DE69838676T2

DE69838676T2 - Neuartige phytase

Info

Publication number: DE69838676T2
Application number: DE69838676T
Authority: DE
Inventors: Jay Short
Original assignee: Verenium Corp
Current assignee: BASF Enzymes LLC
Priority date: 1997-08-13
Filing date: 1998-08-13
Publication date: 2008-10-30
Anticipated expiration: 2018-08-14
Also published as: US6110719A; AU735371B2; CA2300358C; JP4194750B2; AU735371C; ES2296341T3; US5876997A; US6190897B1; JP2008099701A; EP1811020A1; JP2001514869A; AU8904498A; EP1003379A1; EP1003379B1; WO1999008539A1; EP1003379A4; CA2300358A1; ATE377360T1; DE69838676D1; EP1600505A1

Description

Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neu identifizierte Polynucleotide, Polypeptide, die durch solche Polynucleotide kodiert sind, die Verwendung solcher Polynucleotide und Polypeptide, sowie die Herstellung und Isolierung solcher Polynucleotide und Polypeptide. Insbesondere wurden die erfindungsgemäßen Polypeptide als Phytasen und insbesondere als Enzyme mit Phytaseaktivität identifiziert.
Hintergrund
Mineralien sind wesentliche Elemente für das Wachstum aller Organismen. Für die Produktion von monogastrischen Tieren (z. B. Schweine, Geflügel) und Fischen wird das Futter normalerweise mit Mineralien angereichert. Pflanzensamen sind eine reichhaltige Mineralquelle, da sie Ionen enthalten, die mit Phosphatgruppen von Phytinsäure komplexiert sind. Wiederkäuer benötigen kein anorganisches Phosphat und keine Mineralien, da Mikroorganismen im Pansen Enzyme produzieren, die die Umwandlung von Phytat (Myo-Inositol-Hexaphosphat) in Inositol und anorganisches Phosphat katalysieren. In dem Prozess werden mit Phytat komplexierte Mineralien freigesetzt.
Phytat kommt als eine Quelle von gespeichertem Phosphor in praktisch in jedem Pflanzenfutter vor (Phytic Acid. Chemistry and Applications, E. Graf (Ed.). Pilatus Press: Minneapolis, MN. U.S.A. 1986). Phytinsäure bildet einen normalen Bestandteil des Samens in Getreidepflanzen und Hülsenfrüchten. Sie hat die Aufgabe, diätetische Mineralien zu binden, die für die aus dem Samen entstehende neue Pflanze lebenswichtig sind. Wenn die Phosphatgruppen von Phytinsäure durch das Samenenzym Phytase entfernt werden, geht die Fähigkeit zur Bindung von Metallionen verloren und die Mineralien stehen der Pflanze zur Verfügung. In Tierfutterkörnern stehen die durch Phytinsäure gebundenen Spurenmineralien nur teilweise zur Absorption durch monogastrische Tiere zur Verfügung, denen eine Phytaseaktivität fehlt. Obschon eine gewisse Hydrolyse von Phytat im Kolon stattfindet, läuft der größte Teil des Phytats durch den Magen-Darm-Trakt monogastrischer Tiere und wird im Dung ausgeschieden, was in Gebieten mit Massentierhaltung zu Phosphatverunreinigungsproblemen durch Fäkalien beiträgt. Im Kolon freigesetzter anorganischer Phosphor hat keinen Nährwert für Vieh, da anorganischer Phosphor nur im Dünndarm absorbiert wird. Folglich steht eine bedeutende Menge der ernährungsphysiologisch wichtigen diätetischen Mineralien monogastrischen Tieren möglicherweise nicht zur Verfügung.
Die Umwandlung von Phytat in Inositol und anorganischen Phosphor kann durch mikrobielle Enzyme katalysiert werden, die allgemein als Phytasen bezeichnet werden. Phytasen wie die Phytase EC 3.1.3.8 können die Hydrolyse von Myo-Inositol-Hexaphosphat in D-Myo-Inositol-1,2,4,5,6-Pentaphosphat und Orthophosphat katalysieren. Bestimmte Pilzphytasen hydrolysieren angeblich Inositolpentaphosphat in Tetra-, Tri- und niedere Phosphate; z. B. produzieren A. Ficuum Phytasen angeblich Gemische aus Myoinositol-di- und mono-phosphat (Ullah, 1988). Phytase produzierende Mikroorganismen umfassen Bakterien wie Bacillus subtilis (V. K. Powar und V. J. Jagannathan, J. Bacteriol. 151: 1102–1108, 1982) und Pseudomonas (D. J. Cosgrove, Austral. J. Biol. Sci. 2: 1207–1220, 1970); Hefen wie Sacchoromyces cerevisiae (N. R. Nayini und P. Markakis, Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 17: 24–26, 1984); und Pilze wie Aspergillus terreus (K. Yamada, et al., Agric. Biol Chem. 32: 1275–1282, 1968). Über die mögliche Verwendung von Mikroben, die Phytase als Futterzusatz für monogastrische Tiere produzieren können, wurde zuvor berichtet (Shieh und Ware, US-Patent Nr. 3,297,548 ; Nelson, T. S. et al., J. Nutrition 101: 1289–1294, 1971).
Mikrobielle Phytasen können angeblich auch für die Herstellung von Tierfutter aus bestimmten Industrieprozessen nützlich sein (z. B. Weizen- und Maisabfallprodukte). Aus dem Nassvermahlprozess von Mais gehen Glutene hervor, die als Tierfutter verkauft werden. Die Zugabe von Phytase kann den Nährwert des Futterprodukts angeblich verbessern. Über pilzliche Phytase-Enzyme und Verfahrensbedingungen (t ~50°C und pH ~5,5) wurde zuvor in der europäischen Patentanmeldung 0 321 004 berichtet. Bei der Verarbeitung von Sojabohnenmehl werden das Mehl und die Abfallprodukte angeblich durch die Anwesenheit von Phytat für Futter zur Aufzucht von Fischen, Geflügel und anderen Nichtwiederkäuern sowie für mit Milch gefütterte Kälber ungeeignet. Phytase ist angeblich zur Verbesserung des Nährwerts und des kommerziellen Werts dieses proteinreichen Sojamaterials von Nutzen (siehe Finase Enzymes von Alko, Rajamaki, Finnland). Eine Kombination aus Phytase und einer Säurephosphatase (pH-Optimum 2,5) von A. niger wurde von Alko, Ltd. als Tierfutterzusatz in ihrem Phytinsäure-Abbauprodukt Finas F und Finase S verwendet. Eine kosteneffektive Phytasequelle würde den Wert von Sojabohnenmehl als Tierfutter erheblich verbessern (Shieh et al., 1969).
Phytase und weniger spezifische Säurephosphatasen werden von dem Pilz Aspergillus ficuum als extrazelluläre Enzyme produziert (Shieh et al., 1969). Ullah reinigte Berichten zufolge eine Phytase von Wildtyp-A.-ficuum, die eine scheinbare relative Molekülmasse von 61,7 kDA (gemäß SDS-Page; bereinigt im Hinblick auf Glyosylierung); ein pH-Optimum bei pH 2,5 und pH 5,5; einen Km-Wert von etwa 40 μM und eine spezifische Aktivität von etwa 50 U/mg hatte (Ullah, A., Preparative Biochem 18: 443–458, 1988); die PCT-Patentanmeldung WO 91/05053 offenbart ebenfalls den Angaben zufolge die Isolierung und molekulare Klonierung einer Phytase von Aspergillus ficuum mit einem pH-Optimum bei pH 2,5 und pH 5,5, einem Km-Wert von etwa 250 μM und einer spezifischen Aktivität von etwa 104 U/mg Protein.
Säurephosphatasen sind Enzyme, die eine breite Vielfalt von Phosphatestern katalytisch hydrolysieren und gewöhnlich ein pH-Optimum unter 6,0 aufweisen (Hollander, 1971); EC 3.1.3.2 katalysiert z. B. die Hydrolyse von orthophosphorischen Monoestern zu Orthophosphatprodukten. Eine Säurephosphatase wurde angeblich von A. ficuum gereinigt. Die deglykosylierte Form der Säurephosphatase hat eine scheinbare relative Molekülmasse von 32,6 kDa (Ullah et al., 1987).
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine rekombinante Phytase isoliert von Escherichia coli B bereitzustellen, die die Effizienz der Freisetzung von Phosphor von Phytat und den Salzen von Phytinsäure verbessert. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Quelle für ein rekombinantes Enzym bereitzustellen, das für den kommerziellen Einsatz in Futtermitteln und Industrieprozessen mit minimaler Bearbeitung geeignet ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Polynucleotid und ein dadurch kodiertes Polypeptid bereit, das als ein Phytaseenzym mit Phytaseaktivität identifiziert wurde. Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden ein neuartiges rekombinantes Enzym sowie aktive Fragmente, Analoga und Derivate davon bereitgestellt.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden isolierte Nucleinsäuremoleküle, die das erfindungsgemäße Enzym kodieren, einschließlich mRNA, DNA, cDNA, genomische DNA, sowie aktive Analoga und Fragmente solcher Enzyme bereitgestellt.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung solcher Polypeptide durch Rekombinationstechniken bereitgestellt, das das Kultivieren rekombinanter prokaryotischer und/oder eukaryotischer Wirtszellen, die eine Nucleinsäuresequenz enthalten, die ein erfindungsgemäßes Enzym kodiert, unter Bedingungen beinhaltet, die die Expression des genannten Enzyms und die anschließende Gewinnung des genannten Enzyms fördern.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Nutzung eines solchen Enzyms oder Polynucleotids, das solche Enzyme kodiert, in kommerziellen Verfahren bereitgestellt, wie zum Beispiel Verfahren, bei denen Mineralien von Phytaten in Pflanzenmaterialien entweder in vitro, d. h. in Futterbehandlungsverfahren, oder in vivo, d. h. durch die Verabreichung des Enzyms an Tiere, freigesetzt werden.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Nutzung solcher Enzyme oder Polynucleotide, die solche Enzyme kodieren, für In-vitro-Zwecke im Zusammenhang mit wissenschaftlicher Forschung bereitgestellt, zum Beispiel zur Erzeugung von Sonden zur Identifizierung ähnlicher Sequenzen, die möglicherweise ähnliche Enzyme kodieren, von anderen Organismen.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung müssten der Fachperson anhand der Lehren hierin offenkundig sein.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die folgenden Zeichnungen illustrieren Ausgestaltungen der Erfindung und sollen den von den Ansprüchen eingeschlossenen Umfang der Erfindung nicht begrenzen.
1 zeigt die Nucleotid- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen des Enzyms der vorliegenden Erfindung. Die Sequenzierung erfolgte mit einem automatisierten DNA-Sequenzer 378 (Applied Biosystems, Inc.).
2 zeigt das pH- und Temperaturprofil und die Stabilitätsdaten für das Phytaseenzym der vorliegenden Erfindung. Es wird der folgende Assay für diese Analysen für den Nachweis von Phytaseaktivität angewendet: Phytaseaktivität wird durch Inkubieren von 150 μl des Enzympräparates mit 600 μl 2 mM Natriumphytat in 100 mM Tris-HCl-Puffer, pH 75, angereichert mit 1 mM CaCl₂, über einen Zeitraum von 30 Minuten bei 37°C gemessen. Nach dem Inkubieren wird die Reaktion durch Zugabe von 750 μl einer 5%igen Trichloressigsäure gestoppt. Freigesetztes Phosphat wurde anhand eines Phosphatstandards spektrophotometrisch bei 700 nm nach der Zugabe von 1500 μl des Farbreagens (4 Volumen von 1,5% Ammoniummolybdat in 5,5% Schwefelsäure und 1 Volumen von 2,7% Ferrosulfat; Shimizu, M., 1992; Biosci. Biotech. Biochem., 56: 1266–1269) gemessen. OD bei 700 nm ist auf der Y-Achse der Diagramme in 2 angegeben. Temperatur bzw. pH-Wert ist auf der X-Achse der Diagramme angegeben.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Der Begriff „Gen" bezieht sich auf das Segment von DNA, das in der Herstellung einer Polypeptidkette involviert ist; es beinhaltet Regionen, die der Kodierungsregion vorangehen und folgen (Leader und Trailer) sowie Intervening-Sequenzen (Introne) zwischen einzelnen Kodierungssegmenten (Exone).
Eine Kodierungssequenz ist „funktionell verknüpft mit" einer anderen Kodierungssequenz, wenn RNA-Polymerase die beiden Kodierungssequenzen in eine einzelne mRNA transkribiert, die dann in ein einzelnes Polypeptid translatiert wird, das Aminosäuren aufweist, die von beiden Kodierungssequenzen stammen. Die Kodierungssequenzen müssen nicht aneinander angrenzen, solange die exprimierten Sequenzen letztendlich zur Produktion des gewünschten Proteins verarbeitet werden.
„Rekombinante" Enzyme beziehen sich auf Enzyme, die durch DNA-Rekombinationstechniken produziert werden; d. h. sie werden von Zellen produziert, die durch ein exogenes DNA-Konstrukt transformiert wurden, das das gewünschte Enzym kodiert. „Synthetische" Enzyme sind solche, die durch chemische Synthese hergestellt werden.
Eine DNA-„Kodierungssequenz von” einem speziellen Enzym oder eine ein spezielles Enzym „kodierende Nucleotidsequenz" ist eine DNA-Sequenz, die in ein Enzym transkribiert und translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle angemessener Regulationssequenzen gesetzt wird. Eine „Promotorsequenz" ist eine DNA-Regulationsregion, die RNA-Polymerase in einer Zelle binden und die Transkription einer stromabwärtigen (3'-Richtung) Kodierungssequenz initiieren kann. Der Promotor ist Teil der DNA-Sequenz. Diese Sequenzregion hat ein Startcodon an ihrem 3'-Terminus. Die Promotorsequenz beinhaltet die Mindestanzahl von Basen, wo Elemente, die zum Initiieren der Transkription auf nachweisbaren Niveaus über Hintergrund notwendig sind [sic]. Nachdem die RNA-Polymerase die Sequenz gebunden hat und die Transkription am Startcodon (3'-Terminus mit einem Promotor) initiiert wurde, fährt die Transkription jedoch stromabwärts in der 3'-Richtung fort. Innerhalb der Promotorsequenz befinden sich eine Transkriptionsinitiationsstelle (praktisch definiert durch Nuclease-S1-Kartierung) sowie Proteinbindungsdomänen (Konsensussequenzen), die für die Bindung von RNA-Polymerase verantwortlich sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ein gereinigtes rekombinantes Enzym bereit, das die Hydrolyse von Phytat zu Inositol und freiem Phosphat mit der Freisetzung von Mineralien aus dem Phytinsäurekomplex katalysiert. Ein beispielhaftes gereinigtes Enzym ist eine von Escherichia coli B. abgeleitete Phytase. Dieses beispielhafte Enzym ist in 1, SEQ ID Nr. 2, dargestellt.
Das die SEQ ID Nr. 2 kodierende Polynucleotid wurde ursprünglich von genomischer DNA gewonnen, die von Escherichia coli B isoliert wurde, wie nachfolgend beschrieben. Es enthält ein offenes Leseraster, das ein Protein mit 432 Aminosäureresten kodiert.
In einer Ausgestaltung hat das Phytaseenzym der SEQ ID Nr. 2 der vorliegenden Erfindung eine relative Molekülmasse von etwa 47.056 Kilodalton, gemessen anhand SDS-PAGE Gelelektrophorese, und eine von der Nucleotidsequenz des Gens hergeleitete relative Molekülmasse. pl liegt bei 6,70. Das pH- und Temperaturprofil und die Stabilitätsdaten für dieses Enzym sind in 2 präsentiert. Dieses gereinigte Enzym kann zum Katalysieren der Hydrolyse von Phytat zu Inositol und freiem Phosphat bei Bedarf verwendet werden. Das erfindungsgemäße Phytaseenzym hat eine hohe Thermostabilität.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden isolierte Nucleinsäuremoleküle (Polynucleotide) bereitgestellt, die das reife Enzym mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz aus 1 kodieren.
Die vorliegende Erfindung kann zum Isolieren von Nucleinsäuresequenzen verwendet werden, die im Wesentlichen dem in 1 (SEQ ID Nr. 1) offenbarten isolierten Nucleinsäuremolekül, das ein Phytaseenzym kodiert, ähnlich sind. Isolierte Nucleinsäuresequenzen sind im Wesentlichen ähnlich, wenn: (i) sie unter stringenten Bedingungen (im Folgenden beschrieben) mit SEQ ID Nr. 1 hybridisieren können oder (ii) sie DNA-Sequenzen kodieren, die im Hinblick auf SEQ ID Nr. 1 degeneriert sind. Degenerierte DNA-Sequenzen kodieren die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2, haben aber in den Nucleotidkodierungssequenzen Variationen. Der hierin verwendete Begriff „im Wesentlichen ähnlich" bezieht sich auf Sequenzen mit ähnlicher Identität wie Sequenzen der vorliegenden Erfindung.
Die Nucleotidsequenzen, die im Wesentlichen ähnlich sind, können durch Hybridisierung oder durch Sequenzvergleich ermittelt werden. Enzymsequenzen, die im Wesentlichen ähnlich sind, können durch eines oder mehrere der folgenden Verfahren identifiziert werden: proteolytischer Verdau, Gelelektrophorese und/oder Mikrosequenzierung.
Eine Möglichkeit zur Isolierung eines Nucleinsäuremoleküls, das ein Phytaseenzym kodiert, besteht darin, eine genomische Genbibliothek mit einer natürlichen oder künstlich konstruierten Sonde unter Anwendung von in der Technik anerkannten Verfahren zu sondieren (siehe zum Beispiel: Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel F. M. et al. (EDS.) Green Publishing Company Assoc. and John Wiley Interscience, New York, 1989, 1992). Für die Fachperson wird es verständlich sein, dass die SEQ ID Nr. 1 oder Fragmente davon (die wenigstens 15 aneinander grenzende Nucleotide umfassen) eine besonders nützliche Sonde ist. Andere besonders nützliche Sonden für diesen Zweck sind mit den Sequenzen von SEQ ID Nr. 1 hybridisierbare Fragmente (umfassend wenigstens 10 aneinander grenzende Nucleotide und wenigstens 70% komplementär zu einer Targetsequenz), ist eine besonders nützliche Sonde [sic]. Andere besonders nützliche Sonden für diesen Zweck sind mit den Sequenzen von SEQ ID Nr. 1 hybridisierbare Fragmente (d. h. sie umfassen wenigstens 10 aneinander grenzende Nucleotide und sind wenigstens 70% komplementär zu einer Targetsequenz).
Mit Bezug auf Nucleinsäuresequenzen, die mit spezifischen, hierin offenbarten Nucleinsäuresequenzen hybridisieren, kann die Hybridisierung unter Bedingungen reduzierter Stringenz, mittlerer Stringenz oder sogar unter stringenten Bedingungen erfolgen. Als ein Beispiel für die Oligonucleotidhybridisierung wird eine Polymermembran, die immobilisierte denaturierte Nucleinsäure enthält, zunächst 30 Minuten lang bei 45°C in einer Lösung aus 0,9 M NaCl, 50 mM NaH₂PO₄, pH 7,0, 5,0 mM Na₂EDTA, 0,5% SDS, I OX Denhardt's und 0,5 mg/ml Polyriboadenylsäure vorhybridisiert. Etwa 2 × 10⁷ cpm (spezifische Aktivität 4–9 × 10⁸ cpm/μg) einer ³²P-endmarkierten Oligonucleotidsonde werden dann zur Lösung gegeben. Nach 12–16 Stunden Inkubation wird die Membran 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in 1 × SET (150 mM NaCl, 20 mM Tris-Hydrochlorid, pH 7,8, 1 mM Na₂EDTA) mit 0,5% SDS gewaschen, gefolgt von einer 30-minütigen Wäsche in frischem 1 × SET bei Tm –10°C für die Oligonucleotidsonde. Die Membran wird anschließend einem autoradiographischen Film für den Nachweis von Hybridisierungssignalen ausgesetzt.
Stringente Bedingungen bedeuten, dass die Hybridisierung nur dann stattfindet, wenn wenigstens 90% Identität, vorzugsweise wenigstens 95% Identität und am bevorzugtesten wenigstens 97% Identität zwischen den Sequenzen vorliegt (siehe J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2. Ausgabe 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory).
Der hierin verwendete Begriff „Identität" bezieht sich auf eine Polynucleotidsequenz, die einen prozentualen Anteil der gleichen Basen wie ein Referenzpolynucleotid umfasst (SEQ ID Nr. 1). Ein Polynucleotid, das zum Beispiel wenigstens 90% mit einem Referenzpolynucleotid identisch ist, hat Polynucleotidbasen, die zu 90% mit den das Referenzpolynucleotid bildenden Basen identisch sind, und kann einen Basenanteil von 10% haben, die zu den Basen unterschiedlich sind, aus denen sich diese Polynucleodidsequenz zusammensetzt.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Polynucleotide, die sich so von dem Referenzpolynucleotid unterscheiden, dass die Abweichungen stumme Abweichungen sind; zum Beispiel verändern die Abweichungen nicht die Aminosäuresequenz, die von dem Polynucleotid kodiert wird. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Nucleotidveränderungen, die in Aminosäuresubstitutionen, Additionen, Deletionen, Fusionen und Verkürzungen in dem durch das Referenznucleotid (SEQ ID Nr. 1) kodierten Enzym resultieren. In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung behalten diese Enzyme die gleiche biologische Wirkung wie das durch das Referenzpolynucleotid kodierte Enzym bei.
Es ist außerdem zu verstehen, dass solche Sonden vorzugsweise mit einem analytisch nachweisbaren Reagens markiert werden können und dies auch sind, um die Identifizierung der Sonde zu erleichtern. Zu nützlichen Reagenzien gehören unter anderem Radioaktivität, Fluoreszenzfarbstoffe oder Enzyme, die die Bildung eines nachweisbaren Produkts katalysieren können. Die Sonden sind daher zur Isolierung komplementärer Kopien von DNA von anderen tierischen Quellen oder zum Screenen solcher Quellen im Hinblick auf verwandte Sequenzen von Nutzen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein im Wesentlichen reines Phytaseenzym bereit. Der hierin verwendete Begriff „im Wesentlichen rein" beschreibt ein Molekül wie ein Polypeptid (z. B. ein Phytasepolypeptid oder ein Fragment davon), das im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten, Nucleinsäuren und anderen biologischen Materialien ist, mit denen es naturgemäß assoziiert ist. Ein im Wesentlichen reines Molekül wie z. B. ein Polypeptid kann zum Beispiel zu wenigstens 60%, nach Trockengewicht, das Molekül von Interesse sein. Die Reinheit der Polypeptide kann mit Standardverfahren ermittelt werden, wie z. B. Polyacrylamidgelelektrophorese (z. B. SDS-PAGE), Säulenchromatographie (z. B. Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)) und aminoterminale Aminosäuresequenzanalyse.
Das in der Erfindung eingeschlossene Phytasepolypeptid kann die Aminosäuresequenzen der Phytase haben, wie in 1 gezeigt (SEQ ID Nr. 2). Phytasepolypeptide wie die von E. coli B isolierten können durch Katalysieren der Hydrolyse von Phytat zu Inositol und freiem Phosphat mit der Freisetzung von Mineralien von dem Phytinsäurekomplex charakterisiert werden.
Ebenfalls in der Erfindung eingeschlossen sind Polypeptide mit Sequenzen, die „im Wesentlichen identisch" mit der Sequenz eines Phytasepolypeptids sind, wie eines der SEQ ID 2. Eine „im Wesentlichen identische" Aminosäuresequenz ist eine Sequenz, die sich nur durch konservative Aminosäuresubstitutionen von einer Referenzsequenz unterscheidet, z. B. Substitutionen von einer Aminosäure durch eine andere der gleichen Klasse (z. B. Substitution von einer hydrophoben Aminosäure wie Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin durch eine andere, oder Substitution von einer polaren Aminosäure durch eine andere, wie die Substitution von Arginin durch Lysin, Glutaminsäure durch Asparaginsäure oder Glutamin durch Asparagin).
Fragmente des erfindungsgemäßen Phytasepolypeptids können wenigstens ein(e) phytasespezifische(s) Aktivität oder Epitop beibehalten. Phytaseaktivität kann durch Untersuchen der Katalyse von Phytat zu Inositol und freiem Phosphat geprüft werden. Ein Phytasepolypeptidfragment mit z. B. wenigstens 8–10 Aminosäuren kann zum Beispiel als ein Immunogen bei der Herstellung phytasespezifischer Antikörper verwendet werden. Das Fragment kann zum Beispiel eine Aminosäuresequenz enthalten, die in Phytasen konserviert ist, und diese Aminosäuresequenz kann Aminosäuren enthalten, die in Phytasen konserviert sind. Solche Fragmente können ohne weiteres durch einen Vergleich der Sequenzen von Phytasen identifiziert werden, die in 1 zu finden sind. Zusätzlich zu ihrer Verwendung als Peptidimmunogene können die oben beschriebenen Phytasefragmente in Immunoassays wie ELISAs verwendet werden, um die Anwesenheit phytasespezifischer Antikörper in Proben zu ermitteln.
Andere in der Erfindung eingeschlossene Phytasepolypeptide sind Polypeptide mit Aminosäuresequenzen, die zu wenigstens 50% mit der Aminosäuresequenz eines Phytasepolypeptids identisch sind, wie SEQ ID Nr. 2. Die Vergleichslänge bei der Bestimmung der Aminosäuresequenzhomologie kann zum Beispiel wenigstens 15 Aminosäuren umfassen, zum Beispiel wenigstens 20, 25 oder 35 Aminosäuren. Homologie kann mit standardmäßiger Sequenzanalysesoftware (z. B. Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705; siehe auch Ausubel, et al., supra) gemessen werden. Zu solchen Verfahren und Algorithmen gehören z. B. ein BLAST Programm (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information), ALIGN, AMAS (Analysis of Multiply Aligned Sequences), AMPS (Protein Multiple Sequence Alignment), ASSET (Aligned Segment Statistical Evaluation Tool), BANDS, BESTSCOR, BIOSCAN (Biological Sequence Comparative Analysis Node), BLIMPS (BLocks IMproved Searcher), FASIA, Intervals & Points, BMB, CLUSTAL V, CLUSTAL W, CONSENSUS, LCONSENSUS, WCONSENSUS, Smith-Waterman-Algorithmus, DARWIN, Las-Vegas-Algorithmus, FNAT (Forced Nucleotide Alignment Tool), Framealign, Framesearch, DYNAMIC, FILTER, FSAP (Fristensky Sequence Analysis Package), GAP (Global Alignment Program), GENAL, GIBBS, GenQuest, ISSC (Sensitive Sequence Comparison), LALIGN (Local Sequence Alignment), LCP (Local Content Program), MACAW (Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench), MAP (Multiple Alignment Program), MBLKP, MBLKN, PIMA (Pattern-Induced Multi-sequence Alignment), SAGA (Sequence Alignment by Genetic Algorithm) und WHAT-IF.
Das erfindungsgemäße Phytasepolypeptid kann mit einem beliebigen aus verschiedenen Standardverfahren erzeugt werden. Phytasepolypeptide können zum Beispiel in standardmäßigen rekombinanten Expressionssystemen (siehe unten) produziert, chemisch synthetisiert (dieser Ansatz ist möglicherweise auf kleine Phytasepeptidfragmente begrenzt) oder von Organismen gereinigt werden, in denen sie naturgemäß exprimiert sind.
Die Erfindung stellt außerdem isolierte Nucleinsäuremoleküle bereit, die das oben beschriebene Phytasepolypeptid kodieren. Nucleinsäuren, die SEQ ID Nr. 2 kodieren, sind z. B. in der Erfindung eingeschlossen. Diese Nucleinsäuren können natürlich vorkommende Nucleotidsequenzen oder Sequenzen enthalten, die sich von solchen der natürlich vorkommenden Nucleinsäuren, die Phytasen kodieren, unterscheiden, allerdings die gleichen Aminosäuren infolge der Degeneriertheit des genetischen Kodes kodieren. Die Nucleinsäuren der Erfindung können DNA- oder RNA-Nucleotide oder Kombinationen oder Modifikationen davon enthalten. Beispielhafte Nucleinsäuren der Erfindung sind in SEQ ID Nr. 1 dargestellt.
Mit „isolierter Nucleinsäure" ist eine Nucleinsäure, z. B. ein DNA- oder RNA-Molekül, gemeint, das nicht unmittelbar an die 5'- und 3'-flankierenden Sequenzen angrenzt, an die es normalerweise unmittelbar angrenzt, wenn es in dem natürlich vorkommenden Genom des Organismus vorliegt, von dem es abstammt. Der Begriff beschreibt somit zum Beispiel eine Nucleinsäure, die in einen Vektor wie ein Plasmid oder einen viralen Vektor eingebaut ist, eine Nucleinsäure, die in das Genom einer heterologen Zelle (oder das Genom einer homologen Zelle, allerdings an einer anderen Stelle als der, an der sie natürlich vorkommt) eingebaut ist; und eine Nucleinsäure, die als ein separates Molekül existiert, z. B. ein DNA-Fragment, das durch PCR-Amplifikation oder Restriktionsenzymverdau produziert wird, oder ein RNA-Molekül, das durch In-vitro-Transkription produziert wird. Der Begriff beschreibt außerdem eine rekombinante Nucleinsäure, die einen Teil eines Hybridgens bildet, das zusätzliche Polypeptidsequenzen kodiert, die zum Beispiel bei der Herstellung eines Fusionsproteins verwendet werden können.
Die Nucleinsäuremoleküle der Erfindung können als Template in Standardverfahren zur Produktion von Phytasegenprodukten (z. B. Phytase-RNAs und Phytasepolypeptide) verwendet werden. Darüber hinaus können die Nucleinsäuremoleküle, die Phytasepolypeptide (und Fragmente davon) kodieren, und verwandte Nucleinsäuren, wie

(1) Nucleinsäuren, die zu Nucleinsäuren komplementäre Sequenzen enthalten, die Phytasepolypeptide oder Fragmente davon (z. B. Fragmente mit wenigstens 10, 12, 15, 20 oder 25 Nucleotiden) kodieren, oder mit ihnen hybridisieren; und
(2) Nucleinsäuren mit Sequenzen, die mit zu Nucleinsäuren komplementären Sequenzen hybridisieren, die Phytasepolypeptide oder Fragmente davon (z. B. Fragmente mit wenigstens 10, 12, 15, 20 oder 25 Nucleotiden) kodieren, in Verfahren verwendet werden, die den Schwerpunkt auf ihre Hybridisierungseigenschaften legen. Wie im Folgenden ausführlicher beschrieben, können solche Nucleinsäuremoleküle z. B. in den folgenden Verfahren verwendet werden: PCR-Verfahren zum Synthetisieren von Phytasenucleinsäuren, Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit einer Phytasenucleinsäure in einer Probe, Screening-Verfahren zur Identifizierung von Nucleinsäuren, die neue Phytasefamilienmitglieder kodieren. Oligonucleotidsonden, die für Screening-Verfahren von Nutzen sind, haben eine Länge von 10 bis etwa 150 Nucleotiden. Ferner haben solche Sonden vorzugsweise eine Länge von 10 bis etwa 100 Nucleotiden und bevorzugter eine Länge von 10 bis etwa 50 Nucleotiden.

Die Erfindung beinhaltet außerdem Verfahren zum Identifizieren von Nucleinsäuremolekülen, die Mitglieder der Phytasepolypeptidfamilie zusätzlich zu SEQ ID Nr. 2 kodieren. In diesen Verfahren wird eine Probe, z. B. eine Nucleinsäurebibliothek wie eine cDNA-Bibliothek, die eine Nucleinsäure enthält, die ein Phytasepolypeptid kodiert, mit einer phytasespezifischen Sonde, z. B. einer phytasespezifischen Nucleinsäuresonde, gescreent. Phytasespezifische Nucleinsäuresonden sind Nucleinsäuremoleküle (z. B. Moleküle mit DNA oder RNA Nucleotiden oder Kombinationen oder Modifikationen davon), die spezifisch mit Nucleinsäuren, die Phytasepolypeptide kodieren, oder mit komplementären Sequenzen davon hybridisieren. Der Begriff „phytasespezifische Sonde" bezieht sich im Zusammenhang mit diesem erfindungsgemäßen Verfahren auf Sonden, die sich an Nucleinsäuren, die Phytasepolypeptide kodieren, oder an komplementäre Sequenzen davon in einem nachweisbar größeren Ausmaß binden als an Nucleinsäuren, die andere Enzyme kodieren, oder an komplementäre Sequenzen davon.
Die Erfindung erleichtert die Produktion von phytasespezifischen Nucleinsäuresonden. Verfahren zur Erzeugung solcher Sonden können auf der Basis der in 1 dargestellten Aminosäuresequenzen gestaltet werden. Die Sonden, die wenigstens 10, z. B. wenigstens 15, 25, 35, 50, 100 oder 150, Nucleotide enthalten können, können mit einem beliebigen verschiedener Standardverfahren produziert werden (siehe z. B. Ausubel, et al., supra). Vorzugsweise werden die Sonden zum Beispiel unter Anwendung von PCR-Amplifikationsverfahren erzeugt. Bei diesen Verfahren werden Primer entworfen, die phytasekonservierten Sequenzen entsprechen (siehe 1), die phytasespezifische Aminosäuren enthalten können, und das resultierende PCR-Produkt wird als Sonde zum Screenen einer Nucleinsäurebibliothek, wie einer cDNA-Bibliothek, verwendet.
Die Kodierungssequenzen für die Phytaseenzyme der vorliegenden Erfindung wurden identifiziert durch Präparieren von beispielsweise E. coli B Genom-DNA und Gewinnen (z. B. per PCR-Amplifikation) von der Genom-DNA Phytaseaktivität kodierende DNA. Solche Gewinnungsverfahren sind in der Technik allgemein bekannt. Eine Möglichkeit beinhaltet z. B. das Entwerfen von Amplifikationsprimern zur Gewinnung der Kodierungssequenz, das Amplifizieren des Gens von der Genom-DNA, das Subklonieren der DNA in einen Vektor, das Transformieren des resultierenden Konstrukts in einen Wirtsstamm und das Exprimieren des Phytaseenzyms zur Beurteilung. Solche Vorgehensweisen sind in der Technik allgemein bekannt und Verfahren sind zum Beispiel in Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, New York, 1982, enthalten.
In einer bevorzugten Ausgestaltung wurde das erfindungsgemäße Enzym von einer E. coli B Genom-DNA durch die folgende Technik isoliert:
E. coli B Genom-DNA wurde von Sigma (Katalog Nr. D-2001), St. Louis, New Jersey besorgt.
Die folgenden Primer wurden zum Amplifizieren des Gens direkt von der Genom-DNA verwendet:
Pfu Polymerase wurde gemäß dem Herstellerprotokoll (Stratagene Cloning Systems, Inc., La Jolla, CA) verwendet. PCR-Produkt und pQE60 Vektor (Qiagen) wurden mit EcoRI und BglII Restriktionsendonucleasen (New England Biolabs) gemäß Herstellerprotokollen verdaut. Eine Ligation und Transformation und Expression in M15pREP4 Wirtszellen (Qiagen) bringt C-term 6X-His-markiertes Protein hervor.
Fragmente des Volllängengens der vorliegenden Erfindung können als Hybridisierungssonde für eine cDNA oder eine genomische Bibliothek verwendet werden, um die Volllängen-DNA zu isolieren und andere DNAs zu isolieren, die eine hohe Sequenzähnlichkeit mit dem Gen oder eine ähnliche biologische Aktivität haben: Sonden dieses Typs haben wenigstens 10, vorzugsweise wenigstens 15 und noch bevorzugter wenigstens 30 Basen und können zum Beispiel wenigstens 50 oder mehr Basen enthalten. Die Sonde kann auch zum Identifizieren eines DNA-Klons, der einem Volllängentranskript entspricht, und eines genomischen Klons oder genomischer Klone verwendet werden, der/die das komplette Gen enthält/enthalten, einschließlich Regulations- und Promotorregionen, Exone und Introne.
Die isolierten Nucleinsäuresequenzen und andere Enzyme können dann im Hinblick auf die Beibehaltung biologischer Aktivität gemessen werden, die für das Enzym der vorliegenden Erfindung charakteristisch ist, z. B. in einem Assay für den Nachweis enzymatischer Phytaseaktivität. Zu solchen Enzymen gehören verkürzte Formen von Phytase und Varianten wie Deletions- und Insertionsvarianten.
Beispiele für solche Assays sind die folgenden Assays für den Nachweis von Phytaseaktivität: Phytaseaktivität kann durch Inkubieren von 150 μl des Enzympräparats mit 600 μl 2 mM Natriumphytat in 100 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, angereichert mit 1 mM CaCl₂, über einen Zeitraum von 30 Minuten bei 37°C gemessen werden. Nach dem Inkubieren wird die Reaktion durch die Zugabe von 750 μl von 5%iger Trichloressigsäure gestoppt. Freigesetztes Phosphat wurde anhand eines Phosphatstandards spektrophotometrisch bei 700 nm nach der Zugabe von 1500 μl des Farbreagens (4 Volumen von 1,5% Ammoniummolybdat in 5,5%iger Schwefelsäure und 1 Volumen von 2,7% Ferrosulfat; Shimizu, M., 1992; Biosci. Biotech. Biochem., 56: 1266–1269) gemessen. Eine Einheit Enzymaktivität ist als die Enzymmenge definiert, die notwendig ist, um ein Mol Pi je min unter Assaybedingungen freizusetzen. Die spezifische Aktivität kann in Enzymaktivitätseinheiten je mg Protein ausgedrückt werden.
Das erfindungsgemäße Enzym hat enzymatische Aktivität in Bezug auf die Hydrolyse von Phytat zu Inositol und freiem Phosphat.
Das erfindungsgemäße Polynucleotid kann in DNA-Form vorliegen, wobei die DNA cDNA, genomische DNA und synthetische DNA einschließt. Die DNA kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein und kann, wenn einzelsträngig, der Kodierungsstrang oder Nicht-Kodierungs-(Antisense)-Strang sein. Die Kodierungssequenz, die das reife Enzym kodiert, kann mit den in 1 dargestellten Kodierungssequenzen und/oder der des hinterlegten Klons (SEQ ID Nr. 1) identisch sein oder sie kann eine unterschiedliche Kodierungssequenz sein, die infolge der Redundanz oder Degeneriertheit des genetischen Kodes das gleiche reife Enzym wie die DNA aus 1 kodiert (z. B. SEQ ID Nr. 1).
Das Polynucleotid, das das reife Enzym aus 1 kodiert (z. B. SEQ ID Nr. 2), kann unter anderem Folgendes beinhalten: lediglich die Kodierungssequenz für das reife Enzym; die Kodierungssequenz für das reife Enzym und eine zusätzliche Kodierungssequenz wie eine Leader-Sequenz oder eine Proproteinsequenz; die Kodierungssequenz für das reife Enzym (und optional zusätzliche Kodierungssequenz) und eine Nicht-Kodierungssequenz, wie Introne oder eine Nicht-Kodierungssequenz 5' und/oder 3' zur Kodierungssequenz für das reife Enzym.
Folglich schließt der Begriff „Polynucleotid, das ein Enzym (Protein) kodiert" ein Polynucleotid, das lediglich eine Kodierungssequenz für das Enzym beinhaltet, und ein Polynucleotid ein, das eine zusätzliche Kodierungs- und/oder Nicht-Kodierungssequenz beinhaltet.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Varianten der zuvor hierin beschriebenen Polynucleotide, die Analoga und Derivate des Enzyms mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz aus 1 kodieren (z. B. SEQ ID Nr. 2). Die Variante des Polynucleotids kann eine natürlich vorkommende Allelvariante des Polynucleotids oder eine nicht natürlich vorkommende Variante des Polynucleotids sein.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet somit Polynucleotide, die das gleiche reife Enzym wie in 1 dargestellt kodieren, sowie Varianten solcher Polynucleotide, wobei die Varianten ein Derivat oder Analogon des Enzyms aus 1 kodieren. Solche Nucleotidvarianten schließen Deletionsvarianten, Substitutionsvarianten und Additions- oder Insertionsvarianten ein.
Wie zuvor hierin erwähnt, kann das Polynucleotid eine Kodierungssequenz haben, die eine natürlich vorkommende Allelvariante der in 1 dargestellten Kodierungssequenz ist. Wie in der Technik bekannt ist, ist eine Allelvariante eine alternative Form einer Polynucleotidsequenz, die eine Substitution, Deletion oder Addition von einem oder mehreren Nucleotiden aufweisen kann, die die Funktion des kodierten Enzyms nicht wesentlich verändert.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet außerdem Polynucleotide, wobei die Kodierungssequenz für das reife Enzym im gleichen Leseraster mit einer Polynucleotidsequenz fusioniert werden kann, die bei der Expression und Sekretion eines Enzyms von einer Wirtszelle behilflich ist, z. B. eine Leader-Sequenz, die den Transport eines Enzyms von der Zelle kontrolliert. Das Enzym mit einer Leader-Sequenz ist ein Präprotein, wobei die Leader-Sequenz von der Wirtszelle gespalten werden kann, um die reife Enzymform zu bilden. Die Polynucleotide können auch ein Proprotein kodieren, das das reife Protein plus zusätzliche 5' Aminosäurereste ist. Ein reifes Protein mit einer Prosequenz ist ein Proprotein und eine inaktive Form des Proteins. Nach dem Spalten der Prosequenz bleibt ein aktives reifes Protein zurück.
Folglich kann das erfindungsgemäße Polynucleotid zum Beispiel ein reifes Enzym oder ein Enzym mit einer Prosequenz oder ein Enzym mit sowohl einer Prosequenz als auch einer Präsequenz (Leader-Sequenz) kodieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Enzym mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz aus 1, sowie Analoga und Derivate eines solchen Enzyms.
Die Begriffe „Derivat" und „Analogon" beziehen sich in Verbindung mit dem Enzym aus 1 auf ein Enzym, das im Wesentlichen die gleiche biologische Funktion oder Aktivität wie ein solches Enzym beibehält. Ein Analogon beinhaltet daher ein Proprotein, das durch Spaltung des Proproteinanteils aktiviert werden kann, um ein aktives reifes Enzym zu produzieren.
Das erfindungsgemäße Enzym kann ein rekombinantes Enzym, ein natürliches Enzym oder ein synthetisches Enzym, vorzugsweise ein rekombinantes Enzym sein.
Das Derivat oder Analogon des Enzyms aus 1 kann (i) ein solches sein, bei dem einer oder mehrere der Aminosäurereste substituiert ist/sind durch einen Aminosäurerest, der nicht durch den genetischen Kode kodiert ist, oder (ii) ein solches, bei dem einer oder mehrere der Aminosäurereste eine Substituentengruppe enthält/enthalten, oder (iii) ein solches, bei dem das reife Enzym mit einer anderen Verbindung fusioniert ist, wie z. B. einer Verbindung zum Erhöhen der Halbwertszeit des Enzyms (z. B. Polyethylenglykol), oder (iv) eines, bei dem die zusätzlichen Aminosäuren mit dem reifen Enzym fusioniert sind, wie eine Leader- oder Sekretionssequenz oder eine Sequenz, die zur Reinigung des reifen Enzyms verwendet wird, oder eine Proproteinsequenz. Man nimmt an, dass solche Derivate und Analoga angesichts der Lehren hierin in den Kompetenzbereich der Fachperson fallen.
Die Enzyme und Polynucleotide der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise in einer isolierten Form bereitgestellt und vorzugsweise bis zur Homogenität gereinigt.
Der Begriff „isoliert" bedeutet, dass das Material aus seiner ursprünglichen Umgebung (z. B. die natürliche Umgebung, sofern es natürlich vorkommt) entfernt wird. Ein natürlich vorkommendes Polynucleotid oder Enzym, das in einem lebenden Tier vorliegt, ist z. B. nicht isoliert, aber das gleiche Polynucleotid oder Enzym, das von einem Teil der oder allen koexistierenden Materialien in dem natürlichen System getrennt ist, ist isoliert. Solche Polynucleotide könnten Teil eines Vektors sein und/oder solche Polynucleotide oder Enzyme könnten Teil einer Zusammensetzung sein und immer noch isoliert sein, da dieser Vektor oder diese Zusammensetzung nicht Teil ihrer natürlichen Umgebung ist.
Die erfindungsgemäßen Enzyme beinhalten ein Enzym aus 1 (insbesondere das reife Enzym) sowie Enzyme mit wenigstens 70% Ähnlichkeit (vorzugsweise wenigstens 70% Identität) zu einem Enzym aus 1 und bevorzugter wenigstens 90% Ähnlichkeit (bevorzugter wenigstens 90% Identität) mit einem Enzym aus 1 und noch bevorzugter wenigstens 95% Ähnlichkeit (noch bevorzugter wenigstens 95% Identität) mit einem Enzym aus 1 und schließen außerdem Teile solcher Enzyme ein, wobei eine solcher Teil des Enzyms im Allgemeinen wenigstens 30 Aminosäuren und bevorzugter wenigstens 50 Aminosäuren enthält.
Wie in der Technik bekannt ist, wird „Ähnlichkeit" zwischen zwei Enzymen durch einen Vergleich der Aminosäuresequenz und ihrer konservierten Aminosäuresubstituenten von einem Enzym mit der Sequenz eines zweiten Enzyms ermittelt. Ähnlichkeit bei Nucleinsäure- und Aminosäuresequenzen kann mit Verfahren und Algorithmen ermittelt werden, die in der Technik gut bekannt sind. Solche Verfahren und Algorithmen beinhalten z. B. ein BLAST Programm (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information), ALIGN, AMAS (Analysis of Multiply Aligned Sequences), AMPS (Protein Multiple Sequence Alignment), ASSET (Aligned Segment Statistical Evaluation Tool), BANDS, BESTSCOR, BIOSCAN (Biological Sequence Comparative Analysis Node), BLIMPS (BLocks IMproved Searcher), FASIA, Intervals & Points, BMB, CLUSTAL V, CLUSTAL W, CONSENSUS, LCONSENSUS, WCONSENSUS, Smith-Waterman-Algorithmus, DARWIN, Las-Vegas-Algorithmus, FNAT (Forced Nucleotide Alignment Tool), Framealign, Framesearch, DYNAMIC, FILTER, FSAP (Fristensky Sequence Analysis Package), GAP (Global Alignment Program), GENAL, GIBBS, GenQuest, ISSC (Sensitive Sequence Comparison), LALIGN (Local Sequence Alignment), LCP (Local Content Program), MACAW (Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench), MAP (Multiple Alignment Program), MBLKP, MBLKN, PIMA (Pattern-Induced Multi-sequence Alignment), SAGA (Sequence Alignment by Genetic Algorithm) und WHAT-IF.
Ein Varianten-, d. h. ein „Analogon"- oder „Derivat"-Enzym, und Referenzenzym können hinsichtlich der Aminosäuresequenz aufgrund einer oder mehrerer Substitutionen, Additionen, Deletionen, Fusionen und Verkürzungen unterschiedlich sein, die in jeder beliebigen Kombination vorliegen können.
Zu bevorzugten Varianten gehören solche, die von einer Referenz aufgrund konservativer Aminosäuresubstitutionen abweichen. Bei diesen Substitutionen handelt es sich um solche, die eine bestimmte Aminosäure in einem Polypeptid durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen Charakteristiken substituieren. Als konservative Substitutionen werden typischerweise die gegenseitigen Ersetzungen zwischen den aliphatischen Aminosäuren Ala, Val, Leu und Ile; die Auswechslung der Hydroxylreste Ser und Thr, der Austausch der sauren Reste Asp und Glu, die Substitution zwischen den Amidresten Asn und Gln, der Austausch der basischen Reste Lys und Arg und die Ersetzungen zwischen den aromatischen Resten Phe, Tyr angesehen.
Am meisten bevorzugt werden Varianten, die die gleiche biologische Funktion und Aktivität wie das Referenzpolypeptid beibehalten, von denen sie abweichen. Fragmente oder Teile der erfindungsgemäßen Enzyme können zur Produktion des entsprechenden Volllängenenzyms durch Peptidsynthese verwendet werden; folglich können die Fragmente als Intermediate zur Produktion der Volllängenenzyme verwendet werden. Fragmente oder Teile der Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können zum Synthetisieren von Volllängenpolynucleotiden der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Vektoren, die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung beinhalten, Wirtszellen, die mit erfindungsgemäßen Vektoren gentechnisch manipuliert werden, sowie die Produktion von Enzymen der Erfindung durch Rekombinationstechniken.
Wirtszellen werden mit den Vektoren, die die erfindungsgemäßen Polynucleotide enthalten, genetisch manipuliert (transduziert oder transformiert oder transfiziert). Solche Vektoren können zum Beispiel einen Klonierungsvektor oder einen Expressionsvektor beinhalten. Der Vektor kann z. B. in Form eines Plasmids, eines viralen Partikels, eines Phagen usw. vorliegen. Die konstruierten Wirtszellen können in konventionellen Nährmedien kultiviert werden, die zur Aktivierung von Promotoren, Selektierung von Transformanten oder Amplifizierung der Gene der vorliegenden Erfindung angemessen modifiziert werden. Die Kultivierungsbedingungen wie Temperatur, pH-Wert und dergleichen entsprechen denjenigen, die zuvor für die zur Expression selektierten Wirtszelle verwendet wurden, und sind der durchschnittlichen Fachperson bekannt.
Die erfindungsgemäßen Polynucleotide können zum Produzieren von Enzymen durch Rekombinationstechniken verwendet werden. Die Polynucleotide können somit z. B. in einem beliebigen aus einer Vielfalt von Expressionsvektoren zum Exprimieren eines Enzyms eingeschlossen werden. Zu solchen Vektoren gehören chromosomale, nichtchromosomale und synthetische DNA-Sequenzen, z. B. Derivate von SV40; bakterielle Plasmide, Phagen-DNA; Baculovirus; Hefeplasmide; von Kombinationen aus Plasmiden und Phagen-DNA abgeleitete Vektoren; virale DNA wie Vakzinia, Adenovirus, Geflügelpockenvirus und Pseudowut. Es kann aber jeder beliebige andere Vektor verwendet werden, solange er in dem Wirt replizierbar und lebensfähig ist.
Die geeignete DNA-Sequenz kann mit einer Vielfalt von Verfahren in den Vektor eingefügt werden. Im Allgemeinen wird die DNA-Sequenz mit in der Technik bekannten Verfahren in (eine) angemessene Restriktionsendonucleasestelle(n) eingefügt. Es wird angenommen, dass solche und andere Verfahren in den Kompetenzbereich der Fachperson fallen.
Die DNA-Sequenz im Expressionsvektor wird funktionell mit (einer) angemessenen Expressionskontrollsequenz(en) (Promotor) verknüpft, um die mRNA-Synthese zu lenken. Als repräsentative Beispiele für solche Promotoren können die Folgenden genannt werden: LTR oder SV40 Promotor; E. coli lac oder trp, Lambda-Phage-P_L-Promotor und andere Promotoren, die bekanntlich die Expression von Genen in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen oder ihren Viren kontrollieren. Der Expressionsvektor enthält außerdem eine Ribosomenbindungsstelle zur Translationsinitiierung und einen Transkriptionsterminator. Der Vektor kann außerdem geeignete Sequenzen zur Expressionsamplifikation enthalten.
Darüber hinaus enthalten die Expressionsvektoren vorzugsweise ein oder mehrere selektierbare Markergene, um ein phänotypisches Merkmal zur Selektion von transformierten Wirtszellen bereitzustellen, wie Dihydrofolatreduktase- oder Neomycinresistenz für die eukaryotische Zellkultur oder wie Tetracyclin- oder Ampicillinresistenz in E. coli.
Der Vektor, der die geeignete DNA-Sequenz wie zuvor hierin beschrieben sowie eine geeignete Promotor- oder Kontrollsequenz enthält, kann zum Transformieren eines geeigneten Wirts verwendet werden, damit der Wirt das Protein exprimieren kann.
Als repräsentative Beispiele für geeignete Wirte sind die Folgenden zu nennen: Bakterienzellen wie E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis; Pilzzellen wie Hefe; Insektenzellen wie Drosophila S2 und Spodoptera Sf9; Tierzellen wie CHO, COS oder Bowes-Melanom; Adenoviren; Pflanzenzellen usw. Es wird angenommen, dass die Selektion eines geeigneten Wirts angesichts der Lehren hierin im Kompetenzbereich der Fachperson liegt.
Insbesondere beinhaltet die vorliegende Erfindung außerdem rekombinante Konstrukte, die eine oder mehrere der oben grob beschriebenen Sequenzen umfassen. Die Konstrukte umfassen einen Vektor wie ein Plasmid oder einen viralen Vektor, in den eine erfindungsgemäße Sequenz in einer Vorwärts- oder Rückwärtsorientierung eingefügt wurde. In einem bevorzugten Aspekt dieser Ausgestaltung umfasst das Konstrukt ferner Regulationssequenzen, inklusive z. B. eines Promotors, der mit der Sequenz funktionell verknüpft ist. Der Fachperson sind zahlreiche geeignete Vektoren und Promotoren bekannt, die im Handel erhältlich sind. Als Beispiele sind die folgenden Vektoren zu nennen: bakteriell: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBluescript II (Stratagene); pTRC99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia); eukaryotisch: pXT 1, pSG5 (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia). Es kann allerdings jedes/jeder beliebige andere Plasmid oder Vektor verwendet werden, solange sie in dem Wirt replizierbar und lebensfähig sind.
Promotorregionen können aus jedem gewünschten Gen unter Verwendung von CAT-(Chloramphenicoltransferase)-Vektoren oder anderen Vektoren mit selektierbaren Markern selektiert werden. Zwei geeignete Vektoren sind pKK232-8 und pCM7. Zu besonderen genannten bakteriellen Promotoren gehören lacI, lacZ, T3, T7, gpt, Lambda P_R, P_I und trp. Zu eukaryotischen Promotoren gehören CMV-Immediate-Early, HSV Thymidin-Kinase, frühes und spätes SV40, LTRs von Retrovirus und Maus-Metallothionein-I. Die Selektion des geeigneten Vektors und Promotors liegt im Kompetenzbereich einer allgemein fachkundigen Person.
In einer weiteren Ausgestaltung betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, die die oben beschriebenen Konstrukte enthalten. Die Wirtszelle kann eine höhere eukaryotische Zelle wie eine Säugetierzelle oder eine niedere eukaryotische Zelle wie eine Hefezelle sein oder die Wirtszelle kann eine prokaryotische Zelle wie eine Bakterienzelle sein. Die Einführung des Konstrukts in die Wirtszelle I kann durch Calciumphosphattransfektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion oder Elektroporation bewirkt werden (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology (1986)).
Die Konstrukte in Wirtszellen können in einer konventionellen Weise zur Produktion des Genprodukts verwendet werden, das durch die rekombinante Sequenz kodiert wird. Alternativ können die Enzyme der Erfindung synthetisch durch konventionelle Peptid-Synthetisierer produziert werden.
Reife Proteine können in Säugetierzellen, Hefe, Bakterien oder anderen Zellen unter der Kontrolle geeigneter Promotoren exprimiert werden. Zellfreie Translationssysteme können ebenfalls zur Herstellung solcher Proteine unter Verwendung von RNAs verwendet werden, die von den DNA-Konstrukten der vorliegenden Erfindung abgeleitet werden. Zur Verwendung mit prokaryotischen und eukaryotischen Wirten geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren werden von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989) beschrieben.
Die Transkription der DNA, die die Enzyme der vorliegenden Erfindung kodiert, durch höhere Eukaryoten wird durch Einfügen einer Enhancer-Sequenz in den Vektor erhöht. Enhancer sind cis-wirkende Elemente von DNA, gewöhnlich mit etwa 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor einwirken, um seine Transkription zu erhöhen. Zu Beispielen gehören der SV40 Enhancer auf der späten Seite des Replikationsstartpunktes (bp 100 bis 270), ein Zytomegalovirus-Early-Promotor-Enhancer, der Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsstartpunktes sowie Adenovirus-Enhancer.
Im Allgemeinen beinhalten rekombinante Expressionsvektoren Replikationsstartpunkte und selektierbare Marker, die die Transformation der Wirtszelle zulassen, z. B. das Ampicillin-Resistenz-Gen von E. coli und S. cerevisiae TRP1-Gen, und einen Promotor, der von einem hoch exprimierten Gen abstammt, um die Transkription einer stromabwärtigen Struktursequenz zu lenken. Solche Promotoren können von Operonen abgeleitet werden, die glykolytische Enzyme kodieren, wie unter anderem 3-Phosphoglyceratkinase (PGK), Å-Faktor, Säurephosphatase oder Hitzeschockproteine. Die heterologe Struktursequenz wird in einer angemessenen Phase mit Translationsinitiierungs- und Terminationssquenzen und vorzugsweise einer Leader-Sequenz assembliert, die die Sekretion translatierter Enzyme lenken kann. Optional kann die heterologe Sequenz ein Fusionsenzym kodieren, einschließlich eines N-terminalen Identifikationspeptids, das gewünschte Charakteristiken verleiht, wie z. B. Stabilisierung oder vereinfachte Reinigung des exprimierten rekombinanten Produkts.
Zur bakteriellen Verwendung nützliche Expressionsvektoren werden konstruiert durch Einfügen einer strukturellen DNA-Sequenz, die ein gewünschtes Protein kodiert, zusammen mit geeigneten Translationsinitiierungs- und -terminationssignalen in funktionsfähiger Lesephase mit einem funktionellen Promotor. Der Vektor umfasst einen oder mehrere phänotypische selektierbare Marker und einen Replikationsstartpunkt, um die Aufrechterhaltung des Vektors zu gewährleisten und um bei Bedarf eine Amplifikation innerhalb des Wirts zu erbringen. Zur Transformation geeignete prokaryotische Wirte sind u. a. E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Spezies innerhalb der Gattungen Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus, obschon auch andere ausgewählt werden können.
Als repräsentatives, aber nicht begrenzendes Beispiel können zur bakteriellen Verwendung nützliche Expressionsvektoren einen selektierbaren Marker und einen bakteriellen Replikationsstartpunkt umfassen, abgeleitet von handelsüblichen Plasmiden, die genetische Elemente des allgemein bekannten Klonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017) umfassen. Zu solchen handelsüblichen Vektoren gehören zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Diese pBR322 „Rückgrat"-Abschnitte werden mit einem angemessenen Promotor und der zu exprimierenden strukturellen Sequenz kombiniert.
Nach der Transformation eines geeigneten Wirtsstammes und dem Wachstum des Wirtsstammes auf eine angemessene Zelldichte wird der selektierte Promotor durch geeignete Mittel (z. B. Temperaturwechsel oder chemische Induktion) induziert und Zellen werden über einen zusätzlichen Zeitraum kultiviert.
Zellen werden typischerweise durch Zentrifugation geerntet, durch physikalische oder chemische Mittel gesprengt, und der resultierende Rohextrakt wird für eine weitere Reinigung zurückbehalten.
Mikrobielle Zellen, die bei der Expression von Proteinen verwendet werden, können durch jedes beliebige geeignete Verfahren gesprengt werden, einschließlich Gefrier-Tau-Zyklen, Beschallung, mechanische Sprengung oder der Verwendung von Zelllysemitteln. Solche Verfahren sind der Fachperson gut bekannt.
Verschiedene Säugetierzellkultursysteme können ebenfalls zum Exprimieren von rekombinantem Protein verwendet werden. Beispiele für Säugetierexpressionssysteme sind die COS-7-Linien von Affennierenfibroblasten, beschrieben von Gluzman, Cell, 23: 175 (1981), und andere Zelllinien, die einen kompatiblen Vektor exprimieren können, z. B. die C127, 3T3, CHO, HeLa und BHK Zelllinien. Säugetierexpressionsvektoren umfassen einen Replikationsstartpunkt, einen geeigneten Promotor und Enhancer und außerdem jede beliebige erforderliche Ribosomenbindungsstelle, Polyadenylierungsstelle, Splice-Donor- und Akzeptor-Stelle, Transkriptionsterminationssequenz und 5'-flankierende nichttranskribierte Sequenz. DNA-Sequenzen, die von SV40 Spleiß- und Polyadenylierungsstellen stammen, können zur Lieferung der benötigten nichttranskribierten genetischen Elemente verwendet werden.
Das Enzym kann von rekombinanten Zellkulturen mit Verfahren wie Ammoniumsulfat- oder Ethanolpräzipitation, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie, Phosphocellulosechromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie, Affinitätschromatographie, Hydroxylapatitchromatographie und Lektinchromatographie gewonnen und gereinigt werden. Proteinneufaltungsmaßnahmen können bei Bedarf durchgeführt werden, um die Konfiguration des reifen Proteins abzuschließen. Schließlich kann eine Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) für endgültige Reinigungsschritte angewendet werden.
Die erfindungsgemäßen Enzyme können ein natürlich gereinigtes Produkt oder ein Produkt aus chemischen Syntheseverfahren sein oder sie können durch Rekombinationstechniken anhand eines prokaryotischen oder eukaryotischen Wirts produziert werden (z. B. durch Bakterien-, Hefe-, höhere Pflanzen-, Insekten- und Säugetierzellen in Kultur). Je nach dem in einem rekombinanten Produktionsverfahren verwendeten Wirt können die erfindungsgemäßen Enzyme glykosyliert oder nicht glykosyliert sein. Erfindungsgemäße Enzyme können außerdem einen anfänglichen Methionin-Aminosäurerest enthalten oder nicht.
Das erfindungsgemäße Enzym kann für jeden beliebigen Zweck eingesetzt werden, für den eine solche Enzymaktivität notwendig oder erwünscht ist. In einer bevorzugten Ausgestaltung wird das Enzym zum Katalysieren der Hydrolyse von Phytat verwendet. Der Abbau von Phytat kann in Tierfutter verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausgestaltung ist das erfindungsgemäße Enzym ein Phytaseenzym, das hitzebeständig und hitzeresistent ist und die enzymatische Hydrolyse von Phytat katalysiert, d. h. das Enzym kann renaturieren und die Aktivität nach einem kurzen (d. h. 5 bis 30 Sekunden) oder längeren (z. B. Minuten oder Stunden) Kontakt mit einer Temperatur von 50°C, optimal über 50°C, wiedererlangen.
Die Enzyme, ihre Fragmente oder andere Derivate oder Analoga davon oder Zellen, die sie exprimieren, können als ein Immunogen für die Herstellung von Antikörpern dagegen verwendet werden. Diese Antikörper können z. B. polyklonale oder monoklonale Antikörper sein. Die vorliegende Erfindung beinhaltet außerdem chimäre, einkettige und humanisierte Antikörper sowie Fab-Fragmente oder das Produkt einer Fab-Expressionsbibliothek. Verschiedene in der Technik bekannte Verfahren können zur Herstellung solcher Antikörper und Fragmente angewendet werden.
Antikörper, die gegen die Enzyme erzeugt werden, die einer Sequenz der vorliegenden Erfindung entsprechen, können durch direkte Injektion der Enzyme in ein Tier oder durch Verabreichen der Enzyme an ein Tier, vorzugsweise nicht-menschlich, erhalten werden. Der so erhaltene Antikörper bindet dann die Enzyme selbst. Auf diese Weise kann selbst eine Sequenz, die nur ein Fragment der Enzyme kodiert, zum Erzeugen von Antikörpern verwendet werden, die die gesamten nativen Enzyme binden. Solche Antikörper können dann zum Isolieren des Enzyms von Zellen verwendet werden, die dieses Enzym exprimieren.
Zur Präparation monoklonaler Antikörper kann jede beliebige Technik angewendet werden, die Antikörper liefert, die durch kontinuierliche Zelllinienkulturen produziert werden. Zu Beispielen gehören die Hybridomtechnik (Kohler und Milstein, 1975, Nature, 256: 495–497), die Trioma-Technik, die humane B-Zellenhybridomtechnik (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72) und die EBV-Hybridomtechnik zur Herstellung humaner monoklonaler Antikörper (Cole, et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77–96).
Techniken, die zur Herstellung einkettiger Antikörper beschrieben werden ( US-Patent 4,946,778 ), können an die Herstellung einkettiger Antikörper gegen immunogene Enzymprodukte der vorliegenden Erfindung angepasst werden. Außerdem können transgene Mäuse verwendet werden, um humanisierte Antikörper gegen immunogene Enzymprodukte der vorliegenden Erfindung zu exprimieren.
Antikörper, die gegen das erfindungsgemäße Enzym erzeugt werden, können beim Screenen nach ähnlichen Enzymen von anderen Organismen und Proben verwendet werden. Solche Screening-Techniken sind in der Technik bekannt. Antikörper können auch als Sonde zum Screenen von Genbibliotheken verwendet werden, die von diesen oder anderen Organismen erzeugt werden, um diese oder kreuzreaktive Aktivitäten zu identifizieren.
Die Isolierung und Reinigung von Polypeptiden, die in den oben beschriebenen Systemen produziert wurden, können mit konventionellen Verfahren durchgeführt werden, die für das jeweilige System geeignet sind. Es können z. B. eine präparative Chromatographie und immunologische Trennungen unter Verwendung von Antikörpern wie monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern angewendet werden.
Der hierin verwendete Begriff „Antikörper" bezieht sich auf intakte Immunglobulinmoleküle sowie Fragmente von Immunglobulinmolekülen, wie Fab, Fab', (Fab')₂, Fv und SCA-Fragmente, die sich an ein Epitop eines Endoglukanasepolypeptids binden können. Diese Antikörperfragmente, die eine gewisse Fähigkeit zur selektiven Bindung an das Antigen (z. B. ein Endoglukanaseantigen) des Antikörpers, von dem sie abstammen, beibehalten, können mit in der Technik allgemein bekannten Verfahren hergestellt werden (siehe z. B. Harlow und Lane, supra) und werden im Folgenden ausführlicher beschrieben.

(1) Ein Fab-Fragment besteht aus einem monovalenten Antigenbindungsfragment eines Antikörpermoleküls und kann durch den Verdau eines ganzen Antikörpermoleküls mit dem Enzym Papain produziert werden, um ein Fragment hervorzubringen, das aus einer intakten leichten Kette und einem Teil einer schweren Kette besteht.
(2) Ein Fab'-Fragment eines Antikörpermoleküls kann durch die Behandlung eines ganzen Antikörpermoleküls mit Pepsin und einer anschließenden Reduktion erzeugt werden, um ein Molekül hervorzubringen, das aus einer intakten leichten Kette und einem Teil einer schweren Kette besteht. Zwei Fab Fragmente werden je Antikörpermolekül erhalten, das auf diese Weise behandelt wird.
(3) Ein (Fab')₂-Fragment eines Antikörpers kann durch Behandeln eines ganzen Antikörpermoleküls mit dem Enzym Pepsin ohne anschließende Reduktion erhalten werden. Ein (Fab')₂-Fragment ist ein Dimer von zwei Fab Fragmenten, zusammengehalten durch zwei Disulfidbindungen.
(4) Ein Fv-Fragment ist als ein gentechnisch manipuliertes Fragment definiert, das die variable Region einer leichten Kette und die variable Region einer schweren Kette enthält, exprimiert als zwei Ketten.
(5) Ein einkettiger Antikörper („SCA") ist ein gentechnisch manipuliertes einkettiges Molekül, das die variable Region einer leichten Kette und die variable Region einer schweren Kette enthält, verknüpft durch einen geeigneten flexiblen Polypeptidlinker.

Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff „Epitop" bezieht sich auf eine antigene Determinante auf einem Antigen, wie ein Phytasepolypeptid, an die sich das Paratop eines Antikörpers, wie ein phytasespezifischer Antikörper, bindet. Antigene Determinanten bestehen gewöhnlich aus chemisch aktiven Oberflächengruppierungen von Molekülen wie Aminosäuren oder Zuckerseitenketten und können spezifische dreidimensionale Strukturcharakteristiken sowie spezifische Ladungscharakteristiken haben.
Wie oben erwähnt, schließen Antigene, die zur Herstellung von phytasespezifischen Antikörpern verwendet werden können, Phytasepolypeptide ein, wie z. B. jede beliebige der in 1 dargestellten Phytasen Polypeptidfragmente [sic]. Das zum Immunisieren eines Tieres verwendete Polypeptid oder Peptid kann durch standardmäßige rekombinante, chemische Synthese- oder Reinigungsverfahren erhalten werden. Wie in der Technik allgemein bekannt ist, kann ein Antigen zum Erhöhen der Immunogenität mit einem Trägerprotein konjugiert werden. Häufig verwendete Träger schließen Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH), Thyroglobulin, Rinderserumalbumin (BSA) und Tetanustoxoid ein. Das gekoppelte Peptid wird dann zum Immunisieren des Tieres (z. B. eine Maus, eine Ratte oder ein Kaninchen) verwendet. Zusätzlich zu solchen Trägern können allgemein bekannte Adjuvanzien mit dem Antigen verabreicht werden, um die Induktion einer starken Immunantwort zu unterstützen.
Phytasespezifische polyklonale und monoklonale Antikörper können z. B. durch Binden an und Eluieren von einer Matrix gereinigt werden, die ein Phytasepolypeptid enthält, z. B. das Phytasepolypeptid (oder ein Fragment davon), gegen das die Antikörper angehoben wurden. Zusätzliche Verfahren zur Antikörperreinigung und -konzentration sind in der Technik gut bekannt und können mit den phytasespezifischen Antikörpern der Erfindung in die Praxis umgesetzt werden (siehe z. B. C Oligan, et al., Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1994).
Ebenfalls in der Erfindung eingeschlossen sind anti-idiotypische Antikörper, die phytasespezifischen Antigenen entsprechen und die mit Standardverfahren hergestellt werden können. Diese Antikörper werden gegen phytasespezifische Antikörper angehoben und ahmen somit phytasespezifische Epitope nach.
Es heißt, dass sich die Angehörigen eines Paares von Molekülen (z. B. ein Antikörper-Antigen-Paar oder ein Nucleinsäurepaar) aneinander „spezifisch binden", wenn sie sich mit größerer Affinität aneinander binden als an andere unspezifische Moleküle. Ein Antikörper, der gegen ein Antigen angehoben wurde, an das er sich effizienter bindet als an ein unspezifisches Protein, kann zum Beispiel als sich spezifisch an das Antigen bindend beschrieben werden. (Ebenso kann eine Nucleinsäuresonde als sich spezifisch an ein Nucleinsäuretarget bindend beschrieben werden, wenn sie mit dem Target durch Basenpaarungsinteraktionen ein spezifisches Duplex bildet (siehe oben).)
Die vorliegende Erfindung wird ferner unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben; es ist jedoch zu verstehen, dass die vorliegende Erfindung nicht auf solche Beispiele begrenzt ist. Alle Teile oder Mengen sind, sofern nicht anders angegeben, nach Gewicht zu verstehen.
In einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Phytaseenzyms wie das in 1 gezeigte bereitgestellt. Das Verfahren beinhaltet das Kultivieren einer Wirtszelle, die ein Polynucleotid enthält, das das Enzym kodiert (z. B. SEQ ID Nr. 1), unter Bedingungen, die die Expression der Nucleinsäure zulassen, und das Isolieren des durch die Nucleinsäure kodierten Enzyms. Verfahren zum Kultivieren der Wirtszelle sind in den Beispielen beschrieben und der Fachperson bekannt.
In einer anderen Ausgestaltung stellt die Erfindung ein Verfahren zum Katalysieren der Hydrolyse von Phytat zu Inositol und freiem Phosphat mit der Freisetzung von Mineralien von dem Phytinsäurekomplex bereit. Das Verfahren schließt das Inkontaktbringen von Phytat mit einer abbauwirksamen Menge eines Enzyms der Erfindung ein, wie das in SEQ ID Nr. 1 dargestellte Enzym. Der Begriff „abbauwirksame" Menge bezieht sich auf die Enzymmenge, die notwendig ist, um wenigstens 50% des Phytats im Vergleich zu Phytat abzubauen, das nicht mit dem Enzym in Kontakt gebracht wird. Vorzugsweise werden wenigstens 80% des Phytats abgebaut.
In einer anderen Ausgestaltung stellt die Erfindung ein Verfahren zum Hydrolysieren von Phospho-Mono-Ester-Bindungen in Phosphat bereit, wobei das Verfahren das Verabreichen einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Enzyms (z. B. SEQ ID Nr. 1) beinhaltet, um Inositol und freies Phosphat hervorzubringen. Eine „wirksame" Menge bezieht sich auf die Enzymmenge, die notwendig ist, um wenigstens 50% der Phospho-Mono-Ester-Bindungen im Vergleich zu Phytat zu hydrolysieren, das nicht mit dem Enzym in Kontakt gebracht wird. Vorzugsweise werden wenigstens 80% der Bindungen hydrolysiert.
Für ein besseres Verständnis der folgenden Beispiele werden bestimmte häufig vorkommende Verfahren und/oder Begriffe beschrieben.
„Plasmide" sind durch ein kleingeschriebenes p gekennzeichnet, dem Großbuchstaben und/oder Zahlen vorangehen und/oder folgen. Die Ausgangsplasmide hierin sind entweder im Handel erhältlich, unbeschränkt öffentlich erhältlich oder können anhand verfügbarer Plasmide mit veröffentlichten Verfahren hergestellt werden. Darüber hinaus sind zu den beschriebenen Plasmiden äquivalente Plasmide in der Technik bekannt und werden für die durchschnittliche Fachperson offensichtlich sein.
Der „Verdau" von DNA bezieht sich auf die katalytische Spaltung der DNA mit einem Restriktionsenzym, das nur auf bestimmte Sequenzen in der DNA einwirkt. Die verschiedenen hierin verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich und ihre Reaktionsbedingungen, Cofaktoren und anderen Erfordernisse wurden so verwendet, wie es der durchschnittlichen Fachperson bekannt wäre. Für analytische Zwecke wird typischerweise 1 μg Plasmid- oder DNA-Fragment mit etwa 2 Einheiten Enzym in etwa 20 μl Pufferlösung verwendet. Zum Isolieren der DNA-Fragmente zur Plasmidkonstruktion werden typischerweise 5 bis 50 μg DNA mit 20 bis 250 Einheiten Enzym in einem größeren Volumen verdaut. Geeignete Puffer und Substratmengen für spezielle Restriktionsenzyme werden vom Hersteller angegeben. Gewöhnlich wird eine Inkubationszeit von 1 Stunde bei 37°C verwendet, sie kann aber gemäß den Anweisungen des Lieferanten variieren. Nach dem Verdau wird die Reaktion direkt auf einem Polyacrylamidgel der Elektrophorese unterworfen, um das gewünschte Fragment zu isolieren.
Eine Größentrennung der gespaltenen Fragmente findet im Allgemeinen mit 8 Prozent Polyacrylamidgel statt, wie zum Beispiel von Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980) beschrieben.
„Oligonucleotide" beziehen sich entweder auf ein einzelsträngiges Polydesoxynucleotid oder auf zwei komplementäre Polydesoxynucleotidstränge, die chemisch synthetisiert sein können. Solche synthetischen Oligonucleotide können ein 5'-Phosphat haben oder nicht. Solche, die keins haben, ligieren nicht mit einem anderen Oligonucleotid ohne die Zugabe eines Phosphats mit einem ATP in Anwesenheit einer Kinase. Ein synthetisches Oligonucleotid ligiert mit einem Fragment, das nicht dephosphoryliert wurde.
„Ligation" bezieht sich auf den Prozess der Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei doppelsträngigen Nucleinsäurefragmenten (Maniatis, T., et al., Id., S. 146). Sofern nicht anders angegeben, kann die Ligation mit bekannten Puffern und Bedingungen mit 10 Einheiten T4 DNA-Ligase („Ligase") je 0,5 μg von in etwa äquimolaren Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente erreicht werden.
Sofern nicht anders angegeben, fand die Transformation wie in dem Verfahren von Sambrook, Fritsch und Maniatus, 1989, statt. Die folgenden Beispiele dienen Illustrationszwecken und begrenzen die Erfindung nicht. Die in den Beispielen beschriebenen Verfahren sind zwar typisch für solche, die zur Durchführung bestimmter Aspekte der Erfindung angewendet werden können, doch können auch andere Verfahren angewendet werden, die der Fachperson bekannt sind. Die folgenden Materialien und Verfahren wurden zur Durchführung der in den Beispielen beschriebenen Experimente verwendet.
1. Beispiel
Isolierung, bakterielle Expression und Reinigung von Phytase
E. coli B Genom-DNA wurde von Sigma (Katalog Nr. D-2001), St. Louis, New Jersey besorgt.
Die folgenden Primer wurden zum PCR-Amplifizieren des Gens direkt von der Genom-DNA verwendet:
Pfu Polymerase in der PCR-Reaktion [sic], und die Amplifikation fand gemäß dem Herstellerprotokoll statt (Stratagene Cloning Systems, Inc., La Jolla, CA).
Das PCR-Produkt wurde gereinigt und das gereinigte Produkt und pQE60 Vektor (Qiagen) wurden mit EcoRI und BglII Restriktionsendonucleasen (New England Biolabs) gemäß Herstellerprotokollen verdaut. Übernachtligationen fanden mit Standardprotokollen statt, um pQE60 zu erhalten.
Die amplifizierten Sequenzen wurden „in-frame" mit der RBS kodierenden Sequenz eingefügt. Das Ligationsgemisch wurde dann zum Transformieren des E. coli Stamms M15/pREP4 (Qiagen, Inc.) durch Elektroporation verwendet. M15/pREP4 enthält mehrere Kopien des Plasmids pREP4, das den lacI Repressor exprimiert und außerdem Kanamycinresistenz (Kan') verleiht. Plasmid-DNA wurde isoliert und durch Restriktionsanalyse bestätigt. Klone mit den gewünschten Konstrukten wurden über Nacht (O/N) in einer Flüssigkultur in LB-Medium, angereichert mit Amp (100 μg/ml) und Kan (μg/ml), kultiviert. Die O/N-Kultur wurde zum Inokulieren einer großen Kultur in einem Verhältnis von 1:100 bis 1:250 verwendet. Die Zellen wurden auf einen optischen Dichte-600-Wert (O. D.⁶⁰⁰) zwischen 0,4 und 0,6 kultiviert. IPTG („Isopropyl-B-D-thiogalactopyranosid") wurden dann auf eine Endkonzentration von 1 mM gegeben. IPTG induziert durch Inaktivieren des lacI Repressors, wodurch P/O freigegeben wird, was zu einer erhöhten Genexpression führt. Zellen wurden zusätzliche 3 bis 4 Stunden kultiviert. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation geerntet.
Die oben dargelegten Primersequenzen können auch zum Isolieren des Targetgens von dem hinterlegten Material mit den oben beschriebenen Hybridisierungstechniken verwendet werden.
Angesichts der obigen Lehren sind zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung möglich, so dass die Erfindung im Rahmen der angefügten Ansprüche anders als speziell beschrieben umgesetzt werden kann. Es ist zu verstehen, dass die Erfindung zwar mit Bezug auf die obige ausführliche Beschreibung beschrieben wurde, die vorangehende Beschreibung aber illustrativ sein und den Umfang der Erfindung nicht beschränken soll. Andere Aspekte, Vorteile und Modifikationen der Erfindung liegen im Rahmen der folgenden Ansprüche.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Im Wesentlichen reine Phytase mit einer Aminosäuresequenz bestehend aus SEQ ID Nr. 2.
Isolierte Polynucleotidsequenz, die eine Phytase nach Anspruch 1 kodiert.
Isoliertes Polynucleotid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) SEQ ID Nr. 1, b) SEQ ID Nr. 1, wobei T auch U sein kann.
Polynucleotid nach Anspruch 2, wobei das Polynucleotid von einem Prokaryot isoliert ist.
Expressionsvektor, der das Polynucleotid aus Anspruch 2 beinhaltet.
Vektor nach Anspruch 5, der ein Plasmid ist.
Vektor nach Anspruch 5, der von einem Virus abstammt.
Wirtszelle, transformiert mit dem Vektor aus Anspruch 5.
Wirtszelle nach Anspruch 8, wobei die Zelle prokaryotisch ist.
Antikörper, die sich an das Polypeptid aus Anspruch 1 binden.
Antikörper nach Anspruch 10, wobei die Antikörper polyklonal sind.
Antikörper nach Anspruch 10, wobei die Antikörper monoklonal sind.
Verfahren zum Herstellen eines Enzyms, das die folgenden Schritte beinhaltet: Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 8 unter Bedingungen, die die Expression der Nucleinsäure ermöglichen, und Isolieren des durch die Nucleinsäure kodierten Enzyms.
Verfahren zum Abbauen von Phytat, das das Inkontaktbringen von Phytat mit einer Menge des Enzyms aus Anspruch 1 beinhaltet, die notwendig ist, um wenigstens 50% des Phytats im Vergleich zu nicht mit dem Enzym in Kontakt gebrachtem Phytat abzubauen.
Verfahren zum Hydrolysieren der Phospho-Mono-Ester-Bindung in Phytat, das das Inkontaktbringen des Phytats mit einer Menge des Enzyms aus Anspruch 1 beinhaltet, die notwendig ist, um wenigstens 50% der Phospho-Mono-Ester-Bindungen im Vergleich zu nicht mit dem Enzym in Kontakt gebrachtem Phytat zu hydrolysieren.
Tierfutterzusammensetzung, die ein Phytat mit einer Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr. 2 dargelegt umfasst.
Antikörper nach Anspruch 10, wobei der Antikörper nachweisbar markiert ist.