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ERKLÄRUNG ZU BUNDESSTAATLICH GEFÖRDERTER
FORSCHUNG
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Die
vorliegende Erfindung erfolgte zum Teil mit Geldern der National
Institutes of Health, Intramural Program. Die Regierung hat möglicherweise
gewisse Rechte an der vorliegenden Erfindung.
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QUERVERWEIS ZU VERWANDTEN
ANMELDUNGEN
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Die
vorliegende Anmeldung beansprucht die Priorität der am 30. Juli 1998 eingereichten
provisorischen Anmeldung mit der Serien-Nr. 60/094,690, auf die
ein Prioritätsanspruch
unter 35 U.S.C. §119(e)
erhoben wird.
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TECHNISCHER BEREICH DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Gewebereparatur und
insbesondere Verfahren zur Wundheilung unter Verwendung von Thymosin β4.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Verfahren
und Zusammensetzungen, die für
eine effektive Heilung chronischer Wunden unzureichend sind, stellen
in der Gesundheitsfürsorge
ein bedeutendes Problem dar. Eine eingeschränkte Wundheilung erhöht die Wahrscheinlichkeit
von Mortalität
und Morbidität.
Dieses Problem ist vor allem bei Patienten mit Diabetes auffällig, bei
denen sich starke, lebensbedrohliche Wunden an Körperextremitäten entwickeln.
Chronische, diabetische Fußgeschwüre haben
oft Amputationen zur Folge. Diese Wunden sind oft das Ergebnis einer schlechten
Zirkulation, die sich aus den insulingeschädigten Zellen von Diabetikern
ergibt, sowie einer beeinträchtigten
Vaskularisierung des Wundbetts, reduzierten Infiltration keimbekämpfender
Zellen und reduzierten Gewebeepithelialisierung. Folglich schließen die
meisten derzeitigen Therapien Versuche zur Revaskularisierung des
Wundbetts und Verhinderung einer Infektion ein.
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Wunden
in nicht geschädigtem
Gewebe durchlaufen eine komplexe und geordnete Reihe von Ereignissen
zur Gewebereparatur. Die Ereignisreihe kann die Infiltration immuner
Zellen im Rahmen des Prozesses zur Beseitigung und Zerstörung von
nekrotischem Gewebe, eine erhöhte
Vaskularisierung durch angiogene Faktoren und eine erhöhte Zellvermehrung
und extrazelluläre
Matrixablagerung beinhalten. Zwar wurde der Grundprozess der Gewebereparatur
charakterisiert, doch werden die einzelnen Schritte und Faktoren,
die zur Durchführung
dieser komplexen Reihe von Ereignissen notwendig sind, noch nicht
ganz nachvollzogen. Die Identifizierung individueller Schritte und
Faktoren könnte
zu verbesserten Verfahren zur Behandlung von Krankheiten führen, die
durch unzureichende Wundreparaturprozesse hervorgerufen werden.
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In
bisherigen Studien wurde der „Scratch"-Wundverschlusstest zur Beurteilung potenzieller
Effekte eines Agens auf die In-vitro-Zellmigration angewendet. Ein
solcher Test ist zwar informativ, ahmt jedoch nicht die dynamischen
In-vivo-Wundheilungsbedingungen nach, insofern als nicht alle am
Wundverschluss beteiligten Faktoren in dem In-vitro-Assay vorliegen.
Aus diesem Grund wurden In-vivo-Systeme
entwickelt, um die Fähigkeit
eines Agens oder Faktors zur Modulierung von Wundheilungsaktivitäten zu beurteilen.
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Mit
diesen Arten von In-vitro-Modellen wurde eine Reihe spezifischer
Wachstumsfaktoren im Hinblick auf ihre Wirkung auf die Angiogenese
erkannt. Ein solcher Wachstumsfaktor ist TGF-β. Zu dieser Familie dimerer
Proteine gehören
TGF-β1,
TGF-β2,
TGF-β3,
TGF-β4 und
TGF-β5,
die das Wachstum und die Differenzierung vieler Zelltypen regulieren.
Diese Proteinfamilie weist eine Reihe biologischer Effekte aus der
Stimulierung des Wachstums einiger Zelltypen (Noda et al., (1989)
Endocrinology, 124:2991-2995) und Inhibition des Wachstums anderer
Zelltypen (Goey et al., (1989) J. Immunol., 143:877-880; Pietenpol
et al., (1990) Proc. Nat'l.
Acad Sci. USA, 87:3758-3762) auf. Es wurde außerdem gezeigt, dass TGF-β die Expression
extrazellulärer
Matrixproteine erhöht,
einschließlich
Kollagen und Fibronektin (Ignotz et al., (1986) J. Biol. Chem., 261:4337-4345),
und die Heilung von Wunden beschleunigt (Mustoe et al., (1987) Science,
237:1333-1335).
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Ein
weiterer Wachstumsfaktor, der für
seine Wirkung auf die Angiogenese anerkannt ist, ist der aus Blutplättchen gewonnene
Wachstumsfaktor (PDGF). PDGF erwies sich ursprünglich als ein potentes Mitogen für Mesenchymzellen
(Ross R. et al. (1974) Proc Nat'l
Acad Sci USA 71(4):1207-1210.; Kohler N. et al. (1974) Exp. Cell
Res. 87:297-301). Weitere Studien haben gezeigt, dass PDGF die Rate
von Zellularität
und Granulation in der Gewebebildung erhöht. Mit PDGF behandelte Wunden
haben das Aussehen einer Entzündungsreaktion
im Frühstadium,
einschließlich
einer Zunahme von Neutrophilen und Makrophage-Zelltypen an der Wundstelle.
Diese Wunden weisen auch eine verbesserte Fibroblastenfunktion auf
(Pierce, GF et al. (1988) J. Exp. Med. 167: 974-987). Es hat sich
in Tierstudien gezeigt, dass sowohl PDGF als auch TGFβ die Kollagenbildung,
den DNA-Gehalt und die Proteinniveaus erhöhen (Grotendorst, GR et al.
(1985) J. Clin. Invest. 76:2323-2329; Sporn, MB et al. (1983) Science
219:1329). Es hat sich gezeigt, dass die Wundheilungswirkung von
PDGF in Wunden beim Menschen erfolgreich ist. In menschlichen Wunden
ist die PDGF-AA Expression innerhalb von Druckgeschwüren, die
eine Heilung durchlaufen, erhöht.
Die Zunahme von PDGF-AA stimmt mit einer Zunahme von aktivierten
Fibroblasten, extrazellulärer
Matrixablagerung und aktiver Vaskularisierung der Wunde überein.
Ferner ist eine solche Zunahme von PDGF-AA bei chronischen, nicht
heilenden Wunden nicht erkennbar. Zu einer Reihe anderer Wachstumsfaktoren
mit der Fähigkeit
zur Auslösung
von Angiogenese und Wundheilung gehören der vaskuläre Endothelwachstumsfaktor
(VEGF), der Keratinozytenwachstumsfaktor (KGF) und der basische
Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF).
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Die
meisten dieser Wachstumsfaktoren und angiogenen Faktoren haben jedoch
Nebenwirkungen. Demzufolge besteht einen Bedarf an zusätzlichen
Faktoren, die zur Förderung
der Wundreparatur von Nutzen sind.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, dass Thymosin β4 (Tβ4) die Wundheilung
beschleunigt und die Wundreparatur stimuliert. Aufgrund dieser Erkenntnisse
ist es nun möglich,
Verfahren zur Beschleunigung der Wundheilung bei Individuen mit
Wunden, die einer solchen Behandlung bedürfen, zu entwickeln.
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In
einer ersten Ausgestaltung ergibt die Erfindung Anspruch 1. Gemäß einem
Aspekt des Verfahrens ist das Wundheilungspolypeptid Tβ4 oder eine
Isoform von Tβ4.
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In
einer anderen Ausgestaltung stellt die Erfindung eine wirksame Menge
einer Zusammensetzung bereit, die ein Wundheilungspolypeptid, umfassend
die Aminosäuresequenz
LKKTET und konservative Varianten davon, mit Wundheilungsaktivität, oder
eine Nucleinsäure
enthält,
die ein Wundheilungspolypeptid kodiert, zur Herstellung eines Medikamentes
zur Förderung
der Gewebereparatur in einem Gewebe, das einer solchen Behandlung
bedarf. Gemäß einem
Aspekt des Verfahrens ist ein Wundheilungspeptid Tβ4 oder eine
Isoform von Tβ4.
Das Gewebe kann entweder in vivo oder ex vivo kontaktiert werden.
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In
noch einer anderen Ausgestaltung stellt die Erfindung ein Mittel
zur Modulierung der Wundreparatur bei einem Individuum, das einer
solchen Behandlung bedarf, durch die systemische Zuführung einer
wirksamen Wundheilungsmenge eines Wundheilungspolypeptids, umfassend
die Aminosäuresequenz
LKKTET und konservative Varianten davon, mit Wundheilungsaktivität bereit.
Gemäß einem
Aspekt des Verfahrens ist ein Wundheilungspeptid Tβ4 oder eine
Isoform von Tβ4.
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In
noch einer anderen Ausgestaltung stellt die vorliegende Erfindung
ein Mittel zur Stimulierung von Epithelzellmigration an einer Wundstelle
durch Inkontaktbringen der Wunde mit einer wirksamen Menge eines Tβ4-Polypeptids
bereit.
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In
einer anderen Ausgestaltung stellt die Erfindung ein Mittel zur
Diagnose eines pathologischen Zustands in einem Individuum bereit,
der durch eine Wundheilungsstörung
in Verbindung mit Tβ4
gekennzeichnet ist, einschließlich
eines Nachweises des Tβ4-Anteils
in einer Probe des Individuums, die vermutlich Tβ4 enthält, und Vergleichs des Tβ4-Anteils
mit dem Anteil in einer normalen Probe (d.h. einer Standardprobe).
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In
einer anderen Ausgestaltung stellt die Erfindung ein Mittel zur
Linderung einer mit Tβ4
assoziierten Wundheilungsstörung
bereit, wobei ein Individuum mit der Störung mit einer Zusammensetzung
behandelt wird, die Tβ4-Aktivität oder die
Aktivität
einer Tβ4-Isoform
moduliert.
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In
noch einer anderen Ausgestaltung stellt die vorliegende Erfindung
pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, umfassend ein Wundheilungspolypeptid,
umfassend die Aminosäuresequenz
LKKTET und konservative Varianten davon, mit Wundheilungsaktivität und einen
pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Gemäß einem
Aspekt ist das Wundheilungspolypeptid Tβ4 oder eine Isoform von Tβ4.
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Die
Einzelheiten zu einer oder mehreren Ausgestaltung(en) der Erfindung
sind in den Begleitzeichnungen und der nachfolgenden Beschreibung
enthalten. Weitere Merkmale, Aufgaben und Vorzüge der Erfindung sind anhand
der Beschreibung und Zeichnungen sowie anhand der Ansprüche offensichtlich.
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BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
eine schematische Zeichnung einer wunde.
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2 ist ein Balkendiagramm, das den Effekt
der topischen und systemischen Zuführung von Tβ4 auf die Breite einer Punch-Wunde
im Vergleich zu einer Kontrolle darstellt. (A) Bei jedem Tier wurden
drei von sechs Wunden am Tag der Verwundung und 48 Stunden nach
der Verwundung 5 μg/50 μl topisch
zugeführt. (B)
Intraperitoneale Injektionen von 60 μg/300 μl wurden am Tag der Verwundung
und danach jeden zweiten Tag verabreicht. Die Kontrolltiere wurden
in ähnlicher
Weise mit Salzlösung
behandelt. Die Messungen sind als der mittlere prozentuale Rückgang ± SEM ausgedrückt.
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3 ist ein Balkendiagramm, das den Effekt
der topischen und systemischen Zuführung von Tβ4 auf den Spalt einer Punch-Wunde
im Vergleich zu einer Kontrolle darstellt. (A) Die topische Zuführung von
5 μg/50 μl erfolgte
am Tag der Verwundung und 48 Stunden nach der Verwundung. (B) Intraperitoneale
Injektionen von 60 μg/300 μl wurden
am Tag der Verwundung und danach jeden zweiten Tag verabreicht.
Die Messwerte sind als der mittlere prozentuale Rückgang ± SEM ausgedrückt.
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4 ist eine mit H&E gefärbte histologische Sektion,
die das Aussehen von Kontroll- und mit Thymosin β4 behandelten Wunden mit geringer
Vergrößerung und
stärkerer Vergrößerung darstellt.
Die Wunden stammen vom Tag 7, wie in der Legende von 2 beschrieben. Pfeile zeigen auf die Ränder der
ursprünglichen
Wunde. (A) Mit Salzlösung
behandelte Kontrollwunde. Die Migration des Epithelgewebes ist an
den Wundrändern
sichtbar und Debris ist über
der nicht geheilten Wunde sichtbar. (B) Eine erhöhte Reepithelialisierung der
Wunde trat auf, als Tβ4
intraperitoneal injiziert wurde (60 μg/300 μl jeden zweiten Tag). (C) Die topische
Behandlung (5 μg/50 μl Tβ4) resultierte
in der kompletten Reepithelialisierung der Wundepidermis. Die mit
Kästchen
versehenen Bereiche sind der Ort der stärker vergrößerten Felder (D-F). (D-F)
Dermis in der Nähe
der dermalen und epidermalen Verbindung. (D) Kontrolle, die wenige
Zellen in der Nähe
der Dermis und wenig Neovaskularisierung aufweist. (E) und (F) Dermis,
die mit Fibroblasten infiltriertes Granulationsgewebe und extensive
Neovaskularisierung aufweist (Pfeilspitzen). Sowohl die intraperitoneale
Behandlung als auch (F) die topische Applikation resultierten in
beachtlichen neuen Kapillaren. (Maßstabsbalken = 1 mm).
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5 zeigt histologische Sektionen von 7
Tage alten Wunden, die Kollagenablagerung/-ansammlung aufweisen.
Die Masson'sche
Trichromfärbung
zeigt Kollagen und Endothelzellen. (A) Gering vergrößerte Ansicht
einer mit Salzlösung
behandelten Kontrollwunde. (B) und (C) Gering vergrößerte Ansichten
von Wunden mit intraperitoneal injiziertem (B) oder topisch aufgetragenem
Tβ4 (A).
Die mit Kästchen
versehenen Bereiche sind der Ort der stärker vergrößerten Felder (D-F). Pfeile
zeigen auf die Ränder
der ursprünglichen
Wunde. (D) Stärker
vergrößerte Kontrollwunde,
die eine Basislinien-Kollagenansammlung aufweist. Eine intraperitoneale
(E) oder topische (F) Behandlung führte zu einer verbesserten Kollagenproduktion/-ansammlung
im Vergleich zu mit Salzlösung
behandelten Wunden. (Maßstabsbalken
= 1 mm).
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6 stellt
eine Tβ4-stimulierte
Keratinozytenmigration in Boyden-Kammer-Assays dar. (A) Tβ4 in den
unteren Wells der Kammer führte
zu einer 2-3fachen Zunahme der Migration auf mit Kollagen IV beschichteten
Filtern. Die positive Kontrolle, konditioniertes Medium, wies ebenfalls
eine erhöhte
Migration gegenüber Medium
alleine auf.
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7 zeigt
ein Diagramm, das die Migration von Hornhautepithelzellen bei verschiedenen
Tβ4-Konzentrationen
demonstriert.
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8 zeigt
ein Diagramm, das die Hornhaut-Reepithelialisierung
bei Rattenaugenhornhäuten
in An- und Abwesenheit von Tβ4
darstellt.
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9 zeigt
ein Diagramm, das die Hornhaut-Reepithelialisierung
in An- und Abwesenheit verschiedener Konzentrationen von Tβ4 darstellt.
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10 zeigt eine Aminosäuresequenz von Tβ4.
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11 zeigt die Aminosäuresequenz verschiedener bekannter
Isoformen von Tβ4
und ihre phylogenetische Verteilung. N-terminale Acetylierung wird
durch „ac" angegeben. Reste
zwischen 13 und 24 werden für
die Aktinbindung als wichtig angesehen.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Thymosin β4 wurde zunächst als
ein Protein identifiziert, das während
der Endothelzellmigration und -differenzierung in vitro hinauf reguliert
wird. Thymosin β4
wurde ursprünglich
vom Thymus isoliert und ist ein ubiquitäres 4,9 kDa Polypeptid mit
43 Aminosäuren,
das in einer Vielfalt von Geweben identifiziert wird. Diesem Protein
wurden verschiedene Funktionen zugeschrieben, wie z.B. eine Funktion
in der Endothelzelldifferenzierung und -migration, T-Zelldifferenzierung,
Aktin-Sequestrierung und Vaskularisierung. Eine biologische Aktivität von Thymosin β4 (Tβ4), wie hierin
gezeigt, bewirkt eine Gewebereparatur und Wundheilung. Eine weitere
Aktivität
von Tβ4
ist eine entzündungshemmende
Aktivität.
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Die
vorliegende Erfindung ergab sich aus der Untersuchung der Wirkung
von Tβ4
auf die Wundheilung. In-vivo-Ergebnisse
haben gezeigt, dass die topische und systemische Zuführung von
Tβ4 die
Wundheilung fördert.
Weitere Versuche demonstrierten, dass mit Tβ4 behandelte Wunden eine erhöhte extrazelluläre Matrixablagerung
im Wundbett aufweisen.
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Die
vorliegende Erfindung identifiziert Tβ4 als einen aktiven Faktor zur
Förderung
von Wundverschluss und Gewebereparatur in vivo, sowie zur Erhöhung der
Epithelzellmigration. Die In-vivo-Verabreichung von Tβ4 zeigt,
dass Zellmigration, Angiogenese und extrazelluläre Matrixablagerung auf oder über die
bei Kontrolltieren im Hinblick auf Migration, Angiogenese und Matrixablagerung
beobachteten Niveaus stimuliert werden. Tβ4 unterstützt den Wundverschluss bei
systemischer (z.B. intraperitonealer) und topischer Verabreichung
in Tierwundmodellen. Außerdem
wurden erhöhte
Kollagenwerte in behandelten Wunden beobachtet, woraus sich ergibt,
dass die Tβ4-Behandlung
auch die Wundkontraktion beschleunigen und den Heilungsprozess stimulieren
kann.
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Die
erfindungsgemäßen Verfahren
ergeben sich aus der Identifizierung der Wirkung von Tβ4 auf die Wundheilung.
In vivo stimuliert Tβ4
die Wundheilung in einer Vollhaut-Punch-Wunde (siehe Beispiel 1) und die Reparatur
von Wunden am Auge (Beispiel 4). Bei topischer oder systemischer
(z.B. intraperitonealer) Verabreichung beschleunigt Tβ4 den Verschluss
und die Heilung von Wunden (siehe Beispiele 1, 4 und 5).
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Förderung der Geweberegeneration
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In
einer Ausgestaltung stellt die Erfindung ein Mittel zur Beschleunigung
der Wundheilung bei einem Individuum durch Inkontaktbringen einer
Wunde mit einer wirksamen Wundheilungsmenge einer Zusammensetzung
bereit, die Tβ4
oder eine Tβ4-Isoform
enthält.
Das Inkontaktbringen kann topisch oder systemisch erfolgen. Beispiele
für die
topische Verabreichung sind beispielsweise das Inkontaktbringen
der Wunde mit einer Lotion, einem Balsam, einem Gel, einer Paste,
einem Spray, einer Suspension, Dispersion, einem Hydrogel, einer
Salbe oder einem Öl,
umfassend Tβ4.
Die systemische Verabreichung beinhaltet zum Beispiel intravenöse, intraperitoneale,
intramuskuläre
Injektionen einer Zusammensetzung, die Tβ4 oder eine Tβ4-Isoform enthält. Ein
Individuum kann ein beliebiges Säugetier,
vorzugsweise ein Mensch, sein.
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Darüber hinaus
ist Tβ4
oder eine Tβ4-Isoform
in solchen Fällen
von therapeutischem Nutzen, in denen der Wundheilungsprozess beeinträchtigt ist,
wie zum Beispiel bei Individuen mit Wundheilungsstörung. Mit „Individuen
mit Wundheilungsstörung" sind Individuen
mit reduzierter, verringerter Fähigkeit
oder Unfähigkeit
zur Genesung von einer Verwundung oder Verletzung gemeint, aufgrund
von wiederkehrenden Verwundungen, Verletzungen oder der Unfähigkeit
des natürlichen
Systems des Individuums, die Wundheilung ordnungsgemäß herbeizuführen. Steroide
vermindern zum Beispiel die Fähigkeit
eines Individuums zur Heilung im Vergleich zu einem Individuum,
das keine Steroide einnimmt. Zu anderen Wunden, die in gefährdeten
Individuen auftreten können,
gehören
unter anderem Hautwunden wie diabetische Geschwüre, Venengeschwüre oder Druckgeschwüre. Außerdem ist
Tβ4 oder
eine Tβ4-Isoform
zur Steigerung des normalen Heilungsprozesses therapeutisch von
Nutzen.
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Die
hierin verwendete „wirksame
Wundheilungsmenge" einer
Zusammensetzung, die Tβ4
oder eine Tβ4-Isoform
enthält,
zur Verwendung bei der Wundheilung ist als die Menge definiert,
die die Geweberegeneration und -reparatur wirksam fördert. Die „wirksame
Wundheilungsmenge" kann
die therapeutisch wirksame Menge sein. Zu Krankheiten, Störungen oder
Leiden, die möglicherweise
durch Tβ4
oder eine Tβ4-Isoform moduliert
werden, gehören
die Gewebereparatur nach traumatischen Verletzungen oder Zustände wie
Arthritis, Osteoporose und andere Muskel-Skelett-Störungen, Verbrennungen, Geschwüre und andere
Hautläsionen,
neurologische und Nervenkrankheiten und kardiovaskuläre Krankheiten
wie Ischämie
und Atherosklerose. Andere potenzielle Gewebe, die mit den Verfahren
und Zusammensetzungen der Erfindung behandelt werden können, sind
epidermales, Augen-, urogenitales, gastrointestinales, kardiovaskuläres, Muskel-,
Binde- oder Nervengewebe. Die hierin verwendeten Begriffe „induzieren", „Induktion" oder „bewirken" betreffen die Aktivierung,
Stimulierung, Verbesserung, Einleitung und/oder Beibehaltung zellulärer Mechanismen
oder Prozesse, die für
die Bildung eines Gewebes oder eines Teils davon, den Reparaturprozess
oder die Gewebeentwicklung wie hierin beschrieben notwendig sind.
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Modulierung der Wundheilung
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Wundheilung,
Geweberegeneration und Gewebereparatur ergeben sich aus einem komplexen
Prozess, der die Vermehrung und Migration von Entzündungszellen,
Endothelzellen, Stromazellen und Parenchymzellen, die Ablagerung
von extrazellulären
Matrixmaterialien und das Wachstum neuer Blutgefäße, insbesondere Kapillaren,
beinhaltet. Dieser komplexe Prozess spielt eine entscheidende Rolle
bei so vorteilhaften Funktionen wie der Embryogenese, dem weiblichen
Reproduktionszyklus sowie bei abnormen Funktionen wie Arthritis,
chronische Ulzeration und neurodegenerative Krankheiten.
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In
einer anderen Ausgestaltung stellt die Erfindung ein Mittel zur
Modulierung der Wundheilung in einem Individuum oder einem Gewebe
bereit, einschließlich
des Inkontaktbringens des Individuums oder Gewebes mit einer wirksamen
Wundheilungsmenge einer Zusammensetzung, die Tβ4 oder eine Tβ4-Isoform
enthält.
Es ist vorgesehen, dass Tβ4
oder eine Tβ4-Isoform
topisch oder systemisch verabreicht werden kann, um einen Gewebeschaden
zu verhindern oder zu behandeln, wie zum Beispiel aufgrund von Ischämie beschädigtes Gewebe,
einschließlich
der ischämischen
Hirn-, Knochen- und Herzkrankheit, Schäden an Hornhaut- oder Netzhautgewebe
des Auges und Schäden
an Epithelgewebe wie die Haut.
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Ferner
ist der Anwendungsbereich der Erfindung zur Förderung der Wundheilung in
Gewebe nützlich, da
die Angiogenese in Gewebe mit mangelhaftem Blutfluss gefördert wird.
Eine Tβ4
enthaltende Zusammensetzung kann z.B. die Heilung chronischer Geschwüre fördern, indem
die Blutversorgung des Gewebeortes sowie die Keratinozytenmigration
zum Verschließen
einer Wunde erhöht
werden.
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Tβ4-Isoformen
wurden identifiziert und haben zu etwa 70 % oder etwa 75 % oder
etwa 80 % oder mehr Homologie zur Aminosäuresequenz von Tβ4, die in 10 dargestellt ist. Zu solchen Isoformen
gehören
beispielsweise Tβ4ala, Tβ9,
Tβ10, Tβ11, Tβ12, Tβ13, Tβ14 und Tβ15 (11; siehe auch Mihelic et al., (1994) Amino
Acids, 6:1-13, das die Aminosäuresequenz
anderer Tβ4-Isoformen
beschreibt und hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist). Ähnlich wie
Tβ4 haben
die Tβ10
und Tβ15
Isoformen gezeigt, dass sie Aktin sequestrieren. Tβ4, Tβ10 und Tβ15 sowie
diese anderen Isoformen haben eine Aminosäuresequenz, LKKTET, gemeinsam,
die scheinbar an der Vermittlung der Aktinsequestrierung oder -bindung
beteiligt ist. Ohne uns durch eine spezielle Theorie zu binden,
ist die Wundheilungsaktivität
von Tβ4
und Tβ4-Isoformen
möglicherweise
zum Teil in der Fähigkeit
zur Aktinpolymerisierung begründet.
Tβ4 kann
zum Beispiel die Aktin-Polymerisierung in Wunden modulieren, um
die Heilung zu fördern
(z.B. β-Thymosine
scheinen F-Aktin durch Sequestrieren von freiem G-Aktin zu depolymerisieren).
Die Fähigkeit
von Tβ4
zur Modulierung der Aktin-Polymerisierung kann daher völlig oder
teilweise in seiner Fähigkeit
zur Bindung an oder Sequestrierung von Aktin über die LKKTET Sequenz begründet sein.
Somit fördern
genau wie Tβ4
andere Proteine, die Aktin binden oder sequestrieren oder die Aktin-Polymerisierung
modulieren, einschließlich
Tβ4-Isoformen mit der
Aminosäuresequenz
LKKTET, wahrscheinlich die Wundheilung alleine oder in Kombination
mit Tβ4,
wie hierin dargelegt.
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Es
wird somit insbesondere erwogen, dass bekannte Tβ4 Isoformen wie Tβ4ala, Tβ9,
Tβ10, Tβ11, Tβ12, Tβ13, Tβ14 und Tβ15 sowie
Tβ4-Isoformen,
die noch nicht identifiziert sind, in den erfindungsgemäßen Verfahren
von Nutzen sind. Tβ4-Isoformen
sind an sich in den erfindungsgemäßen Verfahren von Nutzen, einschließlich der
in einem Individuum praktizierten Verfahren; die Erfindung stellt
daher ferner pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die Tβ4-Isoformen
Tβ4ala, Tβ9,
Tβ10, Tβ11, Tβ12, Tβ13, Tβ14 und Tβ15 und einen
pharmazeutisch akzeptablen Träger
umfassen.
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Darüber hinaus
können
andere Proteine, die Aktinsequestrierungs- oder -bindefähigkeit
haben oder die Aktin mobilisieren oder die Aktinpolymerisierung
modulieren können,
wie in einem entsprechenden Sequestrierungs-, Bindungs-, Mobilisierungs-
oder Polymerisierungsassay demonstriert oder durch die Anwesenheit
einer Aminosäuresequenz
identifiziert wurde, die Aktinbindung vermittelt, wie LKKTET, zum
Beispiel in ähnlicher
Weise in den erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden. Zu solchen Proteinen gehören zum Beispiel Gelsolin,
Vitamin-D-Bindeprotein
(DBP), Profilin, Cofilin, Depactin, DnaseI, Vilin, Fragmin, Severin, Capping-Protein, β-Aktinin
und Akumentin. Da solche Verfahren die in einem Individuum praktizierten
beinhalten, stellt die Erfindung ferner pharmazeutische Zusammensetzungen
bereit, die Gelsolin, Vitamin-D-Bindeprotein (DBP), Profilin, Cofilin,
Depactin, DNaseI, Vilin, Fragmin, Severin, Capping-Protein, β-Aktinin
und Akumentin wie hierin dargelegt umfassen. Die Erfindung beinhaltet
folglich die Verwendung eines Wundheilungspolypeptids, das die Aminosäuresequenz
LKKTET und konservative Varianten davon umfasst.
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Der
hierin verwendete Begriff „konservative
Variante" oder grammatikalische
Variationen davon beziehen sich auf den Austausch eines Aminosäurerests
durch einen anderen, biologisch ähnlichen
Rest. Zu Beispielen für
konservative Variationen gehören
der Austausch eines hydrophoben Rests wie Isoleucin, Valin, Leucin
oder Methionin durch einen anderen, der Austausch eines polaren
Rests durch einen anderen, wie die Substitution von Arginin durch
Lysin, Glutamin- durch Asparaginsäuren oder Glutamin durch Asparagin
und dergleichen.
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Tβ4 wurde in
einer Reihe von Gewebe- und Zelltypen lokalisiert und folglich können Agenzien,
die die Produktion von Tβ4
stimulieren, in eine Zusammensetzung gegeben werden, um die Tβ4-Produktion
von einem Gewebe und/oder einer Zelle zu bewirken. Agenzien, die
eine Wundreparatur bewirken, können
ebenfalls in einer solchen Zusammensetzung aufgenommen werden, um
den Wundheilungsprozess zu steigern. Zu solchee Agenzien gehören Mitglieder
der Familie von Wachstumsfaktoren, wie der insulinähnliche
Wachstumsfaktor (IGF-1), der aus Blutplättchen gewonnene Wachstumsfaktor
(PDGF), der epidermale Wachstumsfaktor (EGF), der von transformierten
Zellen gebildeter Wachstumsfaktor Beta (TGF-β), der basische Fibroblastenwachstumsfaktor
(bFGF), Thymosin α1
(Tα1) und
der vaskuläre
Endothelwachstumsfaktor (VEGF). Bevorzugter ist das Agens von transformierten
Zellen gebildeter Wachstumsfaktor Beta (TGF-β) oder ein anderes Mitglied
der TGF-β-Überfamilie.
Tβ4-Zusammensetzungen
der Erfindung unterstützen
die Wundheilung, indem sie das Wachstum von Bindegewebe durch extrazelluläre Matrixablagerung,
Zellmigration und Vaskularisierung des Wundbetts herbeiführen.
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Ferner
können
Agenzien, die den Wundheilungsprozess unterstützen oder stimulieren, zusammen
mit Tβ4
oder einer Tβ4-Isoform
in eine Zusammensetzung gegeben werden, um den Wundheilungsprozess
weiter zu modulieren. Zu solchen Agenzien gehören angiogene Agenzien, Wachstumsfaktoren,
Agenzien, die die Differenzierung von Zellen lenken, Agenzien, die
die Migration von Zellen fördern,
und Agenzien, die die Bereitstellung von extrazellulären Matrixmaterialien
im Wundbett stimulieren. So kann zum Beispiel, aber nicht ausschließlich, Tβ4 oder eine
Tβ4-Isoform alleine oder
in Kombination mit einem oder mehreren der folgenden Agenzien in
Kombination zugegeben werden: VEGF, KGF, FGF, PDGF, TGFβ, IGF-1,
IGF-2, IL-1, Prothymosin α1
und Thymosin αl
in einer wirksamen Wundheilungsmenge.
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Gemäß einem
anderen Aspekt ist die Erfindung zur Reparatur von Gewebe nützlich,
das infolge chirurgischer Verfahren, Bestrahlung, Lazeration, toxischer
Chemikalien, Virusinfektionen, Bakterieninfektionen oder Verbrennungen
verletzt wurde. Ferner ist die Erfindung zur Revitalisierung von
Narbengewebe nützlich, das
aus einer Reihe von Verfahren, Unfällen oder Verletzungen herrührt.
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Der
Begriff „Narbengewebe" bedeutet fibrotisches
oder kollagenes Gewebe, das im Laufe der Heilung einer Wunde oder
eines anderen morbiden Prozesses entsteht. Tβ4 kann zum Beispiel in einer
Matrix mit kontrollierter Freisetzung aufgenommen werden, die in
der Nähe
von beschädigtem
Gewebe positioniert werden kann, so dass die Regeneration, Reparatur
und/oder Revaskularisierung eines solchen Gewebes gefördert wird.
Der Begriff „Matrix
mit kontrollierter Freisetzung" bezieht
sich auf eine beliebige Zusammensetzung, die die Freisetzung einer
bioaktiven Substanz zulässt,
die damit vermischt oder darin beigemischt ist. Die Matrix kann
eine feste Zusammensetzung, ein poröses Material (wie ein Gerüst, Gitter
oder Schwamm) oder eine halbfeste, gelförmige oder flüssige Suspension
sein, die bioaktive Substanzen enthält. Der Begriff „bioaktives Material" bezieht sich auf
eine beliebige Zusammensetzung, die die Gewebereparatur moduliert,
wenn sie gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet wird. Die bioaktive(n) Materialien oder Matrix kann/können durch
Injektion, chirurgischen Eingriff, Katheter oder durch ein beliebiges
anderes Mittel eingeführt
werden, das zur Modulierung der Gewebereparatur geeignet ist.
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Es
ist vorgesehen, dass die Anwendungsbereiche und Zusammensetzungen
der Erfindung zur Unterstützung
der Wundheilung und -reparatur in geführten Geweberegenerations-(GTR)-Verfahren
genutzt werden können.
Solche Verfahren werden derzeit von medizinischem Fachpersonal angewendet,
um die Wundheilung zu beschleunigen. Gewöhnlich werden nicht resorbierbare
oder bioabsorbierbare Materialien zur Beschleunigung der Wundheilung
durch Förderung
der Repopulation der Wundfläche
durch Zellen eingesetzt, die die architektonische und strukturelle
Matrix des Gewebes bilden. Die Anwendungsbereiche und Zusammensetzungen
der Erfindung dienen zum Beispiel der Unterstützung der Gewebereparatur oder
-regeneration an einer Geschwürstelle
bei einem Menschen oder anderen Individuum, indem eine Zusammensetzung,
die ein bioreabsorbierbares Polymer und Tβ4 enthält, an der Stelle platziert
wird, die einer Gewebereparatur oder -regeneration bedarf, so dass
die Zusammensetzung effektiv die Geweberegeneration unterstützt, indem
eine wirksame Wundheilungsmenge von Tβ4 an der Stelle freigesetzt
wird.
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Gemäß einem
anderen Aspekt ist die Erfindung zur Förderung von Gewebewachstum
im Laufe des Prozesses des Gewebe-Engineering nützlich. Der hierin verwendete
Begriff „Gewebe-Engineering" ist als die Erzeugung,
Entwicklung und Herstellung biologischer Prothesevorrichtungen in
Kombination mit synthetischen oder natürlichen Materialien zum Erzeugen,
Verbessern oder Ersetzen von Körpergewebe
und Organen definiert. Die vorliegende Erfindung kann somit zum
Verbessern der Entwicklung und des Wachstums von humanem Gewebe
außerhalb
des Körpers
für eine
spätere
Implantation im Körper
oder zum Verbessern der Entwicklung und des Wachstums von Gewebe
im Körper
zum Reparieren oder Ersetzen von erkranktem oder beschädigtem Gewebe
verwendet werden. Tβ4
kann zum Beispiel zur Förderung
des Wachstums von Hauttransplantatersatz nützlich sein, der als Therapie
in der Behandlung von Verbrennungen und Geschwüren eingesetzt wird.
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Gemäß einem
anderen Aspekt des GewebeEngineering kann Tβ4 in externen oder internen
Vorrichtungen aufgenommen werden, die menschliches Gewebe enthalten,
das dafür
vorgesehen ist, die Funktion eines erkrankten internen Gewebes zu
ersetzen. Dieser Ansatz involviert vom Körper isolierte Zellen, die
auf oder in einer dreidimensionalen Matrix platziert werden, wobei
das neue System in den Körper
implantiert oder außerhalb
des Körpers
verwendet wird. Die Anwendungsbereiche und Zusammensetzungen der
Erfindung können
in solchen Matrizen genutzt und aufgenommen werden, um das Wachstum
von in den Matrizen enthaltenem Gewebe zu fördern. Tβ4 kann zum Beispiel in einem
durch Gewebe-Engineering behandelten Konstrukt aufgenommen werden,
um das Wachstum der in dem Konstrukt enthaltenen Zellen zu fördern. Es
ist vorgesehen, dass der Anwendungsbereich der Erfindung zum Verbessern
von Gewebereparatur, -regeneration und -engineering in Endothelzellen-bezogenen
Produkten verwendet werden kann, die Knorpel, Knorpel-Knochen-Verbundstoffe,
Knochen, Gewebe des zentralen Nervensystems, Muskeln, Leber, Pankreasinsel-(insulinproduzierende)-Zellen,
urogenitales Gewebe, Brustgewebe und Gewebe für Gentherapieanwendungen enthalten
können.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner Anwendungsbereiche und Zusammensetzungen
zur Modulierung der weiblichen Reproduktionstraktfunktionen bereit.
Es hat sich gezeigt, dass Wachstumsfaktoren eine Rolle bei der zyklischen
Mitose und Differenzierung von Endometriumzellkomponenten, Rekrutierung
von Makrophagen beim Dezidualisieren des Endometriums, Endometrium-Trophoblasten-Interaktionen,
Frühschwangerschaftserhaltung
und Endometriumfunktionsregeneration spielen. Der hierin verwendete
Begriff „modulieren" bedeutet eine Modifikation
einer existierenden Bedingung oder eines biologischen Zustands.
Die hierin definierte Modulierung einer Bedingung schließt sowohl
eine Erhöhung
als auch eine Verringerung der die existierende Bedingung beeinflussenden
Determinanten ein. Die Verabreichung von Tβ4 könnte zum Beispiel zum Verbessern
der Gebärmutterfunktionen
unter einer Bedingung verwendet werden, bei der die Förderung von
Endothelzellwachstum erwünscht
ist. Die Gebärmutter
kann zum Beispiel mit Tβ4
behandelt werden, um das Wachstum und die Entwicklung von Plazentamembranen
oder Endometriumwachstum oder die Reparatur dieser Gewebe nach einer
Gewebsverletzung zu fördern.
Ferner kann eine Behandlung mit Tβ4
angewendet werden, um Schwangerschaft zu fördern und zu erhalten, indem
die Endometrium-Trophoblasten-Interaktion erleichtert
wird. Alternativ könnte
ein Antagonist gegen Tβ4
verabreicht werden, um Bedingungen mit übermäßigem Endometriumwachstum zu
modulieren, bei denen der Tβ4-Anteil
im Vergleich zu einer normalen biologischen Bedingung übersteigert
ist. Darüber
hinaus kann Tβ4
in Kombination mit anderen Agenzien wie Thymosin α1 zur Behandlung
von Störungen
des Reproduktionstraktes erwünscht
sein.
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Die
hierin beschriebenen therapeutischen Ansätze beinhalten verschiedene
Methoden der Verabreichung oder Zuführung von Reagenzien oder Zusammensetzungen,
die das erfindungsgemäße Tβ4 umfassen, einschließlich beliebiger
konventioneller Verabreichungstechniken (zum Beispiel unter anderem
topische Verabreichung, lokale Injektion, Inhalation oder systemische
Verabreichung) an ein Individuum mit einer Wunde oder mit Gewebe,
das geheilt oder repariert werden muss. Die oben beschriebene Verabreichung
von Tβ4 kann
die Wundheilung beschleunigen, die Zellmigration in eine Wundstelle
erhöhen,
die Gewebereparatur oder -regeneration induzieren oder Wachstum
und Entwicklung des Endometriums fördern. Das Reagens, die Formulierung
oder Zusammensetzung kann mit einem beliebigen hierin beschriebenen
Verfahren oder mit einem beliebigen in der Technik bekannten Verfahren
zum Zuführen,
Targetieren von Tβ4-Polypeptiden
und Exprimieren von Tβ4
kodierenden Genen, auch auf spezifische Zellen oder Rezeptoren targetiert
werden. Die Verfahren und Zusammensetzungen, die das erfindungsgemäße Tβ4 verwenden
oder enthalten, können zum Beispiel
in pharmazeutische Zusammensetzungen durch Vermischen mit pharmazeutisch
akzeptablen, nichttoxischen Exzipienten oder Trägern formuliert werden. Solche
Zusammensetzungen können
präpariert
werden für
die parenterale Verabreichung, insbesondere in Form flüssiger Lösungen oder
Suspensionen in wässrigen physiologischen
Pufferlösungen;
für die
orale Verabreichung, insbesondere in Form von Tabletten oder Kapseln;
oder für
die intranasale Verabreichung, insbesondere in Form von Pulvern,
Nasentropfen oder Aerosolen. Zusammensetzungen mit anhaltender Freisetzung
sind ebenfalls in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Zusammensetzungen
für andere
Verabreichungsmethoden können
nach Bedarf mit Standardverfahren hergestellt werden.
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Eine
erfindungsgemäße Zusammensetzung,
die Tβ4
enthält,
kann praktisch in Einheitsdosisform verabreicht und mit einem beliebigen
der Verfahren hergestellt werden, die in der Pharmazie allgemein
bekannt sind, wie zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub.
Co., Easton, PA, 1990) beschrieben. Formulierungen zur parenteralen
Verabreichung können
als allgemeine Exzipienten steriles Wasser oder Salzlösung, Polyalkylenglykole
wie Polyethylenglykol, Öle
pflanzlichen Ursprungs, hydrierte Naphtalene und dergleichen enthalten.
Vor allem biokompatibles, biologisch abbaubares Lactidpolymer, Lactid/Glycolid-Copolymer
oder Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Copolymere sind Beispiele für Exzipienten
zur Steuerung der Freisetzung einer erfindungsgemäßen Verbindung
in vivo. Zu anderen geeigneten parenteralen Zuführungssystemen gehören Ethylenvinylacetat-Copolymerpartikel,
osmotische Pumpen, implantierbare Infusionssysteme und Liposomen.
Formulierungen zur Inhalationsverabreichung können bei Bedarf Exzipienten
wie Lactose enthalten. Inhalationsformulierungen können wässrige Lösungen sein,
die zum Beispiel Polyoxyethylen-9-laurylether, Glycocholat und Desoxycholat
enthalten, oder sie können ölige Lösungen zur
Verabreichung in Form von Nasentropfen sein. Bei Bedarf können die
Verbindungen als ein Gel formuliert werden, das intranasal aufgebracht
wird. Formulierungen zur parenteralen Verabreichung können auch
Glycocholat zur bukkalen Verabreichung beinhalten.
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Die
Zusammensetzung des Liposoms ist gewöhnlich eine Kombination aus
Phospholipiden, vor allem High-Phase-Übergangstemperatur-Phospholipide,
gewöhnlich
in Kombination mit Steroiden, insbesondere Cholesterol. Es können auch
andere Phospholipide oder andere Lipide verwendet werden. Die physikalischen Charakteristiken
von Liposomen sind vom pH-Wert, der Ionenstärke und der Anwesenheit bivalenter
Kationen abhängig.
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Beispiele
für Lipide,
die in der Liposomenproduktion von Nutzen sind, sind Phosphatidylverbindungen wie
Phosphatidylglycerol, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin,
Sphingolipide, Cerebroside und Ganglioside. Besonders nützlich sind
Diacylphosphatidylglycerole, bei denen der Lipidanteil 14-18 Kohlenstoffatome,
insbesondere 16-18 Kohlenstoffatome, enthält und gesättigt ist. Illustrative Phospholipide
sind u.a. Ei-Phosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin und
Distearoylphosphatidylcholin.
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Das
Targeting von Liposomen wurde auf der Basis anatomischer und mechanistischer
Faktoren klassifiziert. Die anatomische Klassifizierung beruht auf
dem Grad an Selektivität,
zum Beispiel organspezifisch, zellspezifisch und organellenspezifisch.
Das mechanistische Targeting kann danach unterschieden werden, ob es
passiv oder aktiv ist. Passives Targeting nutzt die natürliche Tendenz
von Liposomen zur Verbreitung an Zellen des retikuloendothelialen
Systems (RES) in Organen, die Sinusoidkapillaren enthalten. Aktives
Targeting beinhaltet hingegen die Umänderung des Liposoms durch
Koppeln des Liposoms an einen spezifischen Liganden, wie einen monoklonalen
Antikörper,
Zucker, Glycolipid oder Protein, oder durch Verändern der Zusammensetzung oder
Größe des Liposoms,
um ein Targeting zu anderen Organen und Zelltypen als den natürlich vorkommenden
Lokalisierungsstellen zu erreichen.
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Die
Oberfläche
des targetierten Zuführungssystems
kann auf vielfältige
Weise modifiziert werden. Im Falle eines liposomalen targetierten
Zuführungssystems
können
Lipidgruppen in die Lipid-Bilayer des Liposoms eingebaut werden,
um den Targeting-Liganden in einer stabilen Verbindung mit der liposomalen
Bilayer zu halten.
Verschiedene Verknüpfungsgruppen können zum
Verbinden der Lipidketten mit dem Targeting-Liganden verwendet werden.
Im Allgemeinen sind die an die Oberfläche des targetierten Zuführungssystems
gebundenen Verbindungen Liganden und Rezeptoren, die es dem targetierten
Zuführungssystem
ermöglichen,
die gewünschten
Zellen zu finden und sich auf diese „zu richten". Ein Ligand kann
eine beliebige Verbindung von Interesse sein, die sich an eine andere
Verbindung wie einen Rezeptor bindet.
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Die
therapeutischen Agenzien, die im Anwendungsbereich der Erfindung
von Nutzen sind, können
parenteral durch Injektion oder allmähliche Perfusion über einen
Zeitraum verabreicht werden. Die Verabreichung kann intravenös, intraperitoneal,
intramuskulär,
subkutan, intrakavitär
oder transdermal erfolgen.
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Zu
Präparaten
für die
parenterale Verabreichung gehören
sterile wässrige
oder nichtwässrige
Lösungen,
Suspensionen und Emulsionen. Beispiele für nichtwässrige Lösungsmittel sind Propylenglykol,
Polyethylenglykol, Pflanzenöle
wie Olivenöl
und injizierbare organische Ester wie Ethyloleat. Zu wässrigen
Trägern
gehören
Wasser, alkoholische/wässrige
Lösungen,
Emulsionen oder Suspensionen, einschließlich Salzlösung und gepuffertes Medium.
Zu parenteralen Vehikeln gehören
Natriumchloridlösung,
Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, Ringer-Laktat intravenöse Vehikel
sind u.a. [sic] Fluid- und Nährstoffregenerierungslösungen,
Elektrolytregenerierungslösungen
(z.B. solche auf der Basis von Ringer-Dextrose) und dergleichen.
Konservierungsstoffe und andere Zusätze können ebenfalls vorliegen, wie
zum Beispiel antimikrobielle Mittel, Antioxydationsmittel, Chelatbildner
und inerte Gase und dergleichen.
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Die
Erfindung beinhaltet außerdem
eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame
Menge von Tβ4
oder einer Tβ4-Isoform
in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst. Zu solchen Trägern gehören die
oben in Bezug auf die parenterale Verabreichung aufgeführten.
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Die
konkrete Dosis des Reagens, der Formulierung oder Zusammensetzung,
das/die einen Gewebereparaturprozess, eine fibrotische Störung, eine
sklerotische Störung,
eine Zellvermehrungsstörung
oder die Wundheilung moduliert, ist von vielen Faktoren abhängig, einschließlich der
Größe und des
Gesundheitszustands eines Individuums. Die allgemein fachkundige
Person kann jedoch die folgenden Lehren, die die Verfahren und Techniken
zur Bestimmung klinischer Dosierungen beschreiben (Spilker B., Guide
to Clinical Studies and Developing Protocols, Raven Press Books,
Ltd., New York, 1984, S. 7-13, 54-60; Spilker B., Guide to Clinical
Trials, Raven Press, Ltd., New York, 1991, S. 93-101; Craig C. und R. Stitzel, Hrsg.,
Modern Pharmacology, 2. Ausgabe, Little, Brown und Co., Boston,
1986, S. 127-33; T. Speight, Hrsg., Avery's Drug Treatment: Principles and Practice
of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3.
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Ausgabe,
Williams und Wilkins, Baltimore, 1987, S. 50-56; R. Tallarida, R.
Raffa und P. McGonigle, Principles in General Pharmacology, Springer-Verlag,
New York, 1988, S. 18-20) oder zum Bestimmen der geeigneten zu verwendeten
Dosierung verwenden.
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Antikörper, die sich an Tβ4 binden
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Antikörper gegen
Tβ4-Peptid
oder Fragmente könnten
als Diagnoseinstrumente nützlich
sein, um den Nachweis von Krankheiten zu unterstützen, bei denen Tβ4 ein pathologischer
Faktor ist. Ferner ist die Verwendung von Antikörpern, die sich an Tβ4 binden
und die Wirkungen von Tβ4
inhibieren oder verhindern, in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
In therapeutischer Hinsicht könnten
Antikörper
oder Fragmente des Antikörpermoleküls auch
zum Neutralisieren der biologischen Aktivität von Tβ4 bei Krankheiten verwendet werden,
bei denen Tβ4 überexprimiert
ist. Solche Antikörper
können
ein Epitop von Tβ4
oder Fragmente davon erkennen, das für die Antikörpererkennung und Neutralisation
der Tβ4-Aktivität geeignet
ist. Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff „Epitop" bezieht sich auf
eine Antigendeterminante auf einem Antigen, wie ein Tβ4-Peptid,
an die sich das Paratop eines Antikörpers, wie ein Tβ4-spezifischer
Antikörper,
bindet. Antigendeterminanten bestehen gewöhnlich aus chemisch aktiven
Oberflächengruppierungen
von Molekülen, wie
Aminosäuren
oder Zuckerseitenketten, und können
spezifische dreidimensionale Strukturcharakteristiken sowie spezifische
Ladungscharakteristiken haben.
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Die
Herstellung eines Antikörpers
setzt einen im Wesentlichen gereinigten Anteil voraus, der eine
Antigendeterminante liefern kann. Der hierin verwendete Begriff „im Wesentlichen
rein" bezieht sich
auf Tβ4
oder Varianten davon, das/die im Wesentlichen frei von anderen Proteinen,
Lipiden, Kohlenhydraten oder anderen Materialien ist/sind, mit denen
es/sie naturbedingt assoziiert ist/sind. Im Wesentlichen gereinigt
oder „isoliert" bezieht sich auf
Moleküle,
entweder Nuclein- oder Aminosäuresequenzen,
die aus ihrer natürlichen
Umgebung entfernt, isoliert oder separiert werden und wenigstens
zu 60 %, vorzugsweise 75 % und am bevorzugtesten zu 90 % frei von
anderen Komponenten sind, mit denen sie naturbedingt assoziiert
sind. Die fachkundige Person kann Tβ4 oder eine Tβ4-Isoform
mit Standardtechniken zur Proteinreinigung isolieren. Das im Wesentlichen
reine Peptid erzielt eine einzelne Hauptbande auf einem nicht reduzierenden
Polyacrylamidgel. Die Reinheit des Tβ4-Peptids kann auch anhand einer
aminoterminalen Aminosäuresequenzanalyse
bestimmt werden. Tβ4
oder ein Tβ4-Isoformpeptid
beinhaltet funktionelle Fragmente des Peptids, solange die Aktivität von Tβ4 oder einer
Tβ4-Isoform
bestehen bleibt. Kleinere Peptide mit der biologischen Aktivität von Tβ4 oder einer Tβ4-Isoform
sind in der Erfindung eingeschlossen. Der in der vorliegenden Erfindung
verwendete Begriff „Antikörper" beinhaltet zusätzlich zu
konventionellen Antikörpern
Proteinfragmente, die das Tβ4-Protein
oder Varianten davon spezifisch erkennen und binden können. Regionen
des Gens, die sich auf Proteinebene unterscheiden, sind gut definiert.
Ein Protein kann durch die Expression des Wildtyp-(wt)-Gens oder
Varianten oder, vorzugsweise, Fraktionen davon angehoben werden.
Die Nucleinsäuresequenz
kann zum Beispiel in Expressionsvektoren kloniert werden. Gemäß dieser
Ausgestaltung kann die Sequenz von Interesse zunächst durch PCR wie oben beschrieben
oder von einer synthetischen Genkonstruktion mit überlappenden
und ligierten synthetischen Oligonucleotiden erhalten werden. Eine
weitere Alternative würde
die Synthese eines kurzen Peptids beinhalten. Alle diese Methodiken
sind der fachkundigen Person gut bekannt (siehe z.B. Ausubel et al.,
CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Band 1 und 2 (1987), mit
Anlagen, und Maniatis et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL,
Cold Spring Harbor Laboratory, die hier durch Bezugnahme eingeschlossen
sind).
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Die
Erfindung stellt ein Verfahren für
den Nachweis von Tβ4
oder Varianten davon bereit, das das Inkontaktbringen eines Anti-Tβ4-Antikörpers mit
einer Probe, die vermutlich Tβ4
enthält
(z.B. Zelle oder Protein), und das Nachweisen der Bindung an den
Antikörper
umfasst. Ein Antikörper,
der sich an das Tβ4-Peptid
bindet, wird mit einer Verbindung markiert, die den Nachweis der
Bindung an Tβ4
ermöglicht.
Es gibt viele verschiedene Marker und Markierungsverfahren, die
der durchschnittlichen Fachperson bekannt sind. Beispiele für die Markertypen,
die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind
Enzyme, Radioisotope, fluoreszierende Verbindungen, Kolloidmetalle,
chemilumineszierende Verbindungen, phosphoreszierende Verbindungen
und biolumineszierende Verbindungen. Die durchschnittliche Fachperson
wird andere geeignete Marker zum Binden an den Antikörper kennen
oder diese durch routinemäßiges Experimentieren
ermitteln können.
Für die
Zwecke der Erfindung kann ein für
das Tβ4-Peptid spezifischer
Antikörper
verwendet werden, um den Anteil von Tβ4 in biologischen Fluids und
Geweben festzustellen. Es kann jedes beliebige Testmaterial verwendet
werden, das eine nachweisbare Antigenmenge enthält. Der Anteil von Tβ4 in der
verdächtigen
Zelle kann mit dem Anteil in einer normalen Zelle verglichen werden,
um zu bestimmen, ob das Invididuum für eine Tβ4-assoziierte Zunahme der Angiogenese
oder Wundheilung veranlagt ist.
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Die
Verwendung von Antikörpern
für die
Diagnoseverfahren der Erfindung beinhaltet zum Beispiel Immunoassays,
in denen die Antikörper
in flüssiger
Phase oder gebunden an einen Festphasenträger verwendet werden können. Darüber hinaus
können
die Antikörper
in diesen Immunoassays auf vielfältige
Weise nachweisbar markiert werden. Beispiele für Immunoassaytypen, in denen
Antikörper
der Erfindung verwendet werden können,
sind kompetitive und nichtkompetitive Immunoassays im direkten oder
indirekten Format. Beispiele für
solche Immunoassays sind der Radioimmunoassay (RIA) und der Sandwich-(immunometrische)-Assay. Der Nachweis
von Antigenen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper kann mit Immunoassays erfolgen,
die entweder im Vorwärts-,
Rückwärts- oder
simultanen Modus ablaufen, einschließlich immunhistochemischer
Assays an physiologischen Proben. Die Fachperson wird andere Immunoassayformate
kennen oder kann diese ohne unnötiges
Experimentieren ohne weiteres ermitteln.
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Tβ4-Antikörper können an
viele verschiedene Träger
gebunden und dazu verwendet werden, die Anwesenheit eines Antigens
nachzuweisen, das das erfindungsgemäße Peptid umfasst. Zu Beispielen
für allgemein
bekannte Träger
gehören
Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen,
natürliche
und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetit.
Der Träger
kann im Hinblick auf die Erfindung entweder löslich oder unlöslich sein.
Die Fachperson wird andere geeignete Träger zur Bindung von Antikörpern kennen
oder diese durch routinemäßiges Experimentieren
ermitteln können.
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Eine
weitere Technik, die auch eine höhere
Sensitivität
zur Folge haben kann, umfasst das Koppeln der Antikörper mit
Haptenen von geringer relativer Molekülmasse. Diese Haptene können dann
mit Hilfe einer zweiten Reaktion spezifisch nachgewiesen werden.
Normalerweise werden zum Beispiel Haptene wie Biotin verwendet,
das mit Avidin reagiert, oder Dinitrophenyl, Puridoxal und Fluorescein,
die mit spezifischen Antihapten-Antikörpern reagieren
können.
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Die
Erfindung beinhaltet die Verwendung von Antikörpern, die mit Tβ4-Peptid
oder funktionellen Fragmenten davon immunoreaktiv sind. Es werden
Antikörper,
die im Wesentlichen aus gepoolten monoklonalen Antikörpern mit
verschiedenen epitopischen Spezifitäten bestehen, sowie bestimmte
monoklonale Antikörperpräparate bereitgestellt.
Monoklonale Antikörper
werden aus antigenhaltigen Fragmenten des Proteins durch Verfahren
erzeugt, die der Fachperson allgemein bekannt sind (Kohler, et al.,
Nature, 256:495, 1975). Der in dieser Erfindung verwendete Begriff
Antikörper
beinhaltet intakte Moleküle
sowie Fragmente davon, wie Fab und F(ab')2, Fv und SCA
Fragmente, die eine epitopische Determinante auf Tβ4 binden
können.
- (1) Ein Fab-Fragment besteht aus einem monovalenten
antigenbindenden Fragment eines Antikörpermoleküls und kann durch den Verdau
eines ganzen Antikörpermoleküls mit dem
Enzym Papain produziert werden, um ein Fragment zu erhalten, das
aus einer intakten leichten Kette und einem Teil einer schweren
Kette besteht.
- (2) Ein Fab'-Fragment
eines Antikörpermoleküls kann
erhalten werden durch Behandeln eines ganzen Antikörpermoleküls mit Pepsin,
gefolgt von einer Reduktion, um ein Molekül zu erhalten, das aus einer
intakten leichten Kette und einem Teil einer schwere Kette besteht.
Zwei Fab'-Fragmente
werden pro Antikörpermolekül erhalten,
das auf diese Weise behandelt wird.
- (3) Ein (Fab')2-Fragment eines Antikörpers kann erhalten werden
durch Behandeln eines ganzen Antikörpermoleküls mit dem Enzym Pepsin, ohne
nachfolgende Reduktion. Ein (Fab')2-Fragment ist ein Dimer von zwei Fab'- Fragmenten, die durch zwei Disulfidbindungen
zusammengehalten werden.
- (4) Ein Fv-Fragment ist als ein gentechnisch bearbeitetes Fragment
definiert, das die variable Region einer leichten Kette und die
variable Region einer schweren Kette enthält, exprimiert als zwei Ketten.
- (5) Ein einkettiger Antikörper
(„SCA") ist ein gentechnisch
bearbeitetes einkettiges Molekül,
das die variable Region einer leichten Kette und die variable Region
einer schweren Kette enthält,
die durch einen geeigneten flexiblen Polypeptidlinker verknüpft sind.
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Alternativ
kann ein therapeutisch oder diagnostisch nützlicher Anti-Tβ4-Antikörper von
einem „humanisierten" monoklonalen Antikörper gewonnen
werden. Humanisierte monoklonale Antikörper werden durch Transferieren
von Maus-„complementary
determining regions" von
schweren und leichten variablen Ketten des Mausimmunglobulins in
eine humane variable Domäne
und dann Substituieren humaner Rückstände in den Gerüstregionen
der murinen Entsprechungen produziert. Durch die Verwendung von
Antikörperkomponenten, die
von humanisierten monoklonalen Antikörpern gewonnen werden, werden
potentielle Probleme in Verbindung mit der Immunogenität muriner
konstanter Regionen umgangen. Allgemeine Techniken zum Klonieren variabler
Domänen
von murinem Immunglobulin werden zum Beispiel von Orlandi et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833 (1989) beschrieben, das hiermit
in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Techniken
zur Herstellung humanisierter monoklonaler Antikörper werden zum Beispiel von
Jones et al., Nature 321: 522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:
323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988); Carteret
al., Proc. Nat'l
Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992); Sandhu, Crit. Rev. Biotech 12: 437
(1992); und Singer et al., J. Immunol. 150: 2844 (1993) beschrieben,
die hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
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Erfindungsgemäße Antikörper können außerdem von
humanen Antikörperfragmenten
gewonnen werden, die von einer kombinatorischen Immunglobulinbibliothek
isoliert werden (siehe z.B. Barbas et al., METHODS: A COMPANION
TO METHODS IN ENZYMOLOGY, BD. 2, Seite 119 (1991); Winter et al.,
Ann. Rev. Immunol. 12: 433 (1994), die hiermit durch Bezugnahme
eingeschlossen sind). Klonierungs- und Expressionsvektoren, die
zur Herstellung einer humanen Immunglobulin-Phagenbibliothek nützlich sind, können zum
Beispiel von STRATAGENE Cloning Systems (La Jolla, CA) erhalten
werden.
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Verfahren und Zusammensetzungen
zur Behandlung oder Diagnose von Tβ4-assoziierten Störungen
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In
einer anderen Ausgestaltung der Erfindung wird ein Mittel zur Diagnose
eines pathologischen Zustands in einem Individuum mit Verdacht auf
eine Pathologie, die durch eine Störung in Verbindung mit Tβ4 charakerisiert
ist, bereitgestellt. Der Anwendungsbereich beinhaltet das Bestimmen
des Anteils von Tβ4
in einer Probe, die vermutlich Tβ4
enthält,
von dem Individuum und Vergleichen des Anteils von Tβ4 in der
Probe mit dem Anteil von Tβ4
in einer normalen Standardprobe. Solche Bedingungen schließen unter
anderem Individuen mit Zellvermehrungsstörungen, wiederkehrenden Wunden,
Gewebereparaturstörungen,
fibrotischen Gewebestörungen,
chronischen Geschwüren
und anderen hierin beschriebenen Störungen ein. Solche Störungen beinhalten
ferner solche in Verbindung mit den verschiedenen Tβ4-Isoformen,
die bekannt oder noch nicht identifiziert sind.
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Der
Begriff „Zellvermehrungsstörung" betrifft maligne
sowie nicht maligne Zellpopulationen, die sich oft vom umliegenden
Gewebe sowohl morphologisch als auch genotypisch zu unterscheiden
scheinen. Maligne Zellen (d.h. Krebs) entstehen infolge eines Mehrschrittprozesses.
Solche Störungen
können
mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden.
Zum Beispiel wird eine Probe, die vermutlich Tβ4 enthält, von einem Individuum erhalten,
der Anteil von Tβ4-Peptid
wird bestimmt und mit dem Anteil von Tβ4-Peptid in einer normalen Gewebeprobe
verglichen. Der Anteil von Tβ4
kann mit einer Reihe von Verfahren bestimmt werden, wie zum Beispiel
mit einem Immunoassay unter Verwendung von Anti-Tβ4-Peptid-Antikörpern. Andere
Variationen solcher Assays sind der Radioimmunoassay (RIA), ELISA
und Immunfluoreszenz. Alternativ können Nucleinsäuresonden
für den
Nachweis und die Quantifizierung von Tβ4-Peptid mRNA für denselben Zweck
verwendet werden. Solche Nachweisverfahren sind in der Technik Standard.
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In
einer anderen Ausgestaltung stellt die Erfindung ein Mittel zur
Linderung einer Wundheilungsstörung
in Verbindung mit Tβ4
oder einer Tβ4-Isoform
unter Verwendung einer Zusammensetzung bereit, die die Tβ4 Aktivität reguliert.
Der Begriff „lindern" bedeutet eine Verringerung
des nachteiligen Effektes der krankheitsauslösenden Reaktion in dem die
Therapie empfangenden Individuum. Ist die Krankheit die Folge eines unnormal
hohen Tβ4-Anteils,
dann kann die Verabreichung eines Agens, wie z.B. ein Antagonist
der Tβ4-Aktivität, den Grad
an Tβ4-Aktivität wirksam
verringern. Ist die Krankheit hingegen die Folge eines unnormal
geringen Tβ4-Anteils,
dann kann die Verabreichung von Tβ4
oder eines Agens, das die Tβ4-Aktivität erhöht, wie zum
Beispiel ein Agonist, den Grad an Tβ4-Aktivität wirksam erhöhen.
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In
noch einer anderen Ausgestaltung stellt die Erfindung ein Mittel
zur Behandlung eines Individuums mit einer Wundheilungsstörung bereit,
die durch wiederkehrende oder langsam heilende Wunden oder durch chronische,
nicht heilende Wunden in Verbindung mit einer veränderten
Tβ4- oder Tβ4-Isoform-Genexpression
in einem Individuum gekennzeichnet ist. Eine wirksame Wundheilungsmenge
eines Agens zur Modulierung der Tβ4-Genexpression
wird einem Individuum mit der Störung
verabreicht, wodurch die Störung
behandelt wird. Der Begriff „modulieren" betrifft die Inhibition
oder Unterdrückung
der Tβ4-Expression,
wenn Tβ4 überexprimiert
ist, und die Expressionsinduktion, wenn Tβ4 unterexprimiert ist. Der Begriff „wirksame
Wundheilungsmenge" bezieht
sich auf die Menge des Tβ4-Agens, die die Tβ4-Genexpression
wirksam moduliert, woraus sich die Reduzierung der Symptome der
mit Tβ4
assoziierten Wundheilungsstörung
ergibt.
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Ein
Agens, das die Tβ4-
oder Tβ4-Isoform-Genexpression
moduliert, kann zum Beispiel ein Polynucleotid sein. Das Polynucleotid
kann eine Antisense-Struktur, ein Triplex-Agens oder ein Ribozym sein. Es kann zum
Beispiel die Antisense verwendet werden, die auf die strukturelle
Genregion oder die Promotorregion von Tβ4 gerichtet sein kann.
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Ist
eine Wundheilungsstörung
mit der Expression von Tβ4
verbunden, dann ist ein therapeutischer Ansatz möglich, der die Translation
der Tβ4
mRNA in Protein direkt beeinflusst. Zum Beispiel kann eine Antisense-Nucleinsäure oder
ein Ribozym zum Binden an die Tβ4
RNA oder um sie zu spalten, verwendet werden. Antisense-RNA- oder
-DNA-Moleküle binden
sich spezifisch an die RNA-Botschaft eines targetierten Gens, wobei
die Expression des Proteinsprodukts dieses Gens unterbrochen wird.
Die Antisense bindet sich an die mRNA und bildet ein doppelsträngiges Molekül, das von
der Zelle nicht translatiert werden kann. Antisense-Oligonucleotide
mit etwa 15-25 Nucleotiden werden bevorzugt, da sie ohne weiteres
synthetisiert werden können und
einen Inhibitionseffekt genau wie Antisense-RNA-Moleküle haben.
Darüber
hinaus können
chemisch reaktive Gruppen wie eisenverknüpfte Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA-Fe)
an ein Antisense-Oligonucleotid angelagert werden, wodurch es zu
einer Spaltung der RNA am Ort der Hybridisierung kommt. Diese und
andere Anwendungsbereiche für
Antisense-Verfahren zur Inhibition der In-vitro-Translation von
Genen sind in der Technik allgemein bekannt (Marcus-Sakura, Anal.,
Biochem., 172:289, 1988).
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Antisense-Nucleinsäuren sind
DNA- oder RNA-Moleküle,
die zu wenigstens einem Teil eines spezifischen mRNA Moleküls komplementär sind (Weintraub,
Scientific American, 262:40, 1990). In der Zelle hybridisieren die
Antisense-Nucleinsäuren mit
der entsprechenden mRNA und bilden ein doppelsträngiges Molekül. Die Antisense-Nucleinsäuren beeinflussen
die Translation der mRNA, da die Zelle keine mRNA translatiert,
die doppelsträngig
ist. Antisense-Oligomere
mit etwa 15 Nucleotiden werden bevorzugt, da sie ohne weiteres synthetisiert
werden können
und weniger wahrscheinlich Probleme hervorrufen als größere Moleküle, wenn
sie in die Tβ4
produzierende Targetzelle eingeführt
werden. Die Anwendung von Antisense-Verfahren zur Inhibition der
In-vitro-Translation von Genen ist in der Technik allgemein bekannt
(Marcus-Sakura, Anal. Biochem., 172:289, 1988).
-
Die
Verwendung eines Oligonucleotids zum Aufhalten der Transkription
ist als Triplex-Strategie bekannt, da sich das Oligomer um eine
Doppelhelix-DNA windet und eine dreisträngige Helix bildet. Folglich
können
diese Triplex-Verbindungen
so gestaltet werden, dass sie einen einmaligen Ort auf einem ausgewählten Gen
erkennen (Maker, et al., Antisense Res. and Dev., 1(3):227, 1991;
Helene, C., Anticancer Drug Design, 6 (6) :569, 1991).
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Ribozyme
sind RNA-Moleküle
mit der Fähigkeit,
spezifisch andere einzelsträngige
RNAs in einer Weise zu spalten, die analog zu DNA-Restriktionsendonucleasen
ist. Durch die Modifikation von Nucleotidsequenzen, die diese RNAs
kodieren, können
Moleküle
konstruiert werden, die spezifische Nucleotidsequenzen in einem
RNA-Molekül
erkennen und es spalten [sic] (Cech, J. Amer. Med. Assn., 260:3030,
1988). Ein Hauptvorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass, da
sie sequenzspezifisch sind, nur mRNAs mit bestimmten Sequenzen inaktiviert
werden.
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Es
gibt zwei grundlegende Typen von Ribozymen, nämlich den Tetrahymena-Typ (Hasselhoff,
Nature, 334:585, 1988) und den „Hammerkopf"-Typ. Ribozyme des
Tetrahymena-Typs erkennen Sequenzen mit einer Länge von vier Basen, wohingegen „Hammerkopf"-Ribozyme Basensequenzen
mit 11-18 Basen Länge
erkennen. Je länger
die Erkennungssequenz ist, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit,
dass die Sequenz ausschließlich
in der mRNA-Zielgattung auftritt.
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Diese
und andere Anwendungsbereiche von Antisense-Verfahren zur Inhibition der In-vivo-Translation von
Genen sind in der Technik allgemein bekannt (z.B. De Mesmaeker,
et al., 1995; Backbone modifications in oligonucleotides and peptide
nucleic acid systems; Curr. Opin. Struct. Biol. 5:343-355; Gewirtz,
A.M., et al., 1996b; Facilitating delivery of antisense oligodeoxynucleotides:
Helping antisense deliver on its promise; Proc. Natl. Acad Sci.
U.S.A. 93:3161-3163; Stein, C.A. A discussion of G-tetrads 1996;
Exploiting the potential of antisense: beyond phosphorothioate oligodeoxynucleotides;
Chem. and Biol. 3:319-323).
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Die
Zuführung
von Antisense, Triplex-Agenzien, Ribozymen, kompetitiven Inhibitoren
und dergleichen kann unter Verwendung eines rekombinanten Expressionsvektors,
wie einem chimären
Virus oder einem kolloiden Dispersionssystem, erreicht werden. Verschiedene
virale Vektoren, die für
die hierin gelehrte Gentherapie verwendet werden können, sind
das Adenovirus, Herpesvirus, Vakziniavirus oder, vorzugsweise, ein RNA-Virus
wie ein Retrovirus. Vorzugsweise ist der retrovirale Vektor ein
Derivat eines murinen oder aviären Retrovirus.
Beispiele für
retrovirale Vektoren, in die ein einzelnes Fremdgen eingesetzt werden
kann, sind unter anderem: das Moloney Murine Leukemia Virus (MoMuLV),
Harvey Murine Sarcoma Virus (HaMuSV), Murine Mammary Tumor Virus
(MuMTV) und Rous Sarcoma Virus (RSV). Eine Reihe zusätzlicher
retroviraler Vektoren kann mehrere Gene beinhalten. Alle diese Vektoren
können
ein Gen für
einen selektierbaren Marker transferieren oder aufnehmen, so dass
transduzierte Zellen identifiziert und erzeugt werden können. Durch Einsetzen
einer Polynucleotidsequenz von Interesse in den Virusvektor zusammen
mit einem anderen Gen, das den Liganden für einen Rezeptor auf einer
spezifischen Targetzelle kodiert, ist der Vektor jetzt zum Beispiel targetspezifisch.
Retrovirale Vektoren können
targetspezifisch gemacht werden, indem zum Beispiel ein Polynucleotid
eingesetzt wird, das einen Zucker, ein Glykolipid oder ein Protein
kodiert.
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Vorzugsweise
wird das Targeting durch die Verwendung eines Antikörpers zum
Targetieren des retroviralen Vektors erreicht. Die Fachperson wird
spezifische Polynucleotidsequenzen kennen oder ohne unnötiges Experimentieren
ohne weiteres ermitteln können,
die in das retrovirale Genom eingesetzt werden können, um eine targetspezifische
Zuführung
des retroviralen Vektors zu ermöglichen,
der das Antisense-Polynucleotid enthält.
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Da
rekombinante Retroviren defekt sind, benötigen sie zur Produktion infektiöser Vektorpartikel
Unterstützung.
Diese Unterstützung
kann zum Beispiel durch die Verwendung von Helfer-Zelllinien geleistet
werden, die Plasmide enthalten, die alle Strukturgene des Retrovirus
unter der Kontrolle von Regulationssequenzen innerhalb der LTR kodieren.
Diesen Plasmiden fehlt eine Nucleotidsequenz, die es dem Verpackungsmechanismus
ermöglicht,
ein RNA-Transkript
zur Enkapsidierung zu erkennen. Zu Helfer-Zelllinien mit Deletionen des Verpackungssignals
gehören
unter anderem zum Beispiel Ψ2,
PA317 und PA12. Diese Zelllinien produzieren leere Virionen, da
kein Genom verpackt wird. Wird ein retroviraler Vektor in solche
Zellen eingebracht, in denen das Verpackungssignal intakt ist, die
Strukturgene jedoch durch andere Gene von Interesse ersetzt sind,
dann kann der Vektor verpackt und das Vektorvirion produziert werden.
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Alternativ
können
NIH 3T3 oder andere Gewebekulturzellen direkt mit Plasmiden, die
die retroviralen Strukturgene gag, pol und env kodieren, durch konventionelle
Calciumphosphattransfektion transfiziert werden. Diese Zellen werden
dann mit dem Vektorplasmid transfiziert, das die Gene von Interesse
enthält.
Die resultierenden Zellen geben den retroviralen Vektor in das Kulturmedium
frei.
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Ein
targetiertes Zuführungssystem
zur Zuführung
von Nucleinsäuren,
wie hierin beschrieben, beinhaltet ein kolloides Dispersionssystem.
Kolloide Dispersionssysteme beinhalten Makromolekülkomplexe,
Nanokapseln, Mikrosphären,
Kügelchen,
genaktivierte Matrizen und Systeme auf Lipidbasis, einschließlich Öl-in-Wasser-Emulsionen,
Mizellen, Mischmizellen und Liposome. Das bevorzugte kolloide System
der vorliegenden Erfindung ist ein Liposom. Liposome sind künstliche
Membranvesikel, die als Zuführungsvehikel
in vitro und in vivo von Nutzen sind. Es hat sich gezeigt, dass
große
unilamellare Vesikel (LUV) mit einer Größe von 0,2 bis 4,0 μm einen beträchtlichen
prozentualen Anteil eines wässrigen
Puffers, der große Makromoleküle enthält, einkapseln
können.
RNA, DNA und intakte Virione können
im wässrigen
Inneren eingekapselt und in biologisch aktiver Form Zellen zugeführt werden
(Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). Neben Säugetierzellen
werden Liposome zur Zuführung
von Polynucleotiden in Pflanzen-, Hefe- und Bakterienzellen verwendet.
Damit ein Liposom ein effizientes Gentransfervehikel ist, müssen die
folgenden Charakteristiken vorliegen: (1) hocheffiziente Einkapselung
der Gene von Interesse, während
gleichzeitig ihre biologische Aktivität nicht gefährdet wird; (2) bevorzugte
und wesentliche Bindung an eine Targetzelle im Vergleich zu Nichttargetzellen;
(3) hocheffiziente Zuführung
des wässrigen
Inhalts des Vesikels zum Targetzellzytoplasma; und (4) genaue und
effektive Expression genetischer Informationen (Mannino, et al.,
Biotechniques, 6:682, 1988).
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In
pathologischer Hinsicht kann Tβ4
in Krankheiten involviert sein, bei denen es ein übermäßiges Wachstum
von Blutgefäßen gibt,
wie z.B. Krebs, Tumorbildung und -wachstum, diabetische Retinopathie,
neovaskuläres
Glaukom, Rheumatoidarthritis und Psoriasis.
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Das
Einwachsen von Kapillaren und Nebenblutgefäßen ist für das Wachstum solider Tumore
wesentlich und somit eine unerwünschte
physiologische Reaktion, die die Ausbreitung von malignem Gewebe
und Metastasen erleichtert. Die Inhibition der Angiogenese und des
resultierenden Wachstums von Kapillaren und Blutgefäßen ist
daher eine Komponente einer wirksamen Behandlung von Malignität bei der
Behandlung von Krebspatienten.
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In
einer anderen Ausgestaltung stellt die Erfindung daher ein Mittel
zum Inhibieren von Angiogenese in einem Individuum unter Verwendung
einer Zusammensetzung bereit, die ein Agens enthält, das die Tβ4 Aktivität reguliert.
Die Zusammensetzung kann Agenzien enthalten, die eine Angiogenese
regulieren, wie zum Beispiel Agenzien, die Thymosin αl, PDGF,
VEGF, IGF, FGF und TGFβ beeinflussen.
Die Inhibition einer Angiogenese und Endothelzellmigration kann
zum Kontrollieren des Wachstums solider Tumore von Vorteil sein. Die
meisten, wenn nicht alle soliden Tumore benötigen genau wie normales Gewebe
eine stetige und ausreichende Blutversorgung für ein optimales Wachstum. Tumore
machen sich bekanntlich angiogene Wachstumsfaktoren zunutze, um
neue Blutgefäße anzuziehen
und die Versorgung mit ausreichenden Nährstoffmengen zur Beibehaltung
ihres Wachstums sicherzustellen. Viele Tumore sind gut vaskularisiert
und die Inhibition des Aufbaus einer angemessenen Blutversorgung
des Tumors durch Inhibieren der Tumorvaskularisation infolge der
Angiogeneseinhibition ist zur Bekämpfung des Tumorwachstums von
Vorteil. Ohne eine gute Blutversorgung kann ein schnelles und andauerndes
Tumorwachstum nicht aufrechterhalten werden. Agenzien, die die Tβ4-Aktivität inhibieren,
können
somit zur Verhinderung von neoplastischem Wachstum verwendet werden. Das
Tβ4-Inhibitionsagens
kann oral, parenteral, topisch, intravenös oder systemisch verabreicht
werden. Außerdem
kann das Agens zur Inhibition der Tumorzellvermehrung und des Tumorwachstums
lokal direkt zum Tumor geführt
oder als Bestandteil einer deponierten langsam freigesetzten Formulierung
verabreicht werden. Die Verabreichung kann täglich so lange wie nötig erfolgen,
um Angiogenese, Endothelzellvermehrung, Tumorzellvermehrung oder
Tumorwachstum zu inhibieren. Alternativ kann eine langsam freigesetzte
Formulierung so lange wie nötig
wirken, um Tumorwachstum zu bekämpfen.
Dieser Dosierungsplan kann so angepasst werden, dass eine optimale
therapeutische Reaktion erreicht wird. Es können zum Beispiel täglich mehrere unterteilte
Dosen verabreicht werden, oder die Dosis kann je nach den Anforderungen
der therapeutischen Situation proportional reduziert werden.
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In
dieser Hinsicht enthalten die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die
als Inhibitoren von Angiogenese, Endothelzellvermehrung, Tumorzellvermehrung
und Tumorwachstum nützlich
sind, einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und eine Menge eines Tβ4 modulierenden
Agens, das die Tumor- oder Endothelzellvermehrung wirksam inhibiert.
Zu solchen Zusammensetzungen können
auch Konservierungsstoffe, Antioxydationsmittel, Immunosuppressoren
und andere biologische und pharmazeutisch wirksame Agenzien gehören, die
sich auf das Tumorwachstum auswirken, die jedoch keine nachteilige
Wirkung auf das Tβ4
modulierende Agens haben. Zur Behandlung von Tumorzellen kann die
Zusammensetzung ein Chemotherapeutikum enthalten, zum Beispiel Antikrebsagenzien,
die selektiv die sich schneller replizierenden Tumorzellen abtöten, von
denen viele bekannt sind und klinisch eingesetzt werden. Zu Antikrebsagenzien
gehören
zum Beispiel Mephalan, Cyclophosphamid, Methotrexat, Adriamycin
und Bleomycin.
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Screening im Hinblick
auf Verbindungen, die Tβ4
Aktivität
modulieren
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In
einer anderen Ausgestaltung stellt die Erfindung ein Verfahren zur
Identifizierung einer Verbindung bereit, die Tβ4-Aktivität, Angiogenese-Aktivität oder Wundheilungsaktivität moduliert.
Das Verfahren beinhaltet das Inkubieren von Komponenten, einschließlich der
Verbindung und Tβ4,
unter Bedingungen, die zur Interaktion der Komponenten ausreichen,
und das Bestimmen der Wirkung der Verbindung auf die Tβ4-Aktivität vor und
nach dem Inkubieren in Anwesenheit der Verbindung. Verbindungen,
die die Tβ4-Aktivität beeinflussen (z.B.
Antagonisten und Agonisten) sind Peptide, Peptidonachahmer, Polypeptide,
chemische Verbindungen, Mineralien wie Zink und biologische Agenzien.
Tβ4-Aktivität kann unter
Anwendung der in den vorliegenden Beispielen beschriebenen Methodik
geprüft
werden.
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Die
vorliegenden Beispiele sollen den Umfang der angefügten Ansprüche illustrieren,
aber nicht beschränken.
Folglich wird die Fachperson eine Reihe äquivalenter Materialien und
Verfahren erkennen, die durch die vorliegende Erfindung und Offenbarung
erfasst sein sollen.
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1. BEISPIEL
-
In-vivo-Wundheilung wird
durch Tβ4
beschleunigt
-
Topisch
oder intraperitoneal verabreichtes Tβ4 beschleunigt die Wundheilung
wesentlich im Vergleich zu unbehandelten Wunden (2 und 3). 8-mm-Punch-Biopsie-Vollhautwunden wurden auf der Rückenoberfläche von
Ratten wie zuvor berichtet (Bhartiya et al., J. Cell. Physiol. 150:312,
1992; Sihhu et al., J. Cell. Physiol. 169:108, 1996) erzeugt und
Tβ4 wurde
zum Zeitpunkt der Verwundung (5 μg
in 50 μl)
und noch einmal nach 48 Stunden topisch verabreicht. Kontrollen
zur topischen Behandlung erhielten identische Mengen an Salzlösung zum
Zeitpunkt der Verwundung und nach 48 Stunden. Weitere Ratten erhielten
intraperitoneale Injektionen zum Zeitpunkt der Verwundung (60 μg in 300 μl) und danach
an jedem zweiten Tag (z.B. Tag 0, 2, 4 und 6). Kontrollen zu diesen
Tieren erhielten intraperitoneal identische Mengen an Salzlösung im
Rahmen des gleichen Injektionsplans. Am 4. und 7. Tag nach der Verwundung
wurde die Wundgröße gemessen.
Am 8. und 9. Tag nach der Verwundung wurde Gewebe entnommen und
in 10%igem gepufferten Formalin fixiert. Die Proben wurden zerschnitten
und mit H&E und
Masson'schem Trichrom
(American Histolabs, Gaithersburg, MD) gefärbt.
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Histologische
Sektionen wurden verwendet, um die Reepithelialisierung und die
Kontraktion der Wunde mit einem Okularmikrometer zu messen. Die
epidermale Migration wurde durch Messen der Länge der Epithelgewebezungen
bestimmt, die von den jeweiligen Seiten der Wunde über das
Wundbett von der Proliferationszone am Rand der nicht verletzten
und verwundeten Haut migrierten. Die Epidermisdicke wurde ebenfalls gemessen,
beginnend an der Verbindungstelle der nicht verletzten und proliferierenden
Epidermis. Die Dicke wurde vertikal von der Basalmembran zur oberflächlichsten
Lage der migrierenden Epidermis alle 200 Mikron gemessen. Anschließend wurde
die mittlere Epidermisdicke jeder migrierenden Epidermiszunge von
jeder Wunde berechnet. Es fanden Gefäßzählungen statt, indem zuerst
Gefäßräume anhand
ihrer Endothelauskleidung ermittelt wurden. Alle diese Gefäße im Wundbett
wurden gezählt,
einschließlich
solcher an der Verbindung von Dermis und Subkutis, da eine Angiogenese
in die Wunden in hohem Maße
von diesen Gefäßen stattfindet.
Die Zahlen wurden zu Gefäßanzahlen
pro 10 stark vergrößerter Felder
(40 x) gemittelt.
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Die
Wirkung von Tβ4
auf die Wundheilung wurde in einem Modell einer kutanen Rattenvollhautwunde untersucht. 1 zeigt
ein Schaubild der Wundstelle, die von der Epidermis zur Fett-/Muskelschicht
verläuft. Dieses
Modell lässt
die Messung von zwei Parametern zu: die Reepithelialisierung (Spalt)
und die Kontraktion (Breite) der Wunde. Wunden, die topisch mit
Tβ4 behandelt
wurden, wiesen einen Rückgang
der Breite von etwa 15 % und einen Rückgang des Spalts von etwa
15 % bei den behandelten Ratten gegenüber den Kontrollen auf (jeweils 2 und 3).
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2 zeigt bereits 4 Tage nach der Verwundung
einen Rückgang
der Wundbreite von 15 % im Vergleich zu den Salzlösungskontrollen,
der sich bis zum 7. Tag fortsetzt.
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Die
intraperitoneale Injektion von Tβ4
resultierte am 4. Tag in einem Rückgang
der Wundbreite von 18 % im Vergleich zu den mit Salzlösung behandelten
Kontrollen und am 7. Tag in einem Rückgang von 11 %. Dieser Trend
wurde am 4. Tag nach der Verwundung beobachtet und setzte sich bis
zum 7. Tag fort (*P ≤ 0,0001,
**P ≤ 0,08,
bedeutender Unterschied zu Medium alleine, t-Test nach Student).
Diese Daten zeigen, dass topisch oder systemisch verabreichtes Tβ4 die Wund-Reepithelialisierung
und -Kontraktion erhöht.
Die topische und systemische Behandlung sind gleichermaßen wirksam.
Es wurden geringere Tβ4-Dosen
getestet, wie 2,5 g und 0,5 μg
in 50 μl
für die
topische Behandlung und 30 μg
und 6 μg
in 300 μl
für die
intraperitoneale Injektion, es wurde allerdings jeweils eine reduzierte
oder keine Wirkung auf die Wundheilung beobachtet.
-
3 zeigt bei der topischen Verabreichung
von Tβ4
bereits 4 Tage nach der Verwundung einen Rückgang der Spaltlänge von
18 % gegenüber
den Salzlösungskontrollen.
Dieser Trend setzte sich bis zum Ende am 7. Tag fort (*P ≤ 0,04, t-Test
nach Student). Intraperitoneale Injektionen resultierten in einem
Rückgang
der Spaltgröße von 42
% im Vergleich zu den mit Salzlösung
behandelten Kontrollen. Dieser Rückgang wurde
am 4. Tag nach der Verwundung beobachtet und setzte sich bis zum
7. Tag fort (**P ≤ 0,0007,
t-Test nach Student). Eine Zunahme der Reepithelialisierung wurde
in 7 Tage lang behandelten Wunden beobachtet und die Spaltschließungsgeschwindigkeit
war gegenüber
der am 4. Tag leicht erhöht.
In den mit Tβ4
behandelten Wunden wurde ein Rückgang
der Spaltgröße von 62
beobachtet. Die quantitative Bestimmung der Epidermismigration ergab
eine statistisch bedeutende 1,5fache Zunahme der Migration von Epidermiszungen über das
Wundbett im Anschluss an eine topische Behandlung (Tabelle 1). Die
quantitative Bestimmung der Epithelmigration in intraperitoneal
behandelten Wunden ergab eine statistisch bedeutende Zunahme der
Migration von Epidermiszungen im Vergleich zu den Kontrollen (Tabelle
1). Es gab keinen Unterschied im Hinblick auf die Dicke der migrierenden
Epidermis zwischen den beiden Tβ4-Behandlungen
und der Kontrolle (Tabelle 1). Histologische Sektionen der Wunden
zeigen deutlich eine erhöhte
Reepithelialisierung in den behandelten Wunden im Vergleich zu den
Kontrollen bei 7 Tage alten Wunden (4).
-
-
4 zeigt einen Vergleich zwischen typischen
Kontroll- (D) und mit Tβ4
behandelten (E und F) Sektionen von 7 Tage alten Wunden. Die Behandlung
mit Tβ4
führte
zu einem erheblichen Kapillareinwachsen (4E und
F, Pfeile). Gefäßzählungen
ergaben eine bedeutende (etwa 2fache) Zunahme der Anzahl von Gefäßen in mit
Tβ4 behandelten
Wunden (Tabelle 1). Es wurden keine Zunahmen der Anzahl von Makrophagen in
den Wunden beobachtet. Es gab keine offensichtliche Zunahme der
Ansammlung/Biosynthese von Kollagen in mit Tβ4 behandelten Wunden (5B und C vs A), wodurch eine verringerte
Wundbreite unterstützt
und eine Rolle von Tβ4
in der Wundkontraktion belegt wurde. Die topisch und systemisch
behandelten Wunden hatten ein ähnliches
Aussehen, obschon die Wundkontraktion bei der topischen Behandlung
etwa schneller vonstatten ging.
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Eine
Verringerung der Wundgröße wurde
in beiden Versuchsgruppen im Vergleich zu den Kontrollgruppen beobachtet
(2 – 4).
Mehr und größere Blutgefäße wurden
in den Versuchsgruppen im Vergleich zu den Kontrollen beobachtet
(4). Ferner legt eine Zunahme der
Ansammlung/Biosynthese von Kollagen in mit Tβ4 behandelten Wunden im Vergleich
zur Kontrolle nahe, dass Tβ4
in der Wundkontraktion und extrazellulären Matrixablagerung eine Rolle
spielt. Eine histologische Färbung
dieser Wunden demonstrierte eine Zunahme der Kollagendichte und
extrazellulären
Matrixablagerung im Vergleich zu den Kontrollen (5).
-
2. BEISPIEL
-
Migrationsassays von Keratinozyten
-
Primärkeratinozyten
wurden von neugeborenen Balb/c oder CD-1 Mäusen wie zuvor beschrieben (Dlugosz
et al., 1995) präpariert.
Zellen wurden in calcium- und magnesiumfreiem Eagle Minimal Essential
Medium (EMEM), das 8 % fötales
Kälberserum
enthielt, plattiert, mit 8 % Chelex (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA),
20 Einheiten/ml Penicillin-Streptomycin behandelt, und die Calciumkonzentration
wurde auf 0,25 mM eingestellt. Am nächsten Tag wurden die Kulturen
mit calcium- und magnesiumfreier, phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen,
kurz mit Trypsin (Life Technologies, Gaithersburg, MD) behandelt,
mit Kulturmedium gewaschen und in EMEM, das 0,05 mM Calcium enthielt,
resuspendiert. Die Zellen wurden sofort in Migrationsassays verwendet.
-
Keratinozytenmigrationsassays
wurden in einer Boyden-Kammer
Polyestermembranen mit 12 μm
Poren (Poretics, Livermore, CA) durchgeführt, die mit einer 0,1 mg/ml
Lösung
aus Kollagen IV in dH2O (Trevigen, Gaithersburg,
MD) beschichtet wurden. Die Filter wurden dann mindestens 1 Stunde
lang getrocknet. Zellen wurden mit Versen oder Trypsin (Life Technologies,
Gaithersburg, MD) geerntet und in Eagle Minimal Essential Medium
mit 0,05 mM Ca2+ resuspendiert. Die untere
Kammer wurde mit EMEM, das 0,01, 0,1, 10, 100 und 1000 ng/ml synthetisches
Tβ4 enthielt,
befüllt.
Konditioniertes Medium von primären
Hautfibroblasten und/oder Keratinozytenwachstumsfaktor wurde in
mehrere Wells als positive Kontrolle gegeben. Zellen wurden in die obere
Kammer in einer Konzentration von 50.000 Zellen pro Well gegeben.
Die Kammern wurden 4 bis 5 Stunden lang bei 35 C/7 % CO2 inkubiert,
anschließend
wurden die Filter fixiert und mit Diff-Quik (Baxter Healthcare Corporation,
McGraw Park, IL) gefärbt.
Die durch den Filter migrierenden Zellen wurden durch Zählen der
Mitte jedes Wells mit 10facher Vergrößerung mittels eines Olympus
CK2 Mikroskops quantitativ bestimmt. Jede Bedingung wurde in Wells
dreifacher Ausfertigung untersucht und jeder Versuch wurde viermal
mit unterschiedlichen Zellpräparaten
wiederholt.
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Die
Ergebnisse zeigten, dass Keratinozyten als Reaktion auf Tβ4 nach einer
4- bis 5-stündigen
Einwirkung migrierten. Die Migration wurde um das Zwei- bis Dreifache
(P ≤ 0,003)
gegenüber
der Migration in Anwesenheit von Medium alleine (6)
erhöht
und übertraf
die positive Kontrolle bei der maximalen Reaktionsdosis. Zwar wurden
geringfügig
unterschiedliche Dosiskurven je nach dem Zellpräparat und der Quelle dargestellt,
doch ergab die Wirkung von Tβ4
auf die Migration eindeutig ein biphasisches Muster, wobei 1000 ng/ml
und 0,01 ng/ml die stärkste
Migration ergaben und die mittleren Dosen eine geringere Stimulation
(aber immer noch höher
als das Kontrollmedium) in allen 4 Assays lieferten.
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3. BEISPIEL
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Migrationsassays von Hornhautepithelzellen
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Migrationsassays
von Hornhautepithelzellen wurden in einer Boyden-Kammer Polyestermembranen mit
12 μm Poren
(Poretics, Livermore, CA) durchgeführt, die mit einer 0,1 mg/ml
Lösung
aus Kollagen IV in dH20 (Trevigen, Gaithersburg, MD) beschichtet
wurden. Die Filter wurden anschließend mindestens 1 Stunde lang
getrocknet. Zellen wurden kultiviert und in Eagle Minimal Essential
Medium mit 0,05 mM Ca2+ resuspendiert. Die
untere Kammer wurde mit EMEM, das 0,01, 0,1, 10, 100 und 1000 ng/ml
synthetisches Tβ4
enthielt, befüllt.
Konditioniertes Medium von primären
Hautfibroblasten und/oder Keratinozytenwachstumsfaktor wurde in
mehrere Wells als positive Kontrolle gegeben. Zellen wurde in die
obere Kammer in einer Konzentration von 50.000 Zellen pro Well gegeben.
Die Kammern wurden 4 bis 5 Stunden lang bei 35 C/7 % CO2 inkubiert,
anschließend
wurden die Filter fixiert und mit Diff-Quik (Baxter Healthcare Corporation,
McGraw Park, IL) gefärbt. Die
durch den Filter migrierenden Zellen wurden durch Zählen der
Mitte jedes Wells mit 10facher Vergrößerung unter Verwendung eines
Olympus CK2 Mikroskops quantitativ bestimmt. Jede Bedingung wurde
in Wells dreifacher Ausfertigung untersucht und jeder Versuch wurde
viermal mit unterschiedlichen Zellpräparaten wiederholt. Die Ergebnisse
zeigten, dass Hornhautepithelzellen als Reaktion auf Tβ4 nach einer
4- bis 5-stündigen Einwirkung
migrierten. Die Migration wurde um das Zwei- bis Dreifache gegenüber der
Migration in Anwesenheit von Medium alleine (7) verbessert,
wobei das höchste
Migrationsniveau bei 100 ng/ml Tβ4
vorlag.
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4. BEISPIEL
-
In-vivo-Hornhautreepithelialisierung
-
Zum
Bestimmen der Wirkung von Tβ4
auf die In-vivo-Hornhautreepithelialisierung
wurden Hornhäute von
Ratten entepithelialisiert und mit Tβ4 behandelt. Filter wurden in
Heptanol eingeweicht, 30 Sekunden lang auf das Auge aufgebracht
und anschließend
wurde das Epithelgewebe abgeschabt. Verschiedene Tβ4-Konzentrationen
in Salzlösung
wurden auf das Auge aufgebracht und nach 24 Stunden wurden die Ratten
geopfert. Die Augen wurden fixiert, zerschnitten und der Grad an
Hornhautepithelmigration (gemessen in Pixel) wurde mit einem Mikroskop
mit einem inneren Dickenmesser durch einen maskierten Observer bestimmt.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Reepithelialisierung der Hornhaut
gegenüber
der nicht behandelten Kontrolle in Anwesenheit von etwa 1 bis 25 μg Tβ4 um das
Zweifache erhöht
war (8 und 9). Darüber hinaus wurde festgestellt,
dass mit Tβ4
behandelte Augen im Vergleich zu den nicht behandelten Hornhäuten eine
geringere Entzündung
aufwiesen.
-
5. BEISPIEL
-
Modell einer beeinträchtigten
Heilung
-
Thymosin β4 verbesserte
die Wundheilung auch in einem Modell einer beeinträchtigten
Heilung. Eine Steroidbehandlung verringert die Wundreparaturrate
bei Säugetieren.
Mit Steroiden wie Hydrokortison behandelte Ratten dienen als Modell
einer beeinträchtigten
Wundheilung aufgrund der beim Wundverschluss beobachteten Verzögerung.
Den Tieren wurde täglich
intramuskulär
Hydrokortison injiziert. Die mit Steroiden behandelten Ratten wiesen
eine bedeutende Zunahme des Heilungsgrads auf, als Tβ4 topisch
verabreicht oder intraperitoneal injiziert wurde. Zum Ausgangszeitpunkt,
Tag 4, zeigten die topisch behandelten Tiere kaum Reaktion (≤ 7 % Spalt-
oder Breitenverschluss, N=3) im Vergleich zur Salzlösungsbehandlung.
Die intraperitoneale Injektion erzielte jedoch einen Rückgang der
Spaltgröße von 28
% und einen Rückgang
der Wundbreite von 14 %. Am 7. Tag wurde sowohl bei der topischen
Behandlung als auch bei der intraperitonealen Injektion eine Reaktion
beobachtet.
-
Der
Spalt bei den topisch behandelten Tieren verringerte sich um 39
% im Vergleich zur Salzlösungsbehandlung.
Die Wundbreite verringerte sich um 23 %. Die intraperitoneale Injektion
resultierte in einem Rückgang
der Spaltgröße von 26
% und einem Rückgang
der Wundbreite von 10 %. Insgesamt wird hierdurch demonstriert,
dass Tβ4
zur Behandlung chronischer und akuter Wunden von Nutzen ist.
-
Es
wurde eine Reihe von Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung
beschrieben. Dennoch ist zu verstehen, dass verschiedene Modifikationen
möglich
sind, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Demzufolge befinden
sich andere Ausgestaltungen innerhalb des Umfangs der folgenden
Ansprüche.