DE69922522T2

DE69922522T2 - Funktionalisierte hyaluronsäurederivate, bildung von hydrogelen und deren verwendung in situ

Info

Publication number: DE69922522T2
Application number: DE69922522T
Authority: DE
Inventors: Daniel Aeschlimann; Paul Bullpitt
Original assignee: Orthogene Inc
Current assignee: Orthogene Inc
Priority date: 1998-09-18
Filing date: 1999-09-17
Publication date: 2005-12-15
Anticipated expiration: 2019-09-18
Also published as: IL142068A; US20070149441A1; IL142068A0; ATE284229T1; US6630457B1; EP1115433A1; EP1115433B1; WO2000016818A1; CA2344215A1; EP1757314A1; DE69922522D1; AU6192299A; WO2000016818A9; US7196180B2; US20040072793A1

Description

TECHNISCHER BEREICH DER ERFINDUNG
Diese Erfindung ist auf Biomaterialien für die räumlich und zeitlich kontrollierte Freisetzung von bioaktiven Wirkstoffen wie z.B. Arzneimitteln, Wachstumsfaktoren, Zytokinen oder Zellen gerichtet. Diese Erfindung lehrt vor allem vielseitige Verfahren zur chemischen Kreuzvernetzung in situ von hochmolekularer Hyaluronsäure unter physiologischen Bedingungen, um polymerisierbare, bioabbaubare Materialien zu bilden. Die Verfahren beruhen auf der Einführung von funktionellen Gruppen in Hyaluronsäure (HA) über die Bildung eines aktiven Esters an dem Carboxylat des Glucuronsäure-Restes als Zwischenprodukt und nachfolgende Substituierung mit einer Seitenkette, die an einem Ende eine nukleophile Gruppe und am anderen Ende eine (geschützte) funktionelle Gruppe enthält. Die eingeführten funktionalen Gruppen ermöglichen Kreuzvernetzung der HA-Derivate. Erfindungsgemäße kreuzvernetzte Hyaluronsäure-Hydrogele sind in verschiedenen chirurgischen Anwendungen und als ein temporäres Gerüst für Gewebsregeneration z.B. bei der Knorpelreparatur nützlich.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG Reparatur von Gelenkflächenknorpel
Das Scheitern beim Regenerieren von persistierendem hyalinen Knorpel durch chirurgische Verfahren veranlasste Forscher, Reparatur durch Anwendung biologischer Strategien zu versuchen. Die biologische Reparatur von Gelenkflächenknorpel ist, mit einigen wenigen Ausnahmen, immer noch auf einer experimentellen Stufe. Die biologische Knorpelreparatur wurde auf zwei grundlegenden Wegen angegangen. Zuerst wurden autologe Chondrozyten in eine Läsion transplantiert, um eine Reparatur zu induzieren (Grande et al., J. Orthrop. Res. 7, 208-214 (1989); Brittberg et al., New Engl. J. Med. 331, 889-895 (1994); Shortkroff et al., Biomaterials 17, 147-154 (1996)). Chondrozyten können von einem nun beladenen Bereich eines Gelenkes erhalten und in Kultur proliferiert werden (siehe Grande; Brittberg.; Shortkroff, loc. cit.), oder mesenchymale Stammzellen können geerntet werden, z. B. aus dem Mark des Beckenkamms, und durch Verwendung von Wachstumsfaktoren dazu gebracht werden, sich entlang der Chondrozytenlinie zu differenzieren (Harada et al., Bone 9, 177-183 (1988); Wakitani et al., J. Bone Joint Surg. 76-A, 579-592 (1994)). Die momentan versuchten klinischen Chondrozytentransplantationsverfahren sind, obwohl vielversprechend, erschwert, da sie technisch sehr anspruchsvoll, die Zellpräparation sehr teuer und der mögliche Patientenpool durch Alter, Ort des Defekts, Geschichte der Krankheit etc. limitiert ist. Zellen wurden zudem in Form von perichondralen Transplantaten, die z.B. aus zu den Rippen gehörendem Knorpel erhalten wurden, in Knorpeldefekte transplantiert, jedoch wegen der Begrenzung des Spendermaterials und der Komplikation einer endochondralen Verknöcherung an der Transplantationsstelle, die in Langzeitnachfolgeuntersuchungen beobachtet wurde, mit eingeschränktem Erfolg (Amiel et al., Connect. Tissue Res. 18, 27-39 (1988); O'Driscoll et al., J. Bone Joint Surq. 70-A, 595-606 (1988); Homminga et al., Acta Orthrop. Scand. 326-329 (1989); Homminga et al., J. Bone Joint Surg. 72-B, 1003-1007 (1990)). Ein zweiter Ansatz zielt auf die Einbeziehung von mesenchymalen Stammzellen aus dem umgebenden Bindegewebe, z.B. der Synovialis, durch Verwendung von chemotaktischen und/oder mitogenen Faktoren (Hunziker und Rosenberg, J. Bone Joint Surq. 78-A, 721-733 (1996); siehe auch US-Patent. Nr. 5368858). Die Verfügbarkeit von Wachstumsfakto ren und Zytokinen in rekombinanter Form und das Fehlen einer komplizierten Zelltransplantation macht dieses Verfahren zu einer sehr attraktiven Alternative. Der Nachteil von beiden Verfahren ist die Schwierigkeit, die die Reparatur induzierenden Faktoren, ob Gewebetransplantate, Zellen oder Wachstumsfaktoren, innerhalb der Defektstelle stabil zu verankern. Zudem scheint das Umreißen des zu reparierenden Platzes, z.B. durch Auffüllen mit einem Matrixmaterial, entscheidend zu sein, um eine ebene Knorpeloberfläche wiederherzustellen (Hunziker und Rosenberg, loc. cit.). So weit war die Verfügbarkeit von Matrixmaterialien als Kandidat der beschränkende Faktor, und das Verankern von Materialien, die mit Chondrozyten und/oder chondrogenen Faktoren besät waren, schwierig, was die nicht zufrieden stellenden Ergebnisse erklärt, die mit momentan erhältlichen Materialien erhalten wurden, wie beispielsweise Gerüsten aus Polyessigsäure und polyglykolischer Säure (Freed et al., J. Biomed. Mat. Res. 28, 891-899 (1994); Chu et al., J. Biomed. Mat. Res. 29, 1147-1154 (1995)), Calciumphosphatmineralien (Nakahara et al., Clin. Orthrop. 276, 291-298 (1992)), Fibrinversieglern ("sealants") (Itay et al., Clin. Orthrop. 220, 284-303 (1987)) und Kollagengelen (Wakitani et al., J. Bone Joint Surq. 71-B, 74-80 (1989)). Wir haben neue auf Hyaluronsäure basierende bioabbaubare Materialien entwikkelt, die optimiert sind für die biologischen Anforderungen, die an ein Reparaturmaterial in einem synovialen Gelenk gestellt werden, und die in situ-Polymerisierung ermöglichen.
Biologie der Hyaluronsäure und ihre therapeutische Verwendung
Hyaluronsäure (HA) ist einzigartig unter den Glukosaminoglycanen, da sie nicht kovalent an ein Polypeptid gebunden ist. HA ist auch einzigartig, da sie eine verhältnismäßig einfache Struktur von sich wiederholenden nicht-sulfatierten Disaccharideinheiten aufweist, die sich aus D-Glucuronsäure (GlcUA) und N-Acetyl-D-Glukosamin (GlcNAc) zusammensetzt (Scott et al., The Chemistry, Biology and Medical Applications of Hyaluronan and Its Devivatives, T.C. Laurent (Hrsg.), Portland Press, London, (im Folgenden "Hyaluronan and Its Derivatives"), S. 7-15 (1998)). Ihre Molekularmasse beträgt typischerweise mehrere Millionen Daltons. HA wird auch als Hyaluronan oder Hyaluronat bezeichnet und liegt in verschiedenen Salzformen vor (siehe Formel I).
HA ist eine reichlich vorkommende Komponente des Knorpels und spielt als eine organisierende Struktur für den Zusammenbau von Aggrecan, dem großen Knorpelproteoglycan, eine strukturelle Schlüsselrolle in der Organisierung der extrazellulären Knorpelmatrix (Laurent und Fraser, FASEB J. 6, 2397-2404 (1992); Mörgelin et al., Biophys. Chem. 50, 113-128 (1994)). Die nicht-kovalenten Interaktionen von Aggrecan und dem Link-Protein mit HA führt zu dem Zusammenfügen einer großen Anzahl von Aggrecanmolekülen entlang der HA-Kette und vermittelt die Zurückhaltung von Aggrecan in dem Gewebe. Die hochgradig negativ geladenen Aggrecan/HA-Zusammenlagerungen sind durch Immobilisieren von Wassermolekülen größtenteils für die viskoelastischen Eigenschaften von Knorpel verantwortlich. Eine Anzahl von Zelloberflächenrezeptoren für HA sind beschrieben worden und es wurde für sie gezeigt, dass sie eine wesentliche Rolle in der Zusammenlagerung der perizellulären Matrix von Chondrozyten und anderen Zellen, z.B. Isoformen von CD44 und Vertebratenhomologen von Cdc37, spielen (Knudson und Knudson, FASEB J. 7, 1233-1241 (1993); Grammatikakis et al., J. Biol. Chem. 270, 16198-16205 (1995)), oder an der Rezeptor-vermittelten Endozytose und dem Abbau von HA beteiligt sind, um HA-Gehalte in Geweben und Körperflüssigkeiten zu kontrollieren (Laurent und Fraser, loc. cit.; Fraser et al., Hyualuronan and Its Derivatives, S. 85-92 (1998)). Blockieren der Interaktion dieser Rezeptoren mit HA in prächondrogenen Micromass-Kulturen von Mesoderm aus embryonalen Extremitätenknospen inhibiert die Chondrogenese, was darauf hindeutet, dass die Ausbildung und das Erhalten eines differenzierten Chondrozytenphänotyps zumindest teilweise von HA und HA-Rezeptor-Interaktionen abhängig sind. (Maleski und Knudson, Exp. Cell. Res. 225, 55-66 (1996)).
HA und ihre Salze werden momentan in der Therapie von Gelenkerkrankungen mittels intraartikulärer Injektion (Stachnan et al., Ann. Rheum. Dis. 49, 949-952 (1990); Adams, Hyaluronan and Its Derivatives, S. 243-253 (1998)), bei ophthalmischer Chirurgie zur Implantierung intraokularer Linsen (Denlinger, Hyaluronan and Its Derivatives, S. 235-242 (1998)), zur Förderung von Wundheilung in verschiedenen Geweben (King et al., Surgery 109, 76-84 (1991)), oder erst kürzlich in derivatisierter und/oder quervernetzter Form zum Herstellen dünner Filme verwendet, die zur Gewebstrennung verwendet wurden (für einen Überblick siehe Laurent und Fraser, loc. cit.; Weiss, Hyaluronan and Its Derivatives, S. 255-266 (1998); Larsen, Hyaluronan and Its Derivatives, S. 267-281 (1998); Band, Hyaluronan and Its Derivatives, S. 33-42 (1998)). Ausgedehnte Bemühungen wurden von verschiedenen Laboratorien unternommen, um Derivate von HA mit einzigartigen Eigenschaften für spezifische biomedizinische Anwendungen herzustellen. Die meisten der Entwicklungen waren auf die Herstellung von Materialien wie z.B. Filme oder Schwämme zur Implantierung und die Substituierung von HA mit therapeutischen Wirkstoffen für die verzögerte Freisetzung und/oder verlängerte Wirksamkeit gerichtet (für einen Überblick siehe Band, loc. cit.; Prestwich et al. Hyaluronan and Its Derivatives, S. 43-65 (1998); Gustafson, Hyaluronan and Its Derivatives, S. 291-304 (1998)). Die Strategien haben Esterifizierung von HA (US-Patent Nr. 4957744 und 5336767), Acrylierung von HA (US-Patent Nr. 5410016) und Kreuzvernetzung von HA durch Verwendung von Divinylsulfon (US-Patent Nr. 4582865) oder Glycidylether (US-Patent Nr. 4713448) eingeschlossen. Die modifizierten HA-Moleküle zeigen jedoch veränderte physikalische Eigenschaften, wie z.B. verringerte Löslichkeit in Wasser, und/oder die verwendeten chemischen Reaktionsstrategien sind nicht für die Kreuzvernetzung von HA unter physiologischen Bedingungen (in einer wässrigen Umgebung, bei pH 6,5-8,0) entworfen.
Es ist allgemein bekannt, dass Polyaldehyde durch Oxidieren von Zucker unter Verwendung von Periodat erzeugt werden können (Wong, CRC Press, Inc., Boca Rayton, FL, S. 27 (1993); EP-Nr. 9615888). Periodatbehandlung oxidiert die proximalen Hydroxylgruppen (an C2- und C3-Kohlenstoffen des Glucuronsäurerests) zu Aldehyden, wodurch der Zuckerring geöffnet wird, um eine lineare Kette zu bilden (Schema 1). Während die Periodatoxidation die Bildung einer großen Anzahl von funktionellen Gruppen erlaubt, ist der Nachteil der Verlust der nativen Struktur des Rückgrats. Folglich könnte das gebildete Derivat von den Zellen nicht als HA erkannt werden. Tatsächlich zeigten Hydrogele, die durch Verwendung von Periodat-oxidiertem HA als einem Kreuzvernetzungsmittel z.B. in Verbindung mit den hier beschriebenen HA-Aminen erzeugt wurden, in dem ektopischen Knochenbildungsmodell der Ratte sehr eingeschränkte Gewebstransformation und schlechte zelluläre Infiltration (6), Dies steht in scharfem Gegensatz zu den hier beschriebenen HA-Aldehydderivaten.
Die Einführung von freien Aminogruppen in HA, die für weitere zweckmäßige Kopplungsreaktionen unter milden physiologischen Bedingungen verwendet werden könnten, war ein Gegenstand von großem Interesse. Frühere Verfahren haben eine freie Aminogruppe in hochmolekularer HA durch alkaline N-Deacylierung ihres Glukosamin-Restes erzeugt (Curvall et al., Carbohydr. Res. 41,235-239 (1975); Dahl et al., Anal. Biochem. 175, 397-407 (1988)). Jedoch wurden begleitende Degradierungen der HA über β-Eliminierung in dem Glucuronsäure-Rest bei den benötigten rauen Reaktionsbedingungen beobachtet. Dies ist von besonderer Bedeutung, da gezeigt wurde, dass niedermolekulare HA-Fragmente im Gegensatz zu hochmolekularer HA in der Lage sind, entzündliche Reaktionen hervorzurufen (Noble et al., Hyaluronan and Its Derivatives, S. 219-225 (1998)). Ein früher Bericht behauptet, dass Carbodiimid-katalysierte Umsetzung von HA mit Glycinmethylester, einem monofunktionalen Amin, zur Bildung einer Amidbindung führte (Danishefsky und Siskovic, Carbohydr. Res. 16, 199-201 (1971)). Jedoch wurde in einer Anzahl von Studien gezeigt, dass dies nicht der Fall ist (Kuo et al., Bioconjugate Chem. 2, 232-241 (1991); Ogamo et al., Carbohydr. Res. 105, 69-85 (1982)). Unter leicht sauren Bedingungen wird das instabile Zwischenprodukt O-Acylisoharnstoff leicht gebildet, welches sich in Abwesenheit von Nukleophilen durch eine cyclische elektronische Umlagerung in einen stabilen N-Acylharnstoff umlagert (Kurzer und Douraghi-Zedeh, Chem. Rev. 67, 107-152 (1967)). Diese O-N-Wanderung des O-Acylisoharnstoffs tritt auch ein, wenn das Nukleophil ein primäres Amin ist (Kuo et al., loc. cit.), und jegliche Amidbildung, die auftritt, ist unbedeutend, wie von Ogamo et al., loc. cit., berichteten. Experimente, bei denen hochmolekulares HA (Mr ∼ 2 × 106 Da) mit einem Überschuss des Fluoreszenzfarb-Stoffs 5-Aminofluorescein in Anwesenheit des Carbodiimids EDC umgesetzt wurde, erreichten nur 0,86 % der theoretischen Markierung. Die Einführung einer terminalen Hydrazidogruppe in HA mit einem variablen Spacer wurde kürzlich erreicht und führte zu der Fähigkeit, weitere Kupplungs- und Kreuzvernetzungsreaktionen durchzuführen (Pouyani und Prestwich, Bioconjugate Chem. 5, 339-347 (1994), US-Patent Nr. 5616568, 5652347 und 5502081; Vercruysse et al., Bioconjugate Chem. 8, 686-694 (1997)).
Es ist das Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren zur vielseitigeren Modifizierung von HA mit verschiedenen funktionellen Gruppen zur Verfügung zu stellen, welche die Kreuzvernetzung der HA-Derivate unter physiologischen Bedingungen ermöglichen. Es ist ein anderes Ziel, dass das Verfahren der Funktionalisierung nicht das Molekulargewicht oder die chemische Identität (mit Ausnahme der Zielcarboxylgruppe zum Verkoppeln) der HA beeinträchtigt. Es ist ein weiteres Ziel, dass das Verfahren des Funktionalisierens HA-Moleküle zur Verfügung stellt, die in vivo gut vertragen werden und bioabbaubar sind.
Es ist auch das Ziel dieser Erfindung, HA-Derivate und die Methodik für deren in situ-Polymerisierung zu identifizieren, um ein bioabbaubares Gerüst für Gewebsregenerierung zur Verfügung zu stellen. Es ist ein anderes Ziel, dass die HA-Materialien im Beisein von Zellen polymerisiert werden können, um als ein Vehikel für die Zelltransplantation zu dienen. Es ist ein weiteres Ziel, Methodik zum Funktionalisieren und Kreuzvernetzung von HA zur Verfügung zu stellen, das Variationen in den biomechanischen Eigenschaften der gebildeten Gele ebenso wie in der Empfindlichkeit gegenüber zellulärer Infiltration und dem Abbau ermöglicht.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Biomaterialien für räumlich und zeitlich kontrollierte Freisetzung von bioaktiven Wirkstoffen wie z.B. Arzneimitteln, Wachstumsfaktoren, Zytokinen oder Zellen, sind ein Schlüsselfaktor für die Gewebsreparatur. Vor allem werden in situ-polymerisierbare, bioabbaubare Materialien für das Wiederherstellen von Knorpeloberflächen benötigt, die so gestaltet sind, dass sie den mechanischen Kräften in einem Gelenk widerstehen können.
Die vorliegende Erfindung ist auf eine Zusammensetzung gerichtet, die quervernetzte Hydrogel-Derivate der Hyaluronsäure umfasst, die Disaccharid-Untereinheiten umfassen, wobei mindestens eine dieser Disaccharid-Untereinheiten eine substituierte Disaccharid-Untereinheit mit einer Substitution an einer Carboxyl-Gruppe ist, so dass die substituierte Disaccharid-Untereinheit die Formel
aufweist, worin jedes R' und R'' eine Seitenkette ist, die eine oder mehrere funktionelle Gruppen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff; bioaktivem Peptid; Alkyl; Aryl; Alkylaryl; Arylalkyl; substituiertem Alkylaryl, das ein Atom oder Atome von Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel oder Phosphor enthält; substituiertem Alkylaryl, das ein Atom oder Atome von Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor, Halogen oder ein Metallion enthält; und einer substituierten heterocyclischen Verbindung, die ein Atom oder Atom von Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor, Halogen oder ein Metallion enthält, umfasst;
wobei die funktionellen Gruppen innerhalb jeder der R'- oder R''-Seitenketten entweder direkt aneinander gebunden sind oder durch ein Mitglied getrennt sind, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ether, Keto, Amino, Oxycarbonyl, Sulfat, Sulfoxid, Carboxyamid, Alkyn und Alken;
und bei der jede der R'- und R'' -Seitenketten mit einer terminalen funktionellen Gruppe endet, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Peptid, Aldehyd, Amin, Arylazid, Hydrazid, Maleimid, Sulfhydryl, aktiver Ester, Ester, Carboxylat, Imidoester, Halogen und Hydroxyl; oder
wobei die Derivate der Hyaluronsäure kovalent über eine der terminalen funktionellen Gruppe quervernetzt sind; und
wobei die Derivate der Hyaluronsäure zu einem Grad von mehr als 10 % modifiziert sind.
Die vorliegende Erfindung ist weiterhin auf ein Verfahren zur Herstellung eines quervernetzten Hydrogel-Derivats der Hyaluronsäure gerichtet, Schritte umfassend bei denen man:

a) an einem Carboxylat eines Glucuronsäure-Restes der Hyaluronsäure einen aktivierten Ester bildet;
b) an dem Carbonyl-Kohlenstoff des in Schritt (a) gebildeten aktivierten Esters eine Seitenkette substituiert, die einen nukleophilen Teil und einen Teil mit einer funktionellen Gruppe umfasst; und
c) die in Schritt (b)gebildeten, substituierten Derivate der Hyaluronsäure quervernetzt.

Physikalische und chemische Eigenschaften der erfindungsgemäßen Hydrogele wurden durch Verwendung von biomechanischem Testen und durch Prüfen der Empfindlichkeit gegenüber einem Abbau durch Glykosidasen wie z.B. testikulärer Hyaluronidase abgeschätzt. Bioverträglichkeit wurde durch Verwendung von Zellkulturtests und subkutaner Implantierung der Hyaluronsäurematerialien in Ratten abgeschätzt. Dieser in vivo-Test ist auch das etablierte Modell für die Induktion einer Bildung von ektopischem Knochen durch Mitglieder der „Transforming Growth Factor β''-Familie (TGF-β), und einige erfindungsgemäße quervernetzte Hyaluronsäurematerialien ergaben eine exzellente Bildung von ektopischem Knochen in vivo, wenn sie mit entsprechendem/n Wachstumsfaktor(en) beladen waren.
Wie unten in der ausführlichen Beschreibung der Erfindung dargestellt, haben die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen viele therapeutische Anwendungen. Beispielsweise können erfindungsgemäße Zusammensetzungen verwendet werden, um Blutung in der allgemeinen Chirurgie aufzuhalten, um Nerven und Gefäße in wiederherstellender Neuro- und plastischer Chirurgie wiederherzustellen, und um Haut-, Gefäß- oder Knorpeltransplantate oder -implantate in der orthopädischen, vaskulären und plastischen Chirurgie zu verankern. Erfindungsgemäße Zusammensetzungen sind auch nützlich als Vehikel für die Verabreichung von Zellen oder bioaktiven Molekülen wie z.B. Wachstumsfaktoren, um eine fokale Reparatur zu stimulieren. Lokale Verabreichung von Wachstumsfaktoren erleichtert Wundheilung und Gewebsregenerierung in vielen Situationen, nicht nur durch Fördern der Knochenbildung und durch Stimulieren der Knorpelreparatur in orthopädischen Verfahren, sondern auch z.B. beim Behandeln pathologischer Wunderkrankungen wie beispielsweise chronischer Geschwüre. Diese Zusammensetzungen können auch als ein Gerüst dienen, um künstliche Gewebe durch Proliferierung von autologen Zellen in Kultur zu erzeugen. Auf der anderen Seite macht die anti-adhäsive Eigenschaft von einigen Zusammensetzungen im Hinblick auf Zellen derartige Zusammensetzungen besonders geeignet, um Gewebstrennungen zu erzeugen und Adhäsionen nach einem chirurgischem Eingriff zu verhindern. Die viskoelastischen Eigenschaften der HA machen sie für diesen Zweck besonders gut geeignet, und sie wird klinisch verwendet, um vorübergehendes Nachlassen von Schmerzen durch wiederholte intraartikuläre Injektionen als ein "Gelenkschmiermittel" bei Gelenkserkrankungen zu erreichen, als ein Schutzmittel bei Augenirritationen und bei ophthalmischer Chirurgie, als eine Barriere für Zellen in Gesichts- und anderen Wiederherstellungen bei der plastischen Chirurgie und Zahnmedizin, bei wiederherstellender Chirurgie von Sehnen, bei chirurgischen Verfahren im Urogenitalsystem und in der Thoraxchirurgie. Die injizierbare Beschaffenheit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung macht sie auch geeignet zur Gewebsvermehrung in der plastischen Chirurgie, wo die HA-Matrix vorwiegend als ein inertes, bioverträgliches Füllmaterial dient (Balasz und Laurent, Hyaluronan and Its Derivatives, S. 325-326 (1998)), z.B. zum Verfüllen von Hautfalten oder zur Lippenrekonstruktion.
HA-Hydrogele erfüllen einige der gewünschten Eigenschaften für ein bioabbaubares Material, das mit Zellen bioverträglich ist. Die verhältnismäßig einfache repetitive Struktur der HA ermöglicht spezifische Modifizierung und Einführung einer großen Anzahl von funktionellen Gruppen zur Kreuzvernetzung, um Hydrogele mit hervorragenden physikalischen Eigenschaften zu erzeugen. HA-Hydrogele wurden auch erfolgreich als Verabreichungsvehikel in Chondrozyten-Transplantationsstudien verwendet (Robinson et al., Calcif. Tissue Int. 46, 246-253 (1990)) und HA hat ihre Bioverträglichkeit in verschiedenen Formen in der klinischen Praxis bewiesen (für einen Überblick siehe Laurent und Fraser, loc cit.; Balasz und Laurent, loc. cit.).
Die Reaktionsmechanismen, die wir für in situ-Polymerisierung von HA-Derivaten erforscht haben, sind mit einer wässrigen Umgebung verträglich und sind für Zellen nicht toxisch. Die Aldehyd-vermittelten Kreuzvernetzungsstrategien folgen Reaktionen, die physiologisch bei Kreuzvernetzung von fibrillären Kollagenen und Elastin auftreten. NHS-Ester stellen eine Alternative für die schnelle Bildung von stabilen Bindungen unter physiologischen Bedingungen zur Verfügung, primär durch Reaktion mit primären Aminen. Die Technik der NHS-Ester-vermittelten Proteinkreuzvernetzung wurde für Materialien mit Anwendungen in der plastischen Chirurgie entwickelt, die in situ-Polymerisierung benötigen (US-Patent Nr. 5413791).
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Ergebnisse aus einem Ninhydrin-Test nach reduktiver Alkylierung von HA und HA-Aldehyd in Anwesenheit von Putrescin. Die reduktive Alkylierung wurde mit einem Überschuss von Putrescin in Anwesenheit von Pyridinboran durchgeführt. HA oder ihre Derivate wurden durch wiederholte Ethanolfällung vor der Detektierung von freien Aminogruppen in der HA-Kette durch Verwendung des Ninhydrin-Tests (Sheng et al., Anal. Biochem. 211, 242-249 (1993)) aufgereinigt.
2 zeigt ¹H-NMR von nativem HA (2A) und einem HA-Derivat mit geschützter Aldehydfunktionalität (2B) in D₂O bei 300 MHz. Peaks wurden wie in der Strukturformel bezeichnet zugewiesen.
3 zeigt ¹H-NMR von HA-Derivaten mit Aminfunktionalität, die aus Putrescin (3A), Histidin (3B), Lysin (3C) und Adipinsäure Dihydrazid (3D) gebildet wurden, in D₂O bei 300 MHz. Peaks wurden wie in der Strukturformel bezeichnet zugewiesen.
4 zeigt den Verdau von kreuzvernetzten HA-Hydrogelen mit Hyaluronidase. In 4A wurden HA-Hydrogele durch Kreuzvernetzung von 12 mg/ml hochgradig modifiziertem (∼65-70 %) HA-Amin (Adipinsäure Dihydrazido-HA) mit 15 mg/ml (SPR)₂-PEG gebildet. Die Gele wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von boviner testikulärer Hyaluronidase (HYALase) für die angegebene Zeit inkubiert und der Abbau der Gele durch die Freisetzung von Glucuronsäure in den Überstand durch Verwendung des Carbazol-Verfahrens gemessen. (Bitter und Muir, Anal. Biochem. 4, 330-334 (1962)). Die HA-Hydrogele in 4B wurden durch Kreuzvernetzung von 12 mg/ml optimal modifiziertem (∼20-25 %) HA-Amin (Adipinsäure Dihydrazido-HA) mit 15 mg/ml (SPA)₂-PEG
12 mg/ml hochgradig modifizierter (∼65-70 %), Adipinsäure Dihydrazido-HA mit 15 mg/ml (SPA)2-PEG (Δ); 12 mg/ml optimal modifizierter (∼20-25 %) Lysinmethylester-HA mit entweder 15 mg/ml (SPA)₂-PEG (A) oder 0,44 mg/ml Glutaraldehyd (σ), und 12 mg/ml optimal modifizierter (∼10=15 %) Diaminobutyl-HA mit 15 mg/ml (SPA)₂-PEG (o) gebildet. Die Gele wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von boviner testikulärer Hyaluronidase für die angegebene Zeit inkubiert und der Abbau der Gele wurde wie in 4A oben gemessen.
5 zeigt die Phasenkontrastbilder von Zellen, die auf verschiedenen kreuzvernetzten HA-Hydrogelen kultiviert wurden. 5A: dedifferenzierte Chondrozyten, die auf einem Hydrogel kultiviert wurden, das aus hochgradig modifiziertem (∼65-70 %), mit 5 mg/ml (SPA)₂-PEG kreuzvernetztem HA-Amin (Adipinsäure Dihydrazido-HA) gebildet wurde, aggregieren als eine Folge der Unfähigkeit, an das Substrat zu adhärieren. 5B: Zellen, die auf einem Hydrogel kultiviert wurden, das durch das gleiche HA-Amin kreuzvernetzt mit 0,25 mg/ml Glutaraldehyd gebildet wurde, zeigen eine abgerundete Morphologie und keine Aggregation, was darauf hindeutet, dass sie in der Lage sind, an das Substrat zu adhärieren. 5C: Zellen, die auf einem Hydrogel kultiviert wurden, das aus dem HA-Amin (Adipinsäure Dihydrazido-HA) gebildet wurde, das zu einem Grad von ∼20-25 modifiziert und mit 2 mg/ml (SPA)₂-PEG kreuzvernetzt war, adhärieren an das Substrat, breiten sich aus und infiltrieren anschließend das Hydrogel. Alle Bilder zeigen Zellen 24 h nach dem Aussäen, jedoch bleibt die Morphologie sogar nach mehreren Tagen in Kultur die gleiche.
6 zeigt eine in vivo-Beurteilung von HA-Hydrogelen, die aus verschiedenen HA-Derivaten durch Verwendung der Aldehyd-vermittelten Kreuzvernetzung gebildet wurden. Subkutane Implantierung von HA-Hydrogelen bestehend aus (6A) 12 mg/ml optimal modifiziertem (∼20-25%) HA-Amin (Adipinsäure Dihydrazido-HA) kreuzvernetzt mit 0,25 mg/ml Glutaraldehyd, (6B) 7 mg/ml des gleichen HA-Amins kreuzvernetzt mit 7 mg/ml HA-Aldehyd (mit Periodat oxidiert), (6C) 7 mg/ml des gleichen HA-Amins kreuzvernetzt mit 7 mg/ml HA-Aldehyd (entschütztes Aminodimethylacetal-HA, zu ∼10-15% modifiziert), oder (6D) 7 mg/ml des gleichen HA-Amins kreuzvernetzt mit 7 mg/ml HA-Aldehyd (entschützte Hydrazido-Dimethylacetal-HA, zu 40-45% modifiziert) in Ratten. Die Hydrogele enthielten zudem 1 mg/ml vorfibrilliertes intaktes Kollagen Typ I, 200 μg/ml BMP-2 und 500 ng/ml IGF-1, um Knochenbildung zu induzieren. Gewebeproben wurden 10 Tage nach der Implantierung entnommen, in Formalin fixiert und für die Histologie durch Paraffineinbettung weiterbearbeitet. Schnitte wurden mit Hämatoxylin/Eosin gefärbt. m, Matrixmaterial (beachte: das Matrixmaterial schrumpft während der Dehydrierung); s, Haut (zeigt die Orientierung des Implantats an).
7 zeigt eine in vivo-Beurteilung von mit verschiedenen NHS-Estern kreuzvernetzten HA-Hydrogelen. Subkutane Implantierung von HA-Hydrogelen bestehend aus (7A) 12 mg/ml hochgradig modifiziertem (∼65-70%) HA-Amin (Adipinsäure Dihydrazido-HA) kreuzvernetzt mit 15 mg/ml (SPA)2-PEG, (7B) 12 mg/ml optimal modifiziertem (∼20-25%) HA-Amin (Adipinsäure Dihydrazido-HA) kreuzvernetzt mit 15 mg/ml SPA₂-PEG, oder (7C) 12 mg/ml des gleichen optimal modifizierten HA-Amins kreuzvernetzt mit 3 mg/ml DTSSP (die Konzentrationen der Kreuzvernetzungsmittel sind auf einer molaren Basis gleich) in Ratten. Die Hydrogele enthielten zudem 1 mg/ml vorfibrillisiertes intaktes Kollagen Typ I, 200 μg/ml BMP-2 und 50 ng/ml TGF-β2, um Knochenbildung zu induzieren. Gewebsproben wurden 10 Tage nach der Implantierung entnommen, in Formalin fixiert und für die Histologie durch Paraffineinbettung weiterbearbeitet. Schnitte wurden mit Hämatoxylin/Eosin gefärbt. m, Matrixmaterial (beachte: das Matrixmaterial schrumpft während der Dehydrierung); s, Haut (zeigt die Orientierung des Implantats an).
8 zeigt die unterschiedliche Wirkung von in HA-Hydrogelen enthaltenen Wachstumsfaktoren auf die Gewebstransformation. Subkutane Implantierung des aus 12 mg/ml optimal modifizierten (∼20-25%) HA-Amins (Adipinsäure Dihydrazido-HA) kreuzvernetzt mit 15 mg/ml (SPA)2-PEG gebildeten Hydrogels in Ratten. Die Hydrogele enthielten zudem 1 mg/ml vorfibrillisiertes intaktes Kollagen Typ I und wurden entweder mit 200 μg/ml BMP-2 und 500 ng/ml IGF-1 (8A) oder 200 μg/ml BMP-2 und 50 ng/ml TGF-β2 (8B) ergänzt. Gewebsproben wurden 10 Tage nach der Implantierung entnommen, in Formalin fixiert und für die Histologie durch Paraffineinbettung weiterbearbeitet. Schnitte wurden mit Hämatoxylin/Eosin gefärbt.
KURZE BESCHREIBUNG DER REAKTIONSSCHEMATA
Schema 1 stellt die Periodatoxidation von Hyaluronsäure dar.
Schema 2 stellt das Koppeln von Aminen an Hyaluronsäure mit EDC über ein aktives Triazolester-Zwischenprodukt dar.
Schema 3 stellt das Koppeln von Aminen an Hyaluronsäure mit EDC über ein aktives N-Hydroxysuccinimidester-Zwischenprodukt dar.
Schema 4 stellt die Kreuzvernetzung von Amin-funktionalisierter Hyaluronsäure mit verschiedenen bifunktionellen N-Hydroxysuccinimidester-Kreuzvernetzungsmitteln zum Bilden von Hydrogelen dar. (1. (SPA)₂-PEG; 2. DTSSP).
Schema 5 stellt die Kreuzvernetzung von Amin-funktionalisierter Hyaluronsäure mit Glutaraldehyd zum Bilden von Hydrogelen dar. Zusätzlich zur herkömmlichen Umsetzung von Aldehyden mit Aminen, die zur Bildung einer Schiff'schen Base führt, ist auch bekannt, dass Glutaraldehyd einer Polymerisierung durch Aldolkondensation unterzogen wird, die Polymere mit α,β-ungesättigten Aldehyden bei neutralem oder leicht alkalischem pH hervorbringt (Richards und Knowles, J. Mol. Biol. 37, 231-233 (1968)). Nachfolgend bildet nukleophile Addition von Aminen an die Ethylenyl-Doppelbindung eine stabile Kreuzvernetzung.
Schema 6 stellt das Bilden von Hydrogelen mit Aldehydfunktionalisierter Hyaluronsäure dar. (1. Amin-funktionalisierte HA; 2. Bifunktionelles Amin).
Schema 1
Schema 2
Schema 3
Schema 4
Schema 5
Schema 6
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER EFFINDUNG
Unter Verwendung der Verfahren unserer Erfindung erzeugen wir eine aktivierte Form der HA, die sich minimal von natürlicherweise vorkommender HA unterscheidet, um ihre einzigartigen physiochemischen Eigenschaften zu erhalten. Wir bewirken auch eine minimale Veränderung, die nur eine verhältnismäßig kleine Anzahl von Disaccharideinheiten der natürlicherweise vorkommenden HA betrifft, so dass wir ihre Fähigkeit, als ein Zellsubstrat zu dienen, nicht verändern.
Anfänglich versuchten wir, ein Aldehyd-Derivat der HA durch Reduzierung der Carboxylgruppen der Glucuronsäure-Reste in Aldehyde durch Verwendung von 9-Borbicyclo-3,3-nonan zu erzeugen, einem Verfahren, das direkte Umwandlung der Carboxylsäure in das Aldehyd erlaubt (Cha et al., Bull Korean Chem. Soc. 9, 48-52 (1988), Cha et al., Orq. Prep. Proc. Int. 21, 451-477 (1989))

1) HA-COOH (I) → HA-CHO (II)

Obwohl vorbereitendes Testen die Umwandlung der Carboxylgruppen in Aldehyde bis zu einem Grad von ungefähr 5-10% anzeigte (1), erzeugten Mischungen von konzentrierten, viskosen HA=Aldehydlösungen (∼10 mg/ml) mit "kleinen" Polyaminen wie beispielsweise Putrescin, Lysin, Polylysin, Histidin oder Polyhistidin jedoch in einem vertretbaren Zeitrahmen keine stabilen Gele, um für in situ-Polymerisierung geeignet zu sein. Es ist wichtig, zur Kenntnis zu nehmen, dass die chemischen Eigenschaften der HA nicht lediglich durch ihre funktionellen Gruppen per se bestimmt werden, sondern auch durch die Zugänglichkeit dieser funktionellen Gruppen der HA in einer wässrigen Umgebung, die in Beziehung steht zu der konformationellen Gesamtstruktur und den rheologischen Eigenschaften der HA. HA benimmt sich sogar in Abwesenheit von Kreuzverknüpfungen in einem wässrigen Medium wie ein Hydrogel, da sie ein durch Wasserstoffbindungen und van der Waals-Kräfte stabilisiertes Netzwerk bildet (Laurent und Fraser, loc. cit.). Um die Zugänglichkeit von funktionellen Gruppen zu erhöhen, haben wir Spacer zwischen die funktionelle Gruppe und die HA-Kette eingeführt.
Einführung einer funktionalisierten Seitenkette an HA
Wir haben anschließend Methodik zum Einführen von Seitenketten in HA durch Carbodiimid-vermitteltes Koppeln von primären oder sekundären Aminen an die Carboxylgruppe des Glucuronsäure-Restes durch Verwendung eines aktiven Ester-Zwischenproduktes entwickelt. Wir haben diese Methodik verwendet, um HA mit verschiedenen terminalen funktionellen Gruppen zur Kreuzvernetzung einschließlich Acetale, Aldehyde, Amine und Hydrazide zu erzeugen. Eine große Auswahl an funktionalisierten Aminen ist käuflich erhältlich, was es uns ermöglicht, eine große Vielzahl von verschiedenen funktionellen Gruppen einzuführen, die geeignet sind, bei physiologischen Bedingungen unter Verwendung dieser Methodik kreuzzuvernetzen, einschließlich Maleimiden, die mit Sulfhydrylen oder Arylaziden zum photokreuzvernetzen spezifisch reagieren, neben den unten beschriebenen Aminen und Aldehyden.
Direktes Carbodiimid-vermitteltes Koppeln von Aminen an die Carboxylgruppe von HA in einer wässrigen Umgebung z.B. mit EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimid), bringt nicht das vorhergesagte Produkt hervor, da der O-Acylisoharnstoff, der als ein reaktives Zwischenprodukt gebildet wird, sich schnell in einen stabilen N-Acylharnstoff umlagert (Kuo et al., loc. cit.). Wir zeigen, dass durch "Retten" des aktiven O-Acylisoharnstoffs mittels Bildung eines Hydrolyseresistenteren und nicht-umlagerbaren aktiven Ester-Zwischenprodukts die Kopplung von primären Aminen an HA möglich ist. Eine große Vielzahl von aktiven carboxylischen Estern existiert und kann für die weitere Umsetzung gebildet werden, einschließlich NHS-Estern, Nitrophenolestern, Triazolestern, sulfonischen Estern etc., solange das Reagens für ihre Herstellung in H₂O oder in anderen polaren Lösungsmitteln wie z.B. Dimethylsulfoxid oder Dimethylformamid löslich ist. HA ist in Wasser oder anderen aprotischen, polaren Lösungsmitteln in der nativen Form und wenn es als ein Natriumsalz hergestellt wurde bzw. wenn es als ein Tetrabutylammoniumsalz, wie in dem US-Patent Nr. 4957744 beschrieben, hergestellt wurde, löslich. Wir haben aktive Ester von HA mit 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) oder N-Hydroxysulfo-succinimid durch Verwendung des H₂O-löslichen Carbodiimids EDC für das Koppeln gebildet. Nukleophile Addition an den aus HOBT gebildeten Ester verlangt, dass das Amin. in unprotonierter Form bei saurem pH (ungefähr 5,5 bis 7,0) angeboten wird. Nur eine beschränkte Anzahl von Aminen, einschließlich Hydrazinen und aktivierten Aminen, z.B. Ethylendiamin, haben pKa-Werte in einem geeigneten Bereich und sind folglich unprotoniert und mit dem mit HOBT gebildetem Ester-Zwischenprodukt reaktiv (Schema 2). Einfache primäre Amine, z.B. Putrescin, die typischerweise pKa-Werte >9 haben, bilden unter sauren Kopplungsbedingungen keine signifikanten Mengen das Addukts. Das aus N-Hydroxysulfosuccinimidabgeleitete Zwischenprodukt erlaubt es der Kopplungsreaktion, bei neutralem pH (ungefähr 7,0 bis 8,5) durchgeführt zu werden, und bringt folglich Produkte durch Umsetzen mit einfachen primären Aminen hervor (Schema 3).
Diese Methodik erlaubt folglich, dass die folgenden Umsetzungen durchgeführt werden können. HA-COOH (I) + H₂N-R (III) → HA-CO-NH-R (IV) HA-COOH (I) + R'-NH-R (V) → HA-CO-NR'-R (VI), wobei R und R' Alkyl-, Aryl-, Alkylaryl- oder Arylalkyl-Seitenketten sind, die Heteroatome wie z.B. Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel enthalten können. Die Seitenketten können verzweigt oder unverzweigt sein, und können gesättigt sein oder können eine oder mehrere Mehrfachbindung(en) enthalten. Die Kohlenstoffatome der Seitenkette können ununterbrochen sein oder können durch eine oder mehrere funktionelle Gruppen wie z.B. einem Sauerstoffatom, einer Ketogruppe, einer Aminogruppe und Oxycarbonylgruppe etc. getrennt sein. Die Seitenkette kann mit Arylresten oder Halogenatomen substituiert sein, oder kann als Ganzes oder teilweise durch Ringstrukturen wie z.B. Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl etc. gebildet sein. Die Seitenkette kann eine terminale funktionelle Gruppe zur Kreuzvernetzung wie beispielsweise Aldehyd, Amin, Arylazid, Hydrazid, Maleimid, Sulfhydryl etc. aufweisen. Die Sei tenkette kann ein bioaktives Peptid sein, z.B. Rezeptorbindungsstehlen oder Stellen zur proteolytischen Spaltung enthalten.
Terminale funktionelle Gruppen der Seitenkette, die nützlich zur Kreuzvernetzung von HA unter physiologischen Bedingungen sind, können aus der folgenden Liste ausgewählt werden:

1. Aldehyde, siehe Beispiele H₂N-R-CHO (VII)
2. Amine, siehe Beispiele H₂N-R-NH₂ (VIII)
3. Arylazide, z.B. 4-(p-Azidosalicylamido)butylamin
4. Maleimide, z.B. 4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylhydrazid
5. Sulfhydryle, z.B. S-Methylsulfidcystein H₂N-R-SH (XI)
6. Peptide, z.B. H₂N-APQQEA, das Substratstellen für enzymatisches Kreuzvernetzung, z.B. durch Transglutaminasen, umfasst (Parameswaran et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 8472-8475 (1990); Hohenadl et al., J. Biol. Chem. 270, 23415-23420 (1995)).

Die bei dieser Umsetzung nützlichen Carbodiimide können durch die folgende Formel dargestellt werden: R-N=C=N-R' (XII),wobei R und R' Seitenketten mit variabler Struktur wie oben im Detail beschrieben umfassen. Carbodiimide, die in einem wässrigen Medium löslich sind, sind bevorzugt.
Der aktive Ester kann aus der folgenden Klasse stammen und durch Carbodiimid-vermitteltes Kuppeln einer Verbindung zur Herstellung dieser aktiven Ester, die dem Fachmann bekannt sind, gebildet werden:

1. Triazolester, z.B. 1-Hydroxybenzotriazol
2. NHS-Ester, z.B. N-Hydroxysulfosuccinimid
3. Nitrophenolester, z.B. p-Nitrophenol

Herstellung von HA-Aldehydderivaten
Eine- Seitenkette, die ein geschütztes Aldehyd in Form eines Acetals enthält, wurde wie folgt hergestellt. N-(2,2-Dimethoxyethyl)-4-(methoxycarbonyl)butanamid wurde aus Aminoacetaldehyd-dimethylcetal und Mono-methylsuccinat durch Verwenden von EDC-Koppeln erhalten. Eine Aminogruppe für das Koppeln an HA wurde nachfolgend durch Umsetzen des Produkts mit Hydrazin erhalten, welche die gewünschte Seitenkette N-(2,2-Dimethoxyethyl)-4-(hydrazido)butanamid mit dem geschützten Aldehyd ergab.
Die Seitenkette wurde durch Verwenden von HOBT und EDC an HA gekoppelt (Schema 2). Eine acetalische Seitenkette, 1-Aminoethyl-dimethylacetal, mit einem einfachen primären Amin wurde durch Verwenden von N-Hydroxysuccinimid und EDC an HA konjugiert (Schema 3). Die HA-Derivate wurden durch Ethanolfällung auf gereinigt. Die Art der HA-Derivate wurde durch ¹H-NMR bestätigt (2). Die HA-Acetalderivate werden durch milde Säurebehandlung einfach zu den reaktiven Aldehyden aktiviert. Andere HA-Aldehydderivate mit Veränderungen in der Länge der Seitenkette wurden in einer ähnlichen Weise hergestellt. Siehe Beispiele 1-3.
Herstellung von HA-Aminderivaten
Diaminoethan, Lysinmethylester, Histidin und Adipinsäure, Bernsteinsäure oder Suberinsäure Dihydrazid wurden durch Verwenden von HOBT und EDC (bis zu 5-facher Überschuss abhängig von dem gewünschten Grad der Modifizierung) und Einstellen des pH auf ∼6,5 durch wiederholte Zugabe von 0,1 M HCl während der Reaktion an HA gekoppelt (Schema 2). HA-Derivate wurden auch in einer ähnlichen Weise durch Verwendung von N-Hydroxy-sulfosuccinimid und primären Aminen hergestellt, die unkonjugierte Aminogruppen mit einen höheren pKa (> 9) enthielten, wie beispielsweise 1,4-Diaminobutan oder 1,6-Diaminohexan (Schema 3).
Die HA-Derivate wurden durch wiederholte Ethanolfällung oder durch umfassende Dialyse aufgereinigt und die Art der HA-Derivate durch ¹H-NMR bestätigt (3). Der Grad der Modifizierung wurde aus den NMR-Daten berechnet und als größer 70% bestimmt. Die Reaktionsbedingungen wurden nachfolgend angepasst, so dass ein Modifizierungsgrad von ungefähr 20% erreicht wurde. Begrenzen der Menge des Carbodiimids erwies sich als am erfolgreichsten beim Kontrollieren des Modifizierungsgrades. Ein Modifizierungsgrad von 10-25% ergab effiziente Kreuzvernetzung sowie ein Molekül, das immer noch durch Glykosidasen und HA-Rezeptoren als HA erkannt würde, und dadurch Erkennen und Verarbeiten des Materials durch Zellen ermöglicht (siehe unten). Ähnliche HA-Derivate wurden durch Verwenden von Adipinsäure, Bernsteinsäure oder Suberinsäure Dihydrazid oder Diaminoethan, -butan oder -hexan synthetisiert, um den Einfluss der Länge des Spacers, der die eingeführte funktionelle Gruppe von der HA-Kette trennt, auf die nachfolgende Kreuzvernetzung zu studieren. Siehe Beispiele 4-8.
Kreuzvernetzte HA-Hydrogele
Die funktionalisierten HA-Moleküle können durch Umsetzen von HA-Derivaten mit verschiedenen Funktionalitäten oder durch Verwenden von homo- oder heterobifunktionellen Kreuzvernetzungsmitteln, die in einer großen Vielfalt erhältlich sind, kreuzvernetzt werden. Die folgenden grundlegenden Reaktionsschemata sind für die Kreuzvernetzung der beschriebenen Formen von modifizierter HA geeignet (siehe Beispiele 9-12):

1. Aldehyd-vermittelte Kreuzvernetzung
2. Durch einen aktiven Ester vermittelte Kreuzvernetzung
3. Maleimid-vermittelte Kreuzvernetzung
4. Photo-Kreuzvernetzung
5. Enzymatische Kreuzvernetzung (Transglutaminase) R₁-(CH)₂-CONH₂ + H₂N-R₂ → R₁-(CH)₂-CO-NH-R₂

Kreuzvernetzung der HA-Aminoderivate (Mr ∼10⁶) mit bifunktionellen aktiven Estern, z.B. Polyethylenglykol-bis-succinimidyl-propionat [(SPA)₂-PEG] und reduzierbares 3,3'-Dithio-bis(sulfo-succinimydyl-propionat) (DTSSP) (Schema 4), oder bifunktionellen Aldehyden, z.B. Glutaraldehyd (Schema 5), er zeugte hervorragende Hydrogele. Stabile Gele könnten durch Kreuzvernetzung von 5 bis 25 mg/ml HA-Derivat mit >0,05 mM Aldehyd oder >0,2 mM aktivem Ester gebildet werden (Zahlen spiegeln die Konzentrationen der funktionellen Gruppen wieder). Optimale Gele werden durch Kreuzvernetzung von 10-15 mg/ml HA-Derivat, das zu einem Grad von ungefähr 10-25 % modifiziert ist, mit ungefähr 0,2 mM Aldehyd oder 0,6 mM aktivem Ester erzeugt. Ebenso erzeugte Kreuzvernetzung der HA-Aldehydderivate (Mr ∼10⁶) (optimal ungefähr 10-15 mg/ml) mit bifunktionellen Aminen (optimal ungefähr 0,2 mM) hervorragende Gele (Schema 6). Konjugierte Amine wie beispielsweise Dihydrazide oder Benzylamine werden in diesem Fall für die in situ-Polymerisierung von HA benötigt, um das unstabile Schiff'sche Base-Produkt, das durch Umsetzen eines Aldehyds mit einem primären Amin gebildet wurde, hinsichtlich der Resonanz zu stabilisieren(„resonance stabilize) (d.h. Hydrazine bringen eine stabilere Hydrazonverknüpfung hervor). Hydrogele wurden auch aus einer äquimolaren Mischung von HA-Aldehydderivaten und den verschiedenen HA-Aminderivaten gebildet (Schema 6). Optimale Gele wurden mit ∼15 mg/ml der HA-Derivate gebildet. Bei der optimalen Konzentration von HA und dem Kreuzvernetzungsmittel tritt ein Gelieren typischerweise innerhalb von ca. 30 Sek. bis 5 Min. ein, was geeignet für in situ-Polymerisierung ist. Die kreuzvernetzten HA-Hydrogele sind gegenüber Glykosidasen, d.h. testikulärer Hyaluronidase, empfindlich, was andeutet, dass sie bioabbaubar sind (4).
Eine Anzahl von verschiedenen Tests einschließlich Zellkulturtests und Tierexperimenten diente dazu, die Bioverträglichkeit der formulierten Biomaterialien abzuschätzen. Einbetten von Chondrozyten in die polymerisierenden HA-Hydrogele zeigte, dass weder Aldehyd- noch NHS-Ester-vermitteltes Kreuzvernetzung bei den eingesetzten Konzentrationen für Zellen toxisch war. Aussäen von Zellen auf die Oberfläche von vorpolymerisierten HA-Hydrogelen zeigte eine große Vielfalt an zellu lärem Verhalten in Abhängigkeit von der Art des Kreuzvernetzungsmittels und der Kreuzvernetzungsdichte (5). Hochgradig kreuzvernetzte HA-Hydrogele waren für Zellen undurchdringbar (5, A und B), während optimal kreuzvernetzte Gele infiltriert wurden (5C). Ein Ergänzen der HA-Hydrogele mit Zelladhäsionsmolekülen wie beispielsweise Fibronektin (im Bereich von 0,1 bis 1 ng/ml) induzierte Adhäsion und Ausbreiten von Zellen auf dem Material unabhängig von der Art des Kreuzvernetzungsmittels und der Kreuzvernetzungsdichte, veränderte aber nicht die Ergebnisse hinsichtlich der Zellinfiltration, was zeigt, dass das Fehlen einer Infiltration an der hohen Kreuzvernetzungsdichte und nicht an der Abwesenheit von Zell-Matrix-Interaktionen liegt. Siehe unten und 7.
Subkutane Implantierung von Biomaterialien in Ratten ist das etablierte Modell zur Evaluierung der Bioverträglichkeit von Biomaterialien (Laurencin et al., J. Biomed. Mat. Res. 24, 1463-1481 (1990)) und zur Induzierung von ektopischer Knochenbildung durch Mitglieder der TGF-β-Genfamilie und im Besonderen durch "bone morphogenetic proteins" (BMP) (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 2220-2224 (1990); Sampath et al., J. Biol. Chem. 267, 20352-20362 (1992)). Unter Berücksichtigung der Zellkulturergebnisse haben wir eine Anzahl von HA-Hydrogelen zum Testen der in vivo-Bioverträglichkeit in diesem Modell formuliert. Subkutanes Implantieren von vorpolymerisierten HA-Hydrogelscheiben, die mit rekombinantem BMP-2 und IGF-1 oder TGF-β2 beladen waren, in Ratten, zeigte eine milde Fibrose mit einem variierenden Grad von Knorpel- und Knochenbildung abhängig von der Art des HA-Biomaterials (6 und 7). Die Wachstumsfaktoren wurden mit den HA-Derivaten vor dem Gelieren vermischt und die Induzierung von Knochenbildung legt nahe, dass kein für die HA-Kreuzvernetzung benutzter Reaktionsmechanismus (Aldehyd- oder durch aktiven Ester-vermittelte Umsetzungen) die biologische Aktivität der Wachstumsfaktoren signifikant beeinflusste. Geringfügige Entzündung wurde bei mit aktivem Ester kreuzvernetzten HA-Aminderivaten beobachtet (7) oder mit HA-Aminderivaten, die mit verschiedenen HA-Aldehydderivaten kreuzvernetzt waren (6B–6D), während eine Stimulierung von Fremdkörperriesenzellen („foreign body giant cells") gesehen wurde, wenn die gleichen HA-Aminderivate mit Glutaraldehyd kreuzvernetzt wurden (6A). Der Modifizierungsgrad von RA (HA) beeinflusst die Resorbierung und die Transformationsrate des Biomaterials erheblich (7A, 7B). Dennoch wurde eine eingeschränkte Knochenbildung sogar mit einem aus hochgradig modifizierten (65-70 %) HA-Aminderivate gebildeten Biomaterial beobachtet (7A). Das Fehlen einer Knochenbildung bei einem kleineren, bifunktionellen NHS-Ester-Kreuzvernetzungsmittel deutet an, dass die Größe der gebildeten Kreuzbrücke entscheidend ist für die Resorbierung und die zelluläre Infiltration (7C). Dies liegt vermutlich an dem Unterschied in der Porengröße des Materials, das mit Kreuzvernetzungsmitteln unterschiedlicher Größen gebildet wurde. Die Infiltration und die Transformationsrate war mit BMP-2/IGF-1- und mit BMP-2/TGF-β-2-beladenen Biomaterialien ähnlich, was darauf hindeutet, dass die Resorbierungsrate eine Materialeigenschaft ist. Dennoch war 10 Tage nach Implantierung das neu gebildete Gewebe größtenteils Knorpel bei der ersten Gruppe, und größtenteils Knochen bei der zweiten Gruppe (8), was den angiogenen Einfluss von TGF-β2 veranschaulicht (Yang und Moses, J: Cell. Biol. 111, 731-741 (1990)). Dies zeigt, dass die biologische Aktivität des HA-Materials durch Einschluss von verschiedenen bioaktiven Faktoren moduliert werden kann. Das Fehlen von signifikanten schädlichen Einflüssen und der Nachweis der gewünschten biologischen Aktivität dieser neuen HA-Biomaterialien in vivo zeigt ihre Nützlichkeit als ein Verabreichungsvehikel für Zellen und Wachstumsfaktoren in dem Bereich der Gewebsregenerierung.
Es gibt verschiedene Ansätze für die Herstellung von HA einschließlich der Extraktion aus Gewebe und der Biosynthese. Bei der Extraktion aus Gewebe werden gewöhnlicherweise frische oder gefrorene Hahnenkämme verwendet (US-Patent Nr. 5336767), obwohl andere Gewebe einschließlich der synovialen Flüssigkeit von Gelenken (Kvam et al., Anal. Biochem. 211, 44-49 (1993)), Gewebe aus der menschlichen Nabelschnur, boviner Glaskörper und bovine Luftröhre verwendet worden sind. Es ist auch möglich, HA durch mikrobiologische Verfahren herzustellen, wie z.B. durch Kultivieren eines zu der Gattung Streptococcus gehörenden Mikroorganismus, der nicht hämolytisch und in der Lage ist, HA in einem Kulturmedium herzustellen (US-Patent Nr. 4897349; 4801539; 4780414; 4517295; 5316936). Das HA-Rohmaterial zum Herstellen der erfindungsgemäßen Zusammensetzung besteht bevorzugt aus hochmolekularem HA, bevorzugter aus einem Molekulargewicht größer als 0,5 Millionen Dalton und noch bevorzugter aus einem Molekulargewicht größer als 1 Million Dalton. Das HA-Rohmaterial für die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen der hier beschriebenen Beispiele wurde von Genzyme Corp. (Cambridge, MA) erhalten und hatte ein Molekulargewicht von größer als 1 Million Dalton. Die Größe der HA war nach der Derivatisierung nicht verändert.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen haben zahlreiche therapeutische Verwendungen. Die Tatsache, dass die Verbindungen in einem chirurgisch praktikablen Zeitraum von 1 bis 5 Minuten in situ mit gleichzeitiger Kreuzvernetzung an die Gewebsoberflächen aushärten, erlaubt die Anwendung als ein Gewebskleber. Viele Situationen bei verschiedenen chirurgischen Anwendungen erfordern solche Haftmittel. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet werden, um Blutungen in der allgemeinen Chirurgie zu stoppen, um Nerven und Gefäße in der wiederherstellenden Neuro- und plastischen Chirurgie wiederherzustellen, und um Haut-, Gefäß- oder Knorpeltransplantate oder -implantate bei der orthopädischen, vaskulären und plastischen Chirurgie zu verankern. Fachmänner können bestimmte Ausführungsformen der Erfindung, die für eine gewünschte Anwendung besonders geeignet sind, auswählen und durch Anpassung verschiedener Faktoren, einschließlich: (1) dem Grad der Funktionalisierung der HA, der die Kreuzvernetzungsdichte des Materials und die Interaktion mit zellulären Proteinen einschließlich Rezeptoren und Glykosidasen beeinflusst; (2) der Konzentration des Kreuzvernetzungsmittels, welche die Kreuzvernetzungsdichte des Materials beeinflusst; (3) der Größe der erzeugten Kreuzbrücke, welche die Porengröße des Materials beeinflusst; (4) der Art des Kreuzvernetzungsmechanismus, welcher die Polymerisierungszeit und die Spezifität der Umsetzung bestimmt; und (5) der Art der Kreuzbrücke, die biologische Signalstoffe („cues") zur Verfügung stellt, gestalten. Für Daten, die HA-Hydrogele mit verschiedenen Kreuzvernetzungsdichten und Porengrößen betreffen, siehe 4, 5 und 7. Im Allgemeinen ist Photo-Kreuzvernetzung und Kreuzvernetzung mit aktivem Ester bevorzugt, um Materialien für Anwendungen zu formen, die schnelles Gelieren und starke Bindung mit Gewebsoberflächen erfordern, wie z.B. Gewebekleber. Materialien mit anti-adhäsiven Eigenschaften, die zum Ausbilden von Gewebstrennungen oder zur Gewebsvermehrung geeignet sind, werden aus hochgradig modifizierten HA-Derivaten mit niedrigmolekularen Kreuzvernetzungsmitteln gebildet, die ein dichtes Material mit sehr kleinen Poren erzeugen, und dadurch die Zelladhäsion und Infiltration minimieren. Umgekehrt werden bioabbaubare Gerüste zur Gewebsreparatur aus HA mit einem eingeschränkten Derivatisierungsgrad und hochmolekularen Kreuzvernetzungsmitteln gebildet, die ein poröses, bioabbaubares Material erzeugen. Die Kreuzbrücke kann sogar biologische Signalstoffe („cues") wie beispielsweise Peptidsequenzen enthalten, welche den Abbau des Materials durch z.B. Proteolyse oder zelluläre Infiltration erleichtern (z.B. die RGD-Sequenz).
Erfindungsgemäße Zusammensetzungen wurden entworfen, um als ein Vehikel für die Gabe von Zellen oder bioaktiven Molekülen wie beispielsweise Wachstumsfaktoren zum Stimulieren der fokalen Reparatur zu dienen. Die kreuzvernetzten HA-Derivate sind poröse Hydrogele, in denen biologisch oder therapeutisch aktive Verbindungen (z.B. Wachstumsfaktoren, Zytokine, Arzneimittel und dergleichen) physikalisch oder chemisch eingebaut werden können. Diese Verbindungen sind dann Gegenstand einer lang andauernden Freisetzung durch chemische, enzymatische und physikalische Erosion des Hydrogels und/oder der kovalenten Verknüpfung zwischen der HA-Kette und der biologisch aktiven Verbindung über einen Zeitraum. Lokale Verabreichung von Wachstumsfaktoren mit einem derartigen Gerüst erleichtert in vielen Situationen die Wundheilung und die Gewebsregeneration. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Verbindungen nicht nur verwendet werden, um, wie oben genauer beschrieben, Knochenbildung zu fördern und Knorpelreparatur in orthopädischen Verfahren zu stimulieren, sondern auch um pathologische Wundzustände wie beispielsweise chronische Entzündungen zu behandeln. Sie können auch als ein Gerüst zum Erzeugen von künstlichen Geweben, z.B. Knorpel (Hauselmann et al., Am. J. Physiol. 271, C742-752 (1996)), durch Proliferierung von autologen Zellen in Kultur dienen. Ähnliche Verfahren zum Generieren von Äquivalenten anderer Geweben oder Organe, einschließlich Haut, Leber und anderer, in Kultur können in der Zukunft entwickelt werden und können in Verbindung mit den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet werden.
Hochgradig kreuzvernetzte Materialien haben eine anti-adhäsive Eigenschaft in Bezug auf Zellen, und solche Zusammensetzungen können verwendet werden, um Gewebstrennunngen zu generieren und um Adhäsionen nach einem chirurgischen Eingriff zu verhindern. Siehe 5A und 7C, die hochgradig modifizierte HA-Amine, d.h. Adipinsäure Dihydrazido-HA, zeigen, die bevorzugt mit niedrigmolekularem bifunktionellen NHS-Ester kreuzvernetzt sind. Die viskoelastischen Eigenschaften von HA machen sie für diesen Zweck besonders gut geeignet, und sie wird klinisch verwendet, um als ein „Gelenkschmierstoff" durch wiederholte intraartikuläre Injektionen temporäre Schmerzerleichterung bei Gelenkserkrankungen zu erreichen, und als schützendes Mittel bei Augenirritationen und in der ophthalmischen Chirurgie. Die Technik der Gewebstrennung wird bei der Gesichtsrekonstruktion in der plastischen Chirurgie und Kieferchirurgie verwendet. Die Vorbeugung der Bildung von Adhäsionen ist besonders relevant bei der wiederherstellenden Chirurgie von Sehnen, bei chirurgischen Verfahren im Urogenitalsystem und in der thorakalen Chirurgie. Viele verschiedene HA-basierende Materialien sind in diesen Bereichen bereits in der klinischen Verwendung (Siehe die von Anika Therapeutics, Inc. (Woburn, MA), Biomatrix, Inc. (Ridgefield, NJ), Genzyme Corp. (Campbridge, MA) und Fidia, S.p.A. (Abano Terme, Italien) hergestellten Produkte). Die Fachmänner können bestimmte, für eine gewünschte Anwendung besonders geeignete Ausführungsformen der Erfindung auswählen und durch Auswählen bestimmter Eigenschaften wie oben angegeben gestalten.
Die injizierbare Beschaffenheit der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen machen sie auch für die Gewebsvermehrung in der plastischen Chirurgie geeignet, wo die HA-Matrix vor allem als ein bioverträgliches Füllmaterial dient, z.B. zum Auffüllen von Hautfalten oder zur Lippenwiederherstellung. Auch hier können die Fachmänner bestimmte, für eine gewünschte Anwendung besonders geeignete Ausführungsformen der Erfindung wie oben angegeben auswählen und gestalten.
Es wurde gezeigt, dass die Halbwertszeit von pharmakologischen Verbindungen, sowohl synthetische als auch biologische, drastisch erhöht ist, wenn sie in einer an HA konjugierten Form verabreicht werden (Larsen und Balazs, Adv. Drug. Delivery Rev. 7, 279-293 (1991); Drobnik, J., Drug Delivery Rev. 7, 295-308 (1991)). Die in dieser Erfindung zur Verfügung gestellten funktionalisierten Formen der HA erlauben eine einfache Substituierung mit pharmakologisch aktiven Wirkstoffen wie z.B. anti-entzündlichen Wirkstoffen, Schmerzmitteln, Steroiden, kardiovaskulären Wirkstoffen, Anti-Tumor-Wirkstoffen, Immunsuppressiva, Sedativa, anti-bakteriellen, anti-fungalen und anti-viralen Wirkstoffen etc., und können für die verzögerte Wirkstofffreisetzung über einen Zeitraum entweder lokal in Form eines Hydrogels oder systemisch in freier Form verwendet werden.
In der orthopädischen Chirurgie finden die erfindungsgemäß funktionalisierten Formen der HA Anwendungen als ein Gewebsklebstoff oder als bioaktives Matrixmaterial bei der Behandlung von chondralen und osteochondralen Frakturen, von Osteochondritis dissecans, Meniskusrissen ebenso wie bei gerissenen Bändern, Sehnen oder Muskelsehnenübergängen. Die erfindungsgemäßen HA-Materialien können zur Erleichterung der Verankerung von chondralen oder osteochondralen Transplantaten oder Implantaten oder anderen biologischen oder künstlichen Implantierungsmaterialien, oder zur Stimulierung der Bildung von neuem Knochen oder Knorpel dienen, indem sie als ein Gerüst für Zellen oder als ein Verabreichungsvehikel für Wachstumsfaktoren dienen. Ein allgemeiner Ansatz zum Fördern der artikulären Knorpelreparatur, der auf den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen basiert, umfasst die Verwendung von: (1) in situ-polymerisiertem HA-Hydrogel als eine Matrix, um den zu reparierenden Defekt auszufüllen und um ein Gerüst für Reparaturzellen bereitzustellen, (2) einem optionalen chemotaktischem Wirkstoff, um Reparaturzellen oder alternativ autologe Chondrozyten oder mesenchymale Stammzellen zu der Matrix und der defekten Stelle zu lenken, (3) einem optionalen Faktor, um die zelluläre Proliferierung von Reparaturzellen in der Matrix und der defekten Stelle zu fördern; (4) verzögerter Freisetzung eines transformierenden Faktors aus dem HA-Hydrogel mit der Zeit, um die Differenzierung der Reparatur zu fördern.
Das Wort "umfassen" oder dessen Abwandlungen wie beispielsweise "umfasst" oder "umfassend" werden überall in der gesamten Beschreibung und den Ansprüche so verstanden, dass sie den Einschluss einer angegebenen Zahl oder einer Gruppe von Zahlen, jedoch nicht den Ausschluss jeder anderen Zahl oder Gruppe von Zahlen bedeuten.
Damit diese Erfindung genauer verstanden wird, werden die folgenden Beispiele dargelegt. Diese Beispiele dienen nur der Veranschaulichung und sind nicht als den Umfang der Erfindung in irgendeiner Weise beschränkend auszulegen.
Beispiel 1
Herstellung von N-(2,2-Dimethoxyethyl)-4-(methoxycarbonyl)butanamid (1) – Zu einer Mischung von Aminoacetaldehyddimethylacetal (2,18 ml, 20 mmol) und einem Methylmonoester der Bernsteinsäure (2,64 g, 20 mmol) in 75 ml Dichlormethan wurde EDC (4,98 g, 0,026 mol) gegeben und die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur für 24 h gerührt. Die Lösung wurde nacheinander mit jeweils 50 ml eiskalter Lösungen von 0,75 M Schwefelsäure, 1 M NaCl, gesättigtem Natriumbikarbonat und 1 M NaCl extrahiert. Die organische Phase wurde gesammelt und mit Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck verdampft, was einen Sirup ergab, der beim Verkohlen auf TLC in Lösungsmittel A (R_f 0,75) und Lösungsmittel B (R_f 0,24) einen einzelnen Punkt zeigte. Der scheinbare Ertrag von 1 betrug 65 %: ¹H-NMR in CDCl₃ δ 5,70 (bs, 1H, NH), 4,34 [t, 1H, CH-(OCH₃), 3,67 (s, 3H, COOCH₃), 3,43-3,35 (s und t, 8H, CH₃OC und CHCH₂NH), 2,38-2,26 (m, 4H, CH₂CO).
Bildung des Acyl-Hydrazids (2) aus 1 – Wasserfreies Hydrazin (248 μl, 7,9 mmol) wurde zu einer Lösung von 1 (1,73 g, 7,9 mmol) in 5 ml wasserfreiem Methanol gegeben. Die Mischung wur de über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und das Lösungsmittel nachfolgend unter reduziertem Druck verdampft, was einen festen Rest ergab. Der Rest wurde in H₂O (6 ml) gelöst und dreimal mit einem gleichen Volumen Dichlormethan extrahiert. Die wässrige Lösung wurde bei reduziertem Druck bis zur Trockenheit verdampft und dann in vacuo über Nacht weiter getrocknet. Der kristalline Feststoff (1,04 g, 82 % Ausbeute) war auf TLC in Lösungsmittel A (R_f 0,10) homogen, wenn er durch Verkohlen sichtbar gemacht wurde. Das ¹H-NMR-Spektrum zeigte beim Vergleich mit 1 den Verlust der Estermethoxygruppe an.
Herstellung von Hydrazido-dimethylacetal-HA (Formel XIX) – Natriumhyaluronat (100 mg, 0,25 mmol) und N-(2,2-Dimethoxyethyl)-4-(hydrazido)butanamid (2) (1,646 g, 7,5 mmol) wurden in H₂O (40 ml, 2,5 mg/ml HA) gelöst. Der pH wurde auf 6,5 eingestellt und HOBT (169 mg, 1,25 mmol), das in einer 1:1-Mischung aus Wasser und DMSO (1 ml) vorgelöst war, und EDC (240 mg, 1,25 mmol) wurden zugegeben und die Reaktionsmischung über Nacht gerührt. Der pH wurde anschließend mit 1 M NaOH auf 7,0 eingestellt und NaCl zugegeben, um eine 5% w/v-Lösung herzustellen. Die HA wurde durch Zugabe von 3 Volumenäquivalenten Ethanol ausgefällt. Das Präzipitat wurde mit einer Konzentration von ungefähr 5 mg/ml in H₂O rückgelöst und die Fällung zweimal wiederholt. Das gereinigte Produkt wurde gefriergetrocknet und bei 4°C unter N₂ gehalten. Siehe 2B für die NMR-Daten des Produktes.
Beispiel 2
Herstellung von Aminoacetaldehyd-dimethylacetal-HA (Formel XX) – Natriumhyaluronat (100 mg, 0,25 mmol) und 2,2-Dimethoxyethylamin, (0,788 g, 7,5 mmol) wurden in H₂O (40 ml, 2,5 mg/ml HA) gelöst. Der pH wurde auf 7,5 eingestellt und NHS.SO₃Na (268 mg, 1,25 mmol) und EDC (240 mg, 1,25 mmol) wurden zugegeben und die Reaktionsmischung über Nacht gerührt. Der pH wurde anschließend mit 1 M NaOH auf 7,0 eingestellt und NaCl zugegeben, um eine 5 % w/v-Lösung herzustellen. Die HA wurde durch Zugabe von 3 Volumenäquivalenten Ethanol ausgefällt. Das Präzipitat wurde mit einer Konzentration von ungefähr 5 mg/ml in H₂O rückgelöst und die Fällung zweimal wiederholt. Das gereinigte Produkt wurde gefriergetrocknet und bei 4 C unter N₂ gehalten.
Beispiel 3
Entschützung von HA-Acetalen zum Bilden von HA-Aldehyden – Die acetalmodifizierte HA (Formel XXI) wurde bis zu einer Konzentration von 5-10 mg/ml in H₂O gelöst und 1 M HCl wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,025 M zugegeben. Die Lösung durfte dann für 0,5 bis 1,0 h bei Raumtemperatur stehen. Die Lösung wurde durch die Zugabe von 1 M NaOH₂ neutralisiert, was das entschützte HA-Aldehyd (Formel XXII) hervorbrachte. HA-CO-R-CH(OCH₃)₂ (XXI) → HA-CO-R-CHO (XXII)
Beispiel 4
Herstellung von Diaminoethan-HA (Formel XXII) – Natriumhyaluronat (100 mg, 0,25 mmol) und 1,2-Diaminoethan-HCl (0,998 g, 7,5 mmol) wurden in H₂O (40 ml, 1,5 mg/ml HA) gelöst. Der pH wurde auf 6,5 eingestellt und HOBT (169 mg, 1,25 mmol), das in einer 1:1-Mischung aus Wasser und DMSO (1 ml) vorgelöst war, und EDC (240 mg, 1,25 mmol) wurden zugegeben und die Reaktionsmischung über Nacht gerührt. Der pH wurde anschließend mit 1 M NaOH auf 7,5 eingestellt und NaCl zugegeben, um eine 5 w/v-Lösung herzustellen. Die HA wurde durch Zugabe von drei Volumenäquivalenten Ethanol ausgefällt. Das Präzipitat wurde mit einer Konzentration von ungefähr 5 mg/ml in H₂O rückgelöst und die Fällung zweimal wiederholt. Das aufgereinigte Produkt wurde gefriergetrocknet und bei 4°C unter N₂ gehalten.
Beispiel 5
Herstellung von L-Lysinmethylester-HA (Formel XXIV) – Natriumhyaluronat (100 mg, 0,25 mmol) und L-Lysinmethylesterdihydrochlorid (1,748 g, 7,5 mmol) wurden in H₂O (40 ml, 2,5 mg/ml HA) gelöst. Der pH wurde auf 6,5 eingestellt und HOBT (169 mg, 1,25 mmol), das in einer 1:1-Mischung aus Wasser und DMSO (1 ml) vorgelöst war, und EDC (240 mg, 1,25 mmol) wurden zugegeben und die Reaktionsmischung über Nacht gerührt. Der pH wurde anschließend mit 1 M NaOH auf 7,0 eingestellt und NaCl zugegeben, um eine 5 % w/v-Lösung herzustellen. Die HA wurde durch Zugabe von 3 Volumenäquivalenten Ethanol ausgefällt. Das Präzipitat wurde mit einer Konzentration von ungefähr 5 mg/ml in H₂O rückgelöst und die Fällung zweimal wiederholt. Das aufgereinigte Produkt wurde gefriergetrocknet und bei 4°C unter N₂ gehalten. Siehe 3C für die NMR-Daten des Produktes.
Beispiel 6
Herstellung der L-Histidinmethylester-HA (Formel XXV) – Natriumhyaluronat (100 mg, 0,25 mol) und L-Hisitidinmethylesterdihydrochlorid (1,825 g, 7,5 mmol) wurden in H₂O (40 ml, 2,5 mg/ml HA) gelöst. Der pH wurde auf 6,5 eingestellt und HOBT (169 mg, 1,25 mmol), das in einer 1:1-Mischung aus H₂O und DMSO (1 ml) vorgelöst war, und EDC (240 mg, 1,25 mmol) wurden zugegeben und die Reaktionsmischung über Nacht gerührt. Der pH wurde anschließend mit 1 M NaOH auf 7,0 eingestellt und NaCl zugegeben, um eine 5 % w/v-Lösung herzustellen. Die HA wurde durch Zugabe von 3 Volumenäquivalenten Ethanol ausgefällt. Das Präzipitat wurde mit einer Konzentration von ungefähr 5 mg/ml in H₂O rückgelöst und die Fällung zweimal wiederholt. Das aufgereinigte Produkt wurde gefriergetrocknet und bei 4 C unter N_2g gehalten. Siehe 3B für die NMR-Daten des Produktes.
Beispiel 7
Herstellung von Hydrazido-HA (Formel XXV) – Natriumhyaluronat (100 mg, 0,25 mg) und Dihydrazid, d.h. Adipinsäure Dihydrazid (1,31 g, 7,5 mmol) wurden in H2O (40 ml, 2,5 mg/ml HA) gelöst. Der pH wurde auf 6,5 eingestellt und HOBT (169 mg, 1,25 mmol), das in einer 1:1-Mischung aus Wasser und DMSO (1 ml) vorgelöst war, und EDC (240 mg, 1,25 mmol) wurden zugegeben und die Reaktionsmischung über Nacht gerührt. Der pH wurde anschließend mit 1 M NaOH auf 7,0 eingestellt und NaCl zugegeben, um eine 5 % w/v-Lösung herzustellen. Die HA wurde durch Zugabe von 3 Volumenäquivalenten Ethanol ausgefällt. Das Präzipitat wurde mit einer Konzentration von ungefähr 5 mg/ml in H₂O rückgelöst und die Fällung zweimal wiederholt. Das aufgereinigte Produkt wurde gefriergetrocknet und bei 4°C unter N₂ gehalten. Siehe 3D für die NMR-Daten des Produktes.
Beispiel 8
Herstellung von Diaminoalkyl-HA (Formel XXVII) – Natriumhyaluronat (100 mg, 0,25 mmol) und ein Diaminoalkan, d.h. 1,2-Diaminobutan-HCl (1,208 g, 7,5 mmol) wurden in H₂O (40 ml, 2,5 mg/ml HA) gelöst. Der pH wurde auf 7,5 eingestellt und NHS. SO₃Na (268 mg, 1,25 mmol) und EDC (240 mg, 1,25 mmol) wurden zugegeben und die Reaktionsmischung über Nacht gerührt. Der pH wurde anschließend mit 1 M NaOH auf 7,0 eingestellt und NaCl zugegeben, um eine 5 % w/v-Lösung herzustellen. Die HA wurde durch Zugabe von 3 Volumenäquivalenten Ethanol gefällt. Das Präzipitat wurde mit einer Konzentration von ungefähr 5 mg/ml in H₂O rückgelöst und die Fällung zweimal wiederholt. Das aufgereinigte Produkt wurde gefriergetrocknet und bei 4°C unter N₂ gehalten. Siehe 3A für die NMR-Daten des Produktes.
Beispiel 9
Bilden von kreuzvernetzten HA-Hydrogelen – Das allgemeine Verfahren zum Formen von kreuzvernetzten HA-Hydrogelen ist wie folgt: Modifizierte HA wird durch Schütteln in H₂O oder Phosphat-gepufferter Salzlösung (pH 7,4-8,5) mit einer Konzentration von 5-25 mg/ml gelöst. Der Modifizierungsgrad des HA-Derivats wird durch Integration der ¹H-NMR-Peaks abgeleitet. Nach vollständiger Lösung wird die HA-Derivatlösung in eine 1 ml-Spritze überführt. Wenn die HA-Derivate mit niedrigmolekularer Kreuzvernetzung umgesetzt werden, wird ein leichter Überschuss der Verbindung (ungefähr 1,1 molare Äquivalente der funktionellen Gruppen) in einer zweiten 1 ml-Spritze in 1/10 des Volumens des HA-Derivats unmittelbar vor dem Benutzen gelöst. Die Spritzen werden verbunden, wobei dem Ausschluss von Luft besondere Beachtung geschenkt wird, die Inhalte werden schnell vermischt, üblicherweise durch 20 Passagen und dann herausgepresst. Wenn HA-Derivatmoleküle mit unterschiedlichen Funktionalitäten miteinander umgesetzt werden, werden 0,5 bis 1,0 Äquivalente des HA-Aldehyds, abhängig von dem Modifizierungsgrad der HA-Derivate, mit dem Äquivalent von HA-Hydrazin gemischt. Bei Raumtemperatur erfolgt das Gelieren abhängig von der Formulierung innerhalb von ungefähr 30 Sekunden bis zu mehreren Minuten, und die Geleigenschaften verändern sich nach ungefähr 5 Minuten nicht mehr wesentlich.
Beispiel 10
Verdauen von kreuzvernetzten HA-Hydrogelen mit Hyaluronidase – Das allgemeine Verfahren zum Verdauen von kreuzvernetzten HA-Hydrogelen ist wie folgt: HA-Hydrogele werden in 1 ml-Spritzen durch Kreuzvernetzung von 12 mg/ml HA-Amin in Phosphat-gepufferter Salzlösung mit verschiedenen Kreuzvernetzungsmitteln wie in 4 angegeben gebildet. Das Gelieren kann für 1 Stunde bei 35°C erfolgen, damit die Umsetzung abgeschlossen ist, bevor identische zylindrische Gele von 100 μl durch Zerschneiden der Spritzen mit einer Rasierklinge gebildet werden. Die Gele werden mit verschiedenen Konzentrationen boviner testikulärer Hyaluronidase (Sigma) 50-5000 U/ml in 400 μl 30 mM Zitronensäure, 150 mM Na₂HPO₄, pH 6,3, 150 mM NaCl für die angegebene Zeit von 0 bis 48 Stunden inkubiert. Der Abbau der Gele wurde aus der Freisetzung von Glucuronsäure in den Überstand bestimmt, die durch Anwendung des Carbazol-Verfahrens (Bitter und Muir, loc. cit.) gemessen wurde.
Beispiel 11
Kreuzvernetzte HA-Hydrogele als eine Matrix für die Zellkultur – Chondrozyten wurden aus bovinem Nasenknorpel nach etabliertem Verfahren (Häuselmann et al., Matrix 12, 116-129 (1992); Küttner et al., J. Cell. Biol. 93, 743-750 (1982)) isoliert, in Ham's F12-Medium, das 5 % fötales bovines Serum und Antibiotika enthielt, kultiviert, und durch Einschichtkultur auf Plastik dedifferenziert. Für Zytotoxizitätsstudien wurden Zellen (2,5 × 10⁵) in die HA-Hydrogele durch vorsichtiges Vermischen der trypsinierten Zellen (ungefähr 50 bis 100 μl) mit der polymerisierenden HA- und Kreuzvernetzungsmittel-Mischung (ungefähr 400 μl Gelvolumen) vor dem vollständigen Setzen eingebettet. In Agarose eingebettete Zellen dienten als eine Kontrolle. Nach Anpassung an die Zellbedingungen (24 h) wurden die Zellproliferierung und die metabolische Aktivität durch Puls-Markierung mit [³H]-Thymidin und [³⁵S]-Methionin beurteilt. Für Zellinfiltrations-Studien wurden HA-Hydrogele in 24-Lochplatten (∼15 mm Durchmesser und 3 mm Höhe) für 1 Stunde bei Raumtemperatur polymerisiert und gründlich mit Phosphatgepufferter Salzlösung gespült. Zelladhäsions-Moleküle oder chemotaktische Faktoren, z.B. IGF-1, wurden zu der HA-Lösung vor der Kreuzvernetzung zugegeben, wenn dies gewünscht war. Nach 24 h wurden die Zellen (2,5 × 10⁵) auf die HA-Hydrogele gesät und wie oben kultiviert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Aussaat wurden Gele in Phosphat-gepuffertem 4%igen Paraformaldehyd fixiert und für die Paraffineinbettung weiterbearbeitet. Die Zellinfiltration wurde durch Färbung von Schnitten mit Hämatoxylin/Eosin beurteilt. Siehe 5.
Beispiel 12
Subkutane Implantierung von HA-Hydrogelen in Ratten – Ratten (2-3 pro Testmaterial) wurden mit Ketamin/Xylazin betäubt; der ventrale Thorax und das Abdomen rasiert und aseptisch vorbereitet. Ein kleiner vertikaler Einschnitt wurde auf jeder Seite des Schwertfortsatzknorpels des Brustbeins ausgeführt und die Haut mit einem stumpfen Instrument untergraben, um die Haut von dem darunter liegenden Gewebe zu trennen. HA-Hydrogele wurden in 3 ml-Spritzen wie beschrieben polymerisiert. Zur Induzierung von osteochondraler Differenzierung wurden 1 mg/ml vorfibrillisiertes intaktes Kollagen Typ I (Organogenesis, Canton, MA), 200 μl/ml rekombinantes BMP-2 (Genetics Institute, Cambridge, MA) und 500 ng/ml IGF-1 (Celtrix Pharmaceuticals, Santa Clara, CA) oder 50 ng/ml TGF-β2 (Celtrix Pharmaceuticals, Santa Clara, CA) mit der HA-Lösung vor der Kreuzvernetzung vermischt. Die Kollagenfibrillen wurden durch langsame Polymerisierung (aus verdünnten Lösungen von 2-3 mg/ml) von in Säure aufgelöstem Kollagen in Phosphat-gepufferter Salzlösung hergestellt und durch Zentrifugation nach Standardverfahren (McPherson et al., Collagen Rel. Res. 5, 119-135 (1985)) geerntet. Gelieren der HA-Hydrogele konnte für 24 h bei Raumtemperatur erfolgen, damit die Umsetzung abgeschlossen ist, bevor identische ∼3 mm dicke zylindrische Gele durch Zerschneiden der Spritzen mit einer Rasierklinge hergestellt wurden. HA-Hydrogelscheiben wurden dann in jede Tasche platziert und die Hauteinschnitte mit Nähten verschlossen. 10 Tage nach der Operation wurden die Ratten getötet und das Aussehen der Implantierungsstellen, d.h. der Grad der Entzündung, grob untersucht, und Gewebsproben entnommen und für die Histologie durch Fixierung in Phosphat-gepuffertem Formalin und durch Paraffineinbettung weiterverarbeitet. Schnitte wurden mit Hämatoxylin/Eosin und mit Safranin-O/Fast Green gefärbt, und die Zellinfiltration und Transformation (Knorpel- und Knochenbildung), die durch das Biomaterial induziert war, ebenso wie Zeichen von Fibrose und Entzündung in dem umgebenen Gewebe abgeschätzt. Siehe 6–8.

Claims

Zusammensetzung, die quervernetzte Hydrogel-Derivate der Hyaluronsäure umfasst, die Disaccharid-Untereinheiten umfassen, wobei mindestens eine dieser Disaccharid-Untereinheiten eine substituierte Disaccharid-Untereinheit mit einer Substitution an einer Carboxyl-Gruppe ist, sodass die substituierte Disaccharid-Untereinheit die Formel
aufweist, worin jedes R' und R'' eine Seitenkette ist, die eine oder mehrere funktionelle Gruppen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff; bioaktivem Peptid; Alkyl; Aryl; Alkylaryl; Arylalkyl; substituiertem Alkylaryl, das ein Atom oder Atome von Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel oder Phosphor enthält; substituiertem Arylalkyl, das ein Atom oder Atome von Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor, Halogen oder ein Metallion enthält; und einer substituierten heterocyclischen Verbindung, die ein Atom oder Atome von Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor, Halogen oder ein Metallion enthält, umfasst wobei die funktionellen Gruppen innerhalb jeder der R'- oder R''-Seitenketten entweder direkt aneinander gebunden sind oder durch ein Mitglied getrennt sind, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ether, Keto, Amino, Oxycarbonyl, Sulfat, Sulfoxid, Carboxyamid, Alkyn und Alken; und bei der jede der R'- und R''-Seitenketten mit einer terminalen funktionellen Gruppe endet, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Peptid, Aldehyd, Amin, Arylazid, Hydrazid, Maleimid, Sulfhydryl, aktiver Ester, Ester, Carboxylat, Imidoester, Halogen und Hydroxyl; oder wobei die Derivate der Hyaluronsäure kovalent über eine der terminalen funktionellen Gruppen quervernetzt sind; und wobei die Derivate der Hyaluronsäure zu einem Grad von mehr als 10 % modifiziert sind.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, bei der mindestens 20 der Disaccharid-Untereinheiten gemäß Anspruch 1 substituierte Disaccharid-Untereinheiten sind.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, bei der höchstens 95 der Disaccharid-Untereinheiten gemäß Anspruch 1 substituierte Disaccharid-Untereinheiten sind.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, bei der höchstens 25 der Disaccharid-Untereinheiten gemäß Anspruch 1 substituierte Disaccharid-Untereinheiten sind.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, bei der mindestens eine der terminalen funktionellen Gruppen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Peptid, Aldehyd, Amin, Arylazid, Hydrazid, Maleimid, Sulfhydryl und aktivem Ester.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, bei der das Molekulargewicht der quervernetzten Derivate der Hyaluronsäure mindestens 1.000.000 Dalton beträgt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung biologisch abbaubar ist.
Verfahren zur Herstellung eines quervernetzten Hydrogel-Derivats der Hyaluronsäure, Schritte umfassend bei denen man: a) an einem Carboxylat eines Glucuronsäure-Restes der Hyaluronsäure einen aktivierten Ester bildet, b) an einem Carbonyl-Kohlenstoff des in Schritt (a) gebildeten aktivierten Esters eine Seitenkette substituiert, die einen nukleophilen Teil und einen Teil mit einer funktionellen Gruppen umfasst; und c) die in Schritt (b) gebildeten, substituierten Derivate der Hyaluronsäure quervernetzt.
Verfahren gemäß Anspruch 8, bei dem der nukleophile Teil ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ammoniak, primärem Amin, sekundärem Amin, Hydroxyl und Sulfhydryl.
Verfahren gemäß Anspruch 8, bei dem der Teil mit der funktionellen Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus aktivem Ester, Aldehyd, Amin, Arylazid, Hydrazid, Maleimid, Sulfhydryl und Peptid.
Verfahren gemäß Anspruch 8, bei dem Schritt (a) durch Carbodiimid-vermittelte Kopplung mit einem aktiven Ester durchgeführt wird, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem substituiertem Triazol, N-Sulfosuccinimid, Nitrophenol, teilweise halogeniertem Phenol, Perhalophenol, Pentafluorphenol, HOBT und NHS.
Verfahren gemäß Anspruch 8, bei dem das quervernetzende Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus polyvalentem aktiven Ester, Aldehyd, Amin, Arylazid, Maleimid und Sulfhydryl.
Verfahren gemäß Anspruch 8, bei dem das HA-Derivat ein Peptidsubstrat für die Transglutaminase umfasst, und bei dem das HA-Derivat unter Verwendung von Transglutaminase quervernetzt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 8, bei dem Schritt (c) in Gegenwart von Zellen durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 8, bei dem Schritt (c) in Gegenwart von mindestens einem Mitglied ausgewählt aus der Grup pe bestehend aus Wachstumsfaktoren, Zytokinen, Arzneimitteln und bioaktiven Peptiden durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 15, bei dem das bioaktive Peptid RGD ist.
Verfahren gemäß Anspruch 15, bei dem das bioaktive Peptid ein Substrat für die Transglutaminase ist.
Verfahren gemäß Anspruch 15, bei dem das bioaktive Peptid ein APPQEA ist.
Verfahren gemäß Anspruch 17, bei dem der Wachstumsfaktor TGF-β oder BMP ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 zur Verwendung bei der Herstellung eines Medikamentes zur Gewebereparatur.
Zusammensetzung gemäß der Anspruch 1, bei der die Seitenkette ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus aktiviertem Ester, Aldehyd, Arylazid und Maleimid.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, bei der die quervernetzten Derivate der Hyaluronsäure unter Verwendung eines quervernetzenden Mittels gebildet werden, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus polyvalentem aktivem Ester, Aldehyd, Arylazid, und Maleimid.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, bei der die Zusammensetzung ferner mindestens ein Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Wachstumsfaktoren, Zytokinen, Arzneimitteln, und bioaktiven Peptiden umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 23, bei der der Wachstumsfaktor TGF-β oder BMP-2 ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 23, bei der die Zusammensetzung ferner Zellen umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, bei der das Quervernetzen unter physiologischen Bedingungen durchgeführt wird.