DE69924615T2

DE69924615T2 - Thymosin beta 4 stimuliert wundheilung

Info

Publication number: DE69924615T2
Application number: DE69924615T
Authority: DE
Inventors: K. Hynda KLEINMAN; Allan Goldstein; M. Katherine MALINDA; Gabriel Sosne
Original assignee: US Department of Health and Human Services; National Institutes of Health NIH
Current assignee: US Department of Health and Human Services; National Institutes of Health NIH
Priority date: 1998-07-30
Filing date: 1999-07-29
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2019-07-30
Also published as: AU5244399A; CA2338928A1; MXPA01001041A; EP1100529B1; DK1100529T3; ATE292473T1; PT1100529E; EP1591128A1; US20070111931A9; EP1100529A1; WO2000006190A1; US20170326207A1; ES2239846T3; EP1100529B2; DE69924615D1; US8143218B2; US20110124550A1; EP2311485A1; ES2239846T5; DE69924615T3

Description

ERKLÄRUNG ZU BUNDESSTAATLICH GEFÖRDERTER FORSCHUNG
Die vorliegende Erfindung erfolgte zum Teil mit Geldern der National Institutes of Health, Intramural Program. Die Regierung hat möglicherweise gewisse Rechte an der vorliegenden Erfindung.
QUERVERWEIS ZU VERWANDTEN ANMELDUNGEN
Die vorliegende Anmeldung beansprucht die Priorität der am 30. Juli 1998 eingereichten provisorischen Anmeldung mit der Serien-Nr. 60/094,690, auf die ein Prioritätsanspruch unter 35 U.S.C. §119(e) erhoben wird.
TECHNISCHER BEREICH DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Gewebereparatur und insbesondere Verfahren zur Wundheilung unter Verwendung von Thymosin β4.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Verfahren und Zusammensetzungen, die für eine effektive Heilung chronischer Wunden unzureichend sind, stellen in der Gesundheitsfürsorge ein bedeutendes Problem dar. Eine eingeschränkte Wundheilung erhöht die Wahrscheinlichkeit von Mortalität und Morbidität. Dieses Problem ist vor allem bei Patienten mit Diabetes auffällig, bei denen sich starke, lebensbedrohliche Wunden an Körperextremitäten entwickeln. Chronische, diabetische Fußgeschwüre haben oft Amputationen zur Folge. Diese Wunden sind oft das Ergebnis einer schlechten Zirkulation, die sich aus den insulingeschädigten Zellen von Diabetikern ergibt, sowie einer beeinträchtigten Vaskularisierung des Wundbetts, reduzierten Infiltration keimbekämpfender Zellen und reduzierten Gewebeepithelialisierung. Folglich schließen die meisten derzeitigen Therapien Versuche zur Revaskularisierung des Wundbetts und Verhinderung einer Infektion ein.
Wunden in nicht geschädigtem Gewebe durchlaufen eine komplexe und geordnete Reihe von Ereignissen zur Gewebereparatur. Die Ereignisreihe kann die Infiltration immuner Zellen im Rahmen des Prozesses zur Beseitigung und Zerstörung von nekrotischem Gewebe, eine erhöhte Vaskularisierung durch angiogene Faktoren und eine erhöhte Zellvermehrung und extrazelluläre Matrixablagerung beinhalten. Zwar wurde der Grundprozess der Gewebereparatur charakterisiert, doch werden die einzelnen Schritte und Faktoren, die zur Durchführung dieser komplexen Reihe von Ereignissen notwendig sind, noch nicht ganz nachvollzogen. Die Identifizierung individueller Schritte und Faktoren könnte zu verbesserten Verfahren zur Behandlung von Krankheiten führen, die durch unzureichende Wundreparaturprozesse hervorgerufen werden.
In bisherigen Studien wurde der „Scratch"-Wundverschlusstest zur Beurteilung potenzieller Effekte eines Agens auf die In-vitro-Zellmigration angewendet. Ein solcher Test ist zwar informativ, ahmt jedoch nicht die dynamischen In-vivo-Wundheilungsbedingungen nach, insofern als nicht alle am Wundverschluss beteiligten Faktoren in dem In-vitro-Assay vorliegen. Aus diesem Grund wurden In-vivo-Systeme entwickelt, um die Fähigkeit eines Agens oder Faktors zur Modulierung von Wundheilungsaktivitäten zu beurteilen.
Mit diesen Arten von In-vitro-Modellen wurde eine Reihe spezifischer Wachstumsfaktoren im Hinblick auf ihre Wirkung auf die Angiogenese erkannt. Ein solcher Wachstumsfaktor ist TGF-β. Zu dieser Familie dimerer Proteine gehören TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 und TGF-β5, die das Wachstum und die Differenzierung vieler Zelltypen regulieren. Diese Proteinfamilie weist eine Reihe biologischer Effekte aus der Stimulierung des Wachstums einiger Zelltypen (Noda et al., (1989) Endocrinology, 124:2991-2995) und Inhibition des Wachstums anderer Zelltypen (Goey et al., (1989) J. Immunol., 143:877-880; Pietenpol et al., (1990) Proc. Nat'l. Acad Sci. USA, 87:3758-3762) auf. Es wurde außerdem gezeigt, dass TGF-β die Expression extrazellulärer Matrixproteine erhöht, einschließlich Kollagen und Fibronektin (Ignotz et al., (1986) J. Biol. Chem., 261:4337-4345), und die Heilung von Wunden beschleunigt (Mustoe et al., (1987) Science, 237:1333-1335).
Ein weiterer Wachstumsfaktor, der für seine Wirkung auf die Angiogenese anerkannt ist, ist der aus Blutplättchen gewonnene Wachstumsfaktor (PDGF). PDGF erwies sich ursprünglich als ein potentes Mitogen für Mesenchymzellen (Ross R. et al. (1974) Proc Nat'l Acad Sci USA 71(4):1207-1210.; Kohler N. et al. (1974) Exp. Cell Res. 87:297-301). Weitere Studien haben gezeigt, dass PDGF die Rate von Zellularität und Granulation in der Gewebebildung erhöht. Mit PDGF behandelte Wunden haben das Aussehen einer Entzündungsreaktion im Frühstadium, einschließlich einer Zunahme von Neutrophilen und Makrophage-Zelltypen an der Wundstelle. Diese Wunden weisen auch eine verbesserte Fibroblastenfunktion auf (Pierce, GF et al. (1988) J. Exp. Med. 167: 974-987). Es hat sich in Tierstudien gezeigt, dass sowohl PDGF als auch TGFβ die Kollagenbildung, den DNA-Gehalt und die Proteinniveaus erhöhen (Grotendorst, GR et al. (1985) J. Clin. Invest. 76:2323-2329; Sporn, MB et al. (1983) Science 219:1329). Es hat sich gezeigt, dass die Wundheilungswirkung von PDGF in Wunden beim Menschen erfolgreich ist. In menschlichen Wunden ist die PDGF-AA Expression innerhalb von Druckgeschwüren, die eine Heilung durchlaufen, erhöht. Die Zunahme von PDGF-AA stimmt mit einer Zunahme von aktivierten Fibroblasten, extrazellulärer Matrixablagerung und aktiver Vaskularisierung der Wunde überein. Ferner ist eine solche Zunahme von PDGF-AA bei chronischen, nicht heilenden Wunden nicht erkennbar. Zu einer Reihe anderer Wachstumsfaktoren mit der Fähigkeit zur Auslösung von Angiogenese und Wundheilung gehören der vaskuläre Endothelwachstumsfaktor (VEGF), der Keratinozytenwachstumsfaktor (KGF) und der basische Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF).
Die meisten dieser Wachstumsfaktoren und angiogenen Faktoren haben jedoch Nebenwirkungen. Demzufolge besteht einen Bedarf an zusätzlichen Faktoren, die zur Förderung der Wundreparatur von Nutzen sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, dass Thymosin β4 (Tβ4) die Wundheilung beschleunigt und die Wundreparatur stimuliert. Aufgrund dieser Erkenntnisse ist es nun möglich, Verfahren zur Beschleunigung der Wundheilung bei Individuen mit Wunden, die einer solchen Behandlung bedürfen, zu entwickeln.
In einer ersten Ausgestaltung ergibt die Erfindung Anspruch 1. Gemäß einem Aspekt des Verfahrens ist das Wundheilungspolypeptid Tβ4 oder eine Isoform von Tβ4.
In einer anderen Ausgestaltung stellt die Erfindung eine wirksame Menge einer Zusammensetzung bereit, die ein Wundheilungspolypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz LKKTET und konservative Varianten davon, mit Wundheilungsaktivität, oder eine Nucleinsäure enthält, die ein Wundheilungspolypeptid kodiert, zur Herstellung eines Medikamentes zur Förderung der Gewebereparatur in einem Gewebe, das einer solchen Behandlung bedarf. Gemäß einem Aspekt des Verfahrens ist ein Wundheilungspeptid Tβ4 oder eine Isoform von Tβ4. Das Gewebe kann entweder in vivo oder ex vivo kontaktiert werden.
In noch einer anderen Ausgestaltung stellt die Erfindung ein Mittel zur Modulierung der Wundreparatur bei einem Individuum, das einer solchen Behandlung bedarf, durch die systemische Zuführung einer wirksamen Wundheilungsmenge eines Wundheilungspolypeptids, umfassend die Aminosäuresequenz LKKTET und konservative Varianten davon, mit Wundheilungsaktivität bereit. Gemäß einem Aspekt des Verfahrens ist ein Wundheilungspeptid Tβ4 oder eine Isoform von Tβ4.
In noch einer anderen Ausgestaltung stellt die vorliegende Erfindung ein Mittel zur Stimulierung von Epithelzellmigration an einer Wundstelle durch Inkontaktbringen der Wunde mit einer wirksamen Menge eines Tβ4-Polypeptids bereit.
In einer anderen Ausgestaltung stellt die Erfindung ein Mittel zur Diagnose eines pathologischen Zustands in einem Individuum bereit, der durch eine Wundheilungsstörung in Verbindung mit Tβ4 gekennzeichnet ist, einschließlich eines Nachweises des Tβ4-Anteils in einer Probe des Individuums, die vermutlich Tβ4 enthält, und Vergleichs des Tβ4-Anteils mit dem Anteil in einer normalen Probe (d.h. einer Standardprobe).
In einer anderen Ausgestaltung stellt die Erfindung ein Mittel zur Linderung einer mit Tβ4 assoziierten Wundheilungsstörung bereit, wobei ein Individuum mit der Störung mit einer Zusammensetzung behandelt wird, die Tβ4-Aktivität oder die Aktivität einer Tβ4-Isoform moduliert.
In noch einer anderen Ausgestaltung stellt die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, umfassend ein Wundheilungspolypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz LKKTET und konservative Varianten davon, mit Wundheilungsaktivität und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Gemäß einem Aspekt ist das Wundheilungspolypeptid Tβ4 oder eine Isoform von Tβ4.
Die Einzelheiten zu einer oder mehreren Ausgestaltung(en) der Erfindung sind in den Begleitzeichnungen und der nachfolgenden Beschreibung enthalten. Weitere Merkmale, Aufgaben und Vorzüge der Erfindung sind anhand der Beschreibung und Zeichnungen sowie anhand der Ansprüche offensichtlich.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Zeichnung einer wunde.
2 ist ein Balkendiagramm, das den Effekt der topischen und systemischen Zuführung von Tβ4 auf die Breite einer Punch-Wunde im Vergleich zu einer Kontrolle darstellt. (A) Bei jedem Tier wurden drei von sechs Wunden am Tag der Verwundung und 48 Stunden nach der Verwundung 5 μg/50 μl topisch zugeführt. (B) Intraperitoneale Injektionen von 60 μg/300 μl wurden am Tag der Verwundung und danach jeden zweiten Tag verabreicht. Die Kontrolltiere wurden in ähnlicher Weise mit Salzlösung behandelt. Die Messungen sind als der mittlere prozentuale Rückgang ± SEM ausgedrückt.
3 ist ein Balkendiagramm, das den Effekt der topischen und systemischen Zuführung von Tβ4 auf den Spalt einer Punch-Wunde im Vergleich zu einer Kontrolle darstellt. (A) Die topische Zuführung von 5 μg/50 μl erfolgte am Tag der Verwundung und 48 Stunden nach der Verwundung. (B) Intraperitoneale Injektionen von 60 μg/300 μl wurden am Tag der Verwundung und danach jeden zweiten Tag verabreicht. Die Messwerte sind als der mittlere prozentuale Rückgang ± SEM ausgedrückt.
4 ist eine mit H&E gefärbte histologische Sektion, die das Aussehen von Kontroll- und mit Thymosin β4 behandelten Wunden mit geringer Vergrößerung und stärkerer Vergrößerung darstellt. Die Wunden stammen vom Tag 7, wie in der Legende von 2 beschrieben. Pfeile zeigen auf die Ränder der ursprünglichen Wunde. (A) Mit Salzlösung behandelte Kontrollwunde. Die Migration des Epithelgewebes ist an den Wundrändern sichtbar und Debris ist über der nicht geheilten Wunde sichtbar. (B) Eine erhöhte Reepithelialisierung der Wunde trat auf, als Tβ4 intraperitoneal injiziert wurde (60 μg/300 μl jeden zweiten Tag). (C) Die topische Behandlung (5 μg/50 μl Tβ4) resultierte in der kompletten Reepithelialisierung der Wundepidermis. Die mit Kästchen versehenen Bereiche sind der Ort der stärker vergrößerten Felder (D-F). (D-F) Dermis in der Nähe der dermalen und epidermalen Verbindung. (D) Kontrolle, die wenige Zellen in der Nähe der Dermis und wenig Neovaskularisierung aufweist. (E) und (F) Dermis, die mit Fibroblasten infiltriertes Granulationsgewebe und extensive Neovaskularisierung aufweist (Pfeilspitzen). Sowohl die intraperitoneale Behandlung als auch (F) die topische Applikation resultierten in beachtlichen neuen Kapillaren. (Maßstabsbalken = 1 mm).
5 zeigt histologische Sektionen von 7 Tage alten Wunden, die Kollagenablagerung/-ansammlung aufweisen. Die Masson'sche Trichromfärbung zeigt Kollagen und Endothelzellen. (A) Gering vergrößerte Ansicht einer mit Salzlösung behandelten Kontrollwunde. (B) und (C) Gering vergrößerte Ansichten von Wunden mit intraperitoneal injiziertem (B) oder topisch aufgetragenem Tβ4 (A). Die mit Kästchen versehenen Bereiche sind der Ort der stärker vergrößerten Felder (D-F). Pfeile zeigen auf die Ränder der ursprünglichen Wunde. (D) Stärker vergrößerte Kontrollwunde, die eine Basislinien-Kollagenansammlung aufweist. Eine intraperitoneale (E) oder topische (F) Behandlung führte zu einer verbesserten Kollagenproduktion/-ansammlung im Vergleich zu mit Salzlösung behandelten Wunden. (Maßstabsbalken = 1 mm).
6 stellt eine Tβ4-stimulierte Keratinozytenmigration in Boyden-Kammer-Assays dar. (A) Tβ4 in den unteren Wells der Kammer führte zu einer 2-3fachen Zunahme der Migration auf mit Kollagen IV beschichteten Filtern. Die positive Kontrolle, konditioniertes Medium, wies ebenfalls eine erhöhte Migration gegenüber Medium alleine auf.
7 zeigt ein Diagramm, das die Migration von Hornhautepithelzellen bei verschiedenen Tβ4-Konzentrationen demonstriert.
8 zeigt ein Diagramm, das die Hornhaut-Reepithelialisierung bei Rattenaugenhornhäuten in An- und Abwesenheit von Tβ4 darstellt.
9 zeigt ein Diagramm, das die Hornhaut-Reepithelialisierung in An- und Abwesenheit verschiedener Konzentrationen von Tβ4 darstellt.
10 zeigt eine Aminosäuresequenz von Tβ4.
11 zeigt die Aminosäuresequenz verschiedener bekannter Isoformen von Tβ4 und ihre phylogenetische Verteilung. N-terminale Acetylierung wird durch „ac" angegeben. Reste zwischen 13 und 24 werden für die Aktinbindung als wichtig angesehen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Thymosin β4 wurde zunächst als ein Protein identifiziert, das während der Endothelzellmigration und -differenzierung in vitro hinauf reguliert wird. Thymosin β4 wurde ursprünglich vom Thymus isoliert und ist ein ubiquitäres 4,9 kDa Polypeptid mit 43 Aminosäuren, das in einer Vielfalt von Geweben identifiziert wird. Diesem Protein wurden verschiedene Funktionen zugeschrieben, wie z.B. eine Funktion in der Endothelzelldifferenzierung und -migration, T-Zelldifferenzierung, Aktin-Sequestrierung und Vaskularisierung. Eine biologische Aktivität von Thymosin β4 (Tβ4), wie hierin gezeigt, bewirkt eine Gewebereparatur und Wundheilung. Eine weitere Aktivität von Tβ4 ist eine entzündungshemmende Aktivität.
Die vorliegende Erfindung ergab sich aus der Untersuchung der Wirkung von Tβ4 auf die Wundheilung. In-vivo-Ergebnisse haben gezeigt, dass die topische und systemische Zuführung von Tβ4 die Wundheilung fördert. Weitere Versuche demonstrierten, dass mit Tβ4 behandelte Wunden eine erhöhte extrazelluläre Matrixablagerung im Wundbett aufweisen.
Die vorliegende Erfindung identifiziert Tβ4 als einen aktiven Faktor zur Förderung von Wundverschluss und Gewebereparatur in vivo, sowie zur Erhöhung der Epithelzellmigration. Die In-vivo-Verabreichung von Tβ4 zeigt, dass Zellmigration, Angiogenese und extrazelluläre Matrixablagerung auf oder über die bei Kontrolltieren im Hinblick auf Migration, Angiogenese und Matrixablagerung beobachteten Niveaus stimuliert werden. Tβ4 unterstützt den Wundverschluss bei systemischer (z.B. intraperitonealer) und topischer Verabreichung in Tierwundmodellen. Außerdem wurden erhöhte Kollagenwerte in behandelten Wunden beobachtet, woraus sich ergibt, dass die Tβ4-Behandlung auch die Wundkontraktion beschleunigen und den Heilungsprozess stimulieren kann.
Die erfindungsgemäßen Verfahren ergeben sich aus der Identifizierung der Wirkung von Tβ4 auf die Wundheilung. In vivo stimuliert Tβ4 die Wundheilung in einer Vollhaut-Punch-Wunde (siehe Beispiel 1) und die Reparatur von Wunden am Auge (Beispiel 4). Bei topischer oder systemischer (z.B. intraperitonealer) Verabreichung beschleunigt Tβ4 den Verschluss und die Heilung von Wunden (siehe Beispiele 1, 4 und 5).
Förderung der Geweberegeneration
In einer Ausgestaltung stellt die Erfindung ein Mittel zur Beschleunigung der Wundheilung bei einem Individuum durch Inkontaktbringen einer Wunde mit einer wirksamen Wundheilungsmenge einer Zusammensetzung bereit, die Tβ4 oder eine Tβ4-Isoform enthält. Das Inkontaktbringen kann topisch oder systemisch erfolgen. Beispiele für die topische Verabreichung sind beispielsweise das Inkontaktbringen der Wunde mit einer Lotion, einem Balsam, einem Gel, einer Paste, einem Spray, einer Suspension, Dispersion, einem Hydrogel, einer Salbe oder einem Öl, umfassend Tβ4. Die systemische Verabreichung beinhaltet zum Beispiel intravenöse, intraperitoneale, intramuskuläre Injektionen einer Zusammensetzung, die Tβ4 oder eine Tβ4-Isoform enthält. Ein Individuum kann ein beliebiges Säugetier, vorzugsweise ein Mensch, sein.
Darüber hinaus ist Tβ4 oder eine Tβ4-Isoform in solchen Fällen von therapeutischem Nutzen, in denen der Wundheilungsprozess beeinträchtigt ist, wie zum Beispiel bei Individuen mit Wundheilungsstörung. Mit „Individuen mit Wundheilungsstörung" sind Individuen mit reduzierter, verringerter Fähigkeit oder Unfähigkeit zur Genesung von einer Verwundung oder Verletzung gemeint, aufgrund von wiederkehrenden Verwundungen, Verletzungen oder der Unfähigkeit des natürlichen Systems des Individuums, die Wundheilung ordnungsgemäß herbeizuführen. Steroide vermindern zum Beispiel die Fähigkeit eines Individuums zur Heilung im Vergleich zu einem Individuum, das keine Steroide einnimmt. Zu anderen Wunden, die in gefährdeten Individuen auftreten können, gehören unter anderem Hautwunden wie diabetische Geschwüre, Venengeschwüre oder Druckgeschwüre. Außerdem ist Tβ4 oder eine Tβ4-Isoform zur Steigerung des normalen Heilungsprozesses therapeutisch von Nutzen.
Die hierin verwendete „wirksame Wundheilungsmenge" einer Zusammensetzung, die Tβ4 oder eine Tβ4-Isoform enthält, zur Verwendung bei der Wundheilung ist als die Menge definiert, die die Geweberegeneration und -reparatur wirksam fördert. Die „wirksame Wundheilungsmenge" kann die therapeutisch wirksame Menge sein. Zu Krankheiten, Störungen oder Leiden, die möglicherweise durch Tβ4 oder eine Tβ4-Isoform moduliert werden, gehören die Gewebereparatur nach traumatischen Verletzungen oder Zustände wie Arthritis, Osteoporose und andere Muskel-Skelett-Störungen, Verbrennungen, Geschwüre und andere Hautläsionen, neurologische und Nervenkrankheiten und kardiovaskuläre Krankheiten wie Ischämie und Atherosklerose. Andere potenzielle Gewebe, die mit den Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung behandelt werden können, sind epidermales, Augen-, urogenitales, gastrointestinales, kardiovaskuläres, Muskel-, Binde- oder Nervengewebe. Die hierin verwendeten Begriffe „induzieren", „Induktion" oder „bewirken" betreffen die Aktivierung, Stimulierung, Verbesserung, Einleitung und/oder Beibehaltung zellulärer Mechanismen oder Prozesse, die für die Bildung eines Gewebes oder eines Teils davon, den Reparaturprozess oder die Gewebeentwicklung wie hierin beschrieben notwendig sind.
Modulierung der Wundheilung
Wundheilung, Geweberegeneration und Gewebereparatur ergeben sich aus einem komplexen Prozess, der die Vermehrung und Migration von Entzündungszellen, Endothelzellen, Stromazellen und Parenchymzellen, die Ablagerung von extrazellulären Matrixmaterialien und das Wachstum neuer Blutgefäße, insbesondere Kapillaren, beinhaltet. Dieser komplexe Prozess spielt eine entscheidende Rolle bei so vorteilhaften Funktionen wie der Embryogenese, dem weiblichen Reproduktionszyklus sowie bei abnormen Funktionen wie Arthritis, chronische Ulzeration und neurodegenerative Krankheiten.
In einer anderen Ausgestaltung stellt die Erfindung ein Mittel zur Modulierung der Wundheilung in einem Individuum oder einem Gewebe bereit, einschließlich des Inkontaktbringens des Individuums oder Gewebes mit einer wirksamen Wundheilungsmenge einer Zusammensetzung, die Tβ4 oder eine Tβ4-Isoform enthält. Es ist vorgesehen, dass Tβ4 oder eine Tβ4-Isoform topisch oder systemisch verabreicht werden kann, um einen Gewebeschaden zu verhindern oder zu behandeln, wie zum Beispiel aufgrund von Ischämie beschädigtes Gewebe, einschließlich der ischämischen Hirn-, Knochen- und Herzkrankheit, Schäden an Hornhaut- oder Netzhautgewebe des Auges und Schäden an Epithelgewebe wie die Haut.
Ferner ist der Anwendungsbereich der Erfindung zur Förderung der Wundheilung in Gewebe nützlich, da die Angiogenese in Gewebe mit mangelhaftem Blutfluss gefördert wird. Eine Tβ4 enthaltende Zusammensetzung kann z.B. die Heilung chronischer Geschwüre fördern, indem die Blutversorgung des Gewebeortes sowie die Keratinozytenmigration zum Verschließen einer Wunde erhöht werden.
Tβ4-Isoformen wurden identifiziert und haben zu etwa 70 % oder etwa 75 % oder etwa 80 % oder mehr Homologie zur Aminosäuresequenz von Tβ4, die in 10 dargestellt ist. Zu solchen Isoformen gehören beispielsweise Tβ4^ala, Tβ9, Tβ10, Tβ11, Tβ12, Tβ13, Tβ14 und Tβ15 (11; siehe auch Mihelic et al., (1994) Amino Acids, 6:1-13, das die Aminosäuresequenz anderer Tβ4-Isoformen beschreibt und hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist). Ähnlich wie Tβ4 haben die Tβ10 und Tβ15 Isoformen gezeigt, dass sie Aktin sequestrieren. Tβ4, Tβ10 und Tβ15 sowie diese anderen Isoformen haben eine Aminosäuresequenz, LKKTET, gemeinsam, die scheinbar an der Vermittlung der Aktinsequestrierung oder -bindung beteiligt ist. Ohne uns durch eine spezielle Theorie zu binden, ist die Wundheilungsaktivität von Tβ4 und Tβ4-Isoformen möglicherweise zum Teil in der Fähigkeit zur Aktinpolymerisierung begründet. Tβ4 kann zum Beispiel die Aktin-Polymerisierung in Wunden modulieren, um die Heilung zu fördern (z.B. β-Thymosine scheinen F-Aktin durch Sequestrieren von freiem G-Aktin zu depolymerisieren). Die Fähigkeit von Tβ4 zur Modulierung der Aktin-Polymerisierung kann daher völlig oder teilweise in seiner Fähigkeit zur Bindung an oder Sequestrierung von Aktin über die LKKTET Sequenz begründet sein. Somit fördern genau wie Tβ4 andere Proteine, die Aktin binden oder sequestrieren oder die Aktin-Polymerisierung modulieren, einschließlich Tβ4-Isoformen mit der Aminosäuresequenz LKKTET, wahrscheinlich die Wundheilung alleine oder in Kombination mit Tβ4, wie hierin dargelegt.
Es wird somit insbesondere erwogen, dass bekannte Tβ4 Isoformen wie Tβ4^ala, Tβ9, Tβ10, Tβ11, Tβ12, Tβ13, Tβ14 und Tβ15 sowie Tβ4-Isoformen, die noch nicht identifiziert sind, in den erfindungsgemäßen Verfahren von Nutzen sind. Tβ4-Isoformen sind an sich in den erfindungsgemäßen Verfahren von Nutzen, einschließlich der in einem Individuum praktizierten Verfahren; die Erfindung stellt daher ferner pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die Tβ4-Isoformen Tβ4^ala, Tβ9, Tβ10, Tβ11, Tβ12, Tβ13, Tβ14 und Tβ15 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen.
Darüber hinaus können andere Proteine, die Aktinsequestrierungs- oder -bindefähigkeit haben oder die Aktin mobilisieren oder die Aktinpolymerisierung modulieren können, wie in einem entsprechenden Sequestrierungs-, Bindungs-, Mobilisierungs- oder Polymerisierungsassay demonstriert oder durch die Anwesenheit einer Aminosäuresequenz identifiziert wurde, die Aktinbindung vermittelt, wie LKKTET, zum Beispiel in ähnlicher Weise in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Zu solchen Proteinen gehören zum Beispiel Gelsolin, Vitamin-D-Bindeprotein (DBP), Profilin, Cofilin, Depactin, DnaseI, Vilin, Fragmin, Severin, Capping-Protein, β-Aktinin und Akumentin. Da solche Verfahren die in einem Individuum praktizierten beinhalten, stellt die Erfindung ferner pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die Gelsolin, Vitamin-D-Bindeprotein (DBP), Profilin, Cofilin, Depactin, DNaseI, Vilin, Fragmin, Severin, Capping-Protein, β-Aktinin und Akumentin wie hierin dargelegt umfassen. Die Erfindung beinhaltet folglich die Verwendung eines Wundheilungspolypeptids, das die Aminosäuresequenz LKKTET und konservative Varianten davon umfasst.
Der hierin verwendete Begriff „konservative Variante" oder grammatikalische Variationen davon beziehen sich auf den Austausch eines Aminosäurerests durch einen anderen, biologisch ähnlichen Rest. Zu Beispielen für konservative Variationen gehören der Austausch eines hydrophoben Rests wie Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin durch einen anderen, der Austausch eines polaren Rests durch einen anderen, wie die Substitution von Arginin durch Lysin, Glutamin- durch Asparaginsäuren oder Glutamin durch Asparagin und dergleichen.
Tβ4 wurde in einer Reihe von Gewebe- und Zelltypen lokalisiert und folglich können Agenzien, die die Produktion von Tβ4 stimulieren, in eine Zusammensetzung gegeben werden, um die Tβ4-Produktion von einem Gewebe und/oder einer Zelle zu bewirken. Agenzien, die eine Wundreparatur bewirken, können ebenfalls in einer solchen Zusammensetzung aufgenommen werden, um den Wundheilungsprozess zu steigern. Zu solchee Agenzien gehören Mitglieder der Familie von Wachstumsfaktoren, wie der insulinähnliche Wachstumsfaktor (IGF-1), der aus Blutplättchen gewonnene Wachstumsfaktor (PDGF), der epidermale Wachstumsfaktor (EGF), der von transformierten Zellen gebildeter Wachstumsfaktor Beta (TGF-β), der basische Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), Thymosin α1 (Tα1) und der vaskuläre Endothelwachstumsfaktor (VEGF). Bevorzugter ist das Agens von transformierten Zellen gebildeter Wachstumsfaktor Beta (TGF-β) oder ein anderes Mitglied der TGF-β-Überfamilie. Tβ4-Zusammensetzungen der Erfindung unterstützen die Wundheilung, indem sie das Wachstum von Bindegewebe durch extrazelluläre Matrixablagerung, Zellmigration und Vaskularisierung des Wundbetts herbeiführen.
Ferner können Agenzien, die den Wundheilungsprozess unterstützen oder stimulieren, zusammen mit Tβ4 oder einer Tβ4-Isoform in eine Zusammensetzung gegeben werden, um den Wundheilungsprozess weiter zu modulieren. Zu solchen Agenzien gehören angiogene Agenzien, Wachstumsfaktoren, Agenzien, die die Differenzierung von Zellen lenken, Agenzien, die die Migration von Zellen fördern, und Agenzien, die die Bereitstellung von extrazellulären Matrixmaterialien im Wundbett stimulieren. So kann zum Beispiel, aber nicht ausschließlich, Tβ4 oder eine Tβ4-Isoform alleine oder in Kombination mit einem oder mehreren der folgenden Agenzien in Kombination zugegeben werden: VEGF, KGF, FGF, PDGF, TGFβ, IGF-1, IGF-2, IL-1, Prothymosin α1 und Thymosin αl in einer wirksamen Wundheilungsmenge.
Gemäß einem anderen Aspekt ist die Erfindung zur Reparatur von Gewebe nützlich, das infolge chirurgischer Verfahren, Bestrahlung, Lazeration, toxischer Chemikalien, Virusinfektionen, Bakterieninfektionen oder Verbrennungen verletzt wurde. Ferner ist die Erfindung zur Revitalisierung von Narbengewebe nützlich, das aus einer Reihe von Verfahren, Unfällen oder Verletzungen herrührt.
Der Begriff „Narbengewebe" bedeutet fibrotisches oder kollagenes Gewebe, das im Laufe der Heilung einer Wunde oder eines anderen morbiden Prozesses entsteht. Tβ4 kann zum Beispiel in einer Matrix mit kontrollierter Freisetzung aufgenommen werden, die in der Nähe von beschädigtem Gewebe positioniert werden kann, so dass die Regeneration, Reparatur und/oder Revaskularisierung eines solchen Gewebes gefördert wird. Der Begriff „Matrix mit kontrollierter Freisetzung" bezieht sich auf eine beliebige Zusammensetzung, die die Freisetzung einer bioaktiven Substanz zulässt, die damit vermischt oder darin beigemischt ist. Die Matrix kann eine feste Zusammensetzung, ein poröses Material (wie ein Gerüst, Gitter oder Schwamm) oder eine halbfeste, gelförmige oder flüssige Suspension sein, die bioaktive Substanzen enthält. Der Begriff „bioaktives Material" bezieht sich auf eine beliebige Zusammensetzung, die die Gewebereparatur moduliert, wenn sie gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird. Die bioaktive(n) Materialien oder Matrix kann/können durch Injektion, chirurgischen Eingriff, Katheter oder durch ein beliebiges anderes Mittel eingeführt werden, das zur Modulierung der Gewebereparatur geeignet ist.
Es ist vorgesehen, dass die Anwendungsbereiche und Zusammensetzungen der Erfindung zur Unterstützung der Wundheilung und -reparatur in geführten Geweberegenerations-(GTR)-Verfahren genutzt werden können. Solche Verfahren werden derzeit von medizinischem Fachpersonal angewendet, um die Wundheilung zu beschleunigen. Gewöhnlich werden nicht resorbierbare oder bioabsorbierbare Materialien zur Beschleunigung der Wundheilung durch Förderung der Repopulation der Wundfläche durch Zellen eingesetzt, die die architektonische und strukturelle Matrix des Gewebes bilden. Die Anwendungsbereiche und Zusammensetzungen der Erfindung dienen zum Beispiel der Unterstützung der Gewebereparatur oder -regeneration an einer Geschwürstelle bei einem Menschen oder anderen Individuum, indem eine Zusammensetzung, die ein bioreabsorbierbares Polymer und Tβ4 enthält, an der Stelle platziert wird, die einer Gewebereparatur oder -regeneration bedarf, so dass die Zusammensetzung effektiv die Geweberegeneration unterstützt, indem eine wirksame Wundheilungsmenge von Tβ4 an der Stelle freigesetzt wird.
Gemäß einem anderen Aspekt ist die Erfindung zur Förderung von Gewebewachstum im Laufe des Prozesses des Gewebe-Engineering nützlich. Der hierin verwendete Begriff „Gewebe-Engineering" ist als die Erzeugung, Entwicklung und Herstellung biologischer Prothesevorrichtungen in Kombination mit synthetischen oder natürlichen Materialien zum Erzeugen, Verbessern oder Ersetzen von Körpergewebe und Organen definiert. Die vorliegende Erfindung kann somit zum Verbessern der Entwicklung und des Wachstums von humanem Gewebe außerhalb des Körpers für eine spätere Implantation im Körper oder zum Verbessern der Entwicklung und des Wachstums von Gewebe im Körper zum Reparieren oder Ersetzen von erkranktem oder beschädigtem Gewebe verwendet werden. Tβ4 kann zum Beispiel zur Förderung des Wachstums von Hauttransplantatersatz nützlich sein, der als Therapie in der Behandlung von Verbrennungen und Geschwüren eingesetzt wird.
Gemäß einem anderen Aspekt des GewebeEngineering kann Tβ4 in externen oder internen Vorrichtungen aufgenommen werden, die menschliches Gewebe enthalten, das dafür vorgesehen ist, die Funktion eines erkrankten internen Gewebes zu ersetzen. Dieser Ansatz involviert vom Körper isolierte Zellen, die auf oder in einer dreidimensionalen Matrix platziert werden, wobei das neue System in den Körper implantiert oder außerhalb des Körpers verwendet wird. Die Anwendungsbereiche und Zusammensetzungen der Erfindung können in solchen Matrizen genutzt und aufgenommen werden, um das Wachstum von in den Matrizen enthaltenem Gewebe zu fördern. Tβ4 kann zum Beispiel in einem durch Gewebe-Engineering behandelten Konstrukt aufgenommen werden, um das Wachstum der in dem Konstrukt enthaltenen Zellen zu fördern. Es ist vorgesehen, dass der Anwendungsbereich der Erfindung zum Verbessern von Gewebereparatur, -regeneration und -engineering in Endothelzellen-bezogenen Produkten verwendet werden kann, die Knorpel, Knorpel-Knochen-Verbundstoffe, Knochen, Gewebe des zentralen Nervensystems, Muskeln, Leber, Pankreasinsel-(insulinproduzierende)-Zellen, urogenitales Gewebe, Brustgewebe und Gewebe für Gentherapieanwendungen enthalten können.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Anwendungsbereiche und Zusammensetzungen zur Modulierung der weiblichen Reproduktionstraktfunktionen bereit. Es hat sich gezeigt, dass Wachstumsfaktoren eine Rolle bei der zyklischen Mitose und Differenzierung von Endometriumzellkomponenten, Rekrutierung von Makrophagen beim Dezidualisieren des Endometriums, Endometrium-Trophoblasten-Interaktionen, Frühschwangerschaftserhaltung und Endometriumfunktionsregeneration spielen. Der hierin verwendete Begriff „modulieren" bedeutet eine Modifikation einer existierenden Bedingung oder eines biologischen Zustands. Die hierin definierte Modulierung einer Bedingung schließt sowohl eine Erhöhung als auch eine Verringerung der die existierende Bedingung beeinflussenden Determinanten ein. Die Verabreichung von Tβ4 könnte zum Beispiel zum Verbessern der Gebärmutterfunktionen unter einer Bedingung verwendet werden, bei der die Förderung von Endothelzellwachstum erwünscht ist. Die Gebärmutter kann zum Beispiel mit Tβ4 behandelt werden, um das Wachstum und die Entwicklung von Plazentamembranen oder Endometriumwachstum oder die Reparatur dieser Gewebe nach einer Gewebsverletzung zu fördern. Ferner kann eine Behandlung mit Tβ4 angewendet werden, um Schwangerschaft zu fördern und zu erhalten, indem die Endometrium-Trophoblasten-Interaktion erleichtert wird. Alternativ könnte ein Antagonist gegen Tβ4 verabreicht werden, um Bedingungen mit übermäßigem Endometriumwachstum zu modulieren, bei denen der Tβ4-Anteil im Vergleich zu einer normalen biologischen Bedingung übersteigert ist. Darüber hinaus kann Tβ4 in Kombination mit anderen Agenzien wie Thymosin α1 zur Behandlung von Störungen des Reproduktionstraktes erwünscht sein.
Die hierin beschriebenen therapeutischen Ansätze beinhalten verschiedene Methoden der Verabreichung oder Zuführung von Reagenzien oder Zusammensetzungen, die das erfindungsgemäße Tβ4 umfassen, einschließlich beliebiger konventioneller Verabreichungstechniken (zum Beispiel unter anderem topische Verabreichung, lokale Injektion, Inhalation oder systemische Verabreichung) an ein Individuum mit einer Wunde oder mit Gewebe, das geheilt oder repariert werden muss. Die oben beschriebene Verabreichung von Tβ4 kann die Wundheilung beschleunigen, die Zellmigration in eine Wundstelle erhöhen, die Gewebereparatur oder -regeneration induzieren oder Wachstum und Entwicklung des Endometriums fördern. Das Reagens, die Formulierung oder Zusammensetzung kann mit einem beliebigen hierin beschriebenen Verfahren oder mit einem beliebigen in der Technik bekannten Verfahren zum Zuführen, Targetieren von Tβ4-Polypeptiden und Exprimieren von Tβ4 kodierenden Genen, auch auf spezifische Zellen oder Rezeptoren targetiert werden. Die Verfahren und Zusammensetzungen, die das erfindungsgemäße Tβ4 verwenden oder enthalten, können zum Beispiel in pharmazeutische Zusammensetzungen durch Vermischen mit pharmazeutisch akzeptablen, nichttoxischen Exzipienten oder Trägern formuliert werden. Solche Zusammensetzungen können präpariert werden für die parenterale Verabreichung, insbesondere in Form flüssiger Lösungen oder Suspensionen in wässrigen physiologischen Pufferlösungen; für die orale Verabreichung, insbesondere in Form von Tabletten oder Kapseln; oder für die intranasale Verabreichung, insbesondere in Form von Pulvern, Nasentropfen oder Aerosolen. Zusammensetzungen mit anhaltender Freisetzung sind ebenfalls in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Zusammensetzungen für andere Verabreichungsmethoden können nach Bedarf mit Standardverfahren hergestellt werden.
Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung, die Tβ4 enthält, kann praktisch in Einheitsdosisform verabreicht und mit einem beliebigen der Verfahren hergestellt werden, die in der Pharmazie allgemein bekannt sind, wie zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1990) beschrieben. Formulierungen zur parenteralen Verabreichung können als allgemeine Exzipienten steriles Wasser oder Salzlösung, Polyalkylenglykole wie Polyethylenglykol, Öle pflanzlichen Ursprungs, hydrierte Naphtalene und dergleichen enthalten. Vor allem biokompatibles, biologisch abbaubares Lactidpolymer, Lactid/Glycolid-Copolymer oder Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Copolymere sind Beispiele für Exzipienten zur Steuerung der Freisetzung einer erfindungsgemäßen Verbindung in vivo. Zu anderen geeigneten parenteralen Zuführungssystemen gehören Ethylenvinylacetat-Copolymerpartikel, osmotische Pumpen, implantierbare Infusionssysteme und Liposomen. Formulierungen zur Inhalationsverabreichung können bei Bedarf Exzipienten wie Lactose enthalten. Inhalationsformulierungen können wässrige Lösungen sein, die zum Beispiel Polyoxyethylen-9-laurylether, Glycocholat und Desoxycholat enthalten, oder sie können ölige Lösungen zur Verabreichung in Form von Nasentropfen sein. Bei Bedarf können die Verbindungen als ein Gel formuliert werden, das intranasal aufgebracht wird. Formulierungen zur parenteralen Verabreichung können auch Glycocholat zur bukkalen Verabreichung beinhalten.
Die Zusammensetzung des Liposoms ist gewöhnlich eine Kombination aus Phospholipiden, vor allem High-Phase-Übergangstemperatur-Phospholipide, gewöhnlich in Kombination mit Steroiden, insbesondere Cholesterol. Es können auch andere Phospholipide oder andere Lipide verwendet werden. Die physikalischen Charakteristiken von Liposomen sind vom pH-Wert, der Ionenstärke und der Anwesenheit bivalenter Kationen abhängig.
Beispiele für Lipide, die in der Liposomenproduktion von Nutzen sind, sind Phosphatidylverbindungen wie Phosphatidylglycerol, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin, Sphingolipide, Cerebroside und Ganglioside. Besonders nützlich sind Diacylphosphatidylglycerole, bei denen der Lipidanteil 14-18 Kohlenstoffatome, insbesondere 16-18 Kohlenstoffatome, enthält und gesättigt ist. Illustrative Phospholipide sind u.a. Ei-Phosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin und Distearoylphosphatidylcholin.
Das Targeting von Liposomen wurde auf der Basis anatomischer und mechanistischer Faktoren klassifiziert. Die anatomische Klassifizierung beruht auf dem Grad an Selektivität, zum Beispiel organspezifisch, zellspezifisch und organellenspezifisch. Das mechanistische Targeting kann danach unterschieden werden, ob es passiv oder aktiv ist. Passives Targeting nutzt die natürliche Tendenz von Liposomen zur Verbreitung an Zellen des retikuloendothelialen Systems (RES) in Organen, die Sinusoidkapillaren enthalten. Aktives Targeting beinhaltet hingegen die Umänderung des Liposoms durch Koppeln des Liposoms an einen spezifischen Liganden, wie einen monoklonalen Antikörper, Zucker, Glycolipid oder Protein, oder durch Verändern der Zusammensetzung oder Größe des Liposoms, um ein Targeting zu anderen Organen und Zelltypen als den natürlich vorkommenden Lokalisierungsstellen zu erreichen.
Die Oberfläche des targetierten Zuführungssystems kann auf vielfältige Weise modifiziert werden. Im Falle eines liposomalen targetierten Zuführungssystems können Lipidgruppen in die Lipid-Bilayer des Liposoms eingebaut werden, um den Targeting-Liganden in einer stabilen Verbindung mit der liposomalen Bilayer zu halten.
Verschiedene Verknüpfungsgruppen können zum Verbinden der Lipidketten mit dem Targeting-Liganden verwendet werden. Im Allgemeinen sind die an die Oberfläche des targetierten Zuführungssystems gebundenen Verbindungen Liganden und Rezeptoren, die es dem targetierten Zuführungssystem ermöglichen, die gewünschten Zellen zu finden und sich auf diese „zu richten". Ein Ligand kann eine beliebige Verbindung von Interesse sein, die sich an eine andere Verbindung wie einen Rezeptor bindet.
Die therapeutischen Agenzien, die im Anwendungsbereich der Erfindung von Nutzen sind, können parenteral durch Injektion oder allmähliche Perfusion über einen Zeitraum verabreicht werden. Die Verabreichung kann intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, intrakavitär oder transdermal erfolgen.
Zu Präparaten für die parenterale Verabreichung gehören sterile wässrige oder nichtwässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele für nichtwässrige Lösungsmittel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, Pflanzenöle wie Olivenöl und injizierbare organische Ester wie Ethyloleat. Zu wässrigen Trägern gehören Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, einschließlich Salzlösung und gepuffertes Medium. Zu parenteralen Vehikeln gehören Natriumchloridlösung, Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, Ringer-Laktat intravenöse Vehikel sind u.a. [sic] Fluid- und Nährstoffregenerierungslösungen, Elektrolytregenerierungslösungen (z.B. solche auf der Basis von Ringer-Dextrose) und dergleichen. Konservierungsstoffe und andere Zusätze können ebenfalls vorliegen, wie zum Beispiel antimikrobielle Mittel, Antioxydationsmittel, Chelatbildner und inerte Gase und dergleichen.
Die Erfindung beinhaltet außerdem eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge von Tβ4 oder einer Tβ4-Isoform in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst. Zu solchen Trägern gehören die oben in Bezug auf die parenterale Verabreichung aufgeführten.
Die konkrete Dosis des Reagens, der Formulierung oder Zusammensetzung, das/die einen Gewebereparaturprozess, eine fibrotische Störung, eine sklerotische Störung, eine Zellvermehrungsstörung oder die Wundheilung moduliert, ist von vielen Faktoren abhängig, einschließlich der Größe und des Gesundheitszustands eines Individuums. Die allgemein fachkundige Person kann jedoch die folgenden Lehren, die die Verfahren und Techniken zur Bestimmung klinischer Dosierungen beschreiben (Spilker B., Guide to Clinical Studies and Developing Protocols, Raven Press Books, Ltd., New York, 1984, S. 7-13, 54-60; Spilker B., Guide to Clinical Trials, Raven Press, Ltd., New York, 1991, S. 93-101; Craig C. und R. Stitzel, Hrsg., Modern Pharmacology, 2. Ausgabe, Little, Brown und Co., Boston, 1986, S. 127-33; T. Speight, Hrsg., Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3.
Ausgabe, Williams und Wilkins, Baltimore, 1987, S. 50-56; R. Tallarida, R. Raffa und P. McGonigle, Principles in General Pharmacology, Springer-Verlag, New York, 1988, S. 18-20) oder zum Bestimmen der geeigneten zu verwendeten Dosierung verwenden.
Antikörper, die sich an Tβ4 binden
Antikörper gegen Tβ4-Peptid oder Fragmente könnten als Diagnoseinstrumente nützlich sein, um den Nachweis von Krankheiten zu unterstützen, bei denen Tβ4 ein pathologischer Faktor ist. Ferner ist die Verwendung von Antikörpern, die sich an Tβ4 binden und die Wirkungen von Tβ4 inhibieren oder verhindern, in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. In therapeutischer Hinsicht könnten Antikörper oder Fragmente des Antikörpermoleküls auch zum Neutralisieren der biologischen Aktivität von Tβ4 bei Krankheiten verwendet werden, bei denen Tβ4 überexprimiert ist. Solche Antikörper können ein Epitop von Tβ4 oder Fragmente davon erkennen, das für die Antikörpererkennung und Neutralisation der Tβ4-Aktivität geeignet ist. Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff „Epitop" bezieht sich auf eine Antigendeterminante auf einem Antigen, wie ein Tβ4-Peptid, an die sich das Paratop eines Antikörpers, wie ein Tβ4-spezifischer Antikörper, bindet. Antigendeterminanten bestehen gewöhnlich aus chemisch aktiven Oberflächengruppierungen von Molekülen, wie Aminosäuren oder Zuckerseitenketten, und können spezifische dreidimensionale Strukturcharakteristiken sowie spezifische Ladungscharakteristiken haben.
Die Herstellung eines Antikörpers setzt einen im Wesentlichen gereinigten Anteil voraus, der eine Antigendeterminante liefern kann. Der hierin verwendete Begriff „im Wesentlichen rein" bezieht sich auf Tβ4 oder Varianten davon, das/die im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten oder anderen Materialien ist/sind, mit denen es/sie naturbedingt assoziiert ist/sind. Im Wesentlichen gereinigt oder „isoliert" bezieht sich auf Moleküle, entweder Nuclein- oder Aminosäuresequenzen, die aus ihrer natürlichen Umgebung entfernt, isoliert oder separiert werden und wenigstens zu 60 %, vorzugsweise 75 % und am bevorzugtesten zu 90 % frei von anderen Komponenten sind, mit denen sie naturbedingt assoziiert sind. Die fachkundige Person kann Tβ4 oder eine Tβ4-Isoform mit Standardtechniken zur Proteinreinigung isolieren. Das im Wesentlichen reine Peptid erzielt eine einzelne Hauptbande auf einem nicht reduzierenden Polyacrylamidgel. Die Reinheit des Tβ4-Peptids kann auch anhand einer aminoterminalen Aminosäuresequenzanalyse bestimmt werden. Tβ4 oder ein Tβ4-Isoformpeptid beinhaltet funktionelle Fragmente des Peptids, solange die Aktivität von Tβ4 oder einer Tβ4-Isoform bestehen bleibt. Kleinere Peptide mit der biologischen Aktivität von Tβ4 oder einer Tβ4-Isoform sind in der Erfindung eingeschlossen. Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff „Antikörper" beinhaltet zusätzlich zu konventionellen Antikörpern Proteinfragmente, die das Tβ4-Protein oder Varianten davon spezifisch erkennen und binden können. Regionen des Gens, die sich auf Proteinebene unterscheiden, sind gut definiert. Ein Protein kann durch die Expression des Wildtyp-(wt)-Gens oder Varianten oder, vorzugsweise, Fraktionen davon angehoben werden. Die Nucleinsäuresequenz kann zum Beispiel in Expressionsvektoren kloniert werden. Gemäß dieser Ausgestaltung kann die Sequenz von Interesse zunächst durch PCR wie oben beschrieben oder von einer synthetischen Genkonstruktion mit überlappenden und ligierten synthetischen Oligonucleotiden erhalten werden. Eine weitere Alternative würde die Synthese eines kurzen Peptids beinhalten. Alle diese Methodiken sind der fachkundigen Person gut bekannt (siehe z.B. Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Band 1 und 2 (1987), mit Anlagen, und Maniatis et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, die hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind).
Die Erfindung stellt ein Verfahren für den Nachweis von Tβ4 oder Varianten davon bereit, das das Inkontaktbringen eines Anti-Tβ4-Antikörpers mit einer Probe, die vermutlich Tβ4 enthält (z.B. Zelle oder Protein), und das Nachweisen der Bindung an den Antikörper umfasst. Ein Antikörper, der sich an das Tβ4-Peptid bindet, wird mit einer Verbindung markiert, die den Nachweis der Bindung an Tβ4 ermöglicht. Es gibt viele verschiedene Marker und Markierungsverfahren, die der durchschnittlichen Fachperson bekannt sind. Beispiele für die Markertypen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind Enzyme, Radioisotope, fluoreszierende Verbindungen, Kolloidmetalle, chemilumineszierende Verbindungen, phosphoreszierende Verbindungen und biolumineszierende Verbindungen. Die durchschnittliche Fachperson wird andere geeignete Marker zum Binden an den Antikörper kennen oder diese durch routinemäßiges Experimentieren ermitteln können. Für die Zwecke der Erfindung kann ein für das Tβ4-Peptid spezifischer Antikörper verwendet werden, um den Anteil von Tβ4 in biologischen Fluids und Geweben festzustellen. Es kann jedes beliebige Testmaterial verwendet werden, das eine nachweisbare Antigenmenge enthält. Der Anteil von Tβ4 in der verdächtigen Zelle kann mit dem Anteil in einer normalen Zelle verglichen werden, um zu bestimmen, ob das Invididuum für eine Tβ4-assoziierte Zunahme der Angiogenese oder Wundheilung veranlagt ist.
Die Verwendung von Antikörpern für die Diagnoseverfahren der Erfindung beinhaltet zum Beispiel Immunoassays, in denen die Antikörper in flüssiger Phase oder gebunden an einen Festphasenträger verwendet werden können. Darüber hinaus können die Antikörper in diesen Immunoassays auf vielfältige Weise nachweisbar markiert werden. Beispiele für Immunoassaytypen, in denen Antikörper der Erfindung verwendet werden können, sind kompetitive und nichtkompetitive Immunoassays im direkten oder indirekten Format. Beispiele für solche Immunoassays sind der Radioimmunoassay (RIA) und der Sandwich-(immunometrische)-Assay. Der Nachweis von Antigenen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper kann mit Immunoassays erfolgen, die entweder im Vorwärts-, Rückwärts- oder simultanen Modus ablaufen, einschließlich immunhistochemischer Assays an physiologischen Proben. Die Fachperson wird andere Immunoassayformate kennen oder kann diese ohne unnötiges Experimentieren ohne weiteres ermitteln.
Tβ4-Antikörper können an viele verschiedene Träger gebunden und dazu verwendet werden, die Anwesenheit eines Antigens nachzuweisen, das das erfindungsgemäße Peptid umfasst. Zu Beispielen für allgemein bekannte Träger gehören Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen, natürliche und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetit. Der Träger kann im Hinblick auf die Erfindung entweder löslich oder unlöslich sein. Die Fachperson wird andere geeignete Träger zur Bindung von Antikörpern kennen oder diese durch routinemäßiges Experimentieren ermitteln können.
Eine weitere Technik, die auch eine höhere Sensitivität zur Folge haben kann, umfasst das Koppeln der Antikörper mit Haptenen von geringer relativer Molekülmasse. Diese Haptene können dann mit Hilfe einer zweiten Reaktion spezifisch nachgewiesen werden. Normalerweise werden zum Beispiel Haptene wie Biotin verwendet, das mit Avidin reagiert, oder Dinitrophenyl, Puridoxal und Fluorescein, die mit spezifischen Antihapten-Antikörpern reagieren können.
Die Erfindung beinhaltet die Verwendung von Antikörpern, die mit Tβ4-Peptid oder funktionellen Fragmenten davon immunoreaktiv sind. Es werden Antikörper, die im Wesentlichen aus gepoolten monoklonalen Antikörpern mit verschiedenen epitopischen Spezifitäten bestehen, sowie bestimmte monoklonale Antikörperpräparate bereitgestellt. Monoklonale Antikörper werden aus antigenhaltigen Fragmenten des Proteins durch Verfahren erzeugt, die der Fachperson allgemein bekannt sind (Kohler, et al., Nature, 256:495, 1975). Der in dieser Erfindung verwendete Begriff Antikörper beinhaltet intakte Moleküle sowie Fragmente davon, wie Fab und F(ab')₂, Fv und SCA Fragmente, die eine epitopische Determinante auf Tβ4 binden können.

(1) Ein Fab-Fragment besteht aus einem monovalenten antigenbindenden Fragment eines Antikörpermoleküls und kann durch den Verdau eines ganzen Antikörpermoleküls mit dem Enzym Papain produziert werden, um ein Fragment zu erhalten, das aus einer intakten leichten Kette und einem Teil einer schweren Kette besteht.
(2) Ein Fab'-Fragment eines Antikörpermoleküls kann erhalten werden durch Behandeln eines ganzen Antikörpermoleküls mit Pepsin, gefolgt von einer Reduktion, um ein Molekül zu erhalten, das aus einer intakten leichten Kette und einem Teil einer schwere Kette besteht. Zwei Fab'-Fragmente werden pro Antikörpermolekül erhalten, das auf diese Weise behandelt wird.
(3) Ein (Fab')₂-Fragment eines Antikörpers kann erhalten werden durch Behandeln eines ganzen Antikörpermoleküls mit dem Enzym Pepsin, ohne nachfolgende Reduktion. Ein (Fab')₂-Fragment ist ein Dimer von zwei Fab'- Fragmenten, die durch zwei Disulfidbindungen zusammengehalten werden.
(4) Ein Fv-Fragment ist als ein gentechnisch bearbeitetes Fragment definiert, das die variable Region einer leichten Kette und die variable Region einer schweren Kette enthält, exprimiert als zwei Ketten.
(5) Ein einkettiger Antikörper („SCA") ist ein gentechnisch bearbeitetes einkettiges Molekül, das die variable Region einer leichten Kette und die variable Region einer schweren Kette enthält, die durch einen geeigneten flexiblen Polypeptidlinker verknüpft sind.

Alternativ kann ein therapeutisch oder diagnostisch nützlicher Anti-Tβ4-Antikörper von einem „humanisierten" monoklonalen Antikörper gewonnen werden. Humanisierte monoklonale Antikörper werden durch Transferieren von Maus-„complementary determining regions" von schweren und leichten variablen Ketten des Mausimmunglobulins in eine humane variable Domäne und dann Substituieren humaner Rückstände in den Gerüstregionen der murinen Entsprechungen produziert. Durch die Verwendung von Antikörperkomponenten, die von humanisierten monoklonalen Antikörpern gewonnen werden, werden potentielle Probleme in Verbindung mit der Immunogenität muriner konstanter Regionen umgangen. Allgemeine Techniken zum Klonieren variabler Domänen von murinem Immunglobulin werden zum Beispiel von Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833 (1989) beschrieben, das hiermit in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Techniken zur Herstellung humanisierter monoklonaler Antikörper werden zum Beispiel von Jones et al., Nature 321: 522 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988); Carteret al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992); Sandhu, Crit. Rev. Biotech 12: 437 (1992); und Singer et al., J. Immunol. 150: 2844 (1993) beschrieben, die hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
Erfindungsgemäße Antikörper können außerdem von humanen Antikörperfragmenten gewonnen werden, die von einer kombinatorischen Immunglobulinbibliothek isoliert werden (siehe z.B. Barbas et al., METHODS: A COMPANION TO METHODS IN ENZYMOLOGY, BD. 2, Seite 119 (1991); Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12: 433 (1994), die hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen sind). Klonierungs- und Expressionsvektoren, die zur Herstellung einer humanen Immunglobulin-Phagenbibliothek nützlich sind, können zum Beispiel von STRATAGENE Cloning Systems (La Jolla, CA) erhalten werden.
Verfahren und Zusammensetzungen zur Behandlung oder Diagnose von Tβ4-assoziierten Störungen
In einer anderen Ausgestaltung der Erfindung wird ein Mittel zur Diagnose eines pathologischen Zustands in einem Individuum mit Verdacht auf eine Pathologie, die durch eine Störung in Verbindung mit Tβ4 charakerisiert ist, bereitgestellt. Der Anwendungsbereich beinhaltet das Bestimmen des Anteils von Tβ4 in einer Probe, die vermutlich Tβ4 enthält, von dem Individuum und Vergleichen des Anteils von Tβ4 in der Probe mit dem Anteil von Tβ4 in einer normalen Standardprobe. Solche Bedingungen schließen unter anderem Individuen mit Zellvermehrungsstörungen, wiederkehrenden Wunden, Gewebereparaturstörungen, fibrotischen Gewebestörungen, chronischen Geschwüren und anderen hierin beschriebenen Störungen ein. Solche Störungen beinhalten ferner solche in Verbindung mit den verschiedenen Tβ4-Isoformen, die bekannt oder noch nicht identifiziert sind.
Der Begriff „Zellvermehrungsstörung" betrifft maligne sowie nicht maligne Zellpopulationen, die sich oft vom umliegenden Gewebe sowohl morphologisch als auch genotypisch zu unterscheiden scheinen. Maligne Zellen (d.h. Krebs) entstehen infolge eines Mehrschrittprozesses. Solche Störungen können mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden. Zum Beispiel wird eine Probe, die vermutlich Tβ4 enthält, von einem Individuum erhalten, der Anteil von Tβ4-Peptid wird bestimmt und mit dem Anteil von Tβ4-Peptid in einer normalen Gewebeprobe verglichen. Der Anteil von Tβ4 kann mit einer Reihe von Verfahren bestimmt werden, wie zum Beispiel mit einem Immunoassay unter Verwendung von Anti-Tβ4-Peptid-Antikörpern. Andere Variationen solcher Assays sind der Radioimmunoassay (RIA), ELISA und Immunfluoreszenz. Alternativ können Nucleinsäuresonden für den Nachweis und die Quantifizierung von Tβ4-Peptid mRNA für denselben Zweck verwendet werden. Solche Nachweisverfahren sind in der Technik Standard.
In einer anderen Ausgestaltung stellt die Erfindung ein Mittel zur Linderung einer Wundheilungsstörung in Verbindung mit Tβ4 oder einer Tβ4-Isoform unter Verwendung einer Zusammensetzung bereit, die die Tβ4 Aktivität reguliert. Der Begriff „lindern" bedeutet eine Verringerung des nachteiligen Effektes der krankheitsauslösenden Reaktion in dem die Therapie empfangenden Individuum. Ist die Krankheit die Folge eines unnormal hohen Tβ4-Anteils, dann kann die Verabreichung eines Agens, wie z.B. ein Antagonist der Tβ4-Aktivität, den Grad an Tβ4-Aktivität wirksam verringern. Ist die Krankheit hingegen die Folge eines unnormal geringen Tβ4-Anteils, dann kann die Verabreichung von Tβ4 oder eines Agens, das die Tβ4-Aktivität erhöht, wie zum Beispiel ein Agonist, den Grad an Tβ4-Aktivität wirksam erhöhen.
In noch einer anderen Ausgestaltung stellt die Erfindung ein Mittel zur Behandlung eines Individuums mit einer Wundheilungsstörung bereit, die durch wiederkehrende oder langsam heilende Wunden oder durch chronische, nicht heilende Wunden in Verbindung mit einer veränderten Tβ4- oder Tβ4-Isoform-Genexpression in einem Individuum gekennzeichnet ist. Eine wirksame Wundheilungsmenge eines Agens zur Modulierung der Tβ4-Genexpression wird einem Individuum mit der Störung verabreicht, wodurch die Störung behandelt wird. Der Begriff „modulieren" betrifft die Inhibition oder Unterdrückung der Tβ4-Expression, wenn Tβ4 überexprimiert ist, und die Expressionsinduktion, wenn Tβ4 unterexprimiert ist. Der Begriff „wirksame Wundheilungsmenge" bezieht sich auf die Menge des Tβ4-Agens, die die Tβ4-Genexpression wirksam moduliert, woraus sich die Reduzierung der Symptome der mit Tβ4 assoziierten Wundheilungsstörung ergibt.
Ein Agens, das die Tβ4- oder Tβ4-Isoform-Genexpression moduliert, kann zum Beispiel ein Polynucleotid sein. Das Polynucleotid kann eine Antisense-Struktur, ein Triplex-Agens oder ein Ribozym sein. Es kann zum Beispiel die Antisense verwendet werden, die auf die strukturelle Genregion oder die Promotorregion von Tβ4 gerichtet sein kann.
Ist eine Wundheilungsstörung mit der Expression von Tβ4 verbunden, dann ist ein therapeutischer Ansatz möglich, der die Translation der Tβ4 mRNA in Protein direkt beeinflusst. Zum Beispiel kann eine Antisense-Nucleinsäure oder ein Ribozym zum Binden an die Tβ4 RNA oder um sie zu spalten, verwendet werden. Antisense-RNA- oder -DNA-Moleküle binden sich spezifisch an die RNA-Botschaft eines targetierten Gens, wobei die Expression des Proteinsprodukts dieses Gens unterbrochen wird. Die Antisense bindet sich an die mRNA und bildet ein doppelsträngiges Molekül, das von der Zelle nicht translatiert werden kann. Antisense-Oligonucleotide mit etwa 15-25 Nucleotiden werden bevorzugt, da sie ohne weiteres synthetisiert werden können und einen Inhibitionseffekt genau wie Antisense-RNA-Moleküle haben. Darüber hinaus können chemisch reaktive Gruppen wie eisenverknüpfte Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA-Fe) an ein Antisense-Oligonucleotid angelagert werden, wodurch es zu einer Spaltung der RNA am Ort der Hybridisierung kommt. Diese und andere Anwendungsbereiche für Antisense-Verfahren zur Inhibition der In-vitro-Translation von Genen sind in der Technik allgemein bekannt (Marcus-Sakura, Anal., Biochem., 172:289, 1988).
Antisense-Nucleinsäuren sind DNA- oder RNA-Moleküle, die zu wenigstens einem Teil eines spezifischen mRNA Moleküls komplementär sind (Weintraub, Scientific American, 262:40, 1990). In der Zelle hybridisieren die Antisense-Nucleinsäuren mit der entsprechenden mRNA und bilden ein doppelsträngiges Molekül. Die Antisense-Nucleinsäuren beeinflussen die Translation der mRNA, da die Zelle keine mRNA translatiert, die doppelsträngig ist. Antisense-Oligomere mit etwa 15 Nucleotiden werden bevorzugt, da sie ohne weiteres synthetisiert werden können und weniger wahrscheinlich Probleme hervorrufen als größere Moleküle, wenn sie in die Tβ4 produzierende Targetzelle eingeführt werden. Die Anwendung von Antisense-Verfahren zur Inhibition der In-vitro-Translation von Genen ist in der Technik allgemein bekannt (Marcus-Sakura, Anal. Biochem., 172:289, 1988).
Die Verwendung eines Oligonucleotids zum Aufhalten der Transkription ist als Triplex-Strategie bekannt, da sich das Oligomer um eine Doppelhelix-DNA windet und eine dreisträngige Helix bildet. Folglich können diese Triplex-Verbindungen so gestaltet werden, dass sie einen einmaligen Ort auf einem ausgewählten Gen erkennen (Maker, et al., Antisense Res. and Dev., 1(3):227, 1991; Helene, C., Anticancer Drug Design, 6 (6) :569, 1991).
Ribozyme sind RNA-Moleküle mit der Fähigkeit, spezifisch andere einzelsträngige RNAs in einer Weise zu spalten, die analog zu DNA-Restriktionsendonucleasen ist. Durch die Modifikation von Nucleotidsequenzen, die diese RNAs kodieren, können Moleküle konstruiert werden, die spezifische Nucleotidsequenzen in einem RNA-Molekül erkennen und es spalten [sic] (Cech, J. Amer. Med. Assn., 260:3030, 1988). Ein Hauptvorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass, da sie sequenzspezifisch sind, nur mRNAs mit bestimmten Sequenzen inaktiviert werden.
Es gibt zwei grundlegende Typen von Ribozymen, nämlich den Tetrahymena-Typ (Hasselhoff, Nature, 334:585, 1988) und den „Hammerkopf"-Typ. Ribozyme des Tetrahymena-Typs erkennen Sequenzen mit einer Länge von vier Basen, wohingegen „Hammerkopf"-Ribozyme Basensequenzen mit 11-18 Basen Länge erkennen. Je länger die Erkennungssequenz ist, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass die Sequenz ausschließlich in der mRNA-Zielgattung auftritt.
Diese und andere Anwendungsbereiche von Antisense-Verfahren zur Inhibition der In-vivo-Translation von Genen sind in der Technik allgemein bekannt (z.B. De Mesmaeker, et al., 1995; Backbone modifications in oligonucleotides and peptide nucleic acid systems; Curr. Opin. Struct. Biol. 5:343-355; Gewirtz, A.M., et al., 1996b; Facilitating delivery of antisense oligodeoxynucleotides: Helping antisense deliver on its promise; Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 93:3161-3163; Stein, C.A. A discussion of G-tetrads 1996; Exploiting the potential of antisense: beyond phosphorothioate oligodeoxynucleotides; Chem. and Biol. 3:319-323).
Die Zuführung von Antisense, Triplex-Agenzien, Ribozymen, kompetitiven Inhibitoren und dergleichen kann unter Verwendung eines rekombinanten Expressionsvektors, wie einem chimären Virus oder einem kolloiden Dispersionssystem, erreicht werden. Verschiedene virale Vektoren, die für die hierin gelehrte Gentherapie verwendet werden können, sind das Adenovirus, Herpesvirus, Vakziniavirus oder, vorzugsweise, ein RNA-Virus wie ein Retrovirus. Vorzugsweise ist der retrovirale Vektor ein Derivat eines murinen oder aviären Retrovirus. Beispiele für retrovirale Vektoren, in die ein einzelnes Fremdgen eingesetzt werden kann, sind unter anderem: das Moloney Murine Leukemia Virus (MoMuLV), Harvey Murine Sarcoma Virus (HaMuSV), Murine Mammary Tumor Virus (MuMTV) und Rous Sarcoma Virus (RSV). Eine Reihe zusätzlicher retroviraler Vektoren kann mehrere Gene beinhalten. Alle diese Vektoren können ein Gen für einen selektierbaren Marker transferieren oder aufnehmen, so dass transduzierte Zellen identifiziert und erzeugt werden können. Durch Einsetzen einer Polynucleotidsequenz von Interesse in den Virusvektor zusammen mit einem anderen Gen, das den Liganden für einen Rezeptor auf einer spezifischen Targetzelle kodiert, ist der Vektor jetzt zum Beispiel targetspezifisch. Retrovirale Vektoren können targetspezifisch gemacht werden, indem zum Beispiel ein Polynucleotid eingesetzt wird, das einen Zucker, ein Glykolipid oder ein Protein kodiert.
Vorzugsweise wird das Targeting durch die Verwendung eines Antikörpers zum Targetieren des retroviralen Vektors erreicht. Die Fachperson wird spezifische Polynucleotidsequenzen kennen oder ohne unnötiges Experimentieren ohne weiteres ermitteln können, die in das retrovirale Genom eingesetzt werden können, um eine targetspezifische Zuführung des retroviralen Vektors zu ermöglichen, der das Antisense-Polynucleotid enthält.
Da rekombinante Retroviren defekt sind, benötigen sie zur Produktion infektiöser Vektorpartikel Unterstützung. Diese Unterstützung kann zum Beispiel durch die Verwendung von Helfer-Zelllinien geleistet werden, die Plasmide enthalten, die alle Strukturgene des Retrovirus unter der Kontrolle von Regulationssequenzen innerhalb der LTR kodieren. Diesen Plasmiden fehlt eine Nucleotidsequenz, die es dem Verpackungsmechanismus ermöglicht, ein RNA-Transkript zur Enkapsidierung zu erkennen. Zu Helfer-Zelllinien mit Deletionen des Verpackungssignals gehören unter anderem zum Beispiel Ψ2, PA317 und PA12. Diese Zelllinien produzieren leere Virionen, da kein Genom verpackt wird. Wird ein retroviraler Vektor in solche Zellen eingebracht, in denen das Verpackungssignal intakt ist, die Strukturgene jedoch durch andere Gene von Interesse ersetzt sind, dann kann der Vektor verpackt und das Vektorvirion produziert werden.
Alternativ können NIH 3T3 oder andere Gewebekulturzellen direkt mit Plasmiden, die die retroviralen Strukturgene gag, pol und env kodieren, durch konventionelle Calciumphosphattransfektion transfiziert werden. Diese Zellen werden dann mit dem Vektorplasmid transfiziert, das die Gene von Interesse enthält. Die resultierenden Zellen geben den retroviralen Vektor in das Kulturmedium frei.
Ein targetiertes Zuführungssystem zur Zuführung von Nucleinsäuren, wie hierin beschrieben, beinhaltet ein kolloides Dispersionssystem. Kolloide Dispersionssysteme beinhalten Makromolekülkomplexe, Nanokapseln, Mikrosphären, Kügelchen, genaktivierte Matrizen und Systeme auf Lipidbasis, einschließlich Öl-in-Wasser-Emulsionen, Mizellen, Mischmizellen und Liposome. Das bevorzugte kolloide System der vorliegenden Erfindung ist ein Liposom. Liposome sind künstliche Membranvesikel, die als Zuführungsvehikel in vitro und in vivo von Nutzen sind. Es hat sich gezeigt, dass große unilamellare Vesikel (LUV) mit einer Größe von 0,2 bis 4,0 μm einen beträchtlichen prozentualen Anteil eines wässrigen Puffers, der große Makromoleküle enthält, einkapseln können. RNA, DNA und intakte Virione können im wässrigen Inneren eingekapselt und in biologisch aktiver Form Zellen zugeführt werden (Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). Neben Säugetierzellen werden Liposome zur Zuführung von Polynucleotiden in Pflanzen-, Hefe- und Bakterienzellen verwendet. Damit ein Liposom ein effizientes Gentransfervehikel ist, müssen die folgenden Charakteristiken vorliegen: (1) hocheffiziente Einkapselung der Gene von Interesse, während gleichzeitig ihre biologische Aktivität nicht gefährdet wird; (2) bevorzugte und wesentliche Bindung an eine Targetzelle im Vergleich zu Nichttargetzellen; (3) hocheffiziente Zuführung des wässrigen Inhalts des Vesikels zum Targetzellzytoplasma; und (4) genaue und effektive Expression genetischer Informationen (Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988).
In pathologischer Hinsicht kann Tβ4 in Krankheiten involviert sein, bei denen es ein übermäßiges Wachstum von Blutgefäßen gibt, wie z.B. Krebs, Tumorbildung und -wachstum, diabetische Retinopathie, neovaskuläres Glaukom, Rheumatoidarthritis und Psoriasis.
Das Einwachsen von Kapillaren und Nebenblutgefäßen ist für das Wachstum solider Tumore wesentlich und somit eine unerwünschte physiologische Reaktion, die die Ausbreitung von malignem Gewebe und Metastasen erleichtert. Die Inhibition der Angiogenese und des resultierenden Wachstums von Kapillaren und Blutgefäßen ist daher eine Komponente einer wirksamen Behandlung von Malignität bei der Behandlung von Krebspatienten.
In einer anderen Ausgestaltung stellt die Erfindung daher ein Mittel zum Inhibieren von Angiogenese in einem Individuum unter Verwendung einer Zusammensetzung bereit, die ein Agens enthält, das die Tβ4 Aktivität reguliert. Die Zusammensetzung kann Agenzien enthalten, die eine Angiogenese regulieren, wie zum Beispiel Agenzien, die Thymosin αl, PDGF, VEGF, IGF, FGF und TGFβ beeinflussen. Die Inhibition einer Angiogenese und Endothelzellmigration kann zum Kontrollieren des Wachstums solider Tumore von Vorteil sein. Die meisten, wenn nicht alle soliden Tumore benötigen genau wie normales Gewebe eine stetige und ausreichende Blutversorgung für ein optimales Wachstum. Tumore machen sich bekanntlich angiogene Wachstumsfaktoren zunutze, um neue Blutgefäße anzuziehen und die Versorgung mit ausreichenden Nährstoffmengen zur Beibehaltung ihres Wachstums sicherzustellen. Viele Tumore sind gut vaskularisiert und die Inhibition des Aufbaus einer angemessenen Blutversorgung des Tumors durch Inhibieren der Tumorvaskularisation infolge der Angiogeneseinhibition ist zur Bekämpfung des Tumorwachstums von Vorteil. Ohne eine gute Blutversorgung kann ein schnelles und andauerndes Tumorwachstum nicht aufrechterhalten werden. Agenzien, die die Tβ4-Aktivität inhibieren, können somit zur Verhinderung von neoplastischem Wachstum verwendet werden. Das Tβ4-Inhibitionsagens kann oral, parenteral, topisch, intravenös oder systemisch verabreicht werden. Außerdem kann das Agens zur Inhibition der Tumorzellvermehrung und des Tumorwachstums lokal direkt zum Tumor geführt oder als Bestandteil einer deponierten langsam freigesetzten Formulierung verabreicht werden. Die Verabreichung kann täglich so lange wie nötig erfolgen, um Angiogenese, Endothelzellvermehrung, Tumorzellvermehrung oder Tumorwachstum zu inhibieren. Alternativ kann eine langsam freigesetzte Formulierung so lange wie nötig wirken, um Tumorwachstum zu bekämpfen. Dieser Dosierungsplan kann so angepasst werden, dass eine optimale therapeutische Reaktion erreicht wird. Es können zum Beispiel täglich mehrere unterteilte Dosen verabreicht werden, oder die Dosis kann je nach den Anforderungen der therapeutischen Situation proportional reduziert werden.
In dieser Hinsicht enthalten die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die als Inhibitoren von Angiogenese, Endothelzellvermehrung, Tumorzellvermehrung und Tumorwachstum nützlich sind, einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und eine Menge eines Tβ4 modulierenden Agens, das die Tumor- oder Endothelzellvermehrung wirksam inhibiert. Zu solchen Zusammensetzungen können auch Konservierungsstoffe, Antioxydationsmittel, Immunosuppressoren und andere biologische und pharmazeutisch wirksame Agenzien gehören, die sich auf das Tumorwachstum auswirken, die jedoch keine nachteilige Wirkung auf das Tβ4 modulierende Agens haben. Zur Behandlung von Tumorzellen kann die Zusammensetzung ein Chemotherapeutikum enthalten, zum Beispiel Antikrebsagenzien, die selektiv die sich schneller replizierenden Tumorzellen abtöten, von denen viele bekannt sind und klinisch eingesetzt werden. Zu Antikrebsagenzien gehören zum Beispiel Mephalan, Cyclophosphamid, Methotrexat, Adriamycin und Bleomycin.
Screening im Hinblick auf Verbindungen, die Tβ4 Aktivität modulieren
In einer anderen Ausgestaltung stellt die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung bereit, die Tβ4-Aktivität, Angiogenese-Aktivität oder Wundheilungsaktivität moduliert. Das Verfahren beinhaltet das Inkubieren von Komponenten, einschließlich der Verbindung und Tβ4, unter Bedingungen, die zur Interaktion der Komponenten ausreichen, und das Bestimmen der Wirkung der Verbindung auf die Tβ4-Aktivität vor und nach dem Inkubieren in Anwesenheit der Verbindung. Verbindungen, die die Tβ4-Aktivität beeinflussen (z.B. Antagonisten und Agonisten) sind Peptide, Peptidonachahmer, Polypeptide, chemische Verbindungen, Mineralien wie Zink und biologische Agenzien. Tβ4-Aktivität kann unter Anwendung der in den vorliegenden Beispielen beschriebenen Methodik geprüft werden.
Die vorliegenden Beispiele sollen den Umfang der angefügten Ansprüche illustrieren, aber nicht beschränken. Folglich wird die Fachperson eine Reihe äquivalenter Materialien und Verfahren erkennen, die durch die vorliegende Erfindung und Offenbarung erfasst sein sollen.
1. BEISPIEL
In-vivo-Wundheilung wird durch Tβ4 beschleunigt
Topisch oder intraperitoneal verabreichtes Tβ4 beschleunigt die Wundheilung wesentlich im Vergleich zu unbehandelten Wunden (2 und 3). 8-mm-Punch-Biopsie-Vollhautwunden wurden auf der Rückenoberfläche von Ratten wie zuvor berichtet (Bhartiya et al., J. Cell. Physiol. 150:312, 1992; Sihhu et al., J. Cell. Physiol. 169:108, 1996) erzeugt und Tβ4 wurde zum Zeitpunkt der Verwundung (5 μg in 50 μl) und noch einmal nach 48 Stunden topisch verabreicht. Kontrollen zur topischen Behandlung erhielten identische Mengen an Salzlösung zum Zeitpunkt der Verwundung und nach 48 Stunden. Weitere Ratten erhielten intraperitoneale Injektionen zum Zeitpunkt der Verwundung (60 μg in 300 μl) und danach an jedem zweiten Tag (z.B. Tag 0, 2, 4 und 6). Kontrollen zu diesen Tieren erhielten intraperitoneal identische Mengen an Salzlösung im Rahmen des gleichen Injektionsplans. Am 4. und 7. Tag nach der Verwundung wurde die Wundgröße gemessen. Am 8. und 9. Tag nach der Verwundung wurde Gewebe entnommen und in 10%igem gepufferten Formalin fixiert. Die Proben wurden zerschnitten und mit H&E und Masson'schem Trichrom (American Histolabs, Gaithersburg, MD) gefärbt.
Histologische Sektionen wurden verwendet, um die Reepithelialisierung und die Kontraktion der Wunde mit einem Okularmikrometer zu messen. Die epidermale Migration wurde durch Messen der Länge der Epithelgewebezungen bestimmt, die von den jeweiligen Seiten der Wunde über das Wundbett von der Proliferationszone am Rand der nicht verletzten und verwundeten Haut migrierten. Die Epidermisdicke wurde ebenfalls gemessen, beginnend an der Verbindungstelle der nicht verletzten und proliferierenden Epidermis. Die Dicke wurde vertikal von der Basalmembran zur oberflächlichsten Lage der migrierenden Epidermis alle 200 Mikron gemessen. Anschließend wurde die mittlere Epidermisdicke jeder migrierenden Epidermiszunge von jeder Wunde berechnet. Es fanden Gefäßzählungen statt, indem zuerst Gefäßräume anhand ihrer Endothelauskleidung ermittelt wurden. Alle diese Gefäße im Wundbett wurden gezählt, einschließlich solcher an der Verbindung von Dermis und Subkutis, da eine Angiogenese in die Wunden in hohem Maße von diesen Gefäßen stattfindet. Die Zahlen wurden zu Gefäßanzahlen pro 10 stark vergrößerter Felder (40 x) gemittelt.
Die Wirkung von Tβ4 auf die Wundheilung wurde in einem Modell einer kutanen Rattenvollhautwunde untersucht. 1 zeigt ein Schaubild der Wundstelle, die von der Epidermis zur Fett-/Muskelschicht verläuft. Dieses Modell lässt die Messung von zwei Parametern zu: die Reepithelialisierung (Spalt) und die Kontraktion (Breite) der Wunde. Wunden, die topisch mit Tβ4 behandelt wurden, wiesen einen Rückgang der Breite von etwa 15 % und einen Rückgang des Spalts von etwa 15 % bei den behandelten Ratten gegenüber den Kontrollen auf (jeweils 2 und 3).
2 zeigt bereits 4 Tage nach der Verwundung einen Rückgang der Wundbreite von 15 % im Vergleich zu den Salzlösungskontrollen, der sich bis zum 7. Tag fortsetzt.
Die intraperitoneale Injektion von Tβ4 resultierte am 4. Tag in einem Rückgang der Wundbreite von 18 % im Vergleich zu den mit Salzlösung behandelten Kontrollen und am 7. Tag in einem Rückgang von 11 %. Dieser Trend wurde am 4. Tag nach der Verwundung beobachtet und setzte sich bis zum 7. Tag fort (*P ≤ 0,0001, **P ≤ 0,08, bedeutender Unterschied zu Medium alleine, t-Test nach Student). Diese Daten zeigen, dass topisch oder systemisch verabreichtes Tβ4 die Wund-Reepithelialisierung und -Kontraktion erhöht. Die topische und systemische Behandlung sind gleichermaßen wirksam. Es wurden geringere Tβ4-Dosen getestet, wie 2,5 g und 0,5 μg in 50 μl für die topische Behandlung und 30 μg und 6 μg in 300 μl für die intraperitoneale Injektion, es wurde allerdings jeweils eine reduzierte oder keine Wirkung auf die Wundheilung beobachtet.
3 zeigt bei der topischen Verabreichung von Tβ4 bereits 4 Tage nach der Verwundung einen Rückgang der Spaltlänge von 18 % gegenüber den Salzlösungskontrollen. Dieser Trend setzte sich bis zum Ende am 7. Tag fort (*P ≤ 0,04, t-Test nach Student). Intraperitoneale Injektionen resultierten in einem Rückgang der Spaltgröße von 42 % im Vergleich zu den mit Salzlösung behandelten Kontrollen. Dieser Rückgang wurde am 4. Tag nach der Verwundung beobachtet und setzte sich bis zum 7. Tag fort (**P ≤ 0,0007, t-Test nach Student). Eine Zunahme der Reepithelialisierung wurde in 7 Tage lang behandelten Wunden beobachtet und die Spaltschließungsgeschwindigkeit war gegenüber der am 4. Tag leicht erhöht. In den mit Tβ4 behandelten Wunden wurde ein Rückgang der Spaltgröße von 62 beobachtet. Die quantitative Bestimmung der Epidermismigration ergab eine statistisch bedeutende 1,5fache Zunahme der Migration von Epidermiszungen über das Wundbett im Anschluss an eine topische Behandlung (Tabelle 1). Die quantitative Bestimmung der Epithelmigration in intraperitoneal behandelten Wunden ergab eine statistisch bedeutende Zunahme der Migration von Epidermiszungen im Vergleich zu den Kontrollen (Tabelle 1). Es gab keinen Unterschied im Hinblick auf die Dicke der migrierenden Epidermis zwischen den beiden Tβ4-Behandlungen und der Kontrolle (Tabelle 1). Histologische Sektionen der Wunden zeigen deutlich eine erhöhte Reepithelialisierung in den behandelten Wunden im Vergleich zu den Kontrollen bei 7 Tage alten Wunden (4).
Tabelle 1
4 zeigt einen Vergleich zwischen typischen Kontroll- (D) und mit Tβ4 behandelten (E und F) Sektionen von 7 Tage alten Wunden. Die Behandlung mit Tβ4 führte zu einem erheblichen Kapillareinwachsen (4E und F, Pfeile). Gefäßzählungen ergaben eine bedeutende (etwa 2fache) Zunahme der Anzahl von Gefäßen in mit Tβ4 behandelten Wunden (Tabelle 1). Es wurden keine Zunahmen der Anzahl von Makrophagen in den Wunden beobachtet. Es gab keine offensichtliche Zunahme der Ansammlung/Biosynthese von Kollagen in mit Tβ4 behandelten Wunden (5B und C vs A), wodurch eine verringerte Wundbreite unterstützt und eine Rolle von Tβ4 in der Wundkontraktion belegt wurde. Die topisch und systemisch behandelten Wunden hatten ein ähnliches Aussehen, obschon die Wundkontraktion bei der topischen Behandlung etwa schneller vonstatten ging.
Eine Verringerung der Wundgröße wurde in beiden Versuchsgruppen im Vergleich zu den Kontrollgruppen beobachtet (2 – 4). Mehr und größere Blutgefäße wurden in den Versuchsgruppen im Vergleich zu den Kontrollen beobachtet (4). Ferner legt eine Zunahme der Ansammlung/Biosynthese von Kollagen in mit Tβ4 behandelten Wunden im Vergleich zur Kontrolle nahe, dass Tβ4 in der Wundkontraktion und extrazellulären Matrixablagerung eine Rolle spielt. Eine histologische Färbung dieser Wunden demonstrierte eine Zunahme der Kollagendichte und extrazellulären Matrixablagerung im Vergleich zu den Kontrollen (5).
2. BEISPIEL
Migrationsassays von Keratinozyten
Primärkeratinozyten wurden von neugeborenen Balb/c oder CD-1 Mäusen wie zuvor beschrieben (Dlugosz et al., 1995) präpariert. Zellen wurden in calcium- und magnesiumfreiem Eagle Minimal Essential Medium (EMEM), das 8 % fötales Kälberserum enthielt, plattiert, mit 8 % Chelex (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), 20 Einheiten/ml Penicillin-Streptomycin behandelt, und die Calciumkonzentration wurde auf 0,25 mM eingestellt. Am nächsten Tag wurden die Kulturen mit calcium- und magnesiumfreier, phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen, kurz mit Trypsin (Life Technologies, Gaithersburg, MD) behandelt, mit Kulturmedium gewaschen und in EMEM, das 0,05 mM Calcium enthielt, resuspendiert. Die Zellen wurden sofort in Migrationsassays verwendet.
Keratinozytenmigrationsassays wurden in einer Boyden-Kammer Polyestermembranen mit 12 μm Poren (Poretics, Livermore, CA) durchgeführt, die mit einer 0,1 mg/ml Lösung aus Kollagen IV in dH₂O (Trevigen, Gaithersburg, MD) beschichtet wurden. Die Filter wurden dann mindestens 1 Stunde lang getrocknet. Zellen wurden mit Versen oder Trypsin (Life Technologies, Gaithersburg, MD) geerntet und in Eagle Minimal Essential Medium mit 0,05 mM Ca²⁺ resuspendiert. Die untere Kammer wurde mit EMEM, das 0,01, 0,1, 10, 100 und 1000 ng/ml synthetisches Tβ4 enthielt, befüllt. Konditioniertes Medium von primären Hautfibroblasten und/oder Keratinozytenwachstumsfaktor wurde in mehrere Wells als positive Kontrolle gegeben. Zellen wurden in die obere Kammer in einer Konzentration von 50.000 Zellen pro Well gegeben. Die Kammern wurden 4 bis 5 Stunden lang bei 35 C/7 % CO₂ inkubiert, anschließend wurden die Filter fixiert und mit Diff-Quik (Baxter Healthcare Corporation, McGraw Park, IL) gefärbt. Die durch den Filter migrierenden Zellen wurden durch Zählen der Mitte jedes Wells mit 10facher Vergrößerung mittels eines Olympus CK2 Mikroskops quantitativ bestimmt. Jede Bedingung wurde in Wells dreifacher Ausfertigung untersucht und jeder Versuch wurde viermal mit unterschiedlichen Zellpräparaten wiederholt.
Die Ergebnisse zeigten, dass Keratinozyten als Reaktion auf Tβ4 nach einer 4- bis 5-stündigen Einwirkung migrierten. Die Migration wurde um das Zwei- bis Dreifache (P ≤ 0,003) gegenüber der Migration in Anwesenheit von Medium alleine (6) erhöht und übertraf die positive Kontrolle bei der maximalen Reaktionsdosis. Zwar wurden geringfügig unterschiedliche Dosiskurven je nach dem Zellpräparat und der Quelle dargestellt, doch ergab die Wirkung von Tβ4 auf die Migration eindeutig ein biphasisches Muster, wobei 1000 ng/ml und 0,01 ng/ml die stärkste Migration ergaben und die mittleren Dosen eine geringere Stimulation (aber immer noch höher als das Kontrollmedium) in allen 4 Assays lieferten.
3. BEISPIEL
Migrationsassays von Hornhautepithelzellen
Migrationsassays von Hornhautepithelzellen wurden in einer Boyden-Kammer Polyestermembranen mit 12 μm Poren (Poretics, Livermore, CA) durchgeführt, die mit einer 0,1 mg/ml Lösung aus Kollagen IV in dH20 (Trevigen, Gaithersburg, MD) beschichtet wurden. Die Filter wurden anschließend mindestens 1 Stunde lang getrocknet. Zellen wurden kultiviert und in Eagle Minimal Essential Medium mit 0,05 mM Ca²⁺ resuspendiert. Die untere Kammer wurde mit EMEM, das 0,01, 0,1, 10, 100 und 1000 ng/ml synthetisches Tβ4 enthielt, befüllt. Konditioniertes Medium von primären Hautfibroblasten und/oder Keratinozytenwachstumsfaktor wurde in mehrere Wells als positive Kontrolle gegeben. Zellen wurde in die obere Kammer in einer Konzentration von 50.000 Zellen pro Well gegeben. Die Kammern wurden 4 bis 5 Stunden lang bei 35 C/7 % CO₂ inkubiert, anschließend wurden die Filter fixiert und mit Diff-Quik (Baxter Healthcare Corporation, McGraw Park, IL) gefärbt. Die durch den Filter migrierenden Zellen wurden durch Zählen der Mitte jedes Wells mit 10facher Vergrößerung unter Verwendung eines Olympus CK2 Mikroskops quantitativ bestimmt. Jede Bedingung wurde in Wells dreifacher Ausfertigung untersucht und jeder Versuch wurde viermal mit unterschiedlichen Zellpräparaten wiederholt. Die Ergebnisse zeigten, dass Hornhautepithelzellen als Reaktion auf Tβ4 nach einer 4- bis 5-stündigen Einwirkung migrierten. Die Migration wurde um das Zwei- bis Dreifache gegenüber der Migration in Anwesenheit von Medium alleine (7) verbessert, wobei das höchste Migrationsniveau bei 100 ng/ml Tβ4 vorlag.
4. BEISPIEL
In-vivo-Hornhautreepithelialisierung
Zum Bestimmen der Wirkung von Tβ4 auf die In-vivo-Hornhautreepithelialisierung wurden Hornhäute von Ratten entepithelialisiert und mit Tβ4 behandelt. Filter wurden in Heptanol eingeweicht, 30 Sekunden lang auf das Auge aufgebracht und anschließend wurde das Epithelgewebe abgeschabt. Verschiedene Tβ4-Konzentrationen in Salzlösung wurden auf das Auge aufgebracht und nach 24 Stunden wurden die Ratten geopfert. Die Augen wurden fixiert, zerschnitten und der Grad an Hornhautepithelmigration (gemessen in Pixel) wurde mit einem Mikroskop mit einem inneren Dickenmesser durch einen maskierten Observer bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Reepithelialisierung der Hornhaut gegenüber der nicht behandelten Kontrolle in Anwesenheit von etwa 1 bis 25 μg Tβ4 um das Zweifache erhöht war (8 und 9). Darüber hinaus wurde festgestellt, dass mit Tβ4 behandelte Augen im Vergleich zu den nicht behandelten Hornhäuten eine geringere Entzündung aufwiesen.
5. BEISPIEL
Modell einer beeinträchtigten Heilung
Thymosin β4 verbesserte die Wundheilung auch in einem Modell einer beeinträchtigten Heilung. Eine Steroidbehandlung verringert die Wundreparaturrate bei Säugetieren. Mit Steroiden wie Hydrokortison behandelte Ratten dienen als Modell einer beeinträchtigten Wundheilung aufgrund der beim Wundverschluss beobachteten Verzögerung. Den Tieren wurde täglich intramuskulär Hydrokortison injiziert. Die mit Steroiden behandelten Ratten wiesen eine bedeutende Zunahme des Heilungsgrads auf, als Tβ4 topisch verabreicht oder intraperitoneal injiziert wurde. Zum Ausgangszeitpunkt, Tag 4, zeigten die topisch behandelten Tiere kaum Reaktion (≤ 7 % Spalt- oder Breitenverschluss, N=3) im Vergleich zur Salzlösungsbehandlung. Die intraperitoneale Injektion erzielte jedoch einen Rückgang der Spaltgröße von 28 % und einen Rückgang der Wundbreite von 14 %. Am 7. Tag wurde sowohl bei der topischen Behandlung als auch bei der intraperitonealen Injektion eine Reaktion beobachtet.
Der Spalt bei den topisch behandelten Tieren verringerte sich um 39 % im Vergleich zur Salzlösungsbehandlung. Die Wundbreite verringerte sich um 23 %. Die intraperitoneale Injektion resultierte in einem Rückgang der Spaltgröße von 26 % und einem Rückgang der Wundbreite von 10 %. Insgesamt wird hierdurch demonstriert, dass Tβ4 zur Behandlung chronischer und akuter Wunden von Nutzen ist.
Es wurde eine Reihe von Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung beschrieben. Dennoch ist zu verstehen, dass verschiedene Modifikationen möglich sind, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Demzufolge befinden sich andere Ausgestaltungen innerhalb des Umfangs der folgenden Ansprüche.

Claims

Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz LKKTET oder eine konservative Variante davon, wobei das Polypeptid die Eigenschaft einer Epithelzellen-Migrationsstimulationsaktivität hat, zur Herstellung eines Medikamentes zur Förderung der Epithelzellmigration.
Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz LKKTET oder eine konservative Variante davon, wobei das Polypeptid die Eigenschaften einer Aktin-Sequestrierungs- oder Aktin-Bindefähigkeit und Wundheilungsaktivität hat, zur Herstellung eines Medikamentes zur Förderung der Wundheilung, wobei die Zusammensetzung für eine topische Zuführung, Inhalation, systemische Verabreichung, orale Verabreichung, intranasale Verabreichung, intravenöse Verabreichung, intraperitoneale Verabreichung, intramuskuläre Verabreichung, intrakavitäre Verabreichung oder transdermale Verabreichung geeignet ist.
Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend: (i) ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz LKKTET oder eine konservative Variante davon, wobei das Polypeptid die Eigenschaften einer Aktin-Sequestrierungs- oder Aktin-Bindefähigkeit und Wundheilungsaktivität hat, und (ii) ein zweites Mittel, das die Wundheilungsaktivität unterstützen oder stimulieren kann, wobei das zweite Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus angiogenen Mitteln, Wachstumsfaktoren, Mitteln, die die Differenzierung von Zellen lenken, Mitteln, die die Migration von Zellen fördern, und Mitteln, die die Bereitstellung extrazellulärer Matrixmaterialien im Wundbett stimulieren, zur Herstellung eines Medikamentes zur Förderung der Wundheilungsaktivität.
Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend: (i) ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz LKKTET oder eine konservative Variante davon, wobei das Polypeptid die Eigenschaften einer Aktin-Sequestrierungs- oder Aktin-Bindefähigkeit und Wundheilungsaktivität hat, und (ii) ein zweites Mittel, das die Produktion von Thymosin β4 stimulieren kann, wobei das zweite Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Insulinähnlichern Wachstumsfaktor (IGF-1), aus Blutplättchen gewonnenem Wachstumsfaktor (PDGF), epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), von transformierten Zellen gebildetem Wachstumsfaktor Beta (TGF-β), basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), Thymosin α1 (T α1) und vaskulärem Endothelwachstumsfaktor (VEGF), zur Herstellung eines Medikamentes zur Förderung der Wundheilungsaktivität.
Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz LKKTET oder eine konservative Variante davon, wobei das Polypeptid die Eigenschaften einer Aktin-Sequestrierungs- oder Aktin-Bindefähigkeit und entzündungshemmenden Aktivität hat, zur Herstellung eines Medikamentes zur Reduzierung einer Augenentzündung eines Patienten.
Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz LKKTET oder eine konservative Variante davon, wobei das Polypeptid nicht Thymosin β4 ist, wobei das genannte Polypeptid die Eigenschaften einer Aktin-Sequestrierungs- oder Aktin-Bindefähigkeit und Wundheilungsaktivität hat, zur Herstellung eines Medikamentes zur Förderung der Wundheilung.
Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid, ausgewählt aus Gelsolin, Vitamin-D-Bindeprotein (DBP), Profilin, Cofilin, Depactin, DnaseI, Vilin, Fragmin, Severin, Capping-Protein, Beta-Aktinin, Akumentin, Tβ4ala, Tβ9, Tβ11, Tβ12, Tβ13, Tβ14 und Tβ15, wobei das genannte Polypeptid die Eigenschaften einer Aktin-Sequestrierungs- oder Aktin-Bindefähigkeit und Wundheilungsaktivität hat, zur Herstellung eines Medikamentes zur Förderung der Wundheilung.
Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 5, wobei das Polypeptid Thymosin β4 oder eine Isoform von Thymosin β4 umfasst.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Zusammensetzung zur topischen Zuführung geeignet ist.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Zusammensetzung in einer topischen Formulierung enthalten ist, ausgewählt aus einem Gel, einer Creme, Paste, Lotion, einem Spray, einer Suspension, Dispersion, einem Balsam, Hydrogel und einer Salbe.
Verwendung nach Anspruch 1 bis 8, wobei die Zusammensetzung zur systemischen Zuführung geeignet ist.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Polypeptid rekombinant oder synthetisch ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Polypeptid eine Isoform von Thymosin β4 ist, die zu wenigstens 70 % homolog zu Thymosin β4 Peptid ist, das als SEQ ID Nr. 1 in 10 dargestellt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Polypeptid eine Isoform von Thymosin β4 ist, ausgewählt aus Tβ4^ala, Tβ9, Tβ10, Tβ11, Tβ12, Tβ13, Tβ14 und Tβ15.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gelsolin, Vitamin-D-Bindeprotein (DBP), Profilin, Cofilin, Depactin, DnaseI, Vilin, Fragmin, Severin, Capping-Protein, β-Aktinin und Akumentin.
Verwendung nach den Ansprüchen 1-4 und 6-15, wobei die Zusammensetzung zur Wundheilung in einem Gewebe geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei das Gewebe ausgewählt ist aus epidermalem, Augen-, urogenitalem, gastrointestinalem, kardiovaskulärem, Muskel-, Binde- oder Nervengewebe.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei das Gewebe Hautgewebe ist.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei das Mittel von transformierten Zellen gebildeter Wachstumsfaktor Beta (TGF-b) ist.
Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei die Zusammensetzung ferner ein Mittel enthält, das die Produktion von Thymosin β4 Peptid stimuliert.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Mittel Zink ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Wundheilungsfragment eines Polypeptids, umfassend die Aminosäuresequenz LKKTET oder eine konservative Variante davon, wobei das genannte Fragment die Eigenschaften einer Aktin-Sequestrierungs- oder Aktin-Bindefähigkeit und Wundheilungsaktivität hat, wobei die Zusammensetzung ferner einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei das Wundheilungspolypeptid ein Fragment von Thymosin β4 oder eine Isoform von Thymosin β4 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22 in einer Formulierung mit kontrollierter Freisetzung.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22 in einer liposomalen Form.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22 in einer lyophilisierten Form.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22 in einer Einheitsdosisform.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22 in Kombination mit einem Mittel zur Förderung der Wundheilung.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 28, wobei das Mittel ausgewählt ist aus VEGF, KGF, FGF, PDGF, TGFβ, IGF, IGF-1, IGF-2, IL-1, Prothymosin α und Thymosin α1 oder Kombinationen davon.