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Bereich der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft neu identifizierte Polynucleotide,
Polypeptide, die durch solche Polynucleotide kodiert sind, die Verwendung
solcher Polynucleotide und Polypeptide, sowie die Herstellung und Isolierung
solcher Polynucleotide und Polypeptide. Insbesondere wurden die
erfindungsgemäßen Polypeptide als
Phytasen und insbesondere als Enzyme mit Phytaseaktivität identifiziert.
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Hintergrund
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Mineralien
sind wesentliche Elemente für
das Wachstum aller Organismen. Für
die Produktion von monogastrischen Tieren (z. B. Schweine, Geflügel) und
Fischen wird das Futter normalerweise mit Mineralien angereichert.
Pflanzensamen sind eine reichhaltige Mineralquelle, da sie Ionen
enthalten, die mit Phosphatgruppen von Phytinsäure komplexiert sind. Wiederkäuer benötigen kein
anorganisches Phosphat und keine Mineralien, da Mikroorganismen
im Pansen Enzyme produzieren, die die Umwandlung von Phytat (Myo-Inositol-Hexaphosphat)
in Inositol und anorganisches Phosphat katalysieren. In dem Prozess
werden mit Phytat komplexierte Mineralien freigesetzt.
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Phytat
kommt als eine Quelle von gespeichertem Phosphor in praktisch in
jedem Pflanzenfutter vor (Phytic Acid. Chemistry and Applications,
E. Graf (Ed.). Pilatus Press: Minneapolis, MN. U.S.A. 1986). Phytinsäure bildet
einen normalen Bestandteil des Samens in Getreidepflanzen und Hülsenfrüchten. Sie
hat die Aufgabe, diätetische
Mineralien zu binden, die für
die aus dem Samen entstehende neue Pflanze lebenswichtig sind. Wenn
die Phosphatgruppen von Phytinsäure
durch das Samenenzym Phytase entfernt werden, geht die Fähigkeit
zur Bindung von Metallionen verloren und die Mineralien stehen der
Pflanze zur Verfügung.
In Tierfutterkörnern
stehen die durch Phytinsäure
gebundenen Spurenmineralien nur teilweise zur Absorption durch monogastrische
Tiere zur Verfügung,
denen eine Phytaseaktivität
fehlt. Obschon eine gewisse Hydrolyse von Phytat im Kolon stattfindet,
läuft der
größte Teil
des Phytats durch den Magen-Darm-Trakt monogastrischer Tiere und
wird im Dung ausgeschieden, was in Gebieten mit Massentierhaltung
zu Phosphatverunreinigungsproblemen durch Fäkalien beiträgt. Im Kolon
freigesetzter anorganischer Phosphor hat keinen Nährwert für Vieh,
da anorganischer Phosphor nur im Dünndarm absorbiert wird. Folglich
steht eine bedeutende Menge der ernährungsphysiologisch wichtigen
diätetischen
Mineralien monogastrischen Tieren möglicherweise nicht zur Verfügung.
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Die
Umwandlung von Phytat in Inositol und anorganischen Phosphor kann
durch mikrobielle Enzyme katalysiert werden, die allgemein als Phytasen
bezeichnet werden. Phytasen wie die Phytase EC 3.1.3.8 können die
Hydrolyse von Myo-Inositol-Hexaphosphat in D-Myo-Inositol-1,2,4,5,6-Pentaphosphat
und Orthophosphat katalysieren. Bestimmte Pilzphytasen hydrolysieren
angeblich Inositolpentaphosphat in Tetra-, Tri- und niedere Phosphate;
z. B. produzieren A. Ficuum Phytasen angeblich Gemische aus Myoinositol-di-
und mono-phosphat (Ullah, 1988). Phytase produzierende Mikroorganismen
umfassen Bakterien wie Bacillus subtilis (V. K. Powar und V. J.
Jagannathan, J. Bacteriol. 151: 1102–1108, 1982) und Pseudomonas
(D. J. Cosgrove, Austral. J. Biol. Sci. 2: 1207–1220, 1970); Hefen wie Sacchoromyces
cerevisiae (N. R. Nayini und P. Markakis, Lebensmittel Wissenschaft
und Technologie 17: 24–26,
1984); und Pilze wie Aspergillus terreus (K. Yamada, et al., Agric.
Biol Chem. 32: 1275–1282,
1968). Über
die mögliche
Verwendung von Mikroben, die Phytase als Futterzusatz für monogastrische
Tiere produzieren können,
wurde zuvor berichtet (Shieh und Ware,
US-Patent Nr. 3,297,548 ; Nelson, T.
S. et al., J. Nutrition 101: 1289–1294, 1971).
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Mikrobielle
Phytasen können
angeblich auch für
die Herstellung von Tierfutter aus bestimmten Industrieprozessen
nützlich
sein (z. B. Weizen- und Maisabfallprodukte). Aus dem Nassvermahlprozess
von Mais gehen Glutene hervor, die als Tierfutter verkauft werden.
Die Zugabe von Phytase kann den Nährwert des Futterprodukts angeblich
verbessern. Über
pilzliche Phytase-Enzyme und Verfahrensbedingungen (t ~50°C und pH
~5,5) wurde zuvor in der
europäischen Patentanmeldung
0 321 004 berichtet. Bei der Verarbeitung von Sojabohnenmehl
werden das Mehl und die Abfallprodukte angeblich durch die Anwesenheit
von Phytat für
Futter zur Aufzucht von Fischen, Geflügel und anderen Nichtwiederkäuern sowie
für mit
Milch gefütterte
Kälber
ungeeignet. Phytase ist angeblich zur Verbesserung des Nährwerts
und des kommerziellen Werts dieses proteinreichen Sojamaterials
von Nutzen (siehe Finase Enzymes von Alko, Rajamaki, Finnland).
Eine Kombination aus Phytase und einer Säurephosphatase (pH-Optimum
2,5) von A. niger wurde von Alko, Ltd. als Tierfutterzusatz in ihrem
Phytinsäure-Abbauprodukt
Finas F und Finase S verwendet. Eine kosteneffektive Phytasequelle
würde den
Wert von Sojabohnenmehl als Tierfutter erheblich verbessern (Shieh
et al., 1969).
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Phytase
und weniger spezifische Säurephosphatasen
werden von dem Pilz Aspergillus ficuum als extrazelluläre Enzyme
produziert (Shieh et al., 1969). Ullah reinigte Berichten zufolge
eine Phytase von Wildtyp-A.-ficuum, die eine scheinbare relative
Molekülmasse
von 61,7 kDA (gemäß SDS-Page;
bereinigt im Hinblick auf Glyosylierung); ein pH-Optimum bei pH 2,5 und pH 5,5; einen
Km-Wert von etwa 40 μM
und eine spezifische Aktivität
von etwa 50 U/mg hatte (Ullah, A., Preparative Biochem 18: 443–458, 1988);
die PCT-Patentanmeldung
WO 91/05053 offenbart ebenfalls
den Angaben zufolge die Isolierung und molekulare Klonierung einer
Phytase von Aspergillus ficuum mit einem pH-Optimum bei pH 2,5 und
pH 5,5, einem Km-Wert von etwa 250 μM und einer spezifischen Aktivität von etwa
104 U/mg Protein.
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Säurephosphatasen
sind Enzyme, die eine breite Vielfalt von Phosphatestern katalytisch
hydrolysieren und gewöhnlich
ein pH-Optimum unter 6,0 aufweisen (Hollander, 1971); EC 3.1.3.2
katalysiert z. B. die Hydrolyse von orthophosphorischen Monoestern
zu Orthophosphatprodukten. Eine Säurephosphatase wurde angeblich
von A. ficuum gereinigt. Die deglykosylierte Form der Säurephosphatase
hat eine scheinbare relative Molekülmasse von 32,6 kDa (Ullah
et al., 1987).
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine rekombinante Phytase
isoliert von Escherichia coli B bereitzustellen, die die Effizienz
der Freisetzung von Phosphor von Phytat und den Salzen von Phytinsäure verbessert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Quelle
für ein
rekombinantes Enzym bereitzustellen, das für den kommerziellen Einsatz
in Futtermitteln und Industrieprozessen mit minimaler Bearbeitung
geeignet ist.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Polynucleotid und ein dadurch kodiertes
Polypeptid bereit, das als ein Phytaseenzym mit Phytaseaktivität identifiziert
wurde. Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung werden ein neuartiges rekombinantes
Enzym sowie aktive Fragmente, Analoga und Derivate davon bereitgestellt.
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Gemäß einem
anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden isolierte Nucleinsäuremoleküle, die das
erfindungsgemäße Enzym
kodieren, einschließlich
mRNA, DNA, cDNA, genomische DNA, sowie aktive Analoga und Fragmente
solcher Enzyme bereitgestellt.
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Gemäß noch einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur
Herstellung solcher Polypeptide durch Rekombinationstechniken bereitgestellt,
das das Kultivieren rekombinanter prokaryotischer und/oder eukaryotischer
Wirtszellen, die eine Nucleinsäuresequenz
enthalten, die ein erfindungsgemäßes Enzym
kodiert, unter Bedingungen beinhaltet, die die Expression des genannten
Enzyms und die anschließende
Gewinnung des genannten Enzyms fördern.
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Gemäß noch einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur
Nutzung eines solchen Enzyms oder Polynucleotids, das solche Enzyme
kodiert, in kommerziellen Verfahren bereitgestellt, wie zum Beispiel
Verfahren, bei denen Mineralien von Phytaten in Pflanzenmaterialien
entweder in vitro, d. h. in Futterbehandlungsverfahren, oder in
vivo, d. h. durch die Verabreichung des Enzyms an Tiere, freigesetzt werden.
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Gemäß noch einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur
Nutzung solcher Enzyme oder Polynucleotide, die solche Enzyme kodieren,
für In-vitro-Zwecke im Zusammenhang
mit wissenschaftlicher Forschung bereitgestellt, zum Beispiel zur
Erzeugung von Sonden zur Identifizierung ähnlicher Sequenzen, die möglicherweise ähnliche
Enzyme kodieren, von anderen Organismen.
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Diese
und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung müssten der Fachperson anhand
der Lehren hierin offenkundig sein.
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KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Die
folgenden Zeichnungen illustrieren Ausgestaltungen der Erfindung
und sollen den von den Ansprüchen
eingeschlossenen Umfang der Erfindung nicht begrenzen.
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1 zeigt
die Nucleotid- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen des Enzyms der
vorliegenden Erfindung. Die Sequenzierung erfolgte mit einem automatisierten
DNA-Sequenzer 378
(Applied Biosystems, Inc.).
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2 zeigt
das pH- und Temperaturprofil und die Stabilitätsdaten für das Phytaseenzym der vorliegenden
Erfindung. Es wird der folgende Assay für diese Analysen für den Nachweis
von Phytaseaktivität
angewendet: Phytaseaktivität
wird durch Inkubieren von 150 μl
des Enzympräparates
mit 600 μl
2 mM Natriumphytat in 100 mM Tris-HCl-Puffer, pH 75, angereichert
mit 1 mM CaCl2, über einen Zeitraum von 30 Minuten bei
37°C gemessen.
Nach dem Inkubieren wird die Reaktion durch Zugabe von 750 μl einer 5%igen
Trichloressigsäure
gestoppt. Freigesetztes Phosphat wurde anhand eines Phosphatstandards
spektrophotometrisch bei 700 nm nach der Zugabe von 1500 μl des Farbreagens
(4 Volumen von 1,5% Ammoniummolybdat in 5,5% Schwefelsäure und
1 Volumen von 2,7% Ferrosulfat; Shimizu, M., 1992; Biosci. Biotech.
Biochem., 56: 1266–1269)
gemessen. OD bei 700 nm ist auf der Y-Achse der Diagramme in 2 angegeben.
Temperatur bzw. pH-Wert ist auf der X-Achse der Diagramme angegeben.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Der
Begriff „Gen" bezieht sich auf
das Segment von DNA, das in der Herstellung einer Polypeptidkette involviert
ist; es beinhaltet Regionen, die der Kodierungsregion vorangehen
und folgen (Leader und Trailer) sowie Intervening-Sequenzen (Introne)
zwischen einzelnen Kodierungssegmenten (Exone).
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Eine
Kodierungssequenz ist „funktionell
verknüpft
mit" einer anderen
Kodierungssequenz, wenn RNA-Polymerase die beiden Kodierungssequenzen
in eine einzelne mRNA transkribiert, die dann in ein einzelnes Polypeptid
translatiert wird, das Aminosäuren
aufweist, die von beiden Kodierungssequenzen stammen. Die Kodierungssequenzen
müssen
nicht aneinander angrenzen, solange die exprimierten Sequenzen letztendlich
zur Produktion des gewünschten
Proteins verarbeitet werden.
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„Rekombinante" Enzyme beziehen
sich auf Enzyme, die durch DNA-Rekombinationstechniken produziert
werden; d. h. sie werden von Zellen produziert, die durch ein exogenes
DNA-Konstrukt transformiert wurden, das das gewünschte Enzym kodiert. „Synthetische" Enzyme sind solche,
die durch chemische Synthese hergestellt werden.
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Eine
DNA-„Kodierungssequenz
von” einem
speziellen Enzym oder eine ein spezielles Enzym „kodierende Nucleotidsequenz" ist eine DNA-Sequenz,
die in ein Enzym transkribiert und translatiert wird, wenn sie unter
die Kontrolle angemessener Regulationssequenzen gesetzt wird. Eine „Promotorsequenz" ist eine DNA-Regulationsregion,
die RNA-Polymerase in einer Zelle binden und die Transkription einer
stromabwärtigen
(3'-Richtung) Kodierungssequenz
initiieren kann. Der Promotor ist Teil der DNA-Sequenz. Diese Sequenzregion
hat ein Startcodon an ihrem 3'-Terminus. Die Promotorsequenz
beinhaltet die Mindestanzahl von Basen, wo Elemente, die zum Initiieren
der Transkription auf nachweisbaren Niveaus über Hintergrund notwendig sind
[sic]. Nachdem die RNA-Polymerase die Sequenz gebunden hat und die
Transkription am Startcodon (3'-Terminus
mit einem Promotor) initiiert wurde, fährt die Transkription jedoch
stromabwärts
in der 3'-Richtung fort.
Innerhalb der Promotorsequenz befinden sich eine Transkriptionsinitiationsstelle
(praktisch definiert durch Nuclease-S1-Kartierung) sowie Proteinbindungsdomänen (Konsensussequenzen),
die für
die Bindung von RNA-Polymerase
verantwortlich sind.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein gereinigtes rekombinantes Enzym
bereit, das die Hydrolyse von Phytat zu Inositol und freiem Phosphat
mit der Freisetzung von Mineralien aus dem Phytinsäurekomplex
katalysiert. Ein beispielhaftes gereinigtes Enzym ist eine von Escherichia
coli B. abgeleitete Phytase. Dieses beispielhafte Enzym ist in 1,
SEQ ID Nr. 2, dargestellt.
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Das
die SEQ ID Nr. 2 kodierende Polynucleotid wurde ursprünglich von
genomischer DNA gewonnen, die von Escherichia coli B isoliert wurde,
wie nachfolgend beschrieben. Es enthält ein offenes Leseraster,
das ein Protein mit 432 Aminosäureresten
kodiert.
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In
einer Ausgestaltung hat das Phytaseenzym der SEQ ID Nr. 2 der vorliegenden
Erfindung eine relative Molekülmasse
von etwa 47.056 Kilodalton, gemessen anhand SDS-PAGE Gelelektrophorese,
und eine von der Nucleotidsequenz des Gens hergeleitete relative
Molekülmasse.
pl liegt bei 6,70. Das pH- und Temperaturprofil und die Stabilitätsdaten
für dieses
Enzym sind in 2 präsentiert. Dieses gereinigte
Enzym kann zum Katalysieren der Hydrolyse von Phytat zu Inositol
und freiem Phosphat bei Bedarf verwendet werden. Das erfindungsgemäße Phytaseenzym
hat eine hohe Thermostabilität.
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Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung werden isolierte Nucleinsäuremoleküle (Polynucleotide)
bereitgestellt, die das reife Enzym mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz
aus 1 kodieren.
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Die
vorliegende Erfindung kann zum Isolieren von Nucleinsäuresequenzen
verwendet werden, die im Wesentlichen dem in 1 (SEQ ID
Nr. 1) offenbarten isolierten Nucleinsäuremolekül, das ein Phytaseenzym kodiert, ähnlich sind.
Isolierte Nucleinsäuresequenzen
sind im Wesentlichen ähnlich,
wenn: (i) sie unter stringenten Bedingungen (im Folgenden beschrieben)
mit SEQ ID Nr. 1 hybridisieren können
oder (ii) sie DNA-Sequenzen kodieren, die im Hinblick auf SEQ ID
Nr. 1 degeneriert sind. Degenerierte DNA-Sequenzen kodieren die
Aminosäuresequenz
von SEQ ID Nr. 2, haben aber in den Nucleotidkodierungssequenzen
Variationen. Der hierin verwendete Begriff „im Wesentlichen ähnlich" bezieht sich auf
Sequenzen mit ähnlicher
Identität
wie Sequenzen der vorliegenden Erfindung.
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Die
Nucleotidsequenzen, die im Wesentlichen ähnlich sind, können durch
Hybridisierung oder durch Sequenzvergleich ermittelt werden. Enzymsequenzen,
die im Wesentlichen ähnlich
sind, können
durch eines oder mehrere der folgenden Verfahren identifiziert werden:
proteolytischer Verdau, Gelelektrophorese und/oder Mikrosequenzierung.
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Eine
Möglichkeit
zur Isolierung eines Nucleinsäuremoleküls, das
ein Phytaseenzym kodiert, besteht darin, eine genomische Genbibliothek
mit einer natürlichen
oder künstlich
konstruierten Sonde unter Anwendung von in der Technik anerkannten
Verfahren zu sondieren (siehe zum Beispiel: Current Protocols in
Molecular Biology, Ausubel F. M. et al. (EDS.) Green Publishing
Company Assoc. and John Wiley Interscience, New York, 1989, 1992).
Für die
Fachperson wird es verständlich
sein, dass die SEQ ID Nr. 1 oder Fragmente davon (die wenigstens
15 aneinander grenzende Nucleotide umfassen) eine besonders nützliche
Sonde ist. Andere besonders nützliche
Sonden für
diesen Zweck sind mit den Sequenzen von SEQ ID Nr. 1 hybridisierbare
Fragmente (umfassend wenigstens 10 aneinander grenzende Nucleotide
und wenigstens 70% komplementär
zu einer Targetsequenz), ist eine besonders nützliche Sonde [sic]. Andere
besonders nützliche
Sonden für
diesen Zweck sind mit den Sequenzen von SEQ ID Nr. 1 hybridisierbare
Fragmente (d. h. sie umfassen wenigstens 10 aneinander grenzende
Nucleotide und sind wenigstens 70% komplementär zu einer Targetsequenz).
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Mit
Bezug auf Nucleinsäuresequenzen,
die mit spezifischen, hierin offenbarten Nucleinsäuresequenzen
hybridisieren, kann die Hybridisierung unter Bedingungen reduzierter
Stringenz, mittlerer Stringenz oder sogar unter stringenten Bedingungen
erfolgen. Als ein Beispiel für
die Oligonucleotidhybridisierung wird eine Polymermembran, die immobilisierte
denaturierte Nucleinsäure
enthält,
zunächst
30 Minuten lang bei 45°C
in einer Lösung
aus 0,9 M NaCl, 50 mM NaH2PO4,
pH 7,0, 5,0 mM Na2EDTA, 0,5% SDS, I OX Denhardt's und 0,5 mg/ml Polyriboadenylsäure vorhybridisiert.
Etwa 2 × 107 cpm (spezifische Aktivität 4–9 × 108 cpm/μg)
einer 32P-endmarkierten Oligonucleotidsonde
werden dann zur Lösung
gegeben. Nach 12–16
Stunden Inkubation wird die Membran 30 Minuten lang bei Raumtemperatur
in 1 × SET
(150 mM NaCl, 20 mM Tris-Hydrochlorid, pH
7,8, 1 mM Na2EDTA) mit 0,5% SDS gewaschen,
gefolgt von einer 30-minütigen
Wäsche
in frischem 1 × SET
bei Tm –10°C für die Oligonucleotidsonde.
Die Membran wird anschließend
einem autoradiographischen Film für den Nachweis von Hybridisierungssignalen
ausgesetzt.
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Stringente
Bedingungen bedeuten, dass die Hybridisierung nur dann stattfindet,
wenn wenigstens 90% Identität,
vorzugsweise wenigstens 95% Identität und am bevorzugtesten wenigstens
97% Identität
zwischen den Sequenzen vorliegt (siehe J. Sambrook et al., Molecular
Cloning, A Laboratory Manual (2. Ausgabe 1989) (Cold Spring Harbor
Laboratory).
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Der
hierin verwendete Begriff „Identität" bezieht sich auf
eine Polynucleotidsequenz, die einen prozentualen Anteil der gleichen
Basen wie ein Referenzpolynucleotid umfasst (SEQ ID Nr. 1). Ein
Polynucleotid, das zum Beispiel wenigstens 90% mit einem Referenzpolynucleotid
identisch ist, hat Polynucleotidbasen, die zu 90% mit den das Referenzpolynucleotid
bildenden Basen identisch sind, und kann einen Basenanteil von 10% haben,
die zu den Basen unterschiedlich sind, aus denen sich diese Polynucleodidsequenz
zusammensetzt.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft außerdem Polynucleotide, die
sich so von dem Referenzpolynucleotid unterscheiden, dass die Abweichungen
stumme Abweichungen sind; zum Beispiel verändern die Abweichungen nicht
die Aminosäuresequenz,
die von dem Polynucleotid kodiert wird. Die vorliegende Erfindung
betrifft außerdem
Nucleotidveränderungen,
die in Aminosäuresubstitutionen,
Additionen, Deletionen, Fusionen und Verkürzungen in dem durch das Referenznucleotid
(SEQ ID Nr. 1) kodierten Enzym resultieren. In einem bevorzugten
Aspekt der Erfindung behalten diese Enzyme die gleiche biologische
Wirkung wie das durch das Referenzpolynucleotid kodierte Enzym bei.
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Es
ist außerdem
zu verstehen, dass solche Sonden vorzugsweise mit einem analytisch
nachweisbaren Reagens markiert werden können und dies auch sind, um
die Identifizierung der Sonde zu erleichtern. Zu nützlichen
Reagenzien gehören
unter anderem Radioaktivität,
Fluoreszenzfarbstoffe oder Enzyme, die die Bildung eines nachweisbaren
Produkts katalysieren können.
Die Sonden sind daher zur Isolierung komplementärer Kopien von DNA von anderen
tierischen Quellen oder zum Screenen solcher Quellen im Hinblick
auf verwandte Sequenzen von Nutzen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein im Wesentlichen reines Phytaseenzym
bereit. Der hierin verwendete Begriff „im Wesentlichen rein" beschreibt ein Molekül wie ein
Polypeptid (z. B. ein Phytasepolypeptid oder ein Fragment davon),
das im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten,
Nucleinsäuren
und anderen biologischen Materialien ist, mit denen es naturgemäß assoziiert
ist. Ein im Wesentlichen reines Molekül wie z. B. ein Polypeptid
kann zum Beispiel zu wenigstens 60%, nach Trockengewicht, das Molekül von Interesse
sein. Die Reinheit der Polypeptide kann mit Standardverfahren ermittelt
werden, wie z. B. Polyacrylamidgelelektrophorese (z. B. SDS-PAGE),
Säulenchromatographie
(z. B. Hochleistungsflüssigchromatographie
(HPLC)) und aminoterminale Aminosäuresequenzanalyse.
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Das
in der Erfindung eingeschlossene Phytasepolypeptid kann die Aminosäuresequenzen
der Phytase haben, wie in 1 gezeigt
(SEQ ID Nr. 2). Phytasepolypeptide wie die von E. coli B isolierten
können
durch Katalysieren der Hydrolyse von Phytat zu Inositol und freiem
Phosphat mit der Freisetzung von Mineralien von dem Phytinsäurekomplex
charakterisiert werden.
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Ebenfalls
in der Erfindung eingeschlossen sind Polypeptide mit Sequenzen,
die „im
Wesentlichen identisch" mit
der Sequenz eines Phytasepolypeptids sind, wie eines der SEQ ID
2. Eine „im
Wesentlichen identische" Aminosäuresequenz
ist eine Sequenz, die sich nur durch konservative Aminosäuresubstitutionen von
einer Referenzsequenz unterscheidet, z. B. Substitutionen von einer
Aminosäure
durch eine andere der gleichen Klasse (z. B. Substitution von einer
hydrophoben Aminosäure
wie Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin durch eine andere, oder
Substitution von einer polaren Aminosäure durch eine andere, wie
die Substitution von Arginin durch Lysin, Glutaminsäure durch
Asparaginsäure
oder Glutamin durch Asparagin).
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Fragmente
des erfindungsgemäßen Phytasepolypeptids
können
wenigstens ein(e) phytasespezifische(s) Aktivität oder Epitop beibehalten.
Phytaseaktivität
kann durch Untersuchen der Katalyse von Phytat zu Inositol und freiem
Phosphat geprüft
werden. Ein Phytasepolypeptidfragment mit z. B. wenigstens 8–10 Aminosäuren kann
zum Beispiel als ein Immunogen bei der Herstellung phytasespezifischer Antikörper verwendet werden.
Das Fragment kann zum Beispiel eine Aminosäuresequenz enthalten, die in
Phytasen konserviert ist, und diese Aminosäuresequenz kann Aminosäuren enthalten,
die in Phytasen konserviert sind. Solche Fragmente können ohne
weiteres durch einen Vergleich der Sequenzen von Phytasen identifiziert
werden, die in 1 zu finden sind. Zusätzlich zu
ihrer Verwendung als Peptidimmunogene können die oben beschriebenen Phytasefragmente
in Immunoassays wie ELISAs verwendet werden, um die Anwesenheit
phytasespezifischer Antikörper
in Proben zu ermitteln.
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Andere
in der Erfindung eingeschlossene Phytasepolypeptide sind Polypeptide
mit Aminosäuresequenzen,
die zu wenigstens 50% mit der Aminosäuresequenz eines Phytasepolypeptids
identisch sind, wie SEQ ID Nr. 2. Die Vergleichslänge bei
der Bestimmung der Aminosäuresequenzhomologie
kann zum Beispiel wenigstens 15 Aminosäuren umfassen, zum Beispiel
wenigstens 20, 25 oder 35 Aminosäuren.
Homologie kann mit standardmäßiger Sequenzanalysesoftware
(z. B. Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer
Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University
Avenue, Madison, WI 53705; siehe auch Ausubel, et al., supra) gemessen
werden. Zu solchen Verfahren und Algorithmen gehören z. B. ein BLAST Programm
(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological
Information), ALIGN, AMAS (Analysis of Multiply Aligned Sequences),
AMPS (Protein Multiple Sequence Alignment), ASSET (Aligned Segment
Statistical Evaluation Tool), BANDS, BESTSCOR, BIOSCAN (Biological
Sequence Comparative Analysis Node), BLIMPS (BLocks IMproved Searcher),
FASIA, Intervals & Points,
BMB, CLUSTAL V, CLUSTAL W, CONSENSUS, LCONSENSUS, WCONSENSUS, Smith-Waterman-Algorithmus,
DARWIN, Las-Vegas-Algorithmus,
FNAT (Forced Nucleotide Alignment Tool), Framealign, Framesearch,
DYNAMIC, FILTER, FSAP (Fristensky Sequence Analysis Package), GAP
(Global Alignment Program), GENAL, GIBBS, GenQuest, ISSC (Sensitive
Sequence Comparison), LALIGN (Local Sequence Alignment), LCP (Local Content
Program), MACAW (Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench),
MAP (Multiple Alignment Program), MBLKP, MBLKN, PIMA (Pattern-Induced
Multi-sequence Alignment), SAGA (Sequence Alignment by Genetic Algorithm)
und WHAT-IF.
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Das
erfindungsgemäße Phytasepolypeptid
kann mit einem beliebigen aus verschiedenen Standardverfahren erzeugt
werden. Phytasepolypeptide können
zum Beispiel in standardmäßigen rekombinanten
Expressionssystemen (siehe unten) produziert, chemisch synthetisiert
(dieser Ansatz ist möglicherweise
auf kleine Phytasepeptidfragmente begrenzt) oder von Organismen
gereinigt werden, in denen sie naturgemäß exprimiert sind.
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Die
Erfindung stellt außerdem
isolierte Nucleinsäuremoleküle bereit,
die das oben beschriebene Phytasepolypeptid kodieren. Nucleinsäuren, die
SEQ ID Nr. 2 kodieren, sind z. B. in der Erfindung eingeschlossen. Diese
Nucleinsäuren
können
natürlich
vorkommende Nucleotidsequenzen oder Sequenzen enthalten, die sich von
solchen der natürlich
vorkommenden Nucleinsäuren,
die Phytasen kodieren, unterscheiden, allerdings die gleichen Aminosäuren infolge
der Degeneriertheit des genetischen Kodes kodieren. Die Nucleinsäuren der
Erfindung können
DNA- oder RNA-Nucleotide
oder Kombinationen oder Modifikationen davon enthalten. Beispielhafte
Nucleinsäuren
der Erfindung sind in SEQ ID Nr. 1 dargestellt.
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Mit „isolierter
Nucleinsäure" ist eine Nucleinsäure, z.
B. ein DNA- oder RNA-Molekül,
gemeint, das nicht unmittelbar an die 5'- und 3'-flankierenden Sequenzen angrenzt, an
die es normalerweise unmittelbar angrenzt, wenn es in dem natürlich vorkommenden
Genom des Organismus vorliegt, von dem es abstammt. Der Begriff
beschreibt somit zum Beispiel eine Nucleinsäure, die in einen Vektor wie
ein Plasmid oder einen viralen Vektor eingebaut ist, eine Nucleinsäure, die
in das Genom einer heterologen Zelle (oder das Genom einer homologen
Zelle, allerdings an einer anderen Stelle als der, an der sie natürlich vorkommt)
eingebaut ist; und eine Nucleinsäure,
die als ein separates Molekül
existiert, z. B. ein DNA-Fragment, das durch PCR-Amplifikation oder Restriktionsenzymverdau
produziert wird, oder ein RNA-Molekül, das durch In-vitro-Transkription
produziert wird. Der Begriff beschreibt außerdem eine rekombinante Nucleinsäure, die
einen Teil eines Hybridgens bildet, das zusätzliche Polypeptidsequenzen
kodiert, die zum Beispiel bei der Herstellung eines Fusionsproteins
verwendet werden können.
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Die
Nucleinsäuremoleküle der Erfindung
können
als Template in Standardverfahren zur Produktion von Phytasegenprodukten
(z. B. Phytase-RNAs und Phytasepolypeptide) verwendet werden. Darüber hinaus können die
Nucleinsäuremoleküle, die
Phytasepolypeptide (und Fragmente davon) kodieren, und verwandte Nucleinsäuren, wie
- (1) Nucleinsäuren, die zu Nucleinsäuren komplementäre Sequenzen
enthalten, die Phytasepolypeptide oder Fragmente davon (z. B. Fragmente
mit wenigstens 10, 12, 15, 20 oder 25 Nucleotiden) kodieren, oder mit
ihnen hybridisieren; und
- (2) Nucleinsäuren
mit Sequenzen, die mit zu Nucleinsäuren komplementären Sequenzen
hybridisieren, die Phytasepolypeptide oder Fragmente davon (z. B.
Fragmente mit wenigstens 10, 12, 15, 20 oder 25 Nucleotiden) kodieren,
in Verfahren verwendet werden, die den Schwerpunkt auf ihre Hybridisierungseigenschaften
legen. Wie im Folgenden ausführlicher
beschrieben, können
solche Nucleinsäuremoleküle z. B.
in den folgenden Verfahren verwendet werden: PCR-Verfahren zum Synthetisieren
von Phytasenucleinsäuren, Verfahren
zum Nachweisen der Anwesenheit einer Phytasenucleinsäure in einer
Probe, Screening-Verfahren zur Identifizierung von Nucleinsäuren, die
neue Phytasefamilienmitglieder kodieren. Oligonucleotidsonden, die
für Screening-Verfahren
von Nutzen sind, haben eine Länge
von 10 bis etwa 150 Nucleotiden. Ferner haben solche Sonden vorzugsweise
eine Länge
von 10 bis etwa 100 Nucleotiden und bevorzugter eine Länge von
10 bis etwa 50 Nucleotiden.
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Die
Erfindung beinhaltet außerdem
Verfahren zum Identifizieren von Nucleinsäuremolekülen, die Mitglieder der Phytasepolypeptidfamilie
zusätzlich
zu SEQ ID Nr. 2 kodieren. In diesen Verfahren wird eine Probe, z.
B. eine Nucleinsäurebibliothek
wie eine cDNA-Bibliothek, die eine Nucleinsäure enthält, die ein Phytasepolypeptid
kodiert, mit einer phytasespezifischen Sonde, z. B. einer phytasespezifischen
Nucleinsäuresonde,
gescreent. Phytasespezifische Nucleinsäuresonden sind Nucleinsäuremoleküle (z. B.
Moleküle
mit DNA oder RNA Nucleotiden oder Kombinationen oder Modifikationen
davon), die spezifisch mit Nucleinsäuren, die Phytasepolypeptide
kodieren, oder mit komplementären
Sequenzen davon hybridisieren. Der Begriff „phytasespezifische Sonde" bezieht sich im
Zusammenhang mit diesem erfindungsgemäßen Verfahren auf Sonden, die sich
an Nucleinsäuren,
die Phytasepolypeptide kodieren, oder an komplementäre Sequenzen
davon in einem nachweisbar größeren Ausmaß binden
als an Nucleinsäuren,
die andere Enzyme kodieren, oder an komplementäre Sequenzen davon.
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Die
Erfindung erleichtert die Produktion von phytasespezifischen Nucleinsäuresonden.
Verfahren zur Erzeugung solcher Sonden können auf der Basis der in 1 dargestellten
Aminosäuresequenzen
gestaltet werden. Die Sonden, die wenigstens 10, z. B. wenigstens
15, 25, 35, 50, 100 oder 150, Nucleotide enthalten können, können mit
einem beliebigen verschiedener Standardverfahren produziert werden
(siehe z. B. Ausubel, et al., supra). Vorzugsweise werden die Sonden
zum Beispiel unter Anwendung von PCR-Amplifikationsverfahren erzeugt. Bei
diesen Verfahren werden Primer entworfen, die phytasekonservierten
Sequenzen entsprechen (siehe 1), die
phytasespezifische Aminosäuren
enthalten können,
und das resultierende PCR-Produkt
wird als Sonde zum Screenen einer Nucleinsäurebibliothek, wie einer cDNA-Bibliothek,
verwendet.
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Die
Kodierungssequenzen für
die Phytaseenzyme der vorliegenden Erfindung wurden identifiziert durch
Präparieren
von beispielsweise E. coli B Genom-DNA und Gewinnen (z. B. per PCR-Amplifikation)
von der Genom-DNA Phytaseaktivität
kodierende DNA. Solche Gewinnungsverfahren sind in der Technik allgemein
bekannt. Eine Möglichkeit
beinhaltet z. B. das Entwerfen von Amplifikationsprimern zur Gewinnung
der Kodierungssequenz, das Amplifizieren des Gens von der Genom-DNA,
das Subklonieren der DNA in einen Vektor, das Transformieren des
resultierenden Konstrukts in einen Wirtsstamm und das Exprimieren
des Phytaseenzyms zur Beurteilung. Solche Vorgehensweisen sind in
der Technik allgemein bekannt und Verfahren sind zum Beispiel in
Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press,
New York, 1982, enthalten.
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In
einer bevorzugten Ausgestaltung wurde das erfindungsgemäße Enzym
von einer E. coli B Genom-DNA durch die folgende Technik isoliert:
E.
coli B Genom-DNA wurde von Sigma (Katalog Nr. D-2001), St. Louis, New Jersey besorgt.
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Die
folgenden Primer wurden zum Amplifizieren des Gens direkt von der
Genom-DNA verwendet:
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Pfu
Polymerase wurde gemäß dem Herstellerprotokoll
(Stratagene Cloning Systems, Inc., La Jolla, CA) verwendet. PCR-Produkt
und pQE60 Vektor (Qiagen) wurden mit EcoRI und BglII Restriktionsendonucleasen
(New England Biolabs) gemäß Herstellerprotokollen
verdaut. Eine Ligation und Transformation und Expression in M15pREP4
Wirtszellen (Qiagen) bringt C-term 6X-His-markiertes Protein hervor.
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Fragmente
des Volllängengens
der vorliegenden Erfindung können
als Hybridisierungssonde für
eine cDNA oder eine genomische Bibliothek verwendet werden, um die
Volllängen-DNA
zu isolieren und andere DNAs zu isolieren, die eine hohe Sequenzähnlichkeit
mit dem Gen oder eine ähnliche
biologische Aktivität
haben: Sonden dieses Typs haben wenigstens 10, vorzugsweise wenigstens
15 und noch bevorzugter wenigstens 30 Basen und können zum
Beispiel wenigstens 50 oder mehr Basen enthalten. Die Sonde kann
auch zum Identifizieren eines DNA-Klons, der einem Volllängentranskript
entspricht, und eines genomischen Klons oder genomischer Klone verwendet
werden, der/die das komplette Gen enthält/enthalten, einschließlich Regulations-
und Promotorregionen, Exone und Introne.
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Die
isolierten Nucleinsäuresequenzen
und andere Enzyme können
dann im Hinblick auf die Beibehaltung biologischer Aktivität gemessen
werden, die für
das Enzym der vorliegenden Erfindung charakteristisch ist, z. B.
in einem Assay für
den Nachweis enzymatischer Phytaseaktivität. Zu solchen Enzymen gehören verkürzte Formen
von Phytase und Varianten wie Deletions- und Insertionsvarianten.
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Beispiele
für solche
Assays sind die folgenden Assays für den Nachweis von Phytaseaktivität: Phytaseaktivität kann durch
Inkubieren von 150 μl
des Enzympräparats
mit 600 μl
2 mM Natriumphytat in 100 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, angereichert
mit 1 mM CaCl2, über einen Zeitraum von 30 Minuten
bei 37°C
gemessen werden. Nach dem Inkubieren wird die Reaktion durch die
Zugabe von 750 μl
von 5%iger Trichloressigsäure gestoppt.
Freigesetztes Phosphat wurde anhand eines Phosphatstandards spektrophotometrisch
bei 700 nm nach der Zugabe von 1500 μl des Farbreagens (4 Volumen
von 1,5% Ammoniummolybdat in 5,5%iger Schwefelsäure und 1 Volumen von 2,7%
Ferrosulfat; Shimizu, M., 1992; Biosci. Biotech. Biochem., 56: 1266–1269) gemessen.
Eine Einheit Enzymaktivität
ist als die Enzymmenge definiert, die notwendig ist, um ein Mol
Pi je min unter Assaybedingungen freizusetzen. Die spezifische Aktivität kann in
Enzymaktivitätseinheiten
je mg Protein ausgedrückt
werden.
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Das
erfindungsgemäße Enzym
hat enzymatische Aktivität
in Bezug auf die Hydrolyse von Phytat zu Inositol und freiem Phosphat.
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Das
erfindungsgemäße Polynucleotid
kann in DNA-Form vorliegen, wobei die DNA cDNA, genomische DNA und
synthetische DNA einschließt.
Die DNA kann doppelsträngig
oder einzelsträngig
sein und kann, wenn einzelsträngig,
der Kodierungsstrang oder Nicht-Kodierungs-(Antisense)-Strang sein.
Die Kodierungssequenz, die das reife Enzym kodiert, kann mit den
in 1 dargestellten Kodierungssequenzen und/oder der des
hinterlegten Klons (SEQ ID Nr. 1) identisch sein oder sie kann eine
unterschiedliche Kodierungssequenz sein, die infolge der Redundanz
oder Degeneriertheit des genetischen Kodes das gleiche reife Enzym
wie die DNA aus 1 kodiert (z. B. SEQ ID Nr.
1).
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Das
Polynucleotid, das das reife Enzym aus 1 kodiert
(z. B. SEQ ID Nr. 2), kann unter anderem Folgendes beinhalten: lediglich
die Kodierungssequenz für
das reife Enzym; die Kodierungssequenz für das reife Enzym und eine
zusätzliche
Kodierungssequenz wie eine Leader-Sequenz oder eine Proproteinsequenz; die
Kodierungssequenz für
das reife Enzym (und optional zusätzliche Kodierungssequenz)
und eine Nicht-Kodierungssequenz, wie Introne oder eine Nicht-Kodierungssequenz
5' und/oder 3' zur Kodierungssequenz
für das
reife Enzym.
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Folglich
schließt
der Begriff „Polynucleotid,
das ein Enzym (Protein) kodiert" ein
Polynucleotid, das lediglich eine Kodierungssequenz für das Enzym
beinhaltet, und ein Polynucleotid ein, das eine zusätzliche
Kodierungs- und/oder
Nicht-Kodierungssequenz beinhaltet.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ferner Varianten der zuvor hierin
beschriebenen Polynucleotide, die Analoga und Derivate des Enzyms
mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz
aus 1 kodieren (z. B. SEQ ID Nr. 2). Die Variante
des Polynucleotids kann eine natürlich
vorkommende Allelvariante des Polynucleotids oder eine nicht natürlich vorkommende
Variante des Polynucleotids sein.
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Die
vorliegende Erfindung beinhaltet somit Polynucleotide, die das gleiche
reife Enzym wie in 1 dargestellt kodieren, sowie
Varianten solcher Polynucleotide, wobei die Varianten ein Derivat
oder Analogon des Enzyms aus 1 kodieren.
Solche Nucleotidvarianten schließen Deletionsvarianten, Substitutionsvarianten
und Additions- oder Insertionsvarianten ein.
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Wie
zuvor hierin erwähnt,
kann das Polynucleotid eine Kodierungssequenz haben, die eine natürlich vorkommende
Allelvariante der in 1 dargestellten Kodierungssequenz
ist. Wie in der Technik bekannt ist, ist eine Allelvariante eine
alternative Form einer Polynucleotidsequenz, die eine Substitution,
Deletion oder Addition von einem oder mehreren Nucleotiden aufweisen
kann, die die Funktion des kodierten Enzyms nicht wesentlich verändert.
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Die
vorliegende Erfindung beinhaltet außerdem Polynucleotide, wobei
die Kodierungssequenz für
das reife Enzym im gleichen Leseraster mit einer Polynucleotidsequenz
fusioniert werden kann, die bei der Expression und Sekretion eines
Enzyms von einer Wirtszelle behilflich ist, z. B. eine Leader-Sequenz,
die den Transport eines Enzyms von der Zelle kontrolliert. Das Enzym
mit einer Leader-Sequenz
ist ein Präprotein,
wobei die Leader-Sequenz von der Wirtszelle gespalten werden kann,
um die reife Enzymform zu bilden. Die Polynucleotide können auch
ein Proprotein kodieren, das das reife Protein plus zusätzliche
5' Aminosäurereste
ist. Ein reifes Protein mit einer Prosequenz ist ein Proprotein
und eine inaktive Form des Proteins. Nach dem Spalten der Prosequenz
bleibt ein aktives reifes Protein zurück.
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Folglich
kann das erfindungsgemäße Polynucleotid
zum Beispiel ein reifes Enzym oder ein Enzym mit einer Prosequenz
oder ein Enzym mit sowohl einer Prosequenz als auch einer Präsequenz
(Leader-Sequenz) kodieren.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Enzym mit der abgeleiteten
Aminosäuresequenz
aus 1, sowie Analoga und Derivate eines solchen Enzyms.
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Die
Begriffe „Derivat" und „Analogon" beziehen sich in
Verbindung mit dem Enzym aus 1 auf ein Enzym,
das im Wesentlichen die gleiche biologische Funktion oder Aktivität wie ein
solches Enzym beibehält. Ein
Analogon beinhaltet daher ein Proprotein, das durch Spaltung des
Proproteinanteils aktiviert werden kann, um ein aktives reifes Enzym
zu produzieren.
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Das
erfindungsgemäße Enzym
kann ein rekombinantes Enzym, ein natürliches Enzym oder ein synthetisches
Enzym, vorzugsweise ein rekombinantes Enzym sein.
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Das
Derivat oder Analogon des Enzyms aus 1 kann (i)
ein solches sein, bei dem einer oder mehrere der Aminosäurereste
substituiert ist/sind durch einen Aminosäurerest, der nicht durch den
genetischen Kode kodiert ist, oder (ii) ein solches, bei dem einer
oder mehrere der Aminosäurereste
eine Substituentengruppe enthält/enthalten,
oder (iii) ein solches, bei dem das reife Enzym mit einer anderen
Verbindung fusioniert ist, wie z. B. einer Verbindung zum Erhöhen der
Halbwertszeit des Enzyms (z. B. Polyethylenglykol), oder (iv) eines,
bei dem die zusätzlichen
Aminosäuren
mit dem reifen Enzym fusioniert sind, wie eine Leader- oder Sekretionssequenz
oder eine Sequenz, die zur Reinigung des reifen Enzyms verwendet
wird, oder eine Proproteinsequenz. Man nimmt an, dass solche Derivate
und Analoga angesichts der Lehren hierin in den Kompetenzbereich
der Fachperson fallen.
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Die
Enzyme und Polynucleotide der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise
in einer isolierten Form bereitgestellt und vorzugsweise bis zur
Homogenität
gereinigt.
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Der
Begriff „isoliert" bedeutet, dass das
Material aus seiner ursprünglichen
Umgebung (z. B. die natürliche
Umgebung, sofern es natürlich
vorkommt) entfernt wird. Ein natürlich
vorkommendes Polynucleotid oder Enzym, das in einem lebenden Tier
vorliegt, ist z. B. nicht isoliert, aber das gleiche Polynucleotid
oder Enzym, das von einem Teil der oder allen koexistierenden Materialien
in dem natürlichen
System getrennt ist, ist isoliert. Solche Polynucleotide könnten Teil
eines Vektors sein und/oder solche Polynucleotide oder Enzyme könnten Teil
einer Zusammensetzung sein und immer noch isoliert sein, da dieser
Vektor oder diese Zusammensetzung nicht Teil ihrer natürlichen
Umgebung ist.
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Die
erfindungsgemäßen Enzyme
beinhalten ein Enzym aus 1 (insbesondere das reife Enzym)
sowie Enzyme mit wenigstens 70% Ähnlichkeit
(vorzugsweise wenigstens 70% Identität) zu einem Enzym aus 1 und
bevorzugter wenigstens 90% Ähnlichkeit
(bevorzugter wenigstens 90% Identität) mit einem Enzym aus 1 und
noch bevorzugter wenigstens 95% Ähnlichkeit
(noch bevorzugter wenigstens 95% Identität) mit einem Enzym aus 1 und
schließen
außerdem
Teile solcher Enzyme ein, wobei eine solcher Teil des Enzyms im
Allgemeinen wenigstens 30 Aminosäuren
und bevorzugter wenigstens 50 Aminosäuren enthält.
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Wie
in der Technik bekannt ist, wird „Ähnlichkeit" zwischen zwei Enzymen durch einen Vergleich
der Aminosäuresequenz
und ihrer konservierten Aminosäuresubstituenten
von einem Enzym mit der Sequenz eines zweiten Enzyms ermittelt. Ähnlichkeit
bei Nucleinsäure-
und Aminosäuresequenzen
kann mit Verfahren und Algorithmen ermittelt werden, die in der
Technik gut bekannt sind. Solche Verfahren und Algorithmen beinhalten
z. B. ein BLAST Programm (Basic Local Alignment Search Tool at the
National Center for Biological Information), ALIGN, AMAS (Analysis
of Multiply Aligned Sequences), AMPS (Protein Multiple Sequence Alignment),
ASSET (Aligned Segment Statistical Evaluation Tool), BANDS, BESTSCOR,
BIOSCAN (Biological Sequence Comparative Analysis Node), BLIMPS
(BLocks IMproved Searcher), FASIA, Intervals & Points, BMB, CLUSTAL V, CLUSTAL
W, CONSENSUS, LCONSENSUS, WCONSENSUS, Smith-Waterman-Algorithmus,
DARWIN, Las-Vegas-Algorithmus,
FNAT (Forced Nucleotide Alignment Tool), Framealign, Framesearch, DYNAMIC,
FILTER, FSAP (Fristensky Sequence Analysis Package), GAP (Global
Alignment Program), GENAL, GIBBS, GenQuest, ISSC (Sensitive Sequence
Comparison), LALIGN (Local Sequence Alignment), LCP (Local Content
Program), MACAW (Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench),
MAP (Multiple Alignment Program), MBLKP, MBLKN, PIMA (Pattern-Induced
Multi-sequence Alignment), SAGA (Sequence Alignment by Genetic Algorithm)
und WHAT-IF.
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Ein
Varianten-, d. h. ein „Analogon"- oder „Derivat"-Enzym, und Referenzenzym können hinsichtlich der
Aminosäuresequenz
aufgrund einer oder mehrerer Substitutionen, Additionen, Deletionen,
Fusionen und Verkürzungen
unterschiedlich sein, die in jeder beliebigen Kombination vorliegen
können.
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Zu
bevorzugten Varianten gehören
solche, die von einer Referenz aufgrund konservativer Aminosäuresubstitutionen
abweichen. Bei diesen Substitutionen handelt es sich um solche,
die eine bestimmte Aminosäure
in einem Polypeptid durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen Charakteristiken substituieren.
Als konservative Substitutionen werden typischerweise die gegenseitigen
Ersetzungen zwischen den aliphatischen Aminosäuren Ala, Val, Leu und Ile;
die Auswechslung der Hydroxylreste Ser und Thr, der Austausch der sauren
Reste Asp und Glu, die Substitution zwischen den Amidresten Asn
und Gln, der Austausch der basischen Reste Lys und Arg und die Ersetzungen
zwischen den aromatischen Resten Phe, Tyr angesehen.
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Am
meisten bevorzugt werden Varianten, die die gleiche biologische
Funktion und Aktivität
wie das Referenzpolypeptid beibehalten, von denen sie abweichen.
Fragmente oder Teile der erfindungsgemäßen Enzyme können zur
Produktion des entsprechenden Volllängenenzyms durch Peptidsynthese
verwendet werden; folglich können
die Fragmente als Intermediate zur Produktion der Volllängenenzyme
verwendet werden. Fragmente oder Teile der Polynucleotide der vorliegenden
Erfindung können
zum Synthetisieren von Volllängenpolynucleotiden
der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft außerdem Vektoren, die Polynucleotide
der vorliegenden Erfindung beinhalten, Wirtszellen, die mit erfindungsgemäßen Vektoren
gentechnisch manipuliert werden, sowie die Produktion von Enzymen
der Erfindung durch Rekombinationstechniken.
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Wirtszellen
werden mit den Vektoren, die die erfindungsgemäßen Polynucleotide enthalten,
genetisch manipuliert (transduziert oder transformiert oder transfiziert).
Solche Vektoren können
zum Beispiel einen Klonierungsvektor oder einen Expressionsvektor
beinhalten. Der Vektor kann z. B. in Form eines Plasmids, eines viralen
Partikels, eines Phagen usw. vorliegen. Die konstruierten Wirtszellen
können
in konventionellen Nährmedien
kultiviert werden, die zur Aktivierung von Promotoren, Selektierung
von Transformanten oder Amplifizierung der Gene der vorliegenden
Erfindung angemessen modifiziert werden. Die Kultivierungsbedingungen wie
Temperatur, pH-Wert und dergleichen entsprechen denjenigen, die
zuvor für
die zur Expression selektierten Wirtszelle verwendet wurden, und
sind der durchschnittlichen Fachperson bekannt.
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Die
erfindungsgemäßen Polynucleotide
können
zum Produzieren von Enzymen durch Rekombinationstechniken verwendet
werden. Die Polynucleotide können
somit z. B. in einem beliebigen aus einer Vielfalt von Expressionsvektoren
zum Exprimieren eines Enzyms eingeschlossen werden. Zu solchen Vektoren
gehören
chromosomale, nichtchromosomale und synthetische DNA-Sequenzen,
z. B. Derivate von SV40; bakterielle Plasmide, Phagen-DNA; Baculovirus;
Hefeplasmide; von Kombinationen aus Plasmiden und Phagen-DNA abgeleitete Vektoren;
virale DNA wie Vakzinia, Adenovirus, Geflügelpockenvirus und Pseudowut.
Es kann aber jeder beliebige andere Vektor verwendet werden, solange
er in dem Wirt replizierbar und lebensfähig ist.
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Die
geeignete DNA-Sequenz kann mit einer Vielfalt von Verfahren in den
Vektor eingefügt
werden. Im Allgemeinen wird die DNA-Sequenz mit in der Technik bekannten
Verfahren in (eine) angemessene Restriktionsendonucleasestelle(n)
eingefügt.
Es wird angenommen, dass solche und andere Verfahren in den Kompetenzbereich
der Fachperson fallen.
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Die
DNA-Sequenz im Expressionsvektor wird funktionell mit (einer) angemessenen
Expressionskontrollsequenz(en) (Promotor) verknüpft, um die mRNA-Synthese zu
lenken. Als repräsentative
Beispiele für
solche Promotoren können
die Folgenden genannt werden: LTR oder SV40 Promotor; E. coli lac
oder trp, Lambda-Phage-PL-Promotor und andere
Promotoren, die bekanntlich die Expression von Genen in prokaryotischen oder
eukaryotischen Zellen oder ihren Viren kontrollieren. Der Expressionsvektor
enthält
außerdem
eine Ribosomenbindungsstelle zur Translationsinitiierung und einen
Transkriptionsterminator. Der Vektor kann außerdem geeignete Sequenzen
zur Expressionsamplifikation enthalten.
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Darüber hinaus
enthalten die Expressionsvektoren vorzugsweise ein oder mehrere
selektierbare Markergene, um ein phänotypisches Merkmal zur Selektion
von transformierten Wirtszellen bereitzustellen, wie Dihydrofolatreduktase-
oder Neomycinresistenz für
die eukaryotische Zellkultur oder wie Tetracyclin- oder Ampicillinresistenz
in E. coli.
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Der
Vektor, der die geeignete DNA-Sequenz wie zuvor hierin beschrieben
sowie eine geeignete Promotor- oder Kontrollsequenz enthält, kann
zum Transformieren eines geeigneten Wirts verwendet werden, damit
der Wirt das Protein exprimieren kann.
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Als
repräsentative
Beispiele für
geeignete Wirte sind die Folgenden zu nennen: Bakterienzellen wie
E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis; Pilzzellen wie Hefe; Insektenzellen
wie Drosophila S2 und Spodoptera Sf9; Tierzellen wie CHO, COS oder
Bowes-Melanom; Adenoviren; Pflanzenzellen usw. Es wird angenommen, dass
die Selektion eines geeigneten Wirts angesichts der Lehren hierin
im Kompetenzbereich der Fachperson liegt.
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Insbesondere
beinhaltet die vorliegende Erfindung außerdem rekombinante Konstrukte,
die eine oder mehrere der oben grob beschriebenen Sequenzen umfassen.
Die Konstrukte umfassen einen Vektor wie ein Plasmid oder einen
viralen Vektor, in den eine erfindungsgemäße Sequenz in einer Vorwärts- oder
Rückwärtsorientierung
eingefügt
wurde. In einem bevorzugten Aspekt dieser Ausgestaltung umfasst
das Konstrukt ferner Regulationssequenzen, inklusive z. B. eines
Promotors, der mit der Sequenz funktionell verknüpft ist. Der Fachperson sind
zahlreiche geeignete Vektoren und Promotoren bekannt, die im Handel
erhältlich
sind. Als Beispiele sind die folgenden Vektoren zu nennen: bakteriell:
pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBluescript II (Stratagene); pTRC99a,
pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia); eukaryotisch: pXT 1, pSG5
(Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia). Es kann allerdings
jedes/jeder beliebige andere Plasmid oder Vektor verwendet werden,
solange sie in dem Wirt replizierbar und lebensfähig sind.
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Promotorregionen
können
aus jedem gewünschten
Gen unter Verwendung von CAT-(Chloramphenicoltransferase)-Vektoren oder anderen
Vektoren mit selektierbaren Markern selektiert werden. Zwei geeignete Vektoren
sind pKK232-8 und pCM7. Zu besonderen genannten bakteriellen Promotoren
gehören
lacI, lacZ, T3, T7, gpt, Lambda PR, PI und trp. Zu eukaryotischen Promotoren gehören CMV-Immediate-Early,
HSV Thymidin-Kinase, frühes
und spätes
SV40, LTRs von Retrovirus und Maus-Metallothionein-I. Die Selektion
des geeigneten Vektors und Promotors liegt im Kompetenzbereich einer
allgemein fachkundigen Person.
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In
einer weiteren Ausgestaltung betrifft die vorliegende Erfindung
Wirtszellen, die die oben beschriebenen Konstrukte enthalten. Die
Wirtszelle kann eine höhere
eukaryotische Zelle wie eine Säugetierzelle
oder eine niedere eukaryotische Zelle wie eine Hefezelle sein oder
die Wirtszelle kann eine prokaryotische Zelle wie eine Bakterienzelle
sein. Die Einführung
des Konstrukts in die Wirtszelle I kann durch Calciumphosphattransfektion,
DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion oder Elektroporation bewirkt
werden (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular
Biology (1986)).
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Die
Konstrukte in Wirtszellen können
in einer konventionellen Weise zur Produktion des Genprodukts verwendet
werden, das durch die rekombinante Sequenz kodiert wird. Alternativ
können
die Enzyme der Erfindung synthetisch durch konventionelle Peptid-Synthetisierer
produziert werden.
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Reife
Proteine können
in Säugetierzellen,
Hefe, Bakterien oder anderen Zellen unter der Kontrolle geeigneter
Promotoren exprimiert werden. Zellfreie Translationssysteme können ebenfalls
zur Herstellung solcher Proteine unter Verwendung von RNAs verwendet
werden, die von den DNA-Konstrukten der vorliegenden Erfindung abgeleitet
werden. Zur Verwendung mit prokaryotischen und eukaryotischen Wirten
geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren werden von Sambrook
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition,
Cold Spring Harbor, N. Y., (1989) beschrieben.
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Die
Transkription der DNA, die die Enzyme der vorliegenden Erfindung
kodiert, durch höhere
Eukaryoten wird durch Einfügen
einer Enhancer-Sequenz in den Vektor erhöht. Enhancer sind cis-wirkende
Elemente von DNA, gewöhnlich
mit etwa 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor einwirken, um seine
Transkription zu erhöhen.
Zu Beispielen gehören
der SV40 Enhancer auf der späten
Seite des Replikationsstartpunktes (bp 100 bis 270), ein Zytomegalovirus-Early-Promotor-Enhancer,
der Polyoma-Enhancer
auf der späten
Seite des Replikationsstartpunktes sowie Adenovirus-Enhancer.
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Im
Allgemeinen beinhalten rekombinante Expressionsvektoren Replikationsstartpunkte
und selektierbare Marker, die die Transformation der Wirtszelle
zulassen, z. B. das Ampicillin-Resistenz-Gen von E. coli und S.
cerevisiae TRP1-Gen, und einen Promotor, der von einem hoch exprimierten
Gen abstammt, um die Transkription einer stromabwärtigen Struktursequenz
zu lenken. Solche Promotoren können
von Operonen abgeleitet werden, die glykolytische Enzyme kodieren,
wie unter anderem 3-Phosphoglyceratkinase
(PGK), Å-Faktor,
Säurephosphatase
oder Hitzeschockproteine. Die heterologe Struktursequenz wird in
einer angemessenen Phase mit Translationsinitiierungs- und Terminationssquenzen
und vorzugsweise einer Leader-Sequenz assembliert, die die Sekretion
translatierter Enzyme lenken kann. Optional kann die heterologe
Sequenz ein Fusionsenzym kodieren, einschließlich eines N-terminalen Identifikationspeptids,
das gewünschte
Charakteristiken verleiht, wie z. B. Stabilisierung oder vereinfachte
Reinigung des exprimierten rekombinanten Produkts.
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Zur
bakteriellen Verwendung nützliche
Expressionsvektoren werden konstruiert durch Einfügen einer strukturellen
DNA-Sequenz, die ein gewünschtes
Protein kodiert, zusammen mit geeigneten Translationsinitiierungs- und -terminationssignalen
in funktionsfähiger
Lesephase mit einem funktionellen Promotor. Der Vektor umfasst einen
oder mehrere phänotypische
selektierbare Marker und einen Replikationsstartpunkt, um die Aufrechterhaltung
des Vektors zu gewährleisten
und um bei Bedarf eine Amplifikation innerhalb des Wirts zu erbringen.
Zur Transformation geeignete prokaryotische Wirte sind u. a. E. coli,
Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Spezies
innerhalb der Gattungen Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus,
obschon auch andere ausgewählt
werden können.
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Als
repräsentatives,
aber nicht begrenzendes Beispiel können zur bakteriellen Verwendung
nützliche Expressionsvektoren
einen selektierbaren Marker und einen bakteriellen Replikationsstartpunkt
umfassen, abgeleitet von handelsüblichen
Plasmiden, die genetische Elemente des allgemein bekannten Klonierungsvektors
pBR322 (ATCC 37017) umfassen. Zu solchen handelsüblichen Vektoren gehören zum
Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden)
und GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Diese pBR322 „Rückgrat"-Abschnitte werden
mit einem angemessenen Promotor und der zu exprimierenden strukturellen
Sequenz kombiniert.
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Nach
der Transformation eines geeigneten Wirtsstammes und dem Wachstum
des Wirtsstammes auf eine angemessene Zelldichte wird der selektierte
Promotor durch geeignete Mittel (z. B. Temperaturwechsel oder chemische
Induktion) induziert und Zellen werden über einen zusätzlichen
Zeitraum kultiviert.
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Zellen
werden typischerweise durch Zentrifugation geerntet, durch physikalische
oder chemische Mittel gesprengt, und der resultierende Rohextrakt
wird für
eine weitere Reinigung zurückbehalten.
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Mikrobielle
Zellen, die bei der Expression von Proteinen verwendet werden, können durch
jedes beliebige geeignete Verfahren gesprengt werden, einschließlich Gefrier-Tau-Zyklen,
Beschallung, mechanische Sprengung oder der Verwendung von Zelllysemitteln.
Solche Verfahren sind der Fachperson gut bekannt.
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Verschiedene
Säugetierzellkultursysteme
können
ebenfalls zum Exprimieren von rekombinantem Protein verwendet werden.
Beispiele für
Säugetierexpressionssysteme
sind die COS-7-Linien von Affennierenfibroblasten, beschrieben von
Gluzman, Cell, 23: 175 (1981), und andere Zelllinien, die einen
kompatiblen Vektor exprimieren können,
z. B. die C127, 3T3, CHO, HeLa und BHK Zelllinien. Säugetierexpressionsvektoren
umfassen einen Replikationsstartpunkt, einen geeigneten Promotor
und Enhancer und außerdem
jede beliebige erforderliche Ribosomenbindungsstelle, Polyadenylierungsstelle,
Splice-Donor- und
Akzeptor-Stelle, Transkriptionsterminationssequenz und 5'-flankierende nichttranskribierte
Sequenz. DNA-Sequenzen, die von SV40 Spleiß- und Polyadenylierungsstellen
stammen, können
zur Lieferung der benötigten
nichttranskribierten genetischen Elemente verwendet werden.
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Das
Enzym kann von rekombinanten Zellkulturen mit Verfahren wie Ammoniumsulfat-
oder Ethanolpräzipitation,
Säureextraktion,
Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie, Phosphocellulosechromatographie,
hydrophobe Interaktionschromatographie, Affinitätschromatographie, Hydroxylapatitchromatographie
und Lektinchromatographie gewonnen und gereinigt werden. Proteinneufaltungsmaßnahmen
können bei
Bedarf durchgeführt
werden, um die Konfiguration des reifen Proteins abzuschließen. Schließlich kann
eine Hochleistungsflüssigchromatographie
(HPLC) für
endgültige
Reinigungsschritte angewendet werden.
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Die
erfindungsgemäßen Enzyme
können
ein natürlich
gereinigtes Produkt oder ein Produkt aus chemischen Syntheseverfahren
sein oder sie können
durch Rekombinationstechniken anhand eines prokaryotischen oder
eukaryotischen Wirts produziert werden (z. B. durch Bakterien-,
Hefe-, höhere
Pflanzen-, Insekten- und Säugetierzellen
in Kultur). Je nach dem in einem rekombinanten Produktionsverfahren
verwendeten Wirt können
die erfindungsgemäßen Enzyme
glykosyliert oder nicht glykosyliert sein. Erfindungsgemäße Enzyme können außerdem einen
anfänglichen
Methionin-Aminosäurerest
enthalten oder nicht.
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Das
erfindungsgemäße Enzym
kann für
jeden beliebigen Zweck eingesetzt werden, für den eine solche Enzymaktivität notwendig
oder erwünscht
ist. In einer bevorzugten Ausgestaltung wird das Enzym zum Katalysieren
der Hydrolyse von Phytat verwendet. Der Abbau von Phytat kann in
Tierfutter verwendet werden.
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In
einer bevorzugten Ausgestaltung ist das erfindungsgemäße Enzym
ein Phytaseenzym, das hitzebeständig
und hitzeresistent ist und die enzymatische Hydrolyse von Phytat
katalysiert, d. h. das Enzym kann renaturieren und die Aktivität nach einem
kurzen (d. h. 5 bis 30 Sekunden) oder längeren (z. B. Minuten oder Stunden)
Kontakt mit einer Temperatur von 50°C, optimal über 50°C, wiedererlangen.
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Die
Enzyme, ihre Fragmente oder andere Derivate oder Analoga davon oder
Zellen, die sie exprimieren, können
als ein Immunogen für
die Herstellung von Antikörpern
dagegen verwendet werden. Diese Antikörper können z. B. polyklonale oder
monoklonale Antikörper
sein. Die vorliegende Erfindung beinhaltet außerdem chimäre, einkettige und humanisierte
Antikörper
sowie Fab-Fragmente oder das Produkt einer Fab-Expressionsbibliothek. Verschiedene
in der Technik bekannte Verfahren können zur Herstellung solcher Antikörper und
Fragmente angewendet werden.
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Antikörper, die
gegen die Enzyme erzeugt werden, die einer Sequenz der vorliegenden
Erfindung entsprechen, können
durch direkte Injektion der Enzyme in ein Tier oder durch Verabreichen
der Enzyme an ein Tier, vorzugsweise nicht-menschlich, erhalten
werden. Der so erhaltene Antikörper
bindet dann die Enzyme selbst. Auf diese Weise kann selbst eine
Sequenz, die nur ein Fragment der Enzyme kodiert, zum Erzeugen von
Antikörpern
verwendet werden, die die gesamten nativen Enzyme binden. Solche
Antikörper
können
dann zum Isolieren des Enzyms von Zellen verwendet werden, die dieses
Enzym exprimieren.
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Zur
Präparation
monoklonaler Antikörper
kann jede beliebige Technik angewendet werden, die Antikörper liefert,
die durch kontinuierliche Zelllinienkulturen produziert werden.
Zu Beispielen gehören
die Hybridomtechnik (Kohler und Milstein, 1975, Nature, 256: 495–497), die
Trioma-Technik, die humane B-Zellenhybridomtechnik
(Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72) und die EBV-Hybridomtechnik
zur Herstellung humaner monoklonaler Antikörper (Cole, et al., 1985, in
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S.
77–96).
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Techniken,
die zur Herstellung einkettiger Antikörper beschrieben werden (
US-Patent 4,946,778 ), können an
die Herstellung einkettiger Antikörper gegen immunogene Enzymprodukte
der vorliegenden Erfindung angepasst werden. Außerdem können transgene Mäuse verwendet
werden, um humanisierte Antikörper
gegen immunogene Enzymprodukte der vorliegenden Erfindung zu exprimieren.
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Antikörper, die
gegen das erfindungsgemäße Enzym
erzeugt werden, können
beim Screenen nach ähnlichen
Enzymen von anderen Organismen und Proben verwendet werden. Solche
Screening-Techniken sind in der Technik bekannt. Antikörper können auch
als Sonde zum Screenen von Genbibliotheken verwendet werden, die
von diesen oder anderen Organismen erzeugt werden, um diese oder
kreuzreaktive Aktivitäten
zu identifizieren.
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Die
Isolierung und Reinigung von Polypeptiden, die in den oben beschriebenen
Systemen produziert wurden, können
mit konventionellen Verfahren durchgeführt werden, die für das jeweilige
System geeignet sind. Es können
z. B. eine präparative
Chromatographie und immunologische Trennungen unter Verwendung von
Antikörpern
wie monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern angewendet werden.
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Der
hierin verwendete Begriff „Antikörper" bezieht sich auf
intakte Immunglobulinmoleküle
sowie Fragmente von Immunglobulinmolekülen, wie Fab, Fab', (Fab')2,
Fv und SCA-Fragmente,
die sich an ein Epitop eines Endoglukanasepolypeptids binden können. Diese
Antikörperfragmente,
die eine gewisse Fähigkeit
zur selektiven Bindung an das Antigen (z. B. ein Endoglukanaseantigen)
des Antikörpers,
von dem sie abstammen, beibehalten, können mit in der Technik allgemein
bekannten Verfahren hergestellt werden (siehe z. B. Harlow und Lane,
supra) und werden im Folgenden ausführlicher beschrieben.
- (1) Ein Fab-Fragment besteht aus einem monovalenten
Antigenbindungsfragment eines Antikörpermoleküls und kann durch den Verdau
eines ganzen Antikörpermoleküls mit dem
Enzym Papain produziert werden, um ein Fragment hervorzubringen,
das aus einer intakten leichten Kette und einem Teil einer schweren Kette
besteht.
- (2) Ein Fab'-Fragment
eines Antikörpermoleküls kann
durch die Behandlung eines ganzen Antikörpermoleküls mit Pepsin und einer anschließenden Reduktion
erzeugt werden, um ein Molekül
hervorzubringen, das aus einer intakten leichten Kette und einem
Teil einer schweren Kette besteht. Zwei Fab Fragmente werden je
Antikörpermolekül erhalten,
das auf diese Weise behandelt wird.
- (3) Ein (Fab')2-Fragment eines Antikörpers kann durch Behandeln
eines ganzen Antikörpermoleküls mit dem
Enzym Pepsin ohne anschließende
Reduktion erhalten werden. Ein (Fab')2-Fragment
ist ein Dimer von zwei Fab Fragmenten, zusammengehalten durch zwei
Disulfidbindungen.
- (4) Ein Fv-Fragment ist als ein gentechnisch manipuliertes Fragment
definiert, das die variable Region einer leichten Kette und die
variable Region einer schweren Kette enthält, exprimiert als zwei Ketten.
- (5) Ein einkettiger Antikörper
(„SCA") ist ein gentechnisch
manipuliertes einkettiges Molekül,
das die variable Region einer leichten Kette und die variable Region
einer schweren Kette enthält,
verknüpft
durch einen geeigneten flexiblen Polypeptidlinker.
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Der
in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff „Epitop" bezieht sich auf
eine antigene Determinante auf einem Antigen, wie ein Phytasepolypeptid,
an die sich das Paratop eines Antikörpers, wie ein phytasespezifischer
Antikörper,
bindet. Antigene Determinanten bestehen gewöhnlich aus chemisch aktiven Oberflächengruppierungen
von Molekülen
wie Aminosäuren
oder Zuckerseitenketten und können
spezifische dreidimensionale Strukturcharakteristiken sowie spezifische
Ladungscharakteristiken haben.
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Wie
oben erwähnt,
schließen
Antigene, die zur Herstellung von phytasespezifischen Antikörpern verwendet
werden können,
Phytasepolypeptide ein, wie z. B. jede beliebige der in 1 dargestellten
Phytasen Polypeptidfragmente [sic]. Das zum Immunisieren eines Tieres
verwendete Polypeptid oder Peptid kann durch standardmäßige rekombinante,
chemische Synthese- oder Reinigungsverfahren erhalten werden. Wie
in der Technik allgemein bekannt ist, kann ein Antigen zum Erhöhen der
Immunogenität
mit einem Trägerprotein
konjugiert werden. Häufig
verwendete Träger
schließen
Keyhole-Limpet-Hämocyanin
(KLH), Thyroglobulin, Rinderserumalbumin (BSA) und Tetanustoxoid
ein. Das gekoppelte Peptid wird dann zum Immunisieren des Tieres
(z. B. eine Maus, eine Ratte oder ein Kaninchen) verwendet. Zusätzlich zu
solchen Trägern können allgemein
bekannte Adjuvanzien mit dem Antigen verabreicht werden, um die
Induktion einer starken Immunantwort zu unterstützen.
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Phytasespezifische
polyklonale und monoklonale Antikörper können z. B. durch Binden an
und Eluieren von einer Matrix gereinigt werden, die ein Phytasepolypeptid
enthält,
z. B. das Phytasepolypeptid (oder ein Fragment davon), gegen das
die Antikörper
angehoben wurden. Zusätzliche
Verfahren zur Antikörperreinigung und
-konzentration sind in der Technik gut bekannt und können mit
den phytasespezifischen Antikörpern
der Erfindung in die Praxis umgesetzt werden (siehe z. B. C Oligan,
et al., Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience,
1994).
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Ebenfalls
in der Erfindung eingeschlossen sind anti-idiotypische Antikörper, die phytasespezifischen Antigenen
entsprechen und die mit Standardverfahren hergestellt werden können. Diese
Antikörper
werden gegen phytasespezifische Antikörper angehoben und ahmen somit
phytasespezifische Epitope nach.
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Es
heißt,
dass sich die Angehörigen
eines Paares von Molekülen
(z. B. ein Antikörper-Antigen-Paar oder
ein Nucleinsäurepaar)
aneinander „spezifisch
binden", wenn sie
sich mit größerer Affinität aneinander
binden als an andere unspezifische Moleküle. Ein Antikörper, der
gegen ein Antigen angehoben wurde, an das er sich effizienter bindet
als an ein unspezifisches Protein, kann zum Beispiel als sich spezifisch
an das Antigen bindend beschrieben werden. (Ebenso kann eine Nucleinsäuresonde
als sich spezifisch an ein Nucleinsäuretarget bindend beschrieben
werden, wenn sie mit dem Target durch Basenpaarungsinteraktionen
ein spezifisches Duplex bildet (siehe oben).)
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Die
vorliegende Erfindung wird ferner unter Bezugnahme auf die folgenden
Beispiele beschrieben; es ist jedoch zu verstehen, dass die vorliegende
Erfindung nicht auf solche Beispiele begrenzt ist. Alle Teile oder Mengen
sind, sofern nicht anders angegeben, nach Gewicht zu verstehen.
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In
einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines
Phytaseenzyms wie das in 1 gezeigte bereitgestellt. Das
Verfahren beinhaltet das Kultivieren einer Wirtszelle, die ein Polynucleotid enthält, das
das Enzym kodiert (z. B. SEQ ID Nr. 1), unter Bedingungen, die die
Expression der Nucleinsäure zulassen,
und das Isolieren des durch die Nucleinsäure kodierten Enzyms. Verfahren
zum Kultivieren der Wirtszelle sind in den Beispielen beschrieben
und der Fachperson bekannt.
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In
einer anderen Ausgestaltung stellt die Erfindung ein Verfahren zum
Katalysieren der Hydrolyse von Phytat zu Inositol und freiem Phosphat
mit der Freisetzung von Mineralien von dem Phytinsäurekomplex
bereit. Das Verfahren schließt
das Inkontaktbringen von Phytat mit einer abbauwirksamen Menge eines
Enzyms der Erfindung ein, wie das in SEQ ID Nr. 1 dargestellte Enzym.
Der Begriff „abbauwirksame" Menge bezieht sich auf
die Enzymmenge, die notwendig ist, um wenigstens 50% des Phytats
im Vergleich zu Phytat abzubauen, das nicht mit dem Enzym in Kontakt
gebracht wird. Vorzugsweise werden wenigstens 80% des Phytats abgebaut.
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In
einer anderen Ausgestaltung stellt die Erfindung ein Verfahren zum
Hydrolysieren von Phospho-Mono-Ester-Bindungen in Phosphat bereit, wobei
das Verfahren das Verabreichen einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Enzyms
(z. B. SEQ ID Nr. 1) beinhaltet, um Inositol und freies Phosphat
hervorzubringen. Eine „wirksame" Menge bezieht sich
auf die Enzymmenge, die notwendig ist, um wenigstens 50% der Phospho-Mono-Ester-Bindungen
im Vergleich zu Phytat zu hydrolysieren, das nicht mit dem Enzym
in Kontakt gebracht wird. Vorzugsweise werden wenigstens 80% der
Bindungen hydrolysiert.
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Für ein besseres
Verständnis
der folgenden Beispiele werden bestimmte häufig vorkommende Verfahren
und/oder Begriffe beschrieben.
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„Plasmide" sind durch ein kleingeschriebenes
p gekennzeichnet, dem Großbuchstaben
und/oder Zahlen vorangehen und/oder folgen. Die Ausgangsplasmide
hierin sind entweder im Handel erhältlich, unbeschränkt öffentlich
erhältlich
oder können
anhand verfügbarer
Plasmide mit veröffentlichten
Verfahren hergestellt werden. Darüber hinaus sind zu den beschriebenen
Plasmiden äquivalente
Plasmide in der Technik bekannt und werden für die durchschnittliche Fachperson
offensichtlich sein.
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Der „Verdau" von DNA bezieht
sich auf die katalytische Spaltung der DNA mit einem Restriktionsenzym,
das nur auf bestimmte Sequenzen in der DNA einwirkt. Die verschiedenen
hierin verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich und
ihre Reaktionsbedingungen, Cofaktoren und anderen Erfordernisse wurden
so verwendet, wie es der durchschnittlichen Fachperson bekannt wäre. Für analytische
Zwecke wird typischerweise 1 μg
Plasmid- oder DNA-Fragment mit etwa 2 Einheiten Enzym in etwa 20 μl Pufferlösung verwendet.
Zum Isolieren der DNA-Fragmente zur Plasmidkonstruktion werden typischerweise
5 bis 50 μg
DNA mit 20 bis 250 Einheiten Enzym in einem größeren Volumen verdaut. Geeignete
Puffer und Substratmengen für
spezielle Restriktionsenzyme werden vom Hersteller angegeben. Gewöhnlich wird
eine Inkubationszeit von 1 Stunde bei 37°C verwendet, sie kann aber gemäß den Anweisungen
des Lieferanten variieren. Nach dem Verdau wird die Reaktion direkt
auf einem Polyacrylamidgel der Elektrophorese unterworfen, um das
gewünschte
Fragment zu isolieren.
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Eine
Größentrennung
der gespaltenen Fragmente findet im Allgemeinen mit 8 Prozent Polyacrylamidgel
statt, wie zum Beispiel von Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res.,
8: 4057 (1980) beschrieben.
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„Oligonucleotide" beziehen sich entweder
auf ein einzelsträngiges
Polydesoxynucleotid oder auf zwei komplementäre Polydesoxynucleotidstränge, die
chemisch synthetisiert sein können.
Solche synthetischen Oligonucleotide können ein 5'-Phosphat haben oder nicht. Solche,
die keins haben, ligieren nicht mit einem anderen Oligonucleotid
ohne die Zugabe eines Phosphats mit einem ATP in Anwesenheit einer
Kinase. Ein synthetisches Oligonucleotid ligiert mit einem Fragment,
das nicht dephosphoryliert wurde.
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„Ligation" bezieht sich auf
den Prozess der Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei
doppelsträngigen
Nucleinsäurefragmenten
(Maniatis, T., et al., Id., S. 146). Sofern nicht anders angegeben,
kann die Ligation mit bekannten Puffern und Bedingungen mit 10 Einheiten
T4 DNA-Ligase („Ligase") je 0,5 μg von in
etwa äquimolaren
Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente erreicht werden.
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Sofern
nicht anders angegeben, fand die Transformation wie in dem Verfahren
von Sambrook, Fritsch und Maniatus, 1989, statt. Die folgenden Beispiele
dienen Illustrationszwecken und begrenzen die Erfindung nicht. Die
in den Beispielen beschriebenen Verfahren sind zwar typisch für solche,
die zur Durchführung
bestimmter Aspekte der Erfindung angewendet werden können, doch
können
auch andere Verfahren angewendet werden, die der Fachperson bekannt
sind. Die folgenden Materialien und Verfahren wurden zur Durchführung der
in den Beispielen beschriebenen Experimente verwendet.
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1. Beispiel
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Isolierung, bakterielle Expression und
Reinigung von Phytase
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E.
coli B Genom-DNA wurde von Sigma (Katalog Nr. D-2001), St. Louis, New Jersey besorgt.
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Die
folgenden Primer wurden zum PCR-Amplifizieren des Gens direkt von
der Genom-DNA verwendet:
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Pfu
Polymerase in der PCR-Reaktion [sic], und die Amplifikation fand
gemäß dem Herstellerprotokoll statt
(Stratagene Cloning Systems, Inc., La Jolla, CA).
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Das
PCR-Produkt wurde gereinigt und das gereinigte Produkt und pQE60
Vektor (Qiagen) wurden mit EcoRI und BglII Restriktionsendonucleasen
(New England Biolabs) gemäß Herstellerprotokollen
verdaut. Übernachtligationen
fanden mit Standardprotokollen statt, um pQE60 zu erhalten.
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Die
amplifizierten Sequenzen wurden „in-frame" mit der RBS kodierenden Sequenz eingefügt. Das
Ligationsgemisch wurde dann zum Transformieren des E. coli Stamms
M15/pREP4 (Qiagen, Inc.) durch Elektroporation verwendet. M15/pREP4
enthält
mehrere Kopien des Plasmids pREP4, das den lacI Repressor exprimiert
und außerdem
Kanamycinresistenz (Kan')
verleiht. Plasmid-DNA wurde isoliert und durch Restriktionsanalyse
bestätigt.
Klone mit den gewünschten
Konstrukten wurden über
Nacht (O/N) in einer Flüssigkultur in
LB-Medium, angereichert mit Amp (100 μg/ml) und Kan (μg/ml), kultiviert.
Die O/N-Kultur wurde zum Inokulieren einer großen Kultur in einem Verhältnis von
1:100 bis 1:250 verwendet. Die Zellen wurden auf einen optischen
Dichte-600-Wert
(O. D.600) zwischen 0,4 und 0,6 kultiviert.
IPTG („Isopropyl-B-D-thiogalactopyranosid") wurden dann auf
eine Endkonzentration von 1 mM gegeben. IPTG induziert durch Inaktivieren
des lacI Repressors, wodurch P/O freigegeben wird, was zu einer
erhöhten
Genexpression führt.
Zellen wurden zusätzliche
3 bis 4 Stunden kultiviert. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation
geerntet.
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Die
oben dargelegten Primersequenzen können auch zum Isolieren des
Targetgens von dem hinterlegten Material mit den oben beschriebenen
Hybridisierungstechniken verwendet werden.
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Angesichts
der obigen Lehren sind zahlreiche Modifikationen und Variationen
der vorliegenden Erfindung möglich,
so dass die Erfindung im Rahmen der angefügten Ansprüche anders als speziell beschrieben umgesetzt
werden kann. Es ist zu verstehen, dass die Erfindung zwar mit Bezug
auf die obige ausführliche Beschreibung
beschrieben wurde, die vorangehende Beschreibung aber illustrativ
sein und den Umfang der Erfindung nicht beschränken soll. Andere Aspekte,
Vorteile und Modifikationen der Erfindung liegen im Rahmen der folgenden
Ansprüche.
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