DE69913316T2

DE69913316T2 - Abbaubare, heterobifunktionelle polyethylenglykolacrylate, sowie damit herstellbare gele und konjugate

Info

Publication number: DE69913316T2
Application number: DE1999613316
Authority: DE
Inventors: Milton J. Harris; Xuan Zhao
Original assignee: Debio Recherche Pharmaceutique SA
Current assignee: Debio Recherche Pharmaceutique SA
Priority date: 1998-01-07
Filing date: 1999-01-06
Publication date: 2004-11-18
Anticipated expiration: 2019-01-07
Also published as: CA2316834A1; US6362276B1; US8497357B2; AU2221499A; EP1053019B1; DE69913316D1; AU755051B2; US20110009589A1; PT1053019E; CA2316834C; ES2211033T3; US20120195846A1; US20040086992A1; US20070292931A1; JP2003510375A; JP3786832B2; US7166304B2; WO1999034833A1; US20040086991A1; EP1053019A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft heterobifunktionelle Polyalkylenoxide, die abbaubare Verknüpfungen aufweisen, und Konjugate, die davon abgeleitet sind.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
In seiner gewöhnlichsten Form ist das Polyalkylenoxid Polyethylenglycol (PEG) ein lineares Polymer, das an jedem Ende mit einer Hydroxylgruppe abgeschlossen ist: HO-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-OH.
Dieses Polymer kann in einer kurzen Form als HO-PEG-OH dargestellt werden, wobei es sich versteht, dass -PEG- die folgende Struktureinheit darstellt: -CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-, wobei n typischerweise im Bereich von etwa 10 bis 2.000 liegt.
PEG ist in einer Vielzahl von biotechnischen und pharmazeutischen Anwendungen, insbesondere zum Arzneimitteltransport und zur Modifizierung von Arzneimitteloberflächen, um die Kennzeichen der Verunreinigungsfreiheit zu fördern, nützlich.
PEG ist nicht toxisch, fördert gewöhnlich keine Immunreaktion und ist in Wasser und in vielen organischen Lösemitteln löslich. Das PEG-Polymer kann kovalent an unlösliche Moleküle angelagert werden, um das resultierende PEG-Molekül-Konjugat löslich zu machen. Z. B. führen Greenwald, Pendri und Bolikal in J. Org. Chem., 60, 331–336 (1995) an, dass das wasserunlösliche Arzneimittel Taxol wasserlöslich wird, wenn es an PEG gekuppelt wird. Davis et al. führen in der US-Patentschrift 4,179,337 an, dass Proteine, die an PEG gekuppelt sind, eine erhöhte Lebensdauer im Blutkreislauf aufgrund einer verringerten Geschwindigkeit der Ausscheidung durch die Nieren sowie verringerte Immunogenität aufweisen. Das Fehlen der Toxizität des Polymers und seine Geschwindigkeit der Ausscheidung aus dem Körper sind bei pharmazeutischen Anwendungen wichtige Gesichtspunkte. Pharmazeutische Anwendungen und viele maßgebliche Literaturhinweise sind in dem Buch von Harris (J. M. Harris, Hrsg., "Biomedical and Biotechnical Applications of Polyethylene Glycol Chemistry, Plenum, New York, 1992) beschrieben.
PEG wird gewöhnlich als Methoxy-PEG-OH – oder kurz mPEG – benutzt, in dem ein Terminus die verhältnismäßig reaktionsträge Methoxygruppe ist, während der andere Terminus eine Hydroxylgruppe ist, die bereitwillig der chemischen Modifizierung unterliegt. CH₃O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-OH mPEG
PEG wird gewöhnlich auch in verzweigten Formen benutzt, welche durch die Addition von Ethylenoxid an verschiedene Polyole, einschließlich Glycerin, Pentaerythrit und Sorbit, hergestellt werden können. Z. B. ist unten das mit vier Seitenarmen verzweigte PEG, das aus Pentaerythrit hergestellt wird, gezeigt: C(CH₂OH)_n + n C₂H₄O → C[CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-OH]₄.
Die verzweigten PEG können in einer allgemeinen Form als R(-PEG-OH)_n dargestellt werden, in der R das zentrale Kernmolekül darstellt, das z. B. Glycerin oder Pentaerythrit sein kann, und n die Anzahl der Seitenarme darstellt.
Oft ist es notwendig, ein „aktiviertes Derivat" von PEG zu benutzen, um PEG an ein Molekül zu kuppeln. Die Hydroxylgruppe, die sich an dem PEG-Terminus befindet, oder eine andere Gruppe, die bereitwillig der chemischen Modifizierung unterliegt, wird durch Modifizieren oder Austauschen der Gruppe durch eine funktionelle Gruppe aktiviert, die zum Reagieren mit einer Gruppe an einem anderen Molekül geeignet ist, einschließlich z. B. Proteinen, Oberflächen, Enzymen und anderen. Z. B. bildet der Succinimidyl-„aktive Ester" von carboxymethyliertem PEG kovalente Bindungen mit Aminogruppen an Proteinen, wie von K. Iwasaki und Y. Iwashita in der US-Patentschrift Nr. 4,670,417 beschrieben. Die Synthese, die in der US-Patentschrift Nr. 4,670,417 beschrieben ist, ist unten veranschaulicht, wobei der aktive Ester mit Aminogruppen eines Proteins reagiert, in dem die Succinimidylgruppe als NHS und das Protein als PRO-NH₂ dargestellt ist: PEG-O-CH₂-CO₂-NHS + PRO-NH₂ → PEG-O-CH₂CO₂-NH-PRO.
Succinimidyl-„aktive Ester", wie z. B. PEG-OCH₂-CO₂-NHS, sind gewöhnlich benutzte Formen von aktivierten Carbonsäure-PEG, und sie werden durch Zur-Reaktion-Bringen von Carbonsäure-PEG mit N-Hydroxysuccinimid hergestellt.
PEG-Hydrogele, die wassergequollene Gele sind, sind zur Wundabdeckung und zum Arzneimitteltransport benutzt worden. PEG-Hydrogele werden durch Einbeziehen des löslichen hydrophilen Polymers in ein chemisch vernetztes Netzwerk oder eine Matrix hergestellt, so dass die Zugabe von Wasser ein unlösliches gequollenes Gel erzeugt. Substanzen, die als Arzneimittel nützlich sind, werden zum In-vivo-Transport typischerweise nicht kovalent an das PEG-Hydrogel angelagert. Stattdessen werden die Substanzen in die vernetzte Matrix eingeschlossen und gehen durch die Zwischenräume in der Matrix. Die unlösliche Matrix kann für unbestimmte Zeit in dem Körper verbleiben und die Steuerung der Freisetzung des Arzneimittels kann typischerweise etwas ungenau sein.
Ein Ansatz zur Herstellung dieser Hydrogele ist von Embrey und Grant in der US-Patentschrift Nr. 4,894,238 beschrieben. Die Enden des linearen Polymers sind durch verschiedene starke, nichtabbaubare chemische Verknüpfungen verbunden. Z. B. wird lineares PEG durch Zur-Reaktion-Bringen mit einem Triol und einem Diisocyanat in ein vernetztes Netzwerk eingebunden, um hydrolysestabile Urethanverknüpfungen zu bilden, die in Wasser nicht abbaubar sind.
Ein verwandter Ansatz zur Herstellung von PEG-Hydrogelen ist von Gayet und Fortier in J. Controlled Release, 38, 177–184 (1996) beschrieben, in dem lineares PEG als das p-Nitrophenylcarbonat aktiviert wurde und durch Reaktion mit einem Protein, Rinderserumalbumin, vernetzt wurde. Die gebildeten Verknüpfungen sind hydrolysestabile Urethangruppen, und die Hydrogele sind in Wasser nicht abbaubar.
In einem anderen Ansatz, beschrieben von N. S. Chu in der US-Patentschrift Nr. 3,963,805, sind nichtabbaubare PEG-Netzwerke durch statistische Verflechtung von PEG-Ketten mit anderen Polymeren hergestellt worden, die durch Benutzung von Radikalinitiatoren, gemischt mit multifunktionellen Monomeren, gebildet wurden. P. A. King hat in der US-Patentschrift Nr. 3,149,006 nichtabbaubare PEG-Hydrogele beschrieben, die durch strahlungsinduziertes Vernetzen von PEG mit hohem Molekulargewicht hergestellt worden sind.
Nagaoka et al. haben in der US-Patentschrift Nr. 4,424,311 das Herstellen von PEG-Hydrogelen durch Copolymerisation von PEG-Methacrylat mit anderen Comonomeren, wie z. B. Methylmethacrylat, beschrieben. Die Vinylpolymerisation erzeugt ein Polyethylenhauptgerüst, an das PEG angelagert ist. Das Methylmethacrylat-Comonomer wird addiert, um dem Gel zusätzliche physikalische Festigkeit zu verleihen.
Sawhney et al. haben in Macromolecules, 26, 581 (1993) und in der US-Patentschrift Nr. 5,626,863 die Herstellung von Blockcopolymeren von Polyglycolid oder Polylactid und PEG beschrieben, die mit Acrylatgruppen abgeschlossen sind: CH₂=CH-CO-(O-CHR-CO)_n-O-PEG-O-(CO-CHR-O)_n-OC-CH=CH₂, wobei R für CH₃- oder H steht.
In der obigen Formel sind die -OCH₂-CO-Einheiten die Glycolidblöcke; die Addition einer Methylgruppe an die Methylengruppe lässt einen Lactidblock entstehen; n kann Vielfache von 2 sein. Die Vinylpolymerisation der Acrylatgruppen erzeugt ein unlösliches vernetztes Gel mit einem Polyethylenhauptgerüst. Die oben gezeigten Polylactid- oder Polyglycolidabschnitte des Polymerhauptgerüstes, die Estergruppen sind, sind für eine langsame hydrolytische Spaltung empfänglich, mit dem Ergebnis, dass das vernetzte Gel einen langsamen Abbau und Auflösung erfährt. Obwohl dieser Ansatz abbaubare Hydrogele liefert, liefert die Struktur keine Möglichkeit, Proteine oder andere Arzneimittel für eine gesteuerte Freisetzung kovalent an das Hydrogel anzulagern. Anwendungen dieser Hydrogele beim Arzneimitteltransport sind somit auf die Freisetzung von Proteinen oder anderen Arzneimitteln begrenzt, die physikalisch in dem Hydrogel eingeschlossen sind, wodurch die Möglichkeit einer vorteilhaften Beeinflussung der Freisetzungskinetik vermindert wird.
Hubbell, Pathak, Sawhney, Desai und Hill (US-Patentschrift Nr. 5,410,016, 1995) haben Protein-NH-PEG-O₂C-CH=CH₂ mit langwelliger UV-Strahlung polymerisiert, um ein PEG-Acrylatpolymer zu erhalten, an das ein Protein angeknüpft ist. Die Verknüpfung zwischen dem PEG und dem Protein war nicht abbaubar, so dass das Protein nur mit dem angefügten PEG hydrolytisch freigesetzt werden konnte. Da das Acrylatpolymer nicht hydrolytisch abbaubar ist, ist die Freisetzung des PEG-Protein-Derivates nicht steuerbar.
Yang, Mesiano, Venkatasubramanian, Gross, Harris und Russel haben in J. Am. Chem. Soc. 117, 4843–4850, (1995) heterobifunktionelle Polyethylenglycole beschrieben, die an einem Terminus eine Acrylatgruppe und an dem zweiten Terminus eine aktivierte Carbonsäure aufweisen. Sie führten das Anlagern dieses PEG-Derivates an ein Protein und die Einbindung des resultierenden PEG-Protein-Derivates in ein Acrylatpolymer vor. Das PEG-Hauptgerüst ist dort jedoch nicht abbaubar, und das Protein war somit in Wirklichkeit permanent an das Acrylatpolymer gebunden.
KURZFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung stellt heterobifunktionelle Acrylate von Polyalkylenoxiden, insbesondere Polyethylenglycol-(PEG)-Acrylate, die Verknüpfungen aufweisen, die hydrolytisch abbaubar sind, und Konjugate, die aus diesen Acrylaten hergestellt sind, die Zielmaterialien, wie z. B. Proteine, aufweisen, die kovalent mit diesen verknüpft sind, bereit. Aus diesen Acrylaten können auch Hydrogele hergestellt werden. Die Zielmaterialien können durch gesteuerten hydrolytischen Abbau der Hydrogele aus den Hydrogelen freigesetzt werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist heterobifunktionelles PEG bereitgestellt, das durch die Formel CH₂=CZ-CO₂-PEG-W-Q dargestellt ist, wobei Z für eine Alkylgruppe oder ein Wasserstoffatom steht, W für eine hydrolyseinstabile Verknüpfung steht, die eine hydrolysierbare kovalente Bindung umfasst, und Q für eine reaktionsfähige Gruppierung steht, die in der Lage ist, mit einem Ziel zu reagieren und eine kovalente Verknüpfung zu bilden und somit das PEG-Polymer mit dem Ziel zu verknüpfen.
In einer anderen Ausführungsform stellt diese Erfindung auch ein heterobifunktionelles PEG bereit, das in dem PEG-Hauptgerüst eine hydrolysierbare Verknüpfung W und an einem Terminus eine Acrylatgruppe und an dem anderen Terminus eine reaktionsfähige Gruppierung Q aufweist. Das heterobifunktionelle PEG ist durch die Formel CH₂=CZ-CO₂-PEG-W-PEG-Q dargestellt, wobei Z für eine Alkylgruppe oder ein Wasserstoffatom steht, W für eine hydrolyseinstabile Verknüpfung steht, die eine hydrolysierbare Bindung umfasst, und Q für eine reaktionsfähige Gruppierung steht, die in der Lage ist, mit einer Gruppierung an einem Ziel, wie z. B. einem Protein oder Arzneimittel, zu reagieren.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Konjugat, das die Formel (CH₂=CZ-CO₂-PEG-W-L)_x-T aufweist, wobei Z und W so sind, wie oben beschrieben, T für ein Ziel, z. B. ein Protein oder ein Arzneimittel, steht, L für eine kovalente Verknüpfung steht, die bei der Reaktion von Q mit einer reaktionsfähigen Gruppierung von T gebildet wird, und x für eine Zahl von 1 bis 10 steht.
In einer noch anderen Ausführungsform der Erfindung ist ein Konjugat aus heterobifunktionellem PEG und einem Ziel bereitgestellt, das die Formel (CH₂=CZ-CO₂-PEG-W-PEG-L)_x-T aufweist, wobei Z und W so sind, wie oben beschrieben, T für ein Ziel, z. B. ein Protein oder ein Arzneimittel, steht, das infolge der Reaktion der reaktionsfähigen Gruppierung Q mit einer Gruppierung an T mit dem PEG-Polymer verknüpft ist, L für eine kovalente Verknüpfung steht, welche durch die Reaktion von Q mit einer reaktionsfähigen Gruppierung von T gebildet wird, und x für eine Zahl von 1 bis 10 steht.
Diese Erfindung stellt ferner Polymere bereit, die durch Vinylpolymerisation des vorstehend erwähnten heterobifunktionellen PEG oder dessen Konjugate gebildet sind, die durch die Formeln CH₂=CZ-CO₂-PEG-W-Q, (CH₂=CZ-CO₂-PEG-W-L)_x-T, CH₂=CZ-CO₂-PEG-W-PEG-Q und (CH₂-CZ-CO₂-PEG-W-PEG-L)_x-T dargestellt werden. Die schwachen chemischen Verknüpfungen in den so gebildeten Polymeren sorgen für eine hydrolytische Spaltung bei gleichzeitiger Freisetzung von gebundenen Zielmolekülen. Z. B. ergibt die Polymerisation des oben erwähnten Konjugates (CH₂=CZ-CO₂-PEG-W-PEG-L)_x-T ein wasserlösliches Acrylatpolymer, dass bei dem hydrolytischen Abbau ein kleineres PEG-Fragment freigibt, das ein Ziel, wie z. B. ein Protein oder ein Arzneimittel, trägt.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung sind durch Copolymerisieren eines heterobifunktionellen PEG-Konjugates dieser Erfindung mit einem PEG-Molekül, das zwei oder mehr Acrylatgruppen („PEG-Multiacrylat") aufweist, Hydrogele gebildet. Mustergültige Beispiele für ein derartiges PEG-Multiacrylat können CH₂=CHCO₂-PEG-O₂CCH=CH₂ oder CH₂=CHCO₂-PEG-O-CH₂CO₂CH(CH₃)CH₂CONH-PEGO₂CCH=CH₂ sein.
Das Hydrogel der vorliegenden Erfindung ist ein vernetztes Netzwerk, in dem Protein oder andere Zielmoleküle an einer abbaubaren Matrix kovalent gebunden sind. Wegen der hydrolyseinstabilen Verknüpfungen W in den Hydrogelen können die Zielmoleküle, wie z. B. Arzneimittel- oder Proteinmoleküle, infolge der Spaltung der instabilen Verknüpfungen freigesetzt werden.
In den heterobifunktionellen PEG, Polymeren und Hydrogelen der vorliegenden Erfindung kann die hydrolytische Spaltung der hydrolyseinstabilen Verknüpfungen W teilweise durch Variieren von W, insbesondere der Zahl der Methylengruppen, die der hydrolysierbaren Bindung in W benachbart sind, gesteuert werden. Genau angegeben Wenn die Zahl der Methylengruppen zunimmt, nimmt die Hydrolysegeschwindigkeit der hydrolysierbaren Bindung von W ab.
Ferner kann in dem Hydrogel der vorliegenden Erfindung auch die Geschwindigkeit der Freisetzung des Ziels aus dem Hydrogel durch Variieren der Zahl x in der obigen Formel des PEG-Konjugates, d. h. der Zahl der PEG-Acrylate, die mit dem Ziel verknüpft sind, gesteuert werden. Die Geschwindigkeit der Freisetzung des Ziels aus dem Hydrogel ist verringert, wenn die Zahl der PEG-Acrylate, die mit dem Ziel verknüpft sind, erhöht ist, und umgekehrt.
Somit stellt die vorliegende Erfindung heterobifunktionelle PEG und Hydrogele, die daraus gebildet sind bereit, welche Zielmoleküle aufweisen, die kovalent mit den Hydrogelen verknüpft sind. Im Gegensatz zu den PEG-Hydrogelen, die bisher in dem Fachgebiet bekannt waren, können die Zielmoleküle in einer gesteuerten Weise aus den PEG-Hydrogelen der vorliegenden Erfindung freigesetzt werden. Da die Geschwindigkeit der Freisetzung des Ziels durch die Zahl der angelagerten PEG und die Struktur der hydrolyseinstabilen Verknüpfung in dem angelagerten PEG festgelegt werden kann, ist ferner eine genauere Steuerung der Freisetzungskinetik ermöglicht. Daher können geeignete Arzneimittelträger zum Arzneimitteltransport, die verschiedene Arzneimittelfreisetzungsanforderungen erfüllen, erfindungsgemäß hergestellt werden.
Die vorstehenden und weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung sowie die Weise, in der diese erzielt sind, werden unter Berücksichtigung der folgenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den begleitenden Beispielen, die bevorzugte und beispielhafte Ausführungsformen veranschaulichen, leicht offensichtlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1 ist eine graphische Darstellung des Profils der Freisetzung von Luzifergelb-Lysozym aus einem PEG-Acrylathydrogel.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Ein heterobifunktionelles, wasserlösliches und hydrolytisch abbaubares Polymer ist bereitgestellt, das ein Polymerhauptgerüst, das eine abbaubare Verknüpfung aufweist, einen ersten Terminus, der eine Acrylatgruppe umfasst, und einen zweiten Terminus umfasst, der ein Ziel oder eine funktionelle Gruppe umfasst, die in der Lage ist, das Polymer an ein Ziel anzukuppeln.
Wie hier benutzt, sind die Ausdrücke „Gruppe", „Gruppierung", „Stelle" und „Rest" alle einigermaßen synonym und werden hier benutzt, um eindeutige, definierbare Abschnitte oder Einheiten eines Moleküls oder Einheiten, die eine Funktion oder Aktivität ausführen oder mit anderen Molekülen oder Abschnitten von Molekülen reaktionsfähig sind, zu bezeichnen.
Der Ausdruck „Verknüpfung" wird hier benutzt, um Gruppen zu bezeichnen, die normalerweise infolge einer chemischen Reaktion gebildet werden und typischerweise kovalente Verknüpfungen sind. Hydrolysestabile Verknüpfungen bedeutet, dass die Verknüpfungen in Wasser stabil sind und bei nützlichen pH-Werten für einen ausgedehnten Zeitraum, möglicherweise auf unbestimmte Zeit, mit Wasser nicht reagieren. Hydrolyseinstabile Verknüpfungen sind diejenigen, die mit Wasser reagieren, typischerweise den Abbau eines Hydrogels und die Freisetzung von Substanzen, die in der Matrix eingeschlossen sind, verursachen. Die Verknüpfung wird als der Hydrolyse unterliegend und hydrolysierbar bezeichnet. Die Zeit, die nötig ist, um die vernetzte polymere Struktur abzubauen, wird als die Geschwindigkeit der Hydrolyse bezeichnet und üblicherweise als Halbwertszeit gemessen. So werden in der vorliegenden Erfindung die Zielmoleküle typischerweise mit einer vorbestimmten Geschwindigkeit oder in einer vorbestimmten Zeit freigesetzt.
"Heterobifunktionell" bezieht sich auf den ersten und zweiten Terminus des Polymers, von denen einer Acrylat ist und der andere das Zielmolekül oder eine funktionelle Gruppe ist, die in der Lage ist, das Polymer an ein Ziel zu kuppeln.
Eine bevorzugte Ausführungsform des heterobifunktionellen Polymers ist durch die Formel CH₂=CZ-CO₂-POLY-W-POLY'-Q dargestellt.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist durch die Formel CH₂=CZCO₂-POLY-W-Q dargestellt.
In den obigen Formeln kann Z für H oder eine Alkylgruppe stehen. Die Alkylgruppe weist vorzugsweise weniger als 20 Kohlenstoffatome, stärker bevorzugt weniger als 10 Kohlenstoffatome und am stärksten bevorzugt weniger als 3 Kohlenstoffatome auf.
Das Polymerhauptgerüst, das durch POLY und POLY' dargestellt ist, ist typischerweise Polyalkylenoxid, einschließlich dessen Derivate. Ein geeignetes Polyalkylenoxid oder dessen Derivat kann eine Gruppe umfassen, die durch die Formel -(CH₂CHRO)_n-CH₂CHR- dargestellt ist, in der R für H oder eine Alkylgruppe steht und n in dem Bereich von etwa 10 bis etwa 4.000 liegt. Vorzugsweise steht R für H und das Polymerhauptgerüst umfasst eine Polyethylenglycolgruppe. Polyethylenglycol ist bevorzugt, da es im wesentlichen nicht toxisch und nicht immunogen ist.
W ist eine hydroyseinstabile Verknüpfung, die in einer wässrigen Umgebung durch Hydrolyse gespalten werden kann. Die Verknüpfung W umfasst typischerweise eine hydrolysierbare kovalente Bindung. Geeignete Beispiele für derartige hydrolysierbare kovalente Bindungen sind Carboxylatester, Imine, Phosphatester, Acetale, Orthoester, Peptidbindungen und Oligonucleotide, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Diese hydrolysierbaren Bindungen können durch Reaktion von Paaren reaktionsfähiger Gruppierungen gebildet werden, z. B. Alkohol und Carbonsäure, die zu Carboxylatestern reagieren, Amin und Aldehyd, die zu Iminen reagieren, Hydrazid und Aldehyd, die zu Hydrazonen reagieren, Alkohol und Phosphat, die zu Phosphatestern reagieren, Aldehyd und Alkohol, die zu Acetalen reagieren, Alkohol und Formiat, die zu Orthoestern reagieren, Aminosäure und Aminosäure, die zu Peptidbindungen reagieren, Nucleotid und Nucleotid, die zu Oligonucleotidbindungen reagieren.
Die hydrolytisch abbaubare Verknüpfung W umfasst ferner mehrere Alkylengruppen, vorzugsweise Methylengruppen, die der hydrolysierbaren Bindung benachbart sind. Die Geschwindigkeit des Abbaus der hydrolytisch abbaubaren Verknüpfung W durch Hydrolyse ist zum Teil durch die Zahl der Alkylengruppen und den Abstand dieser Gruppen von der hydrolysierbaren Bindung bestimmt.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist W die Struktur -O(CH₂)_m-CO₂R₁-CO₂- oder -O-(CH₂)_m-CO₂- auf, wobei m im Bereich von 1 bis 10 liegt und R₁ aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus -CH₂-, -CH₂CH₂- und -CH(CH₃)CH₂- besteht. In diesen beiden Beispielen nimmt die Geschwindigkeit der Hydrolyse der Esterverknüpfung bei einem abnehmenden Wert von m zu.
In dem heterobifunktionellen Polymer mit der obigen Formel ist Q eine reaktionsfähige Gruppierung, die in der Lage ist, mit einer reaktionsfähigen Gruppe in einem Ziel zu reagieren, so dass eine Verknüpfung zwischen dem heterobifunktionellen Polymer und dem Ziel gebildet wird. Ein Ziel ist unten definiert. Beispiele für Q sind Aldehyde, Carbonsäuren, Carbonatester, Hydrazide, N-Succinimidylester, Amine, Isocyanate, Alkohole, Epoxid, Thiole, Orthopyridyldisulfide und Sulfonatester, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Q reagiert typischerweise mit einer reaktionsfähigen Gruppe an einem Ziel und bildet eine stabile Verknüpfung, so dass das heterobifunktionelle Polymer der Erfindung an ein Ziel konjugiert wird. Ein Konjugat, das auf diese Weise gebildet ist, kann durch die Formel (CH₂=CZCO₂-POLY-W-L)_x-T oder (CH₂=CZCO₂-POLY-W-POLY'-L)_x-T dargestellt werden, wobei Z, POLY, POLY' und W so sind, wie oben beschrieben. L stellt eine stabile Verknüpfung dar, die infolge der Reaktion von Q mit einer reaktionsfähigen Gruppe an T gebildet ist, wie unten beschrieben. Beispiele für die hydrolysestabile Verknüpfung L sind Amid aus der Reaktion von aktiven Estern mit Amin, Urethan aus der Reaktion von Isocyanat mit Alkohol, Harnstoff aus der Reaktion von Isocyanat mit Amin, Amin aus der Reaktion von Aldehyd mit Amin und einem Reduktionsmittel, Amin aus der Reaktion von Epoxid mit Amin sowie Sulfonamid aus der Reaktion von Sulfonatester mit Amin.
T stellt ein Ziel dar, das typischerweise ein Molekül oder eine Einheit ist, die eine gewünschte Funktion oder Eigenschaft aufweist. Z. B. kann T ein Protein oder ein pharmazeutisch wirksames Mittel sein. Durch das Bilden eines Konjugates oder eines Hydrogels der Erfindung wird ein Ziel T in der Tat auf einen Träger „geladen" und kann unter dem Schutz des Polymerhauptgerüstes oder der Hydrogelmatrix an einen gewünschten Ort übergeben werden, bevor es durch hydrolytische Spaltung der instabilen Verknüpfung W in dem Polymer oder dem Hydrogel freigesetzt wird.
Demgemäß kann ein Ziel T in dieser Erfindung eine beliebige Substanz sein, von der es wünschenswert ist, sie mit Polyalkylenoxid oder dessen Derivaten zu verknüpfen. T muss eine reaktionsfähige Gruppe aufweisen, die in der Lage ist, mit der reaktionsfähigen Gruppierung Q zu reagieren und eine stabile Verknüpfung L zu bilden. Beispiele für geeignete T sind Proteine, Kohlenhydrate, Lipide, Hormone, Oligonucleotide, sind aber nicht auf diese beschränkt. Typischerweise ist T ein pharmazeutisch wirksames Mittel. Beispiele für solche Substanzen sind, aber nicht beschränkt auf, Antikörper und deren Bruchstücke; Zytokine, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Interleukine (z. B. IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 und deren Derivate oder Fragmente), Interferone (z. B. IFN-alpha, IFN-beta und IFN-gamma); Wachstumsfaktoren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf koloniestimulierende Faktoren, Erythropoietine, Hämopoietine, epidermale Wachstumsfaktoren, Wachstumsfaktoren aus Blutplättchen, transformierende Wachstumsfaktoren, Amphiregulin, Somatomedin C, Knochenwachstumsfaktor, Fibroblastenwachstumsfaktoren, insulinähnliche Wachstumsfaktoren, heparinbindende Wachstumsfaktoren, Tumorwachstumsfaktoren und andere Wachstumsfaktoren, plättchenaktivierende Faktoren, Makrophagenaktivierungsfaktoren und andere aktivierende Faktoren; Transkriptionsfaktoren; Substanzen, welche die Blutgerinnung beeinflussen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Heparin, Proteasen und ihre Profaktoren, die Gerinnungsfaktoren VII, VIII, IX, X, XI und XII, Antithrombin III, Protein C, Protein S, Streptokinase, Urokinase, Prourokinase, Gewebeplasminogenaktivator, Fibrinogen, Hirudin, andere fibrinolytische/gerinnungshemmende Mittel und andere Gerinnungsfaktoren; Lipide, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Sphingosin, Cholesterin und andere Steroide und deren Derivate; Nucleotide, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Ribonucleotide, Desoxyribonucleotide, Nucleoside, Oligonucleotide, DNA und RNA; Enzyme; Impfstoffe; Vitamine; Antibiotika und andere pharmazeutisch wirksame Mittel, einschließlich, aber nicht beschränkt auf anthelminthische Mittel, Noradrenalin, alpha-adrenergene Rezeptorliganden, Dopaminrezeptorliganden, Histaminrezeptorliganden, GABA/Benzodiazepinrezeptorliganden, Serotoninrezeptorliganden, Leukotriene und Triiodthyronin und andere kleine Effektormoleküle, Doxorubicin, Methotrexat und andere cytotoxische Mittel und deren Derivate.
Wenn sich die hydrolyseinstabile Verknüpfung W innerhalb des Polyalkylenoxidhauptgerüstes des heterobifunktionellen Polymers oder des Konjugates dieser Erfindung befindet, kann W durch Zur-Reaktion-Bringen von zwei modifizierten Polymeren, die endständige reaktionsfähige Gruppierungen aufweisen, gebildet werden, wie unten veranschaulicht: -PEG-X + Y-PEG- → -PEG-W-PEG-.
In der obigen Veranschaulichung stellt -W- die hydrolyseinstabile, schwache Verknüpfung dar. X und Y stellen die Paare reaktionsfähiger Gruppierungen dar, wie oben beschrieben. Beispielhafte Reaktionen sind unten veranschaulicht, wobei die Umkehrreaktionen die hydrolytische Umkehrbarkeit veranschaulichen: -PEG-CO₂H + HO-PEG- ⇄ -PEG-CO₂-PEG- (Ester) + H₂O -PEG-OPO₃H₂ + HO-PEG- ⇄ -PEG-OPO₃(H)-PEG-(Phosphatester) + H₂O -PEG-CHO + 2(HO-PEG)- ⇄ -PEG-CH(O-PEG-)₂ (Acetal) + H₂O -PEG-CHO + NH₂-PEG- ⇄ -PEG-CH=N-PEG- (Imin) + H₂O -PEG-W-PEG-4- + U-T-PEG-W-PEG-L-T, wobei U eine reaktionsfähige Gruppe an T ist.
Der durchschnittliche Fachmann sollte erkennen, dass, wenn auf eine X-Gruppierung Bezug genommen wird, die mit einer Y-Gruppierung regiert, oder auf eine Q-Gruppe mit einer U-Gruppe, zusätzliche Reagenzien oder Schritte entsprechend gewöhnlich akzeptierter chemischer Arbeitsweisen und Standards eingesetzt werden können, um die gewünschte Verknüpfung W oder L, je nach Lage des Falls, zu erreichen. Es gibt viele mögliche Wege, die zu zahlreich sind, um hier erwähnt zu werden, welche genommen werden könnten und dem durchschnittlichen Fachmann leicht offensichtlich sein sollten. Z. B. kann von einem Fachmann erwartet werden, dass er versteht, dass, wenn ein Alkohol und eine Carbonsäure zur Reaktion gebracht werden, die Säure vor der Reaktion mit Alkohol typischerweise in eine andere Form, das Säurechlorid, umgewandelt wird. Mehrere Beispiele sind in den untenstehenden Beispielen aufgezeigt.
Die oben beschriebenen heterobifunktionellen Polymere und Konjugate dieser Erfindung können in Polymerisationsreaktionen eingesetzt werden, um Polymere und Hydrogele zu bilden.
Da die heterobifunktionellen Polymere und Konjugate dieser Erfindung alle eine Acrylatgruppe aufweisen, kann eine Vinylpolymerisation jedes der heterofunktionellen Polymere oder Konjugate durch ein Verfahren ausgeführt werden, das in dem Fachgebiet bekannt ist. Zwei oder mehr Verbindungen, die aus den heterofunktionellen Polymeren und den Konjugaten dieser Erfindung ausgewählt sind, können copolymerisiert werden. Viele Verfahren der Vinylpolymerisation sind in dem Fachgebiet allgemein bekannt und in der vorliegenden Erfindung nützlich. Wenn ein Konjugat in die Polymerisation oder Copolymerisation einbezogen ist, sollten die Bedingungen für die Polymerisationsreaktion im allgemeinen so ausgewählt werden, dass das Ziel in dem Konjugat nicht nachteilig beeinflusst wird. Zu geeigneten Polymerisationsverfahren gehören z. B. die Redoxinitiierung und die Photoinitiierung. Andere geeignete Verfahren sollten einem durchschnittlichen Fachmann nach Kenntnisnahme der vorliegenden Offenbarung offensichtlich sein.
Einem anderen Gesichtspunkt dieser Erfindung gemäß können Hydrogele aus den heterobifunktionellen Polymeren und Konjugaten, ebenso wie die Vinylpolymere, durch Polymerisation und/oder Vernetzten hergestellt werden. Wie hier benutzt, soll „Hydrogel" Gele bedeuten, die durch Einbinden der löslichen hydrophilen Polymere (z. B. heterofunktionelle Polymere und Konjugate dieser Erfindung) in ein chemisch vernetztes Netzwerk oder Matrix erzeugt werden, sodass die Zugabe von Wasser ein unlösliches gequollenes Gel erzeugt. Vernetzungen können von den heterobifunktionellen Polymeren oder Konjugaten selbst gebildet werden. Typischerweise werden Vernetzungen jedoch durch Copolymerisieren der heterobifunktionellen Polymere oder Konjugate mit einem Multiacrylat als einem Monomeren eingeführt. „Multiacrylat" soll ein Molekül bedeuten, das zwei oder mehr Acrylatgruppen aufweist, sodass es bei der Vinylpolymerisation der heterobifunktionellen Polymere oder Konjugate der vorliegenden Erfindung eine vernetzende Brücke bilden kann. Das benutzte Multiacrylat ist vorzugsweise ein PEG-Multiacrylat, d. h. ein PEG-Molekül, das zwei oder mehr Acrylatgruppen darin aufweist. Mustergültige Beispiele für derartiges PEG-Multiacrylat kann z. B. CH₂=CHCO₂-PEG-O₂CCH=CH₂ oder CH₂=CHCO₂-PEG-O-CH₂CO₂CH(CH₃)CH₂CONH-PEGO₂CCH=CH₂ sein.
Es können jedoch auch viele andere Multiacrylatmonomere benutzt werden, wie es einem durchschnittlichen Fachmann offensichtlich wird, der von dieser Erfindung Kenntnis genommen hat.
Typischerweise wird ein hydrolytisch abbaubares Konjugat dieser Erfindung, das ein Ziel darin aufweist, beim Herstellen des Hydrogels dieser Erfindung benutzt. Auf diese Weise wird das Ziel kovalent in das Hydrogel eingebunden, das als ein Träger für den In-vivo-Transport oder andere Anwendungen benutzt werden kann. Somit sind die Hydrogele der Erfindung besonders in Arzneimitteltransportsystemen nützlich. Mit „Arzneimittel" ist jede Substanz gemeint, die für die Diagnose, Heilung, Linderung, Behandlung oder Vorbeugung von Krankheiten bei Menschen oder anderen Tieren oder um in einer sonstigen Weise das körperliche oder geistige Wohlergehen zu verbessern, vorgesehen sind. Z. B. können Hydrogele, die aus den vernetzten PEG-Polymerstrukturen der Erfindung hergestellt sind, zur Wundabdeckung benutzt werden. Wundabdeckungen können intern benutzt werden, um Abdeckungen bereitzustellen, die innerhalb des Körpers mit der Zeit abgebaut werden.
In dem Hydrogel dieser Erfindung kann das Zielmaterial, das mit dem Hydrogel kovalent verknüpft ist, in einer wässrigen Umgebung durch hydrolytische Spaltung der hydrolyseinstabilen Verknüpfung W freigesetzt werden. Um die Geschwindigkeit der Freisetzung des Ziels in dem Hydrogel zu steuern, kann die instabile Verknüpfung W während der Herstellung des Hydrogels beeinflusst werden. Es ist entdeckt worden, dass die Zahl der Atome, insbesondere der Alkylengruppen, die der hydrolysierbaren Bindung in W benachbart sind, die Geschwindigkeit der Hydrolyse der hydrolysierbaren Bindung beeinflusst. Wenn z. B. die Zahl der Methylengruppen zunimmt, nimmt die Hydrolysegeschwindigkeit ab.
Wenn W z. B. die Struktur -O(CH₂)_m-CO₂R₁-CO₂- aufweist, wobei m im Bereich von 1 bis 10 liegt, R₁ ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus -CH₂-, -CH₂CH₂- und -CH(CH₃)CH₂- besteht, senkt das Vergrößern des m-Wertes die Hydrolysegeschwindigkeit von Estern und erhöht die Dauer, die erforderlich ist, um das Gel abzubauen. Wenn m in dem obigen Beispiel 1 ist, dann werden typischerweise die Esterverknüpfungen des Gels bei pH 7 und 37°C mit einer Halbwertszeit von etwa 4 Tagen hydrolysieren. Wenn m 2 ist, dann beträgt die Halbwertszeit des hydrolytischen Abbaus der Esterverknüpfungen bei pH 7 und 37°C etwa 43 Tage. Phosphatester, Acetale, Imine und andere hydrolyseinstabile Verknüpfungen können in ähnlicher Weise gebildet werden, und die Hydrolysegeschwindigkeit kann in ähnlicher Weise durch Steuern der Zahl von Methylengruppen, die der hydrolyseinstabilen Verknüpfung benachbart sind, gesteuert werden.
Zudem kann in dem Hydrogel der vorliegenden Erfindung auch die Geschwindigkeit der Freisetzung des Ziels aus dem Hydrogel durch Variieren der Zahl x der PEG-Acrylate, die mit dem Ziel verknüpft sind, gesteuert werden. Die Geschwindigkeit der Freisetzung des Ziels aus dem Hydrogel ist verringert, wenn die Zahl der PEG-Acrylate, die mit dem Ziel verknüpft sind, erhöht ist. Die Geschwindigkeit der Freisetzung wird durch Verringern der Zahl erhöht.
In dem Hydrogel dieser Erfindung ist eine zweifache Steuerung der Geschwindigkeit der Freisetzung des Ziels ermöglicht: (1) durch Variieren der Zahl von Atomen, die der hydrolysierbaren Bindung in der hydrolyseinstabilen Verknüpfung W benachbart sind, und (2) durch Steuern der Zahl der PEG-Acrylate, die mit dem Ziel verknüpft sind. Im Ergebnis können die Hydrogele dieser Erfindung so entworfen werden, dass sie eine genauer gesteuerte Geschwindigkeit der Freisetzung des Ziels aufweisen, was in Hydrogelanwendungen, z. B. dem Arzneimitteltransport, nützlich ist.

Die folgenden Beispieler sind gegeben, um die Erfindung zu veranschaulichen.

Beispiel 1	Synthese von CH₂=CHCO₂PEG-OCH₂CO₂CH(CH₃)CH₂CO₂NS (NS=N-Succinimidyl)
Beispiel 2	Modifizierung von Proteinen
Beispiel 3	Herstellung von Gelen
Beispiel 4	Freisetzung von Proteinen aus Gelen

BEISPIELE
BEISPIEL 1
HERSTELLUNG VON CH₂=CHCO₂-PEG-OCH₂CO₂CH(CH₃)CH₂CO₂NS
REAKTIONSSCHEMA:
BzO-PEG-OCH₂CO₂H + SOCl₂ → BzO-PEG-OCH₂COCl + SO₂ + HCl (Bz = Benzyl) BzO-PEG-OCH₂COCl + HOCH(CH₃)CH₂CO₂H → → BzO-PEG-OCH₂CO₂CH(CH₃)CH₂CO₂H + HCl BzO-PEG-OCH₂CO₂CH(CH₃)CH₂CO₂H = H₂ → → HO-PEG-OCH₂CO₂CH(CH₃)CH₂CO₂H + BzH HO-PEG-OCH₂CO₂CH(CH₃)CH₂CO₂H + CH₂=CHCOCl + 2(CH₃CH₂)₃N → → CH₂=CHCO₂-PEG-OCH₂CO₂CH(CH₃)CH₂CO₂ + 2(CH₃CH₂)₃NH⁺ + Cl^– CH₂=CHCO₂-PEG-OCH₂CO₂CH(CH₃)CH₂CO₂ ^–((CH₃CH₂)₃NH⁺ +
a) Herstellung von BzO-PEG-OCH₂CO₂-CH(CH₃)CH₂CO₂H
BzO-PEG-OCH₂CO₂H (MG = 3.400, 15 g, 4,4 mmol) wurde mit 60 ml Toluol unter N₂ azeotrop getrocknet. Nach zwei Stunden wurde die Lösung langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Zu dieser Lösung wurde Thionylchlorid (18 ml, 36 mmol) gegeben. Die resultierende Lösung wurde über Nacht gerührt, das Lösemittel wurde durch Rotationsverdampfung kondensiert und der Sirup in vacuo für etwa vier Stunden über P₂O₅-Pulver getrocknet. 3-Hydroxybuttersäure (1,45 g, 13,5 mmol) wurde mit 70 ml 1,4-Dioxan azeotrop getrocknet und dann zu dem getrockneten BzO-PEG-OCH₂COCl gegeben. Nachdem sich das PEG-Acylchlorid gelöst hatte, wurden 4,5 ml trockenes Triethylamin in das System eingespritzt, und die Lösung wurde über Nacht gerührt. Das Salz wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat in einem Rotationsverdampfer bei 55°C kondensiert und in vacuo getrocknet. Das Rohprodukt wurde dann in 100 ml destilliertem Wasser gelöst und der pH der Lösung auf 3,0 eingestellt. Die wässrige Phase wurde mit insgesamt 80 ml Methylenchlorid dreimal extrahiert. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert, in einem Rotationsverdampfer kondensiert und in 100 ml Ethylether gefällt. Das Produkt wurde durch Filtration aufgefangen und in vacuo bei Raumtemperatur getrocknet. Ausbeute: 14 g (93%). ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 3,5 (br m, PEG), 2,58 (d, -PEGCOOCH(CH₃)CH₂COOH), 5,14 (h, -PEG-COOCH(CH₃)CH₂COOH), 1,21 (d, -PEGCOOCH(CH ₃)CH₂COOH), 4,055 (s, PEGOCH ₂COO), 4,49 (s, C₆H₅-CH ₂-OPEG-), 7,33 (s + comp. mult., C₆ H ₅-CH₂-OPEG-).
b) Herstellung von HO-PEG-OCH₂CO₂-CH(CH₃)CH₂CO₂H
Eine Lösung von BzO-PEG-OCH₂CO₂-PEG-OCH(CH₃)CH₂CO₂H (8 g) in Benzol (50 ml) wurde mit H₂ (2 atm) auf 4 Gramm Pd/C (10%) bei Raumtemperatur für 48 Stunden hydrogenolysiert. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt, das Lösemittel wurde kondensiert und die Lösung in Ethylether gefällt. Das Produkt wurde durch Filtration aufgefangen und in vacuo bei Raumtemperatur getrocknet.
Ausbeute: 6,6 Gramm (83%). ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 3,5 (br m, PEG), 2,51 (d, PEGCO₂CH(CH₃)CH ₂CO₂H), 5,16 (h, -PEG-CO₂CH(CH₃)CH₂CO₂H), 1,22 (d, -PEG-CO₂CH(CH₃)CH₂CO₂H), 4,06 (s, -PEGOCH ₂CO₂PEG-).
c) Herstellung von CH₂=CHCO₂-PEG-OCH₂CO₂-CH(CH₃)CH₂CO₂H
HO-PEG-OCH₂CO₂CH(CH₃)CH₂CO₂H (3 g, 0,88 mol) wurde mit 40 ml Toluol unter N₂ azeotrop destilliert, bis etwa 15 ml der Lösung übrigblieben. Die Lösung wurde dann unter N₂ auf Raumtemperatur abgekühlt, und 25 ml Methylenchlorid und Triethylamin (1,5 mmol) wurden zugegeben. Die Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt und Acryloylchlorid (2 mmol) tropfenweise zugegeben. Nach der Zugabe von Acryloylchlorid wurde das Eisbad entfernt und die Lösung bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Methylenchlorid wurde dann unter Vakuum teilweise entfernt, das Salz wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat zu 100 ml Ether gegeben. Das gefällte Produkt wurde durch Filtration aufgefangen und in vacuo getrocknet. Das Produkt wurde dann in Natriumacetatpuffer (0,1 M, pH 5,5) gelöst, für eine halbe Stunde gerührt und dreimal mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert, kondensiert und in 100 ml Ethylether gefällt. Der Niederschlag wurde durch Filtration aufgefangen und in vacuo bei Raumtemperatur getrocknet. Ausbeute: 2,4 g (80%). ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 3,5 (br m, PEG), 2,51 (d, CH ₂CO₂H), 5,16 (h, -CH(CH₃-), 1,22 (d, -CH(CH ₃)-), 4,06 (s, PEGOCH₂CO₂PEG-), 4,21 (t, -CO₂CH₂CH₂O-), 5,85–6,45 (m, CH ₂=CH-).
d) Herstellung von CH₂=CHCO₂-PEG-OCH₂CO₂-CH(CH₃)CH₂CO₂NS
CH₂=CH-CO₂-PEG-OCH₂CO₂CH(CH₃)CH₂CO₂H (1,4 g, etwa 0,4 mmol) und N-Hydroxysuccinimid (51 mg, 0,43 mmol) wurden in 30 ml trockenem Methylenchlorid gelöst. Zu dieser Lösung wurde Dicyclohexylcarbodiimid (95 mg, 0,45 mmol) in 5 ml trockenem Methylenchlorid gegeben. Die Lösung wurde über Nacht unter Stickstoff gerührt und das Lösemittel durch Rotationsverdampfung entfernt. Der resultierende Sirup wurde in 10 ml trockenem Toluol gelöst und der unlösliche Feststoff durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde zu 100 ml trockenem Ethylether gegeben und das gefällte Produkt durch Filtration aufgefangen und bei Raumtemperatur in vacuo getrocknet.
Ausbeute: 0,94 g (94%). ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 3,5 (br m, PEG), 3,0–3,2 (m, -PEGCOOCH(CH₃)CH ₂COONS), 5,26 (h, PEGCOOCH(CH₃)CH₂COONS), 1,3 (d, -PEGCOOCH(CH ₃)CH₂COONS), 4,10 (s, -PEGOCH ₂COO(CM)), 2,81 (s, NS), 4,21 (t, CH₂=CH-COO-CH ₂CH₂-O-PEG-, 4H), 5,85–6,45 (m, CH ₂=CHCOOPEG-).
BEISPIEL 2
Modifizierung von Proteinen
a) Modifizierung von Luzifergelb-modifiziertem Lysozym
CH₂=CHCO₂-PEG-OCH₂CO₂-CH(CH₃)CH₂CO₂NS (19 mg, 5,5 mmol) wurde in 0,1 ml Wasser gelöst und 0,5 ml einer Lösung (20 mg/ml) von Luzifergelb-modifiziertem Lysozym in Boratpuffer (0,1 M, pH 8,0) wurde zugegeben. Die Lösung wurde in einem automatischen Schüttelapparat bei Raumtemperatur für 3 Stunden behutsam geschüttelt. Das Ende der Reaktion wurde mittels Kapillarelektrophorese angezeigt. Die Lösung wurde dann vor den Untersuchungen zur Freisetzung bei 4°C gelagert.
b) Modifizierung von Fluoresceinisothiocyanat-Rinderserumalbumin (FTIC-BSA):
CH₂=CHCO₂-PEG-OCH₂CO₂-CH(CH₃)CH₂CO₂NS (9,3 mg, 2,7 mmol) wurde in 0,5 ml entionisiertem Wasser gelöst, und 1,5 ml FITC-BSA-Lösung (15 mg/ml) in Borpuffer (0,1 M, pH 8,0) wurden zugegeben. Die Lösung wurde in einem automatischen Schüttelapparat bei Raumtemperatur für 3 Stunden behutsam geschüttelt. Das Ende der Reaktion wurde mittels Kapillarelektrophorese angezeigt. Die Lösung wurde dann vor den Untersuchungen zur Freisetzung bei 4°C gelagert.
BEISPIEL 3
Herstellung von Gelen
a) durch Redoxinitiierung
Eine Lösung (0,5 ml, 200 mg/ml in Wasser) von CH₂=CHCO₂-PEG-O-CH₂CO₂CH(CH₃)CH₂CONH-PEGO₂CCH=CH₂ oder CH₂=CHCO₂-PEG-O-CH₂CO₂PEG-O₂CCH=CH₂ und 0,5 ml gepufferte Lösung (10 mg/ml) von PEG-Acrylat-modifiziertem Luzifergelb-Lysozym (Beispiel 2a) und 20 ml Kaliumpersulfat (K₂S₂O₈, 100 mM) wurden gemischt. Zu der Lösung wurden 20 ml Eisensulfat (FeSO₄, 100 mM) gegeben. Nach schnellem Schütteln bildete sich in wenigen Minuten ein Gel.
Ein geeigneter Puffer für diesen Arbeitsvorgang ist Borpuffer (0,1 M) oder Phosphatpuffer (< 0,01 M) mit einem pH-Bereich von 6 bis 8.
b) durch Photoinitiierung
Bifunktionelle PEG-Acrylatlösung (0,5 ml, 400 mg/ml in Wasser, CH₂=CHCO₂-PEG-O CH₂CO₂CH(CH₃)CH₂CONH-PEGO₂CCH=CH₂ oder CH₂=CHCO₂-PEG-O-CH₂CO₂PEG
-O₂CCH=CH₂, 0,5 ml gepufferte Lösung (pH 7) von PEG-Acrylat-modifiziertem FTIC-BSA (Beispiel 2b) und 100 ml 2,2-Dimethoxy-2-phenyl-acetophonlösung (10 mg/ml in Ethanol) wurden gemischt. Die Lösung wurde der UV-Strahlung mit einer Wellenlänge von 360 nm ausgesetzt, und das Gel bildete sich in etwa 10 Minuten.
BEISPIEL 4
Freisetzung von Proteinen aus den Gelen
Die Freisetzung von Luzifergelb-Lysozym wurde unter Benutzung eines Durchfluß-UV-Spektralphotometers bei 428 nm und 37°C in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7) überwacht. Die Freisetzungsprofile für zwei Versuche sind in der 1 gezeigt.

Claims

Heterobifunktionelles Polymer, umfassend: ein Polyalkylenoxid-Hauptgerüst, einen ersten Terminus, der eine Acrylatgruppe umfasst, einen zweiten Terminus, der ein Ziel oder eine reaktive Gruppierung umfasst, die in der Lage ist, sich an ein Ziel anzukuppeln, und eine einzige hydrolytisch abbaubare Verknüpfung zum Freisetzen des Ziels bei Hydrolyse.
Verbindung, die dargestellt ist durch die Formel CH₂=CZ-CO₂-POLY-W-POLY'-Q, wobei Z H oder Alkyl darstellt, POLY und POLY' für Poly(alkylenoxid)-Gruppen stehen, welche dieselben oder verschieden sein können und durch die Formel -(CH₂CHRO)_n-CH₂CHR- dargestellt sind, in der R für H oder Alkyl steht und n im Bereich von 10 bis 4.000 liegt, Q eine funktionelle Gruppe darstellt und W eine hydrolyseinstabile Verknüpfung darstellt, die an einer einzigen Stelle abbaubar ist.
Verbindung, die dargestellt ist durch die Formel CH₂=CZ-CO₂-POLY-W-Q, wobei Z H oder Alkyl darstellt, POLY für Polyalkylenoxid steht, das durch die Formel -(CH₂CHRO)_n-CH₂CHR- dargestellt ist, in der R für H oder Alkyl steht und n im Bereich von 10 bis 4.000 liegt, Q eine funktionelle Gruppe darstellt und W eine hydrolyseinstabile Verknüpfung darstellt, die an einer einzigen Stelle abbaubar ist.
Verbindung nach Anspruch 2 oder 3, wobei POLY und POLY' für Polyethylenglycol stehen.
Verbindung nach Anspruch 2 oder 3, wobei W eine hydrolysierbare kovalente Bindung umfasst, die an einer einzigen Stelle abbaubar ist, wobei die Bindung ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Estern, Orthoestern, Iminen, Acetalen, Peptidbindungen und Disulfiden besteht.
Verbindung nach Anspruch 2 oder 3, wobei W die Struktur -O(CH₂)_m-CO₂R₁-CO₂- aufweist, wobei m im Bereich von 1 bis 10 liegt und R₁ für -CH₂-, -CH₂CH₂- oder -CH(CH₃)CH₂- steht, oder W die Struktur -O-(CH₂)_m-CO₂- aufweist.
Verbindung nach Anspruch 2 oder 3, wobei Q ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Aldehyden, Carbonsäuren, aktiven Estern, aktiven Carbonaten, Sulfonatestern, Aminen, Hydraziden, Orthopyridyldisulfiden und Thiolen besteht.
Konjugat, das die Formel (CH₂=CZ-CO₂-POLY-W-POLY'-L)_x-T aufweist, wobei Z für H oder eine Alkylgruppe steht, POLY und POLY' für Polyalkylenoxide stehen, die Gruppen umfassen, welche dieselben oder verschieden sein können und durch die Formel -(CH₂CHRO)_n-CH₂CHR- dargestellt sind, in der R für H oder Alkyl steht und n im Bereich von 10 bis 4.000 liegt, W eine hydrolyseinstabile Verknüpfung darstellt, die an einer einzigen Stelle abbaubar ist, L für eine hydrolysestabile Verknüpfung steht, x für eine ganze Zahl von 1 bis 10 steht und T für ein Zielmolekül steht.
Konjugat nach Anspruch 8, wobei R für H steht.
Konjugat nach Anspruch 8, wobei W die Struktur -O(CH₂)_m-CO₂R₁-CO₂- aufweist, wobei m im Bereich von 1 bis 10 liegt, R₁ ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus -CH₂-, -CH₂CH₂- und -CH(CH₃)CH₂- besteht, oder W die Struktur -O-(CH₂)_m-CO₂- aufweist.
Konjugat nach Anspruch 8, wobei T aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Proteinen, Polysacchariden, Oligonukleotiden, Lipiden, Vitaminen, Hormonen oder Pharmazeutika mit kleinen Molekülen besteht.
Verbindung, welche die folgende Struktur aufweist: CH₂=CZCO₂-POLY-W-Q, wobei Z H oder Alkyl darstellt, POLY für ein Polyalkylenoxid steht, das durch die Formel -(CH₂CHRO)_n-CH₂CHR- dargestellt ist, in der R für H oder Alkyl steht und n im Bereich von 10 bis 4.000 liegt, Q eine funktionelle Gruppe darstellt und W eine hydrolyseinstabile Verknüpfung darstellt, die an einer einzigen Stelle abbaubar ist.
Verbindung nach Anspruch 12, wobei POLY für Polyethylenglycol steht.
Verbindung nach Anspruch 12, wobei W eine hydrolysierbare kovalente Bindung umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Estern, Orthoestern, Iminen, Acetalen, Peptidbindungen und Disulfiden besteht.
Verbindung nach Anspruch 12, wobei W die Struktur -O(CH₂)_m-CO₂R₁-CO₂- aufweist, wobei m im Bereich von 1 bis 10 liegt und R₁ für -CH₂-, -CH₂CH₂- oder -CH(CH₃)CH₂- steht, oder W die Struktur -O-(CH₂)_m-CO₂- aufweist.
Verbindung nach Anspruch 12, wobei Q aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Aldehyden, Carbonsäuren, aktiven Estern, aktiven Carbonaten, Sulfonatestern, Aminen, Hydraziden, Orthopyridyldisulfiden, N-Succinimidyl und Thiolen besteht.
Konjugat, das die folgende Struktur aufweist: (CH₂=CZCO₂-POLY-W-L)_x-T, wobei Z H oder Alkyl darstellt, POLY für ein Polyalkylenoxid steht, das eine Gruppe umfasst, die durch die Formel -(CH₂CHRO)_n-CH₂CHR- dargestellt ist, in der R für H oder Alkyl steht und n im Bereich von 10 bis 4.000 liegt, W eine hydrolyseinstabile Verknüpfung darstellt, die an einer einzigen Stelle abbaubar ist, L für eine hydrolysestabile Verknüpfung steht, x für eine ganze Zahl von 1 bis 10 steht und T für ein Zielmolekül steht.
Polymer, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Verbindungen besteht, die dargestellt sind durch die Formeln CH₂=CZ-CO₂-POLY-W-POLY'-Q₁, (CH₂=CZ-CO₂-POLY-W-POLY'-L)_x-T, CH₂=CZCO₂-POLY-W-Q und (CH₂=CZCO₂-POLY-W-L)_x-T, wobei Z für H oder eine Alkylgruppe steht, POLY und POLY' für Polyalkylenoxide stehen, welche dieselben oder verschieden sein können und durch die Formel -(CH₂CHRO)_n-CH₂CHR- dargestellt sind, in der R für H oder Alkyl steht und n im Bereich von 10 bis 4.000 liegt, W eine hydrolyseinstabile Verknüpfung darstellt, die an einer einzigen Stelle abbaubar ist, Q eine funktionelle Gruppe darstellt, L für eine hydrolysestabile Verknüpfung steht, x für eine ganze Zahl von 1 bis 10 steht und T für ein Zielmolekül steht.
Polymer nach Anspruch 18, wobei W die Struktur -O(CH₂)_m-CO₂R₁-CO₂- aufweist, wobei m im Bereich von 1 bis 10 liegt, R₁ ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus -CH₂-, -CH₂CH₂- und -CH(CH₃)CH₂- besteht, oder W die Struktur -O-(CH₂)_m-CO₂- aufweist.
Polymerzusammensetzung nach Anspruch 18, wobei T für ein Protein steht.
Polymerzusammensetzung nach Anspruch 18, wobei R für H steht.
Hydrogel, das ein homogenes Copolymerisationsprodukt eines Multiacrylats und mindestens eine Verbindung umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Verbindungen besteht, die dargestellt sind durch die Formeln CH₂=CZ-CO₂-POLY-W-POLY'-Q₁, (CH₂=CZ-CO₂-POLY-W-POLY'-L)_x-T, CH₂=CZCO₂-POLY-W-Q und (CH₂=CZCO₂-POLY-W-L)_x-T, wobei Z für H oder eine Alkylgruppe steht, POLY und POLY' für Polyalkylenoxide stehen, welche dieselben oder verschieden sein können und durch die Formel -(CH₂CHRO)_n-CH₂CHR- dargestellt sind, in der R für H oder Alkyl steht und n im Bereich von 10 bis 4.000 liegt, W eine hydrolyseinstabile Verknüpfung darstellt, die an einer einzigen Stelle abbaubar ist, Q eine funktionelle Gruppe darstellt, L für eine hydrolysestabile Verknüpfung steht, die durch die Reaktion von Q und T gebildet ist, x für eine ganze Zahl von 1 bis 10 steht und T für ein Zielmolekül steht.
Hydrogel nach Anspruch 22, wobei das Multiacrylat ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus PEG-diacrylaten und N-Vinylpyrrolidon besteht.
Hydrogel nach Anspruch 23, wobei das PEG-diacrylat CH₂=CHCO₂-PEG-O-CH₂CO₂CH(CH₃)CH₂CONH-PEGO₂CCH=CH₂ oder CH₂=CHCO₂-PEG-O-CH₂CO₂PEG-O₂CCH=CH₂ ist.
Hydrogel nach Anspruch 22, wobei T für ein Protein steht.
Hydrogel, das ein homogenes vernetztes Netzwerk mindestens einer Verbindung umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Verbindungen besteht, die dargestellt sind durch die Formeln CH₂=CZ-CO₂-POLY-W-POLY'-Q₁, (CH₂=CZ-CO₂-POLY-W-POLY'-L)_x-T, CH₂=CZCO₂-POLY-W-Q und (CH₂=CZCO₂-POLY-W-L)_x-T, wobei Z für H oder eine Alkylgruppe steht, POLY und POLY' für Polyalkylenoxide stehen, welche dieselben oder verschieden sein können und durch die Formel -(CH₂CHRO)_n-CH₂CHR- dargestellt sind, in der R für H oder Alkyl steht und n im Bereich von 10 bis 4.000 liegt, W eine hydrolyseinstabile Verknüpfung darstellt, die an einer einzigen Stelle abbaubar ist, Q eine funktionelle Gruppe darstellt, L für eine hydrolysestabile Verknüpfung steht, die durch die Reaktion von Q und T gebildet ist, x für eine ganze Zahl von 1 bis 10 steht und T für ein Zielmolekül steht.