DE69928747T2 - Verfahen und Zusammensetzungen zur Vermehrung von feststellbaren Signalen in spezifischen Bindungstests - Google Patents

Verfahen und Zusammensetzungen zur Vermehrung von feststellbaren Signalen in spezifischen Bindungstests Download PDF

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Description

  • QUERVERWEIS AUF VERWANDTE PATENTANMELDUNGEN
  • Diese vorliegende Anmeldung beansprucht den Zeitrang der provisorischen U.S. Patentanmeldung Nr. 60/102,577, eingereicht am 30. September 1998, deren Gegenstand in der vorliegenden Anmeldung in ihrer Gesamtheit durch Zitat aufgenommen wird.
  • TECHNISCHER BEREICH DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft allgemein Verfahren und Materialien zur Amplifikation nachweisbarer Signale in spezifischen Bindungsassays, insbesondere in Nukleinsäure-Bindungsassays.
  • STAND DER TECHNIK
  • Nukleinsäure-Hybridisierungen werden üblicherweise in biochemischer Forschung und in diagnostischen Assays benutzt. Im allgemeinen wird eine einzelsträngige Analyt-Nukleinsäure mit einer markierten Nukleinsäure-Sonde hybridisiert und die resultierenden Nukleinsäure-Duplexe werden nachgewiesen. Radioaktive und nichtradioaktive Markierungen sind benutzt worden. Es sind auch Verfahren entwickelt worden, um das nachzuweisende Signal zu amplifizieren. Zum Beispiel, große, kammähnliche, verzweigte Polynukleotide, welche eine primäre Oligonukleotid-Einheit und Verzweigungen mit sekundären Oligonukleotid-Einheiten enthalten, sind zur Signalamplifikation in Nukleinsäure-Detektionsassays entwickelt worden. Für diese Anwendung wird das verzweigte Polynukleotid über die primäre Oligonukleotid-Einheit mit einzelsträngiger Analyt-Nukleinsäure hybridisiert und anschließend wird markiertes Oligonukleotid mit dem verzweigten Polynukleotid mittels der sekundären Oligonukleotid-Einheiten hybridisiert, wie im U.S. Patent Nr. 5,710,264 der Chiron Corporation beschrieben.
  • Dendrimere sind entwickelt worden, welche durch die sequentielle Hybridisierung von einzelnen DNA-Strängen aufgebaut werden. Paarweise Hybridisierung von Einzelsträngen erzeugt Monomere mit einem doppelsträngigen Zentrum und vier einzelsträngigen „Armen". Die Monomere können in sequentiellen Hybridisierungsschritten exponentiell wachsen, um ein Makromolekül zu erzeugen, welches terminale einzelsträngige Arme enthält. Die Größe der Dendrimere kann den Bereich von Hunderten bis Millionen von Basen umfassen. Die Arme, die nicht mit dem Nukleinsäure-Ziel hybridisieren sollen, können mit kovalent markierten Oligonukleotiden hybridisiert werden. Diese Dendrimere sind kommerziell erhältlich von Polyprobe, Bala Cynwyd, PA. Dendrimere zum Nachweis von Nukleinsäuren sind in den U.S. Patenten Nr. 5,175,270, 5,487,973 und 5,484,904 beschrieben worden, deren Offenbarungsgehalt hierin eingeschlossen werden.
  • Avidin-Biotin-Systeme sind zur Nutzung in einer Vielzahl von Detektionsassays entwickelt worden. Verfahren zum Nachweis und zur Markierung von Nukleinsäuren in Biotin-Systemen sind beschrieben worden, zum Beispiel, in "Nonradioactive Labeling and Detection Systems", C. Kessler, Ed., Springer-Verlag, New York, 1992, Seiten 70–99; und in "Methods in Nonradioactive Detection,", G. Howard, Ed., Appleton and Lange, Norwalk, Connecticut, 1993, Seiten 11–27 und 137–150.
  • Verfahren zur Detektion von Nukleinsäuren wiesen jedoch Nachteile auf, wie Hintergrundsignal, Zeit- und Arbeitserfordernisse, Mangel an Spezifität und Mangel an Sensitivität. Es ist ein Anliegen der Erfindung, Materialien zur Detektion von Polymeren zur Verfügung zu stellen, insbesondere für Nukleinsäuren. Es ist ein besonderes Anliegen der Erfindung, Verfahren und Materialien zur Amplifikation von Markierungssignalen zur Verfügung zu stellen, welche zur Detektion von Nukleinsäuresequenzen in spezifischen Bindungsassays eingesetzt werden. Es ist ein weiteres Anliegen der Erfindung, Verfahren und Materialien zur Verfügung zu stellen, welche es ermöglichen, Nukleinsäuresequenzen spezifisch und schnell mit hoher Sensitivität und mit hoher Auflösung zu detektieren.
  • WO 98/04745 offenbart ein Verfahren zur Analyse von Nukleinsäuresequenzen durch Hybridisierung, bei dem zwei Sondensequenzen mit einer Nukleinsäure-Ziel-Sequenz hybridisiert und ligiert werden, um ein einziges Polynukleotid zu erhalten, welches anschließend detektiert wird. Die Detektion der Hybridisierung kann ein Verfahren zur Amplifikation des Hybridisierungssignals umfassen, wobei eine für das Nukleinsäure-Ziel spezifische Nukleinsäure-Sonde mit einem Liganden markiert wird, ein Überschuss an Ligandenbindender Einheit und eine Signalsonde wird zugegeben, wodurch ein großer Komplex gebildet wird, von dem gesagt wird, dass er einfach zu detektieren sei.
  • Kerstens et al. (J. Histochem. and Cytochem., 1995, Seiten 347–352) beschreiben ebenfalls Strategien zur Amplifikation des Signals in Nukleinsäure-Detektionsverfahren. Eine als CARD ISH ("catalyzed reporter deposition combined with in situ hybridization" [Katalysiertes Ablegen eines Reporters kombiniert mit in situ Hybridisierung]) bezeichnete Technik ist beschrieben, bei der eine DNA-Sondenmarkierung komplexiert wird mit:
    • (1) Maus Anti-Biotin,
    • (2) Biotinyliertes Pferde Anti-Maus,
    • (3) Avidin-Biotin Peroxidase,
    • (4) Ablegen von biotinyliertem Tyramin und
    • (5) Fluorochrom- oder Enzym-markiertes Avidin.
  • Sekundäre Signalamplifikation in Verfahren zur Detektion von Nukleinsäuren wurde auch durch in vitro Transkription des immobilisierten Komplexes Nukleinsäure-Zielmolekül/Amplifikationskonstrukt in der Anwesenheit von Markierungen erreicht, wobei diese in das Transkript eingebaut werden (WO 93/24658).
  • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Verfahren und Materialien werden zum Nachweis von Nukleinsäure-Zielmolekülen, unter Nutzung von spezifischen Bindungsassays, zur Verfügung gestellt. Verfahren und Materialien werden zur Verfügung gestellt, welche in der Signalamplifikation zur Detektion des Nukleinsäure-Zielmoleküls nützlich sind.
  • In einer Ausführungsform werden Verfahren zur Detektion eines Nukleinsäure-Ziels zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren die Hybridisierung eines Nukleinsäure-Ziels, welches eine Ziel-Nukleinsäuresequenz umfasst, mit einer Nukleinsäure-Sonde umfasst, die an einer Oberfläche immobilisiert ist, und die eine Sonden-Nukleinsäuresequenz enthält, und wobei ein Bindungsligand mit dem besagten Nukleinsäure-Ziel komplexiert ist. Das hybridisierte Nukleinsäure-Ziel wird mit einem Rezeptor in Kontakt gebracht, der mehrere Stellen umfasst, welche in der Lage sind, den Bindungsliganden zu binden, um den Rezeptor und den Bindungsliganden in einen Komplex zu überführen; und der Rezeptor wird mit einem Amplifikations-Reagenz in Kontakt gebracht, welches eine Vielzahl von Bindungsliganden enthält, wobei die besagten Bindungsliganden an das Amplifikations-Reagenz kovalent angeheftet sind, um das Amplifikations-Reagenz mit dem Rezeptor in einen Komplex zu überführen, wobei das Amplifikations-Reagenz ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper und einer dendrimeren DNA-Matrix, welche Schichten von DNA und einzelsträngigen Sequenzen an der Oberfläche der Matrix enthält, die frei verfügbar sind, um mit einer vorherbestimmten Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren. Die Anwesenheit des komplexierten Amplifikations-Reagenz wird dann detektiert, zum Beispiel durch Detektion der Anwesenheit einer detektierbaren Markierung in zumindest einem der Rezeptor- und der Amplifikations-Reagenzien.
  • Nach der Komplexierung des Amplifikations-Reagenz mit dem Rezeptor, der mit dem hybridisierten Nukleinsäure-Ziel komplexiert ist, kann das Amplifikations-Reagenz, welches eine Vielzahl von Bindungsliganden enthält, gegebenenfalls mit markierten Rezeptormolekülen in Kontakt gebracht, wobei eine Vielzahl von markierten Rezeptormolekülen mit dem Amplifikations-Reagenz komplexiert werden, und die markierten Rezeptormoleküle welche mit dem Amplifikations-Reagenz komplexiert sind, werden detektiert. Dies ermöglicht es, dass das detektierbare Signal verstärkt und einfacher detektiert wird.
  • Markierungen, die eingesetzt werden können, umfassen fluoreszente Markierungen, Gold-Markierungen und Enzym-Markierungen. Beispielhaft umfassen fluoreszente Markierungen Fluorescein, Rhodamin, Resorufin oder ein Coumarin. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Bindungsligand Biotin und der Rezeptor ist Avidin oder Streptavidin.
  • Das Amplifikations-Reagenz kann ein Polymer beinhalten, wie eine Poly(Aminosäure) oder ein Polynukleotid. In einer Ausführungsform kann das Amplifikations-Reagenz ein Antikörper sein, wie zum Beispiel ein Anti-Rezeptor-Antikörper, der den Rezeptor spezifisch binden kann.
  • In einer anderen Ausführungsform kann das Amplifikations-Molekül eine DNA-Matrix sein. Die DNA-Matrix kann Untereinheiten aus- partiell doppelsträngigen und partiell einzelsträngigen DNA-Molekülen enthalten. In einer Ausführungsform, enthält das DNA-Matrix Molekül eine Vielzahl von Molekülen eines primären partiell doppelsträngigen Polynukleotids, wobei das Polynukleotid ein erstes Molekülende, ein zweites Molekülende und einen doppelsträngigen Körper-Abschnitt zwischen den ersten und zweiten Enden enthält, wobei die ersten und zweiten Enden jeweils mindestens einen der ersten und zweiten Arme enthalten, die aus einem einzelnen Polynukleotid-Strang bestehen, und wobei die Einzelstränge mit einer vorherbestimmten Nukleinsäuresequenz von Nukleotiden in einer Nukleinsäure hybridisierbar sind, und die ersten und zweiten Arme der besagten ersten und zweiten Enden nicht miteinander hybridisierbar sind. Die DNA-Matrix beinhaltet darüber hinaus eine Vielzahl von Molekülen eines zweiten partiell doppelsträngigen Polynukleotids, wobei jedes Polynukleotid ein erstes Molekülende, ein zweites Molekülende und einen doppelsträngigen Körper-Abschnitt zwischen den ersten und zweiten Enden enthält, wobei die ersten und zweiten Enden jeweils mindestens einen der ersten und zweiten Arme enthalten, die aus einem einzelnen Polynukleotid-Strang bestehen, und wobei die Einzelstränge mit einer vorherbestimmten Nukleinsäuresequenz von Nukleotiden in einer Nukleinsäure hybridisierbar sind, und die ersten und zweiten Arme der besagten ersten und zweiten Enden nicht miteinander hybridisierbar sind. In der DNA-Matrix sind die Vielzahl von Molekülen des ersten Polynukleotids und des zweiten Polynukleotids durch Hybridisierung von einem oder mehreren Armen derselben miteinander verbunden, um eine Matrix zu bilden, worin Arme der Vielzahl von ersten und zweiten Polynukleotid-Molekülen, die an der äußeren Oberfläche der Matrix liegen, mit Nukleinsäuren hybridisiert sind an denen der Bindungsligand befestigt ist.
  • In einer Ausführungsform ist der Bindungsligand Biotin und der Rezeptor ist Avidin oder Streptavidin. Zum Beispiel, in der Ausführungsform worin das Amplifikations-Reagenz ein Antikörper ist, kann das Biotin kovalent an den Antikörper angeheftet sein. Zum Beispiel kann der Antikörper ein Anti-Streptavidin-Antikörper sein welcher eine Vielzahl von Biotinmolekülen enthält, welche kovalent an einen Antikörper angeheftet sind. In einem Assay., nachdem der Antikörper mit einem Streptavidin-Rezeptor komplexiert ist, der mit der biotinylierten Ziel-Nukleinsäure verbunden ist, kann der Antikörper mit markiertem Streptavidin kontaktiert werden, wobei eine Vielzahl von markierten Streptavidin-Molekülen mit dem Antikörper komplexiert werden, und die mit dem Antikörper komplexierten, markierten Streptavidin-Moleküle können dann detektiert werden, wodurch eine Signalamplifikation im Assay ermöglicht wird.
  • In der Ausführungsform worin das Amplifikations-Reagenz eine DNA-Matrix ist, welche einzelsträngige DNA enthält, kann durch Hybridisierung einer Vielzahl von biotinylierten Nukleinsäuren mit Einzelsträngen der DNA-Matrix, ein Bindungsligand bestehend aus Biotin an die DNA-Matrix gebunden werden. In dieser Ausführungsform, nach der Komplexierung der DNA-Matrix mit den Rezeptorkomplexen mit dem hybridisierten Nukleinsäure-Ziel, wird die biotinylierte DNA-Matrix mit markiertem Streptavidin in Kontakt gebracht, wobei eine Vielzahl von markierten Streptavidin-Molekülen mit den Biotinen der DNA-Matrix komplexiert wird, und die mit der DNA-Matrix komplexierten, markierten Streptavidin-Moleküle werden detektiert, wodurch das detektierbare Signal verstärkt wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Nukleinsäure-Sonde auf einer Oberfläche immobilisiert. Die Oberfläche kann zum Beispiel Langmuir-Blodgett-Film, Glas, Germanium, Silizium, (Poly)Tetrafluorethylen, Polystyrol, Galliumarsenid, Galliumphosphid, Siliziumoxid, Siliziumnitrid und Kombinationen derselben sein.
  • In einer Ausführungsform wird die Hybridisierung eines Nukleinsäure-Ziels, welches eine Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält, mit einer Nukleinsäure-Sonde, welche eine Nukleinsäure-Sondensequenz enthält, in einer Lösung durchgeführt welche einen Sulfonatpuffer enthält.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zur Detektion eines Nukleinsäure-Ziels zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren beinhaltet, dass eine Oberfläche zur Verfügung gestellt wird, welche mindestens 100 Nukleinsäure-Sonden enthält, jede mit einer Fläche von weniger als ca. 0,1 cm2, und jede Nukleinsäure-Sonde hat eine definierte Sequenz und Lokalisation auf der Oberfläche, und das Kontaktieren der Oberfläche mit einem Nukleinsäure-Ziel, welches eine Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält, die ermöglicht dass das Nukleinsäure-Ziel mit mindestens einer ausgewählten Nukleinsäure-Sonde, welche eine Sonden-Nukleinsäuresequenz enthält die mit der Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisieren kann, und wobei ein Bindungsligand mit dem besagten Nukleinsäure-Ziel komplexiert ist. Die Sonden sind bevorzugterweise auf der Oberfläche immobilisiert, zum Beispiel durch kovalente Bindung. Das Verfahren beinhaltet weiterhin, dass das hybridisierte Nukleinsäure-Ziel mit einem Rezeptor kontaktiert wird, der mehrere Stellen umfasst, welche in der Lage sind, den Bindungsliganden zu binden, um den Rezeptor mit dem Bindungsliganden komplexieren zu können; Kontaktieren des Rezeptors mit einem Amplifikations-Reagenz, welches eine Vielzahl von Bindungsliganden enthält, wobei besagte Bindungsliganden kovalent an das besagte Amplifikations-Reagenz angeheftet sind, um das Amplifikations-Reagenz mit dem Rezeptor zu komplexieren, wobei das Amplifikations-Reagenz ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper und einer dendrimeren DNA-Matrix, welche Schichten von DNA und einzelsträngigen Sequenzen an der Oberfläche der Matrix enthält, die frei verfügbar sind, um mit einer vorherbestimmten Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren und zur Detektion der Anwesenheit des komplexierten Amplifikations-Reagenz. In einer Ausführungsform beinhaltet das Amplifikations-Reagenz einen Antikörper oder eine DNA-Matrix, der Bindungsligand enthält Biotin und der Rezeptor enthält Streptavidin. In einer Ausführungsform wird die Oberfläche, welche die Sonden enthält, mit dem Nukleinsäure-Ziel in einer Hybridisierungslösung in Kontakt gebracht, welche einen Sulfonatpuffer enthält, wie zum Beispiel 2-[N-Morpholino-]Ethansulfonsäure ("MES").
  • Es werden auch Komplexe zur Verfügung gestellt, welche einen Bindungsliganden komplexiert mit einer Nukleinsäure und einen Rezeptor enthalten; sowie ein Amplifikations-Reagenz welches eine Vielzahl von den Bindungsliganden enthält, wobei die besagten Bindungsliganden kovalent an das besagte Amplifikations-Reagenz angeheftet sind. In einer Ausführungsform ist der Bindungsligand Biotin und der Rezeptor ist Streptavidin oder Avidin.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird ein Substrat zur Verfügung gestellt, welches eine Oberfläche enthält worauf eine Nukleinsäure-Sonde immobilisiert wurde, welche eine Sonden-Nukleinsäuresequenz enthält, hybridisiert mit einem Nukleinsäure-Ziel, welches eine Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält; dabei ist ein Bindungsligand mit besagtem Nukleinsäure-Ziel komplexiert, wobei der Bindungsligand im Nukleinsäure-Ziel mit einem Rezeptor komplexiert ist, der mehrere Stellen umfasst, welche in der Lage sind, den Bindungsliganden zu binden, und wobei der Rezeptor mit einem Amplifikations-Reagenz komplexiert ist, welches eine Vielzahl von den Bindungsliganden enthält, wobei die besagten Bindungsliganden kovalent an das besagte Amplifikations-Reagenz angeheftet sind.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist ein Schema und illustriert die Detektion eines Nukleinsäure-Ziels unter Nutzung eines Amplifikations-Reagenz welches einen Anti-Streptavidin-Antikörper enthält, welcher kovalent an eine Vielzahl von Biotinmolekülen angeheftet ist. Die 2a und 2b zeigen einen Vergleich von Fluoreszenz-Detektion ohne beziehungsweise mit Amplifikation.
  • VERFAHREN ZUR AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG
  • Verfahren und Materialien zum Nachweis von Zielmolekülen unter Nutzung von spezifischen Bindungsassays werden zur Verfügung gestellt. Insbesondere werden Verfahren zur Verfügung gestellt, um ein Nukleinsäure-Ziel zu detektieren.
  • In einer Ausführungsform beinhaltet das Verfahren die Hybridisierung eines Nukleinsäure-Ziels, welches eine Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält, mit einer Nukleinsäure-Sonde welche auf einer Oberfläche immobilisiert ist und eine Sonden-Nukleinsäuresequenz enthält, wobei das Nukleinsäure-Ziel einen Bindungsliganden enthält, der mit dem besagten Nukleinsäure-Ziel komplexiert ist. Das hybridisierte Nukleinsäure-Ziel wird mit einem Rezeptor kontaktiert, der mehrere Stellen umfasst, welche in der Lage sind, den Bindungsliganden zu binden, um den Rezeptor mit dem Bindungsliganden zu komplexieren, und der Rezeptor wird mit einem Amplifikations-Reagenz in Kontakt gebracht, welches eine Vielzahl von der Bindungsliganden enthält, wobei die besagten Bindungsliganden an das besagte Amplifikations-Reagenz kovalent angeheftet sind, um das Amplifikations-Reagenz mit dem Rezeptor zu komplexieren, wobei das Amplifikations-Reagenz ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper und einer dendrimeren DNA-Matrix, welche Schichten von DNA und einzelsträngigen Sequenzen an der Oberfläche der Matrix enthält, die frei verfügbar sind, um mit einer vorherbestimmten Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren. Die Anwesenheit des komplexierten Amplifikations-Reagenz wird dann detektiert, zum Beispiel durch Detektion der Anwesenheit einer detektierbaren Markierung, wie zum Beispiel einer fluoreszenten Markierung, am Rezeptor oder am Amplifikations-Reagenz. Nach der Komplexierung des Amplifikations-Reagenz mit dem Rezeptor, der mit dem hybridisierten Nukleinsäure-Ziel komplexiert ist, kann das Amplifikations-Reagenz, welches eine Vielzahl von Bindungsliganden enthält, gegebenenfalls mit markierten Rezeptormolekülen in Kontakt gebracht werden, wobei eine Vielzahl von markierten Rezeptormolekülen mit dem Amplifikations-Reagenz komplexiert werden, und die markierten Rezeptormoleküle welche mit dem Amplifikations-Reagenz komplexiert sind, werden detektiert. Dies ermöglicht es, dass das detektierbare Signal verstärkt und einfacher detektiert wird. In einer Ausführungsform ist das Amplifikations-Reagenz ein Antikörper oder eine DNA-Matrix, der Bindungsligand ist Biotin und der Rezeptor ist Streptavidin.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann eine Serie unterschiedlicher Nukleinsäure-Sonden, die auf einer Oberfläche immobilisiert sind, wobei jede Sonde eine definierte Sequenz und Lokalisation hat, in den hier offengelegten Assays benutzt werden, wodurch das Durchsuchen und die Detektion einer großen Zahl von Nukleinsäuren in einer Probe ermöglicht wird.
  • Während Nukleinsäure-Ziels und Sonden hier im Detail an Hand von Beispielen diskutiert werden, können die Verfahren und Materialien die hier offengelegt werden, benutzt werden um die Bindung von anderen Moleküle zu detektieren, einschließlich von Polypeptiden.
  • Amplifikations-Reagenzien
  • Das Amplifikations-Reagenz kann eine chemische Substanz sein, welche einen Bindungsliganden enthält, der an einen Rezeptor binden kann. Bevorzugterweise enthält das Amplifikations-Molekül eine Vielzahl von Bindungsliganden welche an einen Rezeptor binden können. Die Liganden können zum Beispiel durch nichtkovalente, spezifische Bindungs-Wechselwirkungen an den Rezeptor binden. Das Amplifikations-Reagenz kann zum Beispiel ein Polymer, wie eine Poly(Aminosäure) oder einen Polyester, enthalten.
  • In einer Ausführungsform kann das Amplifikations-Reagenz einen Antikörper enthalten. Die Bezeichnung „Antikörper" bezieht sich auf ein Immunoglobulinmolekül oder auf ein Fragment eines Immunoglobulinmoleküls welches in der Lage ist, ein spezielles Antigen spezifisch zu binden. Der Antikörper kann ein Anti-Rezeptor-Antikörper sein, der spezifisch für den im Assay benutzten Rezeptor ist. Somit kann der Antikörper in der Lage sein, den Rezeptor spezifisch als Antigen zu binden. Antikörper und Verfahren für ihre Herstellung sind im Stand der Technik der Immunologie wohlbekannt. Der Antikörper kann zum Beispiel mit einer Hybridomzellinie, durch Immunisierung zur Erzeugung einer Reaktion mit polyklonalen Antikörpern, oder mit rekombinanten Wirtszellen, die mit einem DNR-Expressionsvektor transformiert wurden, welcher für den Antikörper kodiert, erzeugt werden. Antikörper umfassen, sind aber nicht limitiert auf Immunoglobulinmoleküle jedes Isotyps (IgA, IgG, IgE, IgD, IgM), und auf aktive Fragmente, einschließlich Fab, Fab', F(ab')2, Facb, Fv, ScFv, Fd, VH und VL. Antikörper umfassen, sind aber nicht limitiert auf Einzelketten-Antikörper, chimäre Antikörper, Mutanten, Fusionsproteine, humanisierte Antikörper und jedwede andere modifizierte Konfiguration eines Immunoglobulinmoleküls welches eine Antigen-Erkennugsregion mit der erforderlichen Spezifität enthält.
  • Die Herstellung von Antikörpern, einschließlich Antikörper-Fragmenten und anderen modifizierten Formen ist zum Beispiel beschrieben in "Immunochemistry in Practice," Johnstone and Thorpe, Eds., Blackwell Science, Cambridge, MA, 1996; "Antibody Engineering," 2nd Edition, C. Borrebaeck, Ed., Oxford University Press, New York, 1995; "Immunoassay", E. P. Diamandis and T.K. Christopoulos, Eds., Academic Press, Inc., San Diego, 1996; "Handbook of Experimental Immunology," Herzenberg et al., Eds, Blackwell Science, Cambridge, MA, 1996; and "Current Protocols in Molecular Biology" F.M. Ausubel et al., Eds., Greene Pub. Associates and Wiley Interscience, 1987, deren Offenbarungsgehalt hierin eingeschlossen sind. Eine Vielzahl von Antikörpern ist auch kommerziell erhältlich.
  • Das Amplifikations-Reagenz enthält bevorzugt eine Vielzahl von Bindungsliganden. Bevorzugterweise sind die Bindungsliganden kovalent am Amplifikations-Reagenz angeheftet. Zum Beispiel enthält in einer Ausführungsform der Bindungsligand Biotin, der Rezeptor ist Avidin oder Streptavidin, und das Amplifikations-Reagenz ist ein Anti-Streptavidin-Antikörper.
  • In dieser Ausführungsform, sind zum Beispiel eine Vielzahl von Biotinmolekülen, zum Beispiel ca. 3–10 Biotinmoleküle, an den Antikörper angeheftet.
  • In einer Ausführungsform ist das Amplifikations-Reagenz eine Polynukleotid-Matrix. Die Bezeichnung „Polynukleotid" oder „Nukleinsäure" wie sie hier benutzt werden beziehen sich auf eine polymere Form von Nukleotiden jedweder Länge, entweder Ribonukleotide oder Deoxyribonukleotide, welche Purin- und Pyrimidinbasen umfassen, oder andere natürliche, chemisch oder biochemisch modifizierte, nicht-natürliche, oder derivatisierte Nukleotidbasen. Das Rückgrat des Polynukleotids kann Zucker und Phosphatgruppen umfassen (wie sie typischerweise in RNA und DNA gefunden werden), oder modifizierte oder substituierte Zucker oder Phosphatgruppen. Ein Polynukleotid kann modifiziert Nukleotide enthalten, wie zum Beispiel methylierte Nukleotide und Nukleotid-Analoga. Die Sequenz der Nukleotide kann durch Nicht-Nukleotid-Komponenten unterbrochen sein.
  • In einer Ausführungsform ist das Amplifikations-Reagenz eine Deoxyribonukleinsäure („DNA") Matrix. Wie hier benutzt, bezieht sich der Ausdruck "DNA-Matrix" auf einen Komplex aus DNA der eine oder mehrere Deoxyribonukleinsäuren umfasst. Die DNA kann Purin- und Pyrimidinbasen umfassen, oder andere natürliche, chemisch oder biochemisch modifizierte, nicht-natürliche, oder derivatisierte Nukleotidbasen. In einer Ausführungsform ist die DNA-Matrix ein Dendrimer, das Untereinheiten aus partiell doppelsträngigen und partiell einzelsträngigen DNA-Molekülen umfasst. Die dendrimere DNA-Matrix umfasst aufeinanderfolgende Schichten von Polynukleotiden mit spezifischer Struktur, einschließlich einer doppelsträngigen Taille und einzelsträngigen freien Armen an den Molekülenden, gebildet durch Hybridisierung der Arme mit benachbarten Molekülarmen. Exemplarische dendrimere DNA-Matrizen sind von Polyprobe, Bala Cynwyd, PA, kommerziell erhältlich und sind in den U.S. Patenten Nr. 5,175,270 und 5,487,973 detailliert beschrieben, deren Offenbarungsgehalt hierin eingeschlossen sind.
  • Zum Beispiel, zur Ausbildung der dendrimeren DNA-Matrix wird ein Set von Nukleotidstrang-Molekülen zur Verfügung gestellt, zum Beispiel durch Synthese auf einem DNA-Synthesizer oder einer "Genmaschine" wie zum Beispiel das Modell 1500 SYSTEC Synthesizer. Die Moleküle können in speziell modifizierten E. coli Vektoren kloniert werden, um mittels bekannter Verfahren Produktion im Großmaßstab durchzuführen. Die Moleküle werden hybridisiert um DNA-Matrizen zu bilden.
  • Die dendrimeren DNA-Matrizen umfassen Schichten von DNA. Die äußerste Schicht an der Oberfläche der DNA-Matrix hat einzelsträngige Sequenzen, die mit einer vorherbestimmten Nukleinsäuresequenz hybridisieren können. Jede Schicht ist aus einer spezifischen Klasse von Matrix-Monomeren zusammengesetzt. Sequentielle Addition von Matrix-Monomeren ergibt eine dreidimensionale DNA-Matrix.
  • Eine Ausführungsform zum Zusammenbau eines DNA-Dendrimers ist durch Bezug auf die 1–3 und die Beschreibung in U.S. Patent Nr. 5,175,270 zur Verfügung gestellt. Die Matrix-Monomere sind zum Beispiel DNA-Dimere, welche eine mittlere doppelsträngige „Taille" und vier einzelsträngige „Arme" haben, wie in 2 von U.S. Patent Nr. 5,175,270 gezeigt ist. Das Matrix-Monomer und seine Komponenten (das heißt Taille und Arme) können von jedweder Länge sein. Zum Beispiel, kann jede Taille Längen von ca. 25 bis ca. 2500 Nukleotiden umfassen. Der einzelsträngige Arm kann typischerweise eine Länge von ca. 12 bis ca. 1000 Nukleotiden umfassen, und bevorzugterweise eine Länge von ca. 20 bis ca. 100 Nukleotiden.
  • 1 in U.S. Patent No. 5,175,270 illustriert sieben einzelsträngige DNA-Oligomere, welche zusammengesetzt werden können, um das Matrix-Monomer zu bilden. In jedem gezeigten Oligomer repräsentieren die durchgezogenen Linien (+) Stränge, während die durchbrochenen Linien komplementäre Strang sequenzen repräsentieren. Jedes mit Buchstaben (a–e) versehene Segment bezeichnet eine einzigartige Sequenz auf den unterschiedlichen Oligomeren. 2 in U.S. Patent Nr. 5,175,270 zeigt die Matrix-Monomere A, B', B'', C' und C'', welche durch Hybridisierung der einzelsträngigen DNA-Oligomerstränge zusammengesetzt sind, die mit Nummer 1–7 in 1 von U.S. Pat. Nr. 5,175,270 bezeichnet sind. Jedes Matrix-Monomer ist also ein Dimer, welches doppelsträngige (Taillen-)Regionen und einzelsträngige Regionen (Arme) umfasst. Die sequentielle Addition der Matrix-Monomere A, B', B'', C' and C'' ergibt eine dreidimensionale DNA-Matrix, wie in 3 von U.S. Pat. Nr. 5,175,270 illustriert ist, wobei die dreidimensionale Matrix eine Kern- und eine Oberflächen-Schicht enthält. Weitere Zugabe von Matrix-Monomeren kann ausgeführt werden, um Wachstum der DNA-Matrix zu ermöglichen, um die gewünschte Anzahl von Schichten zu erhalten. Somit werden in einer Ausführungsform DNA-Matrizen durch aufeinderfolgende Hybridisierung von Matrix-Monomeren zusammengefügt, wie oben beschrieben, unter Nutzung von Reaktionsbedingungen zur Hybridisierung wie sie im Stand der Technik verfügbar sind, wie detailliert beschrieben in U.S. Patent Nr. 5,175,270.
  • Die äußerste Schale oder die Oberflächenschicht werden terminale Oligonukleotidarme mit einer ausgewählten Sequenz haben. Die DNA-Matrix kann somit einfach mit einem Liganden oder einem Rezeptor oder einer Markierung hybridisiert werden, die mit einem Oligonukleotid verbunden ist, welches das reverse Komplement zur Sequenz der Matrixarme ist.
  • Somit umfasst, wie in U.S. Patent Nr. 5,175,270 beschrieben, die DNA-Matrix in einer Ausführungsform eine Vielzahl von Molekülen eines ersten partiell doppelsträngigen Polynukleotids, wobei das Polynukleotid ein erstes Molekül-Ende, ein zweites Molekül-Ende und einen doppelsträngigen Körper-Abschnitt zwischen dem ersten und dem zweiten Ende aufweist, wobei das erste und das zweite Ende jeweils mindestens einen von einem ersten und einem zweiten Arm umfasst, die aus einem Polynukleotid-Einzelstrang bestehen, und wobei die Einzelstränge mit einer vorbestimmten Nukleinsäuresequenz von Nukleotiden in einer Nukleinsäure hybridisierbar sind, und der erste und zweite Arm von jedem der ersten und zweiten Enden nicht miteinander hybridisierbar sind. Die DNA-Matrix umfasst weiterhin eine Vielzahl von Molekülen eines zweiten partiell doppelsträngigen Polynukleotids, wobei jedes Polynukleotid ein erstes Molekül-Ende, ein zweites Molekül-Ende und einen doppelsträngigen Körper-Abschnitt zwischen dem ersten und dem zweiten Ende aufweist, wobei das erste und das zweite Ende jeweils mindestens einen von einem ersten und einem zweiten Arm umfasst, die aus einem Polynukleotid-Einzelstrang bestehen, und wobei die Einzelstränge mit einer vorbestimmten Nukleinsäuresequenz von Nukleotiden in einer Nukleinsäure hybridisierbar sind, und der erste und zweite Arm von jedem der ersten und zweiten Enden nicht miteinander hybridisierbar sind. Die Vielzahl von Molekülen des ersten Polynukleotids und des zweiten Polynukleotids sind durch Anlagerung von einem oder mehreren Armen derselben zusammengefügt, wobei eine Matrix gebildet wird, und wobei mindestens einer der nicht zusammengelagerten Arme von der Vielzahl der ersten und zweiten Polynukleotid-Moleküle, der an der äußeren Oberfläche der Matrix lokalisiert ist, frei verfügbar ist um mit einer Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren.
  • Vorteilhafterweise ist der (sind die) nicht zusammengelagerte(n) Arm (oder Arme) mit einer spezifischen Nukleinsäuresequenz in einer Nukleinsäure hybridisierbar. Somit kann eine Nukleinsäure, welche eine zur spezifischen Sequenz der Dendrimer-Arme komplementäre Sequenz hat, und die an andere Einheiten angeheftet ist, wie zum Beispiel Liganden, Rezeptoren und Markierungen, mit den freien Armen hybridisiert werden, unter Nutzung von Hybridisierungsbedingungen die im Stand der Technik verfügbar sind, und in einer bevorzugten Ausführungsform können sie mit kommerziell verfügbaren Reagenzien, wie zum Beispiel Psoralen, irreversibel quervernetzt werden. In einer Ausführungsform ist eine Nukleinsäure, die eine zur spezifischen Sequenz der Dendrimer-Arme komplementäre Sequenz hat, an einen Bindungsliganden kovalent angeheftet, und dann wird eine Vielzahl von diesen Nukleinsäuren mit der DNA-Matrix hybridisiert, um das DNA-Matrix Amplifikations-Reagenz zur Verfügung zu stellen, welches eine Vielzahl von Bindungsliganden umfasst.
  • Amplifikation unter Nutzung von Antikörpern
  • In einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt um die Hybridisierung eines Nukleinsäure-Ziels, welches eine Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält, mit einer Nukleinsäure-Sonde, welche eine Sondensequenz enthält, zu detektieren. Bevorzugterweise ist die Nukleinsäure-Sonde auf der Oberfläche eines Substrats immobilisiert. In einer Ausführungsform wird ein Bindungsligand mit dem Nukleinsäure-Ziel komplexiert, bevorzugterweise durch kovalentes Anheften. In einem Assay wird die immobilisiert Nukleinsäure-Sonde in Kontakt gebracht mit, zum Beispiel aufeinanderfolgend mit dem Nukleinsäure-Ziel, das den Bindungsliganden enthält; mit einem Rezeptor, der mehrere Stellen umfasst, welche in der Lage sind, den Bindungsliganden zu binden; und mit einem Anti-Rezeptor Antikörper, der eine Vielzahl von Bindungsliganden enthält, die bevorzugterweise kovalent an den Antikörper angeheftet sind, in Kontakt gebracht. Falls eine Hybridisierung der Nukleinsäure-Sonde mit dem Nukleinsäure-Ziel aufgetreten ist, wird ein Komplex aus dem Bindungsliganden des Nukleinsäure-Ziels, dem Rezeptor und dem Antikörper gebildet. Der resultierende Komplex kann zum Beispiel dadurch detektiert werden, dass eine detektierbare Markierung auf dem Rezeptor oder dem Antikörper zur Verfügung gestellt und detektiert wird, oder durch in Kontaktbringen und Detektieren des komplexierten Antikörpers mit markierten, detektierbaren Molekülen des Rezeptors, die an die Bindungsligandenmoleküle auf dem Antikörper binden können. Die Detektion der Markierung ergibt somit eine positive Anzeige für die Hybridisierung des Nukleinsäure-Ziels und der Sonde.
  • In einer Ausführungsform sind der Ligand und der Rezeptor Biotin beziehungsweise Streptavidin. In dieser Ausführungsform wird ein Verfahren zur Detektion der Hybridisierung eines Nukleinsäure-Ziels, das eine Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält, mit einer immobilisierten Nukleinsäure-Sonde, die eine Sonden-Nukleinsäuresequenz enthält, zur Verfügung gestellt. Ein biotinyliertes Nukleinsäure-Ziel wird zur Verfügung gestellt. Das Verfahren umfasst: in Kontakt bringen der immobilisierten Nukleinsäure-Sonde, zum Beispiel aufeinanderfolgend, mit: dem biotinylierten Nukleinsäure-Ziel; Streptavidin; einem biotinylierten Anti-Streptavidin-Antikörper, der eine Vielzahl von Biotinen enthält; und markierten Streptavidin-Molekülen. Das Streptavidin ist mit einer detektierbaren Markierung markiert, wie zum Beispiel einer fluoreszenten Markierung. In dieser Ausführungsform kann die Bindung durch Hybridisierung des Nukleinsäure-Ziels mit der Sonde mit hoher Sensitivität detektiert werden. Bei der Hybridisierung der Sonde und des Nukleinsäure-Ziels, enthält das Nukleinsäure-Ziel nur eine Biotin-Einheit mit der Streptavidin komplexiert werden kann. Bei der Komplexierung von Streptavidin mit dem biotinylierten Nukleinsäure-Ziel wird die Zahl der Biotinmoleküle stark amplifiziert. Bei der Komplexierung des markierten Streptavidins mit den Biotinen am Antikörper wird die Zahl der detektierbaren Markierungen stark amplifiziert, wodurch die Sensitivität des Assays stark erhöht wird.
  • Der Assay ist schematisch in 1 illustriert. 1, Schema 1, illustriert eine Nukleinsäure-Sonde 20, immobilisiert auf der Oberfläche eines festen Substrats 10, die mit einem Nukleinsäure-Ziel 30 hybridisiert ist, das ein kovalent angeheftetes Biotinmolekül enthält. Das Biotinmolekül auf dem Nukleinsäure-Ziel 30 ist mit einem Streptavidinmolekül komplexiert, das gegebenenfalls mit einer detektierbaren Markierung markiert ist. Das markierte Streptavidin 40, wie in Schema 2 von 1 gezeigt, ist mit biotinyliertem Anti-Streptavidin-Antikörper 50 komplexiert, der mehrere Biotinmoleküle enthält.
  • Der Antikörper kann somit mit dem immobilisierten, biotinylierten Streptavidin interagieren und komplexieren durch eine oder beide, der Antikörper-Bindungs-Wechselwirkung und der Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung. Wie in Schema 3 der 1 gezeigt, komplexieren markierte Streptavidin-Moleküle 40 mit dem immobilisierten Antikörper 50 und stellen mehrere Markierungen zur Detektion und zur Signalamplifikation zur Verfügung. Der Antikörper stellt somit eine Brücke zur Verfügung, wodurch mehrere markierte Streptavidin-Moleküle komplexiert und detektiert werden können. Innerhalb des Bereichs der Erfindung können zusätzliche Schritte von Brückenbildung und Signalamplifikation ebenfalls durchgeführt werden, um das detektierbare Signal der Markierung zu erhöhen. In einer Ausführungsform ist Streptavidin-Phycoerythrin das detektierbare Streptavidin, das eingesetzt werden kann, und das kommerziell verfügbar ist, zum Beispiel von Molecular Probes (Eugene, Oregon). Biotinylierter Anti-Streptavidin-Antikörper ist zum Beispiel verfügbar von Vector Laboratories (Burlingame, CA).
  • Verfahren und Bedingungen, die im Stand der Technik für Nukleinsäure-Hybridisierungs-Assays entwickelt wurden, können eingesetzt werden, wie sie zum Beispiel beschrieben wurden in: Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2nd Ed., Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Berger and Kimmel, "Methods in Enzymology," Vol. 152, "Guide to Molecular Cloning Techniques", Academic Press, Inc., San Diego, CA., 1987; Young and Davis, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 80:1194 (1983).
  • Puffer, die zur Nukleinsäure-Hybridisierung benutzt werden können umfassen Phosphat- und TRIS-Puffer, zum Beispiel bei einem pH von 6 bis 8. In einer Ausführungsform wird ein Standard Salin-Phosphat-Ethylenediamintetraessigsäure ("SSPE") Puffer benutzt. Ein beispielhafter Phosphatpuffer enthält: 0.06 M H2PO4/HPO4, 1 M Na+, 0.006 M EDTA (Ethylenediamintetraessigsäure), 0.005% Triton®, bei einem pH von ca. 6,8, welcher hier als "6XSSPE-T" bezeichnet wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird in einem Nukleinsäure-Hybridisierungs-Assay ein Sulfonat-Hybridisierungspuffer benutzt, zum Beispiel ein Puffer, der 2-[N-Morpholino-]Ethansulfonsäure ("MES") enthält. Zum Beispiel kann der Hybridisierungspuffer ca. 0,01 M bis ca. 2 M MES oder mehr enthalten, zum Beispiel ca. 0,25 M MES, bei einem pH von, zum Beispiel ca. 6 bis 7. In einer Ausführungsform enthält der MES-Puffer: 0,25 M MES, 1 M Na+, und 0,005 Triton® X-100, bei einem pH von ca. 5,5–6,7, zum Beispiel 6.7. Die Hybridisierung kann zum Beispiel bei ca. 25 bis 70°C durchgeführt werden, zum Beispiel bei ca. 45°C. Der Puffer kann gegebenenfalls vor der Benutzung filtriert werden, zum Beispiel durch ein 2 μm Filter.
  • Amplifikation unter Nutzung von DNA-Matrizen
  • In einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt, um Bindung durch Hybridisierung eines Nukleinsäure-Ziels, welches eine Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält, mit einer Nukleinsäure-Sonde, welche eine Sonden-Nukleinsäuresequenz enthält, zu detektieren. Die Nukleinsäure-Sonde ist bevorzugterweise auf einer Oberfläche immobilisiert. In dieser Ausführungsform wird ein Bindungsligand mit dem Nukleinsäure-Ziel komplexiert, bevorzugterweise durch kovalentes Anheften. Die immobilisierte Nukleinsäure-Sonde wird dann zum Beispiel aufeinanderfolgend kontaktiert mit dem Nukleinsäure-Ziel, das den Bindungsliganden enthält; mit einem Rezeptor, der mehrere Stellen umfasst, welche in der Lage sind, den Bindungsliganden zu binden; und mit einer DNA-Matrix, die eine Vielzahl von Bindungsliganden enthält. Wenn Hybridisierung der Nukleinsäure-Sonde mit dem Nukleinsäure- Ziel aufgetreten ist, wird ein Komplex aus dem Bindungsliganden des Nukleinsäure-Ziels, dem Rezeptor und dem Antikörper gebildet. Der resultierende Komplex kann zum Beispiel dadurch detektiert werden, dass eine detektierbare Markierung auf der DNA-Matrix zur Verfügung gestellt und detektiert wird, oder durch in Kontaktbringen der komplexierten DNA-Matrix und der Detektion von markierten, detektierbaren Molekülen des Rezeptors, die an die Bindungsligandenmoleküle auf der DNA-Matrix binden können. Die Detektion der Markierung ergibt somit eine positive Anzeige für die Hybridisierung des Nukleinsäure-Ziels und der Sonde.
  • In einer Ausführungsform sind der Ligand und der Rezeptor Biotin beziehungsweise Streptavidin. In dieser Ausführungsform wird ein Verfahren zur Detektion der Hybridisierung eines Nukleinsäure-Ziels, das eine Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält, mit einer immobilisierten Nukleinsäure-Sonde, die eine Sonden-Nukleinsäuresequenz enthält, zur Verfügung gestellt. Ein biotinyliertes Nukleinsäure-Ziel wird zur Verfügung gestellt. Das Verfahren umfasst: in Kontakt bringen der immobilisierten Nukleinsäure-Sonde, bevorzugterweise aufeinanderfolgend, mit: dem biotinylierten Nukleinsäure-Ziel; Streptavidin; einer biotinylierten DNA-Matrix, die eine Vielzahl von Biotinen enthält; und markierten Streptavidin-Molekülen. Das Streptavidin ist mit einer detektierbaren Markierung markiert, wie zum Beispiel einer fluoreszenten Markierung. In dieser Ausführungsform kann die Bindung durch Hybridisierung des Nukleinsäure-Ziels mit der Sonde mit hoher Sensitivität detektiert werden. Nach der Hybridisierung der Sonde mit dem Nukleinsäure-Ziel, wobei das Nukleinsäure-Ziel nur eine Biotin-Einheit enthält, die mit Streptavidin komplexiert werden kann. Streptavidin komplexiert mit dem biotinylierten Nukleinsäure-Ziel. Die biotinylierte DNA-Matrix komplexiert mit dem komplexierten Streptavidin. Somit wird die Zahl der Biotinmoleküle stark amplifiziert. Bei der Komplexierung des markierten Streptavidins mit den Biotinen an der DNA-Matrix wird die Zahl der detektierbaren Markierungen stark amplifiziert, wodurch die Sensitivität des Assays stark erhöht wird.
  • Verfahren und Bedingungen, die im Stand der Technik für Nukleinsäure Hybridisierungs-Assays entwickelt wurden, können eingesetzt werden, wie sie zum Beispiel beschrieben wurden in: Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2nd Ed., Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Berger and Kimmel, "Methods in Enzymology," Vol. 152, "Guide to Molecular Cloning Techniques", Academic Press, Inc., San Diego, CA., 1987; Young and Davis, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 80:1194 (1983).
  • Puffer, die zur Nukleinsäure-Hybridisierung benutzt werden können umfassen Phosphat- und TRIS-Puffer, zum Beispiel bei einem pH von 6 bis 8. In einer Ausführungsform wird ein Standard Salin-Phosphat-Ethylenediamintetraessigsäure ("SSPE") Puffer benutzt. Ein beispielhafter Phosphatpuffer enthält: 0.06 M H2PO4/HPO4, 1 M Na+, 0.006 M EDTA (Ethylenediamintetraessigsäure), 0.005 Triton, bei einem pH von ca. 6,8, welcher hier als "6XSSPE-T" bezeichnet wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird in einem Nukleinsäure-Hybridisierungs-Assay ein Sulfonat-Hybridisierungspuffer benutzt, zum Beispiel ein Puffer, der 2-[N-Morpholino-]Ethansulfonsäure ("MES") enthält. Zum Beispiel kann der Hybridisierungspuffer ca. 0,01 M bis ca. 2 M MES oder mehr enthalten, zum Beispiel ca. 0,25 M MES, bei einem pH von, zum Beispiel ca. 6 bis 7. In einer Ausführungsform enthält der MES-Puffer: 0,25 M MES, 1 M Na+, und 0,005 Triton® X-100, bei einem pH von ca. 5,5–6,7, zum Beispiel 6.7. Die Hybridisierung kann zum Beispiel bei ca. 25 bis 70°C durchgeführt werden, zum Beispiel bei ca. 45°C. Der Puffer kann gegebenenfalls vor der Benutzung filtriert werden, zum Beispiel durch ein 2 μm Filter.
  • In einer Ausführungsform wird in einem Assay zur Hybridisierung eines Nukleinsäure-Ziels mit einer Nukleinsäure-Sonde, die auf einer festen Oberfläche, wie zum Beispiel einem biologischen Chip, immobilisiert ist, die Hybridisierung bei ca. 45°C für 16 Stufen durchgeführt. Dies wird gefolgt von: manueller Waschschritt mit 1X ST-T (1 M NaCl, 10 mM TRIS-HCl, 0,01 vol/vol Triton X-100, pH 8,0) dreimal; Waschschritt mit einer Genechip® Fluidics Station (Affymetrix, Santa Clara, CA) unter Nutzung von (6X SSPE-T, 22°C, 10 × 2 (10 Zyklen Entleeren, zweimal in jedem Zyklus Entleeren und Füllen)); Waschschritt bei 50°C für 20 Min mit 0.1X ST-T (pH 8,0); Färbeschritt bei 40°C für 15 Min mit Phycoerythrin ("PE") Färbelösung wie sie in den Beispielen beschrieben ist; manueller Waschschritt mit 1X ST-T (pH 8,0) dreimal; Waschschritt mit Fluidics Station "wash A" (6X SSPE-T, 22°C, 10 × 2). Ein Scan wird mit einem automatischen konfokalen Fluoreszenz-Scanner, dem HP GeneArray® 2500 (Affymetrix, Santa Clara, CA), durchgeführt. Anschließend wird eine Dendrimer-Lösung mit ca. 10 μl BSA (Rinderserumalbumin) in ST-T bei 40°C für 20 Min eingesetzt. Dies wird gefolgt von: manueller Waschschritt mit 1X ST-T, dreimal; ein Fluidics Station Waschschritt (6X SSPE-T, 22°C, 10 × 2); Färbung bei 40°C für 15 Min mit 5.0X PE Färbelösung; manueller Waschschritt unter Nutzung von 1X ST-T (pH 8,0) dreimal; und ein Waschschritt in der Fluidics Station (6X SSPE-T, 22°C, 10 × 2).
  • Liganden-Rezeptor-Paare
  • Der Ausdruck Liganden-Rezeptor-Paare bezeichnet einen Liganden und einen Rezeptor, welche chemische Einheiten sind, die einander erkennen und binden können. Der Ligand und der Rezeptor können jedwede Einheit sein, die einander erkennen und binden können, um einen Komplex zu bilden. Zusätzlich können der Ligand und der Rezeptor miteinander über eine dritte Vermittler-Substanz interagieren. Typischerweise sind der Ligand und der Rezeptor, welche das Liganden-Rezeptor-Paar bilden, bindende Moleküle, die eine spezifische nichtkovalente Bindungs-Interaktion miteinander eingehen. Der Ligand und der Rezeptor können natürlich auftreten oder künstlich hergestellt sein, und können gegebenenfalls mit anderen Spezies aggregiert sein.
  • Beispiele für Liganden und/oder Rezeptoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Agonisten und Antagonisten für Zellmembran-Rezeptoren, Toxine und Schlangengifte, virale Epitope, Hormone wie zum Beispiel Steroide, Hormonrezeptoren, Peptide, Enzyme und andere katalytische Polypeptide, Enzymsubstrate, Kofaktoren, Drogen, einschließlich niedermolekularer organischer Drogen, Opiate, Opiatrezeptoren, Lektine, Zucker, Saccharide, einschließlich Polysacchariden, Proteine, und Antikörper, einschließlich monoklonaler Antikörper und synthetischer Antikörper-Fragmenten, Zellen, Zellmembranen und darin enthaltene Einheiten, einschließlich Zellmembran-Rezeptoren, und Organellen. Beispiele für Liganden-Rezeptor-Paare umfassen Antikörper-Antigen; Lektin-Kohlenhydrat; Peptid-Zellmembran-Rezeptoren; Protein A-Antikörper; Hapten-Antihapten; Digoxigenin-Anti-Digoxigenin; Enzym-Kofaktor und Enzym-Substrat.
  • Bevorzugterweise umfasst ein Liganden-Rezeptor-Paar einen Rezeptor, der in der Lage ist, eine Vielzahl von, zum Beispiel 2, 3, 4 oder mehr Molekülen des Liganden zu binden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Liganden-Rezeptor-Paar Biotin-Avidin oder Biotin-Streptavidin. Das Vitamin Biotin wird durch Bindung an das Indikatorprotein Avidin detektiert, welches aus Hühnereiweiß isoliert wird, oder Streptavidin, welches aus dem Bakterium Streptomyces avidinii isoliert wird. Avidin und Streptavidin haben vier hochaffine Bindungsstellen für Biotin mit einer Bindungskonstanten von ca. K = 1015 mol–1. Kessler, Overview of Nonradioactive Labeling Systems in "Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules", C. Kessler, Ed., Springer-Verlag, New York, 1992, Seiten 27–34. Amplifikations-Reagenzien wie sie in den hier beschriebenen Assay-Verfahren eingesetzt werden, können an jedwedes einer Vielzahl von Mitgliedern von Liganden-Rezeptor-Paaren angeheftet werden, die im Stand der Technik bekannt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform wird in einem Nukleinsäure-Hybridisierungs-Assay eine immobilisierte Nukleinsäure-Sonde eingesetzt, welche mit einer Ziel-Nukleinsäure hybridisieren kann, wobei die Ziel-Nukleinsäure an einen Bindungsliganden angeheftet ist, der ein Mitglied eines Liganden-Rezeptor-Paars ist. Zusätzlich enthält das Amplifikations-Reagenz eine Vielzahl von Bindungsliganden. Bevorzugterweise kann der Rezeptor des Liganden-Rezeptor-Paars zwei oder mehr Moleküle des Liganden binden. Der Ligand kann zum Beispiel Biotin sein, und der Rezeptor kann Avidin oder Streptavidin sein, wobei jedes von beiden vier Moleküle Biotin binden kann. Hybridisierung der Ziel-Nukleinsäure mit der Sonden-Nukleinsäurese wird detektiert durch die Detektion der Bindung des Liganden der Ziel-Nukleinsäure an den Rezeptor, und Bindung des Rezeptor an den Bindungsliganden im Amplifikations-Reagenz. Das Amplifikations-Reagenz wird zum Beispiel dadurch detektiert, dass das Amplifikations-Reagenz eine Markierung enthält, oder durch Komplexierung des Amplifikations-Reagenz mit einer Vielzahl von Molekülen des markierten Rezeptors.
  • Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, um Bindungsmoleküle an Nukleinsäuren anzuheften, können benutzt werden um Liganden oder Rezeptoren an Nukleinsäure-Ziels oder Amplifikations-Reagenzien anzuheften. In einer Ausführungsform können Nukleinsäuren, welche kovalent angeheftete Bindungsmoleküle haben, unter Nutzung eines DNA-Synthesizers und Standard Phosphoramiditreagenzien synthetisiert werden. Zum Beispiel können Biotin-Phosphoramidite zur direkten Markierung von synthetischen Oligonukleotiden benutzt werden. Biotin-Phosphoramidite sind von Glen Research Corporation, Sterling, VA, kommerziell erhältlich.
  • In einer Ausführungsform, in der der Bindungsligand Biotin ist, können biotinylierte DNA-Nukleinsäure-Ziele unter Nutzung von Nick-Translation und Verlängerung von randomisierten Primern hergestellt werden, während biotinylierte RNA-Nukleinsäure-Ziele durch in vitro Transkription unter Nutzung einer RNA-Polymerase hergestellt werden können. Biotinylierte Deoxyribonucleosidtriphosphate und Ribonucleosidtriphosphate sind zur enzymatischen Herstellung von biotinylierter DNA und biotinylierter RNA benutzt worden. Beispielhaft und detailliert offengelegt sind Verfahren in Rashtchian and Mackey, Labeling and Detection of Nucleic Acids, in "Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules", C. Kessler, Ed., Springer-Verlag, New York, 1992, Seiten 70–84. Die Konzentration an Biotinmolekülen kann durch Einsatz eines Psoralen-Biotin-Reagenz erhöht werden, wie beschrieben in Levenson et al., Methods Enzymol., 184:577–583 (1990); und Cimono et al., Ann. Rev. Biochem. 54:1151–1193 (1985). Hintergrund-Hybridisierung kann durch HPLC-Reinigung der biotinylierten Nukleinsäure-Ziele verringert werden.
  • Bindungsliganden, wie Biotin, können in dendrimere DNA-Matrizen eingebaut werden, zum Beispiel durch zur Verfügung stellen von einer Nukleinsäure, die eine Sequenz-Komplementarität zu einer spezifischen Sequenz der Dendrimer-Arme an die ein Bindungsligand, wie zum Beispiel Biotin, kovalent angeheftet ist, und anschließende Hybridisierung einer Vielzahl der Nukleinsäuren mit den Armen der DNA-Matrix, um dabei ein DNA-Matrix Amplifikations-Reagenz herzustellen, welches eine Vielzahl von Bindungsliganden enthält.
  • Bindungsliganden, wie zum Beispiel Biotine, können an Amplifikations-Moleküle, wie zum Beispiel Polymere, einschließlich von Poly(Aminosäuren), wie zum Beispiel Antikörper, unter Nutzung von Verfahren die im Stand der Technik bekannt sind, angeheftet werden. Beispielhafte Verfahren sind detailliert offengelegt in Bayer and Wilchek, Labeling and Detection of Proteins and Glycoproteins, in "Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules", C. Kessler, Ed., Springer-Verlag, New York, 1992, Seiten 91–100 und darin genannte Literaturzitate. Zusätzlich sind biotinylierte Antikörper, wie zum Beispiel biotinylierte Anti- Streptavidin-Moleküle, kommerziell verfügbar, zum Beispiel von Vector Laboratories (Burlingame, CA).
  • Markierungen
  • Unterschiedliche Markierungen können in den hier offengelegten Assay-Verfahren eingesetzt werden. Die Markierung kann am Amplifikations-Reagenz, dem Rezeptor und/oder dem Bindungsliganden zur Verfügung gestellt werden. Beispiele für Markierung umfassen fluoreszente Markierungen, chemilumineszente Markierungen und anorganische Markierungen, wie zum Beispiel Gold, sowie enzymatische Markierungen.
  • Markierungen können benutzt werden, die zum Beispiel durch chromogene Detektion, chemilumineszente Detektion und fluoreszente Detektion detektierbar sind. Markierungen, die benutzt werden können umfassen Marker-Enzyme wie zum Beispiel alkalische Phosphatase ("AP"), β-Galaktosidase oder Meerrettich-Peroxidase, welche durch ein chromogenes Substrat detektiert werden. Zum Beispiel, kann AP unter Nutzung von 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphat oder Nitroblau-Tetrazolium Salz detektiert werden.
  • Andere Markierung umfassen fluoreszente Markierungen wie zum Beispiel Fluorescein, Rhodamin, und Resorufin, und Derivative derselben, sowie Coumarine wie zum Beispiel Hydroxycoumarin. Zusätzlich kann Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer gemessen werden, wie beschrieben in Cardullo, Nonradiative Fluorescence Resonance Energy Transfer in "Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules", C. Kessler, Ed., Springer-Verlag, New York, 1992, Seiten 414–423. Gegebenenfalls können anorganische Markierungen benutzt werden, wie zum Beispiel kolloidale Goldpartikel oder Ferritin. Die Nutzung von kolloidalen Goldpartikeln als Markierungen ist zum Beispiel beschrieben in Van de Plas and Leunissen, Colloidal Gold as a Marker in Molecular Biology: The Use of Ultra-Small Gold Particles, in "Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules", C. Kessler, Ed., Springer-Verlag, New York, 1992, Seiten 116–126.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform für einen Assay zur Detektion eines Nukleinsäure-Ziels, unter Nutzung von einer immobilisierten Sonde oder einer Serie von Sonden, ist der Bindungsligand Biotin und der Rezeptor ist Avidin oder Streptavidin, und das Amplifikations-Reagenz ist ein Antikörper oder eine DNA-Matrix. Eine oder mehr Markierungen können mit dem Avidin oder Streptavidin und/oder dem Amplifikations-Reagenz konjugiert sein.
  • Reagenzien zur Markierung von Streptavidin oder Avidin mit einer fluoreszenten Markierung sind kommerziell erhältlich. Zum Beispiel die Reagenzien 5(6)-Carboxyfluorescein-N-Hydroxysuccinimid-Ester (FLUOS), 7-Amino-4-Methyl-Coumarin-3-Essigsäure-N'-Hydroxysuccinimid-Ester (AMCA, aktiviert) und Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) sind von Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, erhältlich. Verfahren zur Fluoreszenz-Markierung von Proteinen mit fluoreszenten Markierungen und Verfahren zur Detektion der fluoreszenten Markierungen sind beschrieben in Howard, G., Labeling Proteins with Fluorochromes, in "Methods in Nonradioactive Detection,", G. Howard, Ed., Appleton and Lange, Norwalk, Connecticut, 1993, Seiten 39–68. Zusätzlich gibt es mehrere kommerziell erhältliche markierte Streptavidin- und Avidin-Moleküle. Beispiele umfassen Streptavidin-Gold, Streptavidin-Fluorochrom, Streptavidin-AMCA, Streptavidin-Fluorescein, Streptavidin-Phycoerythrin (STPE), Streptavidin-Sulforhodamin 101, Avidin-FITC und Avidin-Texasrot®, welche von Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, kommerziell erhältlich sind.
  • Assays
  • Die Verfahren und Materialien die hier offengelegt wurden können in verschiedenen Anwendungen zum Assay der Hybridisierung eines Nukleinsäure-Ziels, welches eine Ziel- Sequenz enthält, und einer Nukleinsäure-Sonde, welche eine Sonden-Sequenz enthält, verwendet werden. In einer Ausführungsform können eine oder mehrere Nukleinsäure-Ziele, welche unterschiedliche Ziel-Sequenzen enthalten, auf Hybridisierung mit einem hochdichten Array von Nukleinsäure-Sonden, die unterschiedliche Sequenzen enthalten, geprüft werden.
  • Der Ausdruck "Hybridisierung" bezeichnet die Bindungsassoziation zwischen zwei Nukleinsäuren, zum Beispiel die nichtkovalente Interaktion über Basenpaar-Wasserstoffbrückenbindung und über Basen-Stacking. Die Fähigkeit von zwei einzelsträngigen Nukleinsäuren miteinander hybridisieren zu können, wird von Faktoren abhängen wie ihr Grad an Komplementarität sowie der Stringenz der Reaktionsbedingungen in der Hybridisierung.
  • Der Ausdruck "Stringenz" bezeichnet die Bedingungen einer Hybridisierungsreaktion, die den Grad beeinflussen mit dem Nukleinsäuren hybridisieren. Stringente Bedingungen können gewählt werden, die es erlauben, dass Nukleinsäure-Duplexe basierend auf ihrem Grad der Nichtübereinstimmung ("mismatch") unterschieden werden können. Hohe Stringenz ist mit einer niedrigeren Wahrscheinlichkeit zur Bildung eines Duplexes verbunden, der nichtübereinstimmende ("mismatched") Basen enthält. Somit gilt, je höher die Stringenz, um so größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass zwei einzelsträngige Nukleinsäuren, die einen nichtübereinstimmenden ("mismatched") Duplex bilden können, einzelsträngig bleiben werden. Umgekehrt, bei niedriger Stringenz ist die Wahrscheinlichkeit zur Bildung eines nichtübereinstimmenden ("mismatched") Duplex erhöht. Die passende Stringenz, die eine Selektion eines perfekt übereinstimmenden Duplexes erlauben wird, verglichen mit einem Duplex der eine oder mehrere Nichtübereinstimmungen enthält (oder, die eine Selektion von einem bestimmten, nichtübereinstimmenden Duplex erlauben wird, verglichen mit einem Duplex mit einem höheren Grad an Nichtübereinstimmung) wird im allgemeinen empirisch ermittelt. Mittel um die Stringenz einer Hybridisierungsreaktion anzupassen sind dem Fachmann wohlbekannt. Vergleiche, zum Beispiel, Sambrook, et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Ausubel, et al., "Current Protocols In Molecular Biology," John Wiley & Sons, 1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995, 1996 und periodische Aktualisierungen; und Hames et al., "Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach," IRL Press, Ltd., 1985. Im allgemeinen umfassen Bedingungen welche die Stringenz erhöhen (das heißt, welche für die Bildung von besser übereinstimmenden Duplexe selektieren) höhere Temperatur, niedrigere Ionenstärke und die Anwesenheit oder Abwesenheit von Lösungsmitteln; niedrigere Stringenz wird begünstigt durch niedrigere Temperatur, höhere Ionenstärke und niedrigere oder höhere Konzentrationen an Lösungsmitteln (zum Beispiel, niedrigere Konzentrationen an Formamid oder Dimethylsulfoxid). Die Dauer der Hybridisierungsreaktion und die Konzentration der Reaktanden (das heißt, einzelsträngige Nukleinsäuren) können ebenfalls die Stringenz beeinflussen, wobei kurze Reaktionszeiten und niedrige Reaktandenkonzentration eine höhere Stringenz begünstigen.
  • Verfahren zur Durchführung von Nukleinsäure-Hybridisierungs-Assays sind im Stand der Technik gut entwickelt. Hybridisierungs-Assay-Verfahren und Konditionen werden abhängig von der Anwendung variieren, und sie werden in Übereinstimmung mit den allgemeinen, bekannten Bindungsverfahren ausgewählt, einschließlich derer die im folgenden zitiert werden: Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2nd Ed., Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Berger und Kimmel, "Methods in Enzymology," Vol. 152, "Guide to Molecular Cloning Techniques", Academic Press, Inc., San Diego, CA., 1987; Young und Davis, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 80:1194 (1983).
  • Puffer, die zur Nukleinsäure-Hybridisierung benutzt werden können, umfassen Phosphat- und TRIS-Puffer, zum Beispiel bei einem pH von ca. 6 bis 8. In einer Ausführungsform wird ein Standard Salin-Phosphat-Ethylenediamintetraessigsäure ("SSPE") Puffer benutzt. Ein beispielhafter Phosphatpuffer enthält: 0.06 M H2PO4/HPO4, 1 M Na+, 0.006 M EDTA (Ethylenediamintetraessigsäure), 0.005 Triton®, bei einem pH von ca. 6,8, welcher hier als "6XSSPE-T" bezeichnet wird.
  • In einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt um Nukleinsäure-Hybridisierungs-Assays durchzuführen, wobei die Hybridisierungslösung einen Sulfonatpuffer enthält. Sulfonat-Hybridisierungspuffer umfassen 2-[N-Morpholino-]Ethansulfonsäure ("MES") und 3-[N-Morpholino-]Propansulfonsäure ("MOPS"). In einer Ausführungsform kann der Hybridisierungs-Assay unter Nutzung eines Sulfonatpuffers mit Nukleinsäure-Sonden durchgeführt werden, welche auf einer festen Oberfläche immobilisiert sind, wie zum Beispiel eine Silizium- oder Glasoberfläche. Die feste Oberfläche kann, zum Beispiel, vor der Immobilisierung der Nukleinsäure-Sonden mit einer Silanbeschichtung überzogen werden. Der Hybridisierungs-Assay in einer Lösung, die einen Sulfonatpuffer enthält, kann zum Beispiel, bei einer Temperatur von ca. 25 bis 70°C, zum Beispiel, bei mindestens ca. 35°C, oder 45°C, oder mehr, durchgeführt werden, und über einen Zeitraum von, zum Beispiel, ca. 10 Minuten bis zu 5 Stunden oder mehr, zum Beispiel für 16 Stunden oder mehr. Der Sulfonatpuffer kann zum Beispiel in Genexpressions-Hybridisierungs-Assays und in Polymorphismus-Hybridisierungs-Assays eingesetzt werden.
  • Zum Beispiel kann der Hybridisierungspuffer ca. 0,01 M bis ca. 2 M MES oder mehr enthalten, zum Beispiel ca. 0, 25 M MES, bei einem pH von, zum Beispiel ca. 6 bis 7. In einer Ausführungsform enthält der MES-Puffer: 0,25 M MES, 1 M Na+, und 0,005 Triton® X-100, bei einem pH von ca. 5,5–6,7, zum Beispiel 6,7. Die Hybridisierung kann zum Beispiel bei ca. 25 bis 70°C durchgeführt werden, zum Beispiel bei ca. 45°C. Gegebenenfalls kann der Puffer vor der Benutzung filtriert werden, zum Beispiel durch ein 2 μm Filter. Die Nukleinsäure- Hybridisierungspuffer können darüber hinaus oberflächenaktive Substanzen enthalten, wie zum Beispiel Tween-20 and Triton-X100, sowie Additive wie zum Beispiel Antischäumungsmittel.
  • Verfahren zum Screening unter Nutzung von Arrays von Polymeren, wie zum Beispiel Nukleinsäuren, immobilisiert auf einem festen Substrat, werden zum Beispiel in U.S. Patent Nr. 5,510,270 offengelegt. Bei diesem Verfahren wird ein Array von unterschiedlichen Nukleinsäuren auf einem Substrat gebildet. Die Herstellung von Arrays von Polymeren, wie zum Beispiel Nukleinsäuren, auf einem festen Substrat, und Verfahren zur Nutzung der Arrays in unterschiedlichen Assays werden beschrieben in: U.S. Patent Nr. 5,677,195, 5,624,711, 5,599,695, 5,451,683, 5,424,186, 5,412,087, 5,384,261, 5,252,743 und 5,143,854; PCT WO 92/10092; PCT WO 93/09668; PCT WO 97/10365. Zugang zu genetischer Information, unter Nutzung von hochdichten DNA-Arrays, ist weiterhin beschrieben in Chee, Science 274: 610–614 (1996). Die Kombination von Photolithographie und Herstellungstechniken erlaubt es, dass jede Sondensequenz nur eine sehr kleine Stelle auf dem Träger einnimmt. Die Stelle kann so klein sein wie wenige Mikrometer, oder sogar wie ein kleines Molekül. Solche Sonden-Arrays können vom Typ sein, der als "Synthese immobilisierter Polymere im sehr großen Maßstab" (Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis, VLSIPS®), U.S. Patent Nr. 5,631,734 bekannt ist.
  • Substrate, die eine Oberfläche haben an die Arrays von Polynukleotiden angeheftet sind, werden hier als „biologische Chips" bezeichnet. Die Substrate können zum Beispiel Silizium oder Glas sein, und sie können die Dicke eines mikroskopischen Objektträgers oder eines Glasdeckgläschens haben. Substrate, die lichtdurchlässig sind, sind nützlich wenn der Assay optische Detektion umfasst, wie zum Beispiel in U.S. Patent Nr. 5,545,531 beschrieben. Andere Substrate umfassen Langmuir-Blodgett-Film, Germanium, (Poly)Tetrafluorethylen, Polystyrol, Galliumarsenid, Galliumphosphid, Siliziumoxid, Siliziumnitrid und Kombinationen derselben.
  • In der Ausführungsform wobei Arrays von Nukleinsäuren auf einer Oberfläche immobilisiert sind, kann die Zahl der Nukleinsäuresequenzen für unterschiedliche Anwendungen ausgewählt werden, und kann, zum Beispiel, ca. 100 oder mehr, oder, zum Beispiel, in einigen Ausführungsformen mehr als 105 oder 108 sein. In einer Ausführungsform umfasst die Oberfläche mindestens 100 Nukleinsäure-Sonden, wobei bevorzugterweise jede eine andere Sequenz hat, und jede Sonde eine Fläche von weniger als ca. 0,1 cm2 einnimmt, oder, zum Beispiel, zwischen ca. 1 μm2 und 10.000 μm2, und jede Nukleinsäure-Sonde hat eine definierte Sequenz und Lokalisation auf der Oberfläche. In einer Ausführungsform werden mindestens 1.000 unterschiedliche Nukleinsäuren auf der Oberfläche zur Verfügung gestellt, wobei jede Nukleinsäure eine Fläche von weniger als ca. 10–3 cm2 einnimmt, wie zum Beispiel in U.S. Patent Nr. 5,510,270 beschrieben.
  • Arrays von Nukleinsäuren zum Einsatz im Genexpressions-Monitoring sind in PCT WO 97/10365 beschrieben. In einer Ausführungsform werden Arrays von Nukleinsäuren auf einer Oberfläche immobilisiert, wobei der Array mehr als 100 unterschiedliche Nukleinsäuren umfasst und wobei jede unterschiedliche Nukleinsäure in einer vorherbestimmten Fläche der Oberfläche lokalisiert ist, und wobei die Dichte der unterschiedlichen Oligonukleotide höher ist als ca. 60 unterschiedliche Oligonukleotide pro 1 cm2.
  • Arrays von Nukleinsäuren, die auf einer Oberfläche immobilisiert sind, welche ebenfalls benutzt werden können sind detailliert in U.S. Patent Nr. 5,744,305 beschrieben. Wie dort offengelegt, werden auf einem Substrat Nukleinsäuren mit unterschiedlichen Sequenzen immobilisiert, wobei jede in eine vorherbestimmte Fläche auf der Oberfläche immobilisiert wird. Zum Beispiel können 10, 50, 60, 100, 103, 104, 105, 10+, 107, oder 108 unterschiedliche Monomer-Sequenzen auf dem Substrat zur Verfügung gestellt werden. Die Nukleinsäuren mit einer bestimmten Sequenz werden in einer vordefinierten Region des Substrats zur Verfügung gestellt, welche eine Oberflächenregion von, zum Beispiel, ca. 1 cm2 bis 10–10 cm2 hat. In einigen Ausführungsformen haben die Regionen Flächen von weniger als ca. 10–1, 10–2, 10–3, 10–4, 10–5, 10–6, 10–7, 10–8, 10–9, oder 10–10 cm2. Zum Beispiel wird in einer Ausführungsform ein planarer, nicht-poröser Träger zur Verfügung gestellt, der mindestens eine erste Oberfläche hat, und an der ersten Oberfläche eine Vielzahl von unterschiedlichen Nukleinsäuren angeheftet hat, in einer Dichte, die über ca. 400 unterschiedliche Nukleinsäuren/cm2 hinausgeht, wobei jede der unterschiedlichen Nukleinsäuren an der Oberfläche des festen Trägers in einer unterschiedlichen, vordefinierten Region angeheftet ist, und hat eine unterschiedliche, bestimmbare Sequenz, und ist, zum Beispiel, mindestens 4 Nukleotide lang. Die Nukleinsäuren können, zum Beispiel, ca. 4 bis 20 Nukleotide lang sein. Die Zahl der unterschiedlichen Nukleinsäuren kann, zum Beispiel, 1.000 oder mehr sein.
  • In einer Ausführungsform können verschmolzene Silizium-Substrate eingesetzt werden, die einen niedrigen Glas-Fluoreszenz-Hintergrund haben. Silizium-Substrate erlauben eine niedrige Expositions-Druckpause mit wenig oder keinem Signal-Abfall beim Übergang von 50 μm zu 20 μm Features, und sie ergeben verbesserte Leistung, einschließlich 50 μm, zum Beispiel, 2 μm. Eine Beschreibung der Festphasenchemie, Photolithographie, und Verfahren zur Datenerfassung, für die Synthese und Benutzung von Arrays von Materialien, die an ein festen Substrat angeheftet sind, wird in U.S. Patent Nr. 5,744,305 zur Verfügung gestellt.
  • In der Ausführungsform wo Polynukleotide mit einer bekannten chemischen Sequenz an bekannten Lokalisationen auf einem Substrat synthetisiert werden, und Hybridisierung einer Nukleinsäure detektiert wird, und wobei eine fluoreszente Markierung detektiert wird, kann die Detektion durch Einstrahlung von Licht auf relativ kleine und präzise bekannte Lokalisationen auf dem Substrat ausgeführt werden. Zum Beispiel wird das Substrat in ein mikroskopisches Detektionsgerät platziert, um die Lokalisationen zu identifizieren, wo Bindung stattfindet. Das mikroskopische Detektionsgerät umfasst eine monochromatische oder polychromatische Lichtquelle um Licht auf das Substrat einzustrahlen, Mittel zur Detektion des Fluoreszenzlichts vom Substrat, und Mittel zur Bestimmung einer Lokalisation des Fluoreszenzlichts. Das Mittel zur Detektion des Fluoreszenzlichts auf dem Substrat kann in einigen Ausführungsformen einen Photonenzähler umfassen. Das Mittel zur Bestimmung einer Lokalisation des Fluoreszenzlichts kann einen x/y Translationstisch für das Substrat umfassen. Die Translation des Substrats und Datenerfassung werden durch einen entsprechend programmierten digitalen Computer erfasst und verarbeitet, wie in U.S. Patent Nr. 5,510,270 beschrieben, dessen Offenbarungsgehalt hierin eingeschlossen wird.
  • Geräte zur simultanen Prozessierung von mehreren biologischen Chip-Assays können benutzt werden, wie in U.S. Patent Nr. 5,545,531 beschrieben. Verfahren und Systeme zur Detektion eines markierten Markers an einer Probe auf einem festen Träger, wobei das markierte Material Strahlung bei einer Wellenlänge emittiert, die sich von der Anregungswellenlänge unterscheidet, dessen Strahlung durch Sammeloptik gesammelt wird und bildhaft auf einen Detektor übertragen wird, der ein Abbild der Probe generiert, sind in U.S. Patent Nr. 5,578,832 offengelegt. Diese Verfahren erlauben es, eine Abbildung mit hoher Sensitivität und Auflösung mit hoher Geschwindigkeit zu erhalten. Verfahren und Apparate zur Detektion von fluoreszierend markierten Materialien sind weiterhin in U.S. Patenten Nr. 5,631,734 und 5,324,633 beschrieben.
  • Anwendungen
  • Die hier beschriebenen Assay-Verfahren und Zusammensetzungen können in einem Bereich von Anwendungen benutzt werden, einschließlich biomedizinischer und genetischer Forschung und klinischer Diagnostik. Arrays von Polymeren wie zum Beispiel Nukleinsäuren können auf spezifische Bindung an ein Nukleinsäure-Ziel, wie zum Beispiel eine komplementäre Nukleinsäure untersucht werden, zum Beispiel in Untersuchungen zur Bestimmung der Bindungsaffinität und in diagnostischen Assays. In einer Ausführungsform kann die Sequenzierung von Polynukleotiden durchgeführt werden, wie in U.S. Patent Nr. 5,547,839 offengelegt. Der Nukleinsäure-Array kann in vielen anderen Anwendungen eingesetzt werden, einschließlich der Detektion von genetischen Erkrankungen wie zum Beispiel zystische Fibrose, Diabetes, und erworbene Erkrankungen wie zum Beispiel Krebs, wie in U.S. Patent-Anmeldung Ser. Nr. 08/143,312 offengelegt. Genetische Mutationen können durch Sequenzierung oder durch Hybridisierung detektiert werden. In einer Ausführungsform können genetische Marker sequenziert und kartiert werden, unter Nutzung von Typ-IIs Restriktions-Endonukleasen wie in U.S. Patent Nr. 5,710,000 offengelegt.
  • Andere Anwendungen umfassen Chip-basierte Genotypisierung, Spezies-Identifikation und phänotypische Charakterisierung. Monitoring der Genexpression ist durch parallele Hybridisierung von großen Zahlen von mRNAs möglich, wobei hochdichte Arrays der zellulären Nukleinsäuren benutzt werden, wie zum Beispiel in Mikroorganismen wie Hefe, wie in Lockhart et al., Nature Biotechnology, 14:1675–1680 (1996) beschrieben. Abbildung von bakteriellen Transkripten durch Hybridisierung von Gesamt-RNA mit Nukleinsäuren-Arrays kann wie in Saizieu et al., Nature Biotechnology, 16:45–48 (1998) beschrieben, durchgeführt werden.
  • In der Ausführungsform wobei Festphasenchemie, photolabile Schutzgruppen und Photolithographie benutzt werden, um lichtgesteuerte, gerichtete, räumlich adressierbare, parallele chemische Synthese einer großen Serie von Polynukleotiden auf dem Substrat zu realisieren, wie in U.S. Patent Nr. 5,527,681 beschrieben, können Computer-Werkzeuge benutzt werden um die Arrays zu formen. Zum Beispiel kann ein Computer-System benutzt werden, um Nukleinsäure- oder andere Polymer-Sonden auf dem Substrat auszuwählen, und zum Design des Aufbaus der Arrays zu benutzen, wie in U.S. Patent Nr. 5,571,639 beschrieben.
  • In einer anderen Ausführungsform werden Kits zur Verfügung gestellt, um Hybridisierungs-Assays mit amplifizierten Nukleinsäuren durchzuführen, die in verpackter Kombination die Materialien enthalten: immobilisierte Nukleinsäure-Sonden, Amplifikations-Reagenzien, und markierte Rezeptoren. Diese Reagenzien werden, zum Beispiel, in getrennten Behältern im Kit vorhanden sein. Der Kit kann ferner Hybridisierungs-Puffer, Waschlösungen, negative und positive Kontrollen und geschriebene Instruktionen zur Durchführung des Assays enthalten.
  • Durch die nachfolgenden, nicht einschränkenden Beispiele wird die Erfindung besser verstanden werden.
  • BEISPIELE
  • BEISPIEL 1:
  • Ein Nukleinsäure-Hybridisierungs-Assay wurde durchgeführt, wobei ein Verfahren mit Streptavidin-Phycoerythrin ("SAPE") und biotinylierter Anti-Streptavidin-Antikörper-AmplifikationsDetektion eingesetzt wurde.
  • Die folgenden Materialien wurden benutzt. Lösungen wurden in zur Molekularbiologie geeignetem Wasser (BioWhittaker, Walkersville, MD) angesetzt.
  • 12X MES Vorratspuffer
    • 0,33 M MES, freie Säure (Sigma, St. Louis, MO)
    • 0,89 M Na-MES Salz (Sigma)
    • Filtriert durch 0,2 μm Filter.
    • pH 6,5 bis 6,8
  • 2X MES Hybridisierungspuffer ("Hyb")
    • 2X MES Vorratspuffer
    • 1,77 M NaCl (BioWhittaker, Walkersville, MD)
    • 0,04 M EDTA (Sigma, St. Louis, MO)
    • 0,02 % Tween 20 (vol/vol) (Pierce, Rockford, IL)
    • Filtriert durch 0,2 μm Filter.
    • pH 6,5 to 6,8
  • 0,1X MES Stringenz-Puffer
    • 1X MES Vorratspuffer
    • 0,03 M NaCl (BioWhittaker, Walkersville, MD)
    • 0,01 % (vol/vol) Tween 20 (Pierce, Rockford, IL)
    • Filtriert durch 0,2 μm Filter.
    • pH 6,5 to 6,8
  • 6X SSPE-Tween-Puffer
    • 6X SSPE (0,06M H2PO4/HPO4, 1 M Na+, 0, 006 M EDTA) (BioWhittaker, Walkersville, MD)
    • 0,01 % (vol/vol) Tween 20 (Pierce, Rockford, IL)
    • 0,005 % (vol/vol) Anti-Foam 0-30 (Sigma, St. Louis, MO)
    • Filtriert durch 0,2 μm Filter, Zugabe von Anti-Foam nach Filtration.
    • pH ca. 7,6
  • 2X Färbepuffer
    • 2X MES Vorratspuffer
    • 1,85 M NaCl (BioWhittaker, Walkersville, MD)
    • 0,10 % (vol/vol) Tween 20 (Pierce, Rockford, IL)
    • 0,010 % (vol/vol) Anti-Foam 0-30 (Sigma, St. Louis, MO)
    • Filtriert durch 0,2 μm Filter, Zugabe von Anti-Foam nach Filtration.
  • SAPE-Färbelösung
    • 1X Färbepuffer
    • 2,0 mg/ml BSA (acetyliert) (GibcoBRL, Gaithersburg, MD)
    • 10,0 μg/ml SAPE (Molecular Probes, Eugene, OR)
    • Färbevolumen = 500,0 ml
  • Biotinylierte Anti-Streptavidin-Färbelösung
    • 1X Färbepuffer
    • 2,0 mg/ml BSA (acetyliert) (GibcoBRL, Gaithersburg, MD)
    • 0,1 mg/ml normales Ziegen-IgG (Sigma, St. Louis, MO)
    • 3,0 μg/ml biotinylierter polyklonaler Ziegen-Anti-Streptavidin-Antikörper (Vector Laboratories, Burlingame, CA)
    • Färbevolumen = 500,0 ml
  • Chip-Vorbehandlungslösung
    • 1X MES Vorratspuffer
    • 0,89 M NaCl (BioWhittaker, Walkersville, MD)
    • 0,02 M EDTA (Sigma St. Louis, MO)
    • 0,01 % (vol/vol) Tween 20 (Pierce, Rockford, IL)
  • 5x Fragmentierungs-Puffer
    • 200 mM TRIS-Acetat pH 8,1
    • 500 mM Kaliumacetat
    • 150 mM Magnesiumacetat
  • Proben-Herstellung (200 μl)
    • 1X MES Hybridisierungspuffer
    • 0,5 mg/ml BSA (acetyliert) (GibcoBRL, Gaithersburg, MD)
    • 0,1 mg/ml DNA aus Heringssperma (Promega Madison, WI)
    • 50 pM biotinyliertes Kontroll-Oligomer
    • 10 μg fragmentierte cRNA-Probe
    • Spike-Kontrollen (ACTT, Rockville, MD) – in vitro Transkripte (IVTs) der folgenden Plasmide: pglks-BioB; pglks-BioC; pglks-BioD; pglks-Cre; pglbs-lys; pglbs-phe; pglbs-thr; pglbs-trp; pglbs-dap, die durch Erhitzen in Fragmentierungspuffer bei 95°C für 35 Minuten fragmentiert sind
  • Assay-Protokoll
  • Eine fragmentierte cRNA-Probe wurde wie folgt hergestellt. PCR-Amplifikation einer Plasmid-Bibliothek wurde durchgeführt, gefolgt von in vitro Transkription in Anwesenheit von biotinyliertem UTP und CTP um biotinylierte cRNA zu bilden, die dann in 1x Fragmentierungspuffer durch Erhitzen bei 95°C für 35 Minuten fragmentiert wurde. Vergleiche die allgemeinen Verfahren, beschrieben in Sambrook, et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Ausubel, et al., "Current Protocols In Molecular Biology," John Wiley & Sons, 1996; und Lockhart, D.J., et al., Nature Biotechnology, 14: 1675–1680 (1996).
  • 200 μL der Chip-Vorbehandlungslösung wurde auf einen biologischen Chip aufgebracht, worauf ein Array von Nukleinsäure-Sonden mit bekannten Sequenzen immobilisiert war. Der Chip wurde in den Rotator des GeneChip Hybridisierungsofen 320 (Affymetrix, Santa Clara, CA) eingesetzt und bei 45°C, 60 UpM für 10 Minuten rotiert.
  • Die Probe wurde für 5 Minuten auf 99°C erhitzt und dann für 5 Minuten in einem 45°C Wasserbad oder Heizblock inkubiert. Die Chip-Vorbehandlungslösung wurde aus der Patrone entfernt und 200 μL der Probe bei 45°C wurde zugegeben. Der Chip wurde in den Rotator des GeneChip Hybridisierungsofen 320 (Affymetrix, Santa Clara, CA) eingesetzt und bei 45°C, 60 UpM für 16 Stunden hybridisiert.
  • Die Probe wurde aus dem Chip entfernt und mit 200 μl 6X SSPE-Tween-Puffer ersetzt. Der Chip wurde einem automatisierten Wasch-/Färbe-Protokoll in der GeneChip Fluidics Station 400 (Affymetrix, Santa Clara, CA) unterzogen, wobei das "EukGE-WS2 Fluidics Script" wie folgt benutzt wurde.
  • Der Chip wurde in der Fluidics Station bei 25°C, mit 6X SSPE-Tween-Puffer für 10 Zyklen mit 2X Mixen pro Zyklus gewaschen. Dies wurde gefolgt von einem weiteren Waschschritt in 0,1X MES Stringenz-Puffer bei 50°C für 4 Zyklen mit 15X Mixen pro Zyklus.
  • Der Chip wurde dann für 10 Minuten bei 25°C in der Fluidics Station mit der oben beschriebenen SAPE-Färbelösung gefärbt. Die Färbung wurde gefolgt von einem Waschschritt mit 6X SSPE-Tween-Puffer bei 25°C für 10 Zyklen mit 4X Mixen pro Zyklus. Ein erster Scan wurde mit dem HP G2500A GeneArray Scanner (Affymetrix, Santa Clara, CA), durchgeführt. Der 2X Multi-Image Scan wurde bei 570 nm durchgeführt, wobei eine 3 μm Pixelgröße benutzt wurde. Der dynamische Bereich der detektierten Fluoreszenz-Intensität war 500–5000 Zähleinheiten (willkürliche Einheiten). Die Ergebnisse werden in 2a gezeigt, wo der Hintergrund 707 Zähleinheiten war, und die Standardabweichung war 12,6 Zähleinheiten.
  • Der Chip wurde wieder in die Fluidics Station eingeführt und wurde für 10 Minuten bei 25°C mit der biotinylierten Anti-Streptavidin-Färbelösung gefärbt, gefolgt von einem Reinigungsschritt (zweimal) mit 6X SSPE-Tween-Puffer und einem dritten Färbeschritt bei 25°C mit der SAPE-Färbelösung.
  • Der letzte Waschschritt war mit 6X SSPE-Tween-Puffer bei 30°C für 15 Zyklen mit 4x Mixen pro Zyklus.
  • Ein zweiter Scan wurde, wie oben beschrieben, mit dem HP G2500A GeneArray Scanner (Affymetrix, Santa Clara, CA) durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 2b gezeigt, wo der Hintergrund 739,2 Zähleinheiten war und die Standardabweichung des Hintergrundsignals 14,2 Zähleinheiten war. Die Ergebnisse zeigten, dass die Nutzung der Antikörper-Amplifikation das detektierbare Signal im Vergleich zu den Ergebnissen ohne Amplifikation beträchtlich verstärkte.
  • BEISPIEL 2
  • Ein Nukleinsäure-Hybridisierungs-Assay wurde durchgeführt, wobei Streptavidin-Phycoerythrin und biotinylierte Anti-Streptavidin-Antikörper-Amplifikation eingesetzt wurde.
  • Die folgenden Materialien wurden benutzt. Puffer wurden in zur Molekularbiologie geeignetem Wasser (BioWhittaker, Walkersville, MD) angesetzt.
  • 6x SSPE-T-Puffer (pH 7,6)
    • 0,9 M NaCl (BioWhittaker)
    • 0,06 M NaH2PO4 (BioWhittaker)
    • 6 mM EDTA (BioWhittaker)
    • 0,01 (vol/vol) Triton x-100 (Sigma, St. Louis, MO)
  • 1X MES-Puffer (pH 6,7)
    • 0,1 M MES (MES-Hydrat und MES-Natriumsalz (Sigma, St. Louis, MO)) (hergestellt aus einer Vorratslösung von 12X MES, hergestellt durch Kombination von 6,97 g MES-Hydrat and 19,39 g MES-Natriumsalz pro 100 ml Wasser)
    • 1,0 M NaCl (Ambion, Austin, TX)
    • 0,01 (vol/vol) Triton (Sigma)
  • 0,1X MES-Puffer (pH 6,7)
    • 0,1 M MES (MES-Hydrat und MES-Natriumsalz (Sigma)
    • 0,1 M NaCl (Ambion, Austin, TX)
    • 0,01 (vol/vol) Triton (Sigma)
  • 5X SAPE-Färbelösung
    • 2 μl von 1 mg/ml Streptavidin R-Phycoerythrin (Molecular Probes, Eugene, OR)
    • 10 μl von 50 mg/ml acetyliertes BSA (Rinderserumalbumin) (GibcoBRL Gaithersburg, MD)
    • 188 μl von 1x MES-Puffer
  • Biotinylierte Anti-SA-Färbelösung
  • 0,1 mg/ml normales Ziegen-IgG (Sigma, St. Louis, MO)
  • 1 μg/ml biotinylierter polyklonaler Ziegen-Anti-Streptavidin („Anti-SA") Antikörper (Vector Laboratories)
  • 0,5 mg/ml Acetyliertes BSA (GibcoBRL)
    in 1X MES-Puffer
  • Chip-Vorbehandlungslösung
    • 0,5 mg/ml Acetyliertes BSA (GibcoBRL)
    • 0,5 mg/ml HS-(Heringssperma)-DNA (Promega, Madison, WI) in 1X MES-Puffer
  • Probe (200 μl)
    • 10 μg fragmentierte, markierte (biotinylierte) cRNA-Probe
    • 0,1 mg/ml HS-(Heringssperma)-DNA (2 μl einer 10 mg/ml HS-DNA Vorratslösung, Promega)
    • 0,5 mg/ml Acetyliertes BSA (2 μl einer 50 mg/ml BSA Vorratslösung) (GibcoBRL)
    • Spike-Kontrollen (ACTT, Rockville, MD) – (in vitro Transkripte (IVTs) der folgenden Plasmide: pglks-BioB; pglks-BioC; pglks-BioD; pglks-Cre; pglbs-lys; pglbs-phe; pglbs-thr; pglbs-trp; pglbs-dap, die durch Erhitzen in Fragmentierungspuffer, wie in Beispiel 1 beschrieben, fragmentiert sind, bei 95°C für 35 Minuten)
    • 1X MES-Puffer
  • Assay-Protokoll
  • Eine fragmentierte cRNA-Probe von einer Mäuse-B-Zellen-Bibliothek wurde durch PCR-Amplifikation einer Plasmid-Bibliothek (Clonetech) hergestellt, gefolgt von in vitro Transkription in Anwesenheit von biotinyliertem UTP und CTP um biotinylierte cRNA zu bilden, die dann in 1x Fragmentierungspuffer, wie in Beispiel 1 beschrieben, durch Erhitzen bei 95°C für 35 Minuten fragmentiert wurde. Eine fragmentierte cRNA Probe wurde auch von humaner Hirnzellen-mRNA (Clonetech) erhalten. Vergleiche die allgemeinen Verfahren, beschrieben in Sambrook, et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Ausubel, et al., "Current Protocols In Molecular Biology," John Wiley & Sons, 1996; und Lockhart, D.J., et al., Nature Biotechnology, 14: 1675–1680 (1996).
  • Hybridisierung der Mäuse-B-Zellen cRNA mit einem biologischen Chip, auf dem Nukleinsäuren mit Mäuse-B-Zell-Gensequenzen immobilisiert waren, und Hybridisierung der humanen Hirnzellen-cRNA mit einem biologischen Chip, auf dem Nukleinsäuren mit humanen Hirnzell-Gensequenzen immobilisiert waren, wurden in Anwesenheit von variablen Mengen zugefügter Spike-Kontrollen durchgeführt, und Fluoreszenz-Signale wurden vor und nach der Antikörper-Amplifikation des detektierbaren Signals gemessen. Die biologischen Chips hatten Feature-Größen von 24 Mikron.
  • In jedem Hybridisierungs-Assay wurde 200 μl der Chip-Vorbehandlungslösung dem Chip zugefügt. Der Chip wurde in einen Rotator (Rotamix, Appropriate Technical Resources, Laurel, MD) platziert, bei 40°C, bei 60 UpM für 15 Minuten. Der Chip wurde mit 1X MES-Puffer gewaschen.
  • Die Probe wurde für 5 Minuten auf 99°C erhitzt und dann in einem 45°C Wasserbad für weniger als etwa 10 Minuten inkubiert, bevor sie auf den Chip gegeben wurde. 200 μL der Probe bei 45°C wurde zum Chip zugegeben. Hybridisierung auf dem Rotator wurde bei 45°C, 60 UpM, für 16 oder 40 Stunden durchgeführt.
  • Der Chip wurde in der Fluidics Station (GeneChip Fluidics Station 400, Affymetrix, Santa Clara, CA) mit 6X SSPE-T bei 22°C, 10 × 2 (10 Zyklen, zweimal Entleeren und Füllen in jedem Zyklus). Der Chip wurde mit 0,1X MES-Puffer gewaschen. 200 μl 0,1X MES-Puffer wurden dann zugefügt, um den Chip bei 45°C, 60 UpM, für 30 Minuten auf dem Rotator zu waschen. Der Chip wurde mit 1X MES-Puffer gewaschen.
  • Der Chip wurde mit 5X SAPE-Färbelösung bei 40°C, 60 UpM für 15 Minuten gefärbt. Dies wurde gefolgt von einem Waschschritt mit 6X SSPE-T in der Fluidics Station bei 22°C, 10 × 2.
  • Ein erster Scan wurde mit dem HP G2500A GeneArray Scanner (Affymetrix, Santa Clara, CA) durchgeführt. Der 2X Multi-Image Scan wurde bei 570 nm durchgeführt, wobei eine 3 μm Pixelgröße benutzt wurde.
  • Die 6X SSPE-T Lösung wurde aus dem Chip entfernt und 200 μl 1X MES-Puffer wurde benutzt, um den Chip zu waschen. Der Chip wurde mit 200 μl Anti-SA (Anti-Streptavidin) Färbelösung bei 40°C, 60 UpM, für 30 Minuten gefärbt. 200 μl 1X MES-Puffer wurden benutzt, um den Chip manuell zu waschen. Dies wurde gefolgt von einem Waschschritt mit 6X SSPE-T in der Fluidics Station bei 22°C, 10 × 2. Dann wurde der Chip mit 1X MES-Puffer gewaschen.
  • Der Chip wurde mit 200 μl 5X SAPE Lösung bei 40°C, 60 UpM für 15 Minuten gefärbt. Der Chip wurde manuell mit 1X MES-Puffer gewaschen. Dies wurde gefolgt von einem Waschschritt mit 6X SSPE-T in der Fluidics Station bei 22°C, 10 × 2. Ein zweiter Scan wurde durchgeführt.
  • Die Ergebnisse der Hybridisierung der humanen Hirnzellen-cRNA sind unten in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 zeigt in Spalte 1 bis 13: 1) Konzentration der Spikes; 2) Hybridisierungszeit; 3) Benutzung oder Nichtbenutzung des Antikörpers; 4) Anzahl der detektierten Gene; 5) Prozentsatz der detektierten Gene; 6) Durchschnittliche Differenz in der Intensität zwischen Übereinstimmungen ("matches") und Nichtübereinstimmungen ("mismatches") für alle Signale; 7) Durchschnittliche Differenz in der Intensität zwischen Übereinstimmungen ("matches") und Nichtübereinstimmungen ("mismatches") für positive Signale; 8) Hintergrund; 9) Standardabweichung; 10); der Wert Q, entspricht Rauschen; 11); der Wert P/Q, entspricht Signal/Rausch-Verhältnis; 12) Anzahl der detektierten. Spikes; 13) Prozentsatz falsch Negativer oder Positiver. Tabelle 1
    Figure 00460001
  • Die Ergebnisse der Hybridisierung der Mäuse-B-Zellen-cRNA sind unten in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 zeigt in Spalte 1 bis 13: 1) Konzentration der Spikes; 2) Hybridisierungszeit; 3) Benutzung oder Nichtbenutzung des Antikörpers; 4) Anzahl der detektierten Gene; 5) Prozentsatz der detektierten Gene; 6) Durchschnittliche Differenz in der Intensität zwischen Übereinstimmungen ("matches") und Nichtübereinstimmungen ("mismatches") für alle Signale; 7) Durchschnittliche Differenz in der Intensität zwischen Übereinstimmungen ("matches") und Nichtübereinstimmungen ("mismatches") für positive Signale; 8) Hintergrund; 9) Standardabweichung; 10) der Wert Q, entspricht Rauschen; 11) der Wert P/Q, entspricht Signal/Rausch-Verhältnis; 12) Anzahl der detektierten Spikes; 13) Prozentsatz falsch Negativer oder Positiver. Tabelle 2
    Figure 00470001

Claims (36)

  1. Verfahren zum Detektieren eines Nukleinsäure-Ziels, bei dem man: a) ein Nukleinsäure-Ziel, das eine Ziel-Nukleinsäuresequenz umfasst, mit einer an einer Oberfläche immobilisierten Nukleinsäure-Sonde hybridisiert, welche eine Sonden-Nukleinsäuresequenz umfasst, wobei ein Bindungsligand mit dem Ziel komplexiert ist; b) das hybridisierte Ziel mit einem Rezeptor in Kontakt bringt, der mehrere Stellen umfasst, die in der Lage sind, den Bindungsliganden zu binden, um den Rezeptor mit dem Bindungsliganden zu komplexieren; c) den Rezeptor mit einem Amplifikations-Reagenz in Kontakt bringt, das eine Vielzahl von Bindungsliganden umfasst, wobei die Bindungsliganden kovalent an das Amplifikations-Reagenz angeheftet sind, um das Amplifikations-Reagenz mit dem Rezeptor zu komplexieren, wobei das Amplifikations-Reagenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper und einer dendrimeren DNA-Matrix, die Schichten von DNA und einzelsträngige Sequenzen an der Oberfläche der Matrix umfasst, die frei sind, um mit einer vorbestimmten Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren; und d) das Vorhandensein des komplexierten Amplifikations-Reagenzes detektiert.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Bindungsligand kovalent an das Ziel angeheftet ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Amplifikations-Reagenz einen Anti-Streptavidin-Antikörper umfasst.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die DNA-Matrix Untereinheiten von partiell doppelsträngigen und partiell einzelsträngigen DNA-Molekülen umfasst.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die DNA-Matrix umfasst: eine Vielzahl von Molekülen eines ersten partiell doppelsträngigen Polynukleotids, wobei das Polynukleotid ein erstes Molekül-Ende, ein zweites Molekül-Ende und einen doppelsträngigen Körper-Abschnitt zwischen dem ersten und dem zweiten Ende aufweist, wobei das erste und das zweite Ende jeweils mindestens einen von einem ersten und einem zweiten Arm umfasst, die aus einem Polynukleotid-Einzelstrang bestehen, und wobei die Einzelstränge mit einer vorbestimmten Nukleinsäuresequenz von Nukleotiden in einer Nukleinsäure hybridisierbar sind, und der erste und zweite Arm von jedem der ersten und zweiten Enden nicht miteinander hybridisierbar sind; eine Vielzahl von Molekülen eines zweiten partiell doppelsträngigen Polynukleotids, wobei jedes Polynukleotid ein erstes Molekül-Ende, ein zweites Molekül-Ende und einen doppelsträngigen Körper-Abschnitt zwischen dem ersten und dem zweiten Ende umfasst, wobei das erste und das zweite Ende jeweils mindestens einen von einem ersten und einem zweiten Arm aufweist, der aus einem Polynukleotid-Einzelstrang besteht, welcher mit einer vorbestimmten Nukleinsäuresequenz von Nukleotiden in einer Nukleinsäure hybridisierbar ist, wobei der erste und zweite Arm von jedem der ersten und zweiten Enden nicht miteinander hybridisierbar sind; wobei die Vielzahl von Molekülen des ersten Polynukleotids und des zweiten Polynukleotids durch Anlagerung von einem oder mehreren Armen derselben zusammengefügt sind, wobei eine Matrix gebildet wird, und wobei Arme von der Vielzahl der ersten und zweiten Polynukleotid-Moleküle, welche an der äußeren Oberfläche der Matrix lokalisiert sind, mit Nukleinsäuren hybridisiert werden, die den Bindungsliganden daran angeheftet haben.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem mindestens eins von dem Rezeptor und dem Amplifikations-Reagenz eine detektierbare Markierung umfasst; und bei dem Schritt d) das Detektieren der Markierung umfasst.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, das ferner vor Schritt d) die Markierung von mindestens einem von dem Rezeptor und dem Amplifikations-Reagenz mit einer detektierbaren Markierung umfasst; und bei dem Schritt d) das Detektieren der Markierung umfasst.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Verfahren ferner nach Schritt c) und vor Schritt d) den Schritt des Inkontaktbringens des Amplifikations-Reagenzes, welches eine Vielzahl der Bindungsliganden umfasst, mit markierten Rezeptor-Molekülen umfasst, um dadurch eine Vielzahl von markierten Rezeptor-Molekülen mit dem Amplifikations-Reagenz zu komplexieren; und bei dem Schritt d) das Detektieren der markierten Rezeptor-Moleküle, die mit dem Amplifikations-Reagenz komplexiert sind, umfasst.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, bei die Markierung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer fluoreszenten Markierung, einer Gold-Markierung und einer Enzym-Markierung.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die fluoreszente Markierung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fluorescein, Rhodamin, Resorufin und Coumarin.
  11. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Bindungsligand Biotin umfasst und der Rezeptor Avidin oder Streptavidin umfasst.
  12. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Amplifikations-Reagenz einen Antikörper umfasst, der in der Lage ist, den Rezeptor spezifisch zu binden.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem der Bindungsligand Biotin umfasst, der Rezeptor Avidin oder Streptavidin umfasst, und bei dem Biotin kovalent an den Antikörper angeheftet ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem der Rezeptor Streptavidin umfasst, und der Antikörper ein Anti-Streptavidin-Antikörper ist, der eine Vielzahl von Biotin-Molekülen umfasst, welche kovalent an den Antikörper angeheftet sind; wobei das Verfahren ferner nach Schritt c) und vor Schritt d) den Schritt des Inkontaktbringens des Antikörpers mit markiertem Streptavidin umfasst, um dadurch eine Vielzahl von markiertem Streptavidin-Molekülen mit dem Antikörper zu komplexieren; und wobei Schritt d) das Detektieren der markierten Streptavidin-Moleküle, die mit dem Antikörper komplexiert sind, umfasst.
  15. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem das Amplifikations-Reagenz eine DNA-Matrix umfasst, die einzelsträngige DNA umfasst; und bei dem Biotin durch Hybridisierung einer Vielzahl von biotinylierten Nukleinsäuren an Einzelstränge der DNA-Matrix an die DNA-Matrix angeheftet ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem das Verfahren ferner nach Schritt c) und vor Schritt d) den Schritt des Inkontaktbringens der DNA-Matrix mit markiertem Streptavidin umfasst, um dadurch eine Vielzahl von markierten Streptavidin-Molekülen mit der DNA-Matrix zu komplexieren; und bei dem Schritt d) das Detektieren der markierten Streptavidin-Moleküle, welche mit der DNA-Matrix komplexiert sind, umfasst.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die Markierung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer fluoreszenten Markierung, einer Gold-Markierung und einer Enzym-Markierung.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem die fluoreszente Markierung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fluorescein, Rhodamin, Resorufin und Coumarin.
  19. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die Oberfläche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Langmuir-Blodgett-Film, Glas, Germanium, Silizium, (Poly)Tetrafluorethylen, Polystyren, Galliumarsenid, Galliumphosphid, Siliziumoxid, Siliziumnitrid und Kombinationen derselben.
  20. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem in Schritt (a) die Hybridisierung in einer Hybridisierungslösung durchgeführt wird, die einen Sulfonat-Puffer umfasst.
  21. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem in Schritt (a) die Hybridisierung in einer Hybridisierungslösung durchgeführt wird, die einen Sulfonat-Puffer umfasst.
  22. Verfahren zum Detektieren eines Nukleinsäure-Ziels, bei dem man a) ein Substrat bereitstellt, das eine Oberfläche umfasst, wobei die Oberfläche mindestens 100 Nukleinsäure-Sonden umfasst, wobei jede Nukleinsäure-Sonde in einem Bereich von weniger als etwa 0,1 cm2 enhalten ist, und wobei jede Nukleinsäure-Sonde eine definierte Sequenz und Lokalisierung auf der Oberfläche hat; b) die Oberfläche mit einem Nukleinsäure-Ziel in Kontakt bringt, das eine Ziel-Nukleinsäuresequenz umfasst, um es dem Nukleinsäure-Ziel zu ermöglichen, mit mindestens einer ausgewählten Nukleinsäure-Sonde zu hybridisieren, welche eine Sonden-Nukleinsäuresequenz umfasst, welche in der Lage ist, mit der Ziel-Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, und wobei ein Bindungsligand mit dem Ziel komplexiert ist; c) das hybridisierte Ziel mit einem Rezeptor in Kontakt bringt, der mehrere Stellen umfasst, welche in der Lage sind, den Bindungsliganden zu binden, um den Rezeptor mit dem Bindungsliganden zu komplexieren; d) den Rezeptor mit einem Amplifikations-Reagenz in Kontakt bringt, das eine Vielzahl der Bindungsliganden umfasst, wobei die Bindungsliganden kovalent an das Amplifikations-Reagenz angeheftet sind, um das Amplifikations-Reagenz mit dem Rezeptor zu komplexieren, wobei das Amplifikations-Reagenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper und einer dendrimeren DNA-Matrix, die Schichten von DNA und einzelsträngige Sequenzen an der Oberfläche der Matrix umfasst, die frei sind, um mit einer vorbestimmten Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren; und e) das Vorhandensein des komplexierten Amplifikations-Reagenzes detektiert.
  23. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem der Bindungsligand kovalent an das Ziel angeheftet ist.
  24. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem in Schritt b) die Oberfläche mit dem Nukleinsäure-Ziel in einer Hybrdisierungslösung in Kontakt gebracht wird, die einen Sulfonat-Puffer umfasst.
  25. Verfahren nach Anspruch 24, bei dem der Sulfonat-Puffer 2-[N-morpholino]-Ethansulfonsäure („MES") ist.
  26. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem das Amplifikations-Reagenz eine DNA-Matrix umfasst, der Bindungsligand Biotin umfasst und der Rezeptor Streptavidin umfasst.
  27. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem der Bindungsligand Biotin umfasst, der Rezeptor Streptavidin umfasst und das Amplifikations-Reagenz einen Anti-Streptavidin-Antikörper umfasst.
  28. Komplex, umfaßend: einen Bindungsliganden, der mit einer Nukleinsäure komplexiert ist; einen Rezeptor, der mehrere Bindungsstellen umfasst, welche in der Lage sind, den Bindungsliganden zu binden; und ein Amplifikations-Reagenz, das eine Vielzahl von Bindungsliganden umfasst, wobei die Bindungsliganden kovalent an das Amplifikations-Reagenz angeheftet sind, wobei das Amplifikations-Reagenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper und einer dendrimeren DNA-Matrix, die Schichten von DNA und einzelsträngige Sequenzen an der Oberfläche der Matrix umfasst, die frei sind, um mit einer vorbestimmten Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren.
  29. Komplex nach Anspruch 28, bei dem der Bindungsligand kovalent an die Nukleinsäure angeheftet ist.
  30. Komplex nach Anspruch 28, bei dem Bindungsligand Biotin umfasst und der Rezeptor Streptavidin oder Avidin umfasst.
  31. Komplex nach Anspruch 30, bei dem das Amplifikations-Reagenz eine DNA-Matrix umfasst.
  32. Komplex nach Anspruch 30, bei dem das Amplifikations-Reagenz einen Anti-Streptavidin-Antikörper umfasst.
  33. Substrat, das eine Oberfläche mit einer darauf immobilisierten Nukleinsäure-Sonde umfasst, die eine Sonden-Nukleinsäuresequenz umfasst, welche mit einem Nukleinsäure-Ziel hybridisiert ist, das eine Ziel-Nukleinsäuresequenz umfasst; wobei ein Bindungsligand mit dem Ziel komplexiert ist, und wobei der Bindungsligand auf dem Ziel mit einem Rezeptor komplexiert ist, der mehrere Stellen umfasst, die in der Lage sind, den Bindungsliganden zu binden, und wobei der Rezeptor mit einem Amplifikations-Reagenz komplexiert ist, das eine Vielzahl von Bindungsliganden umfasst, wobei die Bindungsliganden kovalent an das Amplifikations-Reagenz angeheftet sind, wobei das Amplifikations-Reagenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper und einer dendrimeren DNA-Matrix, die Schichten von DNA und einzelsträngige Sequenzen an der Oberfläche der Matrix umfasst, die frei sind, um mit einer vorbestimmten Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren.
  34. Verfahren nach Anspruch 33, bei dem der Bindungsligand kovalent an das Ziel angeheftet ist.
  35. Substrat nach Anspruch 33, bei dem der Bindungsligand Biotin umfasst und der Rezeptor Streptavidin oder Avidin umfasst.
  36. Substrat nach Anspruch 35, bei dem das Amplifikations-Reagenz einen Anti-Streptavidin-Antikörper umfasst.
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