DE69927280T2

DE69927280T2 - Verfahren zur verdrängungschromatographie

Info

Publication number: DE69927280T2
Application number: DE69927280T
Authority: DE
Inventors: Erik Agner
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-10-20
Filing date: 1999-10-20
Publication date: 2006-07-06
Anticipated expiration: 2019-10-21
Also published as: US6576134B1; JP2002527773A; JP4424854B2; AU6352099A; EP1123505B1; DE69927280D1; GB9822963D0; CA2347026A1; ATE304702T1; WO2000023798A1; CA2347026C; EP1123505A1

Description

Diese Erfindung betrifft die chromatographische Trennung, spezifischer ein neues und verbessertes Verfahren der Probenverdrängungschromatographie und dessen Anwendungen, als auch eine für diese Verfahren nützliche Vorrichtung.
In den letzten 10–15 Jahren ist die Verdrängungschromatographie als eine Alternative zur Flüssigchromatographie unter Verwendung von Elutionstechniken vorgeschlagen worden. Bei der Elutionschromatographie werden die Komponenten einer Probe an einem Chromatographiebett, welches ein stationäres Phasenmaterial, z.B. in einer Säule, umfasst, mittels einer mobilen Lösungsmittelphase entlang transportiert. Die verschiedenen Komponenten welchselwirken mit dem stationären Phasenmaterial auf unterschiedlichen Höhen und werden daher in Bande getrennt. Die Verdrängungschromatographie dagegen verwendet als mobile Phase eine Verdrängungslösung, die eine höhere Affinität für das stationäre Phasenmaterial als die Probenkomponenten aufweist. Im Falle der Säulenchromatographie werden die Probenkomponenten daher verdrängt und vor der Verdrängungsfront her durch die Säule getrieben, wobei sie im Vorwärtswandern um Adsorptionsstellen konkurrieren und sich in Banden der Einzelkomponenten auftrennen.
Während die Elutionschromatographie normalerweise zu einer beträchtlichen Verdünnung des Probenmaterials führt, erlaubt die Verdrängungschromatographie die Rückgewinnung der Probenkomponenten bei wesentlich höheren Konzentrationen und nutzt sie das stationäre Phasenmaterial im Allgemeinen effizienter aus. Allerdings leidet die Verdrängungschromatographie unter dem Nachteil, dass zur Erzielung optimaler Ergebnisse die Betriebsbedingungen, wie etwa die Zusammensetzung, Konzentration und Fließgeschwindigkeit der Verdrängungslösung, spezifisch für die einzelnen Probentypen angepasst werden muss.
Bei der Probenverdrängungschromatographie handelt es sich um eine Selbstverdrängungstechnik, die zuerst vorgeschlagen wurde von Hodges et al. [J. Chromatogr. 444 (1988), S. 349–362] für die präparative Reinigung von Peptiden durch Umkehrphasen-HPLC, die das Erfordernis einer fremdstofflichen Verdrängungslösung überflüssig macht. Die Peptidkomponenten werden auf den Säulenzulauf aufgegeben und konkurrieren selbst um die Bindungsstellen an der stationären Phase, während sie durch die Säule oder Säulenreihe durch ein geeignetes Lösungsmittel getragen werden. Die stärker bindenden Komponenten binden zuerst und verdrängen weniger stark bindende Komponenten weiter entlang der Säule(n). Die Komponenten werden daher entsprechend ihrer unterschiedlichen Grade an Hydrophobizität/Hydrophilizität und folglich ihrer Affinität für das stationäre Phasenmaterial getrennt. In einem repräsentativen Beispiel wird eine kurze Vorsäule zum Einfangen von Unreinheiten verwendet, die hydrophober als die gewünschte Probenkomponente sind, wobei diese letztere in der Hauptsäule rückgehalten wird und sie sättigt, während die hydrophileren Unreinheiten weiter verdrängt und so aus der Hauptsäule ausgewaschen werden. Es wird vorgeschlagen, dass die Größe der Vorsäule in Anpassung an die Menge der hydrophoben Unreinheiten, die in einer bestimmten Probe vorhanden sind, eingestellt werden kann, wohingegen die Größe der Hauptsäule auf die Gewährleistung einer maximalen Produktrückhaltung und Ausschwemmung der hydrophilen Unreinheiten eingestellt werden kann.
Seltsamerweise wenden Hodges et al. anschließend eine Gradientenelution zur Rückgewinnung des gewünschten Produkts aus der Hauptsäule an, so dass das vorteilhafte Potenzial der Verdrängungschromatographie, relativ hochkonzentrierte Produktlösungen zu erbringen, verloren geht. Dies würde vermuten lassen, dass die ursprüngliche Komponententrennung unvollständig war.
Veeraragavan et al. [J. Chromatogr. 541 (1991), S. 207–220] berichten die Anwendung der Hodges-Technik auf die Reinigung von Proteinen unter Verwendung von Hochleistungs-Anionenaustausch-Chromatographiesäulen. Die verwendete Vorrichtung war ein schnelles Niederdruck-Flüssigchromatographiesystem für Proteine, wobei auch hier eine Gradientenelution angewendet wurde; dies wurde möglicherweise im Hinblick auf die Beobachtung für notwendig erachtet, dass Peak-Überlappungen ein Problem beim primären Trennverfahren darstellten. Ein- und Zwei-Säulensysteme werden spezifisch beschrieben, wobei ersteres bei jenen behauptetermaßen seltenen Gelegenheiten einsetzbar ist, bei denen das gewünschte Produkt entweder die am stärksten oder am wenigsten bindende Komponente ist. Die Möglichkeit der Verwendung eines Mehrsäulensystems, "bei dem theoretisch jede Komponente der Proteinprobe an einer Säule von geeigneten Dimensionen fixiert werden könnte", wird angemerkt.
Mehrsäulen-HPLC-Systeme für die Probenverdrängungschromatographie sind in der Tat beschrieben worden von Hodges, inter alia in CA-A-2059114. Eine repräsentative Darstellung zeigt die Verwendung von zehn Umkehrphasen-HPLC-Säulen oder Säulensegmenten, die für die Reinigung der Peptidproben in Reihe geschaltet sind; nachdem das Probenmaterial aufgegeben und über die Reihe von Säulen verteilt/getrennt worden ist, können einzelne Säulen oder Segmente ohne Rückgriff auf die Gradientenelution separat eluiert werden, wobei die gewünschte Produktkomponente in im Wesentlichen reiner Form aus mindestens einer dieser Säulen oder Segmente rückgewonnen werden kann. Die Vorteile dieses Verfahrens werden wie folgt angegeben: (i) Es ermöglicht eine zehnfach größere Beladung als vergleichbare Gradientenelutionstrennungen; (ii) es beinhaltet eine minimale Verwendung von kostspieligen HPLC-Lösungsmitteln; (iii) es erfordert eine minimale Anwendung von Fraktionsanalysen; (iv) es umgeht das Erfordernis der Verwendung von Verdrängungslösungen während der eigentlichen Trennung; und (v) die Betriebskosten im Hinblick auf Lösungsmittel, Säulenpackungen und Maschineneinsatz sind viel geringer als bei typischen Gradientenelutionen.
Das Mehrsäulen-Verfahren von Hodges scheint keine breite Anwendung gefunden zu haben und wurde in der Ausführung als Produkte von unzureichender Reinheit infolge einer inadäquaten Trennung des Produkts von eng verwandten Unreinheiten ergebend befunden. Darüber hinaus ist aufgrund des Erfordernisses, die HPLC-Verfahren bei einem hohen Druck von typischerweise 80–200 bar auszuführen, die erforderliche Vorrichtung notwendigerweise kompliziert und teuer.
In WO 98/46623 sind probenverdrängungschromatographische Verfahren beschrieben, die typischerweise niedere Betriebsdrücke anwenden und das gewünschte Produkt ohne Gradientenelution rückgewinnen. Diese Anwendung von niederen Betriebsdrücken vereinfacht die Anforderungen an den Apparat bzw. die Vorrichtung stark, was die Verwendung einfacherer und preiswerterer Pumpen, Hähne, Anschlüsse und ähnliches als für die HPLC-Systeme erforderlich erlaubt; die daraus folgenden niederen Fließgeschwindigkeiten der mobilen Phase ergeben auch eine gute Trennung der Probenkomponenten. Indem die Anwendung der Gradientenelution vermieden wird, verringert das Trennverfahren auch die erforderliche Menge an Lösungsmittel und begünstigt wahrscheinlich die Rückgewinnung des gewünschten Produkts in einer vorteilhaft hohen Konzentration.
Bei den bestehenden probenverdrängungschromatographischen Trennungen werden die Probenkomponenten in Form einer homogenen Probenlösung eingebracht, so dass die einzelnen Komponenten jeweils bei einer konstanten Konzentration während des gesamten Schritts der Probenapplikation zugeführt werden. Die treibende Kraft hinter der Trennung besteht darin, dass schwach bindende Komponenten von der begrenzten Anzahl von Bindungsstellen am stationären Phasenmaterial durch die stärker bindende Masse des Produkts verdrängt werden. Dies verläuft in einer kontinuierlichen Weise, bis das Produkt und andere stärker bindende Komponenten vollständig im früheren Teil des Chromatographiebetts rückgehalten werden, was den schwächer bindenden Unreinheiten ermöglicht, am stationären Phasenmaterial weiter entlang des Chromatographiebetts gebunden zu bleiben. Sind einmal alle Probenmoleküle an die stationäre Phase gebunden, so wird keine weitere Bewegung dieser Moleküle mehr beobachtet.
Ein Problem, das allerdings aufgrund der Verwendung dieser homogenen Probenlösungen auftreten kann, ist jedoch, dass Moleküle von stärker bindenden Komponenten, die während eines früheren Abschnitts der Probenaufgabe eingebracht werden, durch schwächer bindende Komponenten, die während eines späteren Stadiums der Probenaufgabe eingeführt werden, unbeabsichtigterweise verdrängt werden können. Da es Probenmolekülen nicht möglich ist, sich gegen den Trägerstrom zu bewegen, können solche verdrängte stark bindende Komponenten als Unreinheiten im gewünschten Produktteil des Chromatographiebetts enden. Weiterhin kann eine schwach bindende Komponente, die das Chromatographiebett zu einem späten Stadium der Aufgabe erreicht, um eine Stelle an einer frühen Position im Bett konkurrieren; da nur eine kleine Fraktion der Gesamtprobe verblieben ist, ist die Wahrscheinlichkeit einer Verdrängung von solch einer frühen Position auf dem Bett vermindert. Daher kann diese Unreinheit an einer unerwartet frühen Position nach der Trennung zurückbleiben und so das gewünschte Produkt kontaminieren. Bei einer schwierigen Trennung, bei der mehrere Komponenten eine starke Ähnlichkeit zum gewünschten Produkt aufweisen, kann dieser Effekt beträchtlich sein.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Feststellung, dass ein Verlust an Auflösung bei probenverdrängungschromatographischen Trennungen, der aus diesem bisher unerkannten Problem resultiert, wesentlich vermindert werden kann, wenn die Probenkomponenten auf das Chromatographiebett in nicht-homogener Form aufgegeben werden. In dieser Weise kann eine größere Konzentration von schwächer bindenden Unreinheiten im frühen Abschnitt der Probenaufgabe eingebracht werden, und dazu die frühe Einbringung von stärker bindenden Unreinheiten vermindert werden; eine unerwünschte Konkurrenz unter Beteiligung dieser Unreinheiten kann daher wesentlich vermindert werden, woraus eine verbesserte Produktauflösung folgt.
Daher wird gemäß eines Aspekts der vorliegenden Erfindung ein Verfahren der probenverdrängungschromatographischen Trennung bereitgestellt, welches das Aufgeben einer Mehrkomponentenprobe an einem Ende eines Chromatographiebetts, das ein stationäres Phasenmaterial mit einer Affinität für die Komponenten der Probe umfasst, das Bewirken, dass die Komponenten der Probe entlang des Chromatographiebetts verteilt werden, indem eine nicht-eluierende mobile Lösungsphase über das Bett geleitet wird, und das Rückgewinnen einer gewünschten Komponente der Probe aus mindestens einem Abschnitt des Chromatographiebetts umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenkomponenten auf das Chromatographiebett in einer nicht-homogenen Weise aufgegeben werden, so dass die Konzentration mindestens einer Komponente mit relativ geringer Affinität für das stationäre Phasenmaterial während eines früheren Abschnitts der Probenaufgabe erhöht wird und/oder die Konzentration mindestens einer Komponente mit relativ hoher Affinität für das stationäre Phasenmaterial während eines späteren Abschnitts der Probenaufgabe erhöht wird.
Die gewünschte nicht-homogene Aufgabe der Probenkomponenten kann in vielfältiger Weise erreicht werden, wie beispielsweise im Folgenden beschrieben; weitere Methoden können von Fachleuten des Gebiets unter Zugrundelegung der Beschreibung der vorliegenden Anmeldung entwickelt werden. In vielen Fällen wird die Nicht-Homogenität unter Anwendung einer vorab erfolgenden chromatographischen Trennung unter Einsatz entweder der Probenverdrängung oder der Elutionschromatographie erzielt werden. Es sollte betont werden, dass zwar vielfältige chromatographische Trennungen im Fachgebiet wohlbekannt sind, die existierenden Verfahren jedoch aufeinander folgende Reinigungen einer teilgereinigten Fraktion aus einer vorangegangenen Trennung einbeziehen. Dies unterscheidet sich grundlegend vom Verfahren der vorliegenden Erfindung, bei dem entweder die Gesamtheit einer vielkomponentigen Probe oder eine beträchtliche Anzahl ihrer Komponenten einer Probenverdrängungschromatographie in Verbindung mit irgendeiner Form von Weiterverarbeitung unterzogen wird, was eine geeignete Inhomogenität der Probenzusammensetzung bewirkt.
Bei den bestehenden chromatographischen Reinigungen unter Einbeziehung entweder des Elutionsmodus oder der Probenverdrängungschromatographie ist es üblich, Fraktionen zu ver werfen, die ein halbreines Produkt aufgrund des Vorhandenseins kontaminierender Unreinheiten, die zu einem späteren Zeitpunkt schwer entfernbar wären, enthalten. Beim Verfahren der Erfindung dagegen können diese produkthaltigen Fraktionen aus einem ersten Trennschritt bei der anschließenden Probenverdrängungschromatographie verwendet werden, da die Unreinheit lediglich in einigen der Fraktionen vorhanden ist. Sie kann daher wirksamer verdrängt werden, wenn sie in früh aufgegebenen Fraktionen vorhanden ist, oder rückgehalten werden, wenn sie in später aufgegebenen Fraktionen vorliegt. Es wird erkennbar sein, dass eine solche Verwendung der halbreinen Produktfraktionen die Gesamtausbeute erhöhen und darüber hinaus die Verdrängungseffekte verstärken kann.
Die gewünschte Inhomogenität bei den Trennverfahren gemäß der Erfindung kann zum Beispiel unter Verwendung einer festen Probe und eines Trägerlösungsmittels erreicht werden, welches die Komponenten der festen Probe zu unterschiedlichen Anteilen löst und dabei einen Konzentrationsgradienten an das Chromatographiebett anlegt. Da die Löslichkeit der Probenkomponenten in den Trägerlösungsmitteln, die sowohl bei der normalen als auch der Umkehrphasenchromatographie verwendet werden, mit zunehmender Bindungsaffinität der Komponenten für das stationäre Phasenmaterial zum Abnehmen neigt, wird der resultierende Löslichkeits-induzierte Konzentrationsgradient die Effizienz der Probenverdrängungstrennung gemäß der Erfindung erhöhen.
Wo die Probenkomponenten bereits an eine stationäre Phase infolge einer vorangegangenen Trennung gebunden sind, können die Extraktionsbedingungen alternativ so gewählt werden, dass die Hauptkomponente relativ spät extrahiert und dazu relativ spät auf das Probenverdrängungs-Chromatographiebett aufgegeben wird. In dieser Weise werden die früher extrahierten Komponenten durch diese später aufgegebene Hauptkomponente wirksamer verdrängt.
In einer weiteren Ausführungsform kann eine Probe zumindest teilweise unter Verwendung eines teilbaren probenverdrängungschromatographischen Säulensystems getrennt werden, wie zum Beispiel beschrieben in der zuvor genannten WO 98/46623, wobei eine Anzahl sukzessiver Fraktionen durch Extraktion aus sukzessiven Portionen des stationären Phasenmaterials abgesammelt wird. Zu repräsentativen Systemen, die hierzu verwendet werden können, zählen die Umkehrphasenchromatographie, wobei mit einem organischen Lösungsmittelsystem, wie z.B. wässrigem Acetonitril oder Essigsäure, extrahiert wird; die Ionenaustauschchromatographie, wobei mit einer Salzlösung extrahiert wird; oder die hydrophobe Interaktionschromatographie, wobei durch eine Senkung der Salzkonzentration extrahiert wird. Nach jeglicher erforderlichen Entfernung der Extraktionsmaterialien, zum Beispiel der organischen Lösungsmittel oder flüchtigen Salze oder unter Durchführung eines Entsalzungsschritts, werden die Fraktionen dann auf dasselbe oder ein ähnliches Chromatographiesystem in der Reihenfolge von zunehmender Bindungsaffinität aufgegeben, d.h. eluierte Fraktionen und Fraktionen aus der Ablaufseite des ursprünglich verwendeten Chromatographiebetts werden zuerst und Fraktionen aus der Zulaufseite des ursprünglich verwendeten Chromatographiebetts werden zuletzt aufgegeben. Eine auf diese Weise verzögerte Einbringung der stärker verdrängenden Substanzen erhöht die Effizienz der zweiten Trennung deutlich.
Noch eine weitere Ausführungsform kann eingesetzt werden, um dem Problem zu begegnen, dass geringfügig schwächer bindende Unreinheiten oftmals aufgrund von am Schwanzende ansetzenden Effekten (engl.: tailing effects) vom gewünschten Produkt schwer entfernbar sind; dies ist insbesondere der Fall, wenn solch eine Unreinheit eine relativ große Fraktion der Probe darstellt, und entsteht, da eine beträchtliche Menge dieser Unreinheit auf das Chromatographiebett zu einem späten Stadium des Trennprozesses aufgegeben wird. In solchen Situationen, bei denen eine Abfolge von Trennungen vorgenommen wird, kann die gewünschte Inhomogenität durch Applizieren einer oder mehrerer Fraktionen aus einer oder mehreren vorangegangenen Trennungen nach Aufgabe der aktuellen Probe auf das Chromatographiebett erzielt werden. Sind die anschließend applizierten ein oder mehreren Fraktionen im gewünschten Produkt, und möglicherweise auch in stärker bindenden Unreinheiten, relativ angereichert, so wird dies eine zusätzliche trennende Kraft auf die schwanzbildende Unreinheit ausüben, was dem gewünschten Produkt eine erhöhte Reinheit verleiht. Es wird zu erkennen sein, dass dort, wo eine nachträglich zugesetzte Fraktion selbst einer weiteren Reinigung bedarf, dies gleichzeitig mit der oben beschriebenen Verdrängung der schwanzbildenden Unreinheit erfolgen wird, wodurch der Produktdurchsatz effektiv erhöht wird.
Bei wiederum einer weiteren Ausführungsform kann die gewünschte Inhomogenität mittels einer Trennung im Elutionsmodus erzielt werden. So kann beispielsweise eine Gelpermeationschromatographie vorgenommen werden, um eine erste partielle Trennung zu bewirken; das Eluat kann dann entweder direkt oder in umgekehrter Reihenfolge, je nach Eignung, auf das Probenverdrängungs-Chromatographiebett aufgegeben werden. Alternativ kann eine nicht vollständig aufgelöste umkehrphasenchromatographische Trennung unter Anwendung einer isokratischen Elution durch eine Probenverdrängungs-Ionenaustauschchromatographie nachbehandelt werden; der Anteil des bei der ersten Trennung verwendeten organischen Lösungsmittels kann vorteilhafterweise so gewählt werden, dass das gewünschte Produkt im Prinzip in einer re lativ frühen und konzentrierten Fraktion eluiert und in einem gewissen Umfang von Unreinheiten befreit ist, z.B. unter Rückhaltung hydrophoberer Unreinheiten auf dem Umkehrphasen-Chromatographiebett. Sofern erwünscht, kann die anfängliche Trennung auch zur Entfernung bestimmter unerwünschter Probenkomponenten eingesetzt werden; so können zum Beispiel Salzunreinheiten oder teilweise geschützte synthetische Produkte abgetrennt und nach der Umkehrphasenchromatographie verworfen werden, im letzteren Fall deshalb, weil Schutzgruppen zur Hydrophobizität eines Produkts beitragen. Die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthalten, können dann einer Probenverdrängungschromatographie, z.B. unter Verwendung eines stationären Ionenaustauch-Phasenmaterials, unterzogen werden.
Zu repräsentativen Bereichen, in denen Trennverfahren gemäß der Erfindung angewendet werden können, zählen die folgenden:
In vielen Situationen des modernen Wirkstoffdesigns werden enorme Anzahlen von Verbindungen, oftmals ohne den Zeit- oder Kapazitätsaufwand für eine entsprechende Reinigung oder Charakterisierung, synthetisiert. Ein zuverlässiges und vorzugsweise automatisiertes Reinigungssystem, das auf der Probenverdrängungschromatographie beruht, kann zur individuellen und gleichzeitigen Handhabung mehrerer Rohprodukte, oftmals zugunsten der Vermeidung weiterer Isolationsschritte, eingesetzt werden.
Wird ein Rohpeptid, das aus der Festphasensynthese stammt, mittels Kationenaus-tausch- oder Umkehrphasenchromatographie gereinigt, so wird eine erhöhte Reinheit erhalten. Um ein Produkt von durchgängig hoher Reinheit zu gewährleisten, können die beiden Schritte gemäß des Verfahrens der vorliegenden Erfindung kombiniert werden. Der Ge halt an Fehlsequenzen im Produkt kann vermindert werden, indem ein Gemisch aus Zielpeptiden mit einer freien Aminofunktion im N-Terminus und kürzeren Fehlsequenzen, die durch Acetylierung endgeschützt worden sind – eine übliche Vorgehensweise bei der Peptidsynthese – in ein System aufgebracht werden, das zur Probenverdrängungschromatographie vorgesehen ist. Die korrekte Sequenz wird eine zusätzliche positive Ladung bei pH 2–3 enthalten, wenn sie auf ein Kationenaustausch-Chromatographiebett unter Verwendung von wässriger Essigsäure als Träger aufgebracht wird. Die Kapazität des Betts wird die optimale Beladung mit Probe bestimmen, so dass der Großteil des Produkts an das Bett gebunden verbleibt und Unreinheiten mit geringerer Ladung aus dem Bett verdrängt werden.
Dieser ersten ionenaustauschchromatographischen Reinigung kann eine umkehrphasenchromatographische Reinigung folgen. Die Zugabe von Salz zum Träger wird die Peptide aus dem Ionenaustausch-Chromatographiebett in der Reihenfolge von zunehmender Ladung extrahieren. Auf diese Weise werden die verbliebenen Unreinheiten auf dem Umkehrphasen-Chromatographiebett über das gewünschte Produkt hinaustransportiert, welches das Bett relativ spät erreicht und so die üblicherweise weniger hydrophoben Unreinheiten effizienter verdrängt als bei Aufgabe der Probe in homogener Form.
Das Produkt aus einer derartigen Trennung kann durch Extraktion vom Umkehrphasen-Chromatographiebett abgesammelt werden, woraufhin ein hochauflösendes analytisches System mit hohem Durchsatz wie die HPLC oder Kapillarelektrophorese zur Überprüfung der Reinheit angewendet werden kann, um die Kombinierung der ausreichend reinen Produktfraktionen zu ermöglichen.
Bestehende Trenn/Reinigungsverfahren sind häufig durch eine unzureichende Selektivität eingeschränkt, was dazu führt, dass mühsame Elutionstrennungen angewendet werden müssen. Typische Beispiele liegen dann vor, wenn ein geringer Unterschied der scheinbaren Größe in der Gelpermeationschromatographie besteht oder wenn geringe Unterschiede bei Ladung oder Hydrophobizität in isokratisch eluierten Ionenaustausch- bzw. Umkehrphasenchromatographiesystemen vorhanden sind. Die Probenverdrängungschromatographie kann auch ineffizient sein, wenn die Konzentration, und daher der Verdrängungseffekt, des gewünschten Produkts in einer gegebenen Probe gering ist.
Ein Beispiel für diese letztere Situation ist angegeben bei Veeraragavan (op. cit.), der Anstrengungen unternahm, Sojabohnen-Trypsininhibitor mittels der Probenverdrängungs-Anionenaustauschchromatographie zu reinigen. Aus den veröffentlichten Ergebnissen wird klar, dass die Selektivität der Komponenten für eine effiziente probenverdrängungschromatographische Trennung inadäquat war, so dass eine Gradiententrennung im Elutionsmodus als der Hauptkraft für die Trennung angewendet wurde. Außerdem war die chemische Reinheit des Produkts nicht besonders hoch, und war die Rückgewinnung für eine effiziente Reinigung ungenügend.
Aus den Ergebnissen für die Gelelektrophorese von Veeraragavan ist erkennbar, dass die am stärksten bindenden, d.h. spät eluierenden, Komponenten (Produktpeak 6 und Unreinheitspeak 8) sich als die mit dem niedrigsten Molekulargewicht und daher der kleinsten Größe erwiesen. Eine verbesserte Gesamttrennung kann daher erreicht werden, indem anfänglich eine gelpermeationschromatographische Trennung vorgenommen und das Eluat direkt auf ein Anionenaustausch-Chromatographiebett gespeist wird. Die resultierende späte Aufgabe der "größensortierten", stark bindenden Komponenten im zweiten Trennschritt wird die Effizienz dieses probenverdrängungschromatographischen Schritts signifikant erhöhen.
Die Gelpermeationschromatographie kann in Verbindung mit einem nachfolgenden Probenverdrängungsschritt bei der Reinigung eines breiten Bereichs von synthetischen Oligomeren und Polymeren angewendet werden, bei der die Hauptunreinheiten größenmäßig vom gewünschten Produkt aufgrund eines Mangels oder eines Überschusses an Monomer-Resten abweichen wird, ebenso wie sie in ihren Bindungsaffinitäten für stellenspezifisches stationäres Phasenmaterial zum Beispiel als Folge von Unterschiedlichkeiten bei Hydrophilizität/Hydrophobizität, Gesamtladung, Ladungsdichte, etc. abweichen wird. Es wird erkennbar sein, dass die Reihenfolge der Aufgabe der eluierten Komponenten aus der Gelpermeationschromatographie in dem Falle umgekehrt werden sollte, dass spät eluierende (d.h. kleinere) Komponentenfraktionen aus der gelpermeationschromatographischen Trennung eine geringere Bindungsaffinität für das stationäre Phasenmaterial in der probenverdrängungschromatographischen Trennung zeigen als früh eluierende (d.h. größere) Komponentenfraktionen.
Das oben genannte Prinzip kann bei der Reinigung von unbearbeiteten Oligonukleotiden angewendet werden, bei denen Sequenzen der vollen Länge eine höhere Ladung aufweisen als kürzere Sequenzen und dabei in der Anionenaustauschchromatographie stärker binden, wobei aber die Probenverdrängungschromatographie alleine eine unzureichende Auflösung zwischen einem gewünschten Produkt und Fehlsequenzen wie einer "n-1"-Unreinheit ergeben. Entsprechend kann bei der Reinigung von rohen Peptidproben durch Umkehrphasen-Probenverdrängungschromatographie die anfängliche Gelpermeationschromatographie und die Umkehrung des resultieren den Eluatstroms zu kleineren, weniger hydrophoben Deletionssequenzen führen, die in das umkehrphasenchromatographische System dem gewünschten Produkt etwas voraus eintreten; diese Unreinheiten werden daher während der Probenverdrängungschromatographie durch den erhöhten Anteil an Produkt in später aufgegebenen Fraktionen viel effizienter verdrängt. Es wird erkennbar sein, dass bei solchen Verfahrensweisen das im gelpermeationschromatographischen Schritt verwendete Lösungsmittel so gewählt werden sollte, dass es als Träger in der späteren probenverdrängungschromatographischen Trennung dient.
Bei einem alternativen Verfahren für die Reinigung von synthetischen Oligonukleotiden wird die Umkehrphasenchromatographie zur Hervorrufung der gewünschten Inhomogenität angewendet. Die Rückhaltezeit der Probenkomponenten auf dem Umkehrphasen-Chromatographiebett kann durch Zugabe eines organischen Lösungsmittels oder eines ionenpaarenden Mittels wie Triethylamin-Puffer eingestellt werden. Beginnt das gewünschte Produkt einmal bei basischem pH-Wert zu eluieren, so kann der Eluat-strom direkt auf ein mit einem geeigneten Träger äquilibriertes Anionenaustausch-Chromatographiebett aufgebracht werden. Im Anschluss an diese Probenverdräng-ungstrennung kann das Produkt durch Zugabe einer Salzlösung extrahiert und dann durch eine Entsalzungssäule geleitet werden. Der Entsalzungsschritt, der im Allgemeinen auf der Gelfiltration basieren wird, kann zur Entfernung sowohl niedermolekularen Salzes als auch Trägerlösung aus der vorangegangenen Trennung entworfen sein, um eine einfache wässrige Lösung des gewünschten Produkts zu erhalten.
Die Reinigung der Homopolymere kann auch unter Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung bewirkt werden. Zu repräsentativen Homopolymeren zählen Methoxy- Polyethylenglykol-(Methoxy-PEG)-Verbindungen, deren Größenverteilung durch Gelpermeationschromatographie in Kombination mit einer umkehrphasenchromatographischen Probenverdrängungstrennung modifiziert werden kann. Ein derartiges Verfahren, das auf einer Trennung nach Größe, gefolgt von einer Größen/Hydrophobi-zitätsselektion basiert, nähert den Molekulargewichtsbereich des Produkts an. Gleichzeitig können bifunktionale Unreinheiten, die Kreuzreaktionen bei anschließenden Anwendungen bewirken können, wie etwa eine Proteinmodifikation, ebenfalls entfernt werden.
Alternativ können PEG-Verbindungen durch aufeinander folgende umkehrphasenchromatographische Probenverdrängungstrennungen gereinigt werden. Ein einziger umkehrphasenchromatographischer Probenverdrängungsschritt trennt die Komponenten bis zu einem bestimmten Umfang, doch kann die Selektivität zum Erhalt eines einzelnen Oligomers in hoher Reinheit unzureichend sein. Unter Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung jedoch kann eine Probe in nahezu monodisperse Fraktionen aufgetrennt werden. Daher können nach einer ersten Trennung Fraktionen der ursprünglichen Probe mit, angenäherter Größenverteilung aus den verschiedenen Teilen des Chromatographiebetts abgesammelt werden. Einmal in der Reihenfolge der Wanderung (kleinste Molekülenthaltende Fraktionen zuerst) reappliziert, wird der Verdrängungseffekt ausgeprägter bei einem geringeren Risiko einer unerwünschten Konkurrenz. Eine verbesserte Produktreinheit wird dabei bei jeder aufeinanderfolgenden Trennung in einem Wiederholungsprozess erhalten. Die gesamte Probe kann nochmals aufgegeben oder Teile davon entfernt werden, z.B. dort, wo eine Fraktion einen großen Anteil an unerwünschtem Material oder Unreinheiten enthält. Um die Effizienz zu erhöhen, kann auch Material aus anderen Fraktionierungen zugegeben werden, wie z.B. im vorangegangenen beschrieben.
Diese Verfahren können bei Prozessen im Industriemaßstab angewendet werden, um die wirtschaftliche Herstellung von hochreinem Polymer zu ermöglichen. Es wird zu erkennen sein, dass sowohl Probe als auch Lösungsmittel nach jedem Trennschritt rückgewonnen werden können, wodurch Betriebskosten gesenkt werden.
Bei kleinmaßstäblichen gelpermeationschromatographischen Anwendungen kann jegliche erforderliche Stromumkehrung vor einem zweiten Trennschritt unter Verwendung einer Sammelschleife, die aus geeigneten Leitungen und Schaltventilen besteht, ganz einfach erreicht werden. Nach Sammeln des Eluats in der Schleife wird ein Ventil geschaltet und die gesammelte Probe auf das zweite Chromatographiebett in umgekehrter Reihenfolge gelenkt. Das tatsächlich wieder zu bearbeitende Volumen kann im Voraus optimiert werden oder kann unter Verwendung eines Nachweissystems nach dem ersten Chromatographiebett bestimmt werden. Sollen größere Volumina verarbeitet werden, so zählen zu geeigneten Sammelvorrichtungen Fraktionssammelkolben, die über Ventile verbunden sind, so dass eine Wiederaufgabe in umgekehrter Reihenfolge vorgenommen werden kann.
Großmaßstäbliche Prozesse können vorteilhafterweise unter Verwendung einer Vielzahl relativ kurzer Säulen anstelle einer oder einiger weniger längerer Säulen durchgeführt werden. So kann zum Beispiel die Verwendung einer Reihe rechteckig geformter Säulen mit einem Oberflächenbereich von 1 × 2 m und einer Betthöhe von 5–15 cm zweckdienlich sein. Mehrere solcher Säulen, zum Beispiel 10 Säulen von 10 cm Betthöhe, können übereinandergestapelt und über Ventile zusammengeschaltet werden, so dass sie während der Probenaufgabe in Reihe oder während der Probenextraktion einzeln betreibbar sind.
Um eine gleichmäßige Lösungsmittelverteilung in Säulen mit solch großen Querschnittsflächen zu gewährleisten, ist eine Positionierung des Zulaufs an einer Seite am Kopfende der Säule und des Ablaufs an der entgegengesetzten Seite am Säulenboden wünschenswert, wobei Zulauf und Ablauf jeweils durch eine Anordnung von Kanälen miteinander verbunden sind, was eine gleichmäßige Verteilung der Probenlösung über die Oberflächen des Chromatographiebetts erleichtert. Alle Probenkomponenten werden dann in gleicher Rate über die Oberfläche des stationären Phasenmaterials transportiert und werden dabei auf dem kürzesten senkrechten Weg durch das Bett passieren. Solch große Chromatographiebetten können von oben gepackt werden und beinhalten vorzugsweise Abstandhalterstäbe, die zwischen gegenüberliegenden Säulenwände eingebracht sind und dieselben Höhe wie die Säulenbetthöhe aufweisen; diese Stäbe verhindern das Seitwärtsbewegen des stationären Phasenmaterials in der Säule und Stabilisieren zugleich die oberen und unteren Fritten. Alternativ können für Trennungen im kleineren Maßstab und/oder dort, wo die Stabilität des Chromatographiebetts weniger entscheidend ist, Chromatographiesäulen mit seitlichen Packportalen, wie z.B. beschrieben in US-A-5667676, verwendet werden.
Eine Vielfalt von Geräten kann zur Vereinfachung der Nahtstellen mit einem folgenden Schritt konstruiert werden. So kann zum Beispiel eine Chromatographiesäulenvorrichtung, bestehend aus mehreren, in einen Zylinder gebohrten Säulen, entweder in Reihe oder parallel durch Rotation der Kopf- oder Boden-Abdichtplatten, die entsprechende Kanäle aufweisen, so betrieben werden, dass eine Probenlösung von einem Zulauf an die Kopfseite der ersten Säule, vom Boden jener Säule durch ein Rohr mit enger Bohrung zum Kopf der folgenden Säule und entsprechend durch alle Säulen passieren kann. Während der Probenextraktion und Säulen-Reäquilibration werden die Platten rotiert, um einen gemeinsamen Zulauf und individuelle Abläufe mit jeder Säule auszurichten.
Die aus einer derartigen Säulenanordnung erhaltenen Produkte können in einer Vorrichtung gesammelt werden, was ihre Weiterverarbeitung erleichtert. Eine solche Vorrichtung kann unter die Säulen während der Sammlung der Fraktionen bei einer Position für jede Säule platziert werden. Nach dem Extrahieren und Analysieren der Fraktionen können diese weiterverarbeitet werden, zum Beispiel durch direkte Aufgabe auf eine neue Säule in einer geeigneten Abfolge. Alternativ können die Fraktionen zum Beispiel auf einem Speed-Vac-Konzentrator konzentriert werden oder können zur Entfernung unerwünschter Lösungsmittel lyophilisiert werden.
Um die Materialhandhabung zu vereinfachen, kann die Sammelvorrichtung ein Loch im Boden jeder Kammer enthalten, um die sequenzielle Entnahme jeder Probenfraktion zu ermöglichen. Die Löcher können durch eine Platte verschlossen werden, welche die Fraktionen am Auslaufen während der vorangehenden Handhabung hindert; diese Platte kann rotierbar sein, so dass immer eine Kammer mit einem Bodenablauf gekoppelt ist, der z.B. mit entsprechenden Verbindungsleitungen ausgestattet ist. Das Anlegen von Druck an die Oberseite der Vorrichtung wird beim Erzeugen eines Stroms der Probenfraktion von der angeschlossenen Kammer zum Beispiel zu einem weiteren Chromatographiebett hilfreich sein. Solche Systeme können unter Verwendung einer einfachen Ventilschaltung automatisiert werden und können Sensoren enthalten, die Luft-Flüssig-Grenzflächen detektieren und die Platte zum Weiterdrehen um einen Schritt zur nächsten Kammer bringen, sobald solch eine Grenzfläche detektiert wird.
Die Säulenelemente können auch auf dem 96-Well-Mikrotiterplatten-Format basieren, wobei die große Anzahl von Fraktionen, die mit diesem Format erhalten werden können, bei den Anwendungen des Verfahrens der Erfindung vorteilhaft ist. Ist das System automatisiert, so können die Produktfraktionen automatisch in einer geeigneten Abfolge durch ein Robotersystem reinjiziert werden. Das Element kann entweder wie in WO 98/46623 beschrieben konstruiert sein oder in einer Form vorliegen, bei der ein Säulenkörper zwischen verschiedenen Stationen transportiert wird, an denen Äquilibration, Trennung oder Extraktion durch Kontaktieren verschiedener Platten mit dem Kopf oder dem Boden des Körpers vorgenommen werden.
Die oben beschriebenen Säulen- und Sammelelemente stellen, mit Ausnahme der in WO 98/46623 und US-A-5667676 beschriebenen Elemente, ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung dar.
Generell kann eine Vielfalt von stationären Phasenmaterialien im probenverdrängungschromatographischen Schritt der Trennverfahren gemäß der Erfindung verwendet werden. Die Anforderung, dass das Material eine Affinität für die Komponenten der Probe aufweist, ist als das Erfordernis zu interpretieren, dass das Material spezifische Stellen aufweist, die zur reversiblen Wechselwirkung mit den Komponenten der Probe fähig sind. Gelfiltrationsmedien, in denen die Proben mit Netzwerken anstelle tatsächlicher Stellen Wechselwirken, sind dafür ungeeignet, doch zählen zu Systemen, die verwendbar sind, die direkte und Umkehrphasenchromatographie, Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie und Affinitätschromatographie.
Die bei den Trennverfahren gemäß der Erfindung verwendeten stationären Phasenmaterialien können in jeglicher bequem geeigneter Form vorliegen, zum Beispiel als Mem-branen, Gele oder Mikrokügelchen, insbesondere monodisperse Mikrokügelchen, und werden üblicherweise in ein oder mehrere Säulen gepackt, wie z.B. im vorangegangenen beschrieben.
Die Anforderung, dass die bei den probenverdrängenden Trennverfahren gemäß der Erfindung verwendete mobile Lösungsmittelphase nicht-eluierend ist, ist als Hinweis darauf zu interpretieren, dass das Lösungsmittel zum Transportieren von weniger verzögerten Probenkomponenten zu den nächstverfügbaren Bindungsstellen fähig ist, doch wenig oder kein beeinträchtigendes Potenzial der Wechselwirkungen zwischen den gelösten Probenkomponenten und dem stationären Phasenmaterial aufweist. Ein breiter Bereich von Lösungssystemen kann in Abhängigkeit von dieser Anforderung verwendet werden. Zu wässrigen Systemen, die zum Beispiel bei der Umkehrphasen- und Ionenaustauschchromatographie nützlich sind, zählen Wasser, Pufferlösungen, Lösungen von Basen wie Natriumhydroxid, Ammoniumbicarbonat oder Ammoniumhydroxid, und Lösungen von Säuren wie Essigsäure oder Trifluoressigsäure.
Es mag zweckdienlich sein, die probenverdrängenden Trennschritte gemäß der Erfindung bei niedrigem Druck vorzunehmen, wie zum Beispiel beschrieben in WO 98/46623. So kann die mobile Lösungsmittelphase in vorteilhafter Weise bei einem Druck aufgegeben werden, der 30 bar, zum Beispiel weniger als 15 bar, vorzugsweise weniger als 10 bar, nicht überschreitet. Betriebsdrücke um 3 bar können vorteilhafterweise für kommerzielle Trennungen angewendet werden; Überdrücke von nur 0,5 bar sind als gute Trennungen ergebend befunden worden. Es mag in Abhängigkeit von der Be schaffenheit des Chromatographiebetts angemessen sein, sogar geringere oder keinen Überdruck anzuwenden. Wo das Bett beispielsweise relativ grobes Material, z.B. ein grobes Polymergel, enthält, kann die mobile Lösungsmittelphase zur Bewegung infolge von Schwerkraft und/oder einer Wechselwirkung mit dem Bettmaterial fähig sein; bei solchen Ausführungsformen mag das Anlegen eines sehr niedrigen Überdrucks von z.B. 0,1 bar zur Kontrolle und nicht zum Vorantreiben des Stroms der mobilen Lösungsmittelphase geeignet sein.
Die Druckquelle, welche die mobile Lösungsmittelphase antreibt, kann vorteilhafterweise ein unter Druck gesetztes Gas wie Stickstoff sein, was das Erfordernis von mechanischen Pumpen umgeht und folglich die Betriebskosten des Verfahrens senkt.
Die Rückgewinnung des gewünschten Produkts nach der Probenverdrängungstrennung kann mittels jeglicher geeigneten Methode erreicht werden, zum Beispiel durch Extraktion in ein wässriges Lösungsmittelsystem oder ein nicht-wässriges Lösungsmittelsystem (z.B. ein organisches Lösungsmittel oder überkritisches Kohlendioxid), durch Verwendung einer Verdrängungslösung mit höherer Affinität für das stationäre Phasenmaterial als sie die Probe aufweist (z.B. wässriges Acetonitril oder Essigsäure im Falle der Umkehrphasenchromatographie oder eine Salzlösung im Falle der Ionenaustauschchromatographie), durch eine Verminderung der Salzkonzentration (z.B. im Falle der hydrophoben Interaktionschromatographie) oder durch pH-Veränderung. Die Anlegung von Konstantzustand-(d.h. Nicht-Gradient)-Bedingungen ist bevorzugt, da dies aus sich heraus den Erhalt des Produkts in konzentrierterer Form erlaubt als dies unter Verwendung der Gradientenelution möglich wäre. Da außerdem das Rückgewinnungsverfahren völlig unabhängig vom Trennverfahren ist, können die Bedingungen zur Rückgewinnung optimiert werden, um eine Maximalleistung der Produktfreisetzung und eine maximale Effizienz der Verwendung der Lösungsmittel, Verdrängungslösungen, etc. zu gewährleisten, ohne in irgendeiner Weise die Effizienz der Trennung zu gefährden. Demgemäß ist es möglich, Produkte in 10- bis 100-fach höheren Konzentrationen rückzugewinnen, als sie mit Gradienten- oder isokratischen Elutionen erhalten werden können.
Die Extrahierbarkeit der Produkte in Lösungsmittel der Wahl ist auch darin vorteilhaft, dass die Produkte in stabilisierter Form oder in einer optimalen Form für die Verwendung bei nachfolgenden Verarbeitungsschritten rückgewonnen werden können. So kann zum Beispiel ein Protein unter Verwendung einer Pufferlösung bei einem zur Maximierung der Stabilität des Proteins geeigneten pH-Wert extrahiert werden.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
In den begleitenden Zeichnungen zeigt:
1 eine massenspektrometrische Analyse von sukzessiven Methoxy-PEG-Fraktionen, die aus derselben Säulenposition gemäß dem Verfahren aus Beispiel 1 erhalten werden.
2 die Ober- und Untergrenzen der Massensignale, die für Methoxy-PEG-Fraktionen beobachtet werden, wie gemäß dem Verfahren aus Beispiel 1 erhalten.
3 die jeweiligen Bacitracin-Reinheiten, die unter Anwendung der verschiedenen, in Beispiel 4 beschriebenen Trenntechniken erzielt werden.
Die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der Erfindung. Sofern nicht anders ange geben, waren die verwendeten Säulen leere Trennpatronen, die mit SP Sepharose FF (Kationenaustausch) oder Lichrosphere C-18 25–40 μm (Umkehrphasenchromatographie) befüllt worden waren. Wurden vielfache Säulen verwendet, so waren diese durch einen standardmäßigen Adapter verbunden (Supelco 5-7020).
Beispiel 1
Erhöhung der Homogenität von Methoxy-PEG 1000
Ein handelsübliches Methoxy-PEG-Produkt wurde mittels Massenspektrometrie (Maldi-MS, Finnegan Lasermat 2000) als aus einem Gemisch von Oligomeren bestehend befunden, die im Bereich von 9–27 Ethylenoxid-Einheiten lagen. Bei der Hauptkomponente wurde ein MG von 760 Dalton festgestellt, was erwartungsgemäß mit dem Natriumaddukt des 16-mer korrellieren sollte.
a) Trennung durch einen einzelnen Umkehrphasen-Probenverdrängungs-Chromatographieschritt (vergleichend)
Sechs Säulen wurden mit 1 ml Lichrosphere 25–40 μm RPC C18-Partikeln gepackt, mit Methanol gewaschen, mit Wasser äquilibriert und in Reihe geschaltet. Eine Probe von 400 mg Methoxy-PEG in 4 ml Wasser durfte sich auf den Säulen auftrennen, woraufhin die Säulen voneinander getrennt und das Polymer mit Methanol aus den einzelnen Säulen extrahiert wurde. Nach der Entfernung des Lösungsmittels und Wiederauflösung in Wasser wurden die Fraktionen nochmals mittels Maldi-MS analysiert. Die Zusammensetzung der Fraktionen zeigte, dass die umkehrphasenchromatographische Trennung auf der Basis der Größe der Polymere unterschieden hatte, wobei die kleineren und weniger hydrophoben Komponenten entweder zu einer spät im System platzierten Säule oder aus den Säulen heraus verdrängt worden waren.
b) Trennung durch eine Abfolge von Umkehrphasen-Probenverdrängungs-Chromatographieschritten
Die Proben aus obigem (a) enthielten untereinander im Wesentlichen alle Komponenten der ursprünglichen Probe, doch waren zu einem gewissen Grad auf der Basis von Hydrophibizität und folglich Größe organisiert. Sie wurden auf dasselbe Säulensystem nochmals aufgegeben, wobei aber diesmal die mit kleineren Polymeren angereicherten früheren Fraktionen zuerst in das System eintreten durften, gefolgt von den späteren Fraktionen, die hauptsächlich größere Polymere enthielten. Nach einer Wiederholung des oben beschriebenen Extraktionsverfahrens wurde festgestellt, dass die einzelnen Fraktionen eine signifikant verbesserte Homogenität zeigten.
Dieselbe Verfahrensweise wurde ein drittes Mal wiederholt, um Fraktionen mit noch weiter erhöhter Homogenität zu erhalten. 1 zeigt die Maldi-MS-Muster für die aus Säule 5 bei jeder der Trennungen extrahierten Fraktionen. 2 zeigt die Ober- und Untergrenzen der Massensignale, die in aus den sechs Säulen abgesammelten Fraktionen beobachtet wurden (etwa 2–5% des Maximalsignals), ebenso wie für das Material in den eluierten Fraktionen (von Probe 7 an), wobei die Ergebnisse für die drei aufeinanderfolgenden Trennungen jeweils durch die Codes MP2, MP3 und MP4 gekennzeichnet wurden. Diese Ergebnisse zeigen eine zunehmend verbesserte Homogenität der Fraktionen relativ zum ursprünglichen komplexen Material.
Beispiel 2
Reinigung von Oligonukleotid durch Probenverdrängungschromatographie
1,5 g eines zu etwa 60% reinen unbearbeiteten 20-mer-Oligonukleotids (TGTGTGTGTGTGTGTGTGTG) wurden auf drei Anionenaustauschsäulen (53 mm × 10 mm), gepackt mit Q Sepharose FF (Pharmacia), unter Verwendung von 50 mM Boratpuffer, pH 9,8, als Träger gereinigt. Dieselbe Trennung wurde mit und ohne einer Vorsäule (30 cm × 10 mm Innendurchmesser), gepackt mit Source 30 RPC (Pharmacia), vorgenommen. Während der Probenaufgabe durften sich die Komponenten über die RPC-Säule entsprechend der Hydrophobizität verteilen, doch wurde die eigentliche Ionenaustausch-SDC-Trennung im Träger vorgenommen, der 20% Methanol enthielt, um die Probe aus der Vorsäule auf die Trennsäulen zu eluieren.
Die HPLC-Anionenaustausch-Analyse (Dionex Nucleopac PA100, Gradient von NaClO₄ in 10 mM NaOH) ergab ein beträchtlich verbessertes Reinheitsprofil über die Säulen hinweg, wenn die Vorsäule in den Stromweg einbezogen war.
Beispiel 3
Peptidreinigung unter Anwendung der Gelpermeationschromatographie und Umkehrphasen-Probenverdrängungschromatographie
Die Reinigung eines zu 65% reinen Rohpeptids (YADKITEDLK) durch Probenverdrängungschromatographie alleine ergab das gewünschte Produkt mit einer signifikant höheren Reinheit. Allerdings sind zwei Deletionssequenzen, denen Alanin bzw.
Threonin fehlen, schwer entfernbar, so dass die Produkt-Gesamtreinheit 92–93% beträgt.
Bei einer Trennung gemäß der Erfindung wird eine Lösung von 200 mg Rohpeptid in 0,1% Essigsäure durch Schwerkraftstrom auf eine 30 ml (50 cm × 9 mm Innendurchmesser) Gelpermeationschromatographiesäule, gepackt mit Sephadex G15 in 0,1 Essigsäure, aufgegeben. Das Eluat wird kontinuierlich in einer Leitung gesammelt, die über ein Ventil an den Säulenablauf angeschlossen ist. Nach Durchfluss eines geeigneten Volumens an Eluat wird der Strom gestoppt und das Ventil geschaltet, so dass das Eluat in umgekehrter Reihenfolge auf das in Beispiel 1 beschriebene Umkehrphasen-Säulensystem aufgebracht wird. Die Säulen werden dann voneinander getrennt und einzeln mit Methanol extrahiert. Die HPLC-Analyse der resultierenden Fraktionen wird mit der der Fraktionen verglichen, die aus einer Probenverdrängungstrennung alleine erhalten werden.
Beispiel 4
Reinigung von Bacitracin
1 g Bacitracin (Sigma B-0125) wurde auf einer 10 ml-Kationenaustauschsäule unter Verwendung von 0,1% Essigsäure als Träger gereinigt. Nach der Trennung wurde das Produkt aus der Säule unter Verwendung von 0,1 M Ammoniumacetat extrahiert, und der Extrakt wurde in Fraktionen abgesammelt. Die Analyse ergab, dass die Reinheit des Bacitracin A über eine Anzahl von Fraktionen zunahm und so einen Reinheitsgradienten schuf. Die Bacitracin A als Hauptkomponente enthaltenden Fraktionen wurden in zwei Teile aufgeteilt. Die ersten Teile wurden in einem Pool gesammelt, wohingegen die zweiten Teile separat gehalten wurden.
Das gepoolte Material wurde auf das in Beispiel 1 beschriebene Umkehrphasen-Säulensystem unter Verwendung von 0,1 Essigsäure als Träger aufgegeben, woraufhin die Säulen voneinander getrennt und einzeln mit Methanol extrahiert und reäquilibriert wurden. Sie wurden dann wieder in Reihe geschaltet und zur Trennung des nicht-gepoolten Materials verwendet, wobei die Fraktionen in der Reihenfolge ihrer Elution aus der Kationenaustauschsäule aufgegeben wurden. Die Säulen wurden nochmals voneinander getrennt und einzeln mit Methanol extrahiert.
Die Umkehrphasen-HPLC-Analyse des extrahierten Materials zeigte, dass das aus der zweiten Trennung gesammelte Produkt Bacitracin A in viel höherer Reinheit enthielt als die Fraktionen aus der ersten Trennung. Bei beiden Experimenten enthielt Säule Nummer 2 das Material der höchsten Reinheit. Die Reinheit des Produkts überstieg jedoch 90%, wenn die Kationenaustausch-Fraktionen nacheinander aufgegeben wurden, wohingegen eine Reinheit von lediglich 77% nach Aufgabe der gepoolten Fraktionen erreicht wurde. Die Ergebnisse sind in 3 veranschaulicht.

Claims

Ein Verfahren der probenverdrängungschromatographischen Trennung, das Aufgeben einer Mehrkomponentenprobe an einem Ende eines Chromatographiebettes, welches ein stationäres Phasenmaterial, das eine Affinität für Komponenten der Probe aufweist, umfasst, Bewirken, dass die Komponenten der Probe entlang des Chromatographiebettes verteilt werden, indem eine nicht-eluierende mobile Lösungsphase über das Bett geleitet wird, und Rückgewinnen einer gewünschten Komponente der Probe aus mindestens einem Abschnitt des Chromatographiebettes umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass Probenkomponenten so auf das Chromatographiebett in einer nicht homogenen Weise appliziert werden, dass die Konzentration mindestens einer Komponente mit relativ geringer Affinität für das stationäre Phasenmaterial während eines früheren Abschnitts der Probenaufgabe erhöht wird und/oder die Konzentration mindestens einer Komponente mit relativ hoher Affinität für das stationäre Phasenmaterial während eines späteren Abschnitts der Probenaufgabe erhöht wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die probenverdrängungschromatographische Trennung Umkehrphasenchromatographie umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Aufgabe in einer nicht homogenen Weise durch Laden einer festen Probe auf das Chromatographiebett und Eluieren mit einem Trägerlösungsmittel, welches die Komponenten der festen Probe zu unterschiedlichen Anteilen löst, erreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Mehrkomponentenprobe von einer vorhergehenden chromatographischen Trennung abgeleitet wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die vorhergehende chromatographische Trennung Verwendung einer trennbaren Probenverdrängungschromatographiesäule umfasst.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die trennbare Probenverdrängungschromatographiesäule eine Umkehrphasenchromatographiesäule, eine Ionenaustauschsäule oder eine hydrophobische Interaktionssäule ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die vorhergehende chromatographische Trennung Gelpermeationschromatographie, Ionenaustauschchromatographie oder Umkehrphasenchromatographie umfasst.