DE69921178T2 - Hapten-träger-konjugate zur behandlung und vorbeugung von nikotinabhängigkeit - Google Patents

Hapten-träger-konjugate zur behandlung und vorbeugung von nikotinabhängigkeit Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Behandlung und Vorbeugung von Nikotinabhängigkeit. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf neuartige Hapten-Träger-Konjugate, die die Produktion von Antikörpern induzieren können. Solche Antikörper sind in der Lage, spezifisch an Nikotin zu binden. Darüber hinaus sieht die vorliegende Erfindung vor, Nikotinabhängigkeit vorzubeugen oder zu behandeln durch die Verabreichung eines Nikotin-Träger-Konjugates in einer pharmazeutisch akzeptablen Formulierung. Vorliegende Erfindung betrachtet auch die Nutzung der Antikörper, die als Antwort auf das Hapten-Träger-Konjugat erzeugt wurden, zur Vorbeugung und Behandlung von Nikotinabhängigkeit.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Das Rauchen von Zigaretten, Zigarren und Pfeifen ist ein weitverbreitetes Problem in den Vereinigten Staaten und weltweit. Rauchtabak und rauchloser Tabak sind reich an Nikotin, einer als abhängig machend bekannten Substanz. Nikotin ist ein aus der Tabakpflanze gewonnenes Alkaloid, das die psychoaktiven und abhängig machenden Effekte des Rauchens verursacht. Nikotin besteht aus zwei Ringen, die durch eine einzige Bindung verbunden sind: einem aromatischen sechsgliedrigen Ring (Pyridin) und einem aliphatischen fünfgliedrigen Ring (Pyrrolidin). Das Pyrrolidin ist N-methyliert und durch sein Kohlenstoffatom-2 mit dem Kohlenstoffatom-3 des Pyridins verbunden. Daher ist Kohlenstoffatom-2 chiral, und die Einfachbindung zwischen den beiden Ringen ist praktisch frei drehbar. Es wurde ermittelt, daß die absolute Konfiguration von Kohlenstoffatom-2 S ist. Daher ist die natürliche Konfiguration von Nikotin (S)-(-)-Nikotin.
  • Der Gebrauch von Nikotin ist weitverbreitet wegen der einfachen Verfügbarkeit von Zigaretten, Zigarren, Pfeifen und rauchlosem Tabak. Laut US-Gesundheitsministerium ist das Zigarettenrauchen die Hauptursache verhinderbarer Todesfälle in den Vereinigten Staaten (siehe auch McGinnis et al., J. Am. Med. Assoc., 270, 2207-2211 (1993)). Es wurde auch berichtet, daß Passivrauchen schwerwiegende schädliche Einflüsse auf die Gesundheit hat, einschließlich der Verschlimmerung von Asthma.
  • Obwohl die abhängig machende Wirkung von Nikotin wohlbekannt ist, ist Zigarettenrauchen weitverbreitet. Spitzenwerte von Nikotin im Blut, etwa 25-50 Nanogramm/ml, werden innerhalb von 10-15 Minuten nach dem Rauchen einer Zigarette erreicht. Bei Menschen führt das Rauchen einer Zigarette zu arteriellen Nikotinkonzentrationen, die zehnfach gegenüber venösen Nikotinkonzentrationen erhöht sind, weil Nikotin schnell aus den Lungen ins Herz transportiert wird (siehe Henningfield (1993) Drug Alcohol Depend. 33:23-29). Dies führt zu einem schnellen Transport von hohen arteriellen Nikotin-Konzentrationen ins Gehirn. Sobald Nikotin die Blut-Hirn-Schranke überwindet, sprechen Anzeichen dafür, daß es an cholinerge Rezeptoren bindet, die normalerweise durch den an Atmung, Steuerung der Herzfrequenz, Gedächtnis, Aufmerksamkeit und Muskelbewegung beteiligten Neurotransmitter Acetylcholin aktiviert werden. Bindet Nikotin an diese Rezeptoren, kann es die normale Gehirnfunktion beeinflussen, indem es die Freisetzung anderer Neurotransmitter wie Dopamin auslöst. Dopamin wird im Gehirn in Regionen gefunden, die mit Emotion, Motivation und Glücksgefühlen zu tun haben. Es ist die Freisetzung von Neurotransmittern, insbesondere Dopamin, die die Abhängigkeit eines Tabakbenutzers von Nikotin oder von einer anderen Art von Nikotinaufnahme auslöst.
  • Wegen der bedeutenden widrigen Effekte des Rauchens auf die Gesundheit versuchen Raucher es oft einzustellen. Der abhängig machende Charakter von Nikotin und die Verfügbarkeit von Zigaretten verstärken jedoch die fortgesetzte Abhängigkeit von Nikotin und die hohe Scheiternsquote derer, die das Rauchen einzustellen versuchen. Die Entwöhnungssymptome sind unangenehm und werden durch Rauchen gelindert.
  • Es wurden viele Therapien für Nikotinabhängigkeit entwickelt, die jedoch weitgehend ineffektiv sind. Die zwei populärsten Therapien bleiben das transdermale Nikotinpflaster und in Kaugummi integriertes Nikotin. Diese Therapien, genannt „Nikotinersatztherapien" („nicotine replacement therapies", NRT), ersetzen die Nikotinmenge, die der Benutzer zuvor durch das Rauchen aufnahm, und wirken darauf hin, den Benutzer des Nikotins zu entwöhnen. Man sieht jedoch gewisse Nachteile bei dieser Therapieart. Insbesondere geht das Nikotin nur schwer in den Blutstrom über, was zu einem erhöhten Wunsch zu rauchen führt. Probleme wie Mundreizungen, Kieferschmerzen oder Übelkeit wurden mit dem Gebrauch von Nikotinkaugummi in Verbindung gebracht. Probleme wie Hautreizungen, Schlafstörungen und Nervosität wurden mit dem Gebrauch von transdermalen Nikotinpflastern verbunden.
  • Aus diesem Grunde wird eine alternative Methodik zur Behandlung von Nikotinabhängigkeit benötigt. Die Literatur würdigt diese Notwendigkeit, und es gab mehrere Versuche, eine Methodologie zur Behandlung von Nikotinabhängigkeit zu erstellen. Eine dieser Methoden beinhaltet die Verabreichung von Antikörpern, die als Antwort gegen Nikotin erzeugt wurden. Verbindungen mit geringem Molekulargewicht, genannt Haptene, können jedoch bekanntlich keine Immunantwort in Wirtstieren auslösen. Nikotin ist hier keine Ausnahme und als Kleinmolekül nicht immunogen. Um eine Antikörper-Antwort auf ein Hapten auszulösen, ist es üblicherweise kovalent an ein Träger-Protein gebunden, und der Komplex wird dann die Produktion von Antikörpern, die das Hapten erkennen, auslösen.
  • Zum Beispiel wurde Cotinin-4'-Carbonsäure, kovalent an Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (keyhole limpet hemocyanin, KLH) gebunden, benutzt, um Antikörper gegen den Nikotin-Metaboliten Cotinin zu erzeugen. Diese Antikörper wurden benutzt, um die Anwesenheit von Cotinin in physiologischen Flüssigkeiten zu bestimmen. Siehe Bjerke et al., J. Immunol. Methods, 96, 239-246 (1987).
  • Weitere Nikotin-Antikörper wurden von Castro et al. (Eur. J. Biochem., 104, 331-340 (1980)) hergestellt. Castro et al. stellten Nikotinhaptene her, konjugiert mit Rinder-Serumalbumin (BSA), wobei das Trägerprotein über einen Linker an der 6-Position von Nikotin konjugiert ist. Castro et al. stellten weitere Nikotin-Konjugate von BSA her, die in Säugetiere injiziert wurden, um Antikörper zu erzeugen. In einer anderen Veröffentlichung (Biochem. Biophys. Res. Commun. 67, 583-589 (1975)) offenbaren Castro et al. zwei Nikotin-Albumin-Konjugate: N-Succinyl-6-amino-(±)-nikotin-BSA und 6-(σ-Aminocapramido)-(±)-nikotin-BSA. In dieser Veröffentlichung von 1975 benutzten Castro et al. auch Antikörper gegen das Nikotin-Träger-Konjugat 6-(σ-Aminocapramido)-(±)-nikotin-BSA, um die Nikotinspiegel in Blut und Urin festzustellen, siehe Res. Commun. Chem. Path. Pharm. 51, 393-404 (1986).
  • Swain et al. (WO 98/14216) offenbaren Nikotin-Träger-Konjugate, bei denen das Hapten an der 1-, 2-, 4-, 5-, 6- oder 1'-Position des Nikotins konjugiert ist. Hieda et al. zeigten, daß mit 6-(Carboxymethylureido)-(±)-nikotin, das an Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin gekoppelt war, immunisierte Tiere für Nikotin spezifische Antikörper produzierten. J. Pharm. and Exper. Thera. 283, 1076-1081 (1997). Langone et al. stellten das Hapten-Derivat O-Succinyl-3'-hydroxymethyl-nikotin her, siehe Biochemistry, 12, 5025-5030, und benutzten die Antikörper gegen dieses Hapten-Träger-Konjugat in Radioimmunoassays. Siehe Methods in Enzymology, 84, 628-635 (1982). Das von Langone hergestellte Konjugat ist anfällig für Hydrolyse. Darüber hinaus beschreiben Abad et al. in Anal. Chem., 65, 3227-3231 (1993) die Konjugierung von 3'-(Hydroxymethyl)nikotin-Hemisuccinat an bovines Serumalbumin zur Produktion von Antikörpern gegen Nikotin, um den Nikotingehalt in Rauchkondensat von Zigaretten in einem ELISA-Assay messen zu können.
  • Daher lehrt der Stand der Technik kein stabiles Nikotin-Träger-Konjugat, das den chiralen Charakter des Nikotinhaptens bewahrt, und das das Hapten in einer Weise an den Träger bindet, die die Beschaffenheit des Nikotin-Epitops oder der Niktotin-Epitope erhält. Darüber hinaus lehrt oder suggeriert der Stand der Technik keine Verfahren zur Vorbeugung und Behandlung von Nikotin-Abhängigkeit durch die Verwendung solcher Konjugate. Seeman offenbart in Heterocycles, 22, 165-193 (1984) Ergebnisse einer Studie über die Konformationsanalyse und chemische Reaktivität von Nikotin.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Als Reaktion auf den Bedarf an einer effektiveren Methodologie zur Behandlung von Nikotinabhängigkeit ist es ein Ziel dieser Erfindung, neue Nikotin-Träger-Konjugate zu liefern, die stabil sind, Nikotin in seinem natürlichen (S)-(-)-Zustand enthalten und eine Nikotin-Träger-Verknüpfung benutzen, die den Charakter des oder der Nikotin-Epitope(s) sowie die relative Orientierung der zwei Ringe des Nikotin-Moleküls erhält. Man geht davon aus, daß beide Nikotin-Ringe und ihre relative Orientierung zueinander essentiell für die Erkennung durch Nikotin-Antikörper in Lösung sind. Solche Konjugate sind in der Lage, die Produktion von Antikörpern anzuregen, die spezifisch an Nikotin binden können. Durch den Gebrauch der erfinderischen Konjugate haben die Erfinder in Säugetieren den Serum-Nikotinspiegel erhöht und den Gehirn-Nikotinspiegel verringert. Des weiteren haben die Erfinder durch den Gebrauch der Konjugate der Erfindung auch nikotininduzierte Änderungen des Blutdrucks und lokomotorische Effekte verhindert.
  • In einem weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung wird eine Methode zur Behandlung von Nikotin-Abhängigkeit, durch die Verabreichung eines Konjugates dieser Erfindung an einen nikotinabhängigen Patienten, wodurch in diesem Patienten anti- Nikotin-Antikörper gebildet werden, bereitgestellt. Daher wird, wenn der Patient raucht (oder Kautabak benutzt), das Nikotin aus diesen Produkten durch die anti-Nikotin-Antikörper im Blut gebunden, was verhindert, daß das Nikotin die Blut-Hirn-Schranke durchschreitet, und damit nikotininduzierte Veränderungen der Gehirn-Chemie unterbindet, die der Ausgangspunkt für Nikotin-Abhängigkeit sind. In diesem Zusammenhang ist es wichtig, daß das Nikotin-Träger-Konjugat die Produktion von Antikörpern anregt, die das native Nikotin-Molekül erkennen. Wie zuvor beschrieben, erhalten die neuartigen Nikotin-Träger-Konjugate dieser Erfindung die Chiralität und das/die Epitop(e) natürlich vorkommenden Nikotins.
  • Die Erfinder beabsichtigen nicht, an irgendeine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wie die Nikotin-Konjugate und die als Antwort auf solche Konjugate erzeugten Antikörper die Effekte von von Säugetieren aufgenommenem Nikotin hemmen. Über die Verhinderung der Überschreitung der Blut-Hirn-Schranke durch Nikotin hinaus könnten die Antikörper durch einfache sterische Blockierung auch verhindern, daß Nikotin an andere Rezeptoren im peripheren Nervensystem bindet.
  • Diese Zielsetzungen können durch die Bereitstellung eines Hapten-Träger-Konjugates der Formel (I) erreicht werden:
    Figure 00060001
    wobei m 1 bis 2500 ist, n 0 bis 12 ist, y 1 bis 12 ist, X ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH, CO-NH-NH-CO, und S-S; Y ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH, CO-NH-NH-CO, und S-S; und der -(CH2)n-X-(CH2)y-Y-Rest an die 3', 4' oder 5'-Position gebunden ist. In einer bevorzugten Ausführungsform des Hapten-Träger-Konjugates ist m 11 bis 17, n ist 1, y ist 2, X ist NH-CO, Y ist CO-NH, das Trägerprotein ist Exoprotein A und der -(CH2)n-X-(CH2)y-Y-Rest ist an die 3'-Position gebunden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Hapten-Träger-Konjugates ist m 11 bis 17, n ist 1, y ist 2, X ist NH-CO, Y ist CO-NH, das Träger-Protein ist Exoprotein A und der -(CH2)n-X-(CH2)y-Y-Rest ist an die 4'-Position gebunden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Hapten-Träger-Konjugates ist m 11 bis 17, n ist 1, y ist 2, X ist NH-CO, Y ist CO-NH, das Träger-Protein ist Exoprotein A und der -(CH2)nX-(CH2)y-Y-Rest ist an die 5'-Position gebunden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist m ausgewählt aus der Gruppe, umfassend 1 bis 20 und 1 bis 200.
  • Obige Zielsetzungen können auch durch die Bereitstellung eines Hapten-Träger-Konjugates der Formel (III) erreicht werden:
    Figure 00070001
    wobei n 0 bis 12 ist, j 1 bis 1000 ist, k 1 bis 20 ist und E eine aminosäureenthaltende Matrix ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Matrix Poly-L-Glutaminsäure.
  • Die Zielsetzungen können auch erreicht werden durch die Bereitstellung eines Antikörpers, der als Antwort auf das Hapten-Träger-Konjugat aus Formel (I) produziert wird. In einer weiteren Ausführungsform ist der Antikörper ein funktionales Fragment. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper. In einer zusätzlichen Ausführungsform der Erfindung ist der Antikörper polyklonal.
  • Die Zielsetzungen können auch erreicht werden durch die Bereitstellung eines Antikörpers, der als Antwort auf das Hapten-Träger-Konjugat aus Formel (III) produziert wird. In einer weiteren Ausführungsform ist der Antikörper ein funktionales Fragment. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper. In einer zusätzlichen Ausführungsform der Erfindung ist der Antikörper polyklonal.
  • Die Zielsetzungen können erreicht werden durch die Bereitstellung einer Methode zur Behandlung oder Vorbeugung von Nikotin-Abhängigkeit bei einem Patienten, der eine solche Behandlung benötigt, die die Verabreichung einer therapeutisch effektiven Menge des Hapten-Träger-Konjugates aus Formel (I) oder (III) umfaßt. Alternativ können die Zielsetzungen erreicht werden durch die Bereitstellung einer Methode zur Behandlung oder Vorbeugung von Nikotin-Abhängigkeit bei einem Patienten, der eine solche Behandlung benötigt, die die Verabreichung einer therapeutisch effektiven Menge an Antikörpern, die als Antwort auf Hapten-Träger-Konjugate der Formel (I) oder (III) erzeugt wurden, umfaßt.
  • Darüber hinaus können die Zielsetzungen erreicht werden durch die Bereitstellung einer Impfstoffzusammensetzung, die das Hapten-Träger-Konjugat aus Formel (I) oder (III) einschließt. Zusätzlich kann der Impfstoff eine weitere therapeutische Verbindung zur Behandlung von Nikotinabhängigkeit umfassen.
  • Die Zielsetzungen können auch erreicht werden durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines Antikörpers, der die Immunisierung eines Wirtssäugers mit einem Hapten-Träger-Konjugat der Formel (I) oder (III) umfaßt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der produzierte Antikörper ein monoklonaler Antikörper. In einer weiteren Ausführungsform ist der Antikörper polyklonal.
  • Weitere Ziele können erreicht werden durch die Bereitstellung eines Kits zur Bestimmung der Anwesenheit von Nikotin in einer Probe, das einen Antikörper, der als Antwort auf das Hapten-Träger-Konjugat der Formel (I) oder (III) erzeugt wurde, enthält.
  • Diese und weitere für den Fachmann offensichtliche Zielsetzungen sind durch die unten in der detaillierten Beschreibung und den angehängten Ansprüchen beschriebene Erfindung erreicht worden.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist ein Diagramm, das den Effekt aktiver Immunisierung mit einem 3'-AMNic-Suc-rEPA-Konjugat-Impfstoff auf den Blutserum-Nikotinspiegel in Ratten nach einer einmaligen Injektion von Nikotin zeigt. Die Serum-Nikotinwerte 3 und 10 Minuten nach Nikotin-Injektion sind abgebildet.
  • 2 zeigt den Effekt passiver Immunisierung mit Antikörpern gegen 3'-AMNic-Suc-rEPA auf den Nikotinspiegel in Blut und Gehirn von Ratten. Die Ratten wurden mit 12,5, 25 und 50 mg Antikörper behandelt.
  • 3 zeigt den Effekt passiver Immunisierung mit Antikörpern gegen 3'-AMNic-Suc-rEPA auf den Nikotinspiegel in Blutserum und Gehirn von Ratten. Die Nikotinspiegel wurden 30 Minuten und 1 Tag nach Antikörper-Verabreichung sowie 3 Minuten nach Nikotin-Injektion gemessen.
  • 4 zeigt den Effekt passiver Immunisierung mit Antikörpern gegen 3'-AMNic-Suc-rEPA auf den Nikotinspiegel im Blutserum von Ratten, die mehrfache Dosen Nikotin erhielten.
  • 5 zeigt den Effekt passiver Immunisierung mit Antikörpern gegen 3'-AMNic-Suc-rEPA auf den Nikotinspiegel im Gehirn von Ratten, die mehrfache Dosen Nikotin erhielten.
  • 6 zeigt den Effekt passiver Immunisierung mit Antikörpern gegen 3'-AMNic-Suc-rEPA auf nikotininduzierte lokomotorische Effekte in Ratten.
  • 7 zeigt den Effekt passiver Immunisierung mit Antikörpern gegen 3'-AMNic-Suc-rEPA auf die nikotininduzierte Zunahme des systolischen Blutdrucks. Die Abbildung zeigt, daß zunehmende Mengen an Antikörper die Effektivität der Antikörper bei der Erniedrigung der Blutdruckzunahme durch Nikotin erhöhen.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Vorliegende Erfindung stellt ein Nikotinhapten-Träger-Konjugat zur Behandlung von Nikotin-Abhängigkeit bereit. Das Nikotinhapten-Träger-Konjugat besitzt die Formel (I):
    Figure 00100001
    wobei m 1 bis 2500 ist; n 0 bis 12 ist; y 1 bis 12 ist; X ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH, CO-NH-NH-CO und S-S; Y ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH, CO-NH-NH-CO und S-S; das Träger-Protein jedes geeignete immunogene Protein oder Polypeptid ist. Vorzugsweise kann das Träger-Protein ein T-Zell-Epitop enthalten, und der -(CH2)n-X-(CH2)y-Y-Rest ist an der 3'-, 4'- oder 5'-Position des Nikotin-Moleküls gebunden.
  • In Formel (I) ist m vorzugsweise 1 bis 200. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist m 1 bis 20. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist m 11 bis 17. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist X ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH und CO-NH-NH-CO.
  • Wenn m größer als 1 ist, wird der Rest in Klammern m-mal an verschiedene Anheftungsstellen des Träger-Proteins angeheftet. Wenn zum Beispiel m = 2 ist, wäre die Formel (I):
    Figure 00110001
  • Da Antikörper nicht als Antwort auf Nikotin selbst erzeugt werden können, haben die gegenwärtigen Erfinder ein Nikotinhapten entwickelt, das an der 3'-, 4'- oder 5'-Position von Nikotin derivatisiert ist. Dieser Rest ist an ein Träger-Protein gebunden, um ein Hapten-Träger-Konjugat zu erhalten, das Antikörper gegen den Nikotin-Bestandteil erzeugen kann, wenn es in ein geeignetes Wirtssäugetier injiziert wird. In diesem Zusammenhang muß das Träger-Protein immunogen sein, damit eine pharmazeutische Zusammenstellung, umfassend das Hapten-Träger-Konjugat, die Produktion von Antikörpern nach Verabreichung an ein Säugetier anregen kann. Vorzugsweise wird es ein T-Zell-Epitop enthalten. Wenn daher das Träger-Protein an das Nikotinhapten konjugiert ist und daraufhin an ein Säugetier verabreicht wird, produziert das Säugetier Antikörper als Antwort auf das Nikotinhapten.
  • Haptene und Derivatisierung
  • Der Begriff „Hapten", wie er in vorliegender Erfindung gebraucht wird, bezieht sich auf eine organische Verbindung mit niedrigem Molekulargewicht, die selbst keine Immunantwort hervorrufen kann, jedoch eine Immunantwort hervorrufen wird, sobald sie an ein Träger-Molekül gekoppelt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Hapten an den Träger über einen Linker gekoppelt. Ein Hapten der vorliegenden Erfindung ist ein Nikotin-Derivat. Dieses Nikotinhapten enthält eine reaktive funktionelle Gruppe, an die der Träger direkt, oder über einen Linker, oder über eine Matrix, oder über einen Linker und eine Matrix gekoppelt werden kann. Vorzugsweise ist das Nikotinhapten an das Träger-Protein über eine Amid- oder eine Disulfid-Bindung gekoppelt. Amid- und Disulfid-Bindungen haben die wünschenswerte Eigenschaft der Stabilität. Da die Hapten-Träger-Konjugate der Erfindung als Impfstoffe verwendet werden, ist es wichtig, daß die Konjugate stabil sind, um die Haltbarkeit der Impfstoffe zu verlängern.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Nikotinhapten durch Formel (II) dargestellt:
    Figure 00120001
    wobei n 0 bis 12 ist, Z NH2, COOH, CHO oder SH ist, und -(CH2)n-Z an der 3'- 4'- oder 5'-Position gebunden sein kann. Der Z-Rest ist in der Lage, an einen Träger zu binden, direkt oder über einen Linker. Das Träger-Hapten-Konjugat wird die Produktion von Antikörpern anregen, sobald es in den Körper eines Patienten oder eines Tieres eingeführt wird.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform besitzt das Nikotinhapten folgende Formel (3'-Aminomethyl-nikotin):
    Figure 00130001
  • 1. Direkte Konjugate
  • Um ein „direktes Konjugat" herzustellen, wird ein einzelnes Nikotinhapten direkt an einen Träger gekoppelt, mit oder ohne Linker. Zum Beispiel kann ein einzelnes Nikotinhapten an jede verfügbare Amingruppe des Trägers gekoppelt werden. Allgemeine Methoden zur direkten Kopplung von Haptenen an Träger-Proteine unter Gebrauch eines homobifunktionellen oder eines heterobifunktionellen Cross-Linkers sind beschrieben, etwa von G.T. Hermanson in Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996) und von Dick und Beurret in Conjugate Vaccines. Contribu. Microbiol. Immunol., Karger, Basel (1989) Band 10, 48-114. Bei direkter Konjugierung mittels bifunktioneller Cross-Linker ist das molare Verhältnis von Hapten zu Protein begrenzt durch die Anzahl von funktionellen Gruppen, die auf dem Protein für spezifische Konjugationschemie verfügbar sind. Zum Beispiel werden bei einem Träger-Protein, das eine Anzahl n Lysin-Reste besitzt, theoretisch n+1 primäre Amine (unter Einschluß der N-terminalen Aminogruppe) für eine Reaktion mit der Carboxyl-Gruppe des Linkers verfügbar sein. Daher wird bei Anwendung dieser direkten Konjugations-Prozedur das Produkt darauf beschränkt sein, n+1 gebildete Amido-Bindungen zu besitzen, d.h. ein Maximum von n+1 gekoppelten Haptenen.
  • Der Fachmann wird erkennen, daß, abhängig von der Konzentration an Reaktanden, die zur Konjugation des Nikotinhaptens an das Träger-Protein benutzt werden, und vom Charakter des Trägerproteins, das Verhältnis von Hapten zu Träger variieren wird. Innerhalb einer gegebenen Präparation von Nikotin-Träger-Konjugat wird es auch Variationen beim Hapten/Träger-Verhältnis jedes individuellen Konjugates geben. Zum Beispiel sind in Exoprotein A theoretisch 15 Amine für die Konjugation mit Hapten verfügbar. Die Erfinder haben jedoch ermittelt, daß, wenn 3'-Aminomethyl-succinyl-nikotin an dieses Protein konjugiert wurde, in einer einzelnen Präparation des Konjugats 11 bis 17 Nikotinhaptene an jeden Exoprotein-A-Träger gekoppelt wurden. Diese Spanne wurde experimentell ermittelt unter Anwendung von Gasfiltrationschromatographie und Messung der Zunahme der UV-Absorption bei 260 nm. An einige Träger waren 17 Nikotine gekoppelt, weil das Nikotinhapten auch an Nicht-Amin-Gruppen auf dem Träger koppeln kann. Beispiele für Nicht-Amin-Gruppen, an die das Hapten koppeln kann, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf -SH und -OH-Gruppen. Die Häufigkeit dieser Nebenreaktionen ist jedoch gering.
  • 2. Matrix-Konjugate
  • Um die Beschränkungen bei der Anzahl an Haptenen, die an den Träger über direkte Konjugation gekoppelt werden können, zu umgehen, kann eine Aminosäure-„Matrix" verwendet werden. Der Begriff „Matrix" bezeichnet eine Aminosäure, ein Peptid, ein Dipeptid oder ein Polypeptid, einschließlich oligomerer und polymerer Polypeptide. Eine Matrix kann auch ein lineares oder verzweigtes Polypeptid sein. Beispiele von Aminosäuren, die zur Bildung einer Matrix verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Asparaginsäure, Lysin, Cystein und L-Glutaminsäure. Solche Matrix-Matertalien können in Polymere wie Poly-L-Glutaminsäure formuliert werden. Wenn eine Aminosäure wie Cystein verwendet wird, wird die Thiol-Gruppe geschützt, was erlaubt, das Hapten an die Carboxyl-Gruppe der Aminosäure zu koppeln. Ein Fachmann wäre sehr vertraut mit Typen von Schutzgruppen und Wegen zur Anbringung von Schutzgruppen an funktionelle Gruppen von Aminosäuren. Zur Diskussion siehe Green, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC CHEMISTRY, John Wiley & Sons, New York, 1991.
  • Eine geeignete Matrix besitzt eine geeignete funktionelle Gruppe und wird mit zwei oder mehr Haptenen beladen. Daher wird in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die nikotinsubstituierte Matrix an das Träger-Protein konjugiert, um das Haptenzu-Träger-Verhältnis im Hapten-Träger-Konjugat zu erhöhen. Die Matrix spielt eine doppelte Rolle, zum einen als Träger für eine große Anzahl Haptene, und zum anderen als Cross-Linker. Die nikotinsubstituierte, an ein Träger-Protein konjugierte Matrix wird durch Formel (III) dargestellt:
    Figure 00150001
    wobei n 0 bis 12 ist, j 1 bis 1000 ist, k 1 bis 20 ist, E eine aminosäurehaltige Matrix ist, an die ein Hapten gebunden werden kann, und das Träger-Protein irgendein geeignetes Protein oder Polypeptid ist, das ein T-Zell-Epitop umfaßt. Die aminosäurehaltige Matrix E kann eine Aminosäure, ein Peptid, Dipeptid oder ein Polypeptid sein, einschließlich oligomerer als auch polymerer Polypeptide. Die Matrix umfaßt eine oder mehrere Aminosäuren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Asparaginsäure, Lysin, Cystein und Poly-L-Glutaminsäure. In einer bevorzugten Ausführungsform ist j 1 bis 200, und in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist j 1 bis 4.
  • Matrix-Träger-Konjugate sind in der Lage, multimere „Netze" zu formen. Solch ein Netz ist in der Abbildung unten dargestellt. Der Begriff „Netz" wird verwendet, um einen kovalent verknüpften Komplex zu bezeichnen, umfassend mehrere Matrices, Haptene, Linker und Träger-Proteine, die alle kovalent miteinander verknüpft sind. Da die nikotinsubstituierte Matrix eine Vielzahl Nikotin-Reste umfaßt, die für eine Konjugation mit dem Träger verfügbar sind, kann ein Netz gebildet werden, das mehrere Träger und mehrere nikotinsubstituierte Matrices umfaßt. Eine vereinfachte Darstellung eines Ausschnitts eines solchen Netzes kann folgendermaßen dargestellt werden:
    Figure 00160001
  • Der Fachmann wird erkennen, daß ein Netz gemäß der Erfindung ein Hapten-Träger-Konjugat der Formel (III) enthält.
  • Diese Konjugations-Methode unter Verwendung einer Matrix bietet Flexibilität und Kontrolle über das molare Hapten-zu-Protein-Verhältnis, unabhängig von der Anzahl an funktionellen Gruppen, die auf dem Protein für die Konjugation verfügbar sind. Dies ist besonders nützlich, wenn ein spezielles Träger-Protein verwendet worden ist und wenn ein optimales Verhältnis erzielt werden muß, um eine höhere Immunogenität des Konjugats zu erhalten. Während es nicht notwendig ist, einen Linker benutzen, wenn man eine Matrix verwendet, kann ein solcher Linker benutzt werden. Um einen Linker in diesem Ausführungsform zu verwenden, wird die nikotinsubstituierte Matrix mit einer aktiven Linker-Verbindung zur Reaktion gebracht. Zum Beispiel kann Adipinsäure-Dihydrazid (ADH) als Linker mit den Matrix-Konjugaten verwendet werden.
  • Träger-Proteine
  • Sobald das Nikotinhapten hergestellt worden ist, wird es an ein Träger-Protein konjugiert, das dann verwendet wird, um Antikörper gegen das Nikotin-Träger-Konjugat zu erzeugen. Das in dem vorliegenden erfinderischen Nikotin-Träger-Konjugat verwendete Träger-Protein wird in Formeln (I) und (III) wie hier dargestellt:
    Figure 00170001
    und umfaßt jedes geeignete immunogene Protein oder Polypeptid. Ein „immunogenes" Molekül ist eines, das in der Lage ist, eine Immunantwort hervorzurufen. Vorzugsweise enthält das Träger-Protein ein T-Zell-Epitop. Durch die Darstellung eines „Träger-Proteins" werden auch MAPs oder multi-antigene Peptide umfaßt, die verzweigte Peptide sind. Durch die Verwendung eines MAP werden die Hapten-Dichte und Wertigkeit wegen einer Vielzahl verzweigter Aminosäure-Reste maximiert. Beispiele von Aminosäuren, die zur Bildung eines MAP verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Lysin.
  • Ein Träger-Protein der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Molekül, das zumindest ein T-Zell-Epitop enthält, das die T-Zellen des Patienten stimulieren kann, was daraufhin B-Zellen zur Produktion von Antikörpern gegen das gesamte Hapten-Träger-Konjugat-Molekül anregt. Der Begriff „Epitop", wie er bei der Beschreibung dieser Erfindung verwendet wird, schließt alle Determinanten auf einem Antigen ein, die für die spezifische Interaktion mit einem Antikörper-Molekül verantwortlich sind. Epitop-Determinanten bestehen normalerweise aus chemisch aktiven Oberflächengruppierungen von Molekülen wie Aminosäuren oder Zucker-Seitenketten und besitzen spezielle dreidimensionale Strukturcharakteristika sowie spezielle Ladungscharakteristika. Man ist der Meinung, daß ein Protein oder Polypeptid, um immunogene Eigenschaften zu haben, in der Lage sein muß, T-Zellen zu stimulieren. Es ist jedoch möglich, daß ein Träger-Protein, das kein T-Zell-Epitop hat, auch immunogen sein kann.
  • Durch die Auswahl eines Träger-Proteins, von dem man weiß, daß es eine starke Immunantwort auslöst, kann eine breitgefächerte Population von Patienten mit den erfinderischen Hapten-Träger-Konjugaten behandelt werden. Das Träger-Protein muß ausreichend fremd sein, um eine starke Immunantwort auf den Impfstoff auszulösen. Typischerweise wäre das verwendete Träger-Protein vorzugsweise ein großes Molekül, das in der Lage ist, einem kovalent gebundenen Hapten Immunogenität zu verleihen. Ein besonders bevorzugtes Träger-Protein ist eines, das inhärent hochimmunogen ist. Daher ist ein Träger-Protein äußerst wünschenswert, das ein hohes Maß an Immunogenität und die Fähigkeit besitzt, die Antikörper-Produktion gegen das Hapten zu maximieren.
  • Sowohl Rinder-Serumalbumin (BSA) als auch Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH) sind häufig als Träger bei der Entwicklung von Konjugat-Impfstoffen für Experimente mit Tieren verwendet worden. Diese Proteine mögen jedoch nicht geeignet für die Verwendung am Menschen sein. Proteine, die zur Herstellung von therapeutischen Konjugat-Impfstoffen verwendet worden sind, umfassen, sind aber nicht limitiert auf eine Anzahl von Toxinen pathogener Bakterien und deren Toxoide. Beispiele umfassen Diphtherie- und Tetanus-Toxin und deren medizinisch akzeptable zugehörige Toxoide. Weitere Kandidaten sind Proteine, die in der Antigenität bakteriellen Toxinen ähnlich sind und die man als „Kreuzreaktions-Stoffe" (cross-reacting materials, CRMs) bezeichnet.
  • Bei der Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen von Nikotin-Konjugat kann rekombinantes Exoprotein A aus Pseudomonas aeruginosa (rEPA) als Träger-Protein verwendet werden, weil seine Struktur und biologische Aktivität gut charakterisiert sind. Darüber hinaus ist dieses rekombinante Protein erfolgreich und sicher an Menschen angewendet worden in den Staphylococcus-aureus-Kapselpolysaccharid-Konjugat- Impfstoffen der National Institutes of Health und der gegenwärtigen Erfinder. Fattom et al., Infect. Immun. 61, 1023-1032 (1993). Dieses Protein wurde als geeigneter Protein-Träger identifiziert, weil die intrinsische enzymatische Aktivität des nativen Exotoxins durch eine Aminosäure-Deletion an Position 553 abgeschaltet ist. Demzufolge besitzt rEPA dasselbe immunologische Profil wie natives Exotoxin A (ETA), aber nicht die hepatotoxischen Eigenschaften des nativen ETA. Wie es in dieser Anmeldung verwendet wird, bezieht sich „Exoprotein A" auf ein modifiziertes, nicht-hepatotoxisches ETA. Ein Beispiel eines solchen Exoproteins A besitzt eine Aminosäure-Deletion an Position 553.
  • Konjugation von Hapten an das Träger-Protein
  • Es gibt eine große Anzahl funktioneller Gruppen, die verwendet werden können, um die Kopplung oder Konjugation eines Trägers an ein kleines Molekül, wie ein Hapten, zu ermöglichen. Diese umfassen funktionelle Gruppen wie Carbonsäuren, Anhydride, gemischte Anhydride, Acylhalide, Acylazide, Alkylhalide, N-Maleinimide, Iminoester, Isocyanate, Amine, Thiole und Isothiocyanate sowie weitere, die dem Fachmann bekannt sind. Diese Gruppen sind in der Lage, kovalente Bindungen mit einer reaktiven Gruppe eines Protein-Moleküls zu bilden. Je nach der verwendeten funktionellen Gruppe kann die reaktive Gruppe die ε-Amino-Gruppe eines Lysin-Restes oder eine Thiol-Gruppe auf einem Träger-Protein oder einem modifizierten Träger-Protein-Molekül sein, die, wenn sie zur Reaktion gebracht wird, eine Amid-, Amin-, Thioether-, Amidinoharnstoff- oder Thioharnstoff-Bindung bildet. Ein Fachmann wird erkennen, daß weitere geeignete Aktivierungsgruppen und Konjugationstechniken verwendet werden können. Siehe z.B. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press, Inc. (1991). Siehe auch Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press: 1996 und Dick und Beurret in Conjugate Yaccines. Contribu. Microbiol. Immunol., Karger, Basel (1989) Band 10, 48-114.
  • Zur Konjugation von Haptenen mit Träger-Proteinen sind lineare Linker-Reste gegenüber zyklischen oder verzweigten Linkem vorzuziehen. Ein bevorzugter Linker ist ein Succinyl-Rest. Ein Linker kann jedoch sowohl eine zyklische Struktur als auch ein linearer Rest sein. Ein weiteres Beispiel für einen Linker ist ADH.
  • Demnach werden die Nikotinhapten-Träger-Konjugate der vorliegenden Erfindung hergestellt, indem man ein odere mehrere Haptene mit einem Träger-Protein zur Reaktion bringt, um ein Hapten-Träger-Konjugat zu erhalten, das T-Zellen stimulieren kann, was zu T-Zell-Proliferation und Freisetzung von Botenstoffen führt, die spezielle B-Zellen zur Stimulation der Antikörper-Produktion als Antwort auf das immunogene Hapten-Träger-Konjugat aktivieren. Gewisse Antikörper, die als Antwort auf das Hapten-Träger-Konjugat erzeugt wurden, werden spezifisch für den Hapten-Teil des Hapten-Träger-Konjugats sein. Vorliegende Erfindung zieht die Verwendung von verschiedenen geeigneten Kombinationen von Haptenen mit Träger-Proteinen zur Verwendung bei der Behandlung von Nikotin-Abhängigkeit in Betracht.
  • Monoklonale und polyklonale Antikörper
  • Techniken zur Herstellung monoklonaler Antikörper sind im Stand der Technik wohlbekannt. Monoklonale Antikörper können erhalten werden, indem man Mäusen eine Zusammensetzung injiziert, die das Nikotinhapten-Träger-Konjugat umfaßt; daraufhin die Anwesenheit von Antikörpern durch Entnahme einer Serumprobe überprüft; die Milz entnimmt, um B-Lymphozyten zu erhalten; die B-Lymphozyten mit Myelom-Zellen verschmilzt, um Hybridome zu erhalten; die Hybridome kloniert; positive Klone auswählt, die Antikörper gegen das Hapten-Träger-Konjugat erzeugen; die Klone, die Antikörper gegen das Antigen erzeugen, in Kultur nimmt; und die Antikörper aus den Hybridom-Kulturen isoliert.
  • Monoklonale Antikörper können aus Hybridom-Kulturen mit einer Vielzahl von gut etablierten Techniken isoliert und gereinigt werden. Solche Isolierungs-Techniken beinhalten Affinitäts-Chromatographie mit Protein-A-Sepharose, Größenausschluß-Chromatographie und Ionenaustausch-Chromatographie. Siehe z.B. Coligan auf den Seiten 2.7.1-2.7.12 und den Seiten 2.9.1-2.9.3. Des weiteren siehe Baines et al., „Purification of Immunoglobulin G (IgG)" in METHODS OF MOLECULAR BIOLOGY, Band 10, Seiten 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992).
  • Techniken zur Herstellung polyklonaler Antikörper sind ebenfalls im Stand der Technik wohlbekannt. Polyklonale Antikörper werden nach im Stand der Technik bekannten Standardtechniken hergestellt. Um einen polyklonalen Antikörper herzustellen, wird einem Tier immunogenes Material injiziert und antikörperreiches Serum abgenommen, das eine Mischung von gegen zahlreiche Epitope des injizierten Immunogens gerichteten Antikörpern enthält. Für die Produktion von Antikörpern geeignete Wirtssäugetiere umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Menschen, Ratten, Mäuse, Kaninchen und Ziegen.
  • In Übereinstimmung mit vorliegender Erfindung können auch funktionelle Antikörper-Fragmente verwendet werden. Die Fragmente werden mit Methoden hergestellt, die die Verdauung mit Enzymen wie Pepsin oder Papain und/oder Spaltung von Disulfidbrücken durch chemische Reduktion einschließen. Alternativ können von der vorliegenden Erfindung umfaßte Antikörper-Fragmente synthetisiert werden unter Verwendung eines automatischen Peptid-Synthesizers, wie den kommerziell von Applied Biosystems, Multiple Peptide Systems und anderen vertriebenen, oder manuell hergestellt werden, mit Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind. Siehe Geysen et al., J. Immunol. Methods 102: 259 (1978). Eine direkte Bestimmung der Aminosäure-Sequenzen der variablen Regionen der schweren und leichten Ketten erfindungsgemäßer monoklonaler Antikörper kann mit konventionellen Techniken durchgeführt werden.
  • Ein Fragment gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Fv-Fragment sein. Ein Fv-Fragment eines Antikörpers besteht aus der variablen Region der schweren Kette (Vh) eines Antikörpers und der variablen Region der leichten Kette eines Antikörpers (Vl). Proteolytische Spaltung eines Antikörpers kann doppelkettige Fv-Fragmente erzeugen, in denen die Vh- und Vl-Regionen nichtkovalent assoziiert bleiben und ihr Antigen-Bindungsvermögen behalten. Fv-Fragmente schließen auch rekombinante einzelkettige Antikörper-Moleküle ein, in denen die variablen Regionen der leichten und schweren Ketten durch einen Peptid-Linker verbunden sind. Siehe Skerra et al., Science, 240, 1038-41 (1988). Antikörper-Fragmente gemäß der Erfindung schließen auch Fab, Fab', F(ab)2 und F(ab')2 mit ein, denen das Fc-Fragment eines intakten Antikörpers fehlt.
  • Theraueutische Methoden
  • Da Nikotin viele seiner bedeutenden Effekte ausübt, nachdem es die Blut-Hirn-Schranke überschritten hat, umfaßt die vorliegende Erfindung therapeutische Methoden, die Nikotin davon abhalten, die Blut-Hirn-Schranke zu überschreiten. Insbesondere wird die Verabreichung eines Nikotinhapten-Träger-Konjugates an einen Patienten Antikörper gegen Nikotin im Blutstrom des Patienten generieren. Alternativ können anti-Nikotin-Antikörper, die außerhalb des Körpers des zu behandelnden Patienten in einem geeigneten Wirtssäugetier erzeugt wurden, einem Patienten verabreicht werden. Raucht der Patient, wird das Nikotin in seinem Blut von den zirkulierenden anti-Nikotin-Antikörpern gebunden werden, was verhindert, daß Nikotin das Gehirn erreicht. Daher werden die Antikörper die physiologischen und psychologischen Effekte von Nikotin verhindern, die im Gehirn ihren Ausgangspunkt haben. Weil der Raucher eine Verringerung oder ein Verschwinden dieser Effekte bemerken wird, wird er oder sie das Verlangen zu rauchen verlieren. Dieselben therapeutischen Effekte sind zu erwarten, wenn ein Patient rauchlosen Tabak verwendet, nachdem er mit einem Nikotinhapten-Träger-Konjugat der Erfindung immunisiert wurde. Darüber hinaus könnten die Konjugate und Antikörper der Erfindung ihre Effekte ausüben, indem sie die Fähigkeit des Nikotins zur Stimulierung des peripheren Nervensystems beeinflussen.
  • Wie oben diskutiert, behalten die neuartigen Nikotin-Träger-Konjugate der Erfindung die natürliche Chiralität und Struktur des Nikotin-Moleküls. Insbesondere besitzt der Nikotin-Teil dieser Konjugate die (S)-(-)-Konfiguration. Daher werden die als Antwort auf solch ein Konjugat erzeugten Antikörper spezifisch für die natürliche Form von Nikotin und die effektivsten darin sein, spezifisch an Nikotin zu binden, das durch Rauchen inhaliert oder aus rauchlosem Tabak aufgenommen wird, und die Effekte dieses aufgenommenen Nikotins zu verhindern. Darüber hinaus sind die erfinderischen Konjugate chemisch stabil, und Stabilität ist kritisch für die Herstellung eines Impfstoffs mit langer Haltbarkeit.
  • Die vorliegende Impfstoffzusammensetzung kann in Kombination mit Verbindungen oder anderen Therapien, die für die Behandlung von Abhängigkeit nützlich sind, angewendet werden. Dies schließt die Verabreichung von Verbindungen ein, die umfassen, doch nicht limitiert sind auf Anti-Depressiva wie Zyban und Prozac.
  • 1. Verabreichung eines Nikotinhapten-Träger-Konjugates
  • Die Konjugate der Erfindung sind geeignet zur Behandlung und Vorbeugung von Nikotin-Abhängigkeit. Zur Behandlung von Nikotin-Abhängigkeit wird ein Nikotin-Träger-Konjugat der Erfindung einem Patienten verabreicht, der an Nikotin-Abhängigkeit leidet. Zur Vorbeugung der Nikotin-Abhängigkeit werden Patienten, die ein Risiko tragen, Nikotin-Abhängigkeit zu entwickeln, wie Teenager, mit einem Konjugat gemäß der Erfindung behandelt. Die direkte Verabreichung des Konjugates an einen Patienten heißt „aktive Immunisierung".
  • Eine Impfstoffzusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfaßt zumindest ein Nikotinhapten-Träger-Konjugat in einer Menge, die ausreicht, eine Immunantwort darauf auszulösen. Das Nikotinhapten-Träger-Konjugat ist in der Lage, in vivo in einer Konzentration zu verbleiben, die ausreicht, um gegen spätere Aufnahme von Nikotin aktiv zu sein.
  • Die initiale Impfung mit dem Nikotinhapten-Träger-Konjugat der vorliegenden Erfindung ruft hohe Titer von für Nikotin spezifischen Antikörpern hervor. Die therapeutisch effektive Menge Konjugat, die einem eine Behandlung der Nikotin-Abhängigkeit benötigenden Patienten verabreicht wird, kann vom Fachmann leicht ermittelt werden. Ein geeigneter Dosisbereich ist 1-1000 μg/Dosis. Im allgemeinen benötigt der Patient eine bis mehrere Wochen, um Antikörper gegen ein fremdes Antigen zu entwickeln. Die Produktion von Antikörpern im Blut eines Patienten kann durch die Anwendung von dem Fachmann vertrauten Techniken wie ELISA, Radioimmunoassay und Western-Blot-Methoden verfolgt werden. Die therapeutische Effektivität kann auch durch die Bestimmung von verschiedenen physischen Effekten des Nikotins wie des Blutdrucks verfolgt werden.
  • Wie weiter unten im Detail beschrieben, können die erfinderischen Nikotinhapten-Träger-Konjugate weiterentwickelt werden, um eine Zusammensetzung zu erreichen, die dem Patienten auf einfache Weise verabreicht werden kann. Bevorzugte Arten der Verabreichung umfassen, sind aber nicht beschränkt auf intranasal, intratracheal, oral, dermal, transmukosale subkutane Injektion und intravenöse Injektion. Der Fachmann wird erkennen, daß die erste Injektion von späterer Verabreichung von einer oder mehreren „Auffrischungen" von Konjugat gefolgt werden kann. Solch eine Auffrischung wird die Produktion von Antikörpern gegen das Nikotinhapten-Träger-Konjugat der Erfindung verstärken.
  • Die Impfstoffzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können zumindest ein Adjuvans enthalten. Das in vorliegender Erfindung benutzte Adjuvans wird so ausgewählt werden, daß der Effekt des Träger-Proteins nicht gehemmt wird. In vorliegender Erfindung verwendete Adjuvanzien sind die, die für Menschen physiologisch akzeptabel sind, umfassend, aber nicht limitiert auf Alaun, QS-21, Saponin und MPLA (Monophosphoryl-Lipid A).
  • Die Impfstoffzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können gegebenenfalls einen oder mehrere pharmazeutisch akzeptable Grundstoffe enhalten. Verwendbare Grundstoffe in der vorliegenden Erfindung schließen steriles Wasser, Salzlösungen wie Saline, Natriumphosphat, Natriumchlorid, Alkohol, Gummiarabicum, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Polyethylenglykol, Gelatine, Mannitol, Kohlenhydrate, Magnesiumstearat, dickflüssiges Paraffin, Fettsäureester, Hydroxymethylzellulose und Puffer ein. Natürlich sind auch weitere dem Fachmann bekannte Grundstoffe für die vorliegende Erfindung verwendbar.
  • Die Hapten-Träger-Konjugate der vorliegenden Erfindung werden, um einem Patienten, der eine Behandlung oder Vorbeugung der Nikotin-Abhängigkeit benötigt, verabreicht zu werden, in eine pharmazeutische Zusammensetzung inkorporiert. Wenn die Zusammensetzung, die das Hapten-Träger-Konjugat enthält, für Injektion verwendet werden soll, ist es vorzuziehen, das Hapten-Träger-Konjugat in einer wäßrigen Salinelösung bei einem pharmazeutisch akzeptablen pH zu lösen. Es ist jedoch möglich, eine injizierbare Suspension des Hapten-Träger-Konjugats zu verwenden. Über die üblichen pharmazeutisch akzeptablen Grundstoffe hinaus kann die Zusammensetzung optionale Komponenten zur Gewährleistung der Reinheit, zur Verbesserung der Bioverfügbarkeit und/oder Erhöhung der Penetration enthalten.
  • Darüber hinaus kann die Impfstoffzusammensetzung gegebenenfalls zumindest einen Zusatzstoff enthalten, wie Dispersionsmedien, Überzüge, Mikrosphären, Liposomen, Mikrokapseln, Lipide, Tenside, Gleitmittel, Konservierungsmittel und Stabilisatoren. Natürlich sind weitere dem Fachmann bekannte Zusatzstoffe für die vorliegende Erfindung verwendbar. Ebenfalls verwendbar sind alle Stoffe, die einen synergetischen Effekt auf die Wirkung der vorliegenden Impfstoffzusammensetzung ausüben.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist steril und ausreichend stabil, um Lagerung, Vertrieb und Gebrauch standzuhalten. Zusätzlich kann die Zusammensetzung weitere Komponenten enthalten, um die Zusammensetzung vor Befall und Wachstum von Mikroorganismen schützen. Vorzugsweise wird die Zusammensetzung in der Form eines lyophilisierten Pulvers hergestellt, das durch ein pharmazeutisch akzeptables Lösungsmittel kurz vor der Verabreichung rekonstituiert werden muß. Methoden zur Herstellung steriler injizierbarer Lösungen sind dem Fachmann wohlbekannt und umfassen, sind aber nicht limitiert auf Vakuumtrocknen, Gefriertrocknen und Zentrifugiertrocknen. Diese Techniken ergeben ein Pulver des Wirkstoffs zusammen mit allen zusätzlichen Grundstoffen, die im Vorgemisch enthalten waren.
  • 2. Verabreichung von als Antwort auf ein Nikotin-Träger-Konjugat erzeugten Antikörpern
  • Passive Immunisierung umfaßt die Verabreichung eines oder die Exposition an einen polyklonalen Antikörper oder monoklonalen Antikörper, der als Antwort auf ein Nikotinhapten-Träger-Konjugat der Erfindung erzeugt wurde. Solche Antikörper können in Tieren oder Menschen erzeugt werden. Als Antwort auf ein Nikotin-Konjugat der Erfindung erzeugte Antikörper können verabreicht werden, um Nikotin-Abhängigkeit zu verhindern. Zum Beispiel können solche Antikörper Leuten verabreicht werden, denen ein Risiko zugeschrieben wird, eine Nikotin-Abhängigkeit zu entwickeln, wie Teenagern. Antikörper sind auch geeignet zur Behandlung eines nikotinabhängigen Patienten. Wie oben diskutiert, werden die Antikörper Nikotin im Blut binden und verhindern, daß Nikotin die Blut-Hirn-Schranke überwindet. Antikörper, die durch die Verabreichung des erfinderischen Hapten-Träger-Konjugates erzeugt wurden, bewegen sich im Molekulargewichts-Bereich von etwa 150 kDa bis etwa 1000 kDa.
  • Die therapeutisch effektive Menge des therapeutischen Antikörpers der Erfindung, die einem Patienten, der eine Behandlung seiner Nikotin-Abhängigkeit benötigt, verabreicht wird, kann auf einfache Weise durch den Fachmann bestimmt werden. Ein geeigneter Dosis-Bereich ist 1-1000 μg/Dosis.
  • Eine therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfaßt zumindest Antikörper, die als Antwort auf ein Nikotin-Träger-Konjugat der Erfindung erzeugt wurden. Diese Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können gegebenenfalls einen oder mehrere pharmazeutisch akzeptable Grundstoffe enthalten. Verwendbare Grundstoffe in der vorliegenden Erfindung schließen steriles Wasser, Salzlösungen wie Saline, Natriumphosphat, Natriumchlorid, Alkohol, Gummiarabicum, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Polyethylenglykol, Gelatine, Mannitol, Kohlenhydrate, Magnesiumstearat, dickflüssiges Paraffin, Fettsäureester, Hydroxymethylzellulose und Puffer ein. Natürlich sind auch weitere dem Fachmann bekannte Grundstoffe für die vorliegende Erfindung verwendbar.
  • Die Antikörper der vorliegenden Erfindung werden, um einem Patienten, der eine Behandlung oder Vorbeugung der Nikotin-Abhängigkeit benötigt, verabreicht zu werden, in eine pharmazeutische Zusammensetzung inkorporiert. Wenn die einen Antikörper enthaltende Zusammensetzung für eine Injektion verwendet werden soll, ist es vorzuziehen, den Antikörper in einer wäßrigen Salinelösung bei einem pharmazeutisch akzeptablen pH vorliegen zu haben. Es ist jedoch möglich, eine injizierbare Suspension des Antikörpers zu verwenden. Über die üblichen pharmazeutisch akzeptablen Grundstoffe hinaus kann die Zusammensetzung optionale Komponenten zur Gewährleistung der Reinheit, zur Verbesserung der Bioverfügbarkeit und/oder Erhöhung der Penetration enthalten.
  • Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen Antikörper der vorliegenden Erfindung, ist steril und ausreichend stabil, um Lagerung, Vertrieb und Gebrauch standzuhalten. Zusätzlich kann die Zusammensetzung weitere Komponenten enthalten, um die Zusammensetzung vor Befall und Wachstum von Mikroorganismen schützen. Methoden zur Herstellung steriler injizierbarer Lösungen sind dem Fachmann wohlbekannt und umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Vakuumtrocknen, Gefriertrocknen und Zentrifugiertrocknen. Diese Techniken ergeben ein Pulver des Wirkstoffs zusammen mit allen zusätzlichen Grundstoffen, die im Vorgemisch enthalten waren.
  • Kits, die Antikörper der Erfindung umfassen
  • Die Antikörper der vorliegenden Erfindung sind auch hilfreich bei der Herstellung eines Kits, das zur Detektion und Quantifizierung von Nikotin-Gehalten in einer Probe verwendet werden kann. Ein Kit gemäß der Erfindung umfaßt einen erfindungsgemäßen nikotinspezifischen Antikörper in einem geeigneten Gefäß. Für einen Radioimmunoassay kann das Kit auch markiertes Nikotin umfassen. Nikotin in einer Probe wird detektiert, indem man markiertes Nikotin an den Antikörper bindet und dann das markierte Nikotin am Antikörper mit der zu untersuchenden Probe konkurrieren läßt. Ein ELISA-Kit würde auch einen Antikörper gemäß der Erfindung enthalten. Der ELISA kann die Inhibition der Antikörper-Bindung mit bekannten Mengen Nikotin einbeziehen, verglichen mit Inhibition mit einer Probe, von der vermutet wird, daß sie Nikotin enthält. Dies würde es ermöglichen, unbekanntes Nikotin in einer Probe zu bestimmen, durch den Vergleich der Probe mit der Standard-Inhibitionskurve einer bekannten Nikotinkonzentration. Bei einem anderen ELISA-Typ würde eine Probe, von der vermutet wird, daß sie Nikotin enthält, auf einer Mikrotiter-Platte inkubiert, die mit einer nikotinbindenden Substanz ausgekleidet ist. Die Antikörper dieser Erfindung würden zugegeben und enzymgekoppelte anti-Antikörper-Antikörper würden auf die Platten gegeben. Zugabe von Substrat würde die an die Platte gebundene Nikotinmenge quantifizieren.
  • Die folgenden Beispiele werden lediglich angegeben, um die Herstellung und den Gebrauch der vorliegenden Erfindung noch weiter zu illustrieren. Der Anwendungsbereich der Erfindung ist nicht auf die folgenden Beispiele beschränkt.
  • Beispiel 1 – Synthese eines derivatisierten Nikotinhaptens an der 3'-Position substituiert)
  • Das Ausgangsmaterial für die Synthese des Haptens ist trans-4'-Carboxy-(-)-Cotinin, das aus kommerziellen Quellen erhältlich ist. Eine Abänderung der Vorschrift von Cushman und Castagnoli, Jr. (1972) J. Org. Chem. 37(8): 1268-1271 liefert den Alkohol trans-3'-Hydroxymethyl-(-)-nikotin, nach Methylveresterung der Säure, gefolgt von der Reduktion des Esters. Der Alkohol wird dann sulfoniert und das Sulfonat durch eine Azidogruppe ersetzt, die schließlich zu einem Amin reduziert wird.
  • 4 g trans-4'-Carboxy-(-)-Cotinin werden in 50 ml einer Lösung von 2 N Schwefelsäure in trockenem Methanol gelöst und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die entstehende Suspension wird durch Whatman-No.1-Filterpapier gefiltert und langsam zu 100 ml einer gesättigten Lösung von Natriumhydrogencarbonat gegeben. Der Ester wird mit Dichlormethan extrahiert, um nach Verdampfen des Lösungsmittels 4,2 g eines rosaroten Öls zu erhalten.
  • Eine Lösung von 3,9 g Ester in trockenem Tetrahydrofuran (100 ml) wird tropfenweise zu einer Suspension von 4 Äquivalenten Lithiumaluminiumhydrid in trockenem Tetrahydrofuran (70 ml) unter trockenem Argon gegeben. Die Suspension wird zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Überschüssiges Hydrid wird durch vorsichtige und kontrollierte Wasserzugabe unter Kühlung im Eisbad zersetzt. Das entstandene weiße Präzipitat wird abgesaugt und das Filtrat über Natriumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck aufkonzentriert, um 2,7 g des Alkohols als gelbes Öl zu erhalten.
  • Der Alkohol (1,9 g) wird in 20 ml Dichlormethan gelöst. Triethylamin (0,75 ml) und p-Toluolsulfonylchlorid (1 g) werden dann nacheinander zur Lösung gegeben. Die orangefarbene Lösung wird 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Ausgefallenes Triethylamin-Hydrochlorid wird durch Filtration über Celite abgetrennt und das Filtrat unter reduziertem Druck aufkonzentriert, um ein braunes Öl zu erhalten. Das Sulfonat wird auf einer Silica-Flash-Chromatographiesäule gereinigt, die mit 5% Methanol in Dichlormethan eluiert wird, um 2,1 g eines gelben Öls zu erhalten.
  • Das Sulfonat (1,8 g) wird mit Natriumazid (0,8 g) in 50 ml Dimethylformamid für eine Stunde bei 80°C reagiert. Nach Abdampfen des Dimethylformamids im Hochvakuum wird der Rückstand in Dichlormethan gelöst, mit Wasser und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Verdampfen des Lösungsmittels erhält man das Azid (1,1 g) als bräunliches Öl.
  • Die Zugabe von Azid in trockenem Tetrahydrofuran (20 ml) zu einer Lösung von Lithiumaluminiumhydrid in trockenem Tetrahydrofuran (50 ml) ergab auf einfache Weise das gewünschte Amin, wie durch Dünnschichtchromatographie verfolgt werden konnte. Die Protonen- und Kohlenstoff-Kernmagnetresonanz-Spektren des gereinigten Amins stimmten mit der erwarteten Struktur überein.
  • Beispiel 2 – Synthese eines derivatisierten Nikotinhaptens (an der 4'-Position substituiert)
  • Die Einführung eines funktionalisierten Arms an Position 4' von Nikotin kann erreicht werden durch Enolat-Alkylierung von Cotinin, gefolgt von der Reduktion des alkylierten Produkts. Verschiedene Alkylierungsreagenzien können verwendet werden, wie etwa ein adäquat geschütztes 3-Bromo-Propylamin. Zum Beispiel können 3-Bromo-N-carbobenzyloxy-propylamin oder N-(3-Bromopropyl)-phthalamid verwendet werden. Die Amin-Schutzgruppe muß nach Alkylierung und Reduktion und vor der Konjugation an ein Träger-Protein entfernt werden. Die Enolat-Alkylierung von zyklischen Laktamen (die einen Pyrrolidinon-Ring enthalten) ist in der Literatur gut beschrieben (siehe G. Heimchen et al. (1995) Stereoselective Synthesis in Houben-Weyl-Methods of Organic Chemistry, Band E21a, 762-881, Thieme, Stuttgart, Deutschland, für einen allgemeinen Überblick, und A.J. Meyers et al. (1997) J. Am. Chem. Soc., 119, 4564-4566 zu sterischen Überlegungen zur Reaktion). Es gibt auch einige Beispiele für Enolat-Alkylierung von Cotinin selbst (N.-H. Lin et al. (1994) J. Med. Chem., 37, 3542-3553). Eine interessante Herstellung von 4'-Acetylnikotin als 1:1-Mischung von zwei Epimeren wurde erreicht, indem man nacheinander eine kationische aza-Cope-Umlagerung und eine Mannich-Zyklisierungsreaktion durchführte, ausgehend von einem Keton (oder einem Aldehyd) und einem 2-Alkoxy-3-alkenamin (L.E. Overman (1983) J. Am. Chem. Soc., 105, 6622-6629). Diese Reaktion kann erweitert werden zur Darstellung von 4'-Aldehydo-nikotin, das für die Konjugation geeignet ist.
  • 3-Bromo-propylamin-Hydrobromid (4,2 g) wurde in 50 ml Dichlormethan suspendiert, und Triethylamin (etwa 7 ml) wurde zugegeben, bis sich eine klare Lösung bildete. Die Lösung wurde auf 0°C gekühlt und Chlorameisensäurebenzylester (2,5 ml) wurde zugetropft. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 16 Stunden unter Rühren weitergeführt. Die ausfallenden Salze wurden abfiltriert und die klare organische Phase mit kaltem Wasser, kalter 1 N HCl und kaltem Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck zu einem gelben Öl (2,93 g Rohmaterial) eingedampft.
  • Cotinin (62 mg) und 3-Bromo-N-carbobenzyloxy-propylamin (100 mg) wurden getrennt mit trockenem Toluol coevaporiert. Cotinin wurde in 5 ml frisch destilliertem wasserfreien Tetrahydrofruan gelöst, 60 μl N,N,N',N'-Tetramethylendiamin (TMEDA) wurden zugegeben und die Lösung durch Eintauchen in ein Ethanol-Trockeneisbad auf -78°C gekühlt. Die Cotinin-Lösung wurde zu einer vorher auf -78°C gekühlten Lösung von Lithiumdiisopropylamid (LDA, 200 μl einer 2 M Lösung in Heptan-Tetrahydrofuran) in Tetrahydrofuran getropft. Die orange Mischung wird 15 Minuten bei -78°C gerührt und dann zum Erwärmen in einem Eisbad (2 bis 6°C) stehengelassen. Die Reaktion wurde dann wieder auf -78°C gekühlt und in wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöstes 3-Bromo-N-carbobenzyloxy-propylamin innerhalb von 15 Minuten zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde zum Erwärmen auf -10°C stehengelassen und dann mit Methanol gestoppt. Das Reaktionsprodukt wurde mittels Flash-Chromatographie auf einer Silikagel-Säule gereinigt.
  • Die Reduktion des Amids dieses Cotininderivats wurde mit Boran durchgeführt, gefolgt von Cäsiumfluorid in heißem Ethanol. Das Amin wurde schließlich nach Entfernung der Carbobenzyloxy-Gruppe unter sauren Bedingungen erhalten.
  • Beispiel 3 – Synthese eines derivatisierten Nikotinhaptens (an der 5'-Position substituiert)
  • Die Einführung eines funktionalisierten Arms an der 5'-Position von Nikotin kann erreicht werden, indem man adäquat geschützte Alkyllithium-Verbindungen mit Cotinin umsetzt, gefolgt von Reduktion mit Natrium-Cyanoborhydrid, nach Vorschriften ähnlich denen beschrieben von Shibagaki et al. (1986) Heterocycles, 24, 423-428 und N.-H. Lin et al. (1994) s.o.
  • Beispiel 4 – Konjugation eines derivatisierten Nikotinhaptens an ein Träger-Protein
  • Rekombinantes Exoprotein A (rEPA) wird an das derivatisierte Nikotinhapten über einen Bernsteinsäure-Arm gekoppelt. Die 15 Lysine von rEPA konnten leicht mit Bernsteinsäureanhydrid succinyliert werden. Daraufhin wurde in einer typischen Konjugierungsreaktion eine 5- bis 10-mg/ml-Lösung des succinylierten rekombinanten Exoproteins A (Suc-rEPA) in 0,05 M 2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure (MES)-Puffer, enthaltend 0,15 M NaCl, bei pH 6,0 hergestellt. Eine gleiche Einwaage 3'-Aminomethyl-(-nkotin (3'-AMNic)-Hapten, gelöst in einem minimalen Volumen destillierten Wassers, wurde zur Proteinlösung gegeben. Der pH der Hapten-Lösung wurde vor der Zugabe mit 0,1 N HCl auf 6,0 eingestellt. Schließlich wurde eine gleiche Einwaage 1-Ethyl-3-(3-diethylamino)propyl-carbodiimid-Hydrochlorid (EDC) zu der Hapten-Protein-Mischung gegeben und die Reaktion 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Rühren fortgesetzt. Das daraufhin erhaltene Nikotin-Konjugat wurde auf einer Sephadex-G-25-Säule gereinigt und mit phosphatgepufferter Saline (PBS) bei pH 7,4 eluiert. Die Konjugat-Ausbeuten lagen im 80- bis 90%-Bereich.
  • Beispiel 5 – Konjugation einer nikotinbeladenen Matrix
  • Dieses Beispiel beschreibt die Synthese eines Hapten-Träger-Konjugates, umfassend 3'-Aminomethyl-(-)-nikotin als derivatisiertes Hapten, rekombinantes Exoprotein A (rEPA) als Träger-Protein, Adipinsäure-Dihydrazid (ADH) als Linker und Poly-L-Glutaminsäure als „Matrix", oder Polymerträger, für die Haptene.
  • In diesem Beispiel wurde eine Poly-L-Glutaminsäure mit einem mittleren Molekulargewicht von 39900 sowie einer Polydispersität von 1,15 und Polymerisationsgrad von 264 verwendet. Die reagierenden Mengen Hapten und Polymer wurden so berechnet, daß der angestrebte Substitutionsgrad etwa 80% ist. Das heißt, wenn 80% Substitution erreicht ist, wurden etwa 208 Hapteneinheiten von den insgesamt 264 Wiederholungseinheiten in einem Durchschnittsmolekül des Glutaminsäurepolymers konjugiert.
  • Diese nikotinbeladene Poly-L-Glutaminsäure besitzt die folgende Formel:
    Figure 00340001
  • Wie der Abbildung zu entnehmen ist, besitzt das Polyglutaminsäure-Polymer etwa 52 Glutaminsäure-Reste. Diese Zahl wird je nach Charge und Herkunft des für die Matrix gewählten Polyaminosäure-Restes variieren. Die Abbildung zeigt auch 4 Nikotinhaptene in jeder Wiederholungseinheit. Diese Zahl wird je nach dem Verhältnis der verwendeten Reaktanden bei der Konjugation der Matrix und des Nikotinhaptens variieren.
  • Nach der Konjugation mit dem derivatisierten Nikotin wurden die unreagierten Carboxylgruppen (etwa 20%) mit ADH derivatisiert. Als diese Matrix an einen Träger konjugiert wurde, wie in Beispiel 6 beschrieben, war das molare Verhältnis von nikotinbeladener Matrix zu Protein 1:1. Daher wäre in diesem Konjugat das theoretische molare Nikotinhapten-zu-Protein-Verhältnis bei Abschluß der Konjugationsreaktion 200:1.
  • Das tatsächliche Verhältnis der Nikotin-Substitution auf der Polyglutaminsäure wurde mittels NMR-Analyse des Produktes abgeschätzt. Die Intensität des Glutaminsäure-α- Wasserstoff-Peaks relativ zu den vier Wasserstoffen des Pyridinrings von Nikotin liefert den Anteil an inkorporiertem Nikotin. Das geschätzte durchschnittliche Verhältnis war 143:1 (Nikotin/Träger-Protein).
  • Beispiel 6 – Herstellung eines Nikotin-Konjugat-Impfstoffs unter Verwendung einer nikotinbeladenen Matrix
  • A. Beladen der Matrix mit Nikotinhapten
  • 10 mg Poly-L-Glutaminsäuresalz (Sigma, Katalognummer P-4761) wurden in 2 ml 0,05 M 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES)-Puffer, enthaltend 0,15 M NaCl, bei pH 6,0 gelöst. 10 mg 3'-Aminomethyl-(-)-nkotin wurden in einem minimalen Volumen destillierten Wassers gelöst und der pH der Lösung wurde mit 0,1 N HCl auf pH 6,0 eingestellt. Die Nikotinhapten-Lösung wurde unter Rühren tropfenweise zu der Polypeptid-Lösung gegeben und dann auf einen pH von 6,0 eingestellt. 20 mg festes 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-Hydrochlorid (EDC) wurden dann in drei Teilen über einen Zeitraum von 20 Minuten zu der Hapten-Polypeptid-Mischung gegeben. Die Reaktion wurde eine Stunde bei Raumtemperatur fortgesetzt. Das Reaktionsprodukt (nikotinsubstituierte Matrix) wurde gegen dreimal gewechseltes Wasser dialysiert und lyophilisiert. 12 mg nikotinsubstituierte Polyglutaminsäure wurden als weißes flockiges Material erhalten.
  • B. Koppeln des Linkers an die nikotinsubstituierte Matrix
  • 10 mg nikotinsubstituierte Polyglutaminsäure wurden in 2 ml MES-Puffer bei pH 6,0 gelöst. 8 mg Adipinsäure-Dihydrazid (ADH), gefolgt von 10 mg EDC, wurden unter Rühren zu der Lösung gegeben. Die Reaktion wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die erhaltene Lösung wurde schließlich gegen dreimal gewechselten MES-Puffer bei pH 6,0 dialysiert.
  • C. Konjugation an das Träger-Protein
  • 10 mg rekombinanten Exoproteins A (rEPA) wurden in 2 ml 0,05 M MES-Puffer bei pH 5,6, enthaltend 0,15 M NaCl, gelöst. Ein Volumen einer ADH-gebundenen nikotinsubstituierten Polyglutaminsäure-Lösung, enthaltend geschätzte 7,5 mg dieses derivatisierten Materials, wurde zur Protein-Lösung gegeben. Festes EDC wurde in drei Teilen über einen Zeitraum von 20 Minuten unter Rühren bei Raumtemperatur zu dieser Mischung gegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur über Nacht fortgesetzt. Das erhaltene Konjugat wurde schließlich of einer Sephadex-G-25-Säule gereinigt und mit phosphatgepufferter Saline (PBS) bei pH 7,4 eluiert. Dies erzeugt eine gereinigte Präparation von Konjugat, wobei das Konjugat nur die (S)-(-)-Form von Nikotin enthält.
  • Beispiel 7 – Charakterisierung des Nikotin-Träger-Konjugates aus Beispiel 4
  • Der gereinigte Konjugat-Impfstoff aus Beispiel 4 wurde auf einer Superose-l2-Größenausschlußchromatographie-Säule analysiert und mit PBS bei pH 7,4 eluiert. Das molare Hapten-zu-Protein-Verhältnis von 11 zu 17 wurde berechnet, indem die Zunahme der UV-Absorption bei 260 nm nach der Inkorporierung von Nikotin relativ zur Absorption bei 280 nm gemessen wurde. Dieser Bereich wurde bestimmt durch die Berechnung des Hapten/Träger-Protein-Verhältnisses von sechs getrennten Chargen Hapten-Träger-Konjugats (Charge 1: 17,2; Charge 2: 16,2; Charge 3: 13,2; Charge 4: 12,0; Charge 5: 11,0; Charge 6: 17,2). Eine weitere Analyse zur Bestimmung dieses Verhältnisses mit MALDI-TOF-Massenspektrometrie ergab im wesentlichen dieselben Werte wie durch UV-Absorptionsdifferenz erhalten. Die Proteinkonzentration des Konjugat-Impfstoffs wurde mit einem BCA-Assay bestimmt. Eine Stabilitätsstudie über das Nikotin-Träger-Konjugat aus Beispiel 4 wurde durchgeführt. Die Studie verwendete den in 1-ml-Glasgefäße abgefüllten Impfstoff bei einer Konzentration von 0,5 mg/ml, und die Stabilität des abgefüllten Impfstoffs wurde bei drei verschiedenen Temperaturen getestet: -70°C, 2 bis 8°C und Raumtemperatur.
  • Beispiel 8 – Stabilität des Nikotin-Träger-Konjugats aus Beispiel 4
  • Die auf der Bildung von Amidbindungen zwischen Hapten-Linker-Träger basierende Konjugationsprozedur schien vorteilhafter als die auf Esterbindungen basierende zu sein, wie die Stabilität des Konjugats über sechs Monate bei -70°C, 2 bis 8°C und sogar Raumtemperatur zeigt. Die Stabilitätsstudie bestand aus der Überwachung und Prüfung des Konjugat-Impfstoffs mit folgenden Mitteln:
    • 1. Visuelle Beobachtung, um etwaige Partikelbildung zu sehen (Trübung, Präzipitation).
    • 2. Überprüfung etwaiger signifikanter pH-Wert-Änderungen.
    • 3. Ein Größenausschlußchromatographie-Profil in Kombination mit UV-Absorption bei 260 und 280 nm, um zu bestimmen, ob sich das Verhältnis der Nikotin-Inkorporation ändert.
    • 4. Reversed-Phase-Chromatographie, um etwaigen Abbau des Träger-Proteins zu überprüfen.
    • 5. SDS-PAGE mit Silberfärbung, die etwaige proteolytische Spaltungen im konjugierten Protein zeigen würde.
  • Die auf der Bildung einer Amidbindung zwischen Hapten und Linker wie auch zwischen Linker und Träger basierende Konjugations-Prozedur schien vorteilhaft zu sein, wie die Stabilität des Konjugats über sechs Monate bei -70°C und 2 bis 8°C zeigt.
  • Beispiel 9 – Nachweis der Immunogenität des Träger-Konjugats aus Beispiel 4 und 6
  • Zwei Nikotin-Träger-Konjugat-Impfstoffe wurden eingesetzt, um Mäuse, Ratten und Kaninchen zu immunisieren.
  • A. Tierversuche – Polyklonale Antikörper
  • Die Tiere wurden gemäß Standard-Protokollen immunisiert. Bei Mäusen wurden drei subkutane Impfstoff-Injektionen im Abstand von zwei Wochen verabreicht, mit Probe-Blutentnahmen je eine Woche nach der ersten und zweiten Injektion und Blutentleerung eine Woche nach der dritten Injektion. Die Serum-Proben wurden mit einem ELISA-Assay wie in Beispiel 10 beschrieben ausgewertet. Der ELISA verwendete an Mikrotiterplatten gebundenes 3'-AMNic-pGlu.
  • Die Ratten wurden dreimal intraperitoneal mit dem Impfstoff immunisiert. Injektionen wurden im Abstand von zwei Wochen gegeben, wobei Test-Blutentnahmen jeweils eine Woche nach der ersten und zweiten Injektion erfolgten. Die Ratten wurden dann eine Woche nach der letzten Injektion blutentleert. Komplettes Freund-Adjuvans wurde für die erste Injektion, und inkomplettes Freund-Adjuvans für die weiteren Injektionen verwendet. Die Serumproben wurden mit einem ELISA-Assay ausgewertet.
  • Die Kaninchen wurden dreimal im Abstand von drei Wochen mit 100 μg Impfstoff intramuskulär immunisiert. Die erste Injektion enthielt Freund-Adjuvans, während die weiteren Injektionen inkomplettes Freund-Adjuvans enthielten. Den Kaninchen wurden Blutproben je eine Woche nach der zweiten und dritten Injektion entnommen, um adäquate Titer für die Produktionsblutung zu gewährleisten. War ein adäquater Titer nach ELISA-Messung erreicht, wurden die Kaninchen auf einen wöchentlichen Produktionsblutungs-Plan gesetzt (20 bis 40 ml Serum pro Kaninchen). Die Antikörper-Titer wurden über die Zeit verfolgt und den Tieren eine Auffrischungs-Impfung verabreicht, wenn es nötig war, um den Antikörper-Spiegel wiederherzustellen.
  • Die Ergebnisse dieser Immunogenitäts-Studien sind in den Tabellen 1-5 dargestellt. Tabellen 1 und 2 zeigen die Ergebnisse einer Immunogenitäts-Studie in Mäusen. In Tabelle 1 war das verwendete Konjugat 3'-Aminomethyl-(-)-nikotin-succinyl-rEPA (Beispiel 4). In Tabelle 2 war das verwendete Konjugat 3-Aminomethyl-(-)-nikotin-polyglutaminsäure-ADH-rEPA (Beispiel 6). Diese Tabellen zeigen die Entstehung hoher Titer von Antikörpern, die spezifisch Nikotin binden. Darüber hinaus zeigten diese Konjugate die Fähigkeit, die Verstärker-Antwort zu induzieren.
  • Tabellen 3 und 4 zeigen die Ergebnisse einer Immunogenitäts-Studie in Ratten. In Tabelle 3 war das verwendete Konjugat 3'-Aminomethyl-(-)-nikotin-succinyl-rEPA (Beispiel 4). In Tabelle 4 war das verwendete Konjugat 3-Aminomethyl-(-)-nikotin-polyglutaminsäure-ADH-rEPA (Beispiel 6).
  • Diese Tabellen zeigen die Entstehung hoher Titer von Antikörpern, die spezifisch Nikotin binden. Darüber hinaus zeigten diese Konjugate die Fähigkeit, die Verstärker-Antwort zu induzieren.
  • Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse einer Immunogenitäts-Studie in Kaninchen. Mit Hilfe von entweder 3'-Aminomethyl-succinyl-rEPA (Beispiel 4) oder 3-Aminomethylpolyglutaminsäure-ADH-rEPA (Beispiel 6) wurden hohe Titer von Antikörpern gegen die beiden Konjugate erzeugt. Diese Titer blieben über mehr als 6 Monate erhöht.
  • TABELLE 1 – Behandlung von Mäusen mit 3'AMNic-Suc-rEPA
    Figure 00400001
    • Dosis basiert auf Protein-Assay.
    • Titer ist das arithmetische Mittel, eine Woche nach der entsprechenden Injektion.
  • TABELLE 2 – Behandlung von Mäusen mit 3'-AMNic-pGlu-ADH-rEPA
    Figure 00400002
    • Dosis basiert auf Trockengewicht lyophilisierten Konjugats.
    • Titer ist arithmetisches Mittel, eine Woche nach entsprechender Injektion.
  • TABELLE 3 – Behandlung von Ratten mit 3'-AMNic-Suc-rEPA
    Figure 00410001
    • Dosis basiert auf Protein-Assay.
    • Titer ist das arithmetische Mittel, eine Woche nach entsprechender Injektion.
  • TABELLE 4 – Behandlung von Ratten mit 3'-AMNic-pGlu-ADH-rEPA
    Figure 00410002
    • Dosis basiert auf Trockengewicht lyophilisierten Konjugats.
    • Arithmetisches Mittel, eine Woche nach entsprechender Injektion.
  • TABELLE 5 – Behandlung von Kaninchen mit 3'-AMNic-Suc-rEPA und 3'-AMNic-pGlu-ADH-rEPA
    Figure 00420001
    • Dosis basiert auf Protein-Assay für 3'-AMNic-Suc-rEPA und auf Trockengewicht für 3'-AMNic-pGlu-rEPA.
    • Titer ist arithmetisches Mittel, sechs bis sieben Wochen nach dritter Injektion.
  • Beispiel 10 – ELISA-Assay und Antikörper-Spezifität
  • Das Nikotin-Molekül selbst ist zum Auskleiden von ELISA-Platten nicht geeignet und muß an ein größeres Molekül gekoppelt werden, das bessere adhäsive Eigenschaften hat. Poly-L-lysine oder Poly-L-glutaminsäure werden üblicherweise für diesen Zweck benutzt. Das derivatisierte Nikotenhapten 3'-Aminomethyl-(-)-nikotin (3'-AMNic) wurde an Poly-L-glutaminsäure konjugiert und das erhaltene 3'-Aminomethyl-(-)-nikotin-Poly-L-glutaminsäure-Konjugat (3'-AMNic-pGlu) wurde zum Auskleiden der ELISA-Platten verwendet.
  • Gegen 3'-AMNic-Impfstoff erzeugte Antikörper wurden mit Hilfe eines 3'-AMNic-pGlu-ELISA wie folgt bewertet: Dynatech-Immulon-4-Mikrotiterplatten (Chantilly, VA) wurden mit 100 μl/well 10 ng/ml 3'-AMNic-pGlu in 0,1 M Bicarbonat-Puffer, pH 9,6 ausgekleidet und über Nacht (ON) bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Die Platten wurden dann abgesaugt und mit 1% BSA in PBS eine Stunde bei RT blockiert. Proben und Referenz-Serum wurden in PBB (1% BSA, 0,3% BRIJ in PBS, pH 7,2) verdünnt auf eine Verdünnung, die eine ungefähre optische Dichte (OD) von 2,0 bei 450 nm ergibt. Die Platten wurden fünfmal gewaschen (9% NaCl, 0,1 % BRIJ) und mit verdünnten Proben und Referenz-Serum beladen. Referenz und Proben wurden 2fach auf den Platten herunterverdünnt auf ein Endvolumen von 10 μl/well und die Platten 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden dann erneut gewaschen und mit 100 μl/well peroxidasekonjugiertem Anti-Spezies-IgG, Fc-spezifisch (Jackson, West Grove, PA), verdünnt in PBB, beladen und bei 37°C eine Stunde inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und 10 Minuten bei RT mit 100 μl/well 3, 3', 5, 5'-Tetramethylbenzidin (TMB)-Substrat (KPL, Gaithersburg, MD), das 1:1 mit H2O2 (Teil des TMB-Reagenz-Kits) verdünnt ist, inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 100 μl/well 1 M Phosphorsäure gestoppt und bei 450 nm auf einem MR4000-Mikrotiterplatten-Leser (Dynatech) ausgelesen. Die Proben werden in Beziehung auf die Referenz mittels Parallel-Line-Analyse quantifiziert. Der Referenz wird ein numerischer Wert (U/ml) zugewiesen, der der Verdünnung entspricht, die eine OD von ungefähr 2,0 bei 450 nm ergibt.
  • Antikörper-Spezifitäten wurden mittels eines Inhibitions-ELISA-Assays ausgewertet. Jedes anti-[3'-AMNic-Suc-rEPA]-Serum wurde auf eine Konzentration verdünnt, die doppelt so hoch ist wie die, die eine optische Dichte von etwa 2,0 bei 450 nm ergeben würde. Mit Hilfe des oben beschriebenen 3'-AMNic-pGlu-ELISA wurde das verdünnte zu untersuchende Antiserum 1:1 (v/v) mit steigenden Mengen Test-Antigen (Inhibitor) 3 Stunden bei 37°C absorbiert, und diese absorbierte Probe wurde im ELISA mit unabsorbiertem Serum als Referenz analysiert. Die prozentuale Absorption in bezug auf die unabsorbierte Probe wurde für jede Probe bestimmt.
  • Die Spezifität von Rattenserum, das als Antwort auf 3'-AMNic-Suc-rEPA erzeugte Antikörper enthält, mittels Inhibitions-ELISA mit Nikotin-Tartrat als Inhibitor, wurde berechnet. Der IC50 dieses Antikörpers war 3,5 × 10-6 M. Die Spezifität von Kaninchenserum, das als Antwort auf 3'-AMNic-Suc-rEPA erzeugte Antikörper enthält, mittels Inhibitions-ELISA mit Nikotin-Tartrat als Inhibitor, wurde berechnet. Der IC50 dieses Antikörpers war 2,3 × 10-5 M.
  • Beispiel 11 – Antikörper-Affinität und -Bindekapazität
  • Die Antikörper-Bindekapazität wurde mittels Gleichgewichts-Dialyse für 4 Stunden bei 37°C mit 0,7 ml Plasma, Teflon-Semimikro-Zellen, Spectrapor-2-Membranen mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 12 bis 14 kD und Sorensons Puffer (0,13 Phosphat, pH 7,4) gemessen, siehe Pentel et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 246, 1061-1066 (1987). Der Plasma-pH wurde am Ende jedes Gleichgewichts-Dialyse-Laufs gemessen, und die Proben wurden nur benutzt, wenn der finale pH 7,30 bis 7,45 war.
  • Die Antikörper-Affinität für Nikotin wurde mittels eines löslichen Radioimmunoassays berechnet, siehe Mueller, Meth. Enzymol., 92, 589-601 (1983). Das Molekulargewicht von IgG wurde als 150 kD bestimmt.
  • Die Bindungskonstanten und Affinitäten, die aus dem Radioimmunoassay erhalten wurden, waren wie folgt: Für anti-[3'-AMNic-Suc-rEPA]-Rattenserum war der IC50 (Molar) 1,36 × 10-7. Der Ka (Molar-1) war 2,57 × 107. Die Bindestellenkonzentration war 2,61 × 10-6 Bindestellen/Liter und die Konzentration an nikotinspezifischem IgG war 0,2 mg/ml.
  • Beispiel 12 – Ermittlung der Nikotinverteilung in Plasma und Gehirn in Tiermodellen
  • Vorliegender erfinderischer Impfstoff wurde in verschiedenen Tiermodellen bewertet. Rattenmodelle wurden verwendet, um den Effekt von aktiver und passiver Immunisierung auf die Nikotin-Verteilung in Plasma und Gehirn zu bestimmen. Eine Studie untersuchte die Effekte passiver Immunisierung auf die Abmilderung der lokomotorischen Effekte des Nikotins, die eine Wirkung des Nikotins auf das Zentralnervensystem (ZNS) sind. Ein weiteres Experiment bewertete die Effekte passiver Immunisierung auf die Effekte des Nikotins auf das kardiovaskuläre System: Erhöhung des systolischen Blutdrucks.
  • Um die vorliegende Immunotherapie zu bewerten, wurde ein Tiermodell entwickelt, um die schnelle Aufnahme von Nikotin aus zwei Zigaretten in Menschen zu simulieren. Dieses Tiermodell wird in Hieda (1997) J. Pharmacol. Exp. Ther. 283(3):1076-1081 beschrieben. In diesem Modell wurde Ratten 0,03 mg/kg Nikotin durch 10-sekündige i.v.-Infusion verabreicht, was die schnelle Aufnahme von Nikotin über die Lungen in menschlichen Rauchern simuliert. Blutproben wurden 3 und 10 min nach Nikotininjektion zur Plasma-Nikotin-Messung entnommen. Wenn Gehirn-Nikotin-Konzentrationen bestimmt werden sollten, wurden die Tiere 3 min nach Nikotininjektion geopfert, und ihre Gehirne wurden schnell entfernt. Der Impfstoff nach Beispiel 4 wurde in Ratten bewertet, um seinen Effekt auf die Verteilung von Nikotin in Plasma und Gehirn zu bestimmen.
  • A. Aktive Immunisierung
  • Ratten wurden mit dem Nikotin-Impfstoff durch drei i.p.-Injektionen von insgesamt 25 μg pro Injektion von Impfstoff (3'-AMNic-Suc-rEPA) im Abstand von zwei Wochen immunisiert. Diese Tiere besaßen erhöhte Nikotinspiegel im Plasma 3 und 10 Minuten nach einer 10-sekündigen Nikotin-Infusion von 0,03 mg/kg, verglichen mit den Werten in nichtimmunisierten Kontrollen. Siehe 1. Daher war aktive Immunisierung effektiv bei der Erhöhung von Nikotinbindung im Plasma. Es ist bekannt, daß eine moderate Reduzierung der Nikotin-Menge, die das Gehirn erreicht, die Verhaltenseffekte des Nikotins dramatisch verändern kann.
  • B. Passive Immunisierung
  • Mit passiver Immunisierung war es möglich, den Dosis-Antwort-Effekt von Immun-IgG bei der Erhöhung des Plasma-Nikotinspiegels und der Reduzierung des Gehirn-Nikotinspiegels zu bestimmen. Ratten wurden verschiedene Mengen anti-(3'-AMNic-SucrEPA)-IgG (12,5 bis 50 mg) gesamt pro Injektion verabreicht. Wie in 2 gezeigt, gab es einen klaren Dosis-Antwort-Effekt – eine Erhöhung der IgG-Dosis erhöhte den Serum- und reduzierte den Gehirn-Nikotinspiegel.
  • 3 zeigt, daß anti-Nikotin-Antikörper (anti-3'-AMNic-Suc-rEPA) im Serum von Ratten vorhanden und aktiv waren, 30 Minuten und 1 Tag nach Verabreichung von Antikörpern (50 mg) gesamt pro Injektion. 3 zeigt, daß nach einer Nikotin-Reizung (10-sekündige 0,03 mg/kg-Infusion) diese Antikörper noch 30 Minuten und 1 Tag nach Verabreichung der Antikörper effektiv bei der Reduzierung der Nikotin-Konzentrationen im Gehirn und der Erhöhung der Nikotinspiegel im Plasma waren.
  • Ein weiterer Beweis für die Wirksamkeit der passiven Immunisierung mit Nikotin-Impfstoff der Erfindung ist seine Fähigkeit, aufeinanderfolgende Infusionen von Nikotin zu bekämpfen. In einem gesonderten passiven Immunisierungs-Experiment in Ratten verringerten wiederholte Nikotin-Dosen weder die vorhandenen Antikörper, noch reduzierten sie signifikant deren Fähigkeit, frisch injiziertes Nikotin zu binden. In 4 wurden 50 mg anti-[3'-AMNic-Suc-rEPA) zum Zeitpunkt Null infundiert. 24 Stunden später wurden fünf Nikotin-Injektionen durchgeführt – 0,03 mg/kg Nikotin wurde 10 Sekunden lang infundiert, über die rechte Halsvene, 80 Minuten lang alle 20 Minuten. Insgesamt wurden fünf Nikotin-Injektionen durchgeführt. Die fünfte Nikotin-Injektion wurde mit 3H-Nikotin versetzt. Das gesamte Blut und das Gehirn wurden 1 Minute nach der fünften Injektion entnommen. Die Ergebnisse sind unten gezeigt, und grafisch in 4 und 5 dargestellt.
  • Figure 00460001
  • Diese Ergebnisse zeigen, daß die Antikörper sogar noch nach der fünften Nikotin-Dosis effektiv bei der Erhöhung des Serum-Nikotinspiegels und der Reduzierung des Gehirn-Nikotinspiegels sind. Die Ergebnisse mit 3H-Nikotin zeigen, daß die Antikörper effektiv gegen das bei der fünften Dosis injizierte Nikotin sind.
  • Beispiel 13 – Bewertung der lokomotorischen Effekte des Nikotins
  • Dieses verwendete Experiment wurde entworfen, um zu bestimmen, ob passive Immunisierung eine unmittelbare, ZNS-vermittelte Wirkung von Nikotin verhindern kann. Das in diesem Experiment verwendete Rattenmodell wurde von Dr. David Malin entwickelt und beschrieben in Malin et al., Nicotine-specific IgG reduced distribution to brain and attenuates its behavioral and cardiovascular effects in rats, eingereicht beim Fifth Annual Meeting of the Society for Research on Nicotine and Tobacco, San Diego, CA, 5.-7. März 1999. Um eine Grundlinie zu erhalten, wurde der Effekt subkutaner Injektion von 0,8 mg/kg Nikotin-Tartrat auf das lokomotorische Aktivitätsniveau in Ratten gemessen. Die 0,8-mg/kg-Dosis Nikotin-Tartrat ist die höchste Dosis, die angewendet werden konnte, ohne lokomotorische Abnormalitäten zu erzeugen.
  • Es gab eine Erhöhung des Aktivitätsniveaus nach Nikotin-Injektion bei Ratten, die nicht mit anti-[3'-AMNic-Suc-rEPA] vorbehandelt waren, und bei Ratten, die mit 50 mg normalen Kaninchenserums-IgG vorbehandelt waren. Siehe 6A, rechter Balken und 6B, linker Balken. Dieser Effekt wurde unterdrückt, indem man die Tiere mit 50 mg anti-[3'-AMNic-Suc-rEPA]-Immun-IgG vorbehandelte (6B, rechter Balken). Dies zeigt, daß das anti-Nikotin-Antiserum einen stimulierenden Effekt von Nikotin in vivo unterband.
  • Beispiel 14 – Bewertung von Nikotin-Effekten auf den systolischen Blutdruck
  • In diesem Experiment wurde ein weiterer Indikator für den Verhaltenseffekt von Nikotin gemessen: die Änderung des systolischen Blutdrucks. Ratten wurden mit anti-[3'-AMNic-Suc-rEPA]-IgG oder Kontroll-IgG vorbehandelt. Die Ratten wurden mit einer subkutanen Injektion von 0,1 mg/kg Nikotin-Tartrat behandelt. Die Kontroll-Ratten zeigten eine Erhöhung des systolischen Blutdrucks von 42,6 ± 3,2 mmHg, wenn sie mit Nikotin behandelt wurden. Wenn die Ratten mit anti-Nikotin-Antiserum-IgG vorbehandelt wurden, war die Nikotin-Reizung weniger effektiv. Wenn steigende Mengen Anti-Nikotin-Serum verabreicht wurden, verminderte das die Fähigkeit von Nikotin, den Blutdruck zu erhöhen. Wie in 7 gezeigt, gab es einen negativen linearen Verlauf des Blutdrucks als Funktion der IgG-Dosis.

Claims (28)

  1. Ein Hapten-Träger Konjugat der folgenden Formel:
    Figure 00490001
    worin m 1 bis 2500 ist, n 0 bis 12 ist, y 1 bis 12 ist, X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH, CO-NH-NH-CO, und S-S; Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus NH-CO, CO-NH, CO-NH-NH, NH-NH-CO, NH-CO-NH, CO-NH-NH-CO, und S-S, und der -(CH2)n-X-(CH2)y-Y- Rest an die 3', 4' oder 5' Position des Nikotins gebunden ist.
  2. Das Konjugat gemäß Anspruch 1, worin m ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 1 bis 20 und 1 bis 200.
  3. Das Konjugat gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin m 11 bis 17 ist, n 1 ist, y 2 ist, X NH-CO ist, Y CO-NH ist, wobei der -(CH2)n-X-(CH2)y-Y- Rest an die 3' Position des Nikotins gebunden ist.
  4. Das Konjugat gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin m 11 bis 17 ist, n 1 ist, y 2 ist, X NH-CO ist, Y CO-NH ist, wobei der -(CH2)n-X-(CH2)y-Y- Rest an die 4' Position des Nikotins gebunden ist.
  5. Das Konjugat gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin m 11 bis 17 ist, n 1 ist, y 2 ist, X NH-CO ist, Y CO-NH ist, wobei der -(CH2)n-X-(CH2)y-Y- Rest an die 5' Position des Nikotins gebunden ist.
  6. Das Konjugat gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Trägerprotein Exoprotein A ist.
  7. Ein Hapten-Träger Konjugat der folgenden Formel:
    Figure 00500001
    worin n 0 bis 12 ist, j 1 bis 1000 ist, k 1 bis 20 ist, und E eine Aminosäurenenthaltende Matrix ist.
  8. Das Konjugat gemäß Anspruch 7, wobei die Matrix poly-L-Glutaminsäure ist.
  9. Das Hapten-Träger Konjugat gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Konjugat hergestellt wird, indem trans-4'-carboxy-(-)-Cotinin als Ausgangsmaterial verwendet wird.
  10. Ein Antikörper, der als Antwort auf das Hapten-Träger Konjugat gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 hergestellt wird.
  11. Der Antikörper gemäß Anspruch 10, wobei der Antikörper monoklonal ist.
  12. Der Antikörper gemäß Anspruch 10, wobei der Antikörper polyklonal ist.
  13. Ein funktionelles Fragment des Antikörpers gemäß Anspruch 10.
  14. Eine Ausstattung, um die Anwesenheit von Nikotin in einer Probe zu bestimmen, welche einen Antikörper oder ein funktionelles Fragments davon gemäß irgendeinem der Ansprüche 10 bis 13 umfasst.
  15. Ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, welches das Immunisieren eines Wirtssäugetieres mit dem Hapten-Träger Konjugat gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 umfasst.
  16. Das Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei der Antikörper monoklonal ist.
  17. Das Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei der Antikörper polyklonal ist.
  18. Eine Impfstoffzusammensetzung, die mindestens ein Hapten-Träger Konjugat gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 umfasst.
  19. Eine Impfstoffzusammensetzung, die im Wesentlichen aus einem Hapten-Träger Konjugat gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 besteht.
  20. Eine Impfstoffzusammensetzung, die aus einem Hapten-Träger Konjugat gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 besteht.
  21. Eine Impfstoffzusammensetzung, die aus einem Hapten-Träger Konjugat gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 und mindestens einem Adjuvans besteht.
  22. Eine Impfstoffzusammensetzung, die aus einem Hapten-Träger Konjugat gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, mindestens einem Adjuvans und mindestens einem Trägerstoff besteht.
  23. Eine Impfstoffzusammensetzung, die aus einem Hapten-Träger Konjugat gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, mindestens einem Adjuvans, mindestens einem Trägerstoff und mindestens einem Zusatzstoff besteht.
  24. Ein Hapten-Träger Konjugat gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, oder ein Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon gemäß irgendeinem der Ansprüche 10 bis 13, zur Verwendung als Arzneimittel.
  25. Ein Hapten-Träger Konjugat gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, oder ein Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon gemäß irgendeinem der Ansprüche 10 bis 13, zur Verwendung als Arzneimittel gemäß Anspruch 24 für die Vorbeugung oder Behandlung von Nikotinabhängigkeit.
  26. Ein Hapten-Träger Konjugat gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 zur Verwendung als Arzneimittel gemäß Anspruch 24 oder 25, wobei das Arzneimittel darüberhinaus eine Verbindung umfasst, die geeignet ist für die Behandlung von Nikotinabhängigkeit.
  27. Verwendung eines Hapten-Träger Konjugates gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, oder eines Antikörper oder eines funktionellen Fragments davon gemäß irgendeinem der Ansprüche 10 bis 13, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Vorbeugung oder Behandlung von Nikotinabhängigkeit.
  28. Verwendung eines Hapten-Träger Konjugates gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines Arzneimittels gemäß Anspruch 27, wobei das Arzneimittel darüber hinaus eine Verbindung umfasst, die geeignet ist für die Behandlung von Nikotinabhängigkeit.
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