierte Zelltod
ist ein physiologischer Mechanismus, der am Verlust der peripheren
T-Lymphocyten des
Immunsystems beteiligt ist und seine Fehlregulation kann zu einer
Reihe von verschiedenen pathogenen Prozessen führen. Krankheiten, die mit
einem erhöhten
Zellüberleben
verbunden sind oder mit der Hemmung der Apoptose, umfassen Krebs,
Autoimmunerkrankungen virale Infektionen, Entzündung, Transplantat v. Empfänger Erkrankung,
akute Transplantatabstoßung
und chronische Transplantatabstoßung. Krankheiten, die mit
einer erhöhten
Apoptose verbunden sind, umfassen AIDS, neurodegenerative Störungen,
myelodisplastische Syndrome, ischämische Schädigung, Gift-induzierte Lebererkrankung,
septischer Schock, Kachexie und Anorexie.
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Daher
liefert die Erfindung des Weiteren ein Verfahren zur Verstärkung der
Apoptose, welche durch einen Liganden der TNF-Familie induziert
wird, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge
eines Agonisten, der in der Lage ist die DR4-vermittelte Signalgebung
zu erhöhen,
an eine Zelle, die das DR4-Polypetptid
exprimiert, umfasst. Vorzugsweise wird die DR4-vermittelte Signalgebung
erhöht,
um eine Krankheit zu behandeln, bei der eine verminderte Apoptose
vorliegt. In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende
Erfindung an ein Verfahren zur Hemmung der durch einen Liganden
der TNF-Familie induzierten Apoptose und umfasst die Verabreichung
einer wirksame Menge eines Antagonisten, der in der Lage ist die DR4-vermittelte
Signalgebung zu vermindern, an eine Zelle, die das DR4-Polypetptid
exprimiert. Vorzugsweise wird die DR4-vermittelte Signalgebung vermindert,
um eine Krankheit zu behandeln, bei der eine erhöhte Apoptose vorliegt. Ob irgendein
zur Auswahl stehender „Agonist" oder „Antagonist" der vorliegenden
Erfindung die Apoptose verstärken
oder hemmen kann, kann unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten TNF-Familie
Ligand/Rezeptor Zellantworttests bestimmt werden, einschließlich solcher,
die nachstehend genauer beschrieben werden. Daher wird in einem
weitern Aspekt ein Durchmusterungsverfahren bereitgestellt, um zu
bestimmen ob ein Kandidat-„Agonist” oder -„Antagonist” in der
Lage ist die zelluläre
Antwort gegenüber einem
Liganden der TNF-Familie zu verstärken oder zu hemmen. Das Verfahren
umfasst: das in Kontaktbringen von Zellen, die das DR4-Polypeptid
exprimieren mit einer zur Wahl stehenden Verbindung und einem TNF-Familie-Liganden,
das Testen einer Zellantwort und Vergleich der Zellantwort mit einer
Standardzellantwort. Der Standard wird getestet, wenn der Kontakt
mit dem Liganden in Abwesenheit der zur Wahl stehenden Verbindung
durchgeführt
wird, wobei eine erhöhte
zelluläre
Antwort über
den Standard darauf hinweist, dass die zur Wahl stehende Verbindung
ein Agonist des Ligand/Rezeptor-Signalübertragungswegs ist und eine
verminderte zelluläre
Antwort im Vergleich zum Standard darauf hinweist, dass die zur
Wahl stehende Verbindung ein Antagonist des Ligand/Rezeptor-Signalübertragungswegs
ist. Durch die Erfindung kann eine Zelle, die das DR4-Polypepeptid
exprimiert, entweder mit einem endogen oder exogen verabreichten
TNF-Familie-Liganden in Kontakt gebracht werden.
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KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
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1 zeigt die Nucleotid- und die abgeleitete
Aminosäuresequenz
von DR4. Es wird vorhergesagt, dass die Aminosäuren 1-23 das Signalpeptid
bilden, die Aminosäuren
24-238 ergeben die extrazelluläre
Domäne,
die Aminosäuren
239-264 stellen die Transmembrandomäne dar und die Aminosäuren 265-468
bilden die intrazelluläre
Domäne,
von der die Aminosäuren
379-422 die „Death-Domain" ausmachen.
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2 zeigt die Regionen mit einer Ähnlichkeit
zwischen den Aminosäuresequenzen
von DR4, dem menschlichen Tumornekrosefaktor-Rezeptor I (SEQ ID
NO:3), dem menschlichen Fas-Protein (SEQ ID NO:4) und dem „Death-Domain"-enthaltenden Rezeptor
3 (DR3, SEQ ID NO:5).
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3 zeigt
eine Analyse der DR4-Aminosäuresequenz.
Alpha-, Beta-, Schleifen- und
Knäuelregionen,
Hydrophilie und Hydrophobie, amphipatische Regionen, flexible Regionen,
Antigenindex und Oberflächenwahrscheinlichkeit
werden gezeigt. Bei der „Antigenindex-Jameson-Wolf"-Kurve korrespondieren
die Aminosäurereste
35-92, 114-160, 169-240, 267-298, 330-364, 391-404 und 418-465 aus 1 mit der gezeigten starken Antigenregionen
des DR4-Proteins.
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4 zeigt
die Nucleotidsequenzen von verwandten Nucleinsäurefragmenten HTOIY07R (SEQ
ID NO:6) und HTXEY80R (SEQ ID NO:7).
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5A und 5B zeigen
die Fähigkeit
von DR4 die Apoptose in den Zelllinien MCF7 und 293 hervorzurufen. 5C zeigt
die Fähigkeit
der „Death"-Proteaseinhibitoren
z-VAD-fmk und CrmA die apoptotische Aktivität von DR4 zu hemmen.
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6A zeigt
die Fähigkeit
eines löslichen
extrazellulären
DR4-Fc-Fusionsproteins die Apoptose-induzierende Aktivität von TRAIL
zu blockieren. 6B zeigt die Unfähigkeit
eines löslichen
extrazellulären DR4-Fc-Fusionsproteins
die Apoptose-induzierende
Aktivität
von TNF-apha zu blockieren.
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GENAUE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN
AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die
vorliegende Erfindung liefert isolierte Nucleinsäuremoleküle und umfasst: eine Nucleinsäuresequenz,
die das DR4-Polypeptid codiert, dessen Aminosäuresequenz in 1 gezeigt
wird (SEQ ID NO.2) oder ein Fragment des Polypeptids. Das erfindungsgemäße DR4-Polypeptid
teilt Sequenzhomologien mit dem menschlichen TNFR-I, DR3 und Fas
Ligand (2). Die in 1 gezeigte
Nucleotidsequenz (SEQ ID NO:1) wurde durch die Sequenzierung von
cDNA-Clonen wie beispielsweise HCUDS60, der am 21 Januar 1997 am American
Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland
20852, unter der Zugangsnummer 97853, hinterlegt wurde, erhalten.
Der hinterlegte Clon ist im pBK-Plasmid
(Stratagene, La Jolla, CA) enthalten.
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Nucleinsäuremoleküle
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Soweit
nicht anders vermerkt, wurden alle Nucleinsäuresequenzen, die hier durch
die Sequenzierung eines DNA-Moleküls bestimmt wurden, unter der
Verwendung eines automatisieren DNA-Sequenzierers (wie beispielsweise
das Model 373 von Applied Biosystems, Inc.) bestimmt, und alle Aminosäuresequenzen
der Polypeptide, die durch die hier bestimmten DNA-Moleküle codiert
werden, wurden durch die Translation einer DNA-Sequenz, die wie
vorstehend bestimmt wurde, vorhergesagt. Daher kann jede hier bestimmte
Nucleinsäuresequenz,
wie es für
jede DNA-Sequenz,
die durch diesen automatisierten Ansatz bestimmt wurde, auf dem
Fachgebiet bekannt ist, einige Fehler enthalten. Automatisiert bestimmte
Nucleotidsequenzen sind normalerweise mindestens etwa 90% identisch,
noch üblicher
mindestens etwa 95% bis mindestens etwa 99,9% identisch, zur wirklichen
Nucleotidsequenz des sequenzierten DNA-Moleküls. Die wirkliche Sequenz kann durch
andere Ansätze
noch genauer bestimmt werden, einschließlich der manuellen DNA-Sequenzierungsverfahren,
die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Wie ebenfalls auf dem Fachgebiet
bekannt, wird eine einzelne Insertion oder Deletion in einer ermittelten
Nucleotidsequenz im Vergleich mit der wirklichen Sequenz eine Leserasterverschiebung
in der Translation der Nucleotidsequenz verursachen, so dass die
vorhergesagte Aminosäuresequenz,
die durch eine ermittelte Nucleotidsequenz codiert wird, vollkommen
verschieden sein wird von der Aminosäuresequenz, die tatsächlich von
dem sequenzierten DNA-Molekül
codiert wird, beginnend an dem Punkt einer solchen Insertion oder
Deletion. Mit „isoliertes" Polypeptid oder
Protein ist ein Polypeptid oder Protein gemeint, welches von seinem
nativen Umfeld entfernt wurde. Zum Beispiel rekombinant hergestellte Polypeptide
und Proteine, die in Wirtszellen exprimiert werden, werden für Erfindungszwecke
als isoliert betrachtet wie auch native oder rekombinante Polypeptide,
die im Wesentlichen durch jedes geeignete Verfahren aufgereinigt
wurden, wie zum Beispiel das Einzelschritt-Aufreinigungsverfahren,
beschrieben in Smith und Johnson, Gene 67:31–40 (1988).
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Unter
Verwendung der hier bereitgestellten Information wie die Nucleinsäuresequenz
dargelegt in 1, kann ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül, das ein
DR4-Plypeptid codiert,
mittels Standardklonierungs- und Durchmusterungsverfahren erhalten
werden. Dazu gehören
solche zur Klonierung von cDNAs, wobei mRNA als Ausgangsmaterial
verwendet wird. Zur Erläuterung
der Erfindung, ist das Gen der vorliegenden Erfindung auch in cDNA-Banken
der folgenden Gewebe identifiziert worden: amniotische Zellen, Herz,
Leberkrebs, Niere, Leukocyten, aktivierte T-Zelle, K562 zuzüglich PMA,
W138 Zellen, Th2-Zellen, menschliche Mandeln und CD34-abgereicherte Leukocyten-
und Thrombocytenschicht (Nabelschnurblut).
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Das
DR4-Gen enthält
einen offenen Leserahmen, der ein reifes Protein mit etwa 445 Aminosäureresten
codiert, dessen Start-Codon an der Position 19–21 der in 1 gezeigten
Nucleotidsequenz (SEQ ID NO:1) liegt, mit einer Leadersequenz von
etwa 23 Aminosäureresten
(d.h. eine Gesamtproteinlänge
von 468 Aminosäuren)
und einem abgeleiteten Molekulargewicht von etwa 50 kDa. Von den
bekannten Mitgliedern der TNF-Rezeptor-Familie teilt das erfindungsgemäße DR4-Polypeptid
den größten Homologiegrad
mit den in 2 gezeigten menschlichen
TNFRI- und DR3-Polypeptiden, einschließlich signifikanter Sequenzhomologie über die
vielfachen Cystein-reichen Domänen.
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Zusätzlich zu
der Sequenzhomologie, die zwischen DR4 und anderen „Death-Domain"-enthaltenden Rezeptoren
auftreten, wurde gezeigt, dass DR4 an TRAIL bindet und dass es Apoptose
induziert, wenn es kurzzeitig exprimiert wird. MCF7 menschliche
Brustkrebszellen und 293-Zellen wurden vorübergehend wie in Beispiel 5
beschrieben mit einem DR4-exprimierendem Konstrukt transfiziert.
Wie in den 5A und 5B beschrieben
machte ein beträchtlicher
Anteil der transfizierten Zellen die für die Apoptose charakteristischen morphologischen
Veränderungen
durch. Wie zu erwarten hebt die Deletion der „Death-Domain" die Fähigkeit von
DR4 den „Death"-Pfad einzuschlagen
auf. Wie in 5C zu sehen ist, wurde die DR4-induzierte Apoptose effizient
durch Inhibitoren der „Death"-Proteasen blockiert,
dazu gehören
z-VAD-fmk, ein irreversibler Caspase-Inhibitor mit breitem Spektrum,
und CrmA, ein Kuhpockenvirus codiertes Serpin, das vorzugsweise
apikale Caspasen wie FLICS/MACH-1 (Caspase-8) hemmt. Da TNFR-1-,
CD-95- und DR3-induzierte Apoptose auch durch dieselben Inhibitoren
abgeschwächt
wird, ist es wahrscheinlich, dass die nachgeschalteten „Death"-Effektormoleküle ähnlich in
ihren Eigenschaften sind.
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Um
zu bestimmen, ob DR4 in der Lage war TRAIL zu binden, wurde die
extrazelluläre
Ligandenbindungsdomäne
von DR4 als Fusionsprotein mit der Fc-Region von menschlichem IgG (DR4-Fc)
exprimiert. TRAIL bindet selektiv an DR4-Fc, aber nicht an die korrespondierenden
extrazellulären
Domänen
von TNFR-1 oder CD-95, ebenfalls als Fc-Fusionen exprimiert, Daten
nicht gezeigt. Außerdem
band DR4-Fc weder TNF-alpha noch den Fas-Liganden unter Bedingungen,
bei denen beide dieser Liganden ihre zugehörigen Rezeptoren binden.
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Die
Fähigkeit
von TRAIL die Apoptose in MCF7-Zellen zu induzieren wurde spezifisch
durch DR4-Fc blockiert, nicht aber durch TNFR1-Fc, CD95-Fc oder
Fc alleine (6A). Des Weiteren wurde wie
erwartet die TNF-alpha-induzierte Apoptose durch TNFR1-Fc, nicht
aber durch DR4-Fc, CD95-Fc oder Fc alleine gehemmt (6B).
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Zusammengefasst
weisen die vorstehend beschriebenen Daten darauf hin, dass DR4 ein „Death-Domain"-enthaltender Rezeptor
mit der Fähigkeit
Apoptose zu induzieren ist und einen Rezeptor für TRAIL, ein bekannter Apoptose-induzierender
Ligand, darstellt.
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Wie
angedeutet liefert die vorliegende Erfindung auch die reife/n Form/en
des erfindungsgemäßen DR4-Proteins.
Gemäß der Signalhypothese
haben Proteine, die von Säugerzellen
sezerniert werden, eine Signal- oder Sekretions-Leadersequenz, die
vom reifen Protein abgespalten wird, sobald der Export der wachsenden
Proteinkette über
das Endoplasmatische Reticulum eingeleitet worden ist. Die meisten
Säugerzellen und
selbst Insektenzellen spalten sezernierte Proteine mit der gleichen
Spezifität.
Jedoch ist in einigen Fällen das
Abspalten nicht völlig
einheitlich, was zu zwei oder mehr reifen Formen des Proteins führt. Ferner
ist lange bekannt gewesen, dass die Spaltungsspezifität eines
sezernierten Proteins letztendlich durch die Primärstruktur
des ganzen Proteins bestimmt wird, das heißt es liegt in der Aminosäuresequenz
des Polypeptids begründet.
Daher liefert die vorliegende Erfindung eine Nucleotidsequenz, die
das reife DR4-Polypeptid codiert mit einer Aminosäuresequenz,
die von den im Wirt enthaltenen cDNA-Clonen codiert wird, identifiziert
als ATCC-Hinterlegungsnummer 97853, und wie in 1 gezeigt
(SEQ ID NO:2). Mit dem reifen DR4-Protein, das eine Aminosäuresequenz
aufweist, die von den im Wirt enthaltenen cDNA-Clonen codiert wird,
und identifiziert wurde als ATCC-Hinterlegungsnummer 97853, ist/sind
die reife/n Form/en des DR4-Proteins gemeint, welche/s durch die
Expression des vollständigen
offenen Leserahmens, der von der menschlichen DNA-Sequenz des Clons,
der in dem Vektor in dem hinterlegten Wirt enthalten ist, codiert
wird, in einer Säugerzelle
(z.B. COS-Zellen, wie nachstehend beschrieben) hergestellt wird.
Wie nachstehend angedeutet, kann sich das reife DR4, das die Aminosäuresequenz,
die durch den cDNA-Clon, der in der ATCC-Hinterlegungsnummer 97853 enthalten
ist, codiert wird, von dem vorhergesagten „reifen" in 1 gezeigte
DR4-Protein (Aminosäuren
von etwa 24 bis etwa 468) unterscheiden oder auch nicht, abhängig von
der Genauigkeit der vorhergesagten Schnittstelle, die auf einer
Computeranalyse beruht. Es stehen Verfahren zur Vorhersage, ob ein
Protein eine sekretorische Leadersequenz besitzt, zur Verfügung und
ebenso für
die Vorhersage der Schnittstelle dieser Leadersequenz. Zum Beispiel
können
die Verfahren von McGeoch (Virus Res. 3:271–286 (1995)) und von Heinje
(Nucleic Acids Res. 14:4683–4690
(1986)) verwendet werden. Die Vorhersagegenauigkeit für die Schnittstellen
von bekannten sekretorischen Säugerproteinen
liegt für
jedes dieser Verfahren im Bereich von 75–80% (von Heinje, vorstehend).
Allerdings erzeugen die beiden Verfahren nicht immer die gleiche/n
vorhergesagte/n Schnittstelle/n für ein gegebenes Protein.
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Im
vorliegenden Fall wurde die vorhergesagte Aminosäuresequenz des vollständigen DR4-Polypeptids
der vorliegenden Erfindung durch ein Computerprogramm („PSORT") analysiert (siehe
Nakai, K. und Kanehisa, M. Genomics 14:897–911 (1992)). Es handelt sich
um ein Expertensystem zur Vorhersage der zellulären Lokalisation eines Proteins,
basierend auf der Aminosäuresequenz.
Als Teil dieser rechnerischen Vorhersage der Lokalisation sind die
Verfahren von McGeoch und von Heinje eingebunden. Die Analyse durch das
PSORT-Programm sagt die Schnittstellen zwischen den Aminosäuren 23
und 24 in 1 (SEQ ID NO:2) vorher.
Danach wurden die vollständigen
Aminosäuresequenzen
durch Sichtprüfung weiter
analysiert, wobei eine einfache Form der (-1,-3)-Regel von von Heinje
(von Heinje, vorstehend) angewendet wurde. So wurde vorhergesagt,
dass die Leadersequenz für
das DR4-Protein aus den Aminosäureresten
1-23 besteht, in 1 unterstrichen (SEQ
ID NO:2), während
das vorhergesagte reife DR4-Protein aus den Resten 24-468 besteht.
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Wie
erwähnt
können
erfindungsgemäße Nucleinsäuremoleküle in Form
von RNA wie beispielsweise mRNA oder in Form von DNA, einschließlich zum
Beispiel cDNA und genomische DNA, die durch Klonieren oder synthetische
Herstellung erhalten wurden, vorliegen. Die DNA kann doppelsträngig oder
einzelsträngig sein.
Einzelstrang-DNA kann der codierende Strang sein, auch bekannt als „Sense"-Strang, oder es kann der nicht-codierende
Strang sein, auch „Antisense"-Strang genannt.
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Mit „isolierten" Nucleinsäuremolekül/en ist
ein Nucleinsäuremolekül gemeint,
DNA oder RNA, das aus seiner natürlichen
Umgebung entfernt wurde. Zum Beispiel werden rekombinante DNA-Moleküle, die
in einem Vektor enthalten sind, für die Zwecke der vorliegenden
Erfindung als isoliert betrachtet. Weitere Beispiele von isolierten
DNA-Molekülen
umfassen rekombinante, in heterologen Wirtszellen erhaltene DNA-Moleküle oder (teilweise
oder größtenteils)
gereinigte DNA-Moleküle
in Lösung.
Isolierte RNA-Moleküle
schließen
in vivo oder in vitro RNA-Transkripte der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle ein.
Isolierte Nucleinsäuremoleküle gemäß der vorliegenden
Erfindung umfassen weiter solche Moleküle, die synthetisch hergestellt
wurden.
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Isolierte,
erfindungsgemäße Nucleinsäuremoleküle umfassen
DR4-DNA-Moleküle,
die einen offenen Leserahmen (ORF) wie in 1 (SEQ
ID NO:1) gezeigt, enthalten, und umfassen des Weiteren DNA-Moleküle mit einer
Sequenz, die sich im Wesentlichen vom ganzen oder Teilen des ORFs,
dessen Start-Codon sich an der Position 19–21 der in 1 gezeigten
Nucleotidsequenz (SEQ ID NO:1) befindet, unterscheiden, wobei aber
wegen der Degeneriertheit des genetischen Codes dennoch das DR4-Polypeptid
oder ein Fragment davon codiert wird. Natürlich ist der genetische Code
auf dem Fachgebiet bestens bekannt. Daher würde es für den Fachmann Routine sein,
solche degenerierten Varianten herzustellen.
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In
einem anderen Aspekt liefert die Erfindung isolierte Nucleinsäuremoleküle, die
das DR4-Polypeptid codieren, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die von
dem cDNA-Clon, der in dem Plasmid, das unter der ATCC-Hinterlegungsnummer
97853 am 21 Januar 1997 hinterlegt wurde, enthalten ist, codiert
wird. Vorzugsweise werden diese Nucleinsäuremoleküle das reife Polypeptid codieren,
das durch den vorstehend beschriebenen hinterlegten cDNA-Clon codiert
wird. Die Erfindung liefert ferner ein isoliertes Nucleinsäuremolekül mit der
in 1 gezeigten Nucleotidsequenz (SEQ
ID NO:1) oder die Nucleotidsequenz der DR4-cDNA, die in dem vorstehend
beschriebenen hinterlegten Clon enthalten ist oder ein Nucleinsäuremolekül mit einer
Sequenz die komplementär
zu einer der vorstehenden Sequenzen ist. Solch isolierte DNA-Moleküle und Fragmente
davon sind nützlich
als DNA-Sonden für
die Genkartierung mittels in situ-Hybridisierung des DR4-Gens im
menschlichem Gewebe durch eine Northern-Blot-Analyse.
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Die
vorliegende Erfindung gilt des Weiteren für Fragmente der hierin beschriebenen
isolieren Nucleinsäuremoleküle. Mit
Fragmenten eines isolierten DNA-Moleküls, das die in 1 gezeigte
Nucleotidsequenz (SEQ ID NO:1) aufweist, sind DNA-Fragmente gemeint,
die eine Länge
von mindestens 20 bp und mehr aufweisen, vorzugsweise mindestens
30 bp, und die wie vorstehend erläutert als DNA-Sonden nützlich sind.
Natürlich
sind auch größere DNA-Fragmente
von 50–1500
bp Länge
als erfindungsgemäße DNA-Sonden
nützlich wie
auch DNA-Fragmente, die zum größten Teil,
wenn nicht der gesamten in 1 gezeigten
Nucleotidsequenzen (SEQ ID NO:1) entsprechen. Mit einem Fragment
von zum Beispiel mindestens 20 bp Länge sind Fragmente gemeint,
die 20 oder mehr Basen von der in 1 gezeigten
Nucleotidsequenz (SEQ ID NO:1) aufweisen.
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Bevorzugte,
erfindungsgemäße Nucleinsäurefragmente
umfassen Nucleinsäuremoleküle, die
folgendes codieren: ein Polypeptid, das die extrazelluläre Domäne von DR4
enthält
(Aminosäurereste
von etwa 24 bis etwa 238 in 1 (SEQ
ID NO:2)), ein Polypeptid, das die DR4-Transmembrandomäne enthält (Aminosäurereste
von etwa 239 bis etwa 264 in 1 (SEQ
ID NO:2)), ein Polypeptid, das die intrazelluläre Domäne von DR4 enthält (Aminosäurereste
von etwa 265 bis etwa 468 in 1 (SEQ
ID NO:2)) und ein Polypeptid, das die „Death-Domain" von DR4 enthält (Aminosäurereste von etwa 379 bis etwa
422 in 1 (SEQ ID NO:2)). Da die Position
dieser Domänen
durch Computergraphiken vorhergesagt worden sind, würde ein Durchschnittsfachmann
bemerken, dass die Aminosäurereste,
welche diese Domänen
ausmachen, leicht variieren können
(z.B. um etwa 1 bis 15 Reste), abhängig von den Kriterien, die
angelegt wurden, um die Domäne zu
definieren.
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Bevorzugte,
erfindungsgemäße Nucleinsäurefragmente
codieren ein Volllängen-DR4-Polypeptid, dem die
Nucleotide, die das amino-terminale Methionin codieren (Nucleotide
19-21 in SEQ ID NO:1), fehlen, da bekannt ist, dass das Methionin
normalerweise abgespalten wird und solche Sequenzen nützlich sein
können
bei der genetischen Veränderung
von DR4-Expressionsvektoren. Polypeptide, die von solchen Polynucleotiden codiert
werden, werden durch die Erfindung ebenso in betracht gezogen.
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Zu
den bevorzugten, erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragmenten
gehören
ferner Nucleinsäuremoleküle, die
Epitop-tragende Anteile des DR4-Proteins codieren. Insbesondere
schließen
solche erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragmente
Nucleinsäuremoleküle, die
folgendes codieren, ein: ein Polypeptid, das die Aminosäurereste
von etwa 35 bis etwa 92 in der 1 (SEQ
ID NO:2) umfasst, ein Polypeptid, das die Aminosäurereste von etwa 114 bis etwa
160 in der 1 (SEQ ID NO:2) umfasst,
ein Polypeptid, das die Aminosäurereste
von etwa 169 bis etwa 240 in der 1 (SEQ
ID NO:2) umfasst, ein Polypeptid, das die Aminosäurereste von etwa 267 bis etwa
298 in der 1 (SEQ ID NO:2) umfasst,
ein Polypeptid, das die Aminosäurereste
von etwa 330 bis etwa 364 in der 1 (SEQ
ID NO:2) umfasst, ein Polypeptid, das die Aminosäurereste von etwa 391 bis etwa
404 in der 1 (SEQ ID NO:2) umfasst
und ein Polypeptid, das die Aminosäurereste von etwa 418 bis etwa
465 in der 1 (SEQ ID NO:2) umfasst.
Die Erfinder haben festgestellt, dass die vorstehenden Polypeptidfragmente
antigene Regionen des DR4-Proteins sind. Verfahren zur Bestimmung
anderer solcher Epitop-tragender Anteile des DR4-Proteins werden
nachstehend genauer beschrieben.
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Außerdem liefert
die Erfindung Nucleinsäuremoleküle mit Nucleinsäuresequenzen,
die verwandt sind mit ausgedehnten Anteilen der SEQ ID NO:1 wie
folgt: HTOIY07R (SEQ ID NO:6) und HTXEY80R (SEQ ID NO:7) beide in 4 gezeigt.
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Des
Weiteren umfasst die Erfindung ein Polynucleotid, das irgendeinen
Teil der SEQ ID NO:1 von den Resten 365 bis 1424 enthält, von
mindestens etwa 30 Nucleotiden, vorzugsweise von mindestes etwa
50 Nucleotiden Länge.
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In
einem andern Aspekt liefert die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das ein
Polynucleotid umfasst, welches unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit
einem Anteil des Polynucleotids in einem erfindungsgemäßen, vorstehend
beschriebenen Nucleinsäuremolekül hybridisiert.
Zum Beispiel der cDNA-Clon, der in der ATCC-Hinterlegungsnummer
97853 enthalten ist. Mit „stringenten
Hybridisierungsbedingungen" ist
gemeint: eine Übernachtinkubation
bei 42°C
in einer Lösung,
die 50% Formamid, 5 × SSC
(150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH
7,6), 5 × Denhardt's Lösung, 10%
Dextransulfat und 20 g/ml denaturierte, gescherte Lachssperma-DNA
enthält,
gefolgt vom Waschen der Filter in 0,1 × SSC bei etwa 65°C.
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Mit
einem Polynucleotid, das mit einen „Teil" eines Polynucleotids hybridisiert,
ist ein Polynucleotid (entweder DNA oder RNA) gemeint, das mit mindestens
etwa 15 Nucleotiden (nt) hybridisiert und stärker bevorzugt etwa 20 nt,
noch stärker
bevorzugt mit mindestens 30 nt und am meisten bevorzugt etwa 30–70 nt des Bezugspolynucleotids.
Diese sind als diagnostische Sonden und Primer wie vorstehend und
nachstehend genauer erläutert
nützlich.
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Mit
einem Teil eines Polynucleotids von zum Beispiel „mindestens
20 nt Länge" ist gemeint, 20
oder mehr benachbarter Nucleotide der Nucleotidsequenz des Bezugspolynucleotids
(z.B. die hinterlegte cDNA oder die Nucleotidsequenz wie in 1 (SEQ ID NO:1) oder 2 (SEQ
ID NO:3) aufgeführt).
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Natürlich würde ein
Polynucleotid, das nur mit einer polyA-Sequenz (wie der 3'-terminale poly(A)-Strang der in 1 aufgeführten DR4-cDNA (SEQ ID NO:1)
oder ein Spanne von komplementären
T (oder U)-Resten) hybridisiert, nicht von den erfindungsgemäßen Polynucleotiden
umfasst sein, um zum Hybridisieren mit einem Anteil einer erfindungsgemäßen Nucleinsäure verwendet
zu werden, da solch ein Polynucleotid mit jedem Nucleinsäuremolekül hybridisieren
würde,
das einen Poly(A)-Strang oder ein Komplement davon besitzt (z.B.
praktisch jeder doppelsträngige
cDNA-Clon).
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Wie
angedeutet, können
erfindungsgemäße Nucleinsäuremoleküle, die
das DR4-Polypeptid
codieren, an sich die codierende Sequenz für das reife Polypeptid einschließen, sind
aber nicht darauf beschränkt;
des Weiteren: die codierende Sequenz für das reife Polypeptid und
zusätzliche
Sequenzen wie beispielsweise solche, die eine Leader- oder Sekretionssequenz
codieren, wie eine Prä-,
Pro- oder Präproproteinsequenz;
die codierende Sequenz des reifen Polypeptids mit oder ohne die
vorstehend erwähnten
zusätzlichen,
codierenden Sequenzen, zusammen mit zusätzlichen, nicht-codierenden
Sequenzen, einschließlich
zum Beispiel, aber nicht darauf beschränkt, Introns und nicht-codierende
5'- und 3'-Sequenzen wie beispielsweise
die transkribierten, nicht-translatierten Sequenzen, die einer Rolle
bei der Transkription, der mRNA-Prozessierung (einschließlich zum
Beispiel der Spleiß- und Polyadenylierungssignale),
der Ribosomenbindung und der mRNA-Stabilität spielen; zusätzlich codierende
Sequenz, die zusätzliche
Aminosäuren
codiert wie beispielsweise solche, die zusätzliche Funktionen liefern.
Daher kann das Polypeptid beispielsweise an eine Marker-Sequenz
wie zum Beispiel an ein Peptid fusioniert werden, das die Aufreinigung
des fusionierten Polypeptides erleichtert. In bestimmten, bevorzugten
Ausführungsformen
dieses Aspekts der Erfindung ist die Markersequenz ein Hexahistidinpeptid
wie unter anderem die in einem pQE-Vektor (Qiagen, Inc.) bereitgestellte
Markierungssequenz von denen viele im Handel erhältlich sind. Wie beispielsweise
in Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821–824 (1989)
beschrieben, gewährleistete
Hexahistidin eine bequeme Aufreinigung des Fusionsproteins. Die
HA-Markierungssequenz entspricht einem Epitop, das von einem Influenza-Hämaglutininprotein
stammt, das zum Beispiel von Wilson et al., Cell 37:767 (1984) beschrieben
worden ist.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Varianten der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle, die
für Fragmente,
Analoge oder Derivate des DR4-Polypeptids
codieren. Die Varianten können
natürlich
vorkommen wie beispielsweise eine Allelvariante. Mit „Allelvariante" ist eine von mehreren
wechselnden Formen eines Gens, das einen gegeben Locus auf einem
Chromosom eines Organismuses besetzt, gemeint (Genes II, Lewin,
B. Hrsg., John Wiley & Sons,
New York (1985)). Nicht-natürlich
vorkommende Varianten können
unter Verwendung auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren hergestellt
werden.
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Diese
Varianten schließen
solche ein, die durch Nucleotidsubstitutionen, Deletionen oder Additionen, die
ein oder mehrere Nucleotide umfassen, hergestellt wurden. Die Varianten
können
in codierende und nicht-codierende Regionen oder beides abgeändert werden. Änderungen
in den codierenden Regionen können
konservative oder nicht-konservative Aminosäuresubstitutionen, Deletionen
oder Additionen erzeugen.
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Weitere
erfindungsgemäße Ausführungsformen
schließen
isolierte Nucleinsäuremoleküle, die
mindestens 90% identisch sind und stärker bevorzugt mindestens 95%,
96%, 97%; 98% oder 99% identisch sind zu (a) einer Nucleotidsequenz,
die das Volllängen-DR4-Polypeptid
codiert, das die vollständige
Aminosäuresequenz
aus 1 (SEQ ID NO:2) aufweist, einschließlich der
vorausgesagten Leadersequenz; (b) einer Nucleotidsequenz, die das
Volllängen-DR4-Polypeptid codiert,
das die vollständige
Aminosäuresequenz
aus 1 (SEQ ID NO:2) aufweist, einschließlich der
vorausgesagten Leadersequenz, aber ohne das amino-terminale Methionin;
(c) eine Nucleotidsequenz, die das reife DR4-Polypeptid (Volllängen-Polypeptid
mit entfernter Leadersequenz) codiert, das die Aminosäuresequenz
von den Positionen um etwa 24 bis etwa 468 aus 1 (SEQ
ID NO:2) aufweist; (d) eine Nucleotidsequenz, die das Volllängen-DR4-Polypeptid
codiert, das die vollständige
Aminosäuresequenz
einschließlich
der vorhergesagten Leadersequenz aufweist, die durch den cDNA-Clon,
der in der ATCC-Hinterlegungsnummer
97853 enthalten ist, codiert wird; (e) eine Nucleotidsequenz, die
das Volllängen-DR4-Polypeptid
codiert, das die vollständige
Aminosäuresequenz
einschließlich
der vorhergesagten Leadersequenz, aber ohne das amino-terminale
Methionin, aufweist, die durch den cDNA-Clon, der in der ATCC-Hinterlegungsnummer
97853 enthalten ist, codiert wird; (f) eine Nucleotidsequenz, die
das reife DR4-Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz aufweist, die durch
den cDNA-Clon, der in der ATCC-Hinterlegungsnummer 97853 enthalten
ist, codiert wird; (g) eine Nucleotidsequenz, welche die extrazelluläre Domäne von DR4
codiert; (h) eine Nucleotidsequenz, welche die Transmembrandomäne von DR4 codiert;
(i) eine Nucleotidsequenz, welche die intrazelluläre Domäne von DR4
codiert; (j) eine Nucleotidsequenz, welche die DR4-„Death-Domain” codiert
oder (k) eine Nucleotidsequenz, die komplementär zu irgendeiner der vorstehenden
Nucleotidsequenzen aus (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i)
oder (j) ist.
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Mit
einem Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz aufweist, die zum
Beispiel 95% „identisch" ist mit einer Bezugsnucleotidsequenz,
die ein DR4-Polypeptid codiert, ist gemeint, dass die Nucleotidsequenz
des Polynucleotids identisch ist zu der Bezugssequenz, mit der Ausnahme
dass die Polynucleotidsequenz bis zu fünf Punktmutationen je 100 Nucleotiden
der Bezugsnucleotidsequenz, die das DR4-Polypeptid codiert, enthalten kann.
In anderen Worten, um ein Polynucleotid zu erhalten, das eine Nucleotidsequenz
aufweist, die mindestens zu 95% identisch ist zu einer Bezugsnucleotidsequenz,
können
bis zu 5% der Nucleotide in der Bezugssequenz deletiert oder durch
eine anderes Nucleotid ersetzt sein, oder eine Nucleotidanzahl von
bis zu 5% der gesamten Nucleotide der Bezugssequenz können in
die Bezugssequenz eingefügt
werden. Diese Mutationen der Bezugssequenz können an den 5'- oder 3'-terminalen Positionen
der Bezugsnucleotidsequenz oder irgendwo zwischen diesen terminalen
Positionen vorkommen, entweder individuell verstreut über die
Nucleotide der Bezugssequenz oder in einer oder mehreren aufeinanderfolgenden
Gruppen innerhalb der Bezugssequenz.
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Ob
ein bestimmtes Nucleinsäuremolekül mindestens
90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch ist mit zum Beispiel
der in 1 gezeigten Nucleotidsequenz
oder dem hinterlegten cDNA-Clon, kann in praktischer Hinsicht unter
Verwendung von bekannten Computerprogrammen, wie beispielsweise
das Bestfit-Programm (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version
8 für Unix,
Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive,
Madison, WI 53711) bestimmt werden. Bestfit verwendet den Algorithmus
für lokale
Homologien von Smith und Waterman, Advances in Applied Mathematics
2:482–489
(1981), um das beste Homologiesegment zwischen zwei Sequenzen zu
finden. Bei der Verwendung von Bestfit oder irgendeinem anderen
Sequenzalignment-Programm zur Bestimmung, ob eine bestimmte Sequenz
zum Beispiel 95% identisch ist mit einer erfindungsgemäßen Bezugssequenz,
werden die Parameter so eingestellt, dass natürlich die prozentuale Identität über die
volle Länge
der Bezugsnucleotidsequenz berechnet wird und Lücken in der Homologie bis zu
5% der Gesamtzahl von Nucleotiden der Bezugssequenz erlaubt sind.
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Die
vorliegende Anmeldung bezieht sich auf Nucleinsäuremoleküle, die mindestens 90%, 95%,
96%, 97%, 98% oder 99% identisch sind mit der in 1 gezeigten
Nucleinsäuresequenz
(SEQ ID NO:1) oder mit der Nucleinsäuresequenz der hinterlegten
cDNAs, unabhängig
davon, ob sie ein Polypeptid codieren, das eine DR4-Aktivität aufweist.
Das liegt daran, dass selbst wenn ein bestimmtes Nucleinsäuremolekül nicht
ein Polypeptid mit DR4-Aktivität
codiert, ein Fachmann dennoch wissen würde, wie das Nucleinsäuremolekül zu verwenden
wäre, zum
Beispiel als Hybridisierungssonde oder als Polymerase-Kettenreaktions
(PCR)-Primer. Die Verwendung
von erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen, die
kein Polypeptid, das DR4-Aktivität
aufweist, codiert, umfassen unter anderem: (1) Isolierung des DR4-Gens
oder Allelvarianten davon in einer cDNA-Genbank; (2) in situ-Hybridisierung
(z.B. „FISH") von gespreiteten
Chromosomen in der Metaphase, um die genaue chomosomale Lokalisation
des DR4-Gens zu liefern wie in Verma et al., Human Chromosomes:
A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988) beschrieben
und (3) Northern-Blot-Analyse zum Nachweis der Expression der DR4-mRNA
in bestimmten Geweben.
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Bevorzugt
jedoch sind Nucleinsäuremoleküle, die
Sequenzen aufweisen, die mindestens 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder
99% identisch sind mit der in 1 gezeigten
Nucleinsäuresequenz
(SEQ ID NO:1) oder mit der Nucleinsäuresequenz der hinterlegten
cDNAs, die in der Tat ein Polypeptid codieren, das DR4-Protein-Aktivität aufweiset.
Mit „ein
Polypeptid, das DR4-Aktivität
aufweist" sind Polypeptide
gemeint, die eine Aktivität
besitzen, die ähnlich,
aber nicht notwendiger Weise identisch ist zu einer Aktivität des erfindungsgemäßen DR4-Proteins
(entweder des Volllängen-Proteins
oder vorzugsweise des reifen Proteins), was in einem besonderen
biologischen Test gemessen wird. Zum Beispiel kann die DR4-Proteinaktivität gemessen
werden unter Verwendung des Zelltod-Tests, der im Wesentlichen durchgeführt wird
wie vorstehend beschrieben (Chinnaiyan, A.M. et al., Cell 81:505–12 (1995);
Boldin, M.P. et al., J. Biol. Chem. 270:7795–8 (1995); Kischkel, F.C. et
al., EMBO 14:5579–5588
(1995); Chinnaiyan, A.M. et al., J. Biol. Chem. 271:4961–4965 (1996))
oder wie es in Beispiel 5 nachstehend dargelegt wird. In MCF7-Zellen
sind Plasmide, die das Volllängen-DR4
oder einen zur Wahl stehenden „Death-Domain"-enthaltenden Rezeptor
codieren, co-transfiziert mit dem pLantern-Reporterkonstrukt, welches
das grün
fluoreszierende Protein codiert. Die Kerne von Zellen, die mit DR4
transfiziert sind, werden wie mittels DAPI-Färbung festgestellt eine apoptotische
Morphologie aufwiesen. Ähnlich
wie TNFR-1 und Fas/APO-1 (Muzio, M. et al., Cell 85:817–827 (1996);
Boldin, M.P. et al., Cell 85:803–815 (1996); Tewari, M. et
al., J. Biol. Chem. 270:3255–60
(1995)) wird die DR4-induzierte
Apoptose durch die Inhibitoren von ICE-ähnlichen Proteasen, CrmA und
z-VAD-fmk, blockiert.
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Natürlich wird
der Durchschnittsfachmann, auf Grund der Degeneration des genetischen
Codes, sofort erkennen, dass eine große Anzahl von Nucleinsäuremolekülen, die
eine Sequenz aufweisen, die mindestens 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder
99% identisch ist mit der Nucleinsäuresequenz der hinterlegten
cDNA oder mit der in 1 gezeigten Nucleinsäuresequenz
(SEQ ID NO:1), ein Polypeptid codieren werden, das „DR4-Proteinaktivität aufweist". Da tatsächlich alle
degenerierten Varianten dieser Nucleotidsequenzen das gleiche Polypeptid
codieren, wird dies dem Fachmann, auch ohne Durchführung des
vorstehend beschriebenen Vergleichtests, klar sein. Der Fachmann
wird ferner erkennen, dass von solchen Nucleinsäuremoleküle, die keine degenerierten
Varianten darstellen, eine gewisse Anzahl auch ein Polypeptid codieren
werden, das DR4-Proteinaktivität
aufweist. Der Grund dafür
ist, dass der Fachmann bescheid weiß, ob Aminosäuresubstitutionen
entweder weniger wahrscheinlich oder nicht wahrscheinlich die Proteinfunktion
signifikant beeinflussen (z.B. Ersetzen einer aliphatischen Aminosäure mit
einer zweiten aliphatischen Aminosäure).
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Zum
Beispiel wird eine Anleitung wie man phänotypisch stille Aminosäuresubstiutionen
erzeugt in Bowie, J.U. et al., „Deciphering the Message in
Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substiutions", Science 247:1306–1310 (1990)
geliefert, worin die Autoren darauf hinweisen, dass Proteine überraschend
tolerant gegenüber
Aminosäuresubstitutionen
sind.
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Polynucleotid-Tests
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Diese
Erfindung betrifft auch die Verwendung von DR4-Polynucleotiden,
um komplementäre
Polynucleotide, zum Beispiel als Diagnostikum, nachzuweisen. Der
Nachweis einer mutierten Form von DR4, die mit einer Funktionsstörung in
Zusammenhang steht, wird ein diagnostisches Hilfsmittel liefern,
das eine Krankheitsdiagnose oder die Empfindlichkeit gegenüber einer
Krankheit liefern oder definieren kann, die auf einer Unterexpression, Überexpression
oder veränderten
Expression von DR4 oder einer löslichen
Form davon zurückzuführen ist,
wie zum Beispiel Tumore oder Autoimmunkrankheiten.
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Personen,
die Mutationen im DR4-Gen tragen, können auf DNA-Ebene durch eine
Vielzahl von Verfahren erfasst werden. Nucleinsäuren für die Diagnose können aus
Patientenzellen wie beispielsweise aus Blut, Urin, Speichel, Gewebebiopsie-
und Autopsiematerial erhalten werden. Die genomische DNA. kann direkt für den Nachweis
verwendet werden oder kann vor der Analyse enzymatisch mittels PCR
amplifiziert werden (Saiki et al., Nature 324:163–166 (1986)).
Ebenso kann RNA oder cDNA in gleicher Weise verwendet werden. Es
können
zum Beispiel PCR-Primer, die komplementär zu der DR4-codierenden Nucleinsäure sind,
verwendet werden, um die DR4-Expression und Mutationen zu identifizieren
und zu analysieren. Zum Beispiel können Deletionen und Insertionen
durch eine Änderung
in der Größe des amplifizierten
Produkts im Vergleich zum normalen Genotyp nachgewiesen werden.
Punktmutationen können
identifiziert werden durch die Hybridisierung amplifizierter DNA
mit radiomarkierter DR4-RNA oder wahlweise radiomarkierter DR4-antisense-DNA-Sequenzen. Völlig übereinstimmende
Sequenzen können
von fehlgepaarten Doppelsträngen
durch RNase A-Verdau oder durch Unterschiede in den Schmelztemperaturen
unterschieden werden.
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Sequenzunterschiede
zwischen einem Bezugsgen und Genen mit Mutationen können durch
direkte DNA-Sequenzierung aufgedeckt werden. Zusätzlich können clonierte DNA-Segmente
als Sonde eingesetzt werden, um spezifische DNA-Segmente nachzuweisen. Die Sensitivität solcher
Verfahren kann durch die Verwendung einer PCR oder anderen Amplifizierungsverfahren
enorm gesteigert werden. Zum Beispiel wird ein Sequenzierungsprimer
mit einem doppelsträngigen
PCR-Produkt oder ein einzelsträngiges
Matrizenmolekül, das
durch eine modifizierte PCR hergestellt wurde, verwendet. Die Sequenzbestimmung
wird mittels herkömmlicher
Verfahren mit radiomarkierten Nucleotiden oder durch automatische
Sequenzierungsverfahren mit Fluoreszenzmarkierungen durchgeführt.
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Eine
genetische Untersuchung, die auf DNA-Sequenzunterschiede basiert,
kann über
den Nachweis einer Änderung
in der elektrophoretischen Beweglichkeit der DNA-Fragmente im Gel,
mit oder ohne denaturierende Agentien, erfolgen. Kleine Sequenzdeletionen
und -insertionen können
durch hochauflösende
Gelelektrophorese sichtbar gemacht werden. DNA-Fragmente mit unterschiedlichen
Sequenzen können
auf denaturierenden Formamid-Gradientengelen unterschieden werden.
Dabei wird die Beweglichkeit der unterschiedlichen DNA-Fragmente
an unterschiedlichen Positionen im Gel, gemäß ihren spezifischen oder partiellen Schmelztemperaturen,
verzögert
(siehe z.B. Myers et al., Science 230:1242 (1985)). Sequenzänderungen
an bestimmten Stellen können
ebenso durch Nuclease-Schutzversuche
wie beispielsweise RNAse- und S1-Schutz oder durch das chemische
Abspaltungsverfahren, aufgedeckt werden (z.B. Cotton et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85:4397–4401
(1985)).
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Daher
kann der Nachweis einer spezifischen DNA-Sequenz durch Verfahren
wie Hybridisierung, RNAse-Schutz, chemische Abspaltung, direkte
DNA-Sequenzierung oder die Verwendung von Restriktionsenzymen (z.B.
Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus
(„RFLP")) und Southern-Blotting
genomischer DNA, erfolgen.
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Zusätzlich zu
der eher herkömmlichen
Gelelektrophorese und DNA-Sequenzierung können Mutationen auch durch
in situ-Analysen nachgewiesen werden.
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Chromosomen-Tests
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Die
erfindungsgemäßen Sequenzen
sind auch nützlich
für die
Chromosomen-Identifizierung.
Die Sequenz zielt spezifisch auf eine bestimmten Stelle auf einem
individuellen menschlichen Chromosom, mit dem sie auch hybridisieren
kann. Die Kartierung von DNAs auf Chromosomen gemäß der vorliegenden
Erfindung ist ein wichtiger erster Schritt bei der Korrelation solcher
Sequenzen mit Genen, die mit einer Erkrankung in Verbindung stehen.
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In
dieser Hinsicht wurde in bestimmten, bevorzugen Ausführungsformen
die hierin beschriebene cDNA verwendet, um genomische DNA eines
DR4-Gens zu clonieren. Dies kann unter Verwendung einer Vielzahl
von bekannten Verfahren und Genbanken, die im Allgemeinen im Handel
erhältlich
sind, erfolgen. Unter Verwendung von bekannten, zweckmäßigen Verfahren
wird die genomische DNA für
die in situ-Chromosomenkartierung verwendet.
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Außerdem können durch
das Bereitstellen von PCR-Primern aus der cDNA (vorzugsweise 15–25 bp) Sequenzen
auf Chromosomen kartiert werden. Eine Computeranalyse der 3' untranslatierten
Region des Gens wird verwendet, um schnell Primer auszuwählen, die
nicht mehr als ein Exon in der genomischen DNA umspannen, da sonst
der Amplifizierungsprozess erschwert werden würde. Diese Primer werden dann
für das PCR-Durchmustern
von somatischen Zellenhybriden, die individuelle menschliche Chromosomen
enthalten, verwendet.
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Um
in einem Schritt eine präzise
chromosomale Lokalisierung zu erhalten, kann die Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung
(„FISH") eines cDNA-Clons
an einem gespreiteten Metaphase-Chromosom angewendet werden. Dieses
Verfahren kann mit ganz kurzer cDNA, von nur 50 oder 60, verwendet
werden. Für
einen Überblick über dieses
Verfahren siehe Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic
Techniques, Pergamon Press, New York (1988).
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Sobald
eine Sequenz auf einer genauen Chromosomenstelle kartiert worden
ist, kann die physikalische Position der Sequenz auf dem Chromosom
mit genetischen Kartendaten korreliert werden. Solche Daten werden
zum Beispiel in V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man gefunden,
online erhältlich über die
John Hopkins University, Welch Medical Library. Die Beziehung zwischen
Genen und Krankheiten, die auf der selben chromosomalen Regionen
kartiert worden sind, werden dann durch Verknüpfungsanalysen (Co-Vererbung
von physikalisch benachbarten Genen) identifiziert.
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Als
Nächstes
ist es nötig
die Unterschiede in der cDNA oder der genomischen Sequenz zwischen
betroffenen und nicht-betroffenen Personen zu bestimmen. Wenn eine
Mutation in einigen oder allen betroffenen Personen beobachtet wird,
aber in keiner nicht-betroffenen Person, dann ist vermutlich die
Mutation das verursachende Agens dieser Erkrankung.
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Vektoren und Wirtszellen
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch Vektoren, die erfindungsgemäße DNA-Moleküle enthalten, Wirtszellen,
die mit den erfindungsgemäßen Vektoren
gentechnisch verändert
wurden und die Herstellung von erfindungsgemäßen Polypeptiden durch rekombinante
Verfahren.
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Wirtszellen
können
gentechnisch verändert
werden, um Nucleinsäuremoleküle einzuschleusen
und erfindungsgemäße Polypeptide
zu exprimieren. Die Polynucleotide können allein oder mit anderen
Polynucleotiden eingeführt
werden. Solche anderen Polynucleotide können unabhängig eingebracht, co-eingeschleust oder
mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden
verbunden eingeführt
werden. In Übereinstimmung
mit diesem Aspekt der Erfindung kann der Vektor zum Beispiel ein
Plasmidvektor, ein einzel- oder doppelsträngiger Phagenvektor oder ein
einzel- oder doppelsträngiger RNA-
oder DNA-Virusvektor sein. Durch bekannte Verfahren zum Einbringen
von DNA und RNA in Zellen, können
solche Vektoren als Polynucleotide, vorzugsweise DNA, in Zellen
eingebracht werden. Virale Vektoren können replikationsfähig oder
replikationsdefekt sein. Im letzteren Fall wird die Virusvermehrung
im Allgemeinen nur in komplementierenden Wirtszellen stattfinden.
In bestimmter Hinsicht sind unter den bevorzugten Vektoren solche
für die
Expression von erfindungsgemäßen Polynucleotiden
und Polypeptiden. Gewöhnlich enthalten
solche Vektoren cis-wirkende Kontrollregionen, die wirksam bei der
Expression in einem Wirt sind und funktionell mit dem zu exprimierenden
Polynucleotid verbunden sind. Geeignete trans-wirkende Faktoren
werden entweder von dem Wirt oder von einem komplementierenden Vektor
bereitgestellt oder nach dem Einbringen in den Wirt durch den Vektor
selbst geliefert.
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Eine
große
Vielzahl von Expressionsvektoren können verwendet werden, um ein
erfindungsgemäßes Polypeptid
zu exprimieren. Solche Vektoren umfassen chromosomale, episomale
und virusstämmige
Vektoren, z.B. Vektoren, die von Bakterienplasmiden stammen, von
Bakteriophagen, von Hefe-Episomen, von chromosomalen Hefe-Elementen,
von Viren wie beispielsweise Baculoviren, Papovaviren wie zum Beispiel
SV40, Vacciniaviren, Adenoviren, Hühnerpockenviren, Pseudorabiesviren
und Retroviren und Vektoren, die aus Kombinationen davon stammen
wie beispielweise diejenigen die von genetischen Elementen des Plasmids oder
Bacteriophagen stammen, wie Cosmide und Phagemide, alle können für die Expression,
in Übereinstimmung
mit diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung, verwendet werden.
Für die
diesbezügliche
Expression kann im Allgemeinen jeder Vektor, der geeignet ist Polynucleotide
zu erhalten, zu propagieren oder zu exprimieren verwendet werden,
um ein Polypeptid in einem Wirt zu exprimieren. Die DNA-Sequenz
in dem Expressionsvektor ist funktionell verbunden mit den geeigneten
Expressionskontrollsequenzen, einschließlich zum Beispiel eines Promotors,
um die mRNA-Transkription zu regeln. Vertreter solcher Promotoren
umfassen den Phagen Lamda PL-Promotor, die E. coli lac-, trp- und
tac-Promotoren, der SV40 frühe
und späte
Promotor und Promotoren der retroviralen LTRs, um nur einige der
bekannten Promotoren zu nennen. Generell werden Expressionskonstrukte
Stellen für
die Transkription, Initiation und Termination enthalten, sowie in
der transkribierten Region eine Ribosomenbindungsstelle für die Translation.
Der codierende Teil der reifen Transkripte, die von den Konstrukten
exprimiert werden, wird am Anfang ein Translation-einleitendes AUG
und am Ende des zu translatierenden Polypeptids ein entsprechend
positioniertes Terminationscodon (UAA, UGA oder UAG) enthalten.
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Zusätzlich können die
Konstrukte Kontrollregionen enthalten, welche die Expression sowohl
regulieren als auch erzeugen. Im Allgemeinen werden solche Regionen durch
die Kontrolle der Transkription wirken, unter anderem über Repressorbindungsstellen
und Enhancer.
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Vektoren
für die
Vermehrung und Expression werden gewöhnlich Selektionsmarker enthalten.
Solche Marker können
auch für
die Amplifizierung geeignet sein oder die Vektoren können zusätzliche
Marker für
diesen Zweck enthalten. In dieser Hinsicht enthalten die Expressionsvektoren
vorzugsweise ein oder mehrere selektierbare Markergene, um eine
phänotypische
Eigenschaft für
die Selektion der transformierten Wirtszelle zu liefern. Bevorzugte
Marker schließen
Dihydrofolatreduktase- oder Neomycin-Resistenz für die eukaryontische Zellkultur
und Tetracyclin- oder Ampicillin-Resistenzgene für die Kultur in E. coli oder
anderen Bakterien ein.
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Vektoren,
die sowohl die entsprechende DNA-Sequenz wie an anderer Stelle beschrieben
als auch einen geeigneten Promotor und andere zweckmäßige Kontrollsequenzen
enthalten, können
in einen geeigneten Wirt eingeschleust werden, unter Verwendung
einer Vielzahl von bekannten Verfahren, die geeignet sind ein gewünschtes
Polypeptid zu exprimieren. Maßgebliche
Beispiele für
geeignete Wirte umfassen Bakterienzellen wie beispielsweise E. coli-,
Streptomyces- und
Salmonella typhimurium-Zellen; Pilzzellen wie beispielsweise Hefezellen;
Insektenzellen wie beispielsweise Drosophila S2- und Spodoptera
Sf9-Zellen; tierische Zellen wie beispielsweise CHO, COS und Bowes
Melanomzellen und pflanzliche Zellen. Wirte für eine große Vielzahl von Expressionskonstrukten
sind bekannt und ein Fachmann wird durch die vorliegende Offenbarung leicht
in der Lage sein einen Wirt zur Expression eines Polypeptids, gemäß diesem
Aspekt der vorliegenden Erfindung, auszuwählen.
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Unter
den Vektoren, die für
die Verwendung in Bakterien bevorzugt werden, sind pQE70, pQE60
und pQE 9, erhältlich
bei Quiagen, pBS-Vektoren, Phagescript-Vektoren, Bluescript-Vektoren, pNH8A,
pNH16a, pNH18A, pNH46A, erhältlich
bei Stratagene und ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5, erhältlich bei Pharmacia.
Unter den bevorzugten eukaryontischen Vektoren sind pWLNEO, pSV2CAT,
pOG44, pXT1 und pSG, erhältlich
bei Stratagene und pSVK3, pBPV, pMSG und pSVL, erhältlich bei
Pharmacia. Diese Vektoren werden aus den vielen im Handel erhältlichen
und bekannten Vektoren, die für
Fachleute verfügbar
sind, lediglich zur Veranschaulichung aufgelistet.
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Die
Auswahl geeigneter Vektoren und Promotoren für die Expression in einer Wirtszelle
ist ein bekanntes Verfahren und die erforderlichen Techniken für die Konstruktion
des Expressionsvektors, das Einbringen des Vektors in den Wirt und
die Expression im Wirt stellen auf dem Fachgebiet Routinefertigkeiten
dar. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Wirtszellen, welche
die vorstehend beschriebenen und behandelten Konstrukte enthalten.
Die Wirtszelle kann eine höhere
eukaryontische Zelle wie beispielsweise eine Säugerzelle sein oder eine niedere
eukaryontische Zelle wie beispielsweise eine Hefezelle, oder die
Wirtszelle kann eine prokaryontische Zelle wie beispielsweise eine
Bakterienzelle sein.
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Das
Einbringen des Konstrukts in die Wirtszelle kann mittels Calciumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextran-vermittelter
Transfektion, kationischem Lipid-vermittelter Transfektion, Elektroporation,
Transduktion, Infektion oder anderen Verfahren, erfolgen. Solche
Verfahren werden in vielen Standardlaborhandbüchern wie zum Beispiel Davis
et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986), beschrieben.
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Das
Polypeptid kann in einer modifizieren Form exprimiert werden wie
beispielsweise als Fusionsprotein und kann nicht nur Sekretionssignale
sondern auch zusätzliche
heterologe funktionelle Regionen beinhalten. Daher kann zum Beispiel
eine Region mit zusätzlichen
Aminosäuren,
insbesondere geladenen Aminosäuren,
am N-Terminus des
Polypeptids angefügt
werden, um die Stabilität
und Persistenz in der Wirtszelle, während der Aufreinigung oder
während
der nachfolgenden Handhabung und Lagerung zu verbessern. Ebenso kann
dem Polypeptid eine Region angefügt
werden, um die Aufreinigung zu erleichtern. Solche Regionen können vor
der endgültigen
Aufbereitung des Polypeptids entfernt werden. Das Hinzufügen von
Peptideinheiten an das Polypeptid, um die Sekretion oder Exkretion
zu ermöglichen,
um die Stabilität
zu verbessern und um die Aufreinigung zu erleichtern sind unter
anderem auf dem Fachgebiet geläufige
und routinemäßige Verfahren.
Ein bevorzugtes Fusionsprotein umfasst eine heterologe Region eines
Immunglobulins, die nützlich
ist, um Proteine löslich
zu machen. Zum Beispiel beschreibt die
EP-A-0 464 533 (Kanadische
Entsprechung 2045869) Fusionsproteine, die verschiedene Teile der
konstanten Region von Immunglobulinmolekülen zusammen mit einem anderen
menschlichen Protein oder einem Teil davon enthalten. In vielen
Fällen
ist der Fc-Teil in einem Fusionsprotein durchweg von Vorteil für die Verwendung
in Therapie und Diagnose und führt zum
Beispiel zu verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften (
EP-A 0232 262 ). Auf der
anderen Seite wäre
es für
einige Verwendungszwecke wünschenswert
in der Lage zu sein den Fc-Teil nach dem das Fusionsprotein in der
beschriebenen vorteilhaften Art und Weise exprimiert, nachgewiesen
und aufgereinigt worden ist, zu entfernen. Dies ist der Fall, wenn
der Fc-Teil sich als Hindernis bei der Verwendung in Therapie und Diagnose
erweist, zum Beispiel wenn das Fusionsprotein als Antigen für die Immunisierung
verwendet werden soll. Beispielsweise sind bei der Arzneimittelentwicklung
menschliche Proteine wie hIL-5 mit Fc-Teilen für Durchmusterungstests im Hochdurchsatz
fusioniert worden, um Antagonisten von hIL-5 zu identifizieren.
Siehe Gennett, D. et al., Journal of Molecular Recognition, Vol.
8:52–58
(1995) und Johanson, K. et al., The Jounal of Biological Chemistry,
Vol. 270, Nr. 16:9459–9471
(1995).
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Die
DR4-Polypeptide können
aus rekombinanten Zellkulturen mittels bekannter Verfahren, einschließlich Ammoniumsulfat-
oder Ethanol-Präzipitation,
Säureextraktion,
Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie, Phosphozellulosechromatographie,
Chromatographie durch hydrophobe Wechselwirkungen, Affinitätschromatographie,
Hydroxylapatitchromatographie und Lektinchromatographie gewonnen
und aufgereinigt werden. Vorzugsweise wird die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
(„HPLC") für die Aufreinigung
verwendet. Bekannte Verfahren für
die Rückfaltung
des Proteins können
eingesetzt werden, um die aktive Konformation wieder herzustellen,
wenn das Polypeptid während
der Isolierung und/oder Aufreinigung des Peptids denaturiert wurde.
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Zu
den erfindungsgemäßen Polypeptiden
gehören
natürlich
aufgereinigte Produkte, Produkte aus chemischen Syntheseverfahren
und Produkte, die mittels Rekombinationsverfahren aus prokaryontischen oder
eukaryontischen Wirten, einschließlich zum Beispiel Bakterien-,
Hefe-, höhere
Pflanzen-, Insekten- und Säugerzellen
hergestellt wurden. Abhängig
vom Wirt, der bei einem rekombinanten Herstellungsverfahren verwendet
wurde, können
die erfindungsgemäßen Polypeptide
glycosyliert oder unglycosyliert sein. Außerdem können erfindungsgemäße Polypeptide
einen modifizierten Startmethioninrest enthalten, in einigen Fällen als Ergebnis
eines Wirts-vermittelten Prozesses.
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DR4-Polynucleotide
und Polypeptide können
gemäß der vorliegenden
Erfindung für
eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden, insbesondere solche,
welche die chemischen und biologischen Eigenschaften von DR4 nutzen.
Unter ihnen sind Anwendungen bei der Behandlung von Tumoren, der
Resistenz gegenüber
Parasiten, Bakterien und Viren, zur Induktion der Proliferation
von T-Zellen, Endothelzellen und bestimmten hämatopoetischen Zellen, zum
Behandeln einer Restenose, Transplantat-gegen-Empfänger-Krankheit, zum
Regulieren der antiviralen Antwort und zur Verhinderung bestimmter
Autoimmunkrankheiten nach der Stimulation von DR4 durch einen Agonisten.
Zusätzliche
Anwendungen betreffen die Diagnose und Behandlung von Krankheiten
der Zellen, Gewebe und Organismen. Diese Aspekte der Erfindung werden
nachstehend weiter erläutert.
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DR4 Polypeptide und Fragmente
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Ferner
liefert die Erfindung ein isoliertes DR4-Polypeptid, das eine in 1 gezeigte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:2) aufweist
oder ein Peptid oder Polypeptid, das einen Teil des vorstehenden
Polypeptids enthält.
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Um
die Eigenschaften der DR4-Polypeptide zu verbessern oder zu ändern, kann
eine gezielte gentechnische Veränderung
von Proteinen durchgeführt
werden. Unter Fachleuten bekannte Rekombinante-DNA-Technologie kann
verwendet werden, um neue mutierte Proteine oder „Muteine" zu schaffen, dazu
gehören
einzelne oder vielfache Aminosäureaustausche,
Deletionen, Additionen oder Fusionsproteine. Solch modifizierten
Polypeptide können
z.B. eine gesteigerte Aktivität
oder erhöhte
Stabilität
zeigen. Des Weiteren können
sie mit höherer
Ausbeute aufgereinigt werden und zeigen eine bessere Löslichkeit
als die entsprechenden natürlichen
Polypeptide, zumindest unter bestimmten Aufreinigungs- und Lagerungsbedingungen.
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Zum
Beispiel ist für
viele Proteine, einschließlich
der extrazellulären
Domäne
eines membrangebundenen Proteins oder die reife/n Form/en eines
sezernierten Proteins, auf dem Fachgebiet bekannt, dass eine oder
mehrere Aminosäuren
vom N-Terminus oder C-Terminus ohne wesentlich Verlust der biologischen
Funktion entfernt werden können.
Beispielsweise beschrieben Ron et al., J. Biol. Chem., 268:2984–2988 (1993) KGF-Proteine,
die eine Heparin-Bindungsaktivität
aufwiesen, auch wenn 3, 8 oder 27 amino-terminale Aminosäurereste
fehlten. Im vorliegenden Fall können,
da das erfindungsgemäße Protein
ein Mitglied der „Death-Domain"-enthaltenden Rezeptor
(DDCR)-Polypeptid-Familie ist, Deletionen der N-terminalen Aminosäuren bis zum
Cysteinrest der Position 132 in der SEQ ID NO:2 einige biologische
Aktivität
wie beispielsweise die Fähigkeit
die Apoptose zu induzieren, behalten.
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Von
Polypeptiden, die weitere N-terminale Deletionen aufweisen, einschließlich dem
Cysteinrest der Position 132 (-132) in der SEQ ID NO:2, würde man
nicht erwarten, dass sie solch biologische Aktivitäten behalten,
da dieser Rest unter den Familienmitgliedern konserviert ist, siehe 2. Möglicherweise
ist er zur Ausbildung einer Disulfid-Brücke erforderlich, um die strukturelle
Stabilität
zu liefern, die für
die Rezeptorbindung nötig
ist.
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Allerdings
können,
auch wenn die Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren vom
N-Terminus eines Proteins
zur Modifikation oder dem Verlust einer oder mehrerer biologischer
Funktionen des Proteins führt,
andere biologische Funktionen nach wie vor erhalten bleiben. Daher
wird die Fähigkeit
des verkürzten
Proteins Antikörper,
die das vollständige
Protein oder die extrazelluläre
Domäne
des Proteins erkennen, zu induzieren und/oder zu binden gewöhnlich erhalten
bleiben, wenn weniger als die Mehrheit der Reste des vollständigen Proteins
oder der extrazellulären
Domäne
des Proteins vom N-Terminus entfernt werden. Ob ein bestimmtes Polypeptid,
dem N-terminale
Reste eines vollständigen
Proteins fehlen, solch immunologische Aktivitäten beibehält, kann leicht mittels Routineverfahren,
die hierin beschrieben werden und auch sonst auf dem Fachgebiet
bekannt sind, bestimmt werden
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Dem
gemäß liefert
die vorliegende Erfindung des Weiteren Polypeptide, bei denen eine
oder mehrere Reste vom Amino-Terminus der in SEQ ID NO:2 gezeigten
Aminosäuresequenz
von DR4 bis zum C-132-Rest, entfernt wurden und Polynucleotide,
die solche Polypeptide codieren. Insbesondere liefert die vorliegende
Erfindung Polypeptide, welche die Aminosäuresequenz der Reste n-468
der SEQ ID NO:2 enthält,
wobei n eine ganze Zahl im Bereich von 1-132 ist, wobei angenommen
wird, dass C-132 der erste Rest vom N-Terminus der extrazellulären Domänen des
DR4-Polypeptids (gezeigt in SEQ ID NO:2) ist, der für die Rezeptor/Ligand-Bindungsaktivität (z.B.
TRAIL-Bindung) des DR4-Proteins erforderlich ist. Polynucleotide,
die diese Polypeptide codieren werden ebenso geliefert.
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Gleichermaßen sind
viele Beispiele von biologisch funktionsfähigen C-terminalen Deletionsmuteinen bekannt.
Zum Beispiel zeigt Interferon Gamma bis zu zehn mal höhere Aktivitäten durch
die Deletion von 8-10 Aminosäureresten
vom Carboxy-Terminus
des Proteins (Döbeli
et al., J. Biotechnology 7:199–216
(1988)). Im vorliegenden Fall können,
da das erfindungsgemäße Protein
ein Mitglied der DDCR-Polypeptid
Familie ist, Deletionen von C-terminalen Aminosäuren bis zum Cystein der Position
221 (C-221) der SEQ ID No:2 einige biologische Aktivität wie Rezeptorbindung
erhalten.
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Von
Polypeptiden, die weitere C-terminale Deletionen, einschließlich C-221
der SEQ ID NO:2 aufweisen, würde
nicht erwartet, dass sie solche biologischen Aktivitäten erhalten,
da dieser Rest unter den DDCR-Familienmitgliedern konserviert ist
und zur Ausbildung einer Disulfid-Brücke erforderlich ist, um die
strukturelle Stabilität
zu liefern, die für
die Rezeptor/Ligandbindung nötig
ist.
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Allerdings
können
auch, wenn die Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren vom
C-Terminus eines Proteins zur Modifikation oder dem Verlust einer
oder mehrerer biologischer Funktionen des Proteins führt, andere
biologische Funktionen nach wie vor erhalten bleiben. Daher wird
die Fähigkeit
des verkürzten Proteins
Antikörper,
die das vollständige
Protein oder die extrazelluläre
Domäne
des Proteins erkennen, zu induzieren und/oder zu binden gewöhnlich erhalten
bleiben, wenn weniger als die Mehrheit der Reste des vollständigen Proteins
oder der extrazellulären
Domäne
des Proteins vom C-Terminus entfernt werden. Ob ein bestimmtes Polypeptid,
dem C-terminale Reste eines vollständigen Proteins fehlen, solch
immunologische Aktivitäten
beibehält,
kann leicht mittels Routineverfahren, die hierin beschrieben werden
und auch sonst auf dem Fachgebiet bekannt sind, bestimmt werden.
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Dem
gemäß liefert
die vorliegende Erfindung des Weiteren Polypeptide, bei denen einer
oder mehrere Reste vom Carboxy-Terminus der in SEQ ID NO:2 gezeigten
Aminosäuresequenz
von DR4, bis zum C-221-Rest der SEQ ID NO:2, entfernt wurden und
Polynucleotide, die solche Polypeptide codieren. Insbesondere liefert
die vorliegende Erfindung Polypeptide, die die Aminosäuresequenz
der Reste 1-m der Aminosäuresequenz
in SEQ ID NO:2 enthält,
wobei m irgendeine ganze Zahl im Bereich von 221-468 ist, und der
Rest C-221 die Position des ersten Rests vom C-Terminus des vollständigen DR4-Polypeptids (gezeigt
in SEQ ID NO:2) ist, von dem angenommen wird, dass er für die Rezeptor-Bindungsaktivität des DR4-Proteins
erforderlich ist. Polynucleotide, die diese Polypeptide codieren
werden ebenso geliefert.
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Die
Erfindung liefert auch Polypeptide, bei denen eine oder mehrere
Aminosäuren
sowohl am Amino- als auch Carboxy-Terminus entfern wurden, allgemein beschrieben
weisen sie die Reste n-m der SEQ ID NO:2 auf, wobei n und m wie
vorstehend beschrieben ganze Zahlen darstellen.
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Dazu
gehört
auch eine Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, welches
aus einem Teil der vollständigen
DR4-Aminosäuresequenz
besteht, die von dem cDNA-Clon
codiert wird, der in der ATCC-Hinterlegungsnummer 97853 enthalten
ist, wobei dieser Teil die Aminosäuren 1 bis etwa 108 des Amino-Terminus
der vollständigen
Aminosäuresequenz,
die von dem cDNA-Clon codiert wird, der in der ATCC-Hinterlegungsnummer
97853 enthalten ist, ausschließt
oder die Aminosäuren
1 bis etwa 247 vom Carboxy-Terminus oder jede Kombination der vorstehenden
amino- und carboxy-terminalen
Deletionen der vollständigen
Aminosäuresequenz,
die von dem cDNA-Clon codiert wird, der in der ATCC-Hinterlegungsnummer
97853 enthalten ist. Ebenso werden Polynucleotide geliefert, die
alle der vorstehenden deletionsmutierten Polypeptidformen codieren.
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Unter
den N- und C-terminalen Deletionsmutanten werden solche bevorzugt,
die nur einen Teil der extrazellulären Domäne, d.h. innerhalb der Reste
24-238, umfassen, da erwartet wird, dass jeder Teil darin löslich ist.
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Auf
dem Fachgebiet wird man erkennen, dass einige Aminosäuresequenzen
von DR4 ohne signifikante Wirkung auf die Struktur oder Funktion
des Proteins verändert
werden können.
Bei der Betrachtung solcher Unterschiede in der Sequenz sollte man
in Erinnerung behalten, dass es auf dem Protein kritische Bereiche gibt,
welche die Aktivität
bestimmen. Solche Bereiche werden gewöhnlich Reste umfassen, welche
die Ligandenbindungsstelle oder die „Death-Domain" ausmachen, oder
welche Tertiärstrukturen
ausbilden, die diese Domänen
beeinflussen.
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Daher
umfasst die Erfindung des Weiteren Abweichungen des DR4-Proteins,
die eine beachtliche DR4-Poteinaktivität zeigen, oder umfasst DR4-Regionen
wie die nachstehend erläuterten
Proteinfragmente. Zu derartigen Mutanten gehören Deletionen, Insertionen,
Inversionen, Wiederholungen und Typ-Substitutionen. Wie vorstehend
angedeutet, kann eine Anleitung hinsichtlich der Aminosäureänderungen,
die wahrscheinlich phänotypisch
stumm sind, in Bowie, J.U. et al., Science 247:1306–1310 (1990)
gefunden werden.
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Von
besonderem Interesse sind Austausche von geladenen Aminosäuren mit
anderen geladenen Aminosäuren
und mit neutralen oder negativ geladenen Aminosäuren. Die Letzteren haben Proteine
zur Folge, die eine geringere positive Ladung aufweisen, um die
Eigenschaften des DR4-Proteins zu verbessern. Die Verhinderung einer
Aggregation ist höchst
erwünscht.
Die Aggregation von Proteinen führt
nicht nur zum Verlust der Aktivität, sondern kann auch problematisch
sein für
die Herstellung von Arzneimitteln, da sie immunogen sein können (Pinckard
et al., Clin. Exp. Immunol. 2:331–340 (1967); Robbins et al.,
Diabetes 36:838–845 (1987);
Cleland et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307–377 (1993)).
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Das
Ersetzten von Aminosäuren
kann auch die Selektivität
der Bindung an Zelloberflächenrezeptoren ändern. Ostade
et al., Nature 361:266–268
(1993) beschreibt bestimmte Mutationen, die dazu führen, dass TNF-alpha
selektiv nur an einen der zwei bekannten Typen von TNF-Rezeptoren
bindet. Daher kann der erfindungsgemäße DR4-Rezeptor eine oder mehrere
Aminosäureaustausche,
Deletionen oder Additionen aufweisen, entweder von natürlichen
Mutationen oder durch menschliches Eingreifen.
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Wie
angedeutet sind Änderungen
vorzugsweise geringer Natur wie beispielsweise konservative Aminosäureaustausche,
die nicht signifikant die Faltung oder Aktivität des Proteins beeinflussen
(siehe Tabelle 1). Tabelle 1. Konservative Aminosäureaustausche.
Aromatisch | Phenylalanin
Tryptophan
Tyrosin |
Hydrophob | Leucin
Isoleucin
Valin |
Polar | Glutamin
Asparagin |
Basisch | Arginin
Lysin
Histidin |
Sauer | Asparaginsäure
Glutaminsäure |
Klein | Alanin
Serin
Threonin
Methionin
Glycin |
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Aminosäuren im
erfindungsgemäßen DR4-Protein,
die für
die Funktion unentbehrlich sind, können mittels auf dem Fachgebiet
bekannten Verfahrer wie beispielsweise ortsgerichtete Mutagenese
oder Alanin-Scanning-Mutagenese identifiziert werden (Cunningham
und Wells, Science 244:1081–1085
(1989)). Das letztere Verfahren führt einzelne Alanin-Mutationen
an jedem Rest im Molekül
ein. Die so entstandenen mutierten Moleküle werden dann bezüglich ihrer
biologischen Aktivität
gemessen wie beispielsweise Rezeptorbindung oder in vitro- oder
in vitro-Proliferationsaktivitat.
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Stellen,
die kritisch sind für
die Ligand/Rezeptor-Bindung können
auch durch Strukturanalyse wie beispielsweise Kristallisation, magnetische
Kernresonanz oder Photoaffinitätsmarkierung
bestimmt werden (Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899–904 (1992)
und de Vos et al., Science 255:306–312 (1992)).
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Die
erfindungsgemäßen Polypeptide
werden vorzugsweise in einer isolieren Form bereitgestellt und sind
vorzugsweise im Wesentlichen aufgereinigt. Eine rekombinant hergestellte
Version des DR4-Polypeptids wird im Wesentlichen mittels Einstufenverfahren,
beschrieben in Smith und Johnson, Gene 67:31–40 (1988), aufgereinigt.
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Zu
den erfindungsgemäßen Polypeptiden
gehört
auch das Polypeptid, das von der hinterlegten cDNA einschließlich Leadersequenz
codiert wird, das reife Polypeptid, das von der hinterlegten cDNA
ohne Leadersequenz (d.h. das reife Protein) codiert wird, das Polypeptid
der 1 (SEQ ID NO:2) einschließlich Leadersequenz,
das Polypeptid der 1 (SEQ ID NO:2)
ohne das amino-terminale Methionin, das Polypeptid der 1 (SEQ ID NO:2) ohne Leadersequenz, die
extrazelluläre
Domäne,
die „Death-Domain", lösliche Polypeptide,
welche die vollständigen
oder Teile der extrazellulären
und intrazellulären
Domänen
enthalten, denen aber die Transmembrandomäne fehlt, genauso wie Polypeptide,
die mindestens 80% identisch, stärker
bevorzugt mindestens 90% oder 95% identisch sind, noch stärker bevorzugt
mindestens 96%, 97%, 98% oder 99% identisch sind zu dem Polypeptid,
das von den hinterlegten cDNA-Clonen codiert wird oder zu dem Polypeptid aus 1 (SEQ ID NO:2) und dazu gehören auch
Teile solcher Polypeptide mit mindestens 30 Aminosäuren und
stärker
bevorzugt mit mindestens 50 Aminosäuren. Mit einem Polypeptid,
das eine Aminosäuresequenz aufweist,
die mindestens zum Beispiel 95% „identisch" ist mit einer Bezugsaminosäure eines
DR4-Polypeptids ist gemeint, dass die Aminosäuresequenz des Polypeptids
identisch ist mit der Bezugssequenz mit Ausnahme, dass die Polypeptidsequenz
bis zu fünf
Aminosäureänderungen
je 100 Aminosäuren
der Bezugsaminosäure des
DR4-Polypeptids
enthalten kann. In anderen Worten, um ein Polypeptid zu erhalten,
das eine Aminosäuresequenz
aufweist, die mindestens zu 95% identisch ist zu einer Bezugsaminosäuresequenz,
können
bis zu 5% der Aminosäurereste
in der Bezugssequenz deletiert oder durch eine andere Aminosäure ersetzt
sein, oder eine Aminosäureanzahl
von bis zu 5% der gesamten Aminosäurereste der Bezugssequenz
können
in die Bezugssequenz eingefügt
werden. Diese Änderungen
der Bezugssequenz können
an den amino- oder carboxy-terminalen Positionen der Bezugsaminosäuresequenz
oder irgendwo zwischen diesen terminalen Positionen vorkommen, entweder
individuell verstreut über
die Reste der Bezugssequenz oder in einer oder mehreren aufeinanderfolgenden
Gruppen innerhalb der Bezugssequenz.
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Ob
ein bestimmtes Polypeptid mindestens 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder
99% identisch ist mit zum Beispiel der in 1 gezeigten
Aminosäuresequenz
(SEQ ID NO:2) oder der Aminosäuresequenz,
die von dem hinterlegten cDNA-Clon codiert wird, kann in praktischer
Hinsicht im Allgemeinen unter Verwendung von bekannten Computerprogrammen
wie beispielsweise das Bestfit-Programm (Wisconsin Sequence Analysis Package,
Version 8 für
Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science
Drive, Madison, WI 53711) bestimmt werden. Bei der Verwendung von
Bestfit oder irgendeinem anderen Sequenzalignment-Programm zur Bestimmung,
ob eine bestimmte Sequenz zum Beispiel 95% identisch ist mit einer
erfindungsgemäßen Bezugssequenz,
werden die Parameter so eingestellt, dass natürlich die prozentuale Identität über die
volle Länge
der Bezugsaminosäuresequenz
berechnet wird und Lücken
in der Homologie bis zu 5% der gesamten Anzahl von Aminosäureresten
der Bezugssequenz erlaubt sind. Die hier genannten Erfinder haben
entdeckt, dass das DR4-Polypeptid ein Protein mit 468 Resten ist,
das drei Hauptstrukturdomänen
aufweist. Zuerst wurde die Ligandenbindungsdomäne innerhalb der Reste von
etwa 24 bis etwa 238 in 1 (SEQ ID
NO:2) identifiziert. Als zweites wurde die Transmembrandomäne innerhalb
der Reste von etwa 239 bis etwa 264 in 1 (SEQ
ID NO:2) identifiziert. Als drittes wurde die intrazelluläre Domäne innerhalb
der Reste von etwa 265 bis etwa 468 in 1 (SEQ
ID NO:2) identifiziert. Nennenswerterweise enthält die intrazelluläre Domäne eine „Death-Domain" bei den Resten von
etwa 379 bis etwa 422. Weitere bevorzugte Fragmente des in 1 (SEQ ID NO:2) gezeigten Polypeptids
schließen
das reife Protein von den Resten um etwa 24 bis etwa 468 und lösliche Polypeptide,
welche die vollständigen
oder Teile der extrazellulären
und intrazellulären
Domänen
enthalten, denen aber die Transmembrandomäne fehlt, ein.
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Ferner
liefert die Erfindung DR4-Polypeptide, die von dem hinterlegten
cDNA-Clon einschließlich
Leadersequenz codiert werden, und DR4-Polypeptidfragmente, ausgewählt aus
dem reifen Protein, der extrazellulären Domäne, der Transmembrandomäne, der
intrazellulären
Domäne
und der „Death-Domain".
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In
einem andern Aspekt liefert die Erfindung ein Peptid oder Polypeptid,
das einen Epitop-tragenden Teil eines hierin beschriebenen Polypeptides
enthält.
Das Epitop dieses Polypeptidteils ist ein immunogenes oder antigenes
Epitop eines erfindungsgemäßen Polypeptides.
Ein „immunogenes
Epitop" ist definiert
als ein Teil eines Proteins, der eine Antikörperantwort hervorruft, wenn
das ganze Protein das Immunogen ist. Auf der andern Seite ist ein
Bereich eines Proteinmoleküls
an den ein Antikörper
binden kann definiert als ein „antigenes
Epitop". Die Anzahl
von immunogenen Epitopen eines Proteins ist im Allgemeinen geringer
als die Anzahl der antigenen Epitope. Siehe zum Beispiel Geysen
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998–4002 (1983).
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Wie
bei der Auswahl der Peptide oder Polypeptide, die ein antigenes
Epitop tragen (d.h. die eine Region eines Proteinmoleküls enthalten
an die ein Antikörper
binden kann), ist es auf dem Fachgebiet bekannt, dass relativ kurze,
synthetische Peptide, die einen Teil einer Proteinsequenz nachahmen,
geeignet sind routinemäßig ein
Antiserum, das mit dem teilweise nachgeahmten Protein reagiert,
hervorzubringen. Siehe zum Beispiel Sutcliffe, J.G., Shinnick, T.M.,
Green, N. und Learner, R.A., Antibodies that react with predetermined sites
an Proteins, Science 219:660–666
(1983). Peptide, die fähig
sind Protein-reaktive Seren hervorzubringen sind häufig in
der Primärsequenz
eines Proteins vertreten, können
mit einem Satz von einfachen chemischen Regeln charakterisiert werden
und sind weder auf immundominante Regionen eines intakten Proteins
(d.h. immunogene Epitope) noch auf die Amino- oder Carboxy-Termini beschränkt.
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Antigene,
Epitop-tragende Peptide und Polypeptide der Erfindung sind daher
nützlich,
um Antikörper, einschließlich monoclonale
Antikörper,
die spezifisch an ein erfindungsgemäßes Polypeptid binden, hervorzubringen.
Siehe zum Beispiel Wilson et al., Cell 37:767–778 (1984) auf Seite 777.
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Antigene,
Epitop-tragende Peptide und Polypeptide der Erfindung enthalten
vorzugsweise eine Sequenz von mindestens sieben, stärker bevorzugt
mindestens neun und am meisten bevorzugt zwischen mindestens 15
bis etwa 30 Aminosäuren,
innerhalb der Aminosäuresequenz
eines erfindungsgemäßen Polypeptids.
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Nicht-einschränkende Beispiele
von antigenen Polypeptiden oder Peptiden, die verwendet werden können, um
DR4-spezifische Antikörper
herzustellen, umfassen: ein Polypeptid, das die Aminosäurereste
von etwa 35 bis etwa 92 in 1 (SEQ
ID NO:2) enthält,
ein Polypeptid, das die Aminosäurereste
von etwa 114 bis etwa 160 in 1 (SEQ
ID NO:2) enthält,
ein Polypeptid, das die Aminosäurereste
von etwa 169 bis etwa 240 in 1 (SEQ
ID NO:2) enthält,
ein Polypeptid, das die Aminosäurereste
von etwa 267 bis etwa 298 in 1 (SEQ
ID NO:2) enthält,
ein Polypeptid, das die Aminosäurereste
von etwa 330 bis etwa 364 in 1 (SEQ
ID NO:2) enthält,
ein Polypeptid, das die Aminosäurereste
von etwa 391 bis etwa 404 in 1 (SEQ
ID NO:2) enthält
und ein Polypeptid, das die Aminosäurereste von etwa 418 bis etwa
465 in 1 (SEQ ID NO:2) enthält. Wie
vorstehend angedeutet, haben die Erfinder festgestellt, dass die
vorstehenden Polypeptidfragmente antigene Regionen des DR4-Proteins
sind.
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Die
Epitop-tragenden Peptide und Polypeptide der Erfindung können durch
jedes konventionelle Mittel hergestellt werden (Houghten, R.A., „General
method for the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptides:
specificity of antigen-antibody
interaction at the level of individual amino acids", Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 82:5131–5135
(1985)). Dieses Verfahren der simultanen, multiplen Peptidsynthese" (SMPS) wird weiter beschrieben
in U.S. Patentnummer 4,631,211 zu Houghten et al. (1986).
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Wie
der Fachmann erkennen wird, können
erfindungsgemäße DR4-Polypeptide
und die vorstehend beschriebenen Epitop-tragenden Fragmente davon
mit Teilen der konstanten Domäne
von Immunglobulinen (IgG) kombiniert werden, was chimäre Polypeptide
ergibt. Diese Fusionsprotein vereinfachen die Aufreinigung und zeigen
in vivo eine erhöhte
Halbwertszeit. Gezeigt worden ist dies z.B. für chimäre Proteine, die aus den ersten
zwei Domänen
des menschlichen CD4-Polypeptids und verschiedenen Domänen der
konstanten Regionen der schweren oder leichten Kette von Säugerimmunglobulinen
bestehen (
EPA 394,827 ,
Traunecker et al., Nature 331:84–86 (1988)). Fusionsproteine,
die wegen des IgG-Teils eine über
Disulfid-Brücken verbundene
dimere Struktur aufweisen, können
auch effizienter in der Bindung und Neutralisation anderer Moleküle sein,
als das monomere DR4-Protein oder Proteinfragment allein (Fountoulakis
et al., J. Biochem. 270:3958–3964
(1995)).
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Polypeptid-Tests
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch diagnostische Tests wie beispielsweise
quantitative und diagnostische Tests für den Nachweis der Spiegel
an DR4-Protein oder der löslichen
Form davon, in Zellen und Geweben, einschließlich der Bestimmung von normalen
und abnormalen Spiegeln. Daher kann zum Beispiel ein erfindungsgemäßer diagnostischer
Test zum Nachweis der Überexpression
von DR4 oder einer löslichen Form
davon, verglichen mit normalen Kontrollgewebeproben, verwendet werden,
um die Anwesenheit von zum Beispiel Tumoren nachzuweisen. Testverfahren,
die verwendet werden können,
um Proteinspiegel wie beispielsweise ein erfindungsgemäßes DR4-Protein
oder eine lösliche
Form davon, in einer Probe, die von einem Wirt stammt, nachzuweisen,
sind auf dem Fachgebiet bekannt. Diese Testverfahren schließen Radioimmuntests,
kompetitive Bindungstests, Western-Blot-Analyse und ELISA-Tests ein.
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Das
Testen von DR4-Proteinspiegeln in einer biologischen Probe kann
unter Verwendung jedes auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren erfolgen.
Für das
Testen von DR4-Proteinspiegeln in einer biologischen Probe werden
Antikörperbasierte
Verfahren bevorzugt. Zum Beispiel kann die DR4-Proteinexpression
in Geweben mit klassischen immunhistologischen Verfahren untersucht
werden (Jalkanen, M., et al., J. Cell. Biol. 101:976–985 (1985);
Jalkanen, M., et al., J. Cell. Biol. 105:3087–3096 (1987)). Andere Antikörper-basierte
Verfahren, die nützlich
für den
Nachweis der DR4-Proteingenexpression sind, schließen Immuntests
wie beispielsweise den Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest (ELISA)
und den Radioimmuntest (RIA) ein.
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Geeignete
Markierungen sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen Enzymmarkierungen
wie beispielsweise Glucoseoxidase, Radioisotope wie beispielsweise
Iod (125I, 121I),
Kohlenstoff (14C), Schwefel (35S),
Tritium (3H), Indium (112In)
und Technetium (99mTc), Fluoreszenzmarkierungen
wie beispielweise Fluorescein und Rhodamin, und Biotin.
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Therapeutika
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Die
Tumornekrosefaktor (TNF)-Familie-Liganden sind bekannt dafür, unter
den am meisten pleiotropen Cytokinen zu sein, die eine große Anzahl
zellulärer
Antworten induziert, einschließlich
Cytotoxizität,
antivirale Aktivität,
immunregulatorische Aktivitäten
und die transkriptionelle Regulation mehrerer Gene (Goeddel, D.V.
et al., „Tumor
Necrosis Factors: Gene Structure and Biological Activities". Symp. Quant. Biol.
51:597–609 (1986),
Cold Spring Harbor; Beutler, B. und Cerami, A., Annu. Rev. Biochem.
57:505–518
(1988); Old, L.J., Sci. Am. 258:59–75 (1988); Fiers, W., FERS
Lett. 285:199–224
(1991)). Die Liganden der TNF-Familie induzieren solch verschiedene
zelluläre
Antworten durch das Binden an Rezeptoren der TNF-Familie, einschließlich dem erfindungsgemäßen DR4.
Zellen, die das DR4-Polypeptid exprimieren und von denen angenommen
wird, dass sie eine wirksame zelluläre Antwort gegenüber DR4-Liganden
aufweisen, umfassen: amniotische Zellen, Herz, Leberkrebs, Nieren,
Leukocyten des peripheren Bluts, aktivierte T-Zellen, zu Th2-Zellen korrespondierendes
Gewebe, menschliche Mandeln und CD34 abgereicherte Leukocyten- und
Thrombocytenschicht (Nabelschnurblut). Mit „eine zelluläre Antwort
gegenüber
einem TNF-Familie-Liganden" ist
irgendeine genotypische, phänotypische
und/oder morphologische Änderung
einer Zelle, Zelllinie, Gewebe, Gewebekultur oder einem Patienten,
der durch ein TNF-Familie-Liganden induziert wird, gemeint. Wie
angedeutet, schließen
solche zellulären
Antworten nicht nur normale physiologische Antworten gegenüber den
Liganden der TNF-Familie sondern auch Krankheiten, die mit erhöhter Apoptose
verbunden sind, oder die Hemmung der Apoptose ein. Der Apoptose-induzierte
programmierte Zelltod ist ein physiologischer Mechanismus, der in
die Entfernung von peripheren T-Lymphocyten des Immunsystems verwickelt
ist, und seine Dysregulation kann zu einer Zahl von verschieden
pathogenen Prozessen führen
(Ameisen, J.C., AXDS 8:1197–1213
(1994); Krammer, P.H. et al., Curr. Opin. Immunol. 6:279–289 (1994)).
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Krankheiten,
die mit einem erhöhten
Zellüberleben
verbunden sind oder der Hemmung der Apoptose umfassen Krebse (wie
beispielsweise Follikuläre
Lymphome, Karzinome mit p53-Mutationen und Hormon-abhängige Tumore
wie Brustkrebs, Prostatakrebs, Kaposi-Sarkom und Eierstockkrebs),
Autoimmunkrankheiten (wie systemischer Lupus erythematodes und immun-vermittelter Glomerulonephritis
Rheumatoide Arthritis) und virale Infektionen (wie Herpes Viren,
Poxviren und Adenoviren), Hinweis auf Transplantat-gegen-Empfänger-Krankheit,
akute Abstoßungsreaktion
und chronische Abstoßungsreaktion.
Krankheiten, die mit einer erhöhten
Apoptose verbunden sind umfassen AIDS, neurodegenerative Erkrankungen
(wie beispielsweise Alzheimer- Krankheit,
Parkinson-Krankheit, Amyotrophe Lateralsklerose, Retinitis pigmentosa,
Kleinhirndegeneration), myelodysplastische Syndrome (wie beispielsweise
Aplastische Anämie),
ischämische
Verletzung (wie beispielsweise solche, die durch Myokardinfarkt,
Schlaganfall und Reperfusionsverletzung verursacht werden), Toxininduzierte
Lebererkrankung (wie beispielsweise auf Alkohol zurückzuführende),
septischer Schock, Kachexie und Anorexie.
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Daher
richtet sich die vorliegende Erfindung in einem Aspekt an ein Verfahren
zur Verstärkung
der durch einen Liganden der TNF-Familie induzierten Apoptose. Dazu
gehört
die Verabreichung einer wirksamen Menge des DR4-Liganden, eines
Analogons oder eines Agonisten, der in der Lage ist die DR4-vermittelte
Signalgebung zu erhöhen,
an eine Zelle, die das DR4-Poypeptid exprimiert. Vorzugsweise wird
die DR4-vermittelte Signalgebung erhöht, um eine Krankheit zu behandeln,
bei der eine verminderte Apoptose oder verminderte Cytokin- und
Adhesionsmolekülexpression
vorliegt. Ein Agonist kann lösliche
Formen von DR4 und monoclonale Antikörper, die gegen das DR4-Polypeptid
gerichtet sind, umfassen.
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In
einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung an
ein Verfahren zur Hemmung der durch einen TNF-Familie-Liganden induzierten
Apoptose. Dazu gehört
die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Antagonisten, der
in der Lage ist die DR4-vermittelte Signalgebung herabzusetzen,
an eine Zelle, die das DR4-Poypeptid
exprimiert. Vorzugsweise wird die DR4-vermittelte Signalgebung herabgesetzt,
um eine Krankheit zu behandeln, bei der eine erhöhte Apoptose oder NFκB-Expression
vorliegt. Ein Antagonist kann lösliche
Formen von DR4 und monoclonale Antikörper, die gegen das DR4-Polypeptid
gerichtet sind, umfassen.
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Mit „Agonist" sind natürlich vorkommende
und synthetische Verbindungen gemeint, die in der Lage sind die
Apoptose zu verstärken
oder zu potenzieren. Mit „Antagonist" sind natürlich vorkommende
und synthetische Verbindungen gemeint, die in der Lage sind die
Apoptose zu hemmen. Ob irgendein zur Wahl stehender, erfindungsgemäßer „Agonist" oder „Antagonist" die Apoptose verstärkt oder
hemmt, kann unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten TNF-Familie
Ligand/Rezeptor-Zellantworttests, einschließlich solcher, die nachstehend
genauer beschrieben werden, bestimmt werden.
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Eines
dieser Durchmusterungsverfahren umfasst die Verwendung von Melanophoren,
die transfiziert werden, um den erfindungsgemäßen Rezeptor zu exprimieren.
Solch ein Durchmusterungsverfahren wird in PCT
WO 92/01810 , veröffentlicht am 6. Februar 1992,
beschrieben. Solch ein Test kann zum Beispiel eingesetzt werden
für die
Durchmusterung nach einer Verbindung, welche die Aktivierung des
erfindungsgemäßen Rezeptorpolypeptids
hemmt (oder verstärkt).
Dies erfolgt durch das Inkontaktbringen der Melanophorzellen, die
den Rezeptor codieren, mit sowohl einem TNF-Familie Liganden als
auch dem zur Wahl stehend Antagonisten (oder Agonisten). Die Hemmung
oder Verstärkung
des Signals, das durch den Liganden erzeugt wird, weist darauf hin,
ob die Verbindung ein Antagonist oder Agonist des Ligand/Rezeptor-Signalübertragungsweges
ist.
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Andere
Durchmusterungsverfahren umfassen die Verwendung von Zellen, die
den Rezeptor exprimieren (beispielsweise CHO-Zellen), in einem System,
das zum Beispiel durch die Rezeptoraktivierung verursachte extrazelluläre pH-Änderungen
misst, wie in Science 246:181–296
(Oktober 1989) beschrieben. Beispielsweise können Verbindungen mit einer
Zelle, die das erfindungsgemäße Rezeptor-Polypeptid exprimiert,
in Kontakt gebracht werden, woraufhin eine sekundäre Botenstoff-Antwort,
z.B. Signalübertragung
oder pH-Änderungen,
gemessen werden kann, um zu ermitteln, ob die potenzielle Verbindung
den Rezeptor aktiviert oder hemmt.
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Ein
anderes dieser Durchmusterungsverfahren umfasst das Einbringen einer
Rezeptor-codierenden RNA in Xenopus-Oocyten, um den Rezeptor vorrübergehend
zu exprimieren. Die Rezeptor-Oocyten können dann mit dem Rezeptor-Liganden
und einer zu durchmusternden Verbindung in Kontakt gebracht werden.
Daraufhin wird im Falle der Durchmusterung nach Verbindungen, von
denen angenommen wird, dass sie die Aktivierung des Rezeptors hemmen,
die Hemmung oder Aktivierung eines Calcium-Signals nachgewiesen.
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Ein
anderes Durchmusterungsverfahren umfasst die Expression eines Konstrukts
in Zellen, wobei der Rezeptor an Phospholipase C oder D gebunden
ist. Zu solchen Zellen gehören
Endothelzellen, glatte Muskelzellen, embrionale Nierenzellen, usw.
Das Durchmustern kann wie hier vorstehend beschrieben, durch den Nachweis
der Aktivierung des Rezeptors oder die Hemmung der Aktivierung des
Rezeptors über
das Phospholipase-Signal durchgeführt werden.
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Ein
anderes Verfahren umfasst das Durchmustern nach Verbindungen, welche
die Aktivierung der erfindungsgemäßen Rezeptorpolypeptid-Antagonisten
hemmen, in dem die Hemmung des Bindens eines markierten Liganden
an Zellen, die den Rezeptor auf ihrer Oberfläche tragen, bestimmt wird.
Solch ein Verfahren umfasst die Transfektion einer eukaryontischen
Zelle mit DNA, die den Rezeptor so codiert, dass die Zelle den Rezeptor
auf ihrer Oberfläche
exprimiert, und das Inkontaktbringen der Zelle mit einer Verbindung
in Anwesenheit eines bekannten Liganden, der in markierter Form
vorliegt. Der Ligand kann z.B. mittels Radioaktivität markiert
werden. Die Menge der an die Rezeptoren gebundenen Liganden wird
gemessen, z.B. durch Messung der Radioaktivität der Rezeptoren. Bindet die
Verbindung an den Rezeptor, was durch eine Reduktion des markierten
Liganden, der an die Rezeptoren bindet, bestimmt wird, wird das
Binden des markierten Liganden an den Rezeptor gehemmt wird.
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Weitere
Durchmusterungstest für
erfindungsgemäße Agonisten
und Antagonisten werden in Tartaglia, L.A. und Goeddel, D.V., J.
Biol. Chem. 267(7):4304–4307
(1992) beschrieben.
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Daher
wird in einem weiteren Aspekt ein Durchmusterungsverfahren bereitgestellt
um nachzuweisen, ob ein zur Wahl stehender Agonist oder Antagonist
in der Lage ist eine zelluläre
Antworten gegenüber
einem Liganden der TNF-Familie zu verstärken oder zu hemmen. Das Verfahren
umfasst das Inkontaktbringen von Zellen, die das DR4-Polypeptid
exprimieren, mit einer Kandidaten-Verbindung und einem TNF-Familie-Liganden,
das Testen einer zellulären
Antwort und Vergleichen der zellulären Antwort mit einer Standardzellantwort. Der
Standard wird getestet, in dem der Kontakt mit dem Liganden in Abwesenheit
der Kandidaten-Verbindung erfolgt, wobei eine erhöhte Zellantwort
gegenüber
dem Standard darauf hinweist, dass die Kandidaten-Verbindung ein
Agonist des Ligand/Rezeptor-Signalweges ist und eine verminderte
Zellantwort gegenüber
dem Standard darauf hinweist, dass die zur Wahl stehende Verbindung
ein Antagonist des Ligand/Rezeptor-Signalweges ist. Mit „Testen
einer Zellantwort" ist
das qualitative oder quantitative Messen einer Zellantwort gegenüber einer
zur Wahl stehenden Verbindung und/oder einem TNF-Familie-Liganden gemeint (z.B. Bestimmen
oder Schätzen
einer erhöhten
oder verminderten T-Zellproliferation oder Markierung mit Tritium-markiertem
Thymidin). Bei der Erfindung kann eine Zelle, die das DR4-Polypeptid
exprimiert, entweder mit einem endogenen oder einem exogen verabreichten
TNF-Familie-Liganden in Kontakt gebracht werden.
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Erfindungsgemäße Agonisten
umfassen natürlich
vorkommende und synthetische Verbindungen wie zum Beispiel Peptidfragmente
von Liganden der TNF-Familie, transformierender Wachstumsfaktor,
Neurotransmitter (wie Glutamat, Dopamin, N-Methyl-D-aspartat), Tumorsupressoren
(p53), zytolytische T-Zellen und Antimetaboliten. Zu den bevorzugten
Agonisten gehören
chemotherapeutische Arzneistoffe wie zum Beispiel Cisplatin, Doxorubicin,
Bleomycin, Cytosinarabinosid, Stickstoffsenfgas, Methotrexat und
Vincristin. Andere schließen
Ethanol und Amyloid-Peptid
ein (Science 267:1457–1458
(1995)). Zu den weiter bevorzugten Agonisten gehören polyclonale und monoclonale
Antikörper
gegen das DR4-Polypeptid oder Fragmente davon. Solch agonistischen
Antikörper,
die gegen einen TNF-Familie Rezeptor gerichtet sind, werden in Tartaglia, L.A.,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9292–9296 (1991) und Tartaglia,
L.A. und Goeddel, D.V., J. Biol. Chem. 267(7):4304–4307 (1992)
beschrieben. Siehe auch PCT Anmeldung
WO
94/09137 . Erfindungsgemäße Antagonisten
umfassen natürlich
vorkommende und synthetische Verbindungen wie beispielsweise den CD40-Liganden,
neutrale Aminosäuren,
Zink, Östrogen,
Androgene, virale Gene (wie Adenovirus EIB, Baculovirus p35 und
IAP, Kuhpockenvirus crmA, Epstein-Barr-Virus BHRF1, LMP-1, afrikanisches
Schweinepestvirus LMW5-HL und Herpesvirus yl 34.5), Calpain-Inhibitoren,
Cystein-Proteaseinhibitoren
und Tumorpromotoren (wie PMA, Phenobarbital und Hexachlorcyclohexan).
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Andere
potenzielle Antagonisten umfassen Antisense-Moleküle. Das
Antisense-Verfahren
kann verwendet werden, um die Genexpression durch Antisense-DNA
oder -RNA oder durch Tripelhelix-Bildung zu kontrollieren. Antisense-Verfahren
werden zum Beispiel in Okano, J., Neurochem. 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides
as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton,
FL (1988) erläutert.
Tripelhelix-Bildung wird zum Beispel in Lee et al, Nucleic Acids
Research 6:3073 (1979); Cooney et al., Science 241:456 (1988) und
Dervan et al., Science 251:1360 (1991) erläutert. Die Verfahren basieren
auf dem Binden eines Polynucleotids an eine komplementäre DNA oder
RNA.
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Zum
Beispiel kann der 5'-codierende
Teil eines Polynucleotids, welches das reife, erfindungsgemäße Polypeptid
codiert verwendet werden, um ein Antisense-RNA- Oligonucleotid von etwa 10 bis 40 Basenpaaren Länge zu entwerfen.
Ein DNA-Oligonucleotid
wird entworfen, das komplementär
ist zu einer Region des Gens, die an der Transkription beteiligt
ist, und daher die Transkription und die Herstellung des Rezeptors
verhindert. Das Antisense-RNA-Oligonucleotid hybridisiert in vivo
mit der mRNA und blockiert die Translation der mRNA-Moleküle in Rezeptor-Polypeptide.
Die vorstehend beschriebenen Oligonucleotide können auch an Zellen abgegeben
werden, so dass die Antisense-RNA oder -DNA in vivo exprimiert werden
kann, damit die Herstellung des Rezeptors gehemmt wird.
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Weitere
erfindungsgemäße Antagonisten
schließen
lösliche
Formen von DR4, d.h. DR4-Fragmente, welche die Ligandenbindungsdomäne der extrazellulären Region
des Volllängen-Rezeptors
enthalten, ein. Solch lösliche
Formen des Rezeptors, die natürlich
vorkommend oder synthetisch sein können, wirken der DR4-vermittelten
Signalgebung, durch das Konkurrieren mit dem Zelloberflächen-DR4
um die Bindung an TNF-Familie-Liganden, entgegen. Daher stellen
lösliche
Formen des Rezeptors, die die Ligandenbindungsdomäne enthalten,
neue Cytokine dar, die in der Lage sind die TNF-Familie-Liganden-induzierte
Apoptose zu hemmen. Diese werden vorzugsweise als Dimere oder Trimer
exprimiert, da diese den monomeren Formen des löslichen Rezeptors als Antagonisten überlegen
sind, z.B. IgGFc-TNF-Rezeptor Familie-Fusionsproteine. Andere solche
Cytokine sind auf dem Fachgebiet bekannt, dazu gehört Fas B
(eine lösliche
Form des Maus Fas-Rezeptors), welches physiologisch die Fas-Ligand-induzierte
Apoptose einschränkt
(Hughes, D.P. und Crispe, I.N., J. Exp. Med. 182:1395–1401 (1995)).
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Die
in Beispiel 5 dargelegten Versuche zeigen, dass DR4 ein „Death-Domain"-enthaltendes Molekül ist, das in der Lage ist
Apoptose auszulösen,
was wichtig ist bei der Regulation des Immunsystems. Zusätzlich zeigen
die nachstehenden Versuche, dass die DR4-induzierte Apoptose durch
Inhibitoren der ICE-ähnlichen Proteasen,
CrmA und z-VAD-fmk, blockiert wurde. Daher können auch Inhibitoren der ICE-ähnlichen
Proteasen, FADD-DN und FLICS-DN/MACHaIC360S, als Antagonisten der
DR4-Aktivtät
verwendet werden.
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Der
Begriff „Antikörper" (Ab) oder „monoclonaler
Antikörper" (mAb) wie hier verwendet,
schließt
intakte Moleküle
genauso wie Fragmente davon (wie zum Beispiel Fab- und F(ab')2-Fragmente),
die in der Lage sind ein Antigen zu binden, ein. Fab- und F(ab')2-Fragmenten
fehlt das Fc-Fragment des intakten Antikörpers, werden schneller aus
dem Kreislauf entfernt und können
weniger unspezifische Gewebebindung als ein intakter Antikörper aufweisen
(Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316–325 (1983)).
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Erfindungsgemäße Antikörper können durch
jedes beliebige Verfahren unter Verwendung von erfindungsgemäßen DR4-Immunogenen
hergestellt werden. Wie angedeutet umfassen solche DR4-Immunogene das
Volllängen–DR4-qPolypeptide
(das die Leadersequenz enthalten kann oder nicht) und DR4-Plypeptidfragmente
wie die Ligandenbindungsdomäne,
die Transmembrandomäne,
die intrazelluläre
Domäne
und die „Death-Domain".
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Proteine
und andere Verbindungen, die an die DR4-Domänen binden, sind ebenfalls
erfindungsgemäße Kandidaten-Agonisten
und -Antagonisten. Solche bindenden Verbindungen können „eingefangen" werden unter Verwendung
des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems
(Fields and Song, Nature 340:245–246 (1989)). Eine abgewandelte
Ausführungsform
des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems ist von Roger Brent und seinen Kollegen
beschrieben worden (Gyuris. J. et al., Cell 75:791–803 (1993);
Zervos, A.S. et al., Cell 72:223–232 (1993)). Vorzugsweise
ist das Hefe-Zwei-Hybrid-System gemäß der vorliegenden Erfindung
verwendet worden, um Verbindungen, die entweder an die DR4-Ligandenbindungsdomäne oder
an die DR4-intrazelluläre
Domäne
binden, einzufangen. Solche Verbindungen stellen gute, erfindungsgemäße Kandidaten-Agonisten
und -Antagonisten dar.
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Mit
einem „TNF-Familie-Liganden" sind natürlich vorkommende,
rekombinante und synthetische Liganden gemeint, die in der Lage
sind an ein Mitglied der TNF-Rezeptor-Familie
zu binden und den Ligand/Rezeptor-Signalweg zu induzieren. Zu den
Mitgliedern der TNF-Ligand Familie gehören ohne darauf beschränkt zu sein
DR4-Liganden einschließlich
TRAIL, TNF-α,
Lymphotoxin-α (LT-α, auch bekannt
als TNF-β),
LT-β (gefunden
im heterotrimeren Komplex LT-α2-β), FasL,
CD40, CD27, CD30, 4-1BB, OX40 und der Nervenwachstumsfaktor (NGF).
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Repräsentative
therapeutische Anwendungen der vorliegenden Erfindung werden nachstehend
genauer erläutert.
Das Stadium der Immundefizienz, die AIDS definiert, ist zweitrangig
hinsichtlich der Verminderung der Anzahl und Funktion von CD4+ T-Lymphozyten.
Neueste Veröffentlichungen
schätzen,
dass der tägliche
Verlust von CD4+ T-Zellen zwischen 3,5 × 107 und 2 × 109 Zellen liegt (Wei X. et al., Nature 373:117–122 (1995)).
Eine Ursache für
die CD4+ T-Zellen-Verarmung bei der Festsetzung
einer HIV-Infektion ist vermutlich die HIV-induzierte Apoptose.
Tatsächlich
ist der HIV-induzierte apoptotische Zelltod nicht nur in vitro,
sondern auch, viel wichtiger, in infizierten Personen gezeigt worden
(Ameisen, J.C.; AIDS 8:1197–1213
(1994); Finkel, T.H. und Banda, N.K., Curr. Opin. Immunol. 6:605–615 (1995);
Muro-Cacho, C.A. et al., J. Immunol. 154:5555–5566 (1995)). Des Weiteren
ist die Apoptose und die Verarmung an CD4+T-Zellen
in verschiedenen Tiermodellen von AIDS eng korreliert (Brunner,
T., et al., Nature 373:441–444
(1995); Gougeon, M.L., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 9:553–563 (1993))
und die Apoptose wird in solchen Tiermodellen, bei denen die Virusreplikation
nicht zu AIDS führt,
nicht beobachtet (Gougeon, M.L., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 9:553–563 (1993)).
Weitere Daten weisen darauf hin, dass nicht-infizierte aber geprimte
oder aktivierte T-Lymphozyten von HIV-infizierten Personen nach
dem Zusammentreffen mit dem TNF-Familie-Liganden Fas L die Apoptose
durchlaufen. Unter Verwendung von monozytischen Zelllinen, die nach
einer HIV-Infektion absterben, ist gezeigt worden, dass die Infektion
von U937-Zellen mit HIV in der de novo-Expression von FasL endet und
dass FasL die HIV-induzierte Apoptose vermittelt (Badely, A.D. et
al., J. Virol. 70:199–206
(1996)). Ferner wurde der Ligand der TNF-Familie in nicht-infizierten Makrophagen
nachgewiesen und seiner Expression wurde nach der Infektion mit
HIV hochreguliert, was das selektiven Töten von nicht-infizierten CD4-T-Lymphozyten zur Folge
hatte (Badley, A.D. et al., J. Virol. 70:199–206 (1996)). Daher wird mit
der Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von HIV+-Personen
geliefert, das die Verabreichung eines erfindungsgemäßen Antagonisten umfasst,
um das selektive Abtöten
von CD4-T-Lymphocyten zu senken. Art und Weise der Verabreichung
und die Dosierungen werden nachstehend genauer erläutert.
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Bei
der Abstoßung
eines Allotransplantats ist das Immunsystem des Empfängertiers
vorher nicht für eine
Antwort geprimt worden, da das Immunsystem zum größten Teil
nur durch Umweltantigene sensibilisiert wird. Gewebe von anderen
Mitgliedern der gleichen Art sind nicht in der gleiche Weise präsentiert
worden, in der zum Beispiel Viren und Bakterien präsentiert
worden sind. Im Fall der Allotransplantatabstoßung werden immunsuppressive
Vorgaben entwickelt, um zu verhindern, dass das Immunsystem das
Effektorstadium erreicht. Jedoch kann das Immunprofil der Xenotransplantatabstoßung mehr
einem Krankheitsrückfall
gleichen als die Allotransplantatabstoßung. Im Fall des Krankheitsrückfalls
ist das Immunsystem bereits aktiviert worden wie durch die Zerstörung der
nativen Inselzellen bewiesen. Daher ist bei einem Krankheitsrückfall das
Immunsystem ohnehin im Effektorstadium. Erfindungsgemäße Agonisten
sind in der Lage die Immunantwort sowohl gegenüber den Allotransplantaten
als auch den Xenotransplantaten zu unterdrücken, da die aktivierten und
in Effektorzellen differenzierten Lymphocyten das DR4-Polypeptid
exprimieren werden und dabei empfänglich sind für Verbindungen,
die die Apoptose verstärken.
Daher liefert die vorliegende Erfindung des Weiteren ein Verfahren
zur Herstellung immunprivilegierter Gewebe. Erfindungsgemäße Antagonisten
können
ferner bei der Behandlung der chronisch entzündlichen Darmerkrankung verwendet
werden.
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DR4-Antagonsiten
können
nützlich
sein bei der Behandlung von entzündlichen
Erkrankungen wie rheumatoider Arthritis, Osteoarthritis, Psoriasis,
Septikämie
und chronisch entzündlicher
Darmerkrankung.
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Außerdem können, wegen
der Expression von DR4 in Lymphoblasten, lösliches DR4, Agonisten- oder Antagonisten-mABs
verwendet werden, um diese Form des Krebs zu behandeln. Des Weiteren
kann lösliches DR4
oder neutralisierende mABs verwendet werden, um verschiedene chronische
und akute Formen einer Entzündung
wie rheumatoider Arthritis, Osteoarthritis, Psoriasis, Septikämie und
chronisch entzündlicher Darmerkrankung
zu behandeln.
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Form der Verabreichung
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Die
hierin beschriebenen Agonisten oder Antagonisten können in
vitro, ex vivo oder in vivo an Zellen, die den erfindungsgemäßen Rezeptor
exprimieren, verabreicht werden. Mit Verabreichung einer „wirksamen Menge" eines Agonisten
oder Antagonisten ist eine Menge einer Verbindung gemeint, die ausreicht,
um die zelluläre
Antwort auf einen TNF-Familie-Liganden zu verstärken oder zu hemmen, dazu gehören auch
Peptide. Insbesondere ist mit Verabreichung einer „wirksamen
Menge" eines Agonisten
oder Antagonisten eine Menge gemeint, die wirksam ist, um die DR4-vermittelte
Apoptose zu verstärken
oder zu hemmen. Natürlich kann,
wenn die Apoptose verstärkt
werden muss, ein erfindungsgemäßer Agonist
mit einem TNF-Familie-Liganden
gemeinsam verabreicht werden. Ein durchschnittlicher Fachmann wird
verstehen, dass wirksame Mengen eines Agonisten oder Antagonisten
empirisch bestimmt werden können
und in reiner Form oder in Form eines pharmazeutisch verträglichen
Salzes, Esters oder einer Prodrug eingesetzt werden können. Der Agonist
oder Antagonist kann in Zusammensetzungen in Verbindung mit einem
oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Exzipienten verabreicht
werden.
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Es
versteht sich, dass bei der Verabreichung an einen menschlichen
Patienten der Gesamttagesbedarf der erfindungsgemäßen Verbindungen
und Zusammensetzungen von dem behandelndem Arzt, innerhalb des Rahmens
einer korrekten medizinischen Beurteilung, festgelegt wird. Die
spezifische therapeutisch wirksame Dosismenge für einen bestimmten Patienten
wird von Faktoren abhängen,
die auf dem medizinischen Fachgebiet bekannt sind.
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Als
ein allgemeiner Vorschlag wird die gesamte pharmazeutisch wirksame
Menge des parenteral verabreichten DR4-Polypeptids im Bereich von
etwa 1 μg/kg/Tag
bis 10 mg/kg/Tag des Patienten-Körpergewichts liegen,
obwohl dies wie vorstehend angemerkt Sache des therapeutischen Ermessens
ist. Stärker
bevorzugt liegt diese Dosis bei mindestens 0,01 mg/kg/Tag und für Menschen
am meisten bevorzugt zwischen etwa 0,01 und 1 mg/kg/Tag für das Hormon.
Bei fortlaufender Gabe wird der DR4-Agonist oder -Antagonist üblicherweise in
einer Dosisrate von etwa 1 μg/kg/Stunde
bis etwa 50 μg/kg/Stunde
verabreicht, entweder durch 1–4
Injektionen pro Tag oder durch fortlaufende subkutane Infusionen,
zum Beispiel unter Verwendung einer Minipumpe. Eine intravenöse Beutellösung kann
auch eingesetzt werden.
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Die
Dosierung kann auch in einer Patienten-spezifischen Art und Weise
eingestellt werden, um eine vorbestimmte Konzentration eines Agonisten
oder Antagonisten im Blut bereit zu stellen wie mittels RIA-Verfahren
bestimmt. Somit kann eine Patientendosierung im Bereich von 50 bis
1000 ng/ml, vorzugsweise 150 bis 500 ng/ml, eingestellt werden,
um regelmäßige andauernde
Minimalblutspiegel wie mittels RIA gemessen, zu erreichen.
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Arzneimittel
werden bereitgestellt, die einen Agonisten oder Antagonisten und
einen pharmazeutisch geeigneten Träger- oder Hilfsstoff enthalten,
der oral, rektal, parenteral, intrazisternal, intravaginal, intraperitoneal,
lokal (wie durch Puder, Salben, Tropfen oder transdermale Pflaster), über die
Wange oder als orales oder nasales Spray verabreicht werden können. Dabei
ist von Bedeutung, dass bei der gemeinsamen Verabreichung eines
Agonisten und eines TNF-Familie-Liganden klinische Nebenwirkungen
durch die Verwendung von geringeren Dosen sowohl des Liganden als
auch des Agonisten gesenkt werden können. Es versteht sich, dass
der Agonist entweder vor, nach oder gleichzeitig mit dem TNF-Familie-Liganden
gemeinsam verabreicht werden kann, abhängig von den Anforderungen
einer bestimmten therapeutischen Anwendung. Mit „pharmazeutisch verträglicher
Trägerstoff" ist ein nicht-toxischer,
fester, halbfester oder flüssiger
Füllstoff,
Verdünnungsmittel,
Verkapselungsmaterial oder eine jeden Typ unterstützende Zubereitung
gemeint. Der Begriff „parenteral" wie er hierin verwendet
wird bezieht sich auf Verabreichungsarten und umfasst: intravenös, intramuskulär, intraperitoneal,
intrasternal, subkutan und intraartikuläre Injektion oder Infusionen.
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Erfindungsgemäße Arzneimittel
für die
parenterale Injektion können
pharmazeutisch geeignete, sterile wässrige oder nicht-wässrige Lösungen,
Dispersionen, Suspensionen oder Emulsionen sein, genauso wie sterile
Puder für
die Rekonstitution in sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen kurz
vor der Verwendung.
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Zusätzlich zu
den löslichen
DR4-Polypeptiden, können
auch DR4-Polypeptide, die die Transmembranregion enthalten, verwendet
werden, wenn sie durch die Zugabe von Detergens wie CHAPS oder NP-40 mit
Puffer sachgemäß gelöst werden.
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BEISPIEL 1: Expression und Aufreinigung
in E.coli
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Die
DNA-Sequenz, die das reife DR4-Protein in dem hinterlegten cDNA-Clon
(ATCC Nr. 97853) codiert, wird unter Verwendung von PCR-Oligonucleotid-Primern,
die spezifisch sind für
die amino-terminalen Sequenzen des DR4-Proteins und für die Vektor-Sequenzen
3' des Gens, amplifiziert.
Zusätzliche
Nucleotide, die Restriktionsschnittstellen enthalten, um das Clonieren
zu erleichtern, werden an die 5'-
beziehungsweise 3'-Sequenzen
hinzugefügt.
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Die
folgenden Primer sind für
die Expression der extrazellulären
Domäne
von DR4 in E.coli verwendet worden: 5'-Primer 5'-GCGGCATGCATGATCAATCAATTGGCAC-3' (SEQ ID NO:8) enthält die unterstrichene SphI-Schnittstelle,
3'-Primer 5'-GCGAAGCTTTCAATTATGTCCATTGCCTG-3' (SEQ ID NO:9) enthält die unterstrichene
HindiIII-Schnittstelle. Der Vektor ist pQE60.
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Die
Restriktionsschnittstellen passen zu den Restriktionsenzymschnittstellen
des bakteriellen Expressionsvektors pQE60, die für die bakterielle Expression
in diesen Beispielen verwendet werden (Quiagen, Inc. 9259 Eton Avenue,
Chatsworth, CA, 91311). pQE60 codiert eine Ampicillin-Antibiotikaresistenz
(„Ampr")
und enthält
einen bakteriellen Replikationsursprung („ori"), einen IPTG-induzierbaren Promotor
und eine Ribosomenbindungsstelle („RBS").
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Die
amplifizierte DR4-DNA und der Vektor pQE60 werden mit SphI und HindiIII
gespalten und die gespaltenen DNAs werden dann zusammenligiert.
Das Einbringen der DDCR-Protein-DNA in den gespaltenen pQE60-Vektor
platziert die DR4-Protein-codierende
Region stromabwärts
und verbindet sie funktionell mit dem IPTG-induzierbaren Promotor des Vektors sowie
im richtigen Leseraster mit einem Start-AUG, das passend für die Translation des DR4-Proteins
positioniert ist.
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Das
Ligationsgemisch wird unter Verwendung von Standardverfahren in
kompetente E.coli-Zellen transformiert. Solche Verfahren werden
in Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laborstory Manual, 2. Ausg., Cold
Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)
beschrieben. Der E.coli Stamm M15/rep4, der vielfache Kopien des
Plasmids pREP4 enthält,
das den lac-Repressor exprimiert und Kanamycin-Resitstenz („Kanr")
verleiht, wird bei der Durchführung
des veranschaulichenden, hierin beschriebenen Beispiels verwendet.
Dieser Stamm, der nur einer von vielen ist, der für die Expression
des DR4-Proteins geeignete ist, ist im Handel von Quiagen zu beziehen.
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Transformanten
werden über
ihre Fähigkeit
in Anwesenheit von Ampicillin und Kanamycin auf LB-Platten zu wachsen
identifiziert. Plasmid-DNA wird von resistenten Kolonien isoliert
und die Identität
der clonierten DNA mittels Restriktionsanalyse bestätigt.
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Klone,
die das gewünschte
Konstrukt enthalten werden über
Nacht („O/N") in Flüssigkultur
mit LB-Medium, das sowohl mit Ampicillin (100 μg/ml) als auch mit Kanamycin
(25 μg/ml)
ergänzt
wurde, gezüchtet.
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Die
O/N-Kultur wird verwendet, um eine große Kultur zu beimpfen, in einer
Verdünnung
von ungefähr 1:100
bis 1:250. Die Zellen werden bei 600 nm („OD600") bis zu einer optischen Dicht von 0,4
bis 0,6 gezüchtet.
Isopropyl-B-D-thiogalactopyranosid
(„IPTG") wird dann in einer
Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt, um die Transkription von
lac-Repressor-sensitiven Promotoren, durch Inaktivierung des lacI-Repressors,
zu induzieren. Die Zellen werden anschließend für die Dauer von 3 bis 4 Stunden
weiter inkubiert. Dann werden die Zellen mittels Standard verfahren
durch Zentrifugation geerntet und aufgeschlossen. Einschlusskörperchen werden
aus den aufgeschossenen Zellen mittels Routine-Sammelverfahren aufgereinigt und Proteine
werden aus den Einschlusskörperchen
in 8 M Harnstoff gelöst.
Die 8 M Harnstoff-Lösung,
die das gelösten
Protein enthält,
wird in 2 × Phosphat-gepufferter
Salzlösung
(„PBS") über eine
PD-10 Säule
laufen lassen, wobei der Harnstoff entfernt, der Puffer ausgetauscht
und das Protein rückgefaltet
wird. Durch einen weiteren Chromatographie-Schritt wird das Protein
gereinigt, um das Endotoxin zu entfernen. Dann wird es Sterilfiltriert.
Die sterilfiltrierte Proteinaufbereitung wird in 2 × PBS in
einer Konzentration von 95 μ/ml
aufbewahrt.
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BEISPIEL 2: Expression in Säugerzellen
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Die
meisten Vektoren, die für
die vorübergehende
Expression einer gegebenen Gensequenz in Säugerzellen verwendet werden,
tragen den SV40-Replikationsursprung.
Dies erlaubt die Replikation des Vektors in einer hohen Kopienzahl
in Zellen (z.B. COS-Zellen), die das T-Antigen exprimern, das für den Start
der viralen DNA-Synthese erforderlich ist. Jede andere Säugerzelllinie
kann ebenfalls für
diesen Zweck verwendet werden.
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Ein
typischer Säuger-Expressionsvektor
enthält
das Promotorelement, welches den Transkriptionsstart der mRNA vermittelt,
die Protein-kodierende Sequenz und Signale, die für die Termination
der Transkription und die Polyadenylierung des Transkripts erforderlich
sind. Zusätzliche
Elemente umfassen Enhancer, Kozak-Sequenzen und Intron-Sequenzen, die
von Donor- und Akzeptorstellen für
das Spleißen
der RNA flankiert werden. Eine hoch effiziente Transkription kann
erreicht werden mit den frühen
und späten
Promotoren von SV40, den langen terminalen Wiederholungen (LTR,
engl.: long terminal repeats) der Retroviren, z.B. RSV, HTLVI, HIVI
und dem frühen
Promotor des Cytomegalievirus (CMV). Allerdings können auch
zelluläre
Signale (z.B. menschliches Actin, Promotor) verwendet werden. Zu
den geeignete Expressionsvektoren für die Durchführung der
Erfindung gehören
zum Beispiel Verkoren wie pSVL und pMSG (Phramacia, Uppsla, Schweden), pRSVcat
(ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) und pBC12MI (ATCC 67109). Zu
den Säugerwirtszellen,
die verwendet werden können,
gehören:
menschliche Hela-, 283-, H9- und Jurkat-Zellen, Maus NIH3T3- und C127-Zellen,
Cos 1-, Cos 7- und CV1- Afrikanische
Grüne Meerkatzen
Zellen, Wachtel QC1-3-Zellen, Maus L-Zellen, Ovarialzellen des Chinesischen
Hamsters wie Wahlweise kann ein Gen von Interesse in stabilen Zelllinien
exprimiert werden, die das Gen in ein Chromosom eingebaut haben.
Die Co-Transfektion eines selektierbaren Markers wie dhfr, gpt,
Neomycin oder Hygromycin erlaubt die Identifizierung und Isolierung
der transfizierten Zellen.
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Das
transfizierte Gen kann auch amplifiziert werden, um große Mengen
des codierten Proteins zu exprimieren. Die DHFR (Dihydrofolat-Reduktase)
ist ein nützlicher
Marker, um Zelllinien herzustellen, die mehrere Hundert oder sogar
mehrere Tausend Kopien des Gens von Interesse tagen. Bei der Verwendung
dieses Markers wachsen die Zellen für die Selektion in steigenden
Mengen von Methotrexat und die Zellen, mit der höchsten Resistenz werden selektiert.
Diese Zelllinien enthalten das/die amplifizierte/n Gen/e in ein
Chromosom eingebaut. Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters (CHO)
werden häufig
für die
Herstellung von Proteinen verwendet.
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Die
Expressionsvektoren pCl und pC4 enthalten den starken Promotor (LTR)
des Rous Sarcoma Virus (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology
438:44701 (März
1985)), zuzüglich
ein Fragment des CMV-Enhancers (Boshart et al., Cell 41:521–530 (1985)).
Multiple Clonierungsstellen z.B. mit den Restriktionsenzymschnittstellen
BamHI, XbaI und Asp718 erleichtert die Clonierung des Gens von Interesse.
Die Vektoren enthalten zusätzlich
das 3'-Intron, das
Polyadenylierungs- und Terminationssignal des Ratten Präproinsulin-Gens.
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Clonierung und Expression
in CHO-Zellen
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Der
Vektor pC4 wird für
die Expression des DR4-Polypeptids verwendet. Das Plasmid pC4 ist
ein Derivat des Plasmids pSV2-dhfr (ATCC Zugangsnr. 37146). Das
Plasmid enthält
das Maus DHFR-Gen unter der Kontrolle des SV40 frühen Promotors.
Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters oder andere Zellen, denen die
Dihydrofolat-Aktivität
fehlt und die mit diesen Plasmiden transfiziert sind können durch
züchten
der Zellen in einem Selektionsmedium (Alpha-minus MEM, Life Technolgies),
ergänzt
mit dem chemotherapeutischen Wirkstoff Methotrexat, selektiert werden.
Die Amplifizierung der DHFR-Gene in Zellen, die resistent gegenüber Methotrexat
(MTX) sind, ist gut dokumentiert worden (siehe, z.B. Alt, F.W.,
Kellems, R.M., Bertino, J.R. und Schimke, R.T., J. Biol. Chem. 253:1357–1370 (1978);
Hamlin, J.L. und Ma, C., Biochem. et Biophys. Acta. 1097:107–143 (1990);
Page, M.J. und Sydenham, M.A., Biotechnology 9:64–68 (1991)).
Zellen, die in steigenden Konzentrationen von MTX wachsen, entwickeln
eine Resistenz gegenüber
dem Arzneistoff. Ursache dafür ist
die Überproduktion
des Zielenzyms DHFR, als Folge der Amplifizierung des DHFR-Gens.
Wird ein zweites Gen mit dem DHFR-Gen verbunden, wird es gewöhnlich co-amplifiziert
und überexprimiert.
Auf dem Fachgebiet ist bekannt, dass diese Verfahrensweise verwendet
werden kann, um Zelllinien zu entwickeln, die mehr als 1000 Kopien
der amplifizierten Gene tragen. Anschließend, wenn das Methotrexat
entzogen wird, werden Zelllinien erhalten, die das amplifizierte
Gen in einem oder mehreren Chromosomen der Wirtszelle eingebaut haben.
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Das
Plasmid pC4 enthält
für die
Expression des Gens von Interesse den starken Promotor der langen terminalen
Wiederholung (LTR) des Rous Sarcoma Virus (Cullen et al., Molecular
and Cellular Biology 438–447
(März 1985))
zuzüglich
ein Fragment, welches aus dem Enhancer des sofort-frühen Promotors
des menschlichen Cytomegalievirus (CMV) isoliert wurden (Boshart
et al., Cell 41:521–530
(1985)). Stromabwärts des
Promotors befinden sich die folgenden einzelnen Restriktionsenzymschnittstellen,
die den Einbau des Gens erlauben: BamHI, XbaI und Asp718. Hinter
diesen Clonierungsstellen enthält
das Plasmid das 3'-Intron und
die Polyadenylierungsstelle des Ratten Präproinsulin-Gens. Andere hoch
effiziente Promotoren können ebenso
für die
Expression verwendet werden, z.B. der menschliche β-Actin-Promotor,
der SV40 frühe
oder späte
Promotor oder die langen terminalen Wiederholungen von anderen Retroviren,
z.B. HIV und HTLVI. Das Clontech Tet-Aus und Tet-An Genexpressionssystem
und ähnliche
Systeme könne
verwendet werden, um das DR4-Polypeptid auf regulierte Art und Weise
in Säugerzellen
zu exprimieren (Gossen, M. & Bujard,
H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547–5551 (1992)). Für die Polyadenylierung
der mRNA können
genauso andere Signale, z.B. vom menschlichen Wachstumshormon oder
den Globin-Genen, verwendet werden. Stabile Zelllinien, die ein
Gen von Interesse in die Chromosomen eingebaut tragen können auch
selektiert werden über
die Co-Transfektion von Selektionsmarkern wie gpt, G418 oder Hygromycin.
Es ist von Vorteil, zu Beginn mehr als einen Selektionsmarker zu
verwenden, z.B. G418 plus Methotrexat.
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Das
Plasmid pC4 wird mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten und dann
mittels auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren unter Verwendung
von Kälberdarm
Phosphatasen dephosphoryliert. Der Vektor wird dann aus einem 1%igen
Agarosegel isoliert.
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Die
DNA-Sequenz, die das vollständige
Polypeptid codiert wird, unter Verwendung von PCR-Oligonucleotid-Primern,
die mit den 5'-
und 3'-Sequenzen
des gewünschten
Genabschnitts korrespondieren, amplifiziert. Der 5'-Primer, der die
unterstrichene BamHI-Schnittstelle, eine Kozak-Sequenz und ein AUG-Start-Codon
enthält,
weist folgende Sequenz auf:
5'-GCGGGATCCGCCATCATGGCGCCACCACCAGCTAGA-3' (SEQ ID NO:10)
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Der
3'-Primer, der die
unterstrichene BamHI-Schnittstelle enthält, weist folgende Sequenz
auf:
5'-GCGGGATCCTCACTCCAAGGACACGGCAGAGCC-3' (SEQ ID NO:11).
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Das
amplifizierte Fragment wird mit der Endonuclease BamHI gespalten
und dann noch mal auf einem 1%igen Agarosegel aufgereinigt. Das
isolierte Fragment und der dephosphorylierte Vektor werden dann
mit T4-DNA-Ligase ligiert. E.coli HB101- oder XL-1 Blue-Zellen werden
dann transformiert und Bakterien, die das Fragment in das Plasmid
pC4 eingebaut haben werden unter Verwendung von zum Beispiel mittels
Restriktionsenzymanalyse identifiziert.
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Ovarialzellen
des Chinesischen Hamsters, denen ein aktives DHFR-Gen fehlt, werden
für die
Transfektion verwendet. Fünf μg des Expressionsplasmids
pC4 werden mit 0,5 μg
des Plasmids pSV-neo unter Verwendung von Lipofectin co-transfiziert (Felgner
et al., vorstehend). Das Plasmid pSV2-neo enthält einen dominanten Selektionsmarker:
das neo-Gen von Tn5, das ein Enzym codiert, welches Resistenz gegenüber einer
Gruppe von Antibiotika, einschließlich G418, verleiht. Die Zellen
werden in Alpha-minus MEM, ergänzt
mit 1 mg/ml G418, ausgesät.
Nach 2 Tagen werden die Zellen trypsiniert und in Hybridoma-Clonierungsplatten (Greiner,
Deutschland) in Alpha-minus MEM, ergänzt mit 10, 25 oder 50 ng/ml
Methotrexat plus 1 mg/ml G418, ausgesät. Nach etwa 10–14 Tagen
werden einzelne Clone trypsiniert und dann in 6-Loch Petrischalen
oder 10 ml Flaschen unter Verwendung von verschiedenen Konzentrationen
von Methotrexat (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM) ausgesät. Clone,
die bei den höchsten
Konzentrationen Methotrexat wachsen, werden dann in neue 6-Loch
Platten überführt, die
sogar noch höhere
Methotrexat-Konzentrationen enthalten (1 μM, 2 μM, 5 μM, 10 mM, 20 mM). Das gleiche
Verfahren wird wiederholt bis Clone erhalten werden, die bei einer
Konzentration von 100–200 μM wachsen.
Die Expression des gewünschten
Genprodukts wird zum Beispiel mittels SDS-PAGE und Western-Blot
oder durch HPLC mit umgekehrten Phasen analysiert.
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BEISPIEL 3: Clonierung und Expression
der extrazellulären
Domäne
von DR4 in einem Baculovirus-Expressionssystem
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Die
cDNA-Sequenz, die die lösliche
extrazelluläre
Domäne
des DR4-Proteins in dem hinterlegten Clon (ATCC Nr. 97853) codiert,
wird unter Verwendung von PCR-Oligonucleotid-Primern,
die mit den 5'-
und 3'-Sequenzen
des Gens korrespondieren, amplifiziert. Der 5'-Primer für DR4 weist die Sequenz 5'-GCGGGATCCGCCATCATGGCGCCACCACCAGCTAGA-3' (SEQ ID NO:10) auf
und enthält
die unterstrichene BamHI Restriktionsenzymschnittstelle. Eingebaut
in einen Expressionsvektor wie nachstehend beschrieben, liefert
das 5'-Ende des
amplifizierten, DR4-codierenden Fragments ein effizient gespaltenes
Signalpeptid. Ein wirksames Signal für den Start der Translation
in eukaryontischen Zellen wie von Kozak, M., J. Mol. Biol. 196:947–950 (1987)
beschrieben, liegt passend im Vektoranteil des Konstrukts. Der 3'-Primer für beide
DR4 hat die Sequenz 5'-GCGGGATCCTCAATTATGTCCATTGCCTG-3' (SEQ ID NO:12) und
enthält
die unterstrichene BamHI Restriktionsschnittstelle, gefolgt von
Nucleotiden, die komplementär
zu der in 1 dargelegten DR4-Nucleotidsequenz
sind, gefolgt vom Stop-Codon.
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Das
amplifizierte Fragment wird aus einem 1%igen Agarosegel unter Verwendung
eines im Handel erhältlichen
Kit („Geneclean", BIO 101 Inc., La
Jolla, CA) isoliert. Dann wird das Fragment mit BamHI und Asp718
gespalten und erneut auf einem 1%igen Agarosegel aufgereinigt.
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Der
Vektor pA2 wird verwendet, um das DR4-Protein unter Verwendung von
Standardverfahren wie jene, die in Summers et al., A Manual of Methods
for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas
Agricultural Experimental Station Bulletin Nr. 1555 (1987) beschrieben,
im Baculovirus-Expressionssystem
zu exprimieren.
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Dieser
Expressionsvektor enthält
den starken Polyhedrin-Promotor des Autographs californica Nuclear
Polydedrosis Virus (ACMNPV), gefolgt von geeigneten Restriktionsschnittstellen.
Für eine
einfache Selektion der rekombinanten Viren wird das Beta-Galactosidase-Gen
von E.coli in der gleichen Orientierung wie der Polyhedrin-Promotor
eingebaut, gefolgt von dem Polyadenylierungssignal des Polyhedrin-Gens.
Die Polyhedrin-Sequenzen werden an beiden Seiten flankiert von viralen
Sequenzen für
die Zell-vermittelte homologe Rekombination mit der viralen Wildtyp-DNA,
um lebensfähige
Viren, die das clonierte Polynucleotid exprimieren, herzustellen.
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Viele
andere Baculovirusvektoren können
an Stelle von pA2 verwendet werden wie beispielsweise die vorgesehenen
pAc373, pVL941 und pAclM 1. Sie liefern für die Herstellung wie der Fachmann
begrüßen wird, entsprechend
lokalisierte Signale für
die Transkription, Translation, den Transport und Ähnliches,
wie beispielsweise ein AUG im richtigen Leseraster und bei Bedarf
ein Signalpeptid. Solche Vektoren werden unter anderen in Luckow
et al., Virology 170:31–39
beschrieben. Mittels auf dem Fachgebiet bekannter Routine-Verfahren
wird das Plasmid mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten und dann
unter Verwendung von Kälberdarm
Phosphatase dephosphoryliert. Die DNA wird dann aus einem 1%igen
Agarosegel unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kit („Geneclean", BIO 101 Inc., La
Jolla, CA) isoliert.
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Das
Fragment und das dephosphorylierte Plasmid werden mit T4-DNA-Ligase
zusammenligiert. E.coli HB101-Zellen werden mit dem Ligationsgemisch
transformiert und auf Kulturplatten verteilt. Bakterien, die das Plasmid
mit dem menschlichen DDCR-Gen enthalten, werden identifiziert, indem
die DNA einzelner Kolonien mittels BamHI gespalten und dann das
gespaltene Produkt mittels Gelelektrophorese analysiert wird. Die
Sequenz des clonierten Fragments wird durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Dieses
Plasmid wird hierin mit pBac DR4 bezeichnet. Unter Verwendung des
Lipofectin-Verfahrens, beschrieben von Felgner et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84:7413–7417
(1987), werden 5 μg
des pBac DR4-Plasmids mit 1,0 μg
im Handel erhältlicher,
linearisierter Baculovirus-DNA ("BaculoGoldTM baculovirus DNA", Pharmingen, San Diego, CA) co-transformiert.
1 μg der
BaculoGoldTM Virus-DNA und 5 μg des pBac
DR4-Plasmids werden in einem Loch einer Mikrotiterplatte, die 50 μl Serum-freies
Grace's Medium (Life
Technologies Inc., Gaithersburg, MD) enthält, gemischt. Danach werden
10 μl Lipofectin
zuzüglich
90 μl Grace's Medium zugegeben,
gemischt und für die
Dauer von 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wird das
Transfektionsgemisch tropfenweise zu den Sf9-Insektenzellen (ATCC
CRL 1711) zugegeben und in einer 35 mm Gewebekulturplatte mit 1
ml Grace's Medium
ohne Serum ausgesät.
Die Platte wird vor- und rückwärtsbewegt,
um die frisch zugegebene Lösung
zu mischen. Die Platte wird dann für die Dauer von 5 Stunden bei
27°C inkubiert.
Nach 5 Stunden wird die Transfektionslösung von der Platte entfernt
und 1 ml Grace's
Insekten-Medium, ergänzt
mit 10% fötalem Kälberserum,
zugegeben. Die Platte wird in den Inkubator zurückgestellt und die Kultivierung
wird für
die Dauer von vier Tagen bei 27°C
fortgeführt.
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Nach
vier Tagen wird der Überstand
gesammelt und ein Plaquetest durchgeführt wie von Summers und Smith,
vorstehend zitiert, beschrieben. Ein Agarosegel mit „Blue Gal" (Life Technologies
Inc., Gaithersburg) wird verwendet, um eine einfache Identifizierung
und Isolierung der Gal-exprimierenden Clone, die blaugefärbte Plaques
erzeugen, zu ermöglichen
(eine genaue Beschreibung eines „Plaque-Tests" diesen Typs kann
auch in der Gebrauchsanweisung für
Insekten-Zellkultur und Baculovirologie, vertrieben von Life Technologies
Inc., Gaithersburg, Seite 9–10,
gefunden werden).
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Vier
Tage nach der Reihenverdünnung
wird das Virus zu den Zellen gegeben. Nach entsprechender Inkubation,
werden blaugefärbte
Plaques mit der Spitze einer Eppendorf-Pipette, gepickt. Der Agar,
der die rekombinanten Viren enthält,
wird dann in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß, welches 200 μl Grace's Medium enthält, resuspendiert.
Der Agar wird durch kurzes Abzentrifugieren entfernt und der rekombinante
Baculovirus-haltige Überstand
wird verwendet, um in 35 mm Platten ausgesäte Sf9-Zellen zu infizieren.
Vier Tage später
werden die Überstände von
diesen Kulturplatten geerntet und dann bei 4°C aufbewahrt. Ein Clon, der
das sauber eingebaute DR4 enthält,
wird mittels DNA-Analyse, einschließlich Restriktionskartierung
und Sequenzierung, identifiziert. Dies wird hierin als V-DR4 bezeichnet.
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Die
Sf9-Zellen werden in Grace's
Medium, ergänzt
mit 10% hitzeinaktiviertem FBS, gezüchtet. Die Zellen werden mit
dem rekombinanten Baculovirus V-DR4 mit einer Infektionsmultiplizität („MOI", engl.: multiplicity of
infection) von etwa 2 (etwa 1 bis etwa 3) infiziert. Sechs Stunden
später
wird das Medium entfernt und durch SF900 II-Medium ohne Methionin und Cystein (erhältlich bei
Life Technologies Inc., Gaithersburg) ersetzt. 42 Stunden später werden
5 gCi 35S-Methionin und 5 μCi 35S-Cystein
(erhältlich
bei Amersham) zugegeben. Die Zellen werden für die Dauer von 16 Stunden
weiter inkubiert. Dann werden sie mittels Zentrifugation geerntet, lysiert
und die markierten Proteine mittels SDS-PAGE und Autoradiographie
sichtbargemacht.
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BEISPIEL 4: Gewebeverteilung der DR4-Expression
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Eine
Northern-Blot-Analyse wird durchgeführt, um die DR4-Gen (ATCC Nr.
97853)-Expression
in humanen Geweben, unter Verwendung von Verfahren die unter anderen
von Sambrook et al., vorstehend zitiert, beschrieben werden, zu
untersuchen. Eine cDNA-Sonde, die die vollständige Nucleotidsequenz des
DR4-Proteins (SEQ
ID NO:1) enthält,
wird mit dem rediprimeTM DNA Markierungssystem
(Amersham Life Science), gemäß den Herstellerangaben,
mit 32P markiert. Nach dem Markieren wird
die Sonde unter einer CHROMA SPIN-100TM-Säule (Clontech
Laborstories, Inc.), gemäß dem Herstellerprotokoll
Nummer PT1200-1, aufgereinigt. Die gereinigte, markierte Sonde wird
dann verwendet, um verschiedene menschliche Gewebe nach DR4-mRNA
zu überprüfen.
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Vielfache
Gewebe Northern-Blots (MTN, engl.: Multiple Tissue Northern), die
verschiedene menschliche Gewebe (H) oder menschliches Immunsystemgewebe
(IM) enthalten, werden von Clontech bezogen und mit der markierten
Sonde mittels ExpressHybTM-Hybridisierungslösung (Clontech),
gemäß dem Herstellerprotokoll
Nummer PT1190-1, untersucht. Nach dem Hybridisieren und Waschen
werden die Blots eingespannt, über
Nach bei –70°C ein Film
exponiert und die Filme gemäß den Standardverfahren
entwickelt. Die Expression von DR4 wurde in Geweben nachgewiesen,
die mit Lymphocyten angereichert waren, einschließlich amniotischen
Zellen, Herz, Leberkrebs, Nieren, Leukocyten des peripheres Bluts,
aktivierte T-Zellen,
K562 plus PMA, W138-Zellen, Th2-Zellen, menschliche Mandeln und
CD34-abgereicherte
Leukocyten- und Thrombocytenschicht (Nabelschnurblut). Es ist vorstellbar,
dass DR4 eine Rolle bei der Lymphocyten-Homöostase spielt.
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BEISPIEL 5: DR4-induzierte Apoptose
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Die Überexpression
von Fas/APO-1 und TNFR-1 in Säugerzellen
ahmt die Rezeptoraktivierung nach (Muzio, M. et al., Cell 85:817–827 (1996),
Boldin, M.P. et al., Cell 85:803–815 (1996)). Daher wurde dieses
System verwendet, um die funktionelle Rolle von DR4 zu untersuchen.
Die vorübergehende
Expression von DR4 in den menschlichen Brustkrebszellen MCF7 und
den menschlichen embryonalen Nierenzellen 293 induziert schnell
die Apoptose.
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Zelltod-Tests
werden im Wesentliche wie vorstehend beschrieben durchgeführt (Chinnaiyan,
A.M. et al., Cell 81:505–12
(1995), Boldin, M.P. et al., J. Biol. Chem. 270:7795–8 (1995),
Kischkel, F.C. et al., EMBO 14, 5579–5588 (1995), Chinnaiyan, A.M.
et al., J. Biol. Chem. 271:4961–4965
(1996)). Kurz, MCF-7, menschliche clonale Brustkrebszelllinien,
die stabil mit entweder dem Vektor allein oder einem CrmA-Expressionskonstrukt
(Tewari, M. et al., J. Biol. Chem. 270:3255–60 (1995)) transfiziert sind,
werden vorübergehend
mit PCMV-DR4-Galactosidase (oder pCMV-DR4-Galactosidase, dem die „Death
Domain" fehlt) in
der Anwesenheit eines zehnfachen Überschusses am pcDNA3-Expressionskonstrukt,
das die angezeigten Proteine codiert, mittels Lipofectamin (GIBCO-BRL)
transfiziert. 293-Zellen werden, unter der Verwendung des CaPO4-Verfahrens, gleichermaßen transfiziert. Der ICE-Familie Inhibitor
z-VAD-fmk (Enzyme Systems Products, Dublin, CA) wird in einer Konzentration
von 10 μM,
5 Stunden nach der Transfektion, zu den Zellen gegeben. 32 Stunden nach
der Transfektion werden die Zellen fixiert und mit X-Gal wie vorstehend
beschrieben gefärbt
(Chinnaiyan, A.M. et al., Cell 81:505–12 (1995), Boldin, M.P. et
al., J. Biol. Chem. 270:7795–8
(1995), Kischkel, F.C. et al., EMBO 14, 5579–5588 (1995).
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Die
Zellen zeigten morphologische Veränderungen, die typisch sind
für Zellen,
die die Apoptose durchlaufen: werden rund, kondensierten und lösten sicht
von der Platte ab. Ähnlich
zu TNFR-1 und Fas/APO-1 (Muzio, M. et al., Cell 85:817–827 (1996);
Boldin, M.P. et al., Cell 85:803–815 (1996), Tewari, M. et
al., J. Biol Chem. 270:3255–60
(1995)) wurde die DR4-induzierte Apoptose durch die Inhibitoren
der ICE-ähnlichen
Proteasen, CrmA und z-VAD-fmk, blockiert.
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Es
ist selbstverständlich,
dass die Erfindung auch auf andere Art als genau in der vorstehenden
Beschreibung und den vorstehenden Beispielen beschriebenen Weise
durchgeführt
werden kann. SEQUENZPROTOKOLL