DE69837806T3

DE69837806T3 - "death-domain"-enthaltender rezeptor 4 (dr4), ein mitglied der tnf-rezeptor superfamilie, welcher an trail (apo-2l) bindet

Info

Publication number: DE69837806T3
Application number: DE69837806T
Authority: DE
Inventors: Reiner Gentz; Jian Ni; Craig Rosen; Vishva Dixit; James Pan
Original assignee: Human Genome Sciences Inc; University of Michigan
Current assignee: Human Genome Sciences Inc; University of Michigan
Priority date: 1997-01-28
Filing date: 1998-01-27
Publication date: 2012-01-05
Anticipated expiration: 2018-01-28
Also published as: US20030073187A1; WO1998032856A1; DK1012274T3; PT1012274E; JP2007326879A; EP1862548A1; JP4450870B2; US20030036168A1; EP1012274B2; US7476384B2; DE69837806D1; US7060272B2; ES2284199T3; ES2284199T5; EP1012274A1; DE69837806T2; EP1012274B1; US20050244857A1; DK1012274T4; JP2001509019A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Mitglied der Tumornekrosefaktor-Familie von Rezeptoren. Genauer werden isolierte Nucleinsäuremoleküle, die den menschlichen „Death Domain”-enthaltenden Rezeptor 4, hier manchmal „DR4” genannt, codieren, bereitgestellt. DR4-Polypeptide werden ebenfalls bereitgestellt, genauso wie Vektoren, Wirtszellen und rekombinante Verfahren zur Herstellung derselben. Die Erfindung betrifft des Weiteren Durchmusterungsverfahren zur Identifizierung von Agonisten und Antagonisten der DR4-Aktivität.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Viele biologische Aktivitäten wie beispielsweise die Antwort auf bestimmte Reize und natürliche biologische Prozesse, werden durch Faktoren wie Cytokine kontrolliert. Viele Cytokine wirken über Rezeptoren indem der Rezeptor aktiviert wird und erzeugen eine intrazelluläre Antwort.
Zum Beispiel sind der Tumornekrosefaktor (TNF) alpha und beta Cytokine, die über TNF-Rezeptoren wirken, um zahlreiche biologische Prozesse zu regulieren, dazu gehören der Schutz vor Infektion und das Einleiten eines Schocks und entzündlicher Erkrankungen. Die TNF-Moleküle gehören zu der „TNF-Ligand”-Superfamilie und wirken zusammen mit ihren Rezeptoren oder Gegen-Liganden, der „TNF-Rezeptor”-Superfamilie. Bis jetzt sind neun Mitglieder der TNF-Ligand-Superfamilie identifiziert und zehn Mitglieder der TNF-Rezeptor-Familie charakterisiert worden.
Unter den Liganden sind TNF-α, Lymphotoxin-α (LT-α, auch bekannt als TNF-β), LT-(im heterotrimeren LT-α2-β Komplex gefunden), FasL, CD40L, CD27L, CD30L, 4-1BBL, OX40L und der Nervenwachstumsfaktor (NGF) eingeschlossen. Die Superfamilie der TNF-Rezeptoren umfasst den p55TNF-Rezeptor, p75TNF-Rezeptor, TNF-Rezeptor-verwandtes Protein, Fas-Antigen oder APO-1, CD40, CD27, CD30, 4-1BB, OX40, gering-affines p75 und NGF-Rezeptor (Meager, A., Biologicals, 22: 291–295 (1994)).
Viele Mitglieder der TNF-Ligand Superfamilie werden von aktivierten T-Zellen exprimiert, was bedeutet, dass sie nötig sind für die T-Zellinteraktionen mit anderen Zelltypen, denen die Zellontogenese und -funktionen unterliegen (Meager, A., vorstehend).
Entscheidende Einblicke in die grundlegenden Funktionen mehrerer Mitglieder der TNF-Rezeptor-Familie sind durch die Identifizierung und Herstellung von Mutanten, bei denen die Expression dieser Proteine aufgehoben ist, gewonnen worden. Zum Beispiel verursachen natürlich vorkommende Mutationen im Fas-Antigen und seinen Liganden lymphoproliferative Erkrankungen (Watanabe-Fukunaga, R., et al., Nature 356: 314 (1992)) und spiegeln vielleicht ein Ausbleiben des programmierten Zelltods wider. Mutationen des CD40-Liganden verursachen einen X-gekoppelte Immundefizienzstatus, der gekennzeichnet ist durch hohe Spiegel an Immunglobulin M und geringe Spiegel an Immunglobulin G im Plasma, was auf eine fehlerhafte T-Zell-abhängige B-Zellaktivierung hinweist (Allen, R. C. et al., Science 259: 990 (1993)). Gezielte Mutationen des gering-affinen Nervenwachstumsfaktor-Rezeptors verursachen eine Erkrankung, die durch eine fehlerhafte sensorische Erneuerung peripherer Strukturen gekennzeichnet ist (Lee, K. F. et al., Cell 69: 737 (1992)). TNF und LT-α sind in der Lage an zwei TNF-Rezeptoren (die 55- und 75-kd TNF-Rezeptoren) zu binden. Eine große Anzahl biologischer Effekte, die von TNF und LT-α ausgelöst werden, wirken über ihre Rezeptoren und umfassen: hämorrhagische Nekrose von transplantierten Tumoren, Cytotoxizität, eine Rolle beim endotoxischen Schock, bei Entzündung, Immunregulation, Proliferation und antiviralen Antworten, genauso wie beim Schutz gegen die schädlichen Wirkungen ionisierender Strahlung. TNF und LT-α sind in die Pathogenese einer weiten Bandbreite von Krankheiten wie endotoxischer Schock, zerebraler Malaria, Tumore, Autoimmunkrankheiten, AIDS und Transplantat/Empfänger-Abstoßung eingebunden (Beutler, B. und Von Huffel, C., Science 264: 667–668 (1994)). Mutationen im p55-Rezeptor verursachen erhöhte Anfälligkeit gegenüber einer mikrobiellen Infektion.
Darüber hinaus wurde eine etwa 80 Aminosäuren-Domäne, nahe des C-Terminus von TNFR1 (p55) und Fas als „Death Domain” veröffentlicht. Sie ist verantwortlich für die Transduktion von Signalen für den programmierten Zelltod (Tartaglia et al., Cell 74: 845 (1993)).
Apoptose, oder der programmierter Zelltod, ist ein physiologischer Prozess, der notwendig ist für die normale Entwicklung und Homöostase vielzelliger Organismen (Steller, H., Science 267: 1445–1449 (1995)). Die Störung der Apoptose trägt zur Pathogenese mehrerer menschlicher Erkrankungen, einschließlich Krebs, neurodegenerativer Erkrankungen und dem erworbenen Immundefizienzsyndrom, bei (Thompson, C. B., Science 267: 1456–1462 (1995)). Kürzlich ist viel Aufmerksamkeit auf die Signaltransduktion und biologische Funktion von zwei Zelloberflächen „Death”-Rezeptoren, Fas/APO-1 und TNFR-1, gerichtet worden (Cleveland, J. L. et al., Cell 81: 479–482 (1995); Fraser, A. et al, Cell 85: 781–784 (1996); Nagata, S. et al., Science 267: 1449–56 (1995)). Beide sind Mitglieder der TNF-Rezeptor-Familie, die ebenso TNFR-2, den gering-affinen NGFR; CD40 und CD30 unter anderen, einschließt (Smith, C. A. et al., Science 248: 1019–23 (1990); Tewari, M. et al., in Modular Texts in Molecular and Cell Biology M. Purton, Heldin, Carl, Hrsg. (Chapman und Hall, London, 1995)). Während die Mitglieder der Familie über die Anwesenheit Cystein-reicher Wiederholungen in ihren extrazellulären Domänen definiert sind, weisen Fas/APO-1 und TNFR-1 eine gemeinsame Region intrazellulärer Homologie auf, treffend als „Death Domain” bezeichnet, die entfernt mit dem Drosophila Suizid-Gen reaper verwandt ist (Golstein, P. et al., Cell 81: 185–6 (1995); White, K. et al., Science 264: 677–83 (1994)). Diese gemeinsame „Death Domain” legt nahe, dass beide Rezeptoren mit einem Set von verwandten Signaltransduktionsmolekülen interagieren, die bis vor kurzem nichtidentifiziert waren. Die Aktivierung von Fas/APO-1 rekrutiert das „ Death Domain”-enthaltende Adaptermolekül FADD/MORT1 (Chinnaiyan, A. M. et al., Cell 81: 505–12 (1995); Boldin, M. P. et al., J. Biol. Chem. 270: 7795–8 (1995); Kischkel, F. C. et al., EMBO 14: 5579–5588 (1995)), welches wiederum an FLICE/MACH1, ein Mitglied der ICE/CED-3 Familie pro-apoptotischer Proteasen, bindet und vermutlich aktiviert (Muzio, M. et al., Cell 85: 817–827 (1996); Boldin, M. P. et al., Cell 85: 803–815 (1996)). Während es die zentrale Rolle von Fas/APO-1 ist, den Zelltod auszulösen, kann TNFR-1 eine ganze Reihe verschiedener biologischer Aktivitäten signalisieren, viele davon beruhen auf seiner Fähigkeit NF-κB zu aktivieren (Tartaglia, L. A. et al., Immunol Today 13: 151–3 (1992)). Dementsprechend rekrutiert TNFR-1 das multivalente Adaptermolekül TRADD, welches wie FADD auch eine „Death Domain” enthält (Hsu, H. et al., Cell 81: 495–504 (1995); Hsu, H. et al., Cell 84: 299–308 (1996)). Durch die große Anzahl von Signalmolekülen mit denen es Bindungen eingeht, einschließlich FADD, TRAF2 und RIP, kann TRADD sowohl Apoptose als auch NF-κB-Aktivierung signalisieren (Hsu, H. et al., Cell 84: 299–308 (1996); Hsu, H. et al., Immunity 4: 387–396 (1996)).
Kürzlich wurde ein neuer Apoptose-induzierender Ligand entdeckt. Wiley, S. R. et al., bezeichnen das neue Molekül als TNF-verwandten Apoptose-induzierenden Liganden oder „TRAIL” (Immunity 3: 673–682 (1995)). Pitti, R. M. et al. bezeichnen das neue Molekül als Apo-2 Ligand oder „Apo-2L”. Dieses Molekül wurde auch in der co-anhängigen einstweiligen US Patentanmeldung Serien-Nr. 60/013405 beschrieben. Der Einfachheit halber wird es hier als TRAIL bezeichnet.
Anders als der Fas-Ligand, dessen Transkripte weitgehend auf stimulierte T-Zellen beschränkt zu sein scheinen, werden von TRAIL signifikante Spiegel in vielen Geweben gefunden und es wird von einigen Zelllinien konstitutiv transkribiert. Es wurde gezeigt, dass TRAIL unabhängig vom Fas-Liganden wirkt (Wiley, S. R., et al. (1995), vorstehend). Studien von Marsters, S. A. et al. haben darauf hingewiesen, dass TRAIL die Apoptose rasch aktiviert, innerhalb eines Zeitrahmens der ähnlich ist zur „Death”-Signalgebung durch FAS/Apo-1L, allerdings viel schneller als die TNF-induzierte Apoptose (Current Biology, 6: 750–752 (1996)). Alle bisherigen Arbeiten legen nahe, dass der Rezeptor für TRAIL keiner der vielen bekannten TNF-Rezeptoren ist.
Die Wirkungen der Liganden und Rezeptoren der TNF-Familie sind unterschiedlich und beeinflussen eine Vielzahl von Funktionen, sowohl normal als auch abnormal, in biologischen Prozessen des Säugersystems. Es besteht eine klare Notwendigkeit dafür solche Rezeptoren und Liganden, welche die biologische Aktivität beeinflussen, zu identifizieren und zu charakterisieren, sowohl im normalen als auch im Krankheitszustand. Insbesondere besteht die Notwendigkeit den Rezeptor für den neu entdeckten TRAIL-Liganden zu isolieren und zu charakterisieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung liefert isolierte Nucleinsäuremoleküle und umfasst Nucleinsäuresequenzen, welche die Aminosäuresequenz codieren, die in 1 (SEQ ID NR. 2) gezeigt ist, oder die Aminosäuresequenz, die den cDNA-Clon codiert, der unter der ATCC-Hinterlegungsur. 97853 am 21. Januar 1997 hinterlegt wurde.
Die vorliegende Erfindung liefert Vektoren und Wirtszellen für die rekombinante Expression von hier beschriebenen Nucleinsäuremolekülen, genauso wie Verfahren zur Herstellung solcher Vektoren und Wirtszellen und für deren Verwendung zur Herstellung von DR4-Polypeptiden oder -Peptiden durch Rekombinationstechniken. Des Weiteren liefert die Erfindung ein isoliertes DR4-Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch ein hier beschriebenes Polynucleotid codiert wird. Die vorliegende Erfindung liefert auch diagnostische Tests wie beispielsweise quantitative und diagnostische Tests, um DR4-Proteinspiegel nachzuweisen. Daher kann zum Beispiel ein erfindungsgemäßer diagnostischer Test zum Nachweis der Überexpression von DR4 oder einer löslichen Form davon, im Vergleich mit normalen Kontrollgewebeproben verwendet werden, um das Vorkommen eines Tumors nachzuweisen.
Liganden der Tumornekrosefaktor (TNF)-Familie sind bekannt dafür unter den am meisten pleiotropen Cytokinen zu sein, die eine große Anzahl von zellulären Antworten induzieren. Dazu gehören Cytotoxizität, antivirale Aktivität, immunregulatorische Aktivitäten und transkriptionelle Regulation mehrerer Gene. Die zelluläre Antwort auf Liganden der TNF-Familie schließt nicht nur normale physiologische Antworten, sondern auch Krankheiten, die mit erhöhter Apoptose oder der Hemmung der Apoptose verbunden sind, ein. Der Apoptose-programmierte Zelltod ist ein physiologischer Mechanismus, der am Verlust der peripheren T-Lymphocyten des Immunsystems beteiligt ist und seine Fehlregulation kann zu einer Reihe von verschiedenen pathogenen Prozessen führen. Krankheiten, die mit einem erhöhten Zellüberleben verbunden sind oder mit der Hemmung der Apoptose, umfassen Krebs, Autoimmunerkrankungen virale Infektionen, Entzündung, Transplantat v. Empfänger Erkrankung, akute Transplantatabstoßung und chronische Transplantatabstoßung. Krankheiten, die mit einer erhöhten Apoptose verbunden sind, umfassen AIDS, neurodegenerative Störungen, myelodisplastische Syndrome, ischämische Schädigung, Gift-induzierte Lebererkrankung, septischer Schock, Kachexie und Anorexie.
Daher liefert die Erfindung des Weiteren ein Verfahren zur Verstärkung der Apoptose, welche durch einen Liganden der TNF-Familie induziert wird, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Agonisten, der in der Lage ist die DR4-vermittelte Signalgebung zu erhöhen, an eine Zelle, die das DR4-Polypetptid exprimiert, umfasst. Vorzugsweise wird die DR4-vermittelte Signalgebung erhöht, um eine Krankheit zu behandeln, bei der eine verminderte Apoptose vorliegt. In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung an ein Verfahren zur Hemmung der durch einen Liganden der TNF-Familie induzierten Apoptose und umfasst die Verabreichung einer wirksame Menge eines Antagonisten, der in der Lage ist die DR4-vermittelte Signalgebung zu vermindern, an eine Zelle, die das DR4-Polypetptid exprimiert. Vorzugsweise wird die DR4-vermittelte Signalgebung vermindert, um eine Krankheit zu behandeln, bei der eine erhöhte Apoptose vorliegt. Ob irgendein zur Auswahl stehender „Agonist” oder „Antagonist” der vorliegenden Erfindung die Apoptose verstärken oder hemmen kann, kann unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten TNF-Familie-Ligand/Rezeptor Zellantworttests bestimmt werden, einschließlich solcher, die nachstehend genauer beschrieben werden. Daher wird in einem weitern Aspekt ein Durchmusterungsverfahren bereitgestellt, um zu bestimmen ob ein Kandidat-„Agonist” oder -„Antagonist” in der Lage ist die zelluläre Antwort gegenüber einem Liganden der TNF-Familie zu verstärken oder zu hemmen. Das Verfahren umfasst: das in Kontaktbringen von Zellen, die das DR4-Polypeptid exprimieren mit einer zur Wahl stehenden Verbindung und einem TNF-Familie-Liganden, das Testen einer Zellantwort und Vergleich der Zellantwort mit einer Standardzellantwort. Der Standard wird getestet, wenn der Kontakt mit dem Liganden in Abwesenheit der zur Wahl stehenden Verbindung durchgeführt wird, wobei eine erhöhte zelluläre Antwort über den Standard darauf hinweist, dass die zur Wahl stehende Verbindung ein Agonist des Ligand/Rezeptor-Signalübertragungswegs ist und eine verminderte zelluläre Antwort im Vergleich zum Standard darauf hinweist, dass die zur Wahl stehende Verbindung ein Antagonist des Ligand/Rezeptor-Signalübertragungswegs ist. Durch die Erfindung kann eine Zelle, die das DR4-Polypepeptid exprimiert, entweder mit einem endogen oder exogen verabreichten TNF-Familie-Liganden in Kontakt gebracht werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt die Nucleotid- und die abgeleitete Aminosäuresequenz von DR4. Es wird vorhergesagt, dass die Aminosäuren 1–23 das Signalpeptid bilden, die Aminosäuren 24–238 ergeben die extrazelluläre Domäne, die Aminosäuren 239–264 stellen die Transmembrandomäne dar und die Aminosäuren 265–468 bilden die intrazelluläre Domäne, von der die Aminosäuren 379–422 die „Death-Domain” ausmachen.
2 zeigt die Regionen mit einer Ähnlichkeit zwischen den Aminosäuresequenzen von DR4, dem menschlichen Tumornekrosefaktor-Rezeptor I (SEQ ID NO: 3), dem menschlichen Fas-Protein (SEQ ID NO: 4) und dem „Death-Domain”-enthaltenden Rezeptor 3 (DR3, SEQ ID NO: 5).
3 zeigt eine Analyse der DR4-Aminosäuresequenz. Alpha-, Beta-, Schleifen- und Knäuelregionen, Hydrophilie und Hydrophobie, amphipatische Regionen, flexible Regionen, Antigenindex und Oberflächenwahrscheinlichkeit werden gezeigt. Bei der „Antigenindex – Jameson-Wolf”-Kurve korrespondieren die Aminosäurereste 35–92, 114–160, 169–240, 267–298, 330–364, 391–404 und 418–465 aus 1 mit der gezeigten starken Antigenregionen des DR4-Proteins.
4 zeigt die Nucleotidsequenzen von verwandten Nucleinsäurefragmenten HTOIY07R (SEQ ID NO: 6) und HTXEY80R (SEQ ID NO: 7).
5A und 5B zeigen die Fähigkeit von DR4 die Apoptose in den Zelllinien MCF7 und 293 hervorzurufen. 5C zeigt die Fähigkeit der „Death”-Proteaseinhibitoren z-VAD-fmk und CrmA die apoptotische Aktivität von DR4 zu hemmen.
6A zeigt die Fähigkeit eines löslichen extrazellulären DR4-Fc-Fusionsproteins die Apoptose-induzierende Aktivität von TRAIL zu blockieren. 6B zeigt die Unfähigkeit eines löslichen extrazellulären DR4-Fc-Fusionsproteins, die Apoptose-induzierende Aktivität von TNF-alpha zu blockieren.
GENAUE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung liefert isolierte Nucleinsäuremoleküle und umfasst: eine Nucleinsäuresequenz, die das DR4-Polypeptid codiert, dessen Aminosäuresequenz in 1 gezeigt wird (SEQ ID NO: 2) oder ein Fragment des Polypeptids wie in den Ansprüchen definiert. Das erfindungsgemäße DR4-Polypeptid teilt Sequenzhomologien mit dem menschlichen TNFR-I, DR3 und Fas Ligand (2). Die in 1 gezeigte Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 1) wurde durch die Sequenzierung von cDNA-Clonen wie beispielsweise HCUDS60, der am 21 Januar 1997 am American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852, unter der Zugangsnummer 97853, hinterlegt wurde, erhalten. Der hinterlegte Clon ist im pBK-Plasmid (Stratagene, La Jolla, CA) enthalten.
Nucleinsäuremoleküle
Soweit nicht anders vermerkt, wurden alle Nucleinsäuresequenzen, die hier durch die Sequenzierung eines DNA-Moleküls bestimmt wurden, unter der Verwendung eines automatisieren DNA-Sequenzierers (wie beispielsweise das Model 373 von Applied Biosystems, Inc.) bestimmt, und alle Aminosäuresequenzen der Polypeptide, die durch die hier bestimmten DNA-Moleküle codiert werden, wurden durch die Translation einer DNA-Sequenz, die wie vorstehend bestimmt wurde, vorhergesagt. Daher kann jede hier bestimmte Nucleinsäuresequenz, wie es für jede DNA-Sequenz, die durch diesen automatisierten Ansatz bestimmt wurde, auf dem Fachgebiet bekannt ist, einige Fehler enthalten. Automatisiert bestimmte Nucleotidsequenzen sind normalerweise mindestens etwa 90% identisch, noch üblicher mindestens etwa 95% bis mindestens etwa 99,9% identisch, zur wirklichen Nucleotidsequenz des sequenzierten DNA-Moleküls. Die wirkliche Sequenz kann durch andere Ansätze noch genauer bestimmt werden, einschließlich der manuellen DNA-Sequenzierungsverfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Wie ebenfalls auf dem Fachgebiet bekannt, wird eine einzelne Insertion oder Deletion in einer ermittelten Nucleotidsequenz im Vergleich mit der wirklichen Sequenz eine Leserasterverschiebung in der Translation der Nucleotidsequenz verursachen, so dass die vorhergesagte Aminosäuresequenz, die durch eine ermittelte Nucleotidsequenz codiert wird, vollkommen verschieden sein wird von der Aminosäuresequenz, die tatsächlich von dem sequenzierten DNA-Molekül codiert wird, beginnend an dem Punkt einer solchen Insertion oder Deletion.
Mit „isoliertes” Polypeptid oder Protein ist ein Polypeptid oder Protein gemeint, welches von seinem nativen Umfeld entfernt wurde. Zum Beispiel rekombinant hergestellte Polypeptide und Proteine, die in Wirtszellen exprimiert werden, werden für Erfindungszwecke als isoliert betrachtet wie auch native oder rekombinante Polypeptide, die im Wesentlichen durch jedes geeignete Verfahren aufgereinigt wurden, wie zum Beispiel das Einzelschritt-Aufreinigungsverfahren, beschrieben in Smith und Johnson, Gene 67: 31–40 (1988).
Unter Verwendung der hier bereitgestellten Information wie die Nucleinsäuresequenz dargelegt in 1, kann ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül, das ein DR4-Polypeptid codiert, mittels Standardklonierungs- und Durchmusterungsverfahren erhalten werden. Dazu gehören solche zur Klonierung von cDNAs, wobei mRNA als Ausgangsmaterial verwendet wird. Zur Erläuterung der Erfindung, ist das Gen der vorliegenden Erfindung auch in cDNA-Banken der folgenden Gewebe identifiziert worden: amniotische Zellen, Herz, Leberkrebs, Niere, Leukocyten, aktivierte T-Zelle, K562 zuzüglich PMA, W138 Zellen, Th2-Zellen, menschliche Mandeln und CD34-abgereicherte Leukocyten- und Thrombocytenschicht (Nabelschnurblut).
Das DR4-Gen enthält einen offenen Leserahmen, der ein reifes Protein mit etwa 445 Aminosäureresten codiert, dessen Start-Codon an der Position 19–21 der in 1 gezeigten Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 1) liegt, mit einer Leadersequenz von etwa 23 Aminosäureresten (d. h. eine Gesamtproteinlänge von 468 Aminosäuren) und einem abgeleiteten Molekulargewicht von etwa 50 kDa. Von den bekannten Mitgliedern der TNF-Rezeptor-Familie teilt das erfindungsgemäße DR4-Polypeptid den größten Homologiegrad mit den in 2 gezeigten menschlichen TNFRI- und DR3-Polypeptiden, einschließlich signifikanter Sequenzhomologie über die vielfachen Cystein-reichen Domänen.
Zusätzlich zu der Sequenzhomologie, die zwischen DR4 und anderen „Death-Domain”-enthaltenden Rezeptoren auftreten, wurde gezeigt, dass DR4 an TRAIL bindet und dass es Apoptose induziert, wenn es kurzzeitig exprimiert wird. MCF7 menschliche Brustkrebszellen und 293-Zellen wurden vorübergehend wie in Beispiel 5 beschrieben mit einem DR4-exprimierendem Konstrukt transfiziert. Wie in den 5A und 5B beschrieben machte ein beträchtlicher Anteil der transfizierten Zellen die für die Apoptose charakteristischen morphologischen Veränderungen durch. Wie zu erwarten hebt die Deletion der „Death-Domain” die Fähigkeit von DR4 den „Death”-Pfad einzuschlagen auf. Wie in 5C zu sehen ist, wurde die DR4-induzierte Apoptose effizient durch Inhibitoren der „Death”-Proteasen blockiert, dazu gehören z-VAD-fmk, ein irreversibler Caspase-Inhibitor mit breitem Spektrum, und CrmA, ein Kuhpockenvirus codiertes Serpin, das vorzugsweise apikale Caspasen wie FLICE/MACH-1 (Caspase-8) hemmt. Da TNFR-1-, CD-95- und DR3-induzierte Apoptose auch durch dieselben Inhibitoren abgeschwächt wird, ist es wahrscheinlich, dass die nachgeschalteten „Death”-Effektormoleküle ähnlich in ihren Eigenschaften sind.
Um zu bestimmen, ob DR4 in der Lage war TRAIL zu binden, wurde die extrazelluläre Ligandenbindungsdomäne von DR4 als Fusionsprotein mit der Fc-Region von menschlichem IgG (DR4-Fc) exprimiert. TRAIL bindet selektiv an DR4-Fc, aber nicht an die korrespondierenden extrazellulären Domänen von TNFR-1 oder CD-95, ebenfalls als Fc-Fusionen exprimiert, Daten nicht gezeigt. Außerdem band DR4-Fc weder TNF-alpha noch den Fas-Liganden unter Bedingungen, bei denen beide dieser Liganden ihre zugehörigen Rezeptoren binden.
Die Fähigkeit von TRAIL die Apoptose in MCF7-Zellen zu induzieren wurde spezifisch durch DR4-Fc blockiert, nicht aber durch TNFR1-Fc, CD95-Fc oder Fc alleine (6A). Des Weiteren wurde wie erwartet die TNF-alpha-induzierte Apoptose durch TNFR1-Fc, nicht aber durch DR4-Fc, CD95-Fc oder Fc alleine gehemmt (68).
Zusammengefasst weisen die vorstehend beschriebenen Daten darauf hin, dass DR4 ein „Death-Domain”-enthaltender Rezeptor mit der Fähigkeit Apoptose zu induzieren ist und einen Rezeptor für TRAIL, ein bekannter Apoptose-induzierender Ligand, darstellt.
Wie angedeutet liefert die vorliegende Erfindung auch die reife/n Form/en des erfindungsgemäßen DR4-Proteins. Gemäß der Signalhypothese haben Proteine, die von Säugerzellen sezerniert werden, eine Signal- oder Sekretions-Leadersequenz, die vom reifen Protein abgespalten wird, sobald der Export der wachsenden Proteinkette über das Endoplasmatische Reticulum eingeleitet worden ist. Die meisten Säugerzellen und selbst Insektenzellen spalten sezernierte Proteine mit der gleichen Spezifität. Jedoch ist in einigen Fällen das Abspalten nicht völlig einheitlich, was zu zwei oder mehr reifen Formen des Proteins führt. Ferner ist lange bekannt gewesen, dass die Spaltungsspezifität eines sezernierten Proteins letztendlich durch die Primärstruktur des ganzen Proteins bestimmt wird, das heißt es liegt in der Aminosäuresequenz des Polypeptids begründet. Daher liefert die vorliegende Erfindung eine Nucleotidsequenz, die das reife DR4-Polypeptid codiert mit einer Aminosäuresequenz, die von den im Wirt enthaltenen cDNA-Clonen codiert wird, identifiziert als ATCC-Hinterlegungsnummer 97853, und wie in 1 gezeigt (SEQ ID NO: 2). Mit dem reifen DR4-Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die von den im Wirt enthaltenen cDNA-Clonen codiert wird, und identifiziert wurde als ATCC-Hinterlegungsnummer 97853, ist/sind die reife/n Formten des DR4-Proteins gemeint, welche/s durch die Expression des vollständigen offenen Leserahmens, der von der menschlichen DNA-Sequenz des Clons, der in dem Vektor in dem hinterlegten Wirt enthalten ist, codiert wird, in einer Sängerzelle (z. B. COS-Zellen, wie nachstehend beschrieben) hergestellt wird. Wie nachstehend angedeutet, kann sich das reife DR4, das die Aminosäuresequenz, die durch den cDNA-Clon, der in der ATCC-Hinterlegungsnummer 97853 enthalten ist, codiert wird, von dem vorhergesagten „reifen” in 1 gezeigte DR4-Protein (Aminosäuren von etwa 24 bis etwa 468) unterscheiden oder auch nicht, abhängig von der Genauigkeit der vorhergesagten Schnittstelle, die auf einer Computeranalyse beruht.
Es stehen Verfahren zur Vorhersage, ob ein Protein eine sekretorische Leadersequenz besitzt, zur Verfügung und ebenso für die Vorhersage der Schnittstelle dieser Leadersequenz. Zum Beispiel können die Verfahren von McGeoch (Virus Res. 3: 271–286 (1995)) und von Heinje (Nucleic Acids Res. 14: 4683–4690 (1986)) verwendet werden. Die Vorhersagegenauigkeit für die Schnittstellen von bekannten sekretorischen Säugerproteinen liegt für jedes dieser Verfahren im Bereich von 75–80% (von Heinje, vorstehend). Allerdings erzeugen die beiden Verfahren nicht immer die gleiche/n vorhergesagte/n Schnittstelle/n für ein gegebenes Protein.
Im vorliegenden Fall wurde die vorhergesagte Aminosäuresequenz des vollständigen DR4-Polypeptids der vorliegenden Erfindung durch ein Computerprogramm („PSORT”) analysiert (siehe Nakai, K. und Kanehisa, M. Genomics 14: 897–911 (1992)). Es handelt sich um ein Expertensystem zur Vorhersage der zellulären Lokalisation eines Proteins, basierend auf der Aminosäuresequenz. Als Teil dieser rechnerischen Vorhersage der Lokalisation sind die Verfahren von McGeoch und von Heinje eingebunden. Die Analyse durch das PSORT-Programm sagt die Schnittstellen zwischen den Aminosäuren 23 und 24 in 1 (SEQ ID NO: 2) vorher. Danach wurden die vollständigen Aminosäuresequenzen durch Sichtprüfung weiter analysiert, wobei eine einfache Form der (–1, –3)-Regel von von Heinje (von Heinje, vorstehend) angewendet wurde. So wurde vorhergesagt, dass die Leadersequenz für das DR4-Protein aus den Aminosäureresten 1–23 besteht, in 1 unterstrichen (SEQ ID NO: 2), während das vorhergesagte reife DR4-Protein aus den Resten 24–468 besteht.
Wie erwähnt können erfindungsgemäße Nucleinsäuremoleküle in Form von RNA wie beispielsweise mRNA oder in Form von DNA, einschließlich zum Beispiel cDNA und genomische DNA, die durch Klonieren oder synthetische Herstellung erhalten wurden, vorliegen. Die DNA kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein. Einzelstrang-DNA kann der codierende Strang sein, auch bekannt als „Sense”-Strang, oder es kann der nicht-codierende Strang sein, auch „Antisense”-Strang genannt.
Mit „isolierten” Nucleinsäuremolekül/en ist ein Nucleinsäuremolekül gemeint, DNA oder RNA, das aus seiner natürlichen Umgebung entfernt wurde. Zum Beispiel werden rekombinante DNA-Moleküle, die in einem Vektor enthalten sind, für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als isoliert betrachtet. Weitere Beispiele von isolierten DNA-Molekülen umfassen rekombinante, in heterologen Wirtszellen erhaltene DNA-Moleküle oder (teilweise oder größtenteils) gereinigte DNA-Moleküle in Lösung. Isolierte RNA-Moleküle schließen in vivo oder in vitro RNA-Transkripte der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle ein. Isolierte Nucleinsäuremoleküle gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen weiter solche Moleküle, die synthetisch hergestellt wurden.
Isolierte, erfindungsgemäße Nucleinsäuremoleküle umfassen DR4-DNA-Moleküle, die einen offenen Leserahmen (ORF) wie in 1 (SEQ ID NO: 1) gezeigt, enthalten, und umfassen des Weiteren DNA-Moleküle mit einer Sequenz, die sich im Wesentlichen vom ganzen oder Teilen des ORFs, dessen Start-Codon sich an der Position 19–21 der in 1 gezeigten Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 1) befindet, unterscheiden, wobei aber wegen der Degeneriertheit des genetischen Codes dennoch das DR4-Polypeptid oder ein Fragment davon codiert wird. Natürlich ist der genetische Code auf dem Fachgebiet bestens bekannt. Daher würde es für den Fachmann Routine sein, solche degenerierten Varianten herzustellen.
In einem anderen Aspekt liefert die Erfindung isolierte Nucleinsäuremoleküle, die das DR4-Polypeptid codieren, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die von dem cDNA-Clon, der in dem Plasmid, das unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 97853 am 21 Januar 1997 hinterlegt wurde, enthalten ist, codiert wird. Vorzugsweise werden diese Nucleinsäuremoleküle das reife Polypeptid codieren, das durch den vorstehend beschriebenen hinterlegten cDNA-Clon codiert wird. Die Erfindung liefert ferner ein isoliertes Nucleinsäuremolekül mit der in 1 gezeigten Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 1) oder die Nucleotidsequenz der DR4-cDNA, die in dem vorstehend beschriebenen hinterlegten Clon enthalten ist oder ein Nucleinsäuremolekül mit einer Sequenz die komplementär zu einer der vorstehenden Sequenzen ist. Solch isolierte DNA-Moleküle und Fragmente davon sind nützlich als DNA-Sonden für die Genkartierung mittels in situ-Hybridisierung des DR4-Gens im menschlichem Gewebe durch eine Northern-Blot-Analyse.
Die vorliegende Erfindung gilt des Weiteren für Fragmente der hierin beschriebenen isolierten Nucleinsäuremoleküle, wobei die Fragmente wie in den Ansprüchen definiert sind. Mit Fragmenten eines isolierten DNA-Moleküls, das die in 1 gezeigte Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 1) aufweist, sind DNA-Fragmente gemeint, die eine Länge von mindestens 20 bp aufweisen, und stärker bevorzugt mindestens 30 bp, und die wie vorstehend erläutert als DNA-Sonden nützlich sind. Natürlich sind auch größere DNA-Fragmente von 50–1500 bp Länge als erfindungsgemäße DNA-Sonden nützlich wie auch DNA-Fragmente, die zum größten Teil, wenn nicht der gesamten in 1 gezeigten Nucleotidsequenzen (SEQ ID NO: 1) entsprechen. Mit einem Fragment von zum Beispiel mindestens 20 bp Länge sind Fragmente gemeint, die 20 oder mehr Basen von der in 1 gezeigten Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 1) aufweisen.
Bevorzugte, erfindungsgemäße Nucleinsäurefragmente umfassen Nucleinsäuremoleküle, die ein Polypeptid codieren, das die extrazelluläre Domäne von DR4 enthält (Aminosäurereste von etwa 24 bis etwa 238 in 1 (SEQ ID NO: 2)). Da die Position dieser Domäne durch Computergraphiken vorhergesagt worden ist, würde ein Durchschnittsfachmann bemerken, dass die Aminosäurereste, welche die Domäne ausmachen, leicht variieren können (z. B. um etwa 1 bis 15 Reste), abhängig von den Kriterien, die angelegt wurden, um die Domäne zu definieren.
Bevorzugte, erfindungsgemäße Nucleinsäurefragmente codieren ein Volllängen-DR4-Polypeptid, dem die Nucleotide, die das amino-terminale Methionin codieren (Nucleotide 19–21 in SEQ ID NO: 1), fehlen, da bekannt ist, dass das Methionin normalerweise abgespalten wird und solche Sequenzen nützlich sein können bei der genetischen Veränderung von DR4-Expressionsvektoren. Polypeptide, die von solchen Polynucleotiden codiert werden, werden durch die Erfindung ebenso in Betracht gezogen.
Zu den Nucleinsäurefragmenten der vorliegenden Offenbarung gehören ferner Nucleinsäuremoleküle, die Epitop-tragende Anteile des DR4-Proteins codieren. Insbesondere schließen solche Nucleinsäurefragmente Nucleinsäuremoleküle, die folgendes codieren, ein: ein Polypeptid, das die Aminosäurereste von etwa 35 bis etwa 92 in der 1 (SEQ ID NO: 2) umfasst, ein Polypeptid, das die Aminosäurereste von etwa 114 bis etwa 160 in der 1 (SEQ ID NO: 2) umfasst, ein Polypeptid, das die Aminosäurereste von etwa 169 bis etwa 240 in der 1 (SEQ ID NO: 2) umfasst, ein Polypeptid, das die Aminosäurereste von etwa 267 bis etwa 298 in der 1 (SEQ ID NO: 2) umfasst, ein Polypeptid, das die Aminosäurereste von etwa 330 bis etwa 364 in der 1 (SEQ ID NO: 2) umfasst, ein Polypeptid, das die Aminosäurereste von etwa 391 bis etwa 404 in der 1 (SEQ ID NO: 2) umfasst und ein Polypeptid, das die Aminosäurereste von etwa 418 bis etwa 465 in der 1 (SEQ ID NO: 2) umfasst. Die Erfinder haben festgestellt, dass die vorstehenden Polypeptidfragmente antigene Regionen des DR4-Proteins sind. Verfahren zur Bestimmung anderer solcher Epitop-tragender Anteile des DR4-Proteins werden nachstehend genauer beschrieben.
Außerdem liefert die Offenbarung Nucleinsäuremoleküle mit Nucleotidsequenzen, die verwandt sind mit ausgedehnten Anteilen der SEQ ID NO: 1 wie folgt: HTOIY07R (SEQ ID NO: 6) und HTXEY80R (SEQ ID NO: 7) beide in 4 gezeigt.
Des Weiteren ist ein Polynucleotid offenbart, das irgendeinen Teil der SEQ ID NO: 1 von den Resten 365 bis 1424 enthält, von mindestens etwa 30 Nucleotiden, vorzugsweise von mindestes etwa 50 Nucleotiden Länge.
In einem andern Aspekt liefert die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das ein Polynucleotid umfasst, welches unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einem Anteil des Polynucleotids in einem erfindungsgemäßen, vorstehend beschriebenen Nucleinsäuremolekül hybridisiert. Zum Beispiel der cDNA-Clon, der in der ATCC-Hinterlegungsnummer 97853 enthalten ist, wobei das Polynucleotid ein Polypeptid codiert, das in der Lage ist TRAIL zu binden. Mit „stringenten Hybridisierungsbedingungen” ist gemeint: eine Übernachtinkubation bei 42°C in einer Lösung, die 50% Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt's Lösung, 10% Dextransulfat und 20 g/ml denaturierte, gescherte Lachssperma-DNA enthält, gefolgt vom Waschen der Filter in 0,1 × SSC bei etwa 65°C.
Mit einem Polynucleotid, das mit einen „Teil” eines Polynucleotids hybridisiert, ist ein Polynucleotid (entweder DNA oder RNA) gemeint, das mit mindestens etwa 15 Nucleotiden (nt) hybridisiert und stärker bevorzugt etwa 20 nt, noch stärker bevorzugt mit mindestens 30 nt und am meisten bevorzugt etwa 30–70 nt des Bezugspolynucleotids. Diese sind als diagnostische Sonden und Primer wie vorstehend und nachstehend genauer erläutert nützlich.
Mit einem Teil eines Polynucleotids von zum Beispiel „mindestens 20 nt Länge” ist gemeint, 20 oder mehr benachbarter Nucleotide der Nucleotidsequenz des Bezugspolynucleotids (z. B. die hinterlegte cDNA oder die Nucleotidsequenz wie in 1 (SEQ ID NO: 1) oder 2 (SEQ ID NO: 3) aufgeführt).
Natürlich würde ein Polynucleotid, das nur mit einer polyA-Sequenz (wie der 3'-terminale poly(A)-Strang der in 1 aufgeführten DR4-cDNA (SEQ ID NO: 1) oder elf Spanne von komplementären T (oder U)-Resten) hybridisiert, nicht von den erfindungsgemäßen Polynucleotiden umfasst sein, um zum Hybridisieren mit einem Anteil einer erfindungsgemäßen Nucleinsäure verwendet zu werden, da solch ein Polynucleotid mit jedem Nucleinsäuremolekül hybridisieren würde, das einen Poly(A)-Strang oder ein Komplement davon besitzt (z. B. praktisch jeder doppelsträngige cDNA-Clon).
Wie angedeutet, können erfindungsgemäße Nucleinsäuremoleküle, die das DR4-Polypeptid codieren, an sich die codierende Sequenz für das reife Polypeptid einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt; des Weiteren: die codierende Sequenz für das reife Polypeptid und zusätzliche Sequenzen wie beispielsweise solche, die eine Leader- oder Sekretionssequenz codieren, wie eine Prä-, Pro- oder Präproproteinsequenz; die codierende Sequenz des reifen Polypeptids mit oder ohne die vorstehend erwähnten zusätzlichen, codierenden Sequenzen, zusammen mit zusätzlichen, nicht-codierenden Sequenzen, einschließlich zum Beispiel, aber nicht darauf beschränkt, Introns und nicht-codierende 5'- und 3'-Sequenzen wie beispielsweise die transkribierten, nicht-translatierten Sequenzen, die einer Rolle bei der Transkription, der mRNA-Prozessierung (einschließlich zum Beispiel der Spleiß- und Polyadenylierungssignale), der Ribosomenbindung und der mRNA-Stabilität spielen; zusätzlich codierende Sequenz, die zusätzliche Aminosäuren codiert wie beispielsweise solche, die zusätzliche Funktionen liefern. Daher kann das Polypeptid beispielsweise an eine Marker-Sequenz wie zum Beispiel an ein Peptid fusioniert werden, das die Aufreinigung des fusionierten Polypeptides erleichtert. In bestimmten, bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung ist die Markersequenz ein Hexahistidinpeptid wie unter anderem die in einem pQE-Vektor (Qiagen, Inc.) bereitgestellte Markierungssequenz von denen viele im Handel erhältlich sind. Wie beispielsweise in Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821–824 (1989) beschrieben, gewährleistete Hexahistidin eine bequeme Aufreinigung des Fusionsproteins. Die HA-Markierungssequenz entspricht einem Epitop, das von einem Influenza-Hämaglutininprotein stammt, das zum Beispiel von Wilson et al., Cell 37: 767 (1984) beschrieben worden ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren Varianten der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle, die für Fragmente, Analoge oder Derivate des DR4-Polypeptids wie in den Ansprüchen definiert codieren. Die Varianten können natürlich vorkommen wie beispielsweise eine Allelvariante. Mit „Allelvariante” ist eine von mehreren wechselnden Formen eines Gens, das einen gegebenen Locus auf einem Chromosom eines Organismuses besetzt, gemeint (Genes II, Lewin, B. Hrsg., John Wiley & Sons, New York (1985)). Nicht-natürlich vorkommende Varianten können unter Verwendung auf dem Fachgebiet bekannter Mutageneseverfahren hergestellt werden.
Diese Varianten schließen solche ein, die durch Nucleotidsubstitutionen, Deletionen oder Additionen, die ein oder mehrere Nucleotide umfassen, hergestellt wurden. Die Varianten können in codierende und nicht-codierende Regionen oder beides abgeändert werden. Änderungen in den codierenden Regionen können konservative oder nicht-konservative Aminosäuresubstitutionen, Deletionen oder Additionen erzeugen.
Weitere erfindungsgemäße Ausführungsformen schließen isolierte Nucleinsäuremoleküle, die mindestens 95% identisch sind und stärker bevorzugt mindestens 96%, 97%, 98% oder 99% identisch sind zu (a) einer Nucleotidsequenz, die das Nalllängen-DR4-Polypeptid codiert, das die vollständige Aminosäuresequenz aus 1 (SEQ ID NO: 2) aufweist, einschließlich der vorausgesagten Leadersequenz; (b) einer Nucleotidsequenz, die das Volllängen-DR4-Polypeptid codiert, das die vollständige Aminosäuresequenz aus 1 (SEQ ID NO: 2) aufweist, einschließlich der vorausgesagten Leadersequenz, aber ohne das aminoterminale Methionin; (c) eine Nucleotidsequenz, die das reife DR4-Polypeptid (Volllängen-Polypeptid mit entfernter Leadersequenz) codiert, das die Aminosäuresequenz von den Positionen um etwa 24 bis etwa 468 aus 1 (SEQ ID NO: 2) aufweist; (d) eine Nucleotidsequenz, die das Volllängen-DR4-Polypeptid codiert, das die vollständige Aminosäuresequenz einschließlich der vorhergesagten Leadersequenz aufweist, die durch den cDNA-Clon, der in der ATCC-Hinterlegungsnummer 97853 enthalten ist, codiert wird; (e) eine Nucleotidsequenz, die das Volllängen-DR4-Polypeptid codiert, das die vollständige Aminosäuresequenz einschließlich der Leadersequenz, aber ohne das amino-terminale Methionin, aufweist, die durch den cDNA-Clon, der in der ATCC-Hinterlegungsnummer 97853 enthalten ist, codiert wird; (f) eine Nucleotidsequenz, die das reife DR4-Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz aufweist, die durch den cDNA-Clon, der in der ATCC-Hinterlegungsnummer 97853 enthalten ist, codiert wird oder (g) eine Nucleotidsequenz, welche die extrazelluläre Domäne von DR4 codiert und die ein Polypeptid codiert, das fähig ist, TRAIL zu binden oder Apoptose zu induzieren.
Mit einem Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz aufweist, die mindestens zum Beispiel 95% „identisch” ist mit einer Bezugsnucleotidsequenz, die ein DR4-Polypeptid codiert, ist gemeint, dass die Nucleotidsequenz des Polynucleotids identisch ist zu der Bezugssequenz, mit der Ausnahme dass die Polynucleotidsequenz bis zu fünf Punktmutationen je 100 Nucleotiden der Bezugsnucleotidsequenz, die das DR4-Polypeptid codiert, enthalten kann. In anderen Worten, um ein Polynucleotid zu erhalten, das eine Nucleotidsequenz aufweist, die mindestens zu 95% identisch ist zu einer Bezugsnucleotidsequenz, können bis zu 5% der Nucleotide in der Bezugssequenz deletiert oder durch eine anderes Nucleotid ersetzt sein, oder eine Nucleotidanzahl von bis zu 5% der gesamten Nucleotide der Bezugssequenz können in die Bezugssequenz eingefügt werden. Diese Mutationen der Bezugssequenz können an den 5'- oder 3'-terminalen Positionen der Bezugsnucleotidsequenz oder irgendwo zwischen diesen terminalen Positionen vorkommen, entweder individuell verstreut über die Nucleotide der Bezugssequenz oder in einer oder mehreren aufeinanderfolgenden Gruppen innerhalb der Bezugssequenz.
Ob ein bestimmtes Nucleinsäuremolekül mindestens 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch ist mit zum Beispiel der in 1 gezeigten Nucleotidsequenz oder dem hinterlegten cDNA-Clon, kann in praktischer Hinsicht unter Verwendung von bekannten Computerprogrammen, wie beispielsweise das Bestfit-Programm (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 für Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) bestimmt werden. Bestfit verwendet den Algorithmus für lokale Homologien von Smith und Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482–489 (1981), um das beste Homologiesegment zwischen zwei Sequenzen zu finden. Bei der Verwendung von Bestfit oder irgendeinem anderen Sequenzalignment-Programm zur Bestimmung, ob eine bestimmte Sequenz zum Beispiel 95% identisch ist mit einer erfindungsgemäßen Bezugssequenz, werden die Parameter so eingestellt, dass natürlich die prozentuale Identität über die volle Länge der Bezugsnucleotidsequenz berechnet wird und Lücken in der Homologie bis zu 5% der Gesamtzahl von Nucleotiden der Bezugssequenz erlaubt sind.
Die vorliegende Anmeldung bezieht sich auf Nucleinsäuremoleküle, die mindestens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch sind mit der in 1 gezeigten Nucleinsäuresequenz (SEQ ID NO: 1) oder mit der Nucleinsäuresequenz der hinterlegten cDNAs, die ein Polypeptid codieren, das eine DR4-Aktivität aufweist. Sogar wenn ein bestimmtes Nucleinsäuremolekül nicht ein Polypeptid mit DR4-Aktivität codiert, wüsste ein Fachmann dennoch, wie das Nucleinsäuremolekül zu verwenden wäre, zum Beispiel als Hybridisierungssonde oder als Polymerase-Kettenreaktions(PCR)-Primer. Die Verwendung von erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen, die kein Polypeptid, das DR4-Aktivität aufweist, codiert, umfassen unter anderem: (1) Isolierung des DR4-Gens oder Allelvarianten davon in einer cDNA-Genbank; (2) in situ-Hybridisierung (z. B. „FISH”) von gespreiteten Chromosomen in der Metaphase, um die genaue chomosomale Lokalisation des DR4-Gens zu liefern wie in Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988) beschrieben und (3) Northern-Blot-Analyse zum Nachweis der Expression der DR4-mRNA in bestimmten Geweben. Mit „ein Polypeptid, das DR4-Aktivität aufweist” sind Polypeptide gemeint, die eine Aktivität besitzen, die ähnlich, aber nicht notwendiger Weise identisch ist zu einer Aktivität des erfindungsgemäßen DR4-Proteins (entweder des Vollsängen-Proteins oder vorzugsweise des reifen Proteins), was in einem besonderen biologischen Test gemessen wird. Zum Beispiel kann die DR4-Proteinaktivität gemessen werden unter Verwendung des Zelltod-Tests, der im Wesentlichen durchgeführt wird wie vorstehend beschrieben (Chinnaiyan, A. M. et al., Cell 81: 505–12 (1995); Boldin, M. P. et al., J. Biol. Chem. 270: 7795–8 (1995); Kischkel, F. C. et al., EMBO 14: 5579–5588 (1995); Chinnaiyan, A. M. et al., J. Biol. Chem. 271: 4961–4965 (1996)) oder wie es in Beispiel 5 nachstehend dargelegt wird. In MCF7-Zellen sind Plasmide, die das Volllängen-DR4 oder einen zur Wahl stehenden „Death-Domain”-enthaltenden Rezeptor codieren, co-transfiziert mit dem pLantern-Reporterkonstrukt, welches das grün fluoreszierende Protein codiert. Die Kerne von Zellen, die mit DR4 transfiziert sind, werden wie mittels DAPI-Färbung festgestellt eine apoptotische Morphologie aufwiesen. Ähnlich wie TNFR-1 und Fas/APO-1 (Muzio, M. et al., Cell 85: 817–827 (1996); Boldin, M. P. et al., Cell 85: 803–815 (1996); Tewari, M. et al., J. Biol. Chem. 270: 3255–60 (1995)) wird die DR4-induzierte Apoptose durch die Inhibitoren von ICE-ähnlichen Proteasen, CrmA und z-VAD-fmk, blockiert.
Natürlich wird der Durchschnittsfachmann, auf Grund der Degeneration des genetischen Codes, sofort erkennen, dass eine große Anzahl von Nucleinsäuremolekülen, die eine Sequenz aufweisen, die mindestens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch ist mit der Nucleinsäuresequenz der hinterlegten cDNA oder mit der in 1 gezeigten Nucleinsäuresequenz (SEQ ID NO: 1), ein Polypeptid codieren werden, das „DR4-Proteinaktivität aufweist”. Da tatsächlich alle degenerierten Varianten dieser Nucleotidsequenzen das gleiche Polypeptid codieren, wird dies dem Fachmann, auch ohne Durchführung des vorstehend beschriebenen Vergleichtests, klar sein. Der Fachmann wird ferner erkennen, dass von solchen Nucleinsäuremoleküle, die keine degenerierten Varianten darstellen, eine gewisse Anzahl auch ein Polypeptid codieren werden, das DR4-Proteinaktivität aufweist. Der Grund dafür ist, dass der Fachmann Bescheid weiß, ob Aminosäuresubstitutionen entweder weniger wahrscheinlich oder nicht wahrscheinlich die Proteinfunktion signifikant beeinflussen (z. B. Ersetzen einer aliphatischen Aminosäure mit einer zweiten aliphatischen Aminosäure).
Zum Beispiel wird eine Anleitung, wie man phänotypisch stille Aminosäuresubstiutionen erzeugt in Bowie, J. U. et al., „Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerante to Amino Acid Substiutions”, Science 247: 1306–1310 (1990) geliefert, worin die Autoren darauf hinweisen, dass Proteine überraschend tolerant gegenüber Aminosäuresubstitutionen sind.
Polynucleotid-Tests
Diese Erfindung betrifft auch die Verwendung von DR4-Polynucleotiden, um komplementäre Polynucleotide, zum Beispiel als Diagnostikum, nachzuweisen. Der Nachweis einer mutierten Form von DR4, die mit einer Funktionsstörung in Zusammenhang steht, wird ein diagnostisches Hilfsmittel liefern, das eine Krankheitsdiagnose oder die Empfindlichkeit gegenüber einer Krankheit liefern oder definieren kann, die auf einer Unterexpression, Überexpression oder veränderten Expression von DR4 oder einer löslichen Form davon zurückzuführen ist, wie zum Beispiel Tumore oder Autoimmunkrankheiten.
Personen, die Mutationen im DR4-Gen tragen, können auf DNA-Ebene durch eine Vielzahl von Verfahren erfasst werden. Nucleinsäuren für die Diagnose können aus Patientenzellen wie beispielsweise aus Blut, Urin, Speichel, Gewebebiopsie- und Autopsiematerial erhalten werden. Die genomische DNA kann direkt für den Nachweis verwendet werden oder kann vor der Analyse enzymatisch mittels PCR amplifiziert werden (Saiki et al., Nature 324: 163–166 (1986)). Ebenso kann RNA oder cDNA in gleicher Weise verwendet werden. Es können zum Beispiel PCR-Primer, die komplementär zu der DR4-codierenden Nucleinsäure sind, verwendet werden, um die DR4-Expression und Mutationen zu identifizieren und zu analysieren. Zum Beispiel können Deletionen und Insertionen durch eine Änderung in der Größe des amplifizierten Produkts im Vergleich zum normalen Genotyp nachgewiesen werden. Punktmutationen können identifiziert werden durch die Hybridisierung amplifizierter DNA mit radiomarkierter DR4-RNA oder wahlweise radiomarkierter DR4-antisense-DNA-Sequenzen. Völlig übereinstimmende Sequenzen können von fehlgepaarten Doppelsträngen durch RNAse A-Verdau oder durch Unterschiede in den Schmelztemperaturen unterschieden werden.
Sequenzunterschiede zwischen einem Bezugsgen und Genen mit Mutationen können durch direkte DNA-Sequenzierung aufgedeckt werden. Zusätzlich können clonierte DNA-Segmente als Sonde eingesetzt werden, um spezifische DNA-Segmente nachzuweisen. Die Sensitivität solcher Verfahren kann durch die Verwendung einer PCR oder anderen Amplifizierungsverfahren enorm gesteigert werden. Zum Beispiel wird ein Sequenzierungsprimer mit einem doppelsträngigen PCR-Produkt oder ein einzelsträngiges Matrizenmolekül, das durch eine modifizierte PCR hergestellt wurde, verwendet. Die Sequenzbestimmung wird mittels herkömmlicher Verfahren mit radiomarkierten Nucleotiden oder durch automatische Sequenzierungsverfahren mit Fluoreszenzmarkierungen durchgeführt.
Eine genetische Untersuchung, die auf DNA-Sequenzunterschieden basiert, kann über den Nachweis einer Änderung in der elektrophoretischen Beweglichkeit der DNA-Fragmente im Gel, mit oder ohne denaturierende Agentien, erfolgen. Kleine Sequenzdeletionen und -insertionen können durch hochauflösende Gelelektrophorese sichtbar gemacht werden. DNA-Fragmente mit unterschiedlichen Sequenzen können auf denaturierenden Formamid-Gradientengelen unterschieden werden. Dabei wird die Beweglichkeit der unterschiedlichen DNA-Fragmente an unterschiedlichen Positionen im Gel, gemäß ihren spezifischen oder partiellen Schmelztemperaturen, verzögert (siehe z. B. Myers et al., Science 230: 1242 (1985)). Sequenzänderungen an bestimmten Stellen können ebenso durch Nuclease-Schutzversuche wie beispielsweise RNAse- und S1-Schutz oder durch das chemische Abspaltungsverfahren, aufgedeckt werden (z. B. Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397–4401 (1985)).
Daher kann der Nachweis einer spezifischen DNA-Sequenz durch Verfahren wie Hybridisierung, RNAse-Schutz, chemische Abspaltung, direkte DNA-Sequenzierung oder die Verwendung von Restriktionsenzymen (z. B. Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus („RFLP”)) und Southern-Blotting genomischer DNA, erfolgen.
Zusätzlich zu der eher herkömmlichen Gelelektrophorese und DNA-Sequenzierung können Mutationen auch durch in situ-Analysen nachgewiesen werden.
Chromosomen-Tests
Die erfindungsgemäßen Sequenzen sind auch nützlich für die Chromosomen-Identifizierung. Die Sequenz zielt spezifisch auf eine bestimmten Stelle auf einem individuellen menschlichen Chromosom, mit dem sie auch hybridisieren kann. Die Kartierung von DNAs auf Chromosomen gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein wichtiger erster Schritt bei der Korrelation solcher Sequenzen mit Genen, die mit einer Erkrankung in Verbindung stehen.
In dieser Hinsicht wurde in bestimmten, bevorzugen Ausführungsformen die hierin beschriebene cDNA verwendet, um genomische DNA eines DR4-Gens zu clonieren. Dies kann unter Verwendung einer Vielzahl von bekannten Verfahren und Genbanken, die im Allgemeinen im Handel erhältlich sind, erfolgen. Unter Verwendung von bekannten, zweckmäßigen Verfahren wird die genomische DNA für die in situ-Chromosomenkartierung verwendet.
Außerdem können durch das Bereitstellen von PCR-Primern aus der cDNA (vorzugsweise 15–25 bp) Sequenzen auf Chromosomen kartiert werden. Eine Computeranalyse der 3' untranslatierten Region des Gens wird verwendet, um schneit Primer auszuwählen, die nicht mehr als ein Exon in der genomischen DNA umspannen, da sonst der Amplifizierungsprozess erschwert werden würde. Diese Primer werden dann für das PCR-Durchmustern von somatischen Zellenhybriden, die individuelle menschliche Chromosomen enthalten, verwendet.
Um in einem Schritt eine präzise chromosomale Lokalisierung zu erhalten, kann die Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung („FISH”) eines cDNA-Clons an einem gespreiteten Metaphase-Chromosom angewendet werden. Dieses Verfahren kann mit ganz kurzer cDNA, von nur 50 oder 60, verwendet werden. Für einen Überblick über dieses Verfahren siehe Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988).
Sobald eine Sequenz auf einer genauen Chromosomenstelle kartiert worden ist, kann die physikalische Position der Sequenz auf dem Chromosom mit genetischen Kartendaten korreliert werden. Solche Daten werden zum Beispiel in V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man gefunden, online erhältlich über die John Hopkins University, Welch Medical Library. Die Beziehung zwischen Genen und Krankheiten, die auf der selben chromosomalen Regionen kartiert worden sind, werden dann durch Verknüpfungsanalysen (Co-Vererbung von physikalisch benachbarten Genen) identifiziert.
Als Nächstes ist es nötig die Unterschiede in der cDNA oder der genomischen Sequenz zwischen betroffenen und nicht-betroffenen Personen zu bestimmen. Wenn eine Mutation in einigen oder allen betroffenen Personen beobachtet wird, aber in keiner nicht-betroffenen Person, dann ist vermutlich die Mutation das verursachende Agens dieser Erkrankung.
Vektoren und Wirtszellen
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vektoren, die erfindungsgemäße DNA-Moleküle enthalten, Wirtszellen, die mit den erfindungsgemäßen Vektoren gentechnisch verändert wurden und die Herstellung von erfindungsgemäßen Polypeptiden durch rekombinante Verfahren.
Wirtszellen können gentechnisch verändert werden, um Nucleinsäuremoleküle einzuschleusen und erfindungsgemäße Polypeptide zu exprimieren. Die Polynucleotide können allein oder mit anderen Polynucleotiden eingeführt werden. Solche anderen Polynucleotide können unabhängig eingebracht, co-eingeschleust oder mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden verbunden eingeführt werden. In Übereinstimmung mit diesem Aspekt der Erfindung kann der Vektor zum Beispiel ein Plasmidvektor, ein einzel- oder doppelsträngiger Phagenvektor oder ein einzel- oder doppelsträngiger RNA- oder DNA-Virusvektor sein. Durch bekannte Verfahren zum Einbringen von DNA und RNA in Zellen, können solche Vektoren als Polynucleotide, vorzugsweise DNA, in Zellen eingebracht werden. Virale Vektoren können replikationsfähig oder replikationsdefekt sein. Im letzteren Fall wird die Virusvermehrung im Allgemeinen nur in komplementierendes Wirtszellen stattfinden. In bestimmter Hinsicht sind unter den bevorzugten Vektoren solche für die Expression von erfindungsgemäßen Polynucleotiden und Polypeptiden. Gewöhnlich enthalten solche Vektoren cis-wirkende Kontrollregionen, die wirksam bei der Expression in einem Wirt sind und funktionell mit dem zu exprimierenden Polynucleotid verbunden sind. Geeignete trans-wirkende Faktoren werden entweder von dem Wirt oder von einem komplementierenden Vektor bereitgestellt oder nach dem Einbringen in den Wirt durch den Vektor selbst geliefert.
Eine große Vielzahl von Expressionsvektoren können verwendet werden, um ein erfindungsgemäßes Polypeptid zu exprimieren. Solche Vektoren umfassen chromosomale, episomale und virusstämmige Vektoren, z. B. Vektoren, die von Bakterienplasmiden stammen, von Bakteriophagen, von Hefe-Episomen, von chromosomalen Hefe-Elementen, von Viren wie beispielsweise Baculoviren, Papovaviren wie zum Beispiel SV40, Vacciniaviren, Adenoviren, Hühnerpockenviren, Pseudorabiesviren und Retroviren und Vektoren, die aus Kombinationen davon stammen wie beispielweise diejenigen die von genetischen Elementen des Plasmids oder Bacteriophagen stammen, wie Cosmide und Phagemide, alle können für die Expression, in Übereinstimmung mit diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung, verwendet werden. Für die diesbezügliche Expression kann im Allgemeinen jeder Vektor, der geeignet ist Polynucleotide zu erhalten, zu propagieren oder zu exprimieren verwendet werden, um ein Polypeptid in einem Wirt zu exprimieren. Die DNA-Sequenz in dem Expressionsvektor ist funktionell verbunden mit den geeigneten Expressionskontrollsequenzen, einschließlich zum Beispiel eines Promotors, um die mRNA-Transkription zu regeln. Vertreter solcher Promotoren umfassen den Phagen Lambda PL-Promotor, die E. coli lac-, trp- und tac-Promotoren, den SV40 frühen und späten Promoter und Promotoren der retroviralen LTRs, um nur einige der bekannten Promotoren zu nennen. Generell werden Expressionskonstrukte Stellen für die Transkription, Initiation und Termination enthalten, sowie in der transkribierten Region eine Ribosomenbindungsstelle für die Translation. Der codierende Teil der reifen Transkripte, die von den Konstrukten exprimiert werden, wird am Anfang ein Translation-einleitendes AUG und am Ende des zu translatierenden Polypeptids ein entsprechend positioniertes Terminationscodon (UAA, UGA oder UAG) enthalten.
Zusätzlich können die Konstrukte Kontrollregionen enthalten, welche die Expression sowohl regulieren als auch erzeugen. im Allgemeinen werden solche Regionen durch die Kontrolle der Transkription wirken, unter anderem über Repressorbindungsstellen und Enhancer.
Vektoren für die Vermehrung und Expression werden gewöhnlich Selektionsmarker enthalten. Solche Marker können auch für die Amplifizierung geeignet sein oder die Vektoren können zusätzliche Marker für diesen Zweck enthalten. In dieser Hinsicht enthalten die Expressionsvektoren vorzugsweise ein oder mehrere selektierbare Markergene, um eine phänotypische Eigenschaft für die Selektion der transformierten Wirtszelle zu liefern. Bevorzugte Marker schließen Dihydrofolatreduktase- oder Neomycin-Resistenz für die eukaryontische Zellkultur und Tetracyclin- oder Ampicillin-Resistenzgene für die Kultur in E. coli oder anderen Bakterien ein.
Vektoren, die sowohl die entsprechende DNA-Sequenz wie an anderer Stelle beschrieben als auch einen geeigneten Promotor und andere zweckmäßige Kontrollsequenzen enthalten, können in einen geeigneten Wirt eingeschleust werden, unter Verwendung einer Vielzahl von bekannten Verfahren, die geeignet sind ein gewünschtes Polypeptid zu exprimieren. Maßgebliche Beispiele für geeignete Wirte umfassen Bakterienzellen wie beispielsweise E. coli-, Streptomyces- und Salmonella typhimurium-Zellen; Pilzzellen wie beispielsweise Hefezellen; Insektenzellen wie beispielsweise Drosophila S2- und Spodoptera Sf9-Zellen; tierische Zellen wie beispielsweise CHO, COS und Bowes Melanomzellen und pflanzliche Zellen. Wirte für eine große Vielzahl von Expressionskonstrukten sind bekannt und ein Fachmann wird durch die vorliegende Offenbarung leicht in der Lage sein, einen Wirt zur Expression eines Polypeptids, gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung, auszuwählen.
Unter den Vektoren, die für die Verwendung in Bakterien bevorzugt werden, sind pQE70, pQE60 und pQE9, erhältlich bei Quiagen, pBS-Vektoren, Phagescript-Vektoren, Bluescript-Vektoren, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, erhältlich bei Stratagene und ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5, erhältlich bei Pharmacia. Unter den bevorzugten eukaryontischen Vektoren sind pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 und pSG, erhältlich bei Stratagene und pSVK3, pBPV, pMSG und pSVL, erhältlich bei Pharmacia. Diese Vektoren werden aus den vielen im Handel erhältlichen und bekannten Vektoren, die für Fachleute verfügbar sind, lediglich zur Veranschaulichung aufgelistet.
Die Auswahl geeigneter Vektoren und Promotoren für die Expression in einer Wirtszelle ist ein bekanntes Verfahren und die erforderlichen Techniken für die Konstruktion des Expressionsvektors, das Einbringen des Vektors in den Wirt und die Expression im Wirt stellen auf dem Fachgebiet Routinefertigkeiten dar.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Wirtszellen, welche die vorstehend beschriebenen und behandelten Konstrukte enthalten. Die Wirtszelle kann eine höhere eukaryontische Zelle wie beispielsweise eine Sängerzelle sein oder eine niedere eukaryontische Zelle wie beispielsweise eine Hefezelle, oder die Wirtszelle kann eine prokaryontische Zelle wie beispielsweise eine Bakterienzelle sein. Das Einbringen des Konstrukts in die Wirtszelle kann mittels Calciumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextran-vermittelter Transfektion, kationischem Lipid-vermittelter Transfektion, Elektroporation, Transduktion, Infektion oder anderen Verfahren, erfolgen. Solche Verfahren werden in vielen Standardlaborhandbüchern wie zum Beispiel Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986), beschrieben.
Das Polypeptid kann in einer modifizieren Form exprimiert werden wie beispielsweise als Fusionsprotein und kann nicht nur Sekretionssignale sondern auch zusätzliche heterologe funktionelle Regionen beinhalten. Daher kann zum Beispiel eine Region mit zusätzlichen Aminosäuren, insbesondere geladenen Aminosäuren, am N-Terminus des Polypeptids angefügt werden, um die Stabilität und Persistenz in der Wirtszelle, während der Aufreinigung oder während der nachfolgenden Handhabung und Lagerung zu verbessern. Ebenso kann dem Polypeptid eine Region angefügt werden, um die Aufreinigung zu erleichtern. Solche Regionen können vor der endgültigen Aufbereitung des Polypeptids entfernt werden. Das Hinzufügen von Peptideinheiten an das Polypeptid, um die Sekretion oder Exkretion zu ermöglichen, um die Stabilität zu verbessern und um die Aufreinigung zu erleichtern sind unter anderem auf dem Fachgebiet geläufige und routinemäßige Verfahren. Ein bevorzugtes Fusionsprotein umfasst eine heterologe Region eines Immunglobulins, die nützlich ist, um Proteine löslich zu machen. Zum Beispiel beschreibt die EP-A-0 464 533 (Kanadische Entsprechung 2045869) Fusionsproteine, die verschiedene Teile der konstanten Region von Immunglobulinmolekülen zusammen mit einem anderen menschlichen Protein oder einem Teil davon enthalten. In vielen Fällen ist der Fc-Teil in einem Fusionsprotein durchweg von Vorteil für die Verwendung in Therapie und Diagnose und führt zum Beispiel zu verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften ( EP-A 0232 262 ). Auf der anderen Seite wäre es für einige Verwendungszwecke wünschenswert in der Lage zu sein, den Fc-Teil, nachdem das Fusionsprotein in der beschriebenen vorteilhaften Art und Weise exprimiert, nachgewiesen und aufgereinigt worden ist, zu entfernen. Dies ist der Fall, wenn der Fc-Teil sich als Hindernis bei der Verwendung in Therapie und Diagnose erweist, zum Beispiel wenn das Fusionsprotein als Antigen für die Immunisierung verwendet werden soll. Beispielsweise sind bei der Arzneimittelentwicklung menschliche Proteine wie hlL-5 mit Fc-Teilen für Durchmusterungstests im Hochdurchsatz fusioniert worden, um Antagonisten von hlL-5 zu identifizieren. Siehe Bennett, D. et al., Journal of Molecular Recognition, Vol. 8: 52–58 (1995) und Johanson, K. et al., The Jounal of Biological Chemistry, Vol. 270, Nr. 16: 9459–9471 (1995).
Die DR4-Polypeptide können aus rekombinanten Zellkulturen mittels bekannter Verfahren, einschließlich Ammoniumsulfat- oder Ethanol-Präzipitation, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie, Phosphozellulosechromatographie, Chromatographie durch hydrophobe Wechselwirkungen, Affinitätschromatographie, Hydroxylapatitchromatographie und Lektinchromatographie gewonnen und aufgereinigt werden. Vorzugsweise wird die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie („HPLC”) für die Aufreinigung verwendet. Bekannte Verfahren für die Rückfaltung des Proteins können eingesetzt werden, um die aktive Konformation wieder herzustellen, wenn das Polypeptid während der Isolierung und/oder Aufreinigung des Peptids denaturiert wurde.
Zu den erfindungsgemäßen Polypeptiden gehören natürlich aufgereinigte Produkte, Produkte aus chemischen Syntheseverfahren und Produkte, die mittels Rekombinationsverfahren aus prokaryontischen oder eukaryontischen Wirten, einschließlich zum Beispiel Bakterien-, Hefe-, höhere Pflanzen-, Insekten- und Sängerzellen hergestellt wurden. Abhängig vom Wirt, der bei einem rekombinanten Herstellungsverfahren verwendet wurde, können die erfindungsgemäßen Polypeptide glycosyliert oder unglycosyliert sein. Außerdem können erfindungsgemäße Polypeptide einen modifizierten Startmethioninrest enthaften, in einigen Fällen als Ergebnis eines Wirts-vermittelten Prozesses.
DR4-Polynucleotide und Polypeptide können gemäß der vorliegenden Erfindung für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden, insbesondere solche, welche die chemischen und biologischen Eigenschaften von DR4 nutzen. Unter ihnen sind Anwendungen bei der Behandlung von Tumoren, der Resistenz gegenüber Parasiten, Bakterien und Viren, zur Induktion der Proliferation von T-Zellen, Endothelzellen und bestimmten hämatopoetischen Zellen, zum Behandeln einer Restenose, Transplantat-gegen-Empfänger-Krankheit, zum Regulieren der antiviralen Antwort und zur Verhinderung bestimmter Autoimmunkrankheiten nach der Stimulation von DR4 durch einen Agonisten. Zusätzliche Anwendungen betreffen die Diagnose und Behandlung von Krankheiten der Zellen, Gewebe und Organismen. Diese Aspekte der Erfindung werden nachstehend weiter erläutert.
DR4 Polypeptide und Fragmente
Ferner liefert die Erfindung ein isoliertes DR4-Polypeptid, das eine in 1 gezeigte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2) aufweist, oder ein Peptid oder Polypeptid, das einen Teil des vorstehenden Polypeptids wie in den Ansprüchen definiert enthält.
Um die Eigenschaften der DR4-Polypeptide zu verbessern oder zu ändern, kann eine gezielte gentechnische Veränderung von Proteinen durchgeführt werden. Unter Fachleuten bekannte Rekombinante-DNA-Technologie kann verwendet werden, um neue mutierte Proteine oder „Muteine” zu schaffen, dazu gehören einzelne oder vielfache Aminosäureaustausche, Deletionen, Additionen oder Fusionsproteine. Solch modifizierten Polypeptide können z. B. eine gesteigerte Aktivität oder erhöhte Stabilität zeigen. Des Weiteren können sie mit höherer Ausbeute aufgereinigt werden und zeigen eine bessere Löslichkeit als die entsprechenden natürlichen Polypeptide, zumindest unter bestimmten Aufreinigungs- und Lagerungsbedingungen.
Zum Beispiel ist für viele Proteine, einschließlich der extrazellulären Domäne eines membrangebundenen Proteins oder der reife/n Form/en eines sezernierten Proteins, auf dem Fachgebiet bekannt, dass eine oder mehrere Aminosäuren vom N-Terminus oder C-Terminus ohne wesentlichen Verlust der biologischen Funktion entfernt werden können. Beispielsweise beschrieben Ron et al., J. Biol. Chem., 268: 2984–2988 (1993) KGF-Proteine, die eine Heparin-Bindungsaktivität aufwiesen, auch wenn 3, 8 oder 27 amino-terminale Aminosäurereste fehlten. Im vorliegenden Fall können, da das erfindungsgemäße Protein ein Mitglied der „Death-Domain”-enthaltenden Rezeptor (DDCR)-Polypeptid-Familie ist, Deletionen der N-terminalen Aminosäuren bis zum Cysteinrest der Position 132 in der SEQ ID NO: 2 einige biologische Aktivität wie beispielsweise die Fähigkeit die Apoptose zu induzieren, behalten. Von Polypeptiden, die weitere N-terminale Deletionen aufweisen, einschließlich dem Cysteinrest der Position 132 (C-132) in der SEQ ID NO: 2, würde man nicht erwarten, dass sie solch biologische Aktivitäten behalten, da dieser Rest unter den Familienmitgliedern konserviert ist, siehe 2. Möglicherweise ist er zur Ausbildung einer Disulfid-Brücke erforderlich, um die strukturelle Stabilität zu liefern, die für die Rezeptorbindung nötig ist.
Allerdings können, auch wenn die Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren vom N-Terminus eines Proteins zur Modifikation oder dem Verlust einer oder mehrerer biologischer Funktionen des Proteins führt, andere biologische Funktionen nach wie vor erhalten bleiben. Daher wird die Fähigkeit des verkürzten Proteins, Antikörper, die das vollständige Protein oder die extrazelluläre Domäne des Proteins erkennen, zu induzieren und/oder zu binden, gewöhnlich erhalten bleiben, wenn weniger als die Mehrheit der Reste des vollständigen Proteins oder der extrazellulären Domäne des Proteins vom N-Terminus entfernt werden. Ob ein bestimmtes Polypeptid, dem N-terminale Reste eines vollständigen Proteins fehlen, solch immunologische Aktivitäten beibehält, kann leicht mittels Routineverfahren, die hierin beschrieben werden und auch sonst auf dem Fachgebiet bekannt sind, bestimmt werden.
Demgemäß liefert die vorliegende Offenbarung des Weiteren Polypeptide, bei denen eine oder mehrere Reste vom Amino-Terminus der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz von DR4 bis zum C-132-Rest, entfernt wurden und Polynucleotide, die solche Polypeptide codieren. Insbesondere liefert die vorliegende Erfindung Polypeptide, welche die Aminosäuresequenz der Reste n–468 der SEQ ID NO: 2 enthält, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von 1–132 ist, wobei angenommen wird, dass C-132 der erste Rest vom N-Terminus der extrazellulären Domänen des DR4-Polypeptids (gezeigt in SEQ ID NO: 2) ist, der für die Rezeptor/Ligand-Bindungsaktivität (z. B. TRAIL-Bindung) des DR4-Proteins erforderlich ist. Polynucleotide, die diese Polypeptide codieren, werden ebenso geliefert.
Gleichermaßen sind viele Beispiele von biologisch funktionsfähigen C-terminalen Deletionsmuteinen bekannt. Zum Beispiel zeigt Interferon Gamma bis zu zehn mal höhere Aktivitäten durch die Deletion von 8–10 Aminosäureresten vom Carboxy-Terminus des Proteins (Döbeli et al., J. Biotechnology 7: 199–216 (1988)). Im vorliegenden Fall können, da das erfindungsgemäße Protein ein Mitglied der DDCR-Polypeptid Familie ist, Deletionen von C-terminalen Aminosäuren bis zum Cystein der Position 221 (C-221) der SEQ ID No: 2 einige biologische Aktivität wie Rezeptorbindung erhalten. Von Polypeptiden, die weitere C-terminale Deletionen, einschließlich C-221 der SEQ ID NO: 2 aufweisen, würde nicht erwartet, dass sie solche biologischen Aktivitäten erhalten, da dieser Rest unter den DDCR-Familienmitgliedern konserviert ist und zur Ausbildung einer Disulfid-Brücke erforderlich ist, um die strukturelle Stabilität zu liefern, die für die Rezeptor/Ligandbindung nötig ist.
Allerdings können auch, wenn die Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren vom C-Terminus eines Proteins zur Modifikation oder dem Verlust einer oder mehrerer biologischer Funktionen des Proteins führt, andere biologische Funktionen nach wie vor erhalten bleiben. Daher wird die Fähigkeit des verkürzten Proteins, Antikörper, die das vollständige Protein oder die extrazelluläre Domäne des Proteins erkennen, zu induzieren und/oder zu binden, gewöhnlich erhalten bleiben, wenn weniger als die Mehrheit der Reste des vollständigen Proteins oder der extrazellulären Domäne des Proteins vom C-Terminus entfernt werden. Ob ein bestimmtes Polypeptid, dem C-terminale Reste eines vollständigen Proteins fehlen, solch immunologische Aktivitäten beibehält, kann leicht mittels Routineverfahren, die hierin beschrieben werden und auch sonst auf dem Fachgebiet bekannt sind, bestimmt werden.
Demgemäß liefert die vorliegende Offenbarung des Weiteren Polypeptide, bei denen einer oder mehrere Reste vom Carboxy-Terminus der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz von DR4, bis zum C-221-Rest der SEQ ID NO: 2, entfernt wurden und Polynucleotide, die solche Polypeptide codieren. Insbesondere liefert die vorliegende Erfindung Polypeptide, die die Aminosäuresequenz der Reste 1–m der Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 2 enthält, wobei m irgendeine ganze Zahl im Bereich von 221–468 ist, und der Rest C-221 die Position des ersten Rests vom C-Terminus des vollständigen DR4-Polypeptids (gezeigt in SEQ ID NO: 2) ist, von dem angenommen wird, dass er für die Rezeptor-Bindungsaktivität des DR4-Proteins erforderlich ist. Polynucleotide, die diese Polypeptide codieren werden ebenso geliefert.
Die Offenbarung liefert auch Polypeptide, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren sowohl am Amino- als auch Carboxy-Terminus entfernt wurden, allgemein beschrieben weisen sie die Reste n–m der SEQ ID NO: 2 auf, wobei n und m wie vorstehend beschrieben ganze Zahlen darstellen.
Dazu gehört auch eine Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, welches aus einem Teil der vollständigen DR4-Aminosäuresequenz besteht, die von dem cDNA-Clon codiert wird, der in der ATCC-Hinterlegungsnummer 97853 enthalten ist, wobei dieser Teil die Aminosäuren 1 bis etwa 108 des Amino-Terminus der vollständigen Aminosäuresequenz, die von dem cDNA-Clon codiert wird, der in der ATCC-Hinterlegungsnummer 97853 enthalten ist, ausschließt oder die Aminosäuren 1 bis etwa 247 vom Carboxy-Terminus oder jede Kombination der vorstehenden amino- und carboxy-terminalen Deletionen der vollständigen Aminosäuresequenz, die von dem cDNA-Clon codiert wird, der in der ATCC-Hinterlegungsnummer 97853 enthalten ist. Ebenso werden Polynucleotide geliefert, die alle der vorstehenden deletionsmutierten Polypeptidformen codieren.
Unter den N- und C-terminalen Deletionsmutanten werden solche bevorzugt, die nur einen Teil der extrazellulären Domäne, d. h. innerhalb der Reste 24–238, umfassen, da erwartet wird, dass jeder Teil darin löslich ist.
Auf dem Fachgebiet wird man erkennen, dass einige Aminosäuresequenzen von DR4 ohne signifikante Wirkung auf die Struktur oder Funktion des Proteins verändert werden können. Bei der Betrachtung solcher Unterschiede in der Sequenz sollte man in Erinnerung behalten, dass es auf dem Protein kritische Bereiche gibt, welche die Aktivität bestimmen. Solche Bereiche werden gewöhnlich Reste umfassen, welche die Ligandenbindungsstelle oder die „Death-Domain” ausmachen, oder welche Tertiärstrukturen ausbilden, die diese Domänen beeinflussen.
Daher umfasst die Erfindung des Weiteren Variationen des DR4-Proteins wie in den Ansprüchen definiert, die eine beachtliche DR4-Proteinaktivität zeigen, oder die DR4-Regionen wie die nachstehend erläuterten Proteinfragmente umfassen. Zu derartigen Mutanten gehören Deletionen, Insertionen, Inversionen, Wiederholungen und Typ-Substitutionen. Wie vorstehend angedeutet, kann eine Anleitung hinsichtlich der Aminosäureänderungen, die wahrscheinlich phänotypisch stumm sind, in Bowie, J. U. et al., Science 247: 1306–1310 (1990) gefunden werden.
Von besonderem Interesse sind Austausche von geladenen Aminosäuren mit anderen geladenen Aminosäuren und mit neutralen oder negativ geladenen Aminosäuren. Die Letzteren haben Proteine zur Folge, die eine geringere positive Ladung aufweisen, um die Eigenschaften des DR4-Proteins zu verbessern. Die Verhinderung einer Aggregation ist höchst erwünscht. Die Aggregation von Proteinen führt nicht nur zum Verlust der Aktivität, sondern kann auch problematisch sein für die Herstellung von Arzneimitteln, da sie immunogen sein können (Pinckard et al., Clin. Exp. Immunol. 2: 331–340 (1967); Robbins et al., Diabetes 36: 838–845 (1987); Cleland et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10: 307–377 (1993)).
Das Ersetzen von Aminosäuren kann auch die Selektivität der Bindung an Zelloberflächenrezeptoren ändern. Ostade et al., Nature 361: 266–268 (1993) beschreibt bestimmte Mutationen, die dazu führen, dass TNF-alpha selektiv nur an einen der zwei bekannten Typen von TNF-Rezeptoren bindet. Daher kann der erfindungsgemäße DR4-Rezeptor eine oder mehrere Aminosäureaustausche, -deletionen oder -additionen aufweisen, entweder von natürlichen Mutationen oder durch menschliches Eingreifen, im Rahmen der Ansprüche.

Wie angedeutet sind Änderungen vorzugsweise geringer Natur wie beispielsweise konservative Aminosäureaustausche, die nicht signifikant die Faltung oder Aktivität des Proteins beeinflussen (siehe Tabelle 1). Tabelle 1. Konservative Aminosäureaustausche.

Aromatisch	Phenylalanin Tryptophan Tyrosin
Hydrophob	Leucin Isoleucin Valin
Polar	Glutamin Asparagin
Basisch	Arginin Lysin Histidin
Sauer	Asparaginsäure Glutaminsäure
Klein	Alanin Serie Threonin Methionin Glycin

Aminosäuren im erfindungsgemäßen DR4-Protein, die für die Funktion unentbehrlich sind, können mittels auf dem Fachgebiet bekannten Verfahrer wie beispielsweise ortsgerichtete Mutagenese oder Alanin-Scanning-Mutagenese identifiziert werden (Cunningham und Wells, Science 244: 1081–1085 (1989)). Das letztere Verfahren führt einzelne Alanin-Mutationen an jedem Rest im Molekül ein. Die so entstandenen mutierten Moleküle werden dann bezüglich ihrer biologischen Aktivität gemessen wie beispielsweise Rezeptorbindung oder in vitro- oder in vitro-Proliferationsaktivität.
Stellen, die kritisch sind für die Ligand/Rezeptor-Bindung können auch durch Strukturanalyse wie beispielsweise Kristallisation, magnetische Kernresonanz oder Photoaffinitätsmarkierung bestimmt werden (Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899–904 (1992) und de Vos et al., Science 255: 306–312 (1992)).
Die erfindungsgemäßen Polypeptide werden vorzugsweise in einer isolieren Form bereitgestellt und sind vorzugsweise im Wesentlichen aufgereinigt. Eine rekombinant hergestellte Version des DR4-Polypeptids wird im Wesentlichen mittels Einstufenverfahren, beschrieben in Smith und Johnson, Gene 67: 31–40 (1988), aufgereinigt.
Zu den erfindungsgemäßen Polypeptiden gehört auch das Polypeptid, das von der hinterlegten cDNA einschließlich Leadersequenz codiert wird, das reife Polypeptid, das von der hinterlegten cDNA ohne Leadersequenz (d. h. das reife Protein) codiert wird, das Polypeptid der 1 (SEQ ID NO: 2) einschließlich Leadersequenz, das Polypeptid der 1 (SEQ ID NO: 2) ohne das amino-terminale Methionin, das Polypeptid der 1 (SEQ ID NO: 2) ohne Leadersequenz, die extrazelluläre Domäne, lösliche Polypeptide, welche die vollständigen extrazellulären und intrazellulären Domänen enthalten, denen aber die Transmembrandomäne fehlt, genauso wie Polypeptide, die mindestens 95% identisch, stärker bevorzugt mindestens 96%, 97%, 98% oder 99% identisch sind zu dem Polypeptid, das von den hinterlegten cDNA-Clonen codiert wird oder zu dem Polypeptid aus 1 (SEQ ID NO: 2) und dazu gehören auch Teile solcher Polypeptide wie in den Ansprüchen definiert.
Mit einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens zum Beispiel 95% „identisch” ist mit einer Bezugsaminosäuresequenz eines DR4-Polypeptids ist gemeint, dass die Aminosäuresequenz des Polypeptids identisch ist mit der Bezugssequenz mit Ausnahme, dass die Polypeptidsequenz bis zu fünf Aminosäureänderungen je 100 Aminosäuren der Bezugsaminosäure des DR4-Polypeptids enthalten kann. In anderen Worten, um ein Polypeptid zu erhalten, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens zu 95% identisch ist zu einer Bezugsaminosäuresequenz, können bis zu 5% der Aminosäurereste in der Bezugssequenz deletiert oder durch eine andere Aminosäure ersetzt sein, oder eine Aminosäureanzahl von bis zu 5% der gesamten Aminosäurereste der Bezugssequenz können in die Bezugssequenz eingefügt werden. Diese Änderungen der Bezugssequenz können an den amino- oder carboxy-terminalen Positionen der Bezugsaminosäuresequenz oder irgendwo zwischen diesen terminalen Positionen vorkommen, entweder individuell verstreut über die Reste der Bezugssequenz oder in einer oder mehreren aufeinanderfolgenden Gruppen innerhalb der Bezugssequenz.
Ob ein bestimmtes Polypeptid mindestens 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch ist mit zum Beispiel der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2) oder der Aminosäuresequenz, die von dem hinterlegten cDNA-Clon codiert wird, kann in praktischer Hinsicht im Allgemeinen unter Verwendung von bekannten Computerprogrammen wie beispielsweise das Bestfit-Programm (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 für Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) bestimmt werden. Bei der Verwendung von Bestfit oder irgendeinem anderen Sequenzalignment-Programm zur Bestimmung, ob eine bestimmte Sequenz zum Beispiel 95% identisch ist mit einer erfindungsgemäßen Bezugssequenz, werden die Parameter so eingestellt, dass natürlich die prozentuale Identität über die volle Länge der Bezugsaminosäuresequenz berechnet wird und Lücken in der Homologie bis zu 5% der gesamten Anzahl von Aminosäureresten der Bezugssequenz erlaubt sind.
Die hier genannten Erfinder haben entdeckt, dass das DR4-Polypeptid ein Protein mit 468 Resten ist, das drei Hauptstrukturdomänen aufweist. Zuerst wurde die Ligandenbindungsdomäne innerhalb der Reste von etwa 24 bis etwa 238 in 1 (SEQ ID NO: 2) identifiziert. Als zweites wurde die Transmembrandomäne innerhalb der Reste von etwa 239 bis etwa 264 in 1 (SEQ ID NO: 2) identifiziert. Als drittes wurde die intrazelluläre Domäne innerhalb der Reste von etwa 265 bis etwa 468 in 1 (SEQ ID NO: 2) identifiziert. Nennenswerterweise enthält die intrazelluläre Domäne eine „Death-Domain” bei den Resten von etwa 379 bis etwa 422. Weitere bevorzugte Fragmente des in 1 (SEQ ID NO: 2) gezeigten Polypeptids schließen das reife Protein von den Resten um etwa 24 bis etwa 468 und lösliche Polypeptide, welche die vollständigen extrazellulären und intrazellulären Domänen enthalten, denen aber die Transmembrandomäne fehlt, ein.
Ferner liefert die Erfindung DR4-Polypeptide, die von dem hinterlegten cDNA-Clon einschließlich Leadersequenz codiert werden, und DR4-Polypeptidfragmente, ausgewählt aus dem reifen Protein und der extrazellulären Domäne.
In einem andern Aspekt liefert die Offenbarung ein Peptid oder Polypeptid, das einen Epitop-tragenden Teil eines hierin beschriebenen Polypeptides enthält. Das Epitop dieses Polypeptidteils ist ein immunogenes oder antigenes Epitop eines erfindungsgemäßen Polypeptides. Ein „immunogenes Epitop” ist definiert als ein Teil eines Proteins, der eine Antikörperantwort hervorruft, wenn das ganze Protein das Immunogen ist. Auf der andern Seite ist ein Bereich eines Proteinmoleküls an den ein Antikörper binden kann definiert als ein „antigenes Epitop”. Die Anzahl von immunogenen Epitopen eines Proteins ist im Allgemeinen geringer als die Anzahl der antigenen Epitope. Siehe zum Beispiel Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998–4002 (1983).
Im Hinblick auf die Auswahl der Peptide oder Polypeptide, die ein antigenes Epitop tragen (d. h. die eine Region eines Proteinmoleküls enthalten, an die ein Antikörper binden kann), ist auf dem Fachgebiet bekannt, dass relativ kurze, synthetische Peptide, die einen Teil einer Proteinsequenz nachahmen, geeignet sind, routinemäßig ein Antiserum, das mit dem teilweise nachgeahmten Protein reagiert, hervorzubringen. Siehe zum Beispiel Sutcliffe, J. G., Shinnick, T. M., Green, N. und Learner, R. A., Antibodies that react with predetermined sites an Proteins, Science 219: 660–666 (1983). Peptide, die fähig sind, Protein-reaktive Seren hervorzubringen, sind häufig in der Primärsequenz eines Proteins vertreten, können mit einem Satz von einfachen chemischen Regeln charakterisiert werden und sind weder auf immundominante Regionen eines intakten Proteins (d. h. immunogene Epitope) noch auf die Amino- oder Carboxy-Termini beschränkt.
Antigene, Epitop-tragende Peptide und Polypeptide sind daher nützlich, um Antikörper, einschließlich monoclonale Antikörper, die spezifisch an ein erfindungsgemäßes Polypeptid binden, hervorzubringen. Siehe zum Beispiel Wilson et al., Cell 37: 767–778 (1984) auf Seite 777.
Antigene, Epitop-tragende Peptide und Polypeptide enthalten vorzugsweise eine Sequenz von mindestens sieben, stärker bevorzugt mindestens neun und am meisten bevorzugt zwischen mindestens 15 bis etwa 30 Aminosäuren, innerhalb der Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen Polypeptids.
Nicht-einschränkende Beispiele von antigenen Polypeptiden oder Peptiden, die verwendet werden können, um DR4-spezifische Antikörper herzustellen, umfassen: ein Polypeptid, das die Aminosäurereste von etwa 35 bis etwa 92 in 1 (SEQ ID NO: 2) enthält, ein Polypeptid, das die Aminosäurereste von etwa 114 bis etwa 160 in 1 (SEQ ID NO: 2) enthält, ein Polypeptid, das die Aminosäurereste von etwa 169 bis etwa 240 in 1 (SEQ ID NO: 2) enthält, ein Polypeptid, das die Aminosäurereste von etwa 267 bis etwa 298 in 1 (SEQ ID NO: 2) enthält, ein Polypeptid, das die Aminosäurereste von etwa 330 bis etwa 364 in 1 (SEQ ID NO: 2) enthält, ein Polypeptid, das die Aminosäurereste von etwa 391 bis etwa 404 in 1 (SEQ ID NO: 2) enthält und ein Polypeptid, das die Aminosäurereste von etwa 418 bis etwa 465 in 1 (SEQ ID NO: 2) enthält. Wie vorstehend angedeutet, haben die Erfinder festgestellt, dass die vorstehenden Polypeptidfragmente antigene Regionen des DR4-Proteins sind.
Die Epitop-tragenden Peptide und Polypeptide der Erfindung können durch jedes konventionelle Mittel hergestellt werden (Houghten, R. A., „General method for the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptides: specificity of antigenantibody interaction at the level of individual amino acids”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131–5135 (1985)). Dieses Verfahren der simultanen, multiplen Peptidsynthese” (SMPS) wird weiter beschrieben in U.S. Patentnummer 4,631,211 zu Houghten et al. (1986).
Wie der Fachmann erkennen wird, können erfindungsgemäße DR4-Polypeptide und die vorstehend beschriebenen Epitop-tragenden Fragmente davon mit Teilen der konstanten Domäne von Immunglobulinen (IgG) kombiniert werden, was chimäre Polypeptide ergibt. Diese Fusionsprotein vereinfachen die Aufreinigung und zeigen in vivo eine erhöhte Halbwertszeit. Gezeigt worden ist dies z. B. für chimäre Proteine, die aus den ersten zwei Domänen des menschlichen CD4-Polypeptids und verschiedenen Domänen der konstanten Regionen der schweren oder leichten Kette von Säugerimmunglobulinen bestehen (EPA 394,827, Traunecker et al., Nature 331: 84–86 (1988)). Fusionsproteine, die wegen des IgG-Teils eine über Disulfid-Brücken verbundene dimere Struktur aufweisen, können auch effizienter in der Bindung und Neutralisation anderer Moleküle sein, als das monomere DR4-Protein oder Proteinfragment allein (Fountoulakis et al., J. Biochem. 270: 3958–3964 (1995)).
Polypeptid-Tests
Die vorliegende Erfindung betrifft auch diagnostische Tests wie beispielsweise quantitative und diagnostische Tests für den Nachweis der Spiegel an DR4-Protein oder der löslichen Form davon, in Zellen und Geweben, einschließlich der Bestimmung von normalen und abnormalen Spiegeln. Daher kann zum Beispiel ein erfindungsgemäßer diagnostischer Test zum Nachweis der Überexpression von DR4 oder einer löslichen Form davon, verglichen mit normalen Kontrollgewebeproben, verwendet werden, um die Anwesenheit von zum Beispiel Tumoren nachzuweisen. Testverfahren, die verwendet werden können, um Proteinspiegel wie beispielsweise ein erfindungsgemäßes DR4-Protein oder eine lösliche Form davon, in einer Probe, die von einem Wirt stammt, nachzuweisen, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Diese Testverfahren schließen Radioimmuntests, kompetitive Bindungstests, Western-Blot-Analyse und ELISA-Tests ein.
Das Testen von DR4-Proteinspiegeln in einer biologischen Probe kann unter Verwendung jedes auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren erfolgen. Für das Testen von DR4-Proteinspiegeln in einer biologischen Probe werden Antikörper-basierte Verfahren bevorzugt. Zum Beispiel kann die DR4-Proteinexpression in Geweben mit klassischen immunhistologischen Verfahren untersucht werden (Jalkanen, M., et al., J. Cell. Biol. 101: 976–985 (1985); Jalkanen, M., et al., J. Cell. Biol. 105: 3087–3096 (1987)).
Andere Antikörper-basierte Verfahren, die nützlich für den Nachweis der DR4-Proteingenexpression sind, schließen Immuntests wie beispielsweise den Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest (ELISA) und den Radioimmuntest (RIA) ein. Geeignete Markierungen sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen Enzymmarkierungen wie beispielsweise Glucoseoxidase, Radioisotope wie beispielsweise Iod (¹²⁵I, ¹²¹I), Kohlenstoff (¹⁴C), Schwefel (³⁵S), Tritium (³H), Indium (¹¹²In) und Technetium (^99mTc), Fluoreszenzmarkierungen wie beispielweise Fluorescein und Rhodamin, und Biotin.
Therapeutika
Die Tumornekrosefaktor (TNF)-Familie-Liganden sind bekannt dafür, unter den am meisten pleiotropen Cytokinen zu sein, die eine große Anzahl zellulärer Antworten induziert, einschließlich Cytotoxizität, antivirale Aktivität, immunregulatorische Aktivitäten und die transkriptionelle Regulation mehrerer Gene (Goeddel, D. V. et al., „Tumor Necrosis Factors: Gene Structure and Biological Activities”. Symp. Quant. Biol. 51: 597–609 (1986), Cold Spring Harbor; Beutler, B. und Cerami, A., Annu. Rev. Biochem. 57: 505–518 (1988); Old, L. J., Sci. Am. 258: 59–75 (1988); Fiers, W., FEBS Lett. 285: 199–224 (1991)). Die Liganden der TNF-Familie induzieren solch verschiedene zelluläre Antworten durch das Binden an Rezeptoren der TNF-Familie, einschließlich dem erfindungsgemäßen DR4. Zellen, die das DR4-Polypeptid exprimieren und von denen angenommen wird, dass sie eine wirksame zelluläre Antwort gegenüber DR4-Liganden aufweisen, umfassen: amniotische Zellen, Herz, Leberkrebs, Nieren, Leukocyten des peripheren Bluts, aktivierte T-Zellen, zu Th2-Zellen korrespondierendes Gewebe, menschliche Mandeln und CD34 abgereicherte Leukocyten- und Thrombocytenschicht (Nabelschnurblut). Mit „eine zelluläre Antwort gegenüber einem TNF-Familie-Liganden” ist irgendeine genotypische, phänotypische und/oder morphologische Änderung an einer Zelle, Zelllinie, Gewebe, Gewebekultur oder einem Patienten, die durch ein TNF-Familie-Liganden induziert wird, gemeint. Wie angedeutet, schließen solche zellulären Antworten nicht nur normale physiologische Antworten gegenüber den Liganden der TNF-Familie sondern auch Krankheiten, die mit erhöhter Apoptose verbunden sind, oder die Hemmung der Apoptose ein. Der Apoptose-induzierte programmierte Zelltod ist ein physiologischer Mechanismus, der in die Entfernung von peripheren T-Lymphocyten des Immunsystems verwickelt ist, und seine Dysregulation kann zu einer Zahl von verschieden pathogenen Prozessen führen (Ameisen, J. C., AXDS 8: 1197–1213 (1994); Krammer, P. H. et al., Curr. Opin. Immunol. 6: 279–289 (1994)).
Krankheiten, die mit einem erhöhten Zellüberleben verbunden sind oder der Hemmung der Apoptose, umfassen Krebsarten (wie beispielsweise Follikuläre Lymphome, Karzinome mit p53-Mutationen und Hormon-abhängige Tumore wie Brustkrebs, Prostatakrebs, Kaposi-Sarkom und Eierstockkrebs), Autoimmunkrankheiten (wie systemischer Lupus erythematodes und immun-vermittelter Glomerulonephritis Rheumatoide Arthritis) und virale Infektionen (wie Herpes Viren, Poxviren und Adenoviren), Hinweis auf Transplantat-gegen-Empfänger-Krankheit, akute Abstoßungsreaktion und chronische Abstoßungsreaktion. Krankheiten, die mit einer erhöhten Apoptose verbunden sind umfassen AIDS, neurodegenerative Erkrankungen (wie beispielsweise Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Amyotrophe Lateralsklerose, Retinitis pigmentosa, Kleinhirndegeneration), myelodysplastische Syndrome (wie beispielsweise Aplastische Anämie), ischämische Verletzung (wie beispielsweise solche, die durch Myokardinfarkt, Schlaganfall und Reperfusionsverletzung verursacht werden), Toxin-induzierte Lebererkrankung (wie beispielsweise auf Alkohol zurückzuführende), septischer Schock, Kachexie und Anorexie.
Daher ist die vorliegende Erfindung in einem Aspekt auf ein Verfahren zur Verstärkung der durch einen Liganden der TNF-Familie induzierten Apoptose gerichtet. Dazu gehört die Verabreichung einer wirksamen Menge des DR4-Liganden, eines Analogons oder eines Agonisten, der in der Lage ist die DR4-vermittelte Signalgebung zu erhöhen, an eine Zelle, die das DR4-Poypeptid exprimiert. Vorzugsweise wird die DR4-vermittelte Signalgebung erhöht, um eine Krankheit zu behandeln, bei der eine verminderte Apoptose oder verminderte Cytokin- und Adhesionsmolekülexpression vorliegt. Ein Agonist kann lösliche Formen von DR4 und monoclonale Antikörper, die gegen das DR4-Polypeptid gerichtet sind, umfassen.
In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung an ein Verfahren zur Hemmung der durch einen TNF-Familie-Liganden induzierten Apoptose. Dazu gehört die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Antagonisten, der in der Lage ist die DR4-vermittelte Signalgebung herabzusetzen, an eine Zelle, die das DR4-Poypeptid exprimiert. Vorzugsweise wird die DR4-vermittelte Signalgebung herabgesetzt, um eine Krankheit zu behandeln, bei der eine erhöhte Apoptose oder NFκB-Expression vorliegt. Ein Antagonist kann lösliche Formen von DR4 und monoclonale Antikörper, die gegen das DR4-Polypeptid gerichtet sind, umfassen. Mit „Agonist” sind natürlich vorkommende und synthetische Verbindungen gemeint, die in der Lage sind, die Apoptose zu verstärken oder zu potenzieren. Mit „Antagonist” sind natürlich vorkommende und synthetische Verbindungen gemeint, die in der Lage sind, die Apoptose zu hemmen. Ob irgendein zur Wahl stehender erfindungsgemäßer „Agonist” oder „Antagonist” die Apoptose verstärkt oder hemmt, kann unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten TNF-Familie Ligand/Rezeptor-Zellantworttests, einschließlich solcher, die nachstehend genauer beschrieben werden, bestimmt werden.
Eines dieser Durchmusterungsverfahren umfasst die Verwendung von Melanophoren, die transfiziert werden, um den erfindungsgemäßen Rezeptor zu exprimieren. Solch ein Durchmusterungsverfahren wird in PCT WO 92/01810 , veröffentlicht am 6. Februar 1992, beschrieben. Solch ein Test kann zum Beispiel eingesetzt werden für die Durchmusterung nach einer Verbindung, welche die Aktivierung des erfindungsgemäßen Rezeptorpolypeptids hemmt (oder verstärkt). Dies erfolgt durch das Inkontaktbringen der Melanophorzellen, die den Rezeptor codieren, mit sowohl einem TNF-Familie-Liganden als auch dem zur Wahl stehend Antagonisten (oder Agonisten). Die Hemmung oder Verstärkung des Signals, das durch den Liganden erzeugt wird, weist darauf hin, ob die Verbindung ein Antagonist oder Agonist des Ligand/Rezeptor-Signalübertragungsweges ist.
Andere Durchmusterungsverfahren umfassen die Verwendung von Zellen, die den Rezeptor exprimieren (beispielsweise CHO-Zellen), in einem System, das zum Beispiel durch die Rezeptoraktivierung verursachte extrazelluläre pH-Änderungen misst, wie in Science 246: 181–296 (Oktober 1989) beschrieben. Beispielsweise können Verbindungen mit einer Zelle, die das erfindungsgemäße Rezeptor-Polypeptid exprimiert, in Kontakt gebracht werden, woraufhin eine sekundäre Botenstoff-Antwort, z. B. Signalübertragung oder pH-Änderungen, gemessen werden kann, um zu ermitteln, ob die potenzielle Verbindung den Rezeptor aktiviert oder hemmt.
Ein anderes dieser Durchmusterungsverfahren umfasst das Einbringen einer Rezeptor-codierenden RNA in Xenopus-Oocyten, um den Rezeptor vorrübergehend zu exprimieren. Die Rezeptor-Oocyten können dann mit dem Rezeptor-Liganden und einer zu durchmusternden Verbindung in Kontakt gebracht werden. Daraufhin wird im Falle der Durchmusterung nach Verbindungen, von denen angenommen wird, dass sie die Aktivierung des Rezeptors hemmen, die Hemmung oder Aktivierung eines Calcium-Signals nachgewiesen.
Ein anderes Durchmusterungsverfahren umfasst die Expression eines Konstrukts in Zellen, wobei der Rezeptor an Phospholipase C oder D gebunden ist. Zu solchen Zellen gehören Endothelzellen, glatte Muskelzellen, embrionale Nierenzellen, usw. Das Durchmustern kann wie hier vorstehend beschrieben, durch den Nachweis der Aktivierung des Rezeptors oder die Hemmung der Aktivierung des Rezeptors über das Phospholipase-Signal durchgeführt werden.
Ein anderes Verfahren umfasst das Durchmustern nach Verbindungen, welche die Aktivierung der erfindungsgemäßen Rezeptorpolypeptid-Antagonisten hemmen, in dem die Hemmung des Bindens eines markierten Liganden an Zellen, die den Rezeptor auf ihrer Oberfläche tragen, bestimmt wird. Solch ein Verfahren umfasst die Transfektion einer eukaryontischen Zelle mit DNA, die den Rezeptor so codiert, dass die Zelle den Rezeptor auf ihrer Oberfläche exprimiert, und das Inkontaktbringen der Zelle mit einer Verbindung in Anwesenheit eines bekannten Liganden, der in markierter Form vorliegt. Der Ligand kann z. B. mittels Radioaktivität markiert werden. Die Menge der an die Rezeptoren gebundenen Liganden wird gemessen, z. B. durch Messung der Radioaktivität der Rezeptoren. Bindet die Verbindung an den Rezeptor, was durch eine Reduktion des markierten Liganden, der an die Rezeptoren bindet, bestimmt wird, wird das Binden des markierten Liganden an den Rezeptor gehemmt. Weitere Durchmusterungstest für erfindungsgemäße Agonisten und Antagonisten werden in Tartaglia, L. A. und Goeddel, D. V., J. Biol. Chem. 267(7): 4304–4307 (1992) beschrieben.
Daher wird in einem weiteren Aspekt ein Durchmusterungsverfahren bereitgestellt um nachzuweisen, ob ein zur Wahl stehender Agonist oder Antagonist in der Lage ist eine zelluläre Antwort gegenüber einem Liganden der TNF-Familie zu verstärken oder zu hemmen. Das Verfahren umfasst das Inkontaktbringen von Zellen, die das DR4-Polypeptid exprimieren, mit einer Kandidaten-Verbindung und einem TNF-Familie-Liganden, das Testen einer zellulären Antwort und Vergleichen der zellulären Antwort mit einer Standardzellantwort. Der Standard wird getestet, in dem der Kontakt mit dem Liganden in Abwesenheit der Kandidaten-Verbindung erfolgt, wobei eine erhöhte Zellantwort gegenüber dem Standard darauf hinweist, dass die Kandidaten-Verbindung ein Agonist des Ligand/Rezeptor-Signalweges ist, und eine verminderte Zellantwort gegenüber dem Standard darauf hinweist, dass die zur Wahl stehende Verbindung ein Antagonist des Ligand/Rezeptor-Signalweges ist. Mit „Testen einer Zellantwort” ist das qualitative oder quantitative Messen einer Zellantwort gegenüber einer zur Wahl stehenden Verbindung und/oder einem TNF-Familie-Liganden gemeint (z. B. Bestimmen oder Schätzen einer erhöhten oder verminderten T-Zellproliferation oder Markierung mit Tritium-markiertem Thymidin). Bei der Erfindung kann eine Zelle, die das DR4-Polypeptid exprimiert, entweder mit einem endogenen oder einem exogen verabreichten TNF-Familie-Liganden in Kontakt gebracht werden.
Erfindungsgemäße Agonisten umfassen natürlich vorkommende und synthetische Verbindungen wie zum Beispiel Peptidfragmente von Liganden der TNF-Familie, transformierender Wachstumsfaktor, Neurotransmitter (wie Glutamat, Dopamin, N-Methyl-D-aspartat), Tumorsupressoren (p53), zytolytische T-Zellen und Antimetaboliten. Zu den bevorzugten Agonisten gehören chemotherapeutische Arzneistoffe wie zum Beispiel Cisplatin, Doxorubicin, Bleomycin, Cytosinarabinosid, Stickstoffsenfgas, Methotrexat und Vincristin. Andere schließen Ethanol und Amyloid-Peptid ein (Science 267: 1457–1458 (1995)). Zu den weiter bevorzugten Agonisten gehören polyclonale und monoclonale Antikörper gegen das DR4-Polypeptid oder Fragmente davon. Solch agonistischen Antikörper, die gegen einen TNF-Familie Rezeptor gerichtet sind, werden in Tartaglia, L. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9292–9296 (1991) und Tartaglia, L. A. und Goeddel, D. V., J. Biol. Chem. 267(7): 4304–4307 (1992) beschrieben. Siehe auch PCT Anmeldung WO 94/09137 . Erfindungsgemäße Antagonisten umfassen natürlich vorkommende und synthetische Verbindungen wie beispielsweise den CD40-Liganden, neutrale Aminosäuren, Zink, Östrogen, Androgene, virale Gene (wie Adenovirus EIB, Baculovirus p35 und IAP, Kuhpockenvirus crmA, Epstein-Barr-Virus BHRF1, LMP-1, afrikanisches Schweinepestvirus LMW5-HL und Herpesvirus yl 34.5), Calpain-Inhibitoren, Cystein-Proteaseinhibitoren und Tumorpromotoren (wie PMA, Phenobarbital und Hexachlorcyclohexan).
Andere potenzielle Antagonisten umfassen Antisense-Moleküle. Das Antisense-Verfahren kann verwendet werden, um die Genexpression durch Antisense-DNA oder -RNA oder durch Tripelhelix-Bildung zu kontrollieren. Antisense-Verfahren werden zum Beispiel in Okano, J., Neurochem. 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988) erläutert. Tripelhelix-Bildung wird zum Beispel in Lee et al, Nucleic Acids Research 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science 241: 456 (1988) und Dervan et al., Science 251: 1360 (1991) erläutert. Die Verfahren basieren auf dem Binden eines Polynucleotids an eine komplementäre DNA oder RNA.
Zum Beispiel kann der 5'-codierende Teil eines Polynucleotids, welches das reife, erfindungsgemäße Polypeptid codiert, verwendet werden, um ein Antisense-RNA-Oligonucleotid von etwa 10 bis 40 Basenpaaren Länge zu entwerfen. Ein DNA-Oligonucleotid wird entworfen, das komplementär ist zu einer Region des Gens, die an der Transkription beteiligt ist, und daher die Transkription und die Herstellung des Rezeptors verhindert. Das Antisense-RNA-Oligonucleotid hybridisiert in vivo mit der mRNA und blockiert die Translation der mRNA-Moleküle in Rezeptor-Palypeptide. Die vorstehend beschriebenen Oligonucleotide können auch an Zellen abgegeben werden, so dass die Antisense-RNA oder -DNA in vivo exprimiert werden kann, damit die Herstellung des Rezeptors gehemmt wird.
Weitere erfindungsgemäße Antagonisten schließen lösliche Formen von DR4, d. h. DR4-Fragmente, welche die Ligandenbindungsdomäne der extrazellulären Region des Volllängen-Rezeptors enthalten, ein. Solch lösliche Formen des Rezeptors, die natürlich vorkommend oder synthetisch sein können, wirken der DR4-vermittelten Signalgebung durch das Konkurrieren mit dem Zelloberflächen-DR4 um die Bindung an TNF-Familie-Liganden, entgegen. Daher stellen lösliche Formen des Rezeptors, die die Ligandenbindungsdomäne enthalten, neue Cytokine dar, die in der Lage sind die TNF-Familie-Liganden-induzierte Apoptose zu hemmen. Diese werden vorzugsweise als Dimere oder Trimer exprimiert, da diese den monomeren Formen des löslichen Rezeptors als Antagonisten überlegen sind, z. B. IgGFc-TNF-Rezeptor-Familie-Fusionsproteine. Andere solche Cytokine sind auf dem Fachgebiet bekannt, dazu gehört FasB (eine lösliche Form des Maus Fas-Rezeptors), welches physiologisch die Fas-Ligand-induzierte Apoptose einschränkt (Hughes, D. P. und Crispe, I. N., J. Exp. Med. 182: 1395–1401 (1995)).
Die in Beispiel 5 dargelegten Versuche zeigen, dass DR4 ein „Death-Domain”-enthaltendes Molekül ist, das in der Lage ist Apoptose auszulösen, was wichtig ist bei der Regulation des Immunsystems. Zusätzlich zeigen die nachstehenden Versuche, dass die DR4-induzierte Apoptose durch Inhibitoren der ICE-ähnlichen Proteasen, CrmA und z-VAD-fmk, blockiert wurde. Daher können auch Inhibitoren der ICE-ähnlichen Proteasen, FADD-DN und FLICE-DN/MACHaIC360S, als Antagonisten der DR4-Aktivität verwendet werden.
Der Begriff „Antikörper” (Ab) oder „monoclonaler Antikörper” (mAb) wie hier verwendet, schließt intakte Moleküle genauso wie Fragmente davon (wie zum Beispiel Fab- und F(ab')₂-Fragmente), die in der Lage sind ein Antigen zu binden, ein. Fab- und F(ab')₂-Fragmenten fehlt das Fc-Fragment des intakten Antikörpers, werden schneller aus dem Kreislauf entfernt und können weniger unspezifische Gewebebindung als ein intakter Antikörper aufweisen (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316–325 (1983)).
Erfindungsgemäße Antikörper können durch jedes beliebige Verfahren unter Verwendung von erfindungsgemäßen DR4-Immunogenen hergestellt werden. Wie angedeutet umfassen solche DR4-Immunogene das Volllängen--DR4-Polypeptide (das die Leadersequenz enthalten kann oder nicht) und DR4-Polypeptidfragmente wie die Ligandenbindungsdomäne, die Transmembrandomäne, die intrazelluläre Domäne und die „Death-Domain”.
Proteine und andere Verbindungen, die an die DR4-Domänen binden, sind ebenfalls erfindungsgemäße Kandidaten-Agonisten und -Antagonisten. Solche bindenden Verbindungen können „eingefangen” werden unter Verwendung des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems (Fields and Song, Nature 340: 245–246 (1989)). Eine abgewandelte Ausführungsform des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems ist von Roger Brent und seinen Kollegen beschrieben worden (Gyuris. J. et al., Cell 75: 791–803 (1993); Zervos, A. S. et al., Cell 72: 223–232 (1993)). Vorzugsweise ist das Hefe-Zwei-Hybrid-System gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet worden, um Verbindungen, die entweder an die DR4-Ligandenbindungsdomäne oder an die DR4-intrazelluläre Domäne binden, einzufangen. Solche Verbindungen stellen gute, erfindungsgemäße Kandidaten-Agonisten und -Antagonisten dar.
Mit einem „TNF-Familie-Liganden” sind natürlich vorkommende, rekombinante und synthetische Liganden gemeint, die in der Lage sind an ein Mitglied der TNF-Rezeptor-Familie zu binden und den Ligand/Rezeptor-Signalweg zu induzieren. Zu den Mitgliedern der TNF-Ligand-Familie gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, DR4-Liganden einschließlich TRAIL, TNF-α, Lymphotoxin-α (LT-α, auch bekannt als TNF-β), LT-β (gefunden im heterotrimeren Komplex LT-α2-β), FasL, CD40, CD27, CD30, 4-IBB, OX40 und der Nervenwachstumsfaktor (NGF).
Repräsentative therapeutische Anwendungen der vorliegenden Erfindung werden nachstehend genauer erläutert. Das Stadium der Immundefizienz, die AIDS definiert, ist zweitrangig hinsichtlich der Verminderung der Anzahl und Funktion von CD4⁺T-Lymphozyten. Neueste Veröffentlichungen schätzen, dass der tägliche Verlust von CD4⁺ T-Zellen zwischen 3,5 × 10 und 2 × 10⁹ Zellen liegt (Wei X. et al., Nature 373: 117–122 (1995)). Eine Ursache für die CD4⁺T-Zellen-Verarmung bei der Festsetzung einer HIV-Infektion ist vermutlich die HIV-induzierte Apoptose. Tatsächlich ist der HIV-induzierte apoptotische Zelltod nicht nur in vitro, sondern auch, viel wichtiger, in infizierten Personen gezeigt worden (Ameisen, J. C.; AIDS 8: 1197–1213 (1994); Finkel, T. H. und Bands, N. K., Curr. Opin. Immunol. 6: 605–615 (1995); Muro-Cacho, C. A. et al., J. Immunol. 154: 5555–5566 (1995)). Des Weiteren ist die Apoptose und die Verarmung an CD4⁺T-Zellen in verschiedenen Tiermodellen von AIDS eng korreliert (Brunner, T., et al., Nature 373: 441–444 (1995); Gougeon, M. L., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 9: 553–563 (1993)) und die Apoptose wird in solchen Tiermodellen, bei denen die Virusreplikation nicht zu AIDS führt, nicht beobachtet (Gougeon, M. L., et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 9: 553–563 (1993)). Weitere Daten weisen darauf hin, dass nicht-infizierte aber geprimte oder aktivierte T-Lymphozyten von HIV-infizierten Personen nach dem Zusammentreffen mit dem TNF-Familie-Liganden FasL die Apoptose durchlaufen. Unter Verwendung von monozytischen Zelllinen, die nach einer HIV-Infektion absterben, ist gezeigt worden, dass die Infektion von U937-Zellen mit HIV in der de novo-Expression von FasL endet und dass FasL die HIV-induzierte Apoptose vermittelt (Badely, A. D. et al., J. Virol. 70: 199–206 (1996)). Ferner wurde der Ligand der TNF-Familie in nicht-infizierten Makrophagen nachgewiesen und seine Expression wurde nach der Infektion mit HIV hochreguliert, was das selektiven Töten von nicht-infizierten CD4-T-Lymphozyten zur Folge hatte (Badley, A. D. et al., J. Virol. 70: 199–206 (1996)). Daher wird mit der Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von HIV⁺-Personen geliefert, das die Verabreichung eines erfindungsgemäßen Antagonisten umfasst, um das selektive Abtöten von CD4-T-Lymphocyten zu senken. Art und Weise der Verabreichung und die Dosierungen werden nachstehend genauer erläutert.
Bei der Abstoßung eines Allotransplantats ist das Immunsystem des Empfängertiers vorher nicht für eine Antwort geprimt worden, da das Immunsystem zum größten Teil nur durch Umweltantigene sensibilisiert wird. Gewebe von anderen Mitgliedern der gleichen Art sind nicht in der gleiche Weise präsentiert worden, in der zum Beispiel Viren und Bakterien präsentiert worden sind. Im Fall der Allotransplantatabstoßung werden immunsuppressive Vorgaben entwickelt, um zu verhindern, dass das Immunsystem das Effektorstadium erreicht. Jedoch kann das Immunprofil der Xenotransplantatabstoßung mehr einem Krankheitsrückfall gleichen als die Allotransplantatabstoßung. Im Fall des Krankheitsrückfalls ist das Immunsystem bereits aktiviert worden, wie durch die Zerstörung der nativen Inselzellen bewiesen. Daher ist bei einem Krankheitsrückfall das Immunsystem ohnehin im Effektorstadium. Erfindungsgemäße Agonisten sind in der Lage die Immunantwort sowohl gegenüber den Allotransplantaten als auch den Xenotransplantaten zu unterdrücken, da die aktivierten und in Effektorzellen differenzierten Lymphocyten das DR4-Polypeptid exprimieren werden und dabei empfänglich sind für Verbindungen, die die Apoptose verstärken. Daher liefert die vorliegende Erfindung des Weiteren ein Verfahren zur Herstellung immunprivilegierter Gewebe. Erfindungsgemäße Antagonisten können ferner bei der Behandlung der chronisch entzündlichen Darmerkrankung verwendet werden.
DR4-Antagonsiten können nützlich sein bei der Behandlung von entzündlichen Erkrankungen wie rheumatoider Arthritis, Osteoarthritis, Psoriasis, Septikämie und chronisch entzündlicher Darmerkrankung.
Außerdem können, wegen der Expression von DR4 in Lymphoblasten, lösliches DR4, Agonisten- oder Antagonisten-mABs verwendet werden, um diese Form des Krebs zu behandeln. Des Weiteren kann lösliches DR4 oder neutralisierende mABs verwendet werden, um verschiedene chronische und akute Formen einer Entzündung wie rheumatoider Arthritis, Osteoarthritis, Psoriasis, Septikämie und chronisch entzündlicher Darmerkrankung zu behandeln.
Form der Verabreichung
Die hierin beschriebenen Agonisten oder Antagonisten können in vitro, ex vivo oder in vivo an Zellen, die den erfindungsgemäßen Rezeptor exprimieren, verabreicht werden. Mit Verabreichung einer „wirksamen Menge” eines Agonisten oder Antagonisten ist eine Menge einer Verbindung gemeint, die ausreicht, um die zelluläre Antwort auf einen TNF-Familie-Liganden zu verstärken oder zu hemmen, dazu gehören auch Peptide. Insbesondere ist mit Verabreichung einer „wirksamen Menge” eines Agonisten oder Antagonisten eine Menge gemeint, die wirksam ist, um die DR4-vermittelte Apoptose zu verstärken oder zu hemmen. Natürlich kann, wenn die Apoptose verstärkt werden muss, ein erfindungsgemäßer Agonist mit einem TNF-Familie-Liganden gemeinsam verabreicht werden. Ein durchschnittlicher Fachmann wird verstehen, dass wirksame Mengen eines Agonisten oder Antagonisten empirisch bestimmt werden können und in reiner Form oder in Form eines pharmazeutisch verträglichen Salzes, Esters oder einer Prodrug eingesetzt werden können. Der Agonist oder Antagonist kann in Zusammensetzungen in Verbindung mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Exzipienten verabreicht werden.
Es versteht sich, dass bei der Verabreichung an einen menschlichen Patienten der Gesamttagesbedarf der erfindungsgemäßen Verbindungen und Zusammensetzungen von dem behandelndem Arzt, innerhalb des Rahmens einer korrekten medizinischen Beurteilung, festgelegt wird. Die spezifische therapeutisch wirksame Dosismenge für einen bestimmten Patienten wird von Faktoren abhängen, die auf dem medizinischen Fachgebiet bekannt sind.
Als ein allgemeiner Vorschlag wird die gesamte pharmazeutisch wirksame Menge des parenteral verabreichten DR4-Polypeptids im Bereich von etwa 1 μg/kg/Tag bis 10 mg/kg/Tag des Patienten-Körpergewichts liegen, obwohl dies wie vorstehend angemerkt Sache des therapeutischen Ermessens ist. Stärker bevorzugt liegt diese Dosis bei mindestens 0,01 mg/kg/Tag und für Menschen am meisten bevorzugt zwischen etwa 0,01 und 1 mg/kg/Tag für das Hormon. Bei fortlaufender Gabe wird der DR4-Agonist oder -Antagonist üblicherweise in einer Dosisrate von etwa 1 μg/kg/Stunde bis etwa 50 μg/kg/Stunde verabreicht, entweder durch 1–4 Injektionen pro Tag oder durch fortlaufende subkutane Infusionen, zum Beispiel unter Verwendung einer Minipumpe. Eine intravenöse Beutellösung kann auch eingesetzt werden.
Die Dosierung kann auch in einer Patienten-spezifischen Art und Weise eingestellt werden, um eine vorbestimmte Konzentration eines Agonisten oder Antagonisten im Blut bereit zu stellen wie mittels RIA-Verfahren bestimmt. Somit kann eine Patientendosierung im Bereich von 50 bis 1000 ng/ml, vorzugsweise 150 bis 500 ng/ml, eingestellt werden, um regelmäßige andauernde Minimalblutspiegel wie mittels RIA gemessen, zu erreichen.
Arzneimittel werden bereitgestellt, die einen Agonisten oder Antagonisten und einen pharmazeutisch geeigneten Träger- oder Hilfsstoff enthalten, der oral, rektal, parenteral, intrazisternal, intravaginal, intraperitoneal, lokal (wie durch Puder, Salben, Tropfen oder transdermale Pflaster), über die Wange oder als orales oder nasales Spray verabreicht werden können. Dabei ist von Bedeutung, dass bei der gemeinsamen Verabreichung eines Agonisten und eines TNF-Familie-Liganden klinische Nebenwirkungen durch die Verwendung von geringeren Dosen sowohl des Liganden als auch des Agonisten gesenkt werden können. Es versteht sich, dass der Agonist entweder vor, nach oder gleichzeitig mit dem TNF-Familie-Liganden gemeinsam verabreicht werden kann, abhängig von den Anforderungen einer bestimmten therapeutischen Anwendung. Mit „pharmazeutisch verträglicher Trägerstoff” ist ein nicht-toxischer, fester, halbfester oder flüssiger Füllstoff, Verdünnungsmittel, Verkapselungsmaterial oder eine jeden Typ unterstützende Zubereitung gemeint. Der Begriff „parenteral”, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Verabreichungsarten und umfasst: intravenös, intramuskulär, intraperitoneal, intrasternal, subkutan und intraartikuläre Injektion oder Infusionen.
Erfindungsgemäße Arzneimittel für die parenterale Injektion können pharmazeutisch geeignete, sterile wässrige oder nicht-wässrige Lösungen, Dispersionen, Suspensionen oder Emulsionen sein, genauso wie sterile Puder für die Rekonstitution in sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen kurz vor der Verwendung.
Zusätzlich zu den löslichen DR4-Polypeptiden, können auch DR4-Polypeptide, die die Transmembranregion enthalten, verwendet werden, wenn sie durch die Zugabe von Detergens wie CHAPS oder NP-40 mit Puffer sachgemäß gelöst werden.
BEISPIEL 1: Expression und Aufreinigung in E. coli
Die DNA-Sequenz, die das reife DR4-Protein in dem hinterlegten cDNA-Clon (ATCC Nr. 97853) codiert, wird unter Verwendung von PCR-Oligonucleotid-Primern, die spezifisch sind für die amino-terminalen Sequenzen des DR4-Proteins und für die Vektor-Sequenzen 3' des Gens, amplifiziert. Zusätzliche Nucleotide, die Restriktionsschnittstellen enthalten, um das Clonieren zu erleichtern, werden an die 5'- beziehungsweise 3'-Sequenzen hinzugefügt.
Die folgenden Primer sind für die Expression der extrazellulären Domäne von DR4 in E. coli verwendet worden: 5'-Primer 5'-GCGGCATGCATGATCAATCAATTGGCAC-3' (SEQ ID NO: 8) enthält die unterstrichene SphI-Schnittstelle, 3'-Primer 5'-GCGAAGCTTTCAATTATGTCCATTGCCTG-3' (SEQ ID NO: 9) enthält die unterstrichene HindIII-Schnittstelle. Der Vektor ist pQE60.
Die Restriktionsschnittstellen passen zu den Restriktionsenzymschnittstellen des bakteriellen Expressionsvektors pQE60, die für die bakterielle Expression in diesen Beispielen verwendet werden (Quiagen, Inc. 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311). pQE60 codiert eine Ampicillin-Antibiotikaresistenz („Amp^r”) und enthält einen bakteriellen Replikationsursprung („ori”), einen IPTG-induzierbaren Promotor und eine Ribosomenbindungsstelle („RBS”).
Die amplifizierte DR4-DNA und der Vektor pQE60 werden mit SphI und HindIII gespalten und die gespaltenen DNAs werden dann zusammenligiert. Das Einbringen der DDCR-Protein-DNA in den gespaltenen pQE60-Vektor platziert die DR4-Protein-codierende Region stromabwärts und verbindet sie funktionell mit dem IPTG-induzierbaren Promoter des Vektors sowie im richtigen Leseraster mit einem Start-AUG, das passend für die Translation des DR4-Proteins positioniert ist.
Das Ligationsgemisch wird unter Verwendung von Standardverfahren in kompetente E. coli-Zellen transformiert. Solche Verfahren werden in Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) beschrieben. Der E. coli Stamm M15/rep4, der vielfache Kopien des Plasmids pREP4 enthält, das den lac-Repressor exprimiert und Kanamycin-Resistenz („Kan^r”) verleiht, wird bei der Durchführung des veranschaulichenden, hierin beschriebenen Beispiels verwendet. Dieser Stamm, der nur einer von vielen ist, der für die Expression des DR4-Proteins geeignete ist, ist im Handel von Quiagen zu beziehen.
Transformanten werden über ihre Fähigkeit, in Anwesenheit von Ampicillin und Kanamycin auf LB-Platten zu wachsen, identifiziert. Plasmid-DNA wird von resistenten Kolonien isoliert und die Identität der clonierten DNA mittels Restriktionsanalyse bestätigt.
Klone, die das gewünschte Konstrukt enthalten werden über Nacht („O/N”) in Flüssigkultur mit LB-Medium, das sowohl mit Ampicillin (100 μg/ml) als auch mit Kanamycin (25 μg/ml) ergänzt wurde, gezüchtet.
Die O/N-Kultur wird verwendet, um eine große Kultur zu beimpfen, in einer Verdünnung von ungefähr 1:100 bis 1:250. Die Zellen werden bei 600 nm („OD600”) bis zu einer optischen Dicht von 0,4 bis 0,6 gezüchtet. Isopropyl-B-D-thiogalactopyranosid („IPTG”) wird dann in einer Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt, um die Transkription von lac-Repressor-sensitiven Promotoren, durch Inaktivierung des lacI-Repressors, zu induzieren. Die Zellen werden anschließend für die Dauer von 3 bis 4 Stunden weiter inkubiert. Dann werden die Zellen mittels Standard verfahren durch Zentrifugation geerntet und aufgeschlossen. Einschlusskörperchen werden aus den aufgeschossenen Zellen mittels Routine-Sammelverfahren aufgereinigt und Proteine werden aus den Einschlusskörperchen in 8 M Harnstoff gelöst. Die 8 M Harnstoff-Lösung, die das gelösten Protein enthält, wird in 2 × Phosphat-gepufferter Salzlösung („PBS”) über eine PD-10 Säule laufen lassen, wobei der Harnstoff entfernt, der Puffer ausgetauscht und das Protein rückgefaltet wird. Durch einen weiteren Chromatographie-Schritt wird das Protein gereinigt, um das Endotoxin zu entfernen. Dann wird es sterilfiltriert. Die sterilfiltrierte Proteinaufbereitung wird in 2 × PBS in einer Konzentration von 95 μ/ml aufbewahrt.
BEISPIEL 2: Expression in Säugerzellen
Die meisten Vektoren, die für die vorübergehende Expression einer gegebenen Gensequenz in Säugerzellen verwendet werden, tragen den SV40-Replikationsursprung. Dies erlaubt die Replikation des Vektors in einer hohen Kopienzahl in Zeilen (z. B. COS-Zellen), die das T-Antigen exprimern, das für den Start der viralen DNA-Synthese erforderlich ist. Jede andere Säugerzelllinie kann ebenfalls für diesen Zweck verwendet werden.
Ein typischer Säuger-Expressionsvektor enthält das Promotorelement, welches den Transkriptionsstart der mRNA vermittelt, die Protein-kodierende Sequenz und Signale, die für die Termination der Transkription und die Polyadenylierung des Transkripts erforderlich sind. Zusätzliche Elemente umfassen Enhancer, Kozak-Sequenzen und Intron-Sequenzen, die von Donor- und Akzeptorstellen für das Spleißen der RNA flankiert werden. Eine hoch effiziente Transkription kann erreicht werden mit den frühen und späten Promotoren von SV40, den langen terminalen Wiederholungen (LTR, engl.: long terminal repeats) der Retroviren, z. B. RSV, HTLVI, HIVI und dem frühen Promotor des Cytomegalievirus (CMV). Allerdings können auch zelluläre Signale (z. B. menschliches Actin, Promotor) verwendet werden. Zu den geeigneten Expressionsvektoren für die Durchführung der Erfindung gehören zum Beispiel Vektoren wie pSVL und pMSG (Phramacia, Uppsla, Schweden), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) und pBC12MI (ATCC 67109). Zu den Säugerwirtszellen, die verwendet werden können, gehören: menschliche Hela-, 283-, H9- und Jurkat-Zellen, Maus NIH3T3- und C127-Zellen, Cos1-, Cos7- und CV1-Afrikanische Grüne Meerkatzen Zelten, Wachtel QC1–3-Zellen, Maus L-Zellen, Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters wie
Wahlweise kann ein Gen von Interesse in stabilen Zelllinien exprimiert werden, die das Gen in ein Chromosom eingebaut haben. Die Co-Transfektion eines selektierbaren Markers wie dhfr, gpt, Neomycin oder Hygromycin erlaubt die Identifizierung und Isolierung der transfizierten Zellen.
Das transfizierte Gen kann auch amplifiziert werden, um große Mengen des codierten Proteins zu exprimieren. Die DHFR (Dihydrofolat-Reduktase) ist ein nützlicher Marker, um Zelllinien herzustellen, die mehrere Hundert oder sogar mehrere Tausend Kopien des Gens von Interesse tagen. Bei der Verwendung dieses Markers wachsen die Zellen für die Selektion in steigenden Mengen von Methotrexat und die Zellen, mit der höchsten Resistenz werden selektiert. Diese Zelllinien enthalten das/die amplifizierte/n Genie in ein Chromosom eingebaut. Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) werden häufig für die Herstellung von Proteinen verwendet.
Die Expressionsvektoren pCI und pC4 enthalten den starken Promotor (LTR) des Rous Sarcoma Virus (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology 438: 44701 (März 1985)), zuzüglich ein Fragment des CMV-Enhancers (Boshart et al., Cell 41: 521–530 (1985)). Multiple Clonierungsstellen, z. B. mit den Restriktionsenzymschnittstellen BamHI, XbaI und Asp718, erleichtern die Clonierung des Gens von Interesse. Die Vektoren enthalten zusätzlich das 3'-Intron, das Polyadenylierungs- und Terminationssignal des Ratten-Präproinsulin-Gens.
Clonierung und Expression in CHO-Zellen
Der Vektor pC4 wird für die Expression des DR4-Polypeptids verwendet. Das Plasmid pC4 ist ein Derivat des Plasmids pSV2-dhfr (ATCC Zugangsnr. 37146). Das Plasmid enthält das Maus DHFR-Gen unter der Kontrolle des SV40 frühen Promotors. Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters oder andere Zellen, denen die Dihydrofolat-Aktivität fehlt und die mit diesen Plasmiden transfiziert sind, können durch Züchten der Zellen in einem Selektionsmedium (Alpha-minus MEM, Life Technolgies), ergänzt mit dem chemotherapeutischen Wirkstoff Methotrexat, selektiert werden. Die Amplifizierung der DHFR-Gene in Zellen, die resistent gegenüber Methotrexat (MTX) sind, ist gut dokumentiert worden (siehe, z. B. Alt, F. W., Kellems, R. M., Bertino, J. R. und Schimke, R. T., J. Biol. Chem. 253: 1357–1370 (1978); Hamlin, J. L. und Ma, C., Biochem. et Biophys. Acta. 1097: 107–143 (1990); Page, M. J. und Sydenham, M. A., Biotechnology 9: 64–68 (1991)). Zeilen, die in steigenden Konzentrationen von MTX wachsen, entwickeln eine Resistenz gegenüber dem Arzneistoff. Ursache dafür ist die Überproduktion des Zielenzyms DHFR, als Folge der Amplifizierung des DHFR-Gens. Wird ein zweites Gen mit dem DHFR-Gen verbunden, wird es gewöhnlich co-amplifiziert und überexprimiert. Auf dem Fachgebiet ist bekannt, dass diese Verfahrensweise verwendet werden kann, um Zelllinien zu entwickeln, die mehr als 1000 Kopien der amplifizierten Gene tragen. Anschließend, wenn das Methotrexat entzogen wird, werden Zelllinien erhalten, die das amplifizierte Gen in einem oder mehreren Chromosomen der Wirtszelle eingebaut haben.
Das Plasmid pC4 enthält für die Expression des Gens von Interesse den starken Promotor der langen terminalen Wiederholung (LTR) des Rous Sarcoma Virus (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology 438–447 (März 1985)) zuzüglich eines Fragments, welches aus dem Enhancer des sofort-frühen Promotors des menschlichen Cytomegalievirus (CMV) isoliert wurden (Boshart et al., Cell 41: 521–530 (1985)). Stromabwärts des Promotors befinden sich die folgenden einzelnen Restriktionsenzymschnittstellen, die den Einbau des Gens erlauben: BamHI, Xba und Asp718. Hinter diesen Clonierungsstellen enthält das Plasmid das 3'-Intron und die Polyadenylierungsstelle des Ratten Präproinsulin-Gens. Andere hoch effiziente Promotoren können ebenso für die Expression verwendet werden, z. B. der menschliche β-Actin-Promator, der SV40 frühe oder späte Promotor oder die langen terminalen Wiederholungen von anderen Retroviren, z. B. HIV und HTLVI. Das Clontech Tet-Aus und Tot-An Genexpressionssystem und ähnliche Systeme können verwendet werden, um das DR4-Polypeptid auf regulierte Art und Weise in Säugerzellen zu exprimieren (Gossen, M. & Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547–5551 (1992)). Für die Polyadenylierung der mRNA können genauso andere Signale, z. B. vom menschlichen Wachstumshormon oder den Globin-Genen, verwendet werden. Stabile Zelllinien, die ein Gen von Interesse in die Chromosomen eingebaut tragen, können auch selektiert werden über die Co-Transfektion von Selektionsmarkern wie gpt, G418 oder Hygromycin. Es ist von Vorteil, zu Beginn mehr als einen Selektionsmarker zu verwenden, z. B. G418 plus Methotrexat. Das Plasmid pC4 wird mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten und dann mittels auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren unter Verwendung von Kälberdarm-Phosphatasen dephosphoryliert. Der Vektor wird dann aus einem 1%igen Agarosegel isoliert.
Die DNA-Sequenz, die das vollständige Polypeptid codiert wird, unter Verwendung von PCR-Oligonucleotid-Primern, die mit den 5'- und 3'-Sequenzen des gewünschten Genabschnitts korrespondieren, amplifiziert. Der 5'-Primer, der die unterstrichene BamHI-Schnittstelle, eine Kozak-Sequenz und ein AUG-Start-Codon enthält, weist folgende Sequenz auf:
Der 3'-Primer, der die unterstrichene BamHI-Schnittstelle enthält, weist folgende Sequenz auf:
Das amplifizierte Fragment wird mit der Endonuclease BamHI gespalten und dann noch mal auf einem 1%igen Agarosegel aufgereinigt. Das isolierte Fragment und der dephosphorylierte Vektor werden dann mit T4-DNA-Ligase ligiert E. coli HB101- oder XL-1 Blue-Zellen werden dann transformiert und Bakterien, die das Fragment in das Plasmid pC4 eingebaut haben, werden unter Verwendung von zum Beispiel Restriktionsenzymanalyse identifiziert.
Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters, denen ein aktives DHFR-Gen fehlt, werden für die Transfektion verwendet. Fünf μg des Expressionsplasmids pC4 werden mit 0,5 μg des Plasmids pSV-neo unter Verwendung von Lipofectin co-transfiziert (Felgner et al., vorstehend). Das Plasmid pSV2-neo enthält einen dominanten Selektionsmarker: das neo-Gen von Tn5, das ein Enzym codiert, welches Resistenz gegenüber einer Gruppe von Antibiotika, einschließlich G418, verleiht. Die Zellen werden in Alpha-minus MEM, ergänzt mit 1 mg/ml G418, ausgesät. Nach 2 Tagen werden die Zellen trypsiniert und in Hybridoma-Clonierungsplatten (Greiner, Deutschland) in Alpha-minus MEM, ergänzt mit 10, 25 oder 50 ng/ml Methotrexat plus 1 mg/ml G418, ausgesät. Nach etwa 10–14 Tagen werden einzelne Clone trypsiniert und dann in 6-Loch Petrischalen oder 10 ml-Flaschen unter Verwendung von verschiedenen Konzentrationen von Methotrexat (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM) ausgesät. Clone, die bei den höchsten Konzentrationen Methotrexat wachsen, werden dann in neue 6-Loch-Platten überführt, die sogar noch höhere Methotrexat-Konzentrationen enthalten (1 μM, 2 μM, 5 μM, 10 mM, 20 mM). Das gleiche Verfahren wird wiederholt, bis Clone erhalten werden, die bei einer Konzentration von 100–200 μM wachsen. Die Expression des gewünschten Genprodukts wird zum Beispiel mittels SDS-PAGE und Western-Blot oder durch HPLC mit umgekehrten Phasen analysiert.
BEISPIEL 3: Clonierung und Expression der extrazellulären Domäne von DR4 in einem Baculovirus-Expressionssystem
Die cDNA-Sequenz, die die lösliche extrazelluläre Domäne des DR4-Proteins in dem hinterlegten Clon (ATCC Nr. 97853) codiert, wird unter Verwendung von PCR-Oligonucleotid-Primern, die mit den 5'- und 3'-Sequenzen des Gens korrespondieren, amplifiziert. Der 5'-Primer für DR4 weist die Sequenz 5'-GCGGGATCCGCCATCATGGCGCCACCACCAGCTAGA-3' (SEQ ID NO: 10) auf und enthält die unterstrichene BamHI-Restriktionsenzymschnittstelle. Eingebaut in einen Expressionsvektor wie nachstehend beschrieben, liefert das 5'-Ende des amplifizierten, DR4-codierenden Fragments ein effizient gespaltenes Signalpeptid. Ein wirksames Signal für den Start der Translation in eukaryontischen Zellen wie von Kozak, M., J. Mol. Biol. 196: 947–950 (1987) beschrieben, liegt passend im Vektoranteil des Konstrukts. Der 3'-Primer für beide DR4 hat die Sequenz 5'-GCGGGATCCTCAATTATGTCCATTGCCTG-3' (SEQ ID NO: 12) und enthält die unterstrichene BamHI-Restriktionsschnittstelle, gefolgt von Nucleotiden, die komplementär zu der in 1 dargelegten DR4-Nucleotidsequenz sind, gefolgt vom Stop-Codon.
Das amplifizierte Fragment wird aus einem 1%igen Agarosegel unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kit („Geneclean”, BIO 101 Inc., La Jolla, CA) isoliert. Dann wird das Fragment mit BamHI und Asp718 gespalten und erneut auf einem 1%igen Agarosegel aufgereinigt.
Der Vektor pA2 wird verwendet, um das DR4-Protein unter Verwendung von Standardverfahren wie jene, die in Summers et al., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin Nr. 1555 (1987) beschrieben, im Baculovirus-Expressionssystem zu exprimieren.
Dieser Expressionsvektor enthält den starken Polyhedrin-Promotor des Autographa californica Nuclear Polydedrosis Virus (ACMNPV), gefolgt von geeigneten Restriktionsschnittstellen. Für eine einfache Selektion der rekombinanten Viren wird das Beta-Galactosidase-Gen von E. coli in der gleichen Orientierung wie der Polyhedrin-Promotor eingebaut, gefolgt von dem Polyadenylierungssignal des Polyhedrin-Gens. Die Polyhedrin-Sequenzen werden an beiden Seiten flankiert von viralen Sequenzen für die Zell-vermittelte homologe Rekombination mit der viralen Wildtyp-DNA, um lebensfähige Viren, die das clonierte Polynucleotid exprimieren, herzustellen.
Viele andere Baculovirusvektoren könnten an Stelle von pA2 verwendet werden, wie beispielsweise pAc373, pVL941 und pAclM1, vorausgesetzt, die Struktur stellt, wie der Fachmann ohne Weiteres verstehen wird, entsprechend lokalisierte Signale für die Transkription, Translation, den Transport und Ähnliches, wie beispielsweise ein AUG im richtigen Leseraster und bei Bedarf ein Signalpeptid, bereit. Solche Vektoren werden unter anderen in Luckow et al., Virology 170: 31–39 beschrieben.
Mittels auf dem Fachgebiet bekannter Routine-Verfahren wird das Plasmid mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten und dann unter Verwendung von Kälberdarm Phosphatase dephosphoryliert. Die DNA wird dann aus einem 1%igen Agarosegel unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kit („Geneclean”, BIO 101 Inc., La Jolla, CA) isoliert.
Das Fragment und das dephosphorylierte Plasmid werden mit T4-DNA-Ligase zusammenligiert. E. coli HB101-Zellen werden mit dem Ligationsgemisch transformiert und auf Kulturplatten verteilt. Bakterien, die das Plasmid mit dem menschlichen DDCR-Gen enthalten, werden identifiziert, indem die DNA einzelner Kolonien mittels BamHI gespalten und dann das gespaltene Produkt mittels Gelelektrophorese analysiert wird. Die Sequenz des clonierten Fragments wird durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Dieses Plasmid wird hierin mit pBac DR4 bezeichnet. Unter Verwendung des Lipofection-Verfahrens, beschrieben von Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413–7417 (1987), werden 5 μg des pBac DR4-Plasmids mit 1,0 μg im Handel erhältlicher, linearisierter Baculovirus-DNA („BaculoGold^TM baculovirus DNA”, Pharmingen, San Diego, CA) co-transfiziert. 1 μg der BaculoGold^TM Virus-DNA und 5 µg des pBac DR4-Plasmids werden in einem Loch einer Mikrotiterplatte, die 50 µl Serum-freies Grace's Medium (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) enthält, gemischt. Danach werden 10 µl Lipofectin zuzüglich 90 µl Grace's Medium zugegeben, gemischt und für die Dauer von 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wird das Transfektionsgemisch tropfenweise zu den Sf9-Insektenzellen (ATCC CRL 1711) zugegeben und in einer 35 mm Gewebekulturplatte mit 1 ml Grace's Medium ohne Serum ausgesät. Die Platte wird vor- und rückwärtsbewegt, um die frisch zugegebene Lösung zu mischen. Die Platte wird dann für die Dauer von 5 Stunden bei 27°C inkubiert. Nach 5 Stunden wird die Transfektionslösung von der Platte entfernt und 1 ml Grace's Insekten-Medium, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, zugegeben. Die Platte wird in den Inkubator zurückgestellt und die Kultivierung wird für die Dauer von vier Tagen bei 27°C fortgeführt.
Nach vier Tagen wird der Überstand gesammelt und ein Plaquetest durchgeführt wie von Summers und Smith, vorstehend zitiert, beschrieben. Ein Agarosegel mit „Blue Gal” (Life Technologies Inc., Gaithersburg) wird verwendet, um eine einfache Identifizierung und Isolierung der Gal-exprimierenden Clone, die blaugefärbte Plaques erzeugen, zu ermöglichen (eine genaue Beschreibung eines „Plaque-Tests” dieses Typs kann auch in der Gebrauchsanweisung für Insekten-Zellkultur und Baculovirologie, vertrieben von Life Technologies Inc., Gaithersburg, Seite 9–10, gefunden werden).
Vier Tage nach der Reihenverdünnung wird das Virus zu den Zellen gegeben. Nach entsprechender Inkubation, werden blaugefärbte Plaques mit der Spitze einer Eppendorf-Pipette, gepickt. Der Agar, der die rekombinanten Viren enthält, wird dann in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß, welches 200 µl Grace's Medium enthält, resuspendiert. Der Agar wird durch kurzes Abzentrifugieren entfernt und der rekombinante Baculovirus-haltige Überstand wird verwendet, um in 35 mm Platten ausgesäte Sf9-Zellen zu infizieren. Vier Tage später werden die Überstände von diesen Kulturplatten geerntet und dann bei 4°C aufbewahrt. Ein Clon, der das sauber eingebaute DR4 enthält, wird mittels DNA-Analyse, einschließlich Restriktionskartierung und Sequenzierung, identifiziert. Dies wird hierin als V-DR4 bezeichnet.
Die Sf9-Zellen werden in Grace's Medium, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem FBS, gezüchtet. Die Zellen werden mit dem rekombinanten Baculovirus V-DR4 mit einer Infektionsmultiplizität („MOI”, engl.: multiplicity of infection) von etwa 2 (etwa 1 bis etwa 3) infiziert. Sechs Stunden später wird das Medium entfernt und durch SF900II-Medium ohne Methionin und Cystein (erhältlich bei Life Technologies Inc., Gaithersburg) ersetzt. 42 Stunden später werden 5 gCi ³⁵S-Methionin und 5 µCi ³⁵S-Cystein (erhältlich bei Amersham) zugegeben. Die Zellen werden für die Dauer von 16 Stunden weiter inkubiert. Dann werden sie mittels Zentrifugation geerntet, lysiert und die markierten Proteine mittels SDS-PAGE und Autoradiographie sichtbargemacht.
BEISPIEL 4: Gewebeverteilung der DR4-Expression
Eine Northern-Blot-Analyse wird durchgeführt, um die DR4-Gen (ATCC Nr. 97853)-Expression in humanen Geweben, unter Verwendung von Verfahren die unter anderem von Sambrook et al., vorstehend zitiert, beschrieben werden, zu untersuchen. Eine cDNA-Sonde, die die vollständige Nucleotidsequenz des DR4-Proteins (SEQ ID NO: 1) enthält, wird mit dem rediprime^TM DNA Markierungssystem (Amersham Life Science), gemäß den Herstellerangaben, mit ³²P markiert. Nach dem Markieren wird die Sonde unter einer CHROMA SPIN-100^TM-Säule (Clontech Laboratories, Inc.), gemäß dem Herstellerprotokoll Nummer PT1200-1, aufgereinigt. Die gereinigte, markierte Sonde wird dann verwendet, um verschiedene menschliche Gewebe nach DR4-mRNA zu überprüfen.
Vielfache Gewebe Northern-Blots (MTN, engl.: Multiple Tissue Northern), die verschiedene menschliche Gewebe (H) oder menschliches Immunsystemgewebe (IM) enthalten, werden von Clontech bezogen und mit der markierten Sonde mittels ExpressHyb^TM-Hybridisierungslösung (Clontech) gemäß dem Herstellerprotokoll Nummer PT1190-1 untersucht. Nach dem Hybridisieren und Waschen werden die Blots eingespannt, über Nacht bei –70°C ein Film exponiert und die Filme gemäß den Standardverfahren entwickelt. Die Expression von DR4 wurde in Geweben nachgewiesen, die mit Lymphocyten angereichert waren, einschließlich amniotischen Zellen, Herz, Leberkrebs, Nieren, Leukocyten des peripheres Bluts, aktivierte T-Zellen, K562 plus PMA, W138-Zellen, Th2-Zellen, menschliche Mandeln und CD34-abgereicherte Leukocyten- und Thrombocytenschicht (Nabelschnurblut). Es ist vorstellbar, dass DR4 eine Rolle bei der Lymphocyten-Homöostase spielt.
BEISPIEL 5: DR4-induzierte Apoptose
Die Überexpression von Fas/APO-1 und TNFR-1 in Säugerzellen ahmt die Rezeptoraktivierung nach (Muzio, M. et al., Cell 85: 817–827 (1996), Boldin, M. P. et al., Cell 85: 803–815 (1996)). Daher wurde dieses System verwendet, um die funktionelle Rolle von DR4 zu untersuchen. Die vorübergehende Expression von DR4 in den menschlichen Brustkrebszellen MCF7 und den menschlichen embryonalen Nierenzellen 293 induziert schnell die Apoptose.
Zelltod-Tests werden im Wesentlichen wie vorstehend beschrieben durchgeführt (Chinnaiyan, A. M. et al., Cell 81: 505–12 (1995), Boldin, M. P. et al., J. Biol. Chem. 270: 7795–8 (1995), Kischkel, F. C. et al., EMBO 14, 5579–5588 (1995), Chinnaiyan, A. M. et al., J. Biol. Chem. 271: 4961–4965 (1996)). Kurz, MCF-7, menschliche clonale Brustkrebszelllinien, die stabil mit entweder dem Vektor allein oder einem CrmA-Expressionskonstrukt (Tewari, M. et al., J. Biol. Chem. 270: 3255–60 (1995)) transfiziert sind, werden vorübergehend mit pCMV-DR4-Galactosidase (oder pCMV-DR4-Galactosidase, dem die „Death Domain” fehlt) in der Anwesenheit eines zehnfachen Überschusses an pcDNA3-Expressionskonstrukt, das die angezeigten Proteine codiert, mittels Lipofectamin (GIBCO-BRL) transfiziert. 293-Zellen werden, unter der Verwendung des CaPO₄-Verfahrens, gleichermaßen transfiziert. Der ICE-Familie-Inhibitor z-VAD-fmk (Enzyme Systems Products, Dublin, CA) wird in einer Konzentration von 10 µM, 5 Stunden nach der Transfektion, zu den Zellen gegeben. 32 Stunden nach der Transfektion werden die Zellen fixiert und mit X-Gal wie vorstehend beschrieben gefärbt (Chinnaiyan, A. M. et al., Cell 81: 505–12 (1995), Boldin, M. P. et al., J. Biol. Chem. 270: 7795–8 (1995), Kischkel, F. C. et al., EMBO 14, 5579–5588 (1995).
Die Zellen zeigten morphologische Veränderungen, die typisch sind für Zellen, die die Apoptose durchlaufen: werden rund, kondensierten und lösten sich von der Platte ab. Ähnlich zu TNFR-1 und Fas/APO-1 (Muzio, M. et al., Cell 85: 817–827 (1996); Boldin, M. P. et al., Cell 85: 803–815 (1996), Tewari, M. et al., J. Biol Chem. 270: 3255–60 (1995)) wurde die DR4-induzierte Apoptose durch die Inhibitoren der ICE-ähnlichen Proteasen, CrmA und z-VAD-fmk, blockiert.
Es ist selbstverständlich, dass die Erfindung auch auf andere Art als genau in der vorstehenden Beschreibung und den vorstehenden Beispielen beschriebenen Weise durchgeführt werden kann. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nucleinsäuremolekül, umfassend ein Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Nucleotidsequenz, die das Volllängen-DR4-Polypeptid codiert, das die vollständige Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist, einschließlich der vorausgesagten Leadersequenz; (b) einer Nucleotidsequenz, die das Volllängen-DR4-Polypeptid codiert, das die vollständige Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist, einschließlich der vorausgesagten Leadersequenz aber ohne das amino-terminale Methionin; (c) einer Nucleotidsequenz, die das reife DR4-Polypeptid (Volllängen-Polypeptid mit entfernter Leadersequenz) codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 an den Positionen von etwa 24 bis etwa 468 aufweist; (d) einer Nucleotidsequenz, die das Volllängen-DR4-Polypeptid codiert, das die vollständige Aminosäuresequenz einschließlich der Leadersequenz aufweist, die durch den cDNA-Clon, der in der ATCC-Hinterlegungsnummer 97853 enthalten ist, codiert wird; (e) einer Nucleotidsequenz, die das Volllängen-DR4-Polypeptid codiert, das die vollständige Aminosäuresequenz einschließlich der Leadersequenz aber ohne das amino-terminale Methionin aufweist, die durch den cDNA-Clon, der in der ATCC-Hinterlegungsnummer 97853 enthalten ist, codiert wird; (f) einer Nucleotidsequenz, die das reife DR4-Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz, die durch den cDNA-Clon, der in der ATCC-Hinterlegungsnummer 97853 enthalten ist, codiert wird; (g) einer Nucleotidsequenz, die die DR4-extrazelluläre Domäne mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 an den Positionen von etwa 24 bis etwa 238 aufweist, oder wie durch die ATCC-Hinterlegungsnummer 97853 codiert; (h) einer Nucleinsäuresequenz, die die vollständige Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 oder des cDNA-Clons, der in der ATCC-Hinterlegungsnummer 97853 enthalten ist, aufweist; (i) einer Nucleinsäuresequenz, die die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 aufweist, die das DR4-Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz an den Positionen 2 bis 468 der SEQ ID NO: 2 aufweist; (j) einer Nucleinsäuresequenz, die die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 aufweist, die die extrazelluläre Domäne des DR4-Polypeptids codiert, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 and den Positionen von etwa 24 bis etwa 238 aufweist; (k) einer Nucleotidsequenz, die zu mindestens 95% identisch ist zu einer Nucleotidsequenz, wie in einem von (a) bis (j) definiert, und die ein Polypeptid codiert, das fähig ist, den TNF-verwandten Apoptose-induzierenden Liganden (TRAIL) zu binden oder Apoptose zu induzieren; (l) einer Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, das mindestens 95% Identität zur Aminosäuresequenz eines Polypeptids aufweist, das von einer Nucleotidsequenz aus einem von (a) bis (j) codiert wird, und die ein Polypeptid codiert, das fähig ist, TRAIL zu binden oder Apoptose zu induzieren; und (m) einer Nucleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nucleotidsequenz, wie durch einen von (a) bis (j) definiert, hybridisiert, wobei die hybridisierende Nucleotidsequenz unter stringenten Bedingungen nicht mit einem Polynucleotid hybridisiert, das eine Nucleotidsequenz aufweist, die nur aus A-Resten oder nur aus T-Resten besteht, und wobei die Nucleotidsequenz ein Polypeptid codiert, das fähig ist, TRAIL zu binden, oder den komplementären Strang eines solchen Polynucleotids.
Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1, das DNA oder RNA ist.
Verfahren zur Herstellung eines Vektors, der das Einbringen des Nucleinsäuremoleküls gemäß Anspruch 1 oder 2 in einen Vektor umfasst.
Vektor, der das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2 beinhaltet oder der durch das Verfahren gemäß Anspruch 3 hergestellt wurde.
Verfahren zur Herstellung einer Wirtszelle, das das Einbringen des Vektors gemäß Anspruch 4 in eine Wirtszelle umfasst.
Wirtszelle, die das Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 oder 2 oder den Vektor gemäß Anspruch 4 umfasst, oder die durch das Verfahren gemäß Anspruch 5 hergestellt wurde.
Verfahren zur Herstellung eines DR4-Polypeptids, das das Züchten der Wirtszelle gemäß Anspruch 6 unter solchen Bedingungen, dass das Polypeptid exprimiert wird, und das Gewinnen des Polypeptids umfasst.
Polypeptid, das die Aminosäuresequenz aufweist, die durch das Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 codiert wird oder die durch das Verfahren gemäß Anspruch 7 erhältlich ist.
Antikörper, der spezifisch an das Polypeptid gemäß Anspruch 8 bindet.
Antisense-Molekül, das befähigt ist, die Expression des Polypeptids gemäß Anspruch 8 zu steuern, wobei das Antisense-Molekül spezifisch mit dem Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 oder 2 hybridisiert.
Agonist des Polypeptids gemäß Anspruch 8, der ein Antikörper gemäß Anspruch 9 ist, der befähigt ist, die apoptotische Aktivität des Polypeptids zu erhöhen.
Arzneimittel, das das Polypeptid gemäß Anspruch 8, den Antikörper gemäß Anspruch 9, den Agonisten gemäß Anspruch 11 oder das Antisense-Molekül gemäß Anspruch 10 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Diagnosemittel, das das Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 oder 2 oder einen Antikörper gemäß Anspruch 9 umfasst.
Verfahren für das Durchmustern auf einen Antagonisten oder einen Agonisten des Polypeptids gemäß Anspruch 8, umfassend das Züchten der Wirtszelle gemäß Anspruch 6 unter solchen Bedingungen, dass das Polypeptid exprimiert wird, das Inkontaktbringen der Wirtszelle mit einer Kandidaten-verbindung und einem Liganden zu dem Polypeptid, das Ermitteln einer zellulären Antwort und das Vergleichen der ermittelten Antwort mit einer zellulären Antwort, wenn die Wirtszelle nur mit dem Liganden in Kontakt gebracht wurde.