DE69902396T3 - Stabilisierte flüssige arzneizubereitungen enthaltend botulinum toxin - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Botulinum-Toxin ist ein Polypeptidprodukt des anaeroben Bakteriums Clostridium botulinum. Das Toxin verursacht bei Säugetieren eine Muskellähmung, indem es die präsynaptische Freisetzung des Neurotransmitters Acetylcholin an der neuromuskulären Verbindungsstelle blockiert. Während das Toxin lange Zeit mit dem tödlichen Botulismus in Verbindung gebracht wurde, wurde es in den letzten Jahren therapeutisch zur Behandlung bestimmter unwillkürlicher Muskelbewegungserkrankungen eingesetzt, darunter fokale Dystonien (wie Schielen, essenzielle Blepharospasmen und halbseitige Gesichtsspasmen) sowie segmentale Dystonien (wie Torticollis, Mund- und Unterkieferdystonie und krampfartige Dystonie) und spastische Lähmungen. Das Toxin fand außerdem Anwendung bei verschiedenen kosmetischen Indikationen, wie beispielsweise bei der nicht-chirurgischen Verringerung von „Stirnfalten” im Gesicht sowie bei der Behandlung einer Hyperhidrose (exzessive Schweißproduktion).
  • Es gibt derzeit zwei Botulinum-Toxin(Typ A)-Zubereitungen, die für die therapeutische Verwendung beim Menschen zugelassen sind – „BOTOX® (Oculinum®; Allergan Inc., Irvine, CA) und „DYSPORT®” (Spexwood Pharmaceuticals, Ltd.; Großbritannien). Beide Formulierungen werden dem Kliniker in lyophilisierter (gefriergetrockneter) Form geliefert und müssen unmittelbar vor der Verwendung rekonstituiert werden.
  • Aufgrund des jeweils unterschiedlichen Dosisbedarfs kann die erforderliche Dosis von Patient zu Patient verschieden sein. Darüber hinaus darf der Kliniker bei bestimmten Anwendungen nur einen kleinen Bruchteil des Inhalts eines vorbereiteten Fläschchens über einen in die Länge gezogenen Zeitraum hinweg verabreichen, wobei es sich dabei um mehrere Stunden handeln kann. Obgleich eine Studie vermuten ließ, dass flüssige Botulinum-Toxin-Formulierungen nur mit erheblichen Aktivitätseinbußen erneut eingefroren und aufgetaut werden können (Schantz and Kautter, 1978), haben neuere Studien, in denen die Aktivität des rekonstituierten Toxins bestimmt wurde, gezeigt, dass „BOTEX®” mindestens 44% seiner pharmakologischen Wirksamkeit verliert, wenn es rekonstituiert und in einem Standardkühlschrank (ungefähr 4°C) für die Dauer von 12 Stunden aufbewahrt wird. Darüber hinaus verlor die rekonstituierte Formulierung bei Aufbewahrung in einem Gefriergerät bei –70°C nach 2 Wochen etwa 70% ihrer pharmakologischen Wirksamkeit (Gartlan and Hoffman, 1993). Aus diesen Gründen wird empfohlen, solche Zusammensetzungen spätestens 4 Stunden nach der Rekonstituierung zu verwenden. Dies kann zu einer erheblichen Verschwendung des Arzneimittels und zu erheblichen Kosten für den Patienten führen.
  • Es ist daher ein Bedarf für eine gebrauchsfertige Flüssigformulierung von Botulinum-Toxin vorhanden, die bequem verschickt, aufbewahrt und je nach Bedarf des Klinikers verwendet werden kann. Die vorliegende Erfindung stellt eine solche Formulierung bereit.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung richtet sich auf stabile gebrauchsfertige Flüssigformulierungen von Botulinum-Toxin, wie in den Ansprüchen gekennzeichnet. Solche Formulierungen sind besonders nützlich bei Zuständen, bei denen eine anhaltende Verringerung oder Hemmung der cholinergen Innervierung einer Region, insbesondere eines Muskels oder einer Muskelgruppe, Drüse oder Organ vorliegt. Beispiele für solche Konditionen sind hierin beschrieben.
  • Gemäß der Erfindung können im Allgemeinen alle bekannten Botulinum-Toxin-Serotypen (z. B. die Serotypen A, B, C1, C2, D, E, F oder G) oder andere Serotypen mit äquivalenter biologischer Aktivität in Formulierungen der Erfindung eingebaut werden. In bevorzugten Ausführungsformen ist das in der Formulierung verwendete Botulinum-Toxin Botulinum-Toxin-Serotyp A oder B, aus Clostridium botulinum isoliert.
  • In bevorzugten Ausführungsformen ist Botulinum-Toxin Typ B in der Formulierung als Komplex mit einem Molekulargewicht von 700 Kilodalton, einer Konzentration von zirka 100–20.000 E/ml und insbesondere zwischen zirka 1.000–5.000 E/ml vorhanden. Wird Typ A verwendet, so ist es im Allgemeinen in einer Konzentration von zirka 20–2.000 E/ml und insbesondere von zirka 100–1.000 E/ml vorhanden. Werden in der Formulierung Kombinationen verschiedener Serotypen verwendet, so können deren sinnvolle Dosierung oder deren sinnvolle Konzentrationsbereiche im Verhältnis zu den hierin als Beispiel genannten Dosierungen und Konzentrationen und gemäß ihrer jeweiligen biologischen Aktivität bestimmt werden.
  • Die in der Formulierung einsetzbaren Puffer sind physiologische Puffer, die als unbedenklich für die Injektion in Säugetiergewebe und insbesondere in Menschen gelten.
  • Repräsentative Puffer schließen Puffersysteme auf der Basis von Phosphat, Phosphat-Citrat, Succinat, Acetat, Zitrat, Aconitat, Malat und Carbonat ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die Toxinformulierung der Erfindung kann in verschiedene, aus dem Stand der Technik bekannte Behälter oder Fläschchen verpackt werden, und gleichzeitig seine pharmakologische Wirksamkeit beibehalten.
  • In einem verwandten Aspekt beinhaltet die Erfindung die Verwendung der Formulierungen der Erfindung in der Zubereitung eines Medikaments zum Hemmen cholinerger Übertragung auf einen ausgewählten Muskel oder eine Muskelgruppe oder auf eine spezifische Drüsenregion, wie beispielsweise Schweißdrüsen, oder auf ein bestimmtes Organ mit cholinerger Innervierung.
  • Beispiele für therapeutische und kosmetische Indikationen, die durch Verwenden der Botulinum-Toxin-Formulierung behandelt werden, beinhalten, jedoch ohne darauf eingeschränkt zu sein, Blepharospasmus, Schielen, halbseitige Gesichtslähmung, Mittelohrentzündung, spastischer Darmkatarrh, Anismus, Dyssynergie der Harnentleer- und -schließmuskulatur, Zähneknirschen, Verkrümmung der Wirbelsäule, spastische Lähmungen, wie spastische Lähmungen infolge einer oder mehreren aus der Gruppe bestehend aus Schlaganfall, Rückenmarksverletzung, geschlossenem Schädel-Hirn-Trauma, zerebrale Kinderlähmung, multiple Sklerose und Parkinsons Krankheit sowie Dystonie (z. B. krampfartigem Schiefhals (Dystonie des Halses)), krampfartige Dystonie, Gliedmaßen-Dystonie, Kehlkopf-Dystonie und Mund- und Unterkiefer-(Meige's)Dystonie. Die Formulierung ist auch in den Beckenboden (Beckenbodenmuskeln) eines Patienten während des Geburtsvorgangs eines Kindes verabreichbar, um eine Entspannung solcher Muskeln zu bewirken. Beispiele für kosmetische Indikationen der Formulierung beinhalten die Verabreichung an Muskeln, die Falten oder eine zerfurchte Stirn produzieren. Andere Indikationen für die Formulierung beinhalten myofasziale Schmerzen, Kopfweh in Verbindung mit Migräne, Gefäßstörungen, Neuralgie, Neuropathie, Gelenksentzündungsschmerz, Rückenschmerz, Hyperhydrose, Nasenbluten, Asthma, überschüssigen Speichelfluss und überschüssige Magensäureproduktion.
  • Besonders spezifizierte Wege der Verabreichung von Formulierungen der Erfindung beinhalten die intramuskuläre, subkutane oder iontophoretische Verabreichung. Beispielsweise war Botulinum-Toxin Typ B in zur Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführten Studien bei der Kontrolle einer Dystonie des Halses wirksam, wenn es intramuskulär in einer geteilten Dosis oder in einer Einzeldosis zwischen 5.000 und 10.000 Einheiten verabreicht wurde.
  • Gemäß einem anderen verwandten Aspekt beinhaltet die Erfindung Medikamente für Patienten, die Immunität oder Unempfindlichkeit gegen einen spezifischen Botulinum-Serotyp mit einer stabilen Flüssigformulierung entwickelt haben, die einen anderen Serotyp beinhaltet. Beispielsweise ist ein Patient, der unempfindlich gegen Botulinum-Toxin Serotyp A ist, mit einer stabilen Flüssigformulierung behandelbar, die einen der Botulinum Serotypen B, C1, C2, D, E, F oder G enthält, bzw. ist ein Patient, der unempfindlich gegen Botulinum-Toxin Serotyp B ist, mit einer stabilen Flüssigformulierung behandelbar, die einen der Botulinum Serotypen A, C1, C2, D, E, F oder G enthält, um erneute Wirksamkeit zu bewirken.
  • Diese und andere Aufgaben und Eigenschaften der Erfindung werden offensichtlicher, wenn die folgende ausführliche Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den angeschlossenen Zeichnungen gelesen wird.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung befasst sich mit stabilen gebrauchsfertigen pharmazeutischen Flüssigformulierungen von Botulinum-Toxin und deren Verwendung. Während Botulinum-Toxin-Zubereitungen für unterschiedliche therapeutische und kosmetische Anwendungen kommerziell vermarktet werden, müssen Formulierungen aufgrund der Labilität des aktiven, sich in Lösung befindenden Toxinbestandteils derzeit aus lyophylisierten Inhaltsstoffen, die stringente Lagerbedingungen haben, rekonstituiert werden. So wird „BOTOX®” beispielsweise als lyophylisiertes Pulver bereit gestellt, das in einer Kühleinheit bei oder unter –5°C verschickt und aufbewahrt und durch Zugabe einer abgemessenen Menge an Salzlösung unmittelbar vor Gebrauch rekonstituiert werden muss. Es wird empfohlen, dass die Formulierung nach der Rekonstituierung innerhalb von 4 Stunden an den Patienten verabreicht wird, und dass jedes rekonstituierte Produkt während dieses Zeitraums gekühlt wird (PDR, 1997); Einfrieren und Auftauen des rekonstituierten Produktes wird nicht empfohlen (Hoffman, 1993).
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine stabile Flüssigformulierung bereit, wie in den Ansprüchen gekennzeichnet. Diese Formulierung ist vorteilhaft, da sie keine unüblichen Aufbewahrungs- oder Transportbedingungen erfordert und da sie die Möglichkeit von Fehlern bei der Verdünnung des Toxins, die zu einer Überdosis führen könnten, verringert.
  • I. Definitionen
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „stabil” auf den Erhalt der biologischen Aktivität oder pharmakologischen Wirksamkeit einer biologisch aktiven Substanz, genauer gesagt Botulinum-Toxin, über einen bestimmten oder unbestimmten Zeitraum.
  • Der Begriff „Botulinum-Toxin” bezieht sich auf ein biologisch aktives Protein oder einen biologisch aktiven Proteinkomplex, der in der Regel aus dem Bakterium Clostridium botulinum stammt. Der Begriff bezieht sich auf jedes der mindestens acht serologisch unterschiedliche Toxine (A, B, C1, C2, D, E, F und G), sowie auf alle zusätzlichen Botulinum-Toxine mit derselben allgemeinen Fähigkeit zum Hemmen cholinerger Neurotransmission, welche das aktive Molekül bilden. Gegebenenfalls schließt der Begriff auch ein Trägerprotein ein, das ebenfalls aus Clostridium botulinum stammt und das, wie in Abschnitt IIA hierin beschrieben, mit dem aktiven Molekül Komplexe bildet. Botulinum-Toxin Serotypen sind pharmakologisch verwandt, wie nachfolgend erörtert wird, aber immunologisch unterscheidbar. Im Allgemeinen hat das aktive Toxinmolekül eine Molekulargröße zwischen 145 und 170 Kilodalton (kD). In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird vorausgesetzt, dass das Toxinprotein Toxine und Trägerproteine einschließt, die aus natürlichen Quellen isoliert sind, sowie korrespondierende Toxine und Trägerproteine, die gemäß den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren rekombinant hergestellt sind. Ferner umfasst der Begriff „Botulinum-Toxin” Proteine mit Aminosäuresequenzen, die konservative Aminosäureaustausche, einschließlich Deletionen, einschließen, und zwar bezogen auf die bekannten Botulinum-Toxin-Sequenzen wie unten beschrieben.
  • Die „biologische Aktivität” von Botulinum-Toxin bezieht sich auf dessen Fähigkeit, durch Blockieren der Acetylcholinfreisetzungen aus Nervenenden die Neurotransmission an Synapsen mit Acetylcholinrezeptoren zu hemmen. Dieser Begriff wird hierin mit den Begriffen „Hemmung der cholinergen Transmission”, „Hemmung der cholinergen Eingabe”, „Verringerung der cholinergen Eingabe” und Ableitungen davon austauschbar verwendet. In-vitro-Tests zur Bestimmung der biologischen Aktivität des Toxins beinhalten den Maus-LD50-Test wie hierin beschrieben. Eine „Einheit” der Aktivität in diesem Test ist definiert als die Menge an Toxinprotein, die erforderlich ist, um 50% der mit dieser Dosis getesteten Mäuse zu töten. Eine funktionelle Definition dieses Begriffs wird hierin in Beispiel 2 gegeben.
  • Häufige Aminosäuren sind hierin durch ihren Ein- oder Drei-Buchstaben-Code angegeben: Alanin (A, Ala), Cystein (C, Cys), Asparaginsäure (D, Asp), Glutaminsäure (E, Glu), Phenylalanin (F, Phe), Glycin (G, Gly), Histidin (H, His), Isoleucin (I, Ile), Lysin (K, Lys), Leucin (L, Leu), Methionin (M, Met), Asparagin (N, Asn), Prolin (P, Pro), Glutamin (Q, Gln), Arginin (R, Arg), Serin (S, Ser), Threonin (T, Thr), Valin (V, Val), Tryptophan (W, Trp), Tyrosin (Y, Tyr).
  • Der Begriff „flüssige pharmazeutische Formulierung” bezieht sich auf eine pharmazeutisch aktive Zubereitung eines Arzneimittels oder biologischen Stoffes, die in gepufferter Salzlösung über einen längeren Zeitraum hinweg aufbewahrt werden kann. Die Formulierung kann eine konzentrierte Formulierung sein, die vor dem Gebrauch in einer ähnlichen oder unterschiedlichen Flüssigkeit verdünnt wird.
  • Der Begriff „Puffer” bezieht sich auf einen Bestandteil, in der Regel ein Salz, das, wenn es in einem wässrigen Medium aufgelöst wird, innerhalb eines bestimmten pH-Bereiches zur Erhaltung der Konzentration an freien Wasserstoffionen in der Lösung dient, wenn Wasserstoffionen der Lösung zugegeben oder daraus entfernt werden Von einem Salz oder einer Lösung wird dann gesagt, dass sie eine „Pufferkapazität” haben oder die Lösung über einen solchen Bereich „puffern”, wenn sie diese Funktion bieten. Im Allgemeinen hat ein Puffer in einem Bereich, der innerhalb von ±1 pH-Einheit seines pK-Wertes liegt, adäquate Pufferkapazität. Ein „physiologischer Puffer” ist ein Puffer, der für Säugetiere, insbesondere für Menschen, nicht toxisch ist, wenn er als Teil einer pharmazeutischen Zubereitung verabreicht wird. Es werden hierin Beispiele für relevante physiologische Puffer in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bereitgestellt.
  • Eine „pharmazeutisch akzeptable Flüssigkeit” ist eine Flüssigkeit, die als sicher zum Verzehr oder zur Injektion in Säugetiere, insbesondere in Menschen, gilt.
  • Der Begriff „Exzipientprotein”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf Serumalbumine, insbesondere humanes Serumalbumin und rekombinantes humanes Serumalbumin. Solche Proteine sind für die Säugetierspezies, der die pharmazeutische Formulierung verabreicht wird, vorzugsweise relativ nichtimmunogen.
  • Der Begriff „umfassen”, wie er im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung und insbesondere in Zusammenhang mit den Patentansprüchen verwendet wird, soll die Bedeutung des Begriffes „einschließend”, „enthaltend” oder „gekennzeichnet durch” haben. Eine Zusammensetzung oder ein Verfahren, das Elemente A, B und C „umfasst”, kann außer A, B und C auch noch andere, nicht erwähnte Elemente, wie z. B. X oder Y, beinhalten.
  • Der Begriff „zirka”, wie er in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung und insbesondere in Zusammenhang mit den Patentansprüchen verwendet wird, bedeutet „ungefähr” oder „fast”. In Zusammenhang mit numerischen Werten ist der Begriff ohne Festlegung auf eine strikte numerische Definition so auszulegen, einen Wert zu schätzen, der ±10% des erwähnten Wertes oder Bereiches beträgt.
  • Alle anderen, hierin verwendeten Begriffe sind so auszulegen, dass sie die üblichen Definitionen, die Fachleuten bekannt sind, oder die in medizinischen oder wissenschaftlichen Standardwörterbüchern aufgeführt sind, übernehmen.
  • II. Botulinum-Toxin
  • Wie oben erwähnt, ist Botulinum-Toxin ein Polypeptidprodukt, das von verschiedenen Stämmen von Clostridium botulinum produziert wird. Diese Stämme produzieren mindestens acht bekannte, serologisch unterschiedliche Toxine (A, B, C1, C2, D, E, F und G). C. barati und C. butyricum produzieren jeweils einen einzelnen Serotyp, der dem Serotyp E, bzw. F ähnlich ist (Simpson, 1993). Im Allgemeinen hat das Toxinmolekül eine Molekulargröße zwischen zirka 145 und 170 Kilodalton (kD). In einigen Fällen besteht das aktive Toxinmolekül aus zwei, über Disulfide verbundenen Ketten, die von einem Vorläuferpolypeptid gebildet werden. Botulinum-Toxin Typ B wird beispielsweise von einem einzelnen Vorläuferpolypeptid mit 150 kD gebildet, das eingeschnitten wird, um für maximale Aktivität zwei über Disulfide verbundene Fragmente – eine schwere Kette (H-Kette) mit 100 kD und eine leichte Kette (L-Kette) mit 50 kD zu erzeugen. Das natürlich vorkommende Toxin bindet nichtkovalent an nicht toxische Trägerproteine, die ebenfalls von C. botulinum produziert werden. Diese Trägerproteine binden an die Toxinketten, um Komplexe mit bis zu 900 kD (Typ A) und vorzugsweise etwa 700 kD für Typ B zu bilden. Die Trägerproteine werden zusammen mit dem Toxin aufgereinigt und bilden auf optimale Weise einen Teil der hierin beschriebenen Formulierung.
  • Die verschiedenen Botulinum-Toxin Serotypen haben in Zellen unterschiedliche Bindungsspezifitäten. So scheinen Toxine vom Typ A und Typ E an die gleiche synaptosomale Bindungsstelle zu binden, während Toxin vom Typ B an eine andere Stelle bindet und nicht um die Bindung an die Bindungsstelle für Toxine vom Typ A und Typ E konkurriert (Melling, 1988). Ohne Festlegung auf eine bestimmte Theorie oder einen Wirkungsmechanismus wird angenommen, dass die H-Kette des Toxins die Bindung an Neuronenzellen und die Zelldurchdringungsaktivität vermittelt, während die L-Kette die Freisetzung von Acetylcholin an der Synapse hemmt. Es wird weiters angenommen, dass Botulinum-Toxin Typ A und B leicht unterschiedliche Mechanismen für das Bewirken der Hemmung der Acetylcholinfreisetzung verwenden: Typ A schneidet das Synapse-Associated-Protein-25 (SNAP-25) und Typ B schneidet das Vesicle-Associated-Membrane-Protein (VAMP oder Synaptobrevin). Beide Proteine sind Bestandteile der Freisetzung synaptischer Vesikel an den Synapsen.
  • Alle C. botulinum-Toxin Serotypen produzieren bei Säugetieren ein gemeinsames physiologisches Ergebnis. Alle hemmen oder blockieren die cholinerge Synapsenaktivität, was je nach Verabreichungsstelle eine teilweise oder vollständige Muskellähmung oder Blockade oder Hemmung der Funktion eines Organs oder einer Drüse zur Folge hat. Entsprechend kann die Formulierung der vorliegenden Erfindung mit jedem der Botulinum-Toxin Serotypen, abstammend von C. botulinum, verwendet werden, die durch die oben beschrieben biologischen Aktivitäten gekennzeichnet sind. Auch sind die Aminosäuresequenzen der meisten derzeit bekannten Serotypen bekannt oder können durch aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren bestimmt werden. Es wird vorausgesetzt, dass eine Botulinum-Toxin-Formulierung in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung weiters so auszulegen ist, dass sie ein durch Rekombination konstruiertes Botulinum-Toxin beinhaltet, welches konservative Aminosäureaustausche in Bezug auf solche bekannten Sequenzen aufweist. Im Allgemeinen werden solche Austausche mit Standardklassen natürlich vorkommender Aminosäuren vorgenommen. Austauschstandardklassen können beispielsweise die sechs Klassen sein, die auf gemeinsamen Seitenketteneigenschaften und der höchsten Austauschhäufigkeit in homologen Proteinen in der Natur beruhen, wie dies beispielsweise durch eine aus dem Stand der Technik bekannte Standardfrequenzaustauschmatrix, wie beispielsweise die Dayhoff-Matrix, bestimmt ist. Nach der Dayhoff-Matrix sind die Klassen beispielsweise Klasse I: Cys; Klasse II: Ser, Thr, Pro, Hyp, Ala und Gly, die für kurze aliphatische Seitengruppen und OH-Gruppen als Seitengruppen stehen; Klasse III: Asn, Asp, Glu und Gln, die für neutrale und negativ geladene Seitenketten mit der Fähigkeit zur Ausbildung von Wasserstoffbindungen stehen; Klasse IV: His, Arg und Lys, die für polare Seitenketten stehen; Klasse V: Ile, Val und Leu, die für verzweigte aliphatische Seitenketten stehen, sowie Met; und Klasse VI: Phe, Tyr und Trp, die für aromatische Seitenketten stehen. Außerdem kann jede Gruppe verwandte Aminosäureanaloga einschließen, wie beispielsweise Ornithin, Homoarginin, N-Methyl-Lysin, Dimethyl-Lysin oder Trimethyl-Lysin in der Klasse IV und ein halogeniertes Tyrosin in Gruppe VI. Die Klassen können außerdem sowohl L- als auch D-Stereoisomere einschließen, obwohl L-Aminosäuren für Austausche bevorzugt sind. So ist beispielsweise der Austausch eines Asp gegen einen anderen Aminosäurerest aus Klasse III, wie beispielsweise Asn, Gln oder Glu, ein konservativer Austausch.
  • Während die Botulinum-Toxin-Aktivität mit elektrophysiologischen Assays, wie den aus dem Stand der Technik bekannten, gemessen werden kann, wird die Aktivität im Allgemeinen gemessen, indem das Toxin Kleintieren, wie z. B. Mäusen, injiziert und die Dosis bestimmt wird, die erforderlich ist, um durchschnittlich 50% der Tiere zu töten. Diese Dosis wird als „Letale Dosis 50” oder LD50 bezeichnet und ist als eine Einheit für die biologische Aktivität definiert. Dosismengen für therapeutische Anwendungen sind per Konvention nach solchen Einheiten in Abschnitt IIIB unten in weiteren Einzelheiten erörtert ist, können die verschiedenen Serotypen unterschiedliche therapeutische Wirksamkeit besitzen. Ausgehend von dieser Information und gemäß den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren können therapeutische Dosismengen titriert werden.
  • III. Zubereitung von Botulinum-Toxin
  • Dieser Abschnitt beschreibt Verfahren zum Zubereiten von Botulinum-Toxin zur Verwendung in der Formulierung gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • A. Reinigung von Botulinum-Toxin aus C. botulinum
  • Dieser Abschnitt stellt allgemeine Verfahren zum Zubereiten gereinigten Botulinum-Toxins aus Kulturen von C. botulinum am Beispiel von Botulinum-Toxin Typ B bereit. Außer den hierin spezifisch erwähnten Verfahren sind aus dem Stand der Technik alternative Verfahren zum Zubereiten von Botulinum-Toxin Typ A und B sowie der anderen bekannten Serotypen bekannt.
  • Wie oben erwähnt, ist der aktive Bestandteil in Formulierungen der vorliegenden Erfindung ein Proteinbestandteil von Extrakten aus C. botulinum, bekannt als Botulinum-Toxin, dessen aktiver Bestandteil ein Molekulargewicht zwischen zirka 145–170 kD hat und in der Regel in einem nativen Proteinkomplex vorliegt, der ein viel höheres Molekulargewicht hat. Dieser Abschnitt stellt beispielhafte Verfahren zur Reinigung der verschiedenen Botulinum-Toxine bereit, konzentriert sich allerdings auf die Botulinum-Toxin Serotypen A und B. Es ist selbstverständlich, dass die allgemeine wissenschaftliche Literatur Anleitungen für alternative Verfahren zum Reinigen der Toxine bereit stellt, und dass Fachleute in der Lage sind, solche Verfahren zu identifizieren und sie auf ein bestimmte Toxin anzuwenden, das zum Gebrauch in Formulierungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung zubereitet werden, gewünscht ist.
  • Im Allgemeinen wird Botulinum-Toxin Typ B als Komplex aus hochtitrigen Fermentationen von C. botulinum-Kulturen gemäß aus dem Stand der Technik bekannter Verfahren isoliert. Institutionen, die eine Lizenz vom Center for Disease Control (CDC) besitzen, können in den Vereinigten Staaten Stammkulturen erhalten, in anderen Ländern richtet sich dies nach der nationalen Gesetzgebung hinsichtlich der Verteilung des Organismus. Zur Reinigung von Botulinum-Toxin Typ B eignen sich als Ausgangsmaterial C. botulinum Okra oder Bean B. Gefrorene Stammkulturen werden in Kulturmedium, wie Thioglycollat-Medium oder Trypticase-Pepton-Medium, enthaltende Regagensröhrchen geimpft, die Kulturen gezüchtet und gemäß den unten und in der US-Patentschrift 5,696,077 ausführlich beschriebenen Verfahren weiterverarbeitet.
  • Kurz beschrieben werden die Kulturen gemäß aus dem Stand der Technik bekannter Verfahren vermehrt, um ausreichende Mengen von bakteriellem Ausgangsmaterial zu produzieren, um einen gewünschten Ertrag an Toxin zu erhalten. Im Allgemeinen sind zirka 20 Liter Bakterienkultur erforderlich, um 0,5 Gramm Toxin zu produzieren. Die Kultur wird auf Raumtemperatur gebracht und der pH-Wert der Kultur wird mit Schwefelsäure oder einer anderen geeigneten Säure auf pH 3,5 eingestellt. Der sich daraus ergebende Niederschlag wird absetzen gelassen und der klare Überstand dekantiert. Daraufhin wird unter Umrühren Calciumchlorid zu dem Niederschlag gegeben und das Volumen mit entionisiertem Wasser vergrößert, so dass die Endkonzentration an CaCl2 zirka 150 mM beträgt. Der pH-Wert wird bis fast in den Neutralbereich (pH 6,5) erhöht und die Toxinlösung durch Zentrifugieren geklärt. Durch Einstellen des pH-Wertes auf 3,7 wird das Toxin erneut ausgefällt. Der sich daraus ergebende Niederschlag wird absetzen gelassen und der toxische Niederschlag wird durch Zentrifugation gesammelt, dann in Puffer (pH 5,5) erneut gelöst und über Nacht gegen denselben Puffer ausgiebig dialysiert. Das dialysierte Toxin wird zentrifugiert und der sich ergebende Überstand durch eine Anionenaustauschsäule (DEAE) chromatographiert. Die nicht gebundene Fraktion wird gesammelt und der Proteingehalt wird ermittelt. Aus dieser Fraktion werden die Toxinkomplexe durch Zugabe von Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von zirka 60% ausgefällt. Das Pellet wird in Phosphatpuffer gelöst und gegen denselben Puffer (pH 6,5) dialysiert. Die gereinigte Toxinzubereitung kann dazu verwendet werden, die Formulierung zuzubereiten.
  • Aus dem Stand der Technik sind auch Verfahren zur Zubereitung von Botulinum-Toxin Typ A bekannt. So beschreiben beispielsweise Hambleton et al. (1981) und Melling et al. (1988) die Produktion und Reinigung von Botulinum-Toxin Typ A aus Clostridium botulinum Typ A NCTC 2916. Bakterienkulturen werden aus einem verifizierten Stamm vermehrt und in einen 30-l-Fermenters, der unter anaeroben Bedingungen betrieben wird, eingeimpfr, und zwar gemäß aus dem Stand der Technik bekannten Standardbedingungen. Der Toxinertrag wird ständig überwacht (z. B. durch Bestimmung der LD50), und wenn der Höchstertrag erreicht ist (zirka 2 × 106 Maus-LD50/ml), wird die Kultur angesäuert (mit 3 N H2SO4 auf pH 3,5 eingestellt) und das Toxin wird durch Zentrifugation geerntet. Das ausgefällte Rohtoxin wird erneut gelöst und mit 0,2 M Phosphatpuffer (pH 6,0) extrahiert, gefolgt von einer Behandlung mit Ribonuklease (100 μg/ml bei 34°C) und Ausfällen mit NH4SO4 (60%ige Sättigung bei 25°C). Der Niederschlag wird dann resuspendiert und einer DEAE-Sephacel-Ionenaustauschchromatographie bei pH 5,5 unterzogen (nach einer Voradsorption der Charge). Die Fraktionen werden hinsichtlich ihrer Aktivität überwacht, und aktive Fraktionen werden erneut mit NH4SO4 (60%ige Sättigung bei 25°C) ausgefällt. Der Niederschlag kann aufbewahrt und erneut gelöst werden, um eine Formulierung der Erfindung, wie hierin beschrieben, herzustellen.
  • Formulierungen der vorliegenden Erfindung beinhalten vorzugsweise den Toxinbindungskomplex, wie er gemäß den oben in Bezug auf Botulinum-Toxin Typ A und B beschriebenen Verfahren zubereitet wurde, oder nutzen äquivalente Formen der Botulinum-Toxin Typen C1, C2, D, E, F oder G, die gemäß den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren zubereitet wurden. Der Titer des Toxins wird durch serielle Verdünnung des rekonstituierten Toxinbindungskomplexes in ein Exzipientprotein, wie beispielsweise humanes Serumalbumin, bestimmt, wobei Blasenbildung und starke Bewegung, wie z. B. Mischen im Vortex, vermieden werden. Konventionsgemäß wird der Titer in einem Mäuse-Letalitäts-Test wie dem Maus-LD50-Test, beschrieben in Beispiel 2, bestimmt. Eine Arbeitsstammlösung wird verdünnt, aliquotiert und zur Aufbewahrung lyophylisiert. Diese Stammlösung wird verwendet, um in Tests Proteinkonzentration, LD50, Reinheitsgrad und pharmazeutische Eignung gemäß den aus dem Stand der Technik gut bekannten Verfahren, und wie in Beispiel 2 hierin beispielhaft aufgeführt, zu testen.
  • IV. Stabile Botulinum-Toxin-Formulierungen
  • Es ist die Entdeckung der vorliegenden Erfindung, dass Botulinum-Toxin in einer stabilen Flüssigformulierung hergestellt und aufbewahrt werden kann, die ihre pharmakologische Wirksamkeit über einen erweiterten Zeitraum beibehält, z. B. für mindestens 1–2 Jahre bei „Kühlschrank”-Temperaturen (z. B. bei zirka 5 ± 3°C oder spezifischer bei zirka 4 ± 2°C oder allgemeiner bei 0–10°C) oder mindestens zirka 6 Monate bei „Raumtemperatur” (z. B. bei etwa 25°C oder allgemeiner bei 10–30°C). Eine solche Formulierung kann ohne weitere Rekonstitution durch den Arzt bequem an Menschen oder andere Säugetierspezies als Pharmazeutikum verabreicht werden. Die Formulierung ist gekennzeichnet durch einen pH-Wert zwischen zirka pH 5 und 6, vorzugsweise zirka pH 5,5–5,6, der durch geeignete Pufferkonditionen beibehalten wird. Die Formulierung kann auch eines oder mehr Exzipientproteine enthaften.
  • Beispiel 1 gibt Einzelheiten zur Zubereitung einer Formulierung von Botulinum-Toxin (Typ B) einer Konzentration von 5.000 E/ml. Es ist selbstverständlich, dass solche Formulierungsbedingungen auf andere Serotypen von Botulinum-Toxin angewandt werden können, wie z. B. auf Botulinum-Toxin Typ A, und zwar in den für solche Serotypen erforderlichen Konzentrationen, um stabile Formulierungen in praktischen Dosierungsverpackungen bereit zu stellen.
  • Kurz beschrieben, es wird eine konzentrierte Zubereitung von Botulinum-Toxin, wie z. B. die oben unter Bezugnahme auf die Typen A und B beschriebene Toxinzubereitung, mit einem Verdünnungsmittel, wie z. B. Succinatpuffer mit einem pH-Wert zwischen pH 5 und pH 6, vorzugsweise zirka pH 5,6, vergemischt. Im Falle von Botulinum-Toxin Typ B, ist eine Konzentration von zirka 5.000 E/ml, wie im Maus-LD50-Test bestimmt, wünschenswert; je nach der zu verabreichenden Dosis kann jedoch alles im Bereich von 100–20.000 E/ml oder sogar höher benötigt oder wünschenswert sein. Im Falle von Botulinum-Toxin Typ A können Konzentrationen von 20–2.000 und vorzugsweise zirka 100–1.000 E/ml praktisch sein. Für den pharmazeutischen Fertigungsprozess wird eine Probe der Formulierung auf Vorhandensein möglicher mikrobieller Verunreinigungen (Biobelastung) getestet und steril in Glas- oder Polypropylenfläschchen filtriert, um an Patienten verteilt zu werden. Das Endprodukt kann als Flüssigkeit für mindestens ein Jahr und vorzugsweise für mehr als zwei Jahre bei 0–10°C ohne signifikanten Verlust der pharmakologischen Wirksamkeit aufbewahrt werden, wie durch einen Verlust der pharmakologischen Wirksamkeit von < 20% im Maus-LD50-Test erwiesen wurde (Beispiel 2).
  • Das oben erwähnte Verdünnungsmittel kann jede pharmazeutisch akzeptable Flüssigkeit sein, welche die Stabilität des Komplexes nicht nachteilig beeinflusst und welche einen stabilen pH-Bereich zwischen zirka pH 5 und pH 6 unterstützt. Beispiele für besonders geeignete Puffer beinhalten Succinat- und Phosphatpuffer; Fachleute werden jedoch erkennen, dass Formulierungen der Erfindung nicht auf einen bestimmten Puffer begrenzt sind, so lange, wie der Puffer in dem angezeigten Bereich ein akzeptables Maß an pH-Stabilität oder „Pufferkapazität” gewährleistet. Ein Puffer hat im Allgemeinen innerhalb von zirka 1 pH-Einheit seines pK-Werts eine adäquate Pufferkapazität (Lachmann et al., 1986). In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung beinhaltet dies Puffer mit pK-Werten im Bereich von zirka 4,5–6,5. Die Eignung von Puffern kann auf der Basis von veröffentlichten pK-Tabellen geschätzt oder durch aus dem Stand der Technik wohl bekannte Verfahren empirisch bestimmt werden. Außer den oben erwähnten Succinat- und Phosphatpuffern schließen andere pharmazeutisch einsetzbare Puffer Acetat, Aconitat, Malat und Carbonat ein (Lachman). Der pH-Wert der Lösung kann auf den gewünschten Endpunkt innerhalb des Bereiches eingestellt werden, und zwar mit jeder pharmazeutisch akzeptablen Säure, z. B. Salzsäure oder Schwefelsäure, oder Base, z. B. Natriumhydroxid.
  • Das zu der Formulierung gegebene Exzipientprotein ist Serumalbumin. Humanes Serumalbumin eignet sich beispielsweise gut für die Verwendung in pharmazeutischen Formulierungen, die an Menschen verabreicht werden; im Gegensatz wird für die Verwendung in Rindern Rinderserumalbumin ausgewählt. Der Exzipient ist in der Formulierung in ausreichender Konzentration vorhanden, um eine Adsorption des Toxinproteinkomplexes an das Inhaltsgefäß- oder -fläschchen zu vermeiden. Die Konzentration des Exzipienten variiert je nach Art des Exzipienten und der Konzentration des Toxinkomplexes in der Formulierung. In Studien, die zur Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, wurde beispielsweise bestimmt, dass eine Konzentration von 0,5 mg/ml humanes Serumalbumin für Formulierungen mit 5.000 E/ml Botulinum-Toxin Typ B ausreichend ist, und dabei bei den meisten Menschen keine signifikanten immunologischen oder allergischen Reaktionen hervorruft; im Allgemeinen sollten Konzentrationen von zwischen zirka 0,05 mg und 1 mg pro 1.000 Einheiten Botulinum-Toxin B ausreichenden Schutz gewährleisten.
  • Es sind auch geeignete Exzipientkonzentrationen zum Stabilisieren von Botulinum-Toxin Typ A beschrieben worden. So wird „BOTOX®” beispielsweise durch Zugabe von 0,5 mg Albumin pro 100 Einheiten Toxinaktivität (PDR) stabilisiert.
  • V. Verwendung
  • A. Therapeutische und kosmetische Verwendungen von Botulinum-Toxin-Formulierungen
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können für eine Zahl von Indikationen verwendet werden, bei denen die Hemmung oder Blockade der cholinergen Neurotransmission wünschenswert ist, besonders, jedoch nicht ausschließlich die cholinerge Transmission in Verbindung mit der Kontrolle von glatten Muskeln oder Skelettmuskeln. Dieser Abschnitt gibt Beispiele für Erkrankungen, bei denen Formulierungen der Erfindung therapeutisch verwendet werden können; die hierin gegebenen Beispiele sind jedoch nicht als Einschränkung der Erfindung auszulegen. In Teil B unten sind repräsentative Dosismengen und Verabreichungswege für einige dieser Indikationen beschrieben.
  • Botulinum-Toxin, insbesondere Botulinum-Toxin Typ A, erwies sich als effektive Behandlung für spastische Muskelerkrankungen. Eine einzelne Behandlung (die mehrere intramuskuläre Injektionen einschließen kann) kann unkontrollierbare Muskelspasmen bis zu sieben Monate lang lindern. So ist „BOTOX®” (Botulinum-Toxin Typ A) beispielsweise von der US-amerikanischen Food and Drug Administration für lokalisierte Injektionen in die Augenhöhle zur Behandlung von Blepharospasmen zugelassen. Andere Indikationen beinhalten andere fokale Dystonien, wie z. B. Kehlkopfdystonie, Meige's Syndrom (Mund- und Unterkieferdystonie; orofaziale Dyskinesie), krampfartiger Schiefhals (Hardman et al., 1996), Gliedmaßen-Dystonie, Animus, Dyssynergien der Harnentleer- und schließmuskulatur, Blepharospasmen, Schielen, halbseitige Gesichtsspasmen sowie Hydrorrhoea nasalis, Mittelohrentzündung, exzessive Speichelbildung, Asthma, spastischer Darmkatarrh, exzessive Magensäuresekretion (siehe z. B. US-Patentschrift 5,766,005 ), Kopfschmerzen in Verbindung mit Migräne, Gefäßstörungen, Neuralgie oder Neuropathie ( US-Patentschrift 5,714,468 ; WO 953041 ), Gelenksentzündungsschmerzen ( WO 9517904 ), Erkrankungen des Magendarmtraktes mit Einbeziehung gestreifter oder glatter Muskeln ( US-Patentschrift 5,674,205 ), Entspannung des Beckenbodens während der Geburt eines Kindes ( US-Patentschrift 5,562,899 ) oder Linderung von Zähneknirschen ( US-Patentschrift 5,298,019 ). Botulinum-Toxin Typ A wurde auch lokal injiziert, um kosmetische Linderung der Muskelspannung zu erzielen, die „Stirnrunzeln” im Gesicht hervorruft, sowie zur Anhebung der Augenbrauen (Frankel, 1998), und es erwies sich als nützlich, wenn es zur Behandlung einer fokalen Hyperhidrose (exzessive Schweißabsonderung) intrakutan injiziert wurde ( WO 9528171 ; US-Patentschrift 5,766,605 ) sowie zur Behandlung einer Wirbelsäulenverkrümmung im Jugendalter ( US-Patentschrift 5,053,005 ), einer Kinderlähmung im Erwachsenen- und Jugendalter ( US-Patentschrift 5,298,019 ; WO 9305800 ) sowie von Spasmen und unwillkürlichen Kontraktionen, hervorgerufen durch Kinderlähmung, multiple Sklerose oder die Parkinson Krankheit ( US-Patentschrift 5,183,462 ).
  • In Experimenten, die als Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, wurden stabile Flüssigformulierungen, die Botulinum-Toxin Typ B enthielten, getestet und als wirksam bei Dystonie des Halses, auch bekannt als krampfartiger Schiefhals, befunden, einem Zustand, bei dem eine Person unwillkürliche Spasmen und Muskelkontraktionen von Kopf, Hals und Wirbelsäule erlebt, was zu Dreh- oder Neigebewegungen des Kopfes führt. Dieser Zustand ist häufig begleitet von Zittern und Schmerzen in den Skelettmuskeln. Die Ätiologie der Erkrankung ist im Allgemeinen unbekannt; es wird jedoch erwogen, sie sei das Ergebnis einer Fehlfunktion des zentralen Nervensystems, was zu einer Hyperaktivität der involvierten Muskulatur führt. Derzeitige Behandlungen, einschließlich anticholinerger, dopaminerger, muskelentspannender, krampflösender und antiepileptischer Medikamente, bieten keine anhaltende Linderung. Botulinum-Toxin Typ B ist bei der Behandlung dieses Zustandes wirksam, indem es eine lokale Lähmung oder Parese verursacht, die typischerweise zirka 1 Woche nach der Injektion einsetzt und zirka 1 bis 4 Monate anhält.
  • Formulierungen der anderen Botulinum-Toxin Serotypen sind nützlich zur Primärbehandlung eines jeden der zuvor unter Bezugnahme auf Typ A beschriebenen Zustände. Zusätzlich sind die Typen B bis G von Botulinum-Toxin, wie oben erwähnt, ebenfalls nützlich für die Behandlung von Patienten, die gegen Behandlung mit Botulinum-Toxin Typ A aufgrund des Vorhandenseins einer Immunantwort gegen das Toxin unempfindlich geworden sind. Im umgekehrten Fall kann der Serotyp A bei Patienten verwendet werden, die gegen Serotyp B oder einen der anderen Toxinserotypen unempfindlich geworden sind. Gemäß der vorliegenden Erfindung können Formulierungen eines oder mehrerer Botulinum-Toxin Serotypen hergestellt und verwendet werden.
  • Es ist im Allgemeinen anerkannt, dass die verschiedenen Botulinum-Toxin Typen angesichts ihrer ähnlichen biologischen Wirkung bei der Behandlung verschiedener Erkrankungen, besonders derjenigen in Bezug auf Muskelspasmen, im Wechsel eingesetzt werden können. Nichtsdestotrotz können sich, wie unten beschrieben und in Bezug auf Typ A und B, die wirksamen Dosismengen (ausgedrückt als LD50-Einheiten oder biologische Einheiten) der verschiedenen Serotypen erheblich unterscheiden. Schätzungen der äquivalenten Dosismengen können auf der Basis der bekannten Dosismengen, die bezüglich eines jeden der getesteten Toxine beschrieben sind, gemacht werden.
  • B. Dosismengen und Verabreichungswege
  • Botulinum-Toxin ist bei Tieren als wirksames und manchmal tödliches Toxin bekannt. Wird jedoch ausreichende Sorgfalt bei der Anpassung des Verabreichungsweges und der Dosierung angewandt, so kann dieses Arzneimittel dennoch ohne Bedenken für Menschen verwendet werden.
  • Die Dosismengen der verschiedenen Formen von Botulinum-Toxin unterscheiden sich je nach Serotyp des verwendeten Toxins. So wurde in zur Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführten Experimenten beim Vergleich der Maus-LD50-Einheiten herausgefunden, dass Botulinum-Toxin Typ A („BOTOX®”) beim Auslösen einer Lähmung bei Affen zirka 4–6 Mal wirksamer ist als Typ B des Toxins, wie durch elektrophysiologische Messungen ausgewählter Skelettmuskeln bestimmt wurde. Diese Beobachtung stimmt überein mit experimentellen Ergebnissen an Ratten, die große Unterschiede in Bezug auf die zum Produzieren einer Lähmung von Rattengliedmaßen erforderliche Menge der beiden Toxine aufzeigte (Sellin; Jackson). Angesichts dieser Beobachtungen können angemessene äquivalente Dosismengen geschätzt oder von einem erfahrenen Praktiker empirisch bestimmt werden.
  • Die empfohlene Dosierung kann auch gemäß der Krankengeschichte des Patienten variieren. So wurde beispielsweise berichtet, dass Patienten, die wiederholte Dosierungen von Botulinum-Toxin Typ A erhalten haben, gegen eine weitere Behandlung „unempfindlich” werden und größere Dosismengen benötigen, um über die Zeit eine äquivalente Wirkung zu produzieren. Ohne Festlegung auf einen bestimmten Wirkungsmechanismus wird angenommen, dass dieses Phänomen mit der Entwicklung einer serotypspezifischen Immunantwort in dem Patienten zusammenhängt. Berichte über die Inzidenz von Antikörpern bei Patienten, die sich einer wiederholten Botulinum-Toxin-Typ-A-Therapie unterziehen, reichen von zirka 3% bis 57%. Dem gemäß wird empfohlen, dass für den Fall, dass sich ein Kliniker entscheidet, die Serotypen während einer Behandlung zu wechseln, die anfängliche Dosis des neuen Serotyps auf der Basis eines nie zuvor behandelten Patienten berechnet wird und nicht auf der Basis der Dosismenge, die der Patient zuvor erhalten hat.
  • Angemessene Verfahren zur Verabreichung beinhalten alle, die zu einer gezielten Verabreichung des aktiven Toxinbestandteils in das Gewebe, das von Interesse ist, führen, ohne schwere Nebenwirkungen für den Patienten zu verursachen. Solche Verfahren beinhalten, ohne Einschränkung, intramuskuläre (i. m.) Injektion, oberflächliche Verabreichung, subdermale und perineurale Verabreichung, Iontophorese und ähnliche. Spezifische Vorgehensweisen zur Verabreichung von Botulinum-Toxinen, einschließlich Maßnahmen zur Begrenzung der systemischen Verteilung der aktiven Bestandteile, sind aus dem Stand der Technik gut bekannt. Zur Identifizierung und genaueren Lokalisierung spezifischer Muskelgruppen kann eine Elektromyograhie angewandt werden, insbesondere bei Behandlungen, an denen Muskeln beteiligt sind, die schwierig zu identifizieren sind, wie die in der Augenhöhle, im Kehlkopf oder im Pterygoideusbereich liegenden, sowie Muskeln bei übergewichtigen Personen.
  • Die Behandlung von Dystonien wird in der Regel durch Verabreichung des Toxins in die Nähe der Bereiche der Innervierung des betroffenen Muskels erreicht, in der Regel durch intramuskuläre Injektion mit einer hypodermischen Kanüle. Die darauf folgende lokalisierte Lähmung kann dem Patienten für bis zu 3 oder 4 Monate Linderung verschaffen. Patienten können mit geringeren Dosismengen getestet und individuell bis zu einer optimalen Dosis hochtitriert werden, um eine ausreichende neuromuskuläre Blockade zu erreichen und eine jede Dysfunktion ohne Produktion einer bloßen Lähmung zu korrigieren. Wird der Patient unempfindlich gegen das Toxin, können Veränderungen der Dosierung angezeigt sein. Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist der, dass sie ein häufiges Dosierungsproblem in Zusammenhang mit der Instabilität des Toxinmaterials in Lösung überwindet, die zu weiteren Unklarheiten in Bezug auf die angemessene Dosis führen kann.
  • Für eine Reihe von Indikationen sind Empfehlungen für Dosismengen von Botulinum-Toxin Typ A bestimmt worden und im Stand der Technik bekannt. Zur Behandlung von Schielen ist beispielsweise eine Dosismenge von 1,25 bis 2,5 Einheiten Botulinum-Toxin Typ A zur Verabreichung in vertikale Muskeln und für ein horizontales Schielen von weniger als 20 Dioptrien empfohlen; 2,5–5 Einheiten werden empfohlen für horizontalen Strabismus mit mehr als 20 Prismendioptrien (Physician's Desk Reference, 51st Edition).
  • Botulinum-Toxin Typ A bei einer Dosis von 1,25–2,5 Einheiten wird auch zur Behandlung von Blepharospasmen verwendet, injiziert mit einer Injektionsnadel der Größe 27–30 Gauge in den medialen und lateral-prätarsalen Musculus orbicularis oculi des Oberlids und in den lateral-prätarsalen Musculus orbicularis oculi des Unterlids. Behandlungen dauern erwartungsgemäß zirka 3 Monate; bei wiederholter Dosierung und je nach Ansprechen des Patienten kann die Dosierung bis zum Doppelten erhöht werden. Es wird empfohlen, dass über einen Zeitraum von 30 Tagen nicht mehr als insgesamt 200 Einheiten Botulinum-Toxin Typ A verabreicht werden (Physician's Desk Reference, 51st Edition).
  • Beispiel 3 gibt ein Beispiel für Dosierungsbereichstudien zur Verwendung von Botulinum-Toxin Typ B in einer Formulierung gemäß der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von zervikaler Dystonie (krampfartiger Schiefhals). In diesen Studien, wie auch unten ausgeführt, wurde die erfindungsgemäße Flüssigformulierung von Botulinum-Toxin Typ B den verabreichenden Ärzten bereit gestellt und zwar zusammen mit Anweisungen, die Formulierung in einem Klinikkühlschrank mit Temperaturkontrolle zwischen 2 und 8°C aufzubewahren. Im Allgemeinen stammte die Formulierung aus zubereiteten Chargen und wurde 6–12 Monate lang bei der empfohlenen Temperatur aufbewahrt. Die Menge der Formulierung, die die Kliniker erhielten, war für zirka 6 Monate ausreichend.
  • Kurz beschrieben, den Patienten wurden verschiedene Dosismengen an Toxin durch intramuskuläre (i. m.) Injektion in 2–4 oberflächliche Muskelgruppen des Halses und/oder der Schultern verabreicht, was entsprechend der Evaluierung der Muskelbeteiligung an der Erkrankung durch den Kliniker bestimmt wurde. In einer Studie wurden individuell aufgeteilte Dosismengen im Bereich von 100–1.200 Einheiten gegeben, wobei die kumulativen Dosismengen in einem Zeitraum von bis zu 398 Tagen zwischen 270 und 2.280 Einheiten betrugen. Bei allen Patienten kam es während der Studie zu einer Verbesserung, und im Verlauf der Studie wurde keine Minderung der pharmakologischen Wirksamkeit der Formulierung beobachtet.
  • Weitere, zur Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt Studien ergaben, dass Patienten, welche gegen Botulinum-Toxin Typ A resistent geworden waren, mit Botulinum-Toxin Typ B behandelt werden können. Patienten, die an dieser Studie teilnahmen, erfuhren ein vermindertes Ansprechen auf Botulinum-Toxin Typ A und wurden als erfolgreich behandelt eingestuft, wenn sie nach der Behandlung eine mindestens 25%ige Verringerung der Gesamtbewertung (Verringerung = Verbesserung) zeigten, wie mit der Toronto Western Spasmodic Torticollis-Bewertungsskala (TWSTRS; Consky, 1994) durch Vergleich mit dem Ausgangswert bestimmt wurde. Verabreicht wurden individuelle Dosismengen zwischen 150 und 1.430 Einheiten der Botulinum-Toxin Typ B-Formulierung, wobei über einen Zeitraum von bis zu 117 Tagen eine kumulative Dosis von 300 bis 12.000 Einheiten verabreicht wurde, wie in Beispiel 3 ausführlich ausgeführt ist. Die Patienten erfuhren in dieser Studie insgesamt eine Verbesserung, vor allem bei höheren Dosismengen, und es gab keine Hinweise auf die Entwicklung von blockierenden Antikörpern gegen Botulinum-Toxin Typ B und keine Hinweise auf Minderung der pharmakologischen Wirksamkeit der Formulierung. In einer weiteren Studie wurden periodisch bis zu 203 Tage lang individuelle Dosismengen von 0, 400, 1.200 und 2.400 Einheiten der Botulinum-Toxin Typ B-Formulierung verabreicht, und zwar, wie oben beschrieben, mit Erfolg in der Behandlung eines krampfartigen Schiefhalses.
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, sollen diese aber in keiner Weise einschränken.
  • BEISPIELE
  • Materialien
  • Es sei denn, es ist anders angegeben, können alle hierin beschrieben Reagenzien von jedem angesehenen kommerziellen Lieferanten bezogen werden, der Reagenzien zur Verwendung in der chemischen, biochemischen, biotechnologischen oder pharmazeutischen Industrie, wie jeweils anwendbar, verkauft.
  • Beispiel 1: Zubereitung einer stabilen Botulinum-Toxin-Fomulierung
  • A. Zubereitung von Succinatpuffer
  • Succinatpuffer wurde in 3-Liter-Chargen mit 2,7 mg/ml Dinatriumsuccinat und 5,8 mg/ml Natriumschlorid hergestellt, ergänzt durch 0,5 mg/ml humanes Serumalbumin (Michigan Biological Products Institute). Der pH-Wert des Puffers wurde mit konzentrierter Salzsäure auf 5,6 eingestellt. Der Puffer wurde durch einen 0,2 μm-Filter in einen autoklavierten, versiegelten Behälter filtriert. Vor der Verwendung wurde dem Puffer eine Probe entnommen und der pH-Wert, sowie bakterielles Endotoxin und Biobelastung getestet.
  • B. Zubereitung der Botulinum-Toxin-Formulierung
  • Ein Aliquot des konzentrierten Botulinum-Toxin Typ B wurde mit Succinatpuffer (pH 5,6) etwa 1.000-fach verdünnt, um eine pharmakologische Wirksamkeit von 5.000 ± 1.000 E/ml zu erhalten. Das verdünnte Toxin wurde in verschlossenen 2-Liter-Behältern aufbewahrt und wird als „Bulk-Lösung” bezeichnet. Es wurde bei 5 ± 3°C aufbewahrt, bis das Material zum Abfüllen verschickt wurde.
  • Vor dem Abfüllen wurde eine Probe aus der Bulk-Lösung entnommen und auf Vorhandensein mikrobieller Verunreinigungen (Biobelastung) gemäß aus dem Stand der Technik bekannter Standardverfahren getestet. Sie wurde dann mittels einer peristaltischen Pumpe durch einen für medizinische Anwendungen geeigneten Schlauch übertragen und steril in eine sterile Empfangsvorrichtung filtriert (0,2 μm), die sich im Abfüllraum befand. Die resultierende, steril filtrierte Bulk-Lösung wurde in Aliquots von jeweils 0,5 ml (2.500 E), 1 ml (5.000 E) oder 2 ml (10.000 E) in 3,5 ml Glasbehälter abgefüllt.
  • Die Zusammensetzung des Endproduktes im Behälter ist in Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1 Zusammensetzung der Botulinum-Toxin-Formulierung
    Aktiver Bestandteil Inaktiver Bestandteil Konzentration
    Botulinum-Toxin Typ B - 5.000 ± 1.000 LD50-E/ml
    - Succinat, USP 10 mM
    - Natriumchlorid, USP 100 mM
    - Humanalbumin, zugelassen von der FDA 0,5 mg/ml
    - Salzsäure, NF Zur pH-Einstellung
  • Beispiel 2: Testung der Stabilität der Botulinum-Toxin-Formulierung
  • A. Stabilitätsergebnisse
  • Botulinum-Toxin Typ B wurde hergestellt, wie oben beschrieben, auf eine Konzentration von 2500 E/ml verdünnt und in Aliquots von 1 ml bei 5°C und bis zu 30 Monate lang in 5 ml-Glasfläschchen aufbewahrt. 0, 1, 3, 6, 9, 12, 18, 24 und 30 Monate nach Beginn der Aufbewahrung wurden zufällig Aliquots ausgewählt und deren pharmakologische Wirksamkeit im Maus-LD50-Test getestet. Das Aussehen der Lösungen und deren pH-Wert wurden mit Standardverfahren überprüft.
  • Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der Testung von Aliquots, die zu verschiedenen Zeitpunkten entfernt wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass Formulierungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung zubereitet sind, mindestens 30 Monate stabil sind, wenn sie bei 5°C aufbewahrt werden, wie sich an der pharmakologischen Wirksamkeit zeigte, die innerhalb des Bereichs der pharmakologischen Wirksamkeit, die zum Zeitpunkt 0 erfaßt wurde, zeigte. TABELLE 2 Stabilität der Formulierung bei 5°C
    Aufbewahrungsdauer (Monate) Pharmakologische Wirksamkeit (Mittelwert; E/ml) pH-Wert Aussehena
    0 1.750–3.250 5,5 Bestanden
    1 1.941 NDb ND
    3 2.541 5,6 ND
    6 2.020 5,6 Bestanden
    9 2.357 5,6 Bestanden
    12 2.064 5,6 Bestanden
    18 2.318 5,4 Bestanden
    24 1.799 5,6 Bestanden
    30 2.101 5,6 Bestanden
    • a
    Bestanden = klar; farblose bis hellgelbe Lösung; im Wesentlichen frei von sichtbaren Partikeln
    b
    Test nicht durchgeführt.
  • Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse der Testung von Aliquots der Botulinum-Toxin-Typ B-Formulierung, die wie oben beschrieben zubereitet und aliquotiert, aber bei 25°C aufbewahrt wird. Die Ergebnisse zeigen, dass die Formulierung mindestens 6 Monate bei 25°C stabil ist, wie sich an der pharmakologischen Wirksamkeit zeigte, die mindestens ca. 90%, und vorzugsweise mindestens 95%, nach 6 Monaten Aufbewahrung, und mindestens 75% der anfänglichen pharmakologischen Wirksamkeit nach 9 Monaten Aufbewahrung bei 25°C behält. TABELLE 3 Stabilität der Formulierung bei 25°C
    Aufbewahrungsdauer (Monate) Pharmakologische Wirksamkeit (Mittelwert; E/ml) pH-Wert Aussehena
    0 1.941 5,5 Bestanden
    1 2.297 5,6 NDb
    2 1.935 5,6 ND
    3 2.017 5,6 ND
    6 1.909 ND Bestanden
    9 1.579 5,6 Bestanden
    • a
    Bestanden = klar; farblose bis hellgelbe Lösung; im Wesentlichen frei von sichtbaren Partikeln
    b
    Test nicht durchgeführt.
  • B. Stabilitätstests
  • 1. Bestimmung des pH-Wertes der Botulinum-Toxin-Formulierung
  • Der pH-Wert der Formulierung von Botulinum-Toxin Typ B wurde mit einem Accumet pH-Meter, Modell 50, von Fisher Scientific mit einer Sonde mit automatischer Temperaturkompensation gemessen. Die Elektrode war eine Kombinationselektrode von Orion Ross mit einer KCl-Referenzelektrode. Die pH-Bestimmung wurde mit einer standardmäßigen Zwei-Punkte-Standardisierung (pH 4,0, pH 7,0) gemäß der Anleitung des Herstellers durchgeführt. Für jede Probe wurden drei Messungen durchgeführt. Die pH-Werte wurden zu zwei signifikanten Zahlenangaben aufgezeichnet und der Mittelwert ermittelt.
  • 2. Maus-LD50-Test der pharmakologischen Wirksamkeit
  • Zur Bestimmung der LD50 wurden gesunde, nicht benutzte, männliche und weibliche CFW- oder CD-1-Mäuse mit einem Gewicht von 18 bis 22 g verwendet. Jedes abgefüllte Produkt wurde in 5 Dosierungen der Botulinum-Toxin Typ B-Formulierung an den Mäusen getestet. Jeder Test wurde fünf Mal wiederholt.
  • Von der Testprobe wurden zwei Stammlösungen zubereitet. Stammlösung A wurde erhalten, indem die Testprobe mit Gelatine-Phosphatpuffer, pH 6,2, auf eine geschätzte pharmakologische Wirksamkeit von 750 E/ml verdünnt wurde. Stammlösung B wurde erhalten, indem Lösung A 10-fach auf 75 E/ml verdünnt wurde. Aus Stammlösung A wurden die folgenden Testverdünnungen zubereitet: 1:7,5, 1:10, 1:13,5, 1:18 und 1:24,3.
  • Den Mäusen wurden intraperitoneale Injektionen von 0,2 ml der angemessenen Verdünnung der Mischung verabreicht. Die Mäuse wurden nach der Injektion für 4 Tage gehalten und jeden Tag beobachtet. Tote Mäuse wurden dokumentiert. Die Beobachtungen wurden nach vier Tagen beendet.
  • Indem die Anzahl der toten Mäuse von der höchsten Verdünnung an nach oben addiert wurde, wurde bei den verschiedenen Verdünnungsstufen die kumulative Sterberate (cumulative deaths; CD) berechnet. Die kumulative Überlebensrate (cumulative survivors; CS) wurde berechnet, indem die Zahl der Überlebenden von der kleinsten Verdünnung an nach unten addiert wurde. Für jede Verdünnung wurde die%CD als CD/(CD + CS) × 100% berechnet. Die der LD50 entsprechende Verdünnung wurde anhand der Proportional-Distance(PD)-Methode von Reed und Muench bestimmt, und zwar unter Verwendung der Verdünnungen, die%CD-Werte produzieren, welche eine kumulative Sterberate von 50% einrahmen.
    Figure 00220001
  • Der so erhaltene PD-Wert wurde mit der logarithmischen Differenz zwischen den Verdünnungsstufen, die die 50%-CD einrahmen, multipliziert. Dieser Wert wurde zum Logarithmus der Verdünnung addiert, bei der die Mortalität (CD) größer als 50 war, um die Verdünnung zu erhalten, die der LD50 entspricht. Um die Anzahl der LD50-Einheiten an Toxin pro Injektionsvolumen (0,2 ml) zu erhalten, wurde der umgekehrte Logarithmus der Verdünnung berechnet. Diese Zahl wurde dann mit 5 multipliziert, um die LD50-Einheiten pro ml der Stammlösung B des Toxins zu erhalten.
  • Die LD50-Einheiten pro ml der Stammlösung B wurden mit deren Verdünnungsfaktor (z. B. der Verdünnung, die zum Produzieren einer geschätzten pharmakologischen Wirksamkeit von 75 E/ml erforderlich ist) multipliziert, um die pharmakologische Wirksamkeit der Probe zu erhalten. Für 5 valide Tests wurde das arithmetische Mittel und die Standardabweichung von LD50-Einheiten pro ml berechnet.
  • 3. Aussehen der Formulierung
  • Das Aussehen wurde nach vorsichtigem Durchmischen durch visuelle Inspektion gegen schwarze und weiße Hintergründe unter hellem Licht bestimmt. Beurteilt wurden Farbe, Klarheit und Vorhandensein sichtbarer Partikel.
  • Beispiel 3: Behandlung einer Dystonie des Halses
  • A. Arzneimittelverdünnung, -berechnung, -verabreichung und -dosierungsschema
  • 1. Handhabung des Arzneimittels
  • Fläschchen mit dem Arzneimittel wurden gefüllt, um 2,0 ml (10.000 E), 1,0 ml (5.000 E) oder 0,5 ml (2.500 E) des unverdünnten Studienarzneimittels zu liefern. Bei allen Handhabungsschritten wurde starkes Schütteln oder Blasenbildung vermieden, da Botulinum-Toxin durch diese Zustände denaturiert werden kann. Die Formulierung wurde mit einer 1 ml-Tuberkulin-Spritze aus dem Fläschchen entnommen, wobei sichergestellt wurde, dass das exakte Volumen entnommen wurde.
  • 2. Arzneimittelberechnung
  • Botulinum-Toxin Typ B wurde Patienten mit einer Dystonie des Halses verabreicht, indem der Inhalt des angemessenen Fläschchens/der angemessenen Fläschchen verabreicht wurde/wurden, um die in der Tabelle unten angegebenen Dosismengen bereit zu stellen. Die Maus-Einheiten (E) zur Dosissteigerung sind wie folgt berechnet, wobei IE die Menge an der LD50 entsprechendem Toxin ist, was, wie in Beispiel 2 beschrieben, an Mäusen bestimmt wurde.
  • Wie unten ausführlich ausgeführt, wurde bei jeder Dosierungssitzung Botulinum-Toxin Typ B gemäß Standardverfahren verabreicht. Injektionen der Mischung wurden von einem Neurologen vorgenommen, der zuvor in der therapeutischen Anwendung von Botulinum-Toxin bei Patienten mit Dystonie des Halses geschult worden war. Die Patienten wurden gebeten, sich so weit wie möglich zu entspannen, um die Beobachtung der Haltung des Kopfes und des Halses im Ruhezustand zu erleichtern. Es wurde eine Bestimmung der an der Produktion der Dystonie des Halses beteiligten Halsmuskeln vorgenommen und durch Abtasten der beteiligten Muskeln bestätigt. Je nach Ermessen des Untersuchenden wurde eine EMG-Evaluierung vorgenommen, um die hauptsächlich betroffenen Muskeln noch besser zu lokalisieren. Die zur Behandlung in diesem Prüfplan in Betracht gezogenen Muskeln sind der Musculus levator scapulae, der Musculus scalenus medius und anterior, der Musculus semispinalis capitis, der Musculus splenius capitis, der Musculus sternocleidomastoideus und der Musculus trapezius. In jeden dieser Muskeln wurden an 1 bis 5 Stellen Injektionen vorgenommen. Insgesamt betrug das Injektionsvolumen pro Stelle weniger oder gleich 1,0 ml, um eine lokale Gewebsverzerrung zu vermeiden, jedoch mindestens 0,1 ml, um die genaue Volumenmessung mit einer standardmäßigen 1,0 ml-Spritze zu erleichtern. Zu Beginn erhielten die Patienten eine Gesamtdosis von 5.000 E, bei Nachfolgebesuchen in der Klinik Folgedosismengen von bis zu zirka 15.000 E.
  • B. Klinische Studie der Dystonie des Halses
  • 1. Studie 1
  • Acht Patienten (3 Männer, 5 Frauen) des Durchschnittsalters von 43,9 Jahren und individueller klinischer Diagnose einer idiopathischen Dystonie des Halses nahmen an einer Studie teil, bei der Botulinum-Toxin Typ B-Formulierung in 2–4 oberflächliche Muskelgruppen des Halses und/oder der Schultern injiziert wurde. Die Patienten konnten in Abständen von bis zu 4 Wochen behandelt werden, vorausgesetzt, es lagen bei der Präsentation keine schweren Nebenwirkungen oder eine anhaltende klinische Verbesserung vor. Die Patienten nahmen an 1–5 Dosierungssitzungen teil. Individuelle Dosierungssitzungen reichten von 100 E bis 1.200 E, wobei die kumulative Gesamtdosis, wie hierin beschrieben, von 270 E bis 2.280 E Botulinum-Toxin Typ B-Formulierung reichte. Wirksamkeit wurde mithilfe der Tsui-Torticollis-Skala berechnet (Tsui, J. K. C. (1986), Lancet 2: 245–247). Die Patienten nahmen 127 bis 398 Tage an der Studie teil, die durchschnittliche Teilnahmedauer betrug 244,8 Tage. Die Ausgangswerte der Torticollis-Skala waren ähnlich und alle Patienten erfuhren bei Vergleich der Gesamtdosismengen eine mäßige Verringerung der Bewertung (Verringerung = Verbesserung) mit einigen Anzeichen eines dosisbezogenen Trends. Generell erfuhren die Patienten eine Verbesserung ihres krampfartigen Schiefhalses. Es gab keine Anzeichen der Entwicklung blockierender Antikörper in dieser Studie.
  • 2. Studie 2
  • Patienten, die an dieser Studie teilnahmen, hatten eine klinische Diagnose einer idiopathischen Dystonie des Halses (krampfartiger Schiefhals) und hatten eine Unempfindlichkeit gegen Botulinum-Toxin Typ A entwickelt. Die Patienten erhielten in 2–4 oberflächliche Hals- und Schultermuskeln intramuskuläre Injektionen der Botulinum-Toxin Typ B-Formulierung gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • Zwölf Patienten (Durchschnittsalter 52,3 Jahre) nahmen an der Studie bis zum Ende teil. Die Teilnahmedauer lag zwischen 37 und 127 Tagen und durchschnittlich bei 65 Tagen. Die Patienten wurden mit 1–3 Dosismengen des Studienarzneimittels behandelt. Kumulative Dosismengen reichten von 940 bis 2.100 E, die individuellen Dosismengen reichten von 150 bis 1.430 E Botulinum-Toxin Typ B. Der durchschnittliche Zeitraum zwischen den Dosierungssitzungen betrug bei Patienten, die geringere Dosismengen (insgesamt 100–899 E) erhielten, 22,3 Tage und 48,4 Tage bei denjenigen im höheren Dosisbereich (900–1.500 E).
  • Ein positives klinisches Ergebnis war definiert als eine mindestens 25%ige Verringerung der Bewertung auf der Toronto Western Spasmodic Torticollis-Bewertungsskala (TWSTRS) des Schweregrades (Consky, E. S., Lang, A. E. (1994) In: Therapy with Botulinum-Toxin. Jankovic, J and Hallet M, eds. Marcel Dekker, Inc., New York) im Vergleich zum Ausgangswert (Verringerung = Verbesserung). Die Durchschnittsbewertung des Ausgangswertes war bei allen Patienten ähnlich. Im Gegensatz zu 7% der Patienten in der geringeren Dosisgruppe zeigten 56% der Patienten in der höheren Dosisgruppe eine Verringerung der Schweregradbewertung auf der TWSTRS-Skala. In beiden Gruppen war eine mäßige Verbesserung der Schmerzbewertung auf der TWSTRS-Skala zu beobachten. Es gab keine Anzeichen der Entwicklung von blockierenden Antikörpern gegen Botulinum-Toxin Typ B bei diesen Patienten.
  • 3. Studie 3
  • Achtundzwanzig Patienten (Durchschnittsalter 50,9 Jahre) mit einer bestätigten Diagnose einer Dystonie des Halses erhielten in 2–4 oberflächliche Hals- und Schultermuskeln Injektionen von Botulinum-Toxin Typ B-Formulierung und zwar mit ansteigenden Dosismengen (bis zu 1,5-fach von Sitzung zu Sitzung). Positive klinische Ergebnisse wurden, wie oben beschrieben, anhand des Schweregradtests der TWSTRS-Skala bestimmt, wobei eine 25%ige Verringerung der Bewertung als Verbesserung galt.
  • Die Patienten nahmen zwischen 28 und 177 Tage lang an der Studie teil, was einem Durchschnitt von 71,9 Tagen entspricht. Die Patienten wurden mit 1–3 Dosismengen der Formulierung behandelt. Die kumulativen Dosismengen betrugen zwischen 1.430 E und 12.000 E, wobei die Einzeldosismengen zwischen 300 E und 12.000 E lagen. Zum Zwecke der klinischen Bestimmung wurden 4 Dosisgruppen definiert: 100–800 E (Gruppe A), 900–2.399 E (Gruppe B), 2.400–5.999 E (Gruppe C) und 6.000–12.000 E (Gruppe D). Die Länge des Zeitraums zwischen den Dosierungssitzungen war wie folgt: Gruppe A, 13–101 Tage, durchschnittlich 35,7 Tage; Gruppe B, 14–113 Tage, durchschnittlich 48,8 Tage; Gruppe C, 29–177 Tage, durchschnittlich 62,2 Tage; Gruppe D, 28–177 Tage, durchschnittlich 55,1 Tage.
  • Bei allen Patienten waren die mittleren Ausgangswerte in allen Behandlungsgruppen ähnlich, und alle vier Gruppen erfuhren während der Studie eine durchschnittliche Verringerung der Bewertung (Verbesserung). Generell war die durchschnittliche Verbesserung in Prozent, ausgehend vom Ausgangswert, und die durchschnittliche Ansprechrate pro Schwergradbewertung während der Studie in den Gruppen C und D am größten. Messungen der mittleren maximalen Verbesserung, der mittleren maximalen Verbesserung in Prozent und der mittleren maximalen Ansprechrate waren bei den beiden höheren Dosisgruppen größer als bei den beiden geringeren Dosisgruppen (8,1 und 6,8 im Vergleich zu 2,1 und 3,6 in Bezug auf die maximale Verbesserung; 43,9% und 35,5% im Vergleich zu 10% und 16,1% in Bezug auf die durchschnittliche maximale Verbesserung; 0,32 und 0,23 im Vergleich zu 0,05 und 0,09 in Bezug auf die mittlere maximale Ansprechrate). Die Prozentzahl an Patienten, die auf die Behandlung ansprachen, war bei den beiden höheren Dosisgruppen größer (C, 80% und D, 78%) als bei den beiden geringeren Dosisgruppen (A, 0% und B, 27%). Die mittlere Dauer des Ansprechens war bei den höheren Dosisgruppen länger (C, 47,6 Tage; D, 38,1 Tage) als bei den beiden geringeren Dosisgruppen (A, 0 Tage; B, 31 Tage). Diese Daten zeigen ein dosisabhängiges Ansprechen auf Botulinum-Toxin Typ B-Formulierung gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • 4. Studie 4
  • In einer Studie, an der 85 Patienten mit einer Dystonie des Halses teilnahmen, wurden drei Dosismengen der Botulinum-Toxin Typ B-Formulierung mit einer Placebobehandlung verglichen; es handelte sich um eine randomisierte, vierarmige, im Doppelblindverfahren durchgeführte Multicenterstudie mit parallelen Gruppen, in der Einzeldosismengen verabreicht wurden. Die Patienten waren im Bereich zwischen 18 und 80 Jahren. Die Dosismengen waren 400, 1.200 und 2.400 E Botulinum-Toxin Typ B, injiziert in 2–4 oberflächliche Muskelgruppen des Halses und/oder der Schultern. Anhand der TWSTRS-Bewertungsskala wurden der Ausgangswert der Patienten und Werte nach 2 und 4 Wochen bestimmt. Patienten, die nach 4 Wochen keine Verbesserung von 3 oder mehr Bewertungspunkten (≥ 20%) auf der TWSTRS-Bewertungsskala des Schweregrades zeigten, wurden als nicht auf die Behandlung Ansprechende (Non-Responders) aus der Studie ausgeschlossen. Die auf die Behandlung ansprechenden Patienten kehrten alle 4 Wochen zur Bewertung zurück, bis der Grad ihres Ansprechens um mehr als 50% absank.
  • Alle TWSTRS-Bewertungen zeigten mit steigenden Dosismengen an Botulinum-Toxin Typ B-Formulierung eine Verbesserung. In Woche 4 gab es im Vergleich zu den mit Placebo behandelten Patienten eine statistisch signifikante Verbesserung bei den Patienten in der Dosisgruppe 2.400 E, und zwar sowohl in Bezug auf die Schmerzbewertung nach TWSTRS als auch in Bezug auf die TWSTRS-Bewertung insgesamt, und die Prozentzahl der Patienten, die eine Verbesserung zeigten, war in der Gruppe mit 2.400 E am größten. In Woche 2, 4 und 8 war die mittlere Gesamtbestimmung der Patienten in der 2.400 E-Gruppe erheblich größer als in jeder anderen Behandlungsgruppe; bei den Varianzanalysen der Woche-4-Daten gab es einen statistisch signifikanten Unterschied (p = 0,0286) zwischen den Behandlungsgruppen. Es gab auch signifikante Unterschiede zwischen der Placebogruppe und der 2.400 E-Dosisgruppe (p = 0,0050) und in der Dosis-Wirkungs-Analyse (p = 0,0028). Bei der Varianzanalyse der Woche-4-Daten gab es einen statistisch signifikanten Unterschied (p = 0,0073) zwischen den Behandlungsgruppen, und es gab auch signifikante Unterschiede zwischen Placebo und der 2.400 E-Dosisgruppe (p = 0,0015) und in der Dosis-Wirkungs-Analyse (p = 0,0008).
  • Die Patienten nahmen zwischen 25 und 203 Tagen an der Studie teil, wobei die Zahl der Tage in der 2.400 E-Dosisgruppe im Durchschnitt höher war (61 Tage).
  • 5. Studie 5
  • Bei dieser Studie handelte es sich ebenfalls um eine randomisierte, placebokontrollierte, vierarmige, im Doppelblindverfahren durchgeführte, ambulante Multicenterstudie mit parallelen Gruppen, in der Einzeldosismengen verabreicht wurden, in der die Auswirkungen eine Einzelbehandlung mit Placebo (Gruppe A) oder einer von drei Dosismengen (2.500 E, Gruppe B; 5.000 E, Gruppe C; 10.000 E, Gruppe D) an Botulinum-Toxin Typ B-Formulierung untersucht wurden, welche in 2–4 oberflächliche Muskelgruppen des Halses und/oder der Schultern von Patienten mit einer bestätigten Diagnose einer Dystonie des Halses verabreicht wurden. Die Patienten wurden bei Besuchen 2 und 4 Wochen nach der Behandlung evaluiert. Die Patienten mir einer mehr als 20%igen Verbesserung in Woche 4 im Vergleich zu den Ausgangswerten (Gesamt-TWSTRS-Bewertung) wurden als „auf die Behandlung ansprechend” eingestuft und wurden gebeten, für eine erneute Evaluierung in vierwöchigen Abständen maximal 4 Monate lang zurückzukommen, oder solange, bis der Grad ihres Ansprechens um mehr als 50% absank.
  • An der Studie nahmen einhundertzweiundzwanzig Patienten im Alter zwischen 19 bis 81 Jahren teil. Die Dauer der Teilnahme der Patienten an der Studie spiegelte die Dauer ihres Ansprechens auf das Studienarzneimittel wider. Die Behandlungsgruppen waren sich in Bezug auf die kleinste und größte Anzahl von Tagen, die die Patienten jeweils an der Studie teilnahmen, ähnlich. Die Teilnahmedauer an der Studie erhöhte sich mit ansteigender Dosis, und zwar von 45 Tagen für Placebogruppe A auf 61 Tage (B), 67 Tage (C) und 75 Tage (D).
  • Alle Behandlungsgruppen zeigten für alle TWSTRS-Bewertungen zum 4-Wochen-Zeitpunkt eine Verbesserung gegenüber dem Ausgangswert. Alle TWSTRS-Bewertungen tendierten mit Ansteigen der Dosis der Formulierung zu einer Verbesserung. In einer Kovarianzanalyse der Gesamt-TWSTRS-Bewertungen zum 4-Wochen-Zeitpunkt war die generelle Differenz zwischen den Behandlungsgruppen statistisch signifikant (p = 0,0001). Außerdem war die Analyse des Dosis-Wirkungs-Bezuges signifikant (p = 0,0001) und alle drei Vergleiche von Placebo und den aktiven Gruppen waren signifikant (p = 0,0016 für Placebo im Vergleich zu 2.500 E; p = 0,0005 für Placebo im Vergleich zu 5.000 E; p = 0,0001 für Placebo im Vergleich zu 10.000 E). Die Prozentzahl von Patienten, die zum 4-Wochen-Zeitpunkt auf die Behandlung ansprachen, war in Gruppe D (10.000 E) größer als in allen anderen Gruppen, und zwar in Bezug auf die Gesamtbewertung nach TWSTRS, die Bewertung der Behinderung nach TWSTRS und die Schmerzbewertung nach TWSTRS. Für alle vier TWSTRS-Bewertungen gab es eine signifikante Dosisantwort (Gesamt p < 0,001; Schweregrad p = 0,035; Behinderung p = 0,002; Schmerz p = 0,001). Die Schmerzbewertung verbesserte sich bei allen Behandlungsgruppen in Woche 4, und zwar auf 67,5 für Gruppe B, auf 70,2 für Gruppe C und auf 75,1 für Gruppe D. Der generelle Unterschied zwischen den Behandlungsgruppen war statistisch signifikant (p = 0,0049), die Analyse des Dosis-Wirkungs-Bezuges war statistisch signifikant (p = 0,0017) und der Vergleich von Placebo mit allen drei aktiven Behandlungsgruppen war ebenfalls signifikant (p = 0,0149 für Gruppe B, p = 0,0084 für Gruppe C und p = 0,0007 für Gruppe D, jeweils im Vergleich zur Placebogruppe).
  • Beispiel 4: Physiologische Reaktion auf Botulinum-Toxin Typ B-Formulierung bei menschlichen Testpersonen
  • Bei achtzehn gesunden Testpersonen wurde mithilfe von aus dem Stand der Technik bekannten elektrophysiologischen Verfahren die M-Wellen-Amplitudenantwort des Musculus extensor digitorum brevis (EDB) auf Botulinum-Toxin Typ B getestet. Das Alter der Testpersonen lag zwischen 18 und 22 Jahren.
  • An den Tagen 2, 4, 6, 9, 11, 13 und 14 nach der Injektion von Dosismengen von 1,25 E bis 480 E (i. m.) an Botulinum-Toxin Typ B-Formulierung wurden elektrophysiologische Studien durchgeführt. Das Ergebnis der Datenanalyse zeigte eine dosisabhängige Verringerung von EDB-M-Wellen-Amplitude und -Bereich mit ansteigenden Dosismengen. Die Maximalwirkung bei 480 E ergab eine 75%ige Verringerung der M-Wellen-Amplitude im Vergleich zu Ausgangswert.
  • In einer separaten Studie wurden 10 Testpersonen im Zufallsverfahren aufgeteilt und mit einer Dosis Botulinum-Toxin Typ B-Formulierung „B” in einen EDB und einer Dosis „BOTOX®” (Botulinum-Toxin Typ A, „A”) in den anderen EDB injiziert, wobei fünf verschiedenen Dosisschemata verwendet wurden: 1,25E A/20E B; 2,5E A/80E B; 5E A/160E B; 7,5E A/320E B; 10E A/480E B (2 Testpersonen pro Dosierungsplan). Einer Kontrollperson wurde in jeden EDB-Muskel eine Salzlösung injiziert. Die Rate der Verringerung von M-Wellen-Amplitude und -Bereich war in beiden Muskeln ähnlich, wobei zirka am Tag 6 nach der Injektion die Höchstwirkung erreicht war. Beide Serotypen zeigten eine dosisabhängige Verringerung der M-Wellen-Amplitude. Die Erleichterung der Beweglichkeit war an Tag 9 nach der Injektion in Bezug auf beide Toxinarten am größten.
  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung bezieht sich auf stabile, gebrauchsfertige flüssige therapeutische Formulierungen von Botulinum-Toxin, wie in den Ansprüchen gekennzeichnet.
  • LITERATURHINWEISE
    • Consky, E. S., Lang, A. E. (1994) In: Therapy with Botulinum Toxin. Jankovic, J and Hallet M, eds. Marcel Dekker, Inc., New York.
    • Frankel, A. S., and Kamer, F. M. (1998) Chemical browlift. Arch. Otolaryngol. Surg. 124(3): 321–323.
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Claims (22)

  1. Stabile, gebrauchsfertige flüssige pharmazeutische Formulierung, welche Serumalbumin, eine pharmazeutisch annehmbare gepufferte Kochsalzlösung, die einen gepufferten pH-Bereich zwischen pH 5 und pH 6 bereitstellt, und isoliertes Botulinum-Toxin beinhaltet, das in der Formulierung für zumindest ein Jahr bei einer Temperatur zwischen 0° und 10°C oder zumindest 6 Monate bei einer Temperatur zwischen 10° und 30°C stabil ist.
  2. Formulierung nach Anspruch 1, wobei der gepufferte pH-Bereich pH 5,6 ± 0,2 ist.
  3. Formulierung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die gepufferte Kochsalzlösung mit Phosphat-Puffer, Phosphat-Citrat-Puffer oder Succinat-Puffer gepuffert ist.
  4. Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Botulinum-Toxin ein Botulinum-Toxin-Serotyp A, B, C1, D, E, F oder G ist.
  5. Formulierung nach Anspruch 4, wobei das Botulinum-Toxin Botulinum-Toxin Typ B ist und in der stabilen, gebrauchsfertigen flüssigen pharmazeutischen Formulierung in einer Konzentration im Bereich von etwa 100 bis 20.000 E/ml vorhanden ist.
  6. Formulierung nach Anspruch 5, wobei das Botulinum-Toxin Typ B in der stabilen, gebrauchsfertigen flüssigen pharmazeutischen Formulierung in einer Konzentration zwischen 1.000 bis 5.000 E/ml vorhanden ist.
  7. Formulierung nach Anspruch 5 oder 6, wobei das Botulinum-Toxin Typ B in einem Komplex mit einem hohen Molekulargewicht von etwa 700 Kilodaltons (kD) vorhanden ist.
  8. Formulierung nach Anspruch 4, wobei das Botulinum-Toxin Botulinum-Toxin Typ A ist und in der stabilen, gebrauchsfertigen flüssigen pharmazeutischen Formulierung in einer Konzentration im Bereich von etwa 20 bis 2.000 E/ml vorhanden ist.
  9. Formulierung nach Anspruch 8, wobei das Botulinum-Toxin Typ A in der stabilen, gebrauchsfertigen flüssigen pharmazeutischen Formulierung in einer Konzentration im Bereich von etwa 100 bis 1.000 E/ml vorhanden ist.
  10. Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Serumalbumin rekombinantes menschliches Serumalbumin ist.
  11. Formulierung nach Anspruch 1, wobei die stabile, gebrauchsfertige flüssige pharmazeutische Formulierung 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Succinat-Puffer mit einem gepufferten pH von 5,6, 0,5 mg/ml menschliches Serumalbumin und Botulinum Typ B, das in einer Konzentration von 5.000 ± 1.000 E/ml vorhanden ist, umfasst.
  12. Verwendung einer stabilen, gebrauchsfertigen flüssigen pharmazeutischen Formulierung wie in einem der vorhergehenden Ansprüche definiert für die Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der cholinergenen Übertragung auf einen ausgewählten Muskel, eine Muskelgruppe, eine Drüse oder ein Organ.
  13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Medikament zur Behandlung einer Störung vorgesehen ist, die aus der Gruppe bestehend aus spastischer Lähmung, Blepharospasmus, Schielen, halbseitige Gesichtsspasmen, Dystonie, Mittelohrentzündung, spastischem Darmkatarrh, Anismus, Dyssynergie der Harnentleer- und -schließmuskulatur, Zähneknirschen und Verkrümmung der Wirbelsäule ausgewählt ist.
  14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Medikament ein Medikament zur Behandlung von spastischer Lähmung infolge einer oder mehrerer aus der Gruppe bestehend aus Schlaganfall, Rückenmarksverletzung, geschlossenem Schädel-Hirn-Trauma, zerebraler Kinderlähmung, multipler Sklerose und Parkinson-Krankheit ist.
  15. Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Medikament ein Medikament zur Behandlung einer Dystonie ist, welche aus der Gruppe bestehend aus krampfartigem Schiefhals (Dystonie des Halses), krampfartiger Dysphonie, Gliedmaßen-Dystonie, Kehlkopf-Dystonie und Mund- und Unterkiefer-(Meige's) Dystonie ausgewählt ist.
  16. Verwendung nach Anspruch 12, wobei der gewählte Muskel oder die Muskelgruppe eine Falte oder eine gefurchte Stirn hervorruft.
  17. Verwendung nach Anspruch 12, wobei der gewählte Muskel ein Beckenbodenmuskel ist und wobei das Medikament zur Verabreichung an eine Patientin während der Geburt eines Kindes vorgesehen ist.
  18. Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Medikament ein Medikament zur Behandlung eines Zustandes ist, der aus der Gruppe bestehend aus myofaszialem Schmerz, Kopfweh in Verbindung mit Migräne, Gefäßstörungen, Neuralgie, Neuropathie, Gelenksentzündungsschmerz, Rückenschmerz, Hyperhidrose, Nasenbluten, Asthma, übermäßigem Speichelfluss und übermäßiger Magensäureproduktion ausgewählt ist.
  19. Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 18, wobei das Medikament ein Medikament zur Behandlung eines Patienten ist, der unempfindlich gegen Botulinum-Toxin Serotyp A ist, wobei das Botulinum-Toxin in dieser Formulierung aus der Gruppe bestehend aus Botulinum-Toxin Serotypen B, C1, D, E, F und G ausgewählt ist.
  20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei das Botulinum-Toxin in dieser Formulierung Botulinum-Toxin Typ B ist.
  21. Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 18, wobei das Medikament ein Medikament zur Behandlung eines Patienten ist, der unempfindlich gegen Botulinum-Toxin Typ B ist, wobei das Botulinum-Toxin in dieser Formulierung aus der Gruppe bestehend aus Botulinum-Toxin Serotypen A, C1, D, E, F und G ausgewählt ist.
  22. Verwendung nach Anspruch 21, wobei das Botulinum-Toxin in dieser Formulierung Botulinum-Toxin Typ A ist.
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