DE69914770T2

DE69914770T2 - Mitochondriale, als tumormarker geeignete mutationen, die nur ein basenpaar betreffen

Info

Publication number: DE69914770T2
Application number: DE69914770T
Authority: DE
Inventors: Bert Vogelstein; W. Kenneth KINZLER; Kornelia Polyak
Original assignee: Johns Hopkins University; School of Medicine of Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University; School of Medicine of Johns Hopkins University
Priority date: 1998-08-20
Filing date: 1999-08-20
Publication date: 2005-05-12
Anticipated expiration: 2019-08-21
Also published as: CA2340175A1; EP1104492B1; NO20010843D0; US6750021B2; WO2000011219A1; US20020164622A1; WO2000011219A9; AU773956B2; DE69914770D1; ATE259425T1; AU5677899A; EP1104492A1; US6344322B1; NO20010843L; JP2002523061A

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft das Gebiet der Krebsgenetik. Insbesondere betrifft sie mit Krebs verbundene somatische Mutationen.
Hintergrund der Erfindung
Das humane mitochondriale Genom ist eine zirkuläre doppelsträngige 16 Kilobasen-DNA, die 13 Polypeptide der mitochondrialen Atmungskette, 22 Transfer-RNAs und zwei ribosomale RNAs, die zur Proteinsynthese erforderlich sind, kodiert. Das mitochondriale Genom ist insbesondere empfänglich für Mutationen auf Grund des hohen Grades an in der Organelle erzeugten reaktiven Sauerstoffspezies, gekoppelt mit einem niedrigen Grad an DNA-Reparaturen (7–10). Überraschenderweise gibt es wenig detaillierte Analysen von Änderungen der humanen mitochondrialen DNA bei Krebs, obwohl es Hinweise gibt, das Mitochondrien bei Neoplasie und Apoptose (2–6) sowie beim Krebswachstum (1) beteiligt sind. Ivanova et al. (Int. J. Cancer, 1998, 76: 495–498) vergleicht das mitochondriale Genom von lymphoblastoiden Zellen bei Patienten mit akuter lymphoblastischer Leukämie mit dem mitochondrialen Genom von lymphoblastoiden Zellen in normalen gesunden Kontrollpatienten, vergleicht jedoch nicht Gewebeproben, von denen angenommen wird, dass sie einen Tumor beherbergen, mit gesunden Zellen des gleichen Individuums. Es besteht daher ein Bedürfnis, eine Korrelation von Änderungen in der humanen mitochondrialen DNA und Krebs zu erkennen.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist ein Ziel der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, das den Nachweis der Gegenwart von Tumorzellen in einem Patienten unterstützt. Diese und andere Ziele der Erfindung werden durch eines oder mehrere der im Folgenden beschriebenen Ausführungsformen bereitgestellt.
Eine Ausführungsform der Erfindung stellt ein Verfahren zum Screenen der Patienten auf das Vorliegen von Tumorzellen bereit, wie es in den Patentansprüchen definiert ist.
Das Verfahren umfasst einen Schritt zur Bestimmung des Vorliegens einer Mutation eines einzelnen Basenpaars in einem mitochondrialen Genom einer Zellprobe eines Patienten. Wenn eine Substitution eines einzelnen Basenpaares in einer Zellprobe des Patienten gefunden wird, die im normalen Gewebe des Patienten nicht vorliegt, zeigt dies an, dass der Patient einen Tumor aufweist.
Die Erfindung stellt der Technik daher neue Verfahren zum Nachweis und Aufspüren von Tumoren durch Prüfen der mitochondrialen DNA auf das Auftreten somatischer Mutationen zur Verfügung.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt Beispiele für mitochondriale DNA-Mutationen. Die Sequenz des mitochondrialen Genoms wurde in normalen Zellen, Primärtumoren und Tumorzelllinien der selben Patienten bestimmt. Pfeile zeigen die G-nach-A-Transition (Antisense-Strang) bei Codon 121 des COX Untereinheit 1 Gens in Linie V425 an, eine A-Insertion in dem (A)8-Trakt des ND5-Gens in Linie V425, eine T-nach-C-Transition bei Codon 1 des ND1 Gens in Linie 478 und eine G-nach-A-Transition (Antisense-Strang) bei Codon 142 des COX Untereinheit II Gens in Linie V429.
2A bis 2C stellen somatische Zellfusionen dar. 2A. Bestätigung der erfolgreichen Kernfusion unter Verwendung nukleärer genomischer DNA Polymorphismen aus den angegebenen Linien. 2B. Analyse der mitochondrialen DNA und Verwendung der T-nach-C-Variante bei Nukleotid 4216, die eine Erkennungsstelle für N1a III (CATG) erzeugt. Die C Variante, die nach Restriktionsabbau eines 1140 bp PCR Priodukts zu 376 und 231 Fragmenten führt, liegt nur in DLD-1-Zellen vor. 2C. Zeitverlauf, über den der replikative Vorteil von DLD-1 Mitochondrien offensichtlich ist. Zunächst waren HCT116 Zell-Mitochondrien in den Fusionen geringfügig überrepräsentiert, jedoch war eine Verschiebung zu DLD-1-Mitochondrien innerhalb von fünf Tagen offensichtlich und dieser Prozess war zwischen 15 und 60 Tagen beendet. DNA wurde isoliert und die Mitochondrien wurden mittels N1a III-Abbau an den angegebenen Tagen nach Zellfusion analysiert.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Erfinder haben gefunden, dass das Vorliegen von subtilen Mutationen in den mitochondrialen Genomen als ein Mittel eingesetzt werden kann, um das Vorliegen, die Ausbreitung, die Metastase, das Wachstum oder das Wiederauftreten eines Tumors in einem Patienten aufzuspüren. Derartige subtile Mutationen schließen Substitutionen einzelner Basenpaare, Insertionen einzelner Basenpaare und Deletionen einzelner Basenpaare mit ein. Substitutionen einzelner Basenpaare können entweder Transitionen oder Transversionen sein, obwohl erstere häufiger vorkommen. Der Nachweis solcher Mutationen kann für das Screenen des ursprünglichen Auftretens eines Tumors, sowie für das Wiederauftreten eines bereits früher identifizierten Tumors brauchbar sein. Die Verfahren sind besonders geeignet zum Überwachen einer Antikrebstherapie, dem Wiederauftreten, der Metastase und der Vollständigkeit der Entfernung bei chirurgischen Eingriffen.
Eine einzelne Basenpaarsubstitution ist die Substitution einer einzelnen Nukleotidbase durch eine andere Nukleotidbase an der selben Position, und der entsprechenden Substitution der komplementären Base auf dem anderen Strang der DNA. Obwohl jede Einzelbasenpaarsubstitution innerhalb des Umfangs der Erfindung denkbar ist, sind die am häufigsten vorkommenden Substitutionen solche, die einer oxidativen Schädigung entsprechen, wie beispielsweise T nach C oder G nach A Transitionen. Die Mutationen können in proteinkodierenden Regionen, die ribosomale oder Transfer-RNAs kodieren, auftreten.
Die homoplasmische Eigenschaft der meisten mutierenden mitochondrialen Genome aus Tumoren erlauben ohne weiteres den Nachweis solcher Mutationen in einer Probe der mitochondrialen DNA eines Patienten. Homoplasmische Mutationen sind diejenigen, die im Wesentlichen in sämtlichen Kopien des mitochondrialen Genoms in einer gegebenen Zelle oder Gewebe auftreten. Jedoch sind auch heteroplasmische Mutationen, die lediglich in einer Fraktion des mitochondrialen Genoms einer Zelle oder eines Gewebes auftreten, zur erfindungsgemäßen Verwendung ebenfalls geeignet.
Jede Zellprobe eines Patienten, der ein Karzinom hat oder von dem angenommen wird, dass er ein Karzinom hat, kann getestet werden. Geeignete Zellproben umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Gewebe aus einer Wucherung, von der angenommen wird oder bekannt ist, das sie kanzerös ist, Gewebe neben einer Resektion eines Tumors und Gewebe, das entfernt von einer Tumorstelle liegt, wie Lymphknoten, von denen angenommen wird, dass sie Metastasenzellen enthalten. Zellen können auch aus Körperflüssigkeiten oder Sekretionen, z. B. Blut, Urin, Sputum, Speichel oder Stuhl erhalten werden, die Krebszellen oder Metastasenzellen enthalten können. Zellproben können auch aus anderen Körpersekretionen und -geweben entnommen wer den, wie im Stand der Technik bekannt ist. Eine Zellprobe kann aus vermuteten oder bekannten kanzerösen Gewebe oder aus Körperflüssigkeiten oder Sekretionen, die Krebszellen enthalten, sowie aus vermuteten oder bekannten normalen Gewebe und Körperflüssigkeiten oder Sekretionen, die normale Zellen enthalten, entnommen werden.
Zum Nachweis von Mutationen des mitochondrialen Genoms aus einer Zellprobe eines Patienten kann mitochondriale DNA aus einer Zellprobe mittels eines beliebigen im Stand der Technik bekannten Verfahrens isoliert werden. Eine Möglichkeit, subtile Mutationen zu identifizieren, bezieht das Sequenzieren der mitochondrialen DNA mit ein. Dies kann nach jedem im Stand der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden. Beispielsweise kann isolierte mitochondriale DNA mittels Endonukleasen in überlappende Fragmente einer zur Sequenzierung geeigneten Größe gespalten werden können, z. B. etwa 1–3 Kilobasen Länge, worauf eine Amplifizierung mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Sequenzieren der Fragmente erfolgt. Beispiele für Verfahren zur DNA-Sequenzierung befinden sich in Brumely, R. L. Jr., und Smith, L. M., 1991, Rapid DNA sequencing by horizontal ultrathin gel electrophoresis, Nucleic Acids Res. 19: 4121–4126 und Lackey, J. A., Drossman, H., Kostihka, T.; und Smith, L. M., 1993, High-speed DNA sequencing by capillary gel electrophoresis, Methods Enzymol. 218: 154–172. Amplifizierungsverfahren wie PCR können bei so kleinen Proben wie einer einzigen Zelle angewendet werden und ergeben dennoch ausreichend DNA für eine vollständige Sequenzanalyse. Die kombinierte Anwendung von PCR und Sequenzieren der mitochondrialen DNA ist in Hopgood, R., Sullivan, K. M., und Gill, P., 1992, Strategies for automated sequencing of human mitochondrial DNA directly from PCR prodcuts, Biotechniques 13: 82–92 und Tanaka, M., Hayakawa, M., und Ozawa, T., 1996, Automated sequencing of mitochondrial DNA, Methods Enzymbol. 264: 407–21 beschrieben.
Mutationen können zunächst durch Vergleiche mit Sequenzen identifiziert werden, die in öffentlichen Datenbanken für humane mitochondriale DNA vorliegen, z. B. bei http://www.gen.emory.edu/mitomap.html. Jede einzelne Basenpaarsubstitution, die durch Vergleich mit einer normalen Sequenz aus einer Datenbank in der Probe-DNA identifiziert wird kann als eine somatische Mutation bestätigt werden, im Gegensatz zu einer polymorphen Variante durch Vergleichen der mitochondrialen Probe-DNA oder aus ihr erhaltener Sequenzen mit Kontroll-DNA aus mitochondrialen Zellen des selben Individuums oder daraus enthaltenen Sequenzen. Kontroll-Zellen werden aus anderen, anscheinend normalen Geweben isoliert, d. h. Geweben, die phänotypisch normal sind und keine sichtbaren, histologischen oder immunologischen Eigenschaften von Krebsgewebe aufweisen. Eine Differenz zwischen der Probe und der Kontrolle wird als eine somatische Mutation betrachtet, die mit dem Tumor verbunden ist.
Eine Alternative zum seriellen Sequenzieren des gesamten mitochondrialen Genoms um eine einzelne Basenpaarsubstitution zu identifizieren ist die Verwendung der Hybridisierung der mitochondrialen DNA an einer Reihe von Oligonukleotiden. In der Technik sind Hybridisierungstechniken verfügbar, mit denen Mutationen rasch identifiziert werden können, indem die Hybridisierung der Probe mit passenden und nicht passenden Sequenzen verglichen wird, die auf dem humanen mitochondrialen Genom basieren. Eine solche Reihe kann einfach aus zwei Oligonukleotidsonden bestehen, deren eine Sequenz zum Wildtyp oder zur mutierenden Region, die eine einzelne Basensubstitution enthält passt (passende Sonde) und eine andere deren Sequenz eine einzelne, nicht passende Base enthält (nicht passende Kontrollprobe). Wenn die Probe-DNA mit der passenden Sonde hybridisiert, mit der nicht passenden Sonde jedoch nicht, wird festgelegt, dass sie die selbe Sequenz aufweist wie die passende Sonde. Größere Reihen, die tausende solcher passender/nicht passender Paare von Sonden auf einem Glasträger oder einem Mikrochip ("Mikroarrays" oder "Genchips") enthalten, sind erhältlich, die in der Lage sind, das gesamte mitochondriale Genom sehr rasch zu sequenzieren. Solche Arrays sind im Handel erhältlich. Übersichtsartikel, die die Verwendung von Mikroarrays in der Genom- und DNA-Sequenz-Analyse beschreiben und Links zu den Handelsanbietern sind unter www.gene-chips.com erhältlich.
Die Erfindung kann dazu verwendet werden, um Patienten, von denen angenommen wird, dass sie ein Karzinom haben, auf das Vorliegen von Tumorzellen zu screenen. Eine Zellprobe wird zunächst aus einem vermuteten Tumor des Patienten erhalten oder sie wird aus einer anderen Quelle wie Blut oder Lymphgewebe erhalten, beispielsweise wenn Metasierung angenommen wird. Die Zellprobe wird getestet, um das Vorliegen einer einzelnen Basenpaarmutation in mitochondrialer DNA aus der Zellprobe zu bestimmen, wobei die zuvor beschriebenen Techniken verwendet werden. Eine Zellprobe aus normalen, nicht kanzerösen Zellen oder Gewebe des Patienten wird ebenfalls erhalten und auf das Vorliegen oder die Abwesenheit einer einzelnen Basenpaarmutation in mitochondrialer DNA getestet. Wenn eine einzelne Basenpaarmutation bestimmt wird, die in einer Zellprobe aus normalem Gewebe des Patienten nicht vorliegt, dann ist die Mutation eine somatische Mutation und das Vorliegen von Tumorzellen im Patienten ist indiziert. Wenn eine oder mehrere einzelne Basenpaarmutationen im mitochondrialen Genom der Zellprobe des Patienten bestimmt werden, dann wird festgelegt, dass der Patient einen Tumor aufweist. Wie in jeder diagnostischen Technik für Krebs, können weitere diagnostische Techniken gerechtfertigt sein, um die Diagnose zu bestätigen oder zu erweitern. Beispielsweise können konventionelle histologische Prüfungen einer Biopsieprobe durchgeführt werden, um das Vorliegen von Tumorzellen nachzuweisen oder es kann eine Analyse eines tumorspezifischen Antigens in einer Blut- oder Gewebeprobe durchgeführt werden.
Das zuvor skizzierte Verfahren kann sowohl in dem Fall, dass die somatische Mutation bereits bekannt ist als auch in dem Fall, dass sie unbekannt ist, durchgeführt werden. Nach den Erkenntnissen der Erfinder zeigt die Identifizierung einer zuvor unbekannten somatischen Mutation in einem mitochondrialen Genom einer Zelle eines Patienten wahrscheinlich das Vorliegen von Tumorzellen in den Patienten an. Das Verfahren kann daher selbst in Abwesenheit von Vorkenntnissen über irgendeine spezielle somatische Mutation durchgeführt werden. Das Verfahren kann auch nach dem Auffinden einer somatischen Mutation in einem mitochondrialen Genom einer Zelle des Patienten oder eines anderen Patienten durchgeführt werden. Eine vorherige Assoziation einer somatischen Mutation mit dem Vorliegen eines Tumors in dem Patienten oder in einem anderen Patienten ist in diesem Fall ein starker Hinweis auf das Vorliegen von Tumorzellen in dem Patienten. Sie kann auch auf das Wiederauftreten eines Tumors oder eine unvollständige frühere Entfernung von kanzerösem Gewebe aus dem Patienten hinweisen.
Die Wirksamkeit einer Therapie kann bestimmt werden, wenn ein Tumor bereits identifiziert worden ist und gefunden wurde, dass in dem mitochondrialen Genom eine einzelne Basenpaarsubstitution enthalten ist. Wenn eine einzelne Basenpaarmutation in der mitochondrialen DNA eines Tumors des Patienten identifiziert worden ist, können weitere Tumorzellen im Gewebe um eine Resektion herum oder an anderen Stellen nachgewiesen werden, wenn eine Metastasenbildung eingetreten ist. Unter Verwendung der zuvor beschriebenen Verfahren kann das Wiederauftreten des Tumors oder seine unvollständige Entfernung festgestellt werden. Wenn ein Tumor mittels eines nichtchirurgischen Verfahrens wie beispielsweise Chemotherapie oder Bestrahlung behandelt worden ist kann der Erfolg der Therapie gleichfalls zu späterer Zeit durch Wiederholen der Analyse bewertet werden. Der Schritt der Bestimmung des Vorliegens einer einzelnen Basenpaarmutation in einem mitochondrialen Genom einer Zellprobe eines Patienten kam 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 oder mehr Male durchgeführt werden, um die Entwicklung oder Regression eines Tumors zu überwachen oder den Fortschritt oder das Fehlen eines Fortschritts der Therapie zu überwachen, die zum Eliminieren des Tumors unternommen wurde.
Mit wiederholten Analysen vereinfacht sich der Schritt der Bestimmung des Vorliegens einer einzelnen Basenpaarmutation, da lediglich eine gut definierte und beschränkte Region des Genoms sequenziert werden muss. Bei Verwendung des Hybridisierungsverfahrens ist es beispielsweise möglich, das Vorliegen der Mutation mit lediglich einem einzelnen passenden/unpassenden Paar von Oligonukleotidsonden in dem Array zu bestimmen. Für den Fall, dass ein Gemisch von Genotypen beobachtet wird, ist es möglich, quantitative Informationen über die relative Menge eines jeden mitochondrialen Genotyps zu erhalten, wobei im Stand der Technik bekannte Techniken, z. B. Hybridisierung, verwendet werden. Eine quantitative Analyse kann Veränderungen in der relativen Proportion von Tumor- zu normalen Zellen in einem Gewebe über einen Zeitraum oder in Antwort auf eine Therapie aufdecken.
Die zuvor beschriebenen Verfahren wurden zum Untersuchen von somatischen Mutationen in mitochondrialer DNA aus humanen kolorektalen Tumorzellen (siehe Beispiele 1 und 2) verwendet. Die im allgemeinen beobachteten Mutationen waren Transitionen, die G-Reste beeinflussten, die die bevorzugten Ziele für oxidative Schädigungen einer DNA im Allgemeinen und mitochondrialer DNA im Besonderen sind (zumindest in vitro) (12, 13, 17, 18). Dieses Mutationsspektrum unterstützt die Idee, das die mitochondrialen DNA-Mutationen von den reaktiven Sauerstoffsspezies herrühren, die in Mitochondrien kontinuierlich gebildet werden. Sequenzanalysen von nukleären Genen aus den selben zehn Zelllinien, die auf mitochondriale DNA-Mutationen untersucht wurden, zeigten, dass die Prävalenz von Mutationen in dem mitochondrialen Genom mindestens 10-fach höher ist als in dem nukleären Genom dieser Zellen. Vorherige Experimente haben statt der hier beobachteten subtilen Mutationen große Deletionen in der mitochondrialen DNA einiger Tumore (19–23) gezeigt. In den hier untersuchten Zelllinien wurden keine Deletionen beobachtet, trotz mehrerer Versuche, sie mittels eines multiplen Primerpaares in auf PCR beruhenden Strategien zu finden. In der Literatur sind keine vorherigen Versuche zu finden, dass nach subtilen Mutationen mitochondrialen Genome durch vollständiges Sequenzieren gesucht wurde.
Die in Tabelle 1 angegebenen Mutationen waren meist homoplasmisch, während die zuvor in Tumorzellen oder normalen Zellen von alternden Personen beobachteten Deletionen im Allgemeinen heteroplasmisch waren und lediglich in einem geringem Anteil der mitochondrialen Population (19–24) vorlagen. Die hier angegebenen Ergebnisse weichen nicht ab von einer früheren Untersuchung, bei der keine somatischen Mutationen in 200 bp der D-Loop Sequenz gefunden wurden. Diese D-Loop Sequenz enthält Promotorelemente für die Transkription des mitochondrialen Genoms, während die von den Erfindern gefundenen Mutationen auf Regionen beschränkt sind, die mitochondriale Proteine oder rRNA kodieren.
Die auffallende und unerwartete Homoplasmie der Mutationen, die durch die Erfinder identifiziert wurde, zeigt eine signifikante Selektion in mehreren Ebenen an. Zunächst muss das somatisch mutierte mitochondriale Genom besser repliziert werden als das, das in der Keimbahn vorliegt. Vorhergehende Experimente haben gezeigt, dass die Replikation von Mitochondrien individuell kontrolliert werden kann, indem Signale von aberrierend funktionierenden Mitochondrien ihre Überreplikation induzieren, vielleicht in dem Versuch einer Kompensierung (25). Die Fusionsexperimente von Beispiel 2 zeigen, dass der Prozess der mitochondrialen Selektion in Tumorzellen sehr rasch stattfinden kann (2C). Über die tausende von Generationen, die für eine Tumorigenese in vivo erforderlich sind, könnte dieser Prozess ohne weiteres zum Ersetzen sämtlicher mitochondrialer Genome in der Zelle durch eine mutante Form führen. Diese Zelle könnte dann die Population durch klonales Wachstum übernehmen, entweder weil die aberranten Mitochondrien selbst die Zelle mit einem selektiven Wachstumsvorteil ausstatteten oder weil diese Zelle eine nukleäre Genmutation erhielt, die einen solchen Vorteil verleiht.
Diese Erklärung führte zu dem Gedanken, dass die mitochondrialen Mutationen selbst eine funktionelle Wirkung aufweisen können. Es ist unwahrscheinlich, dass die meisten der beobachteten somatischen Mutationen zu größeren Störungen der mitochondrialen Funktion führen, da der Sauerstoffverbrauch und die enzymatischen Aktivitäten der Atmungskette mehrere der in Tabelle 1 aufgeführten Linien weitgehend normal waren. Stattdessen führen diese Mutationen, vielleicht zusammen mit polymorphen Variationen in mitochondrialer DNA, zu subtilen Veränderungen, die geringfügig höhere Konzentrationen an ROS erzeugen können. Es ist gezeigt worden, dass ROS-Konzentrationen stark mitogen sind, während hohe ROS-Konzentrationen toxisch sind (9). Ungeachtet ihres Auswahlmechanismuses stellen die Mutationen, die identifiziert worden sind, jedoch eine zuvor unerkannte Veränderung in Tumorzellen dar, die signifikante Wirkungen auf die zellulären Prozesse, die von Mitochondrien kontrolliert werden, aufweisen können. Ihre Homoplasmie stellt faszinierende Fragen über die Kontrolle der mitochondrialen DNA auf der Ebene der intramitochondrialen, intrazellulären und zellulären Population. Es gibt an, dass eine einzelne Zelle mit einem mutierten mitochondrialen Genom einen selektiven Wachstumsvorteil während der Tumorentwicklung erworben hat, was ihr erlaubt, in der Tumorzellpopulation ein vorherrschender Zelltyp zu werden. Darüber hinaus ist es von Bedeutung, zu erkennen, dass Zellen, einschließlich der hier verwendeten kolorektalen Karzinomzellinien, jeweils Hunderte von Mitochondrien enthalten und jedes Mitochondrion enthält ein bis zehn DNA-Moleküle (14). Die Homoplasmie zeigt daher zusätzlich, dass jedes mutierte mitochondriale Genom in dem speziellen Mitochondrion in dem es auftritt, einen replikativen Vorteil hatte und dass dieses Mitochondrion gegenüber anderen Mitochondrien der selben Zelle selektiv gewachsen war. Veränderungen der mitochondrialen Tumor-DNA können auch Hinweise auf ihren umfeldbedingten oder genetischen Hintergrund geben, eine Hypothese, die in der Zukunft unter Verwendung der DNA-Chip-Technologien (26) geprüft werden kann.
Die vorhergehende Beschreibung beschreibt die vorliegende Erfindung allgemein. Ein besseres Verständnis ergibt sich durch Bezugnahme auf die folgenden spezifischen Beispiele, die jedoch lediglich der Veranschaulichung dienen und den Umfang der Erfindung nicht einschränken sollen.
Beispiel 1
Identifizierung somatischer Mutationen in mitochondrialer DNA humaner kolorektaler Krebszellen
Um festzustellen, ob Mutationen der mitochondrialen DNA in humanen kolorektalen Tumoren vorliegen, wurde das gesamte mitochondriale Genom aus zehn humanen kolorektalen Krebszelllinien in 1–3 kb überlappenden Fragmenten PCR amplifiziert und die PCR-Produkte vollständig sequenziert. Die Verwendung großer PCR-Produkte schloss die Möglichkeit aus, dass nukleäre Pseudogene diese Analyse verkomplizieren (11).
Zelllinien und Tumore. Abstammung und Erhaltung der VACO Linien ist bereits zuvor beschrieben worden (27). Die humanen kolorektalen Krebszelllinien DLD-1, HCT116, SW837 und HT29 wurden von ATCC erhalten und in McCoy's Medium (Gibco, BRL), das mit 10%igem fetalem Rinderserum (Hyclone) und Antibiotika (Gibko, BRL) ergänzt war, gehalten.
DNA Reinigung, PCR Amplifikation und Sequenzieren. Zelluläre DNA aus Zelllinien, aus Primärtumoren und aus normaler Kolonschleimhaut wurde wie zuvor beschrieben isoliert (28). Überlappende Fragmente Qeweils 1–3 kb) des mitochondrialen Genoms wurden mittels PCR unter Verwendung dieser DNA als Templat amplifiziert. Das Sequenzierverfahren erlaubte den Nachweis einer jeden Mutation, die in > 25% der mitochondrialen DNA-Moleküle einer gegebenen Probe vorlag. In ausgewählten Zellen wurde die Richtigkeit der Sequenzdaten bestätigt, wobei gereinigte mitochondriale DNA als Template verwendet wurde. Um die Mutationen in den Primärtumoren zu bestätigen, wurden kleinere PCR-Fragmente aus mikrozerkleinerten, paraffinierten Proben der DNA erzeugt. Manuelles Sequenzieren der DNA-Fragmente wurde unter Verwendung von Thermosequenase (Amersham) und einer Genomyx Elektrophorese-Vorrichtung (Beckman) durchgeführt.
Sequenzanalyse. Die erhaltenen Sequenzen wurden zunächst mit den in der mitochondrialen Datenbank unter www.gen.emory.edu/mitomap.html aufgezeichneten verglichen. Es wurden achtundachtzig Sequenzvarianten identifiziert (4–31 pro Tumor), die in dieser Datenbank nicht aufgezeichnet waren. Diese enthielten 27 Varianten, von denen vorhergesagt wurde, dass sie die Aminosäuresequenz des kodierten Proteins verändern, 48 Varianten, die in den Proteinkodierenden Regionen lagen, von denen jedoch vorhergesagt wurde, dass die still sind, und 13, die rRNA- oder tRNA-Gene beeinflussten.
Die Datenbankrecherche ergab lediglich einen vorläufigen Nachweis für Mutationen, da somatische Mutationen nicht von seltenen Keimbahnvarianten unterschieden werden konnten. Um diese Unterscheidung zu treffen, wurden mitochondriale DNA-Sequenzen aus normalen Kolons des selben Patienten bestimmt. Diese Analyse zeigte, dass mindestens sieben der Linien tatsächliche somatische Mutationen enthielten. Drei der Linien enthielten eine einzelne Mutation während vier andere zwei oder drei Mutationen enthielten (Tabelle 1).
Jede der 27 Sequenzvarianten von denen vorausgesagt wurden, dass sie zu Aminosäureveränderungen führen, wurde evaluiert, um ihre somatische Natur zu bestimmen. Es wurde gefunden, dass acht davon somatisch waren und 19 wurden in der Keimbahn des selben Patienten gefunden. Von den 13 Varianten in rRNA- oder tRNA-Genen wurden neun auf diese Weise evaluiert und bei vier wurde gefunden, dass sie somatisch sind. Fünfundzwanzig der 48 stillen Mutationen wurden ebenfalls evaluiert und es wurde gefunden, dass keine davon somatisch war.
Von den 12 identifizierten somatischen Mutationen waren acht in proteinkodierenden Genen und vier waren in rRNA-Genen (Tabelle 1). Elf waren Nukleotidsubstitutionen und eine war eine einzelne bp Insertion. Von den acht Mutationen in proteinkodierenden Genen war eine Nonsensemutation, eine war eine 1 bp Insertion und sechs waren Missensemutationen (Tabelle 1). Alle bis auf eine der 11 nt Substitutionen waren T nach C oder G nach A Transitionen. Dieses Mutationsspektrum stimmt völlig überein mit den bekannten mutagenen Spektren oxidativer Schädigungen (12, 13).
Um festzustellen, ob diese Mutationen eher in vivo als während des Prozesses der Zellkultur entstehen, wurde DNA aus fünf der Primärtumoren aus denen die Linien abstammten, gereinigt (in zwei Fällen waren keine Primärtumore verfügbar). In jedem evaluierbaren Fall wurde die Mutation sowohl in dem Primärtumor als auch in der Zelllinie gefunden (Beispiele in 1).
Überraschenderweise lag jede der 12 Mutationen in einem großen Teil der mitochondrialen DNA-Moleküle vor und in zehn der 12 Fälle waren die Mutationen homoplasmisch, d. h. anscheinend lagen sie in jedem mitochondrialen Genom vor (Tabelle 1). Diese Homoplasmie wurde sowohl in den Primärtumoren als auch in den Zelllinien beobachtet (1.)
Beispiel 2
Proliferation von Mitochondrien, die somatische Mutationen aufweisen
Zellfusionsexperimente haben gezeigt, dass Mitochondrien aus Tumorzellen selektiv proliferieren können, wenn solche Zellen mit normalen Zellen verschmolzen werden (15). Die Erfinder suchten einen Weg, um festzustellen, ob eine ähnliche mitochondriale Dominanz bei Fusion zwischen zwei kolorektalen Krebszelllinien beobachtet werden konnte. Versuche, die Linien zu verschmelzen, die für mitochondriale Mutationen untersucht worden waren, waren aus technischen Gründen nicht erfolgreich. Es wurden daher häufiger verwendete kolorektale Krebszelllinien verwendet, in denen interzelluläre Fusionen möglich waren (16).
Geneticin-resistente DLD-1 Zellen wurden mit Hygromycin-resistenten Subklonen einer jeder der drei verschiedenen kolorektalen Krebszelllinien (HCT116, HT29 und SW837) verschmolzen. Geneticin- oder Hygromycin-resistente Klone wurden durch Transfekti on geeigneter Plasmidvektoren erhalten. Etwa 10⁶ Hygromycin-resistente Zellen wurden mit einer gleichen Anzahl Neomycin-resistenter Zellen vermischt und mittels PEG-Behandlung wie in (16) beschrieben verschmolzen. Hybride wurden ausgewählt in einem Standardwachstumsmedium das 1 mg/ml Geneticin und 0.25 mg/ml Hygromycin (DLD-1-HCT116 Fusion), 1.5 mg/ml Geneticin und 0.6 mg/ml Hygromycin (DLD-HT29 Fusion) und 1 mg/ml Geneticin und 0.25 mg/ml Hygromycin (DLD-SW837 Fusion) enthielt. Erfolgreiche Fusionen wurden durch nukleäre Genotypisierung nachgewiesen. Allelotypisierung wurde durchgeführt wie beschrieben (29) wobei das Primerpaar wg1g5A/wg1g5B oder MapPair Primerfür D19S591 und D16S764 (Research Genetics) verwendet wurden. Amplifizierte Fragmente wurden mittels Elektrophorese in 8% Polyacrylamidgelen zerlegt. Reaktionen, wobei radioaktiv markierte Primer verwendet wurden, wurden auf einem 4,5% Sequenziergel (Genomyx) aufgetrennt, während Reaktionen, bei denen Fluoreszenz-markierte Primer verwendet wurden, auf einem ABI Sequenziersystem (Perkin-Elmer) analysiert wurden.
Der Erfolg der Fusion wurde gezeigt, indem nukleäre genomische Polymorphismen (2A) verwendet wurden. Ein vollständiges Sequenzieren der mitochondrialen Genome ergab 3–7 potentielle Varianten in jeder Linie; es konnte nicht festgestellt werden, welche von diesen somatisch waren, da normale Zellen, die von den Personen abstammten, von denen die Zelllinien abstammten, nicht verfügbar waren. Diese Varianten stellten jedoch ein bequemes Verfahren bereit, um das Schicksal der mitochondrialen DNA in den Fusionen zu verfolgen. Insbesondere wurde eine T nach C Variante bei Nukleotid 4216 verwendet, die eine Restriktionsendonuklease-Erkennungsstelle für N1a III (2B) erzeugt. Die C Variante lag in DLD-1 Zellen vor, nicht jedoch in irgendeiner der anderen drei Linien. Wie in 2B gezeigt ist, waren die DLD-1 Mitochondrien gegenüber den anderen Mitochondrien in jeder der Fusionen "dominant". Alle drei getesteten Klone, die von DLD-1/HCT116-Fusionen abstammten, enthielten Mitochondrien mit ausschließlichem DLD-1-Ursprung. Ein Pool von über 100 stabilen Klonen aus dieser Funktion enthielt ebenfalls lediglich Mitochondrien aus DLD-1 Zellen. DLD-1 Mitochondrien waren auch gegenüber denjenigen aus HT29 und SW837 Zellen dominant, wobei sie entweder den gesamten oder den größten Teil der mitochondrialen Genome in den getesteten Klonen beitrugen (2B).
Um den Zeitverlauf zu bestimmen, über den der replikative Vorteil von DLD-1 Mitochondrien stattfand wurden gepoolte Klone aus DLD-1/HCT116 Fusionen verfolgt. Zu Beginn dieses Experiments lag ein Gemisch aus mitochondrialen Genomen mit einem geringen Überschuss der Mitochondrien aus HCT116 Zellen vor. Innerhalb von fünf Tagen wurde eine Verlagerung in Richtung der DLD-1 Mitochondrien offensichtlich und zwischen 15 und 60 Tagen nach der Fusion trat eine größere Verschiebung ein, wobei zu diesem Zeitpunkt lediglich DLD-1 Mitochondrien in den Hybriden verblieben waren (2C). Ob es streng genommen die Mitochondrien waren oder ein Kombination aus nukleären und mitochondrialen Faktoren, die für die Selektion für DLD-1 Mitochondrien verantwortlich waren, konnte nicht festgestellt werden. Diese Experimente dokumentieren jedoch eindeutig, dass Tumormitochondrien eines Typs einen signifikanten replikativen Vorteil gegenüber anderen Typen aufweisen können und sie stimmen mit anderen Experimenten überein, die das Potential für mitochondriale Dominanz (15) dokumentieren.
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Claims

Verfahren zum Stützen des Nachweises des Vorliegens einer Tumorzelle in einem Patienten, umfassend: Testen einer ersten und einer zweiten Zellprobe eines Patienten, um das Vorliegen einer einzelnen Basenpaarmutation in einem mitochondrialen Genom der ersten Zellprobe des Patienten zu bestimmen, wobei die erste Zellprobe aus einem vermuteten Tumor des Patienten oder einer Körperflüssigkeit oder Sekretion, von der angenommen wird, dass sie Krebszellen enthält, stammt und die zweite Zellprobe aus nicht-kanzerösen Zellen des Patienten stammt; und Feststellen, dass der Patient einen Tumor hat, wenn ein oder mehrere einzelne Basenpaarmutationen in dem mitochondrialen Genom der ersten Zellprobe des Patienten bezogen auf die zweite Zellprobe des Patienten festgestellt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei vor dem Testschritt die Mutation in einem Tumor identifiziert worden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste Zellprobe aus einem Gewebe stammt, von dem vermutet wird, dass es eine Metastase enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste Zellprobe aus Blut stammt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste Zellprobe aus Urin stammt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste Zellprobe aus Sputum stammt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste Zellprobe aus Speichel stammt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste Zellprobe aus Stuhl stammt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Testschritt ein Amplifizieren der mitochondrialen DNA umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Testschritt ein Sequenzieren mitochondrialer DNA umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Testschritt ein Hybridisieren der DNA umfasst, die aus dem mitochondrialen Genom der Zellprobe amplifiziert worden ist, mit einer Reihe von Oligonukleotiden, die passende und nicht-passende Sequenzen zur menschlichen mitochondrialen genomischen DNA umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die einzelne Basenpaarmutation eine Substitutionsmutation ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die einzelne Basenpaarmutation eine Ein-Basenpaar-Insertion ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die einzelne Basenpaarmutation eine Ein-Basenpaar-Deletion ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die einzelne Basenpaarmutation eine Transitionsmutation ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die einzelne Basenpaarmutation eine homoplasmische Mutation ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die einzelne Basenpaarmutation eine T→C-Substitution an Position 710 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die einzelne Basenpaarmutation eine T→C-Substitution an Position 1738 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die einzelne Basenpaarmutation eine T→C-Substitution an Position 3308 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die einzelne Basenpaarmutation eine G→A-Substitution an Position 8009 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die einzelne Basenpaarmutation eine G→A-Substitution an Position 14985 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die einzelne Basenpaarmutation eine T→C-Substitution an Position 15572 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die einzelne Basenpaarmutation eine G→A-Substitution an Position 9949 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die einzelne Basenpaarmutation eine T→C-Substitution an Position 10563 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die einzelne Basenpaarmutation eine G→A-Substitution an Position 6264 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die einzelne Basenpaarmutation eine A-Insertion an Position 12418 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die einzelne Basenpaarmutation eine T→C-Substitution an Position 1967 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die einzelne Basenpaarmutation eine T→A-Substitution an Position 2299 ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Mutation zuvor in einem Tumor eines Patienten identifiziert wurde.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei der Patient eine Krebstherapie erhalten hat und der Testschritt mindestens drei mal durchgeführt wird, um einen Fortschritt der Krebstherapie aufzuzeichnen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste Zellprobe aus einem vermuteten kolorektalen Tumor stammt.