DE69929060T2

DE69929060T2 - Beta-l-2'-deoxynukleoside für die behandlung von hepatitis b virus

Info

Publication number: DE69929060T2
Application number: DE69929060T
Authority: DE
Inventors: Gilles Gosselin; Jean-Louis Imbach; L. Martin BRYANT
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Idenix Cayman Ltd
Current assignee: L'universite Montpellier Ii Montpellier Fr; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Idenix Cayman Ltd
Priority date: 1998-08-10
Filing date: 1999-08-10
Publication date: 2006-08-31
Anticipated expiration: 2019-08-11
Also published as: FR07C0046I2; CN1320128A; KR20050062664A; LU91348I2; AU5475799A; CY2007017I1; DK2415776T3; CN100387237C; ES2531928T3; KR100691737B1; HK1034083A1; HK1097776A1; CN1478483A; BR9912896A; KR20060035817A; DK1104436T3; RU2424016C2; BRPI9912896B1; JP2007269798A; ES2579903T3

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung betrifft das Gebiet von Verfahren zur Behandlung des Hepatitis-B-Virus (auch als "HBV" bezeichnet), die die Verabreichung an einen Wirt, der dessen bedarf, entweder allein oder in Kombination, einer wirksamen Menge von einer oder mehreren der hier offenbarten aktiven Verbindungen oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes einer dieser Verbindungen umfasst.
HBV wird als Krebsursache bei Menschen nur noch von Tabak übertroffen. Der Mechanismus, durch den HBV Krebs auslöst, ist unbekannt, obwohl postuliert wird, dass es die Tumorentwicklung direkt oder indirekt über chronische Entzündung, Zirrhose und Zelldegeneration in Verbindung mit der Infektion auslösen kann.
Das Hepatitis-B-Virus hat weltweit epidemische Niveaus erreicht. Nach einer zwei- bis sechsmonatigen Inkubationsdauer, während der der Wirt nichts von der Infektion ahnt, kann die HBV-Infektion zu einer akuten Hepatitis B und zur Leberschädigung führen, die Abdominalschmerz, Gelbsucht und erhöhte Blutspiegel von bestimmten Enzymen verursachen kann. HBV kann eine plötzlich ausbrechende Hepatitis, eine schnell fortschreitende, oft letale Form dieser Krankheit bewirken, wobei große Bereiche der Leber zerstört werden.
Typischerweise erholen sich die Patienten von einer akuten Hepatitis. Bei einigen Patienten dauern allerdings hohe Spiegel von Virusantigen im Blut für eine ausgedehnte oder unbestimmte Zeitdauer an und führen zu einer chronischen Infektion. Chronische Infektionen können zu einer chronisch persistenten Hepatitis führen. Patienten, die mit chronisch persistenter HBV infiziert sind, leben besonders häufig in Entwicklungsländern. Mitte des Jahres 1991 gab es allein in Asien etwa 225 Millionen chronische Träger von HBV, und weltweit fast 300 Millionen Träger. Die chronisch persistente Hepatitis kann Müdigkeit, Leberzirrhose und Leberzellenkarzinom, ein primärer Leberkrebs, hervorrufen.
In den westlichen Industrienationen schließen die Hochrisikogruppen für eine HBV-Infektion diejenigen ein, die mit HBV-Trägern oder ihren Blutproben Kontakt haben. Die Epidemiologie von HBV ist derjenigen des acquired immune deficiency syndrome (AIDS) sehr ähnlich, was dafür verantwortlich ist, dass die HBV-Infektion bei Patienten mit AIDS oder dem AIDS-verwandten Komplex häufig ist. Allerdings ist HBV ansteckender als HIV.
Neuerdings wurden jedoch Impfstoffe bereits gentechnisch hergestellt und werden derzeit breit eingesetzt. Leider können die Impfstoffe denjenigen, die bereits mit HBV infiziert sind, nicht helfen. Tägliche Behandlungen mit α-Interferon, einem gentechnisch hergestellten Protein, haben sich ebenfalls als viel versprechend erwiesen, allerdings ist diese Therapie nur bei etwa einem Drittel der behandelten Patienten erfolgreich. Außerdem kann Interferon nicht oral gegeben werden.
Eine Anzahl von synthetischen Nucleotiden, die Aktivität gegen HBV zeigen, wurde bereits identifiziert. Das (–)-Enantiomer von BCH-189, als 3TC bekannt, das in der U.S.-Patentschrift 5,539,116 von Liotta et al. beansprucht ist, wurde von der U.S. Food and Drug Administration zur Behandlung von Hepatitis-B zugelassen. Siehe auch EPA 0 494 119 A1 , eingereicht von Bio-Chem Pharma, Inc.
Cis-2-Hydroxymethyl-4-(5-fluorcytosin-1-yl)-1,3-oxathiolan ("FTC") zeigt Aktivität gegen HBV. Siehe WO 92/15308; Furman et al., "The Anti-Hepatitis B Virus Activities, Cytotoxicities, and Anabolic Profiles of the (–) und (+) Enantiomers of cis-5-Fluoro-1-[2-(Hydroxymethyl)-1,3-oxathiolane-5-yl]-Cytosine" Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Dezember 1992, Seite 2686–2692; und Cheng et al., Journal of Biological Chemistry, Bd. 267(20), 13938–13942 (1992).
Von Janta-Lipinski et al. offenbaren die Verwendung des L-Enantiomers von 3'-Fluor-modifizierten β-2'-Deoxyribonucleosid-5'-triphosphaten zur Hemmung von Hepatitis-B-Polymerase (J. Med. Chem., 1998, 41, 2040–2046). Insbesondere werden die 5'-Triphosphate von 3'-Deoxy-3'-fluoro-β-L-thymidin (β-L-FTTP), 2',3'-Dideoxy-3'-fluor-β-L-cytidin (β-L-FdCTP) und 2',3'-Dideoxy-3'-fluor-β-L-5-methylcytidin (β-L-FMethCTP) als wirksame Inhibitoren der HBV-DNA-Polymerasen offenbart.
T.S. Lin et al. (Tetrahedron, Bd. 51(4), 1995, Seiten 1055–1068) lehren, dass β-L-5-Iod-2'-deoxyuridin (β-L-IUdR) gegen Herpesinfektion und verschiedene andere DNA-Viren aktiv ist, dass auch BVdU und β-L-BV-ara-U gegen Herpes aktiv sind, dass β-L-BV-ara-U gegen das Varicella-Zoster-Virus aktiv ist und dass festgestellt wurde, dass 2',3'-Dideoxy-β-L-azacytidin gegen HBV aktiv ist.
CA-A-2 206 878 und WO-A-99 45 935, beide von Weis et al., lehren die Verwendung bestimmter Dinucleotid-Dimere, die mindestens einen L-Zucker enthalten, hauptsächlich zur Behandlung von Tumoren. Beide Anmeldungen lehren, dass es die dimere Form ist, die die Aktivität aufweist.
WO 96/13512 von Genencor International Inc. und Lipitek Inc. offenbart, dass bestimmte L-Ribofuranosylnucleoside zur Behandlung von Krebs und Viren geeignet sein können. Besonders offenbar ist die Verwendung dieser Klasse von Verbindungen zur Behandlung von Krebs und HIV.
Die U.S.-Patentschriften Nrn. 5,565,438, 5,567,688 und 5,587,362 (Chu et al.) offenbaren die Verwendung von 2'-Fluor-5-methyl-β-L-arabinofuranolyluridin (L-FMAU) zur Behandlung des Hepatitis-B- und Epstein-Barr-Virus.
Yale University und University of Georgia Research Foundation Inc. offenbaren die Verwendung von L-FddC (β-L-5-Fluor-2',3'-dideoxycytidin) zur Behandlung des Hepatitis-B-Virus in WO 92/18517.
Die synthetischen Nucleoside β-L-2'-Deoxycytidin (β-L-2'-dC), β-L-2'-Deoxythymidin (β-L-dT) und β-L-2'-Deoxyadenosin (β-L-2'-dA) sind aus der Technik bekannt. Antonin Holy offenbarte zuerst β-L-dC und β-L-dT 1972 "Nucleic Acid Components and Their Analogs. CLIII". Preparation of 2'-deoxy-L-Ribonucleosides of the Pyrimidine Series, "Collect. Czech. Chem. Commun. (1972), 37(12), 4072–87. Morris S. Zedeck et al. offenbarten zuerst β-L-dA zur Hemmung der Synthese induzierter Enzyme in Pseudomonas testosteroni, Mol. Phys. (1967), 3(4), 386–95.
Bestimmte 2'-Deoxy-β-L-erythro-pentofuranonucleoside besitzen bekanntlich antineoplastische und ausgewählte antivirale Aktivitäten. Verri et al. offenbaren die Verwendung von 2'-Deoxy-β-L-erythro-pentofuranonucleosiden als antineoplastische Mittel und als Antiherpesmittel (Mol. Pharmacol. (1997), 51(1), 132–138 und Biochem. J. (1997), 328(1), 317–20). Saneyoshi et al. zeigen die Verwendung von 2'-Deoxy-L-ribonucleosiden als Reverse-Transcriptase-(I)-Inhibitoren zur Kontrolle von Retroviren und zur Behandlung von AIDS, Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 06293645 (1994).
Giovanni et al. testeten 2'-Deoxy-β-L-erythro-pentofuranonucleoside insbesondere gegen das Pseudorabies-Virus (PRV), Biochem. J. (1993), 294(2), 381–5.
Die chemotherapeutischen Anwendungen der 2'-Deoxy-β-L-erythro-pentafuranonucleoside wurde von Tyrsted et al. (Biochim. Biophys. Acta (1968), 155(2), 619–22) und Bloch et al. (J. Med. Chem. (1967), 10(5), 908–12) studiert.
Von β-L-2'-Deoxythymidin (β-L-dT) ist aus der Technik bekannt, dass es die Herpes-Simplex-Virus-Typ-1 (HSV-1)-Thymidinkinase (TK) hemmt. lotti et al., WO 92/08727, lehren, dass β-L-dT die Phosphorylierung von D-Thymidin durch HSV-1-TK, allerdings nicht durch menschliche TK selektiv hemmt. Spaldari et al. berichteten, dass L-Thymidin durch die Herpes-Simplex-Virus-Typ-1-Thymidinkinase phosphoryliert wird, was das virale Wachstum hemmt, J. Med. Chem. (1992), 35(22), 4214–20.
Angesichts der Tatsache, dass das Hepatitis-B-Virus weltweit epidemische Niveaus erreicht hat und schwerwiegende und oft tragische Auswirkungen auf den infizierten Patienten hat, besteht immer noch eine starke Nachfrage nach der Bereitstellung von neuen wirksamen pharmazeutischen Arzneimitteln, die gegenüber dem Wirt wenig Toxizität aufweisen, zur Behandlung von mit dem Virus infizierten Patienten.
Darum besteht ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung darin, neue Verfahren zur Behandlung von menschlichen Patienten und anderen mit Hepatitis-B-Virus-infizierten Wirten bereitzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Offenbart wird ein Verfahren zur Behandlung der Hepatitis-B-Infektion in Menschen und anderen Wirtstieren, das die Verabreichung einer wirksamen Menge eines biologisch aktiven 2'-Deoxy-β-L-erythro-pentofuranonucleosids (alternativ hier als β-L-d-Nucleosid oder als β-L-2'-d-Nucleosid bezeichnet) oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon, das entweder allein oder in Kombination, gegebenenfalls in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, verabreicht wird, umfasst. Der Begriff 2'-Deoxy, wie in dieser Spezifikation verwendet, bezieht sich auf ein Nucleosid, das in der 2'-Position keine Substituenten aufweist.
Die offenbarten 2'-Deoxy-β-L-erythro-pentofuranonucleoside oder die pharmazeutisch verträglichen Salze oder die pharmazeutisch verträglichen Formulierungen, die diese Verbindungen enthalten, sind bei der Prävention und Behandlung von Hepatitis-B-Infektionen und anderen verwandten Zuständen, wie anti-HBV-Antikörper-positive und HBV-positive Zustände, chronische von HBV verursachte Leberentzündung, Zirrhose, akute Hepatitis, plötzlich ausbrechende Hepatitis, chronisch persistente Hepatitis und Ermüdung, geeignet. Diese Verbindungen oder Formulierungen können auch prophylaktisch zur Verhinderung oder Verzögerung des Fortschritts von klinischen Krankheit in Individuen eingesetzt werden, die anti-HBV-Antikörper- oder anti-HBV-Antigen-positiv sind oder die gegenüber HBV exponiert wurden.
Bei einer Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung einer wirksamen Menge eines β-L-2'-Deoxynucleosids der Formel
oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Hepatitis-B-Virusinfektion in einem Wirt.
Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst die Erfindung die Verwendung einer wirksamen Menge eines β-L-2'-Deoxynucleosids der Formel
oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Hepatitis-B-Virusinfektion in einem Wirt.
Bei einer weiteren Ausführungsform wird das 2'-Deoxy-β-L-erythro-pentofuranonucleosid alternierend oder in Kombination mit einem anderen 2'-Deoxy-β-L-erythro-pentofuranonucleosid oder einer oder mehreren anderen Verbindungen verabreicht, die gegen das Hepatitis-B-Virus Aktivität aufweisen. Im Allgemeinen wird während der alternierenden Therapie jeweils eine wirksame Dosis des Mittels nacheinander verabreicht, wohingegen bei der Kombinationstherapie eine wirksame Dosis von zwei oder mehreren Mitteln zusammen verabreicht wird. Die Dosen hängen von der Absorption, der Inaktivierung und von den Ausscheidungsgeschwindigkeiten des Arzneimittels sowie von anderen den Fachleuten bekannten Faktoren ab. Festzustellen ist, dass die Dosierungsgrößen auch mit der Schwere des zu lindernden Zustandes schwanken. Es ist außerdem selbstverständlich, dass für jedes bestimmte Individuum spezielle Dosierungsvorgaben und Dosierungspläne zeitabhängig je nach individuellem Bedürfnis und fachlicher Beurteilung der verabreichenden oder die Verabreichung der Zusammensetzungen überwachenden Person eingestellt werden sollten.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 erläutert ein allgemeines Verfahren zum Erhalt von β-L-erythro-Pentafuranonucleosiden (β-L-dN) unter Verwendung von L-Ribose oder L-Xylose als Ausgangsmaterial.
2 ist ein Graph, der den Metabolismus von L-dA, L-dC und L-dT in menschlichen Hep-G2-Zellen im Hinblick auf Akkumulation und Abnahme zeigt. Die Zellen wurden mit 10 μM Verbindung inkubiert.
3 ist ein Graph, der die antivirale Wirkung von β-L-dA, β-L-dC und β-L-dT in dem chronischen Hepatitis-Woodchuck-Modell erläutert.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "im Wesentlichen in Form eines einzigen Isomers" oder "in isolierter Form" auf ein 2'-Deoxy-β-L-erythro-pentofuranonucleosid, das zu mindestens etwa 95% in der bezeichneten Stereokonfiguration vorliegt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die aktive Verbindung in mindestens diesem Reinheitsniveau an den Wirt, der der Therapie bedarf, verabreicht.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff Hepatitis B und verwandte Zustände auf Hepatitis B und verwandte Zustände, wie anti-HBV-Antikörper-positive und HBV-positive Zustände, durch HBV verursachte chronische Leberentzündung, Zirrhose, akute Hepatitis, plötzlich ausbrechende Hepatitis, chronisch persistente Hepatitis und Ermüdung. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die prophylaktische Verwendung von 2'-Deoxy-β-L-erythro-pentofuranonucleosid-Derivaten zur Prävention oder Verzögerung des Fortschritts von klinischer Erkrankung bei Individuen, die anti-HBV-Antikörper- oder HBV-Antigen-positiv sind oder die gegenüber HBV exponiert wurden.
Der Begriff biologisch aktives Nucleosid, wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Nucleosid, das beim Testen an 2.2.15-Zellen, die mit dem Hepatitis-Virion transfiziert wurden, eine EC₅₀ von 15 Micromolar oder weniger aufweist.
Das 2'-Deoxy-β-L-erythro-pentofuranonucleosid kann als 5'-Phospholipid oder als ein 5'-Etherlipid bereitgestellt werden, wie in den folgenden Referenzen offenbart: Kucera, L.S., N. Lyer, E. Leake, A. Raben, Modest E.J., D.L.W., und C. Piantadosi, 1990. Novel membrane-interactive ether lipid analogs that inhibit infectious HIV-1 production and induce defective virus formation. AIDS Res Hum Retroviruses, 6: 491–501; Piantadosi, C., J. Marasco C.J., S.L. Morris-Natschke, K.L. Meyer, F. Gumus, J.R. Surles, K.S. Ishaq, L.S. Kucera, N. Iyer, C.A. Wallen, S. Piantadosi und E.J. Modest. 1991-Synthesis und evaluation of novel ether lipid nucleoside conjugates for anti-HIV-activity. J Med Chem. 34: 1408–1414; Hostetler, K.Y., D.D. Richman, D.A. Carson, L.M. Stuhmiller, G.M.T. van Wijk und H. van den Bosch. 1992. Greatly enhanced inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication in CEM und HT4-6C cells by 31-deoxythymidine diphosphate dimyristoylglycerol, a lipid prodrug of 31-deoxythymidine. Antimicrob Agents Chemother. 36: 2025–2029; Hostetler, K.Y., L.M. Stuhmiller, H.B. Lenting, H. van den Bosch, and D.D. Richman, 1990. Synthesis and antiretroviral activity of phospholipid analogs of azidothymidine and other antiviral nucleosides. J. Biol Chem. 265: 6112–7.
Das 2'-Deoxy-β-L-erythro-pentofuranonucleosid kann durch Umsetzung mit einem entsprechenden Veresterungsmittel, beispielsweise einem Säurehalogenid oder Anhydrid, in einen pharmazeutisch verträglichen Ester übergeführt werden. Das Nucleosid oder sein pharmazeutisch verträgliches Prodrug kann auf herkömmliche Weise, beispielsweise durch Behandlung mit einer entsprechenden Base oder Säure, in ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon umgewandelt werden. Der Ester oder das Salz können beispielsweise durch Hydrolyse in das Stammnucleosid übergeführt werden.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff pharmazeutisch verträgliche Salze oder Komplexe auf Salze oder Komplexe der 2'-Deoxy-β-L-erythro-pentofuranonucleoside, die die gewünschte biologische Aktivität der Stammverbindung beibehalten und minimale, falls überhaupt, unerwünschte toxikologische Wirkungen zeigen. Nichteinschränkende Beispiele für solche Salze sind (a) Säure-Additionssalze, die mit anorganischen Säuren (beispielsweise Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure und dergleichen) und mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Succinsäure, Äpfelsäure, Ascorbinsäure, Benzoesäure, Gerbsäure, Palmsäure, Alginsäure, Polyglutaminsäure, Naphthalinsulfonsäuren, Naphthalindisulfonsäuren und Polygalacturonsäure, gebildet werden; (b) Base-Additionssalze, die mit Kationen, wie Natrium, Kalium, Zink, Calcium, Wismut, Barium, Magnesium, Aluminium, Kupfer, Cobalt, Nickel, Cadmium, Natrium, Kalium und dergleichen oder mit einem organischen aus N,N-Dibenzylethylendiamin, Ammonium oder Ethylendiamin gebildeten Kation gebildet werden; oder (c) Kombinationen von (a) und (b); z.B. ein Zinktannatsalz oder dergleichen.
Modifikationen der aktiven Verbindungen, insbesondere an der N⁴- und 5'-O-Position, können die Bioverfügbarkeit und die Metabolismusgeschwindigkeit der aktiven Spezies beeinflussen und stellen somit eine Kontrolle über die Abgabe der wirksamen Spezies bereit.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung von HBV-Infektionen in Menschen oder in anderen Wirtstieren, das die Verabreichung einer wirksamen Menge von einem oder mehreren eines 2'-Deoxy-β-L-erythro-pentofuranonucleosid-Derivats umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus β-L-2'-Deoxycytidin. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das 2'-Deoxy-β-L-erythro-pentofuranonucleosid im Wesentlichen in Form eines einzelnen Isomers, d.h. mindestens zu etwa 95% in der bezeichneten Stereokonfiguration, verabreicht.
Kombinationstherapie oder alternierende Therapie
Es ist bekannt, dass nach längerer Behandlung mit einem antiviralen Mittel Arzneimittel-resistente Varianten von HBV auftreten können. Besonders typisch tritt die Arzneimittelresistenz durch Mutation eines Gens, das ein Enzym kodiert, das im viralen Lebenscyclus eingesetzt wird, und besonders typisch im Fall der HBV-DNA-Polymerase auf. Neuerdings wurde gezeigt, dass die Wirksamkeit eines Arzneimittels gegen HBV-Infektion durch die Verabreichung der Verbindung in Kombination oder alternierend mit einer zweiten oder vielleicht einer dritten antiviralen Verbindung verlängert, gesteigert oder wieder hergestellt werden kann, die eine von der durch das Hauptarzneimittel verursachten unterschiedliche Mutation auslöst. Alternativ können Pharmakokinetik, Biodistribution oder andere Parameter des Arzneimittels durch eine solche Kombinationstherapie oder alternierende Therapie verändert werden. Im Allgemeinen ist typischerweise die Kombinationstherapie gegenüber der alternierenden Therapie bevorzugt, da sie mehrere gleichzeitige Belastungen auf das Virus auslöst.
Die hier bereitgestellte virale Anti-Hepatitis-B-Aktivität von β-L-2'-dC oder β-L-2'-dT oder von Salzen dieser Verbindungen kann durch Verabreichung von zwei oder mehreren dieser Nucleoside in Kombination oder abwechselnd verstärkt werden. Alternativ kann beispielsweise eines oder mehrere der hier bereitgestellten β-L-2'-dC oder β-L-2'-dT in Kombination oder alternierend mit 3TC, FTC, L-FMAU, DAPD, Famciclovir, Penciclovir, BMS-200475, Bis-pom-PMEA (Adefovir, Dipivoxil); Lobucavir, Ganciclovir oder Ribavarin verabreicht werden.
Bei einer der hier beschriebenen Ausführungsformen, wenn das erfindungsgemäße β-L-2'-Nucleosid in Kombination oder alternierend mit einem zweiten Nucleosid oder mit einem nichtnucleosidischen Reverse-Transcriptasehemmer, der zu einer aktiven Form phosphoryliert ist, verabreicht wird, ist es bevorzugt, dass eine zweite Verbindung durch ein Enzym phosphoryliert wird, das von demjenigen verschieden ist, das das ausgewählte erfindungsgemäße β-L-2'-Nucleosid in vivo phosphoryliert. Beispiele für Kinaseenzyme sind Thiymidinkinase, Cytosinkinase, Guanosinkinase, Adenosinkinase, Deoxycytinkinase, 5'-Nucleotidase und Deoxyguanosinkinase.
Herstellung der aktiven Verbindungen
Die erfindungsgemäßen 2'-Deoxy-β-L-erythro-pentofuranonucleosid-Derivate sind aus der Technik bekannt und können nach dem von Holy, Collect. Czech. Chem. Commun. (1972), 37(12), 4072–87 und Mol. Phys. (1967), 3(4), 386–95 beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
Ein allgemeines Verfahren zum Erhalt von β-L-erythro-Pentofuranonucleosiden (β-L-dN) ist in 1 unter Verwendung von L-Ribose oder L-Xylose als Ausgangsmaterial gezeigt.
Experimentprotokolle
Die Schmelzpunkte wurden in offenen Kapillarröhrchen auf einem Gallenkamp-MFB-595-010 M-Gerät bestimmt und sind unkorrigiert. Die UV-Absorptionsspektren wurden auf einem Uvikon 931 (KONTRON)-Spektralphotometer in Ethanol aufgenommen. Die ¹H-NMR-Spektren wurden bei Raumtemperatur in DMSO-d₆ mit einem Bruker AC 250 oder 400-Spektrometer aufgenommen. Die chemischen Verschiebungen sind in ppm angegeben, wobei DMSO-d₅ bei 2,49 ppm als Referenz eingestellt wurde. Zur Bestätigung der Protonenzuordnungen wurden Deuteriumaustausch-Entkopplungsexperimente oder 2D-COSY durchgeführt. Die Signalmultiplizitäten sind angegeben in s (Singulett), d (Dublett), dd (Doppeldublett), t (Triplett), q (Quadruplett), br (breit), m (Multiplett). Sämtliche J-Werte sind in Hz angegeben. Die FAB-Massenspektrum wurden im positiven (FAB > 0) oder negativen (FAB > 0) Ionenmodus auf einem JEOL DX 300-Massenspektrometer aufgezeichnet. Die Matrix war 3-Nitrobenzylalkohol (NBA) oder ein Gemisch (50:50, Vol./Vol.) von Glycerin und Thioglyerin (GT). Die spezifischen Rotationen wurden auf einem Perkin-Elmer-241-Spektropolarimeter (Weglänge 1 cm) aufgezeichnet und sind in den Einheiten 10^–1 deg cm² g^–1 angegeben. Die Elementaranalyse wurde von "Service de Microanalyses du CNRS, Division de Vernaison" (Frankreich) durchgeführt. Die durch die Symbole der Elemente oder Funktionen angegebenen Analysen lagen innerhalb von ±0,4% der theoretischen Werte. Die Dünnschichtchromatographie wurde auf vorbeschichteten Aluminiumblechen mit Silica-Gel 60 F₂₅₄ (Merck, Art. 5554) durchgeführt, wobei die Sichtbarmachung der Produkte durch UV-Absorption und anschließende Verkohlung mit 10% ethanolischer Schwefelsäure und Erhitzen erreicht wurde. Die Säu lenchromatographie wurde auf Silica-Gel 60 (Merck, Art. 9385) unter Atmosphärendruck durchgeführt.
Referenzbeispiel 1 Stereospezifische Synthese von 2'-Deoxy-β-L-adenosin
9-(3,5-Di-O-benzoyl-β-L-xylofuranosyl)adenin (3)
Eine Lösung von 9-(2-O-Acetyl-3,5-di-O-benzoyl-β-L-xylofuranosyl)adenin 2 (Ref.: Gosselin, G., Bergogne, M.-C.; Imbach, J.-L., "Synthesis and Antiviral Evaluation of β-L-Xylofuranosyl Nucleosides of the Five Naturally Occuring Nucleic Acid Bases", Journal of Heterocyclic Chemistry, 1993, 30 (Okt.–Nov.), 1229–1233] (8,30 g, 16,05 mmol) und Hydrazinhydrat 98% (234 ml, 48,5 mmol) in einem Gemisch von Pyridin/Eisessig (4/1, Vol./Vol., 170 ml) wurde 22 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Umsetzung wurde durch Zugabe von Aceton (40 ml) gestoppt, und das Rühren wurde noch 1 h fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf die Hälfte seines Volumens reduziert, mit Wasser (250 ml) verdünnt und mit Chloroform (2 × 150 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde nacheinander mit einer wässrigen gesättigten Lösung von NaHCO₃ (3 × 100 ml) und Wasser (3 × 100 ml) gewaschen, getrocknet, filtriert, konzentriert und zusammen mit Toluol und Methanol eingedampft. Der Rückstand wurde durch Silicagel-Säulenchromatographie (0–3% MeOH in Dichlormethan) unter Erhalt von 3 (5,2 g, 68%), das aus Diisopropylether ausgefällt wurde, gereinigt: ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 4,5–4,9 (m, 4H, H-2', H-4', H-5' und H-5''), 5,64 (t, 1H, H-3', J_2',3' = J_3',4' = 3,5 Hz), 6,3 (br s, 1H, OH-2'), 6,45 (d, 1H, H-1', J_1',2' = 4,6 Hz), 7,3 br s, 2H, NH₂-6), 7,4–7,9 (m, 10H, 2 Benzoyle), 8,07 und 8,34 (2s, 2H, H-2 und H-8); ms: Matrix G/T, (FAB⁺) m/z 476 [M+H]⁺, 136 [BH₂]⁺, (FAB^–) m/z 474 [M–H]^–, 134 [B]^–; UV (95% Ethanol): λ_max 257 nm (ε 16400), 230 nm (ε 29300), λ_min 246 nm (ε 14800); [α]_D ²⁰ = –64 (c 1,07, CHCl₃). Anal. ber. für C₂₄H₂₁N₅O₄ (M = 475,45): C; 60,43; H, 4,45; N, 14,73, gefunden: C, 60,41; H, 4,68; N, 14,27.
9-(3,5-Di-O-benzoyl-2-deoxy-β-L-threo-pentofuranosyl)adenin (4)
Einer Lösung der Verbindung 3 (1,00 g, 2,11 mmol) in trockenem Acetonitril (65 ml) wurden 4-(Dimethylamino)pyridin (0,77 g, 6,32 mmol) und Phenoxythiocarbonylchlorid (0,44 ml, 3,16 mmol) zugesetzt. Das Gemisch wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Konzentrieren wurde der Rückstand in Dichlormethan (50 ml) gelöst und nacheinander mit Wasser (2 × 30 ml), einer wässrigen Lösung von Chlorwasserstoffsäure, 0,5 N (30 ml), und Wasser (3 × 30 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet, filtriert und zur Trockene konzentriert. Die rohe thiocarbonylierte Zwischenstufe wurde direkt mit Tris(trimethylsilyl)silanhydrid (0,78 ml, 5,23 mmol) und α,α'-Azoisobutyronitril (AIBN, 0,112 g, 0,69 mmol) in trockenem Dioxan (17 ml) und 2 h unter Rückfluss behandelt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde durch Silicagel-Säulenchromatographie gereinigt (0–5% MeOH in Dichlormethan), um reines 4 (0,93 g, 96%) als Schaum zu ergeben: ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 2,9–3,1 (m, 2H, H-2' und H-2''), 4,6–4,7 (m, 3H, H-4', H-5'und H-5''), 5,8 (br s, 1H, H-3'), 6,43 (dd, 1H, H-1', J_1',2' = 3,1 Hz, J_1',2'' = 7,6 Hz), 7,3 (br s, 2H, NH₂-6), 7,4–7,9 (m, 10H, 2 Benzoyle), 8,05 und 8,33 (2s, 2H, H-2 und H-8); ms: Matrix G/T, (FAB⁺) m/z 460 [M+H]⁺, 325 [S]⁺, 136 [BH₂]⁺, (FAB^–) m/z 458 [M–H]^–, 134 [B]^–; UV (95% Ethanol): λ_max 261 nm (ε 14400), 231 nm (ε 26300), λ_min 249 nm (ε 12000); [α]_D ²⁰ = –38 (c 1,04, DMSO).
6-N-(4-Monomethoxytrityl)-9-(3,5-di-O-benzoyl-2-deoxy-β-L-threo-pentofuranosyl)adenin (5)
Einer Lösung von Verbindung 4 (0,88 g, 1,92 mmol) in trockenem Pyridin (40 ml) wurde 4-Monomethoxytritylchlorid (1,18 g, 3,84 mmol) zugesetzt. Das Gemisch wurde 24 h bei 60°C gerührt. Nach Zugabe von Methanol (5 ml) wurde die Lösung zur Trockene konzentriert, der Rückstand wurde in Dichlormethan (50 ml) gelöst und nacheinander mit Wasser, wässrigem gesättigtem NaHCO₃ (30 ml) und Wasser (30 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet, filtriert, konzentriert und unter Erhalt von reinem 5 (1,01 g, 72%) als Schaum mit Toluol eingedampft: ¹H-NMR (CDCl₃): δ 2,9–3,0 (m, 2H, H-2' und H-2''), 3,62 (s, 3H, OCH₃), 4,6–4,8 (m, 3H, H-4', H-5' und H-5''), 5,85 (pt, 1H, H-3'), 6,44 (dd, 1H, H-1', J_1',2' = 3,1 Hz, J_1',2'' = 7,3 Hz), 6,9 (br s, 1H, NH-6), 6,7–6,8 und 7,2–7,4 (2m, 24H, 2 Benzoyle und MMTr), 7,97 und 8,13 (2S, 2H, H-2 und H-8); ms: Matrix G/T, (FAB⁺) m/z 732 [M+H]⁺, (FAB^–) m/z 730 [M–H]^–; UV (95% Ethanol): λ_max 274 nm (ε 12100), 225 nm (ε 24200), λ_min 250 nm (ε 5900); [α]_D ²⁰ = –16 (c 1,12, DMSO).
6-N-(4-Monomethoxytrityl)-9-(2-deoxy-β-L-threo-pentofuranosyl)adenin (6)
Verbindung 5 (0,95 g, 1,30 mmol) wurde mit einer Lösung (gesättigt bei –10°C) von methanolischem Ammoniak (40 ml) bei Raumtemperatur über Nacht behandelt. Nach dem Konzentrieren wurde der Rückstand in Dichlormethan (60 ml) gelöst und mit Wasser (30 ml) gewaschen. Die wässrige Schicht wurde zweimal mit Dichlormethan (10 ml) extrahiert. Die vereinigte organische Schicht wurde getrocknet, filtriert und konzentriert. Der Rückstand wurde durch Silicagel-Säulenchromatographie (0–5% MeOH in Dichlormethan) unter Erhalt von reinem 6 (0,67 g, 98%) als Schaum gereinigt: ¹H-NMR (CDCl₃): δ 2,6–2,9 (m, 2H, H-2' und H-2''), 3,5 (br s, 1H, OH-5'), 3,55 (s, 3H, OCH₃), 3,9–4,0 (m, 3H, H-4', H-5' und H-5''), 4,5–4,6 (m, 1H, H-3'), 6,03 (dd, 1H, H-1', J_1',2' = 4,0 Hz, J_1',2'' = 8,8 Hz), 7,0 (br s, 1H, NH-6), 6,7–6,8 und 7,1–7,4 (2m, 14H, MMTr), 7,40 (d, 1H, OH-3', J_H,OH = 10,6 Hz), 7,80 und 7,99 (2s, 2H, H-2 und H-8); ms: Matrix G/T, (FAB⁺) m/z 524 [M+H]⁺, 408 [BH₂]⁺, (FAB^–) m/z 1045 [2M–H]^–, 522 [M–H]^–, 406 [B]^–; UV (95% Ethanol): λ_max 275 nm (ε 12300), λ_min 247 nm (ε 3600), [α]_D ²⁰ = +28 (c 0,94, DMSO).
6-N-(4-Monomethoxytrityl)-9-(2-deoxy-5-O-(4-monomethoxytrityl)-β-L-threo-pentofuranosyl)adenin (7)
Verbindung 6 (0,62 g, 1,24 mmol) in trockenem Pyridin (25 ml) wurde 16 h bei Raumtemperatur mit 4-Monomethoxytritylchlorid (0,46 g, 1,49 mmol) behandelt. Nach Zugabe von Methanol (5 ml) wurde das Gemisch zur Trockene konzentriert. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (60 ml) gelöst und nacheinander mit Wasser (40 ml), einer gesättigten wässrigen Lösung von NaHCO₃ (40 ml) und Wasser (3 × 40 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet, filtriert, konzentriert und mit Toluol und Methanol zusammen eingedampft. Der Rückstand wurde durch Silicagel- Säulenchromatographie (0–10% MeOH in Dichlormethan) unter Erhalt von 7 (0,71 g, 72%) als Schaum gereinigt: ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 2,21 (d, 1H, H-2',J_2',2'' = 14,3 Hz), 2,6–2,7 (m, 1H, H-2''), 3,1–3,3 (2m, 2H, H-5' und H-5''), 3,64 und 3,65 (2s, 6H, 2 × OCH₃), 4,1–4,2 (m, 1H, H-4'), 4,2–4,3 (m, 1H, H-3'), 5,68 (d, 1H, OH-3', J_H,OH = 5,2 Hz), 6,24 (d, 1H, H-1', J_1',2'' = 7,0 Hz), 6,7–6,8 und 7,1–7,3 (2m, 29H, 2 MMTr und NH-6), 7,83 und 8,21 (2s, 2H, H-2 und H-8); ms: Matrix G/T, (FAB⁺) m/z 796 [M+H]⁺, 408 [BH₂]⁺, (FAB^–) m/z 794 [M–H]^–, 406 [B]^–; UV (95% Ethanol): λ_max 275 nm (ε 30900), λ_min 246 nm (ε 12800); [α]_D ²⁰ = +14 (c 1,03, DMSO).
6-N-(4-Monomethoxytrityl)-9-(3-O-benzoyl-2-deoxy-5-O-(4-monomethoxytrityl)-β-L-erythro-pentofuranosyl)adenin (8)
Eine Lösung von Diethylazodicarboxylat (0,38 ml, 2,49 mmol) in trockenem Tetrahydrofuran (20 ml) wurde einer gekühlten Lösung (0°C) von Nucleosid 7 (0,66 g, 0,83 mmol), Triphenylphosphin (0,66 g, 2,49 mmol) und Benzoesäure (0,30 g, 2,49 mmol) in trockenem THF (20 ml) zugetropft. Das Gemisch wurde 18 h bei Raumtemperatur gerührt, und Methanol (1 ml) wurde zugesetzt. Die Lösungsmittel wurden unter reduziertem Druck entfernt, und das Rohmaterial wurde durch Silicagel-Säulenchromatographie (0–5% Ethylacetat in Dichlormethan) unter Erhalt von Verbindung 8, die leicht mit Triphenylphosphinoxid verunreinigt war, gereinigt.
6-N-(4-Monomethoxytrityl)-9-(2-deoxy-5-O-(4-monomethoxytrityl)-β-L-erythro-pentofuranosyl)adenin (9)
Verbindung 8 wurde durch eine Lösung (gesättigt bei –10°C) von methanolischem Ammoniak (20 ml) 24 h bei Raumtemperatur behandelt, anschließend wurde das Reaktionsgemisch zur Trockene konzentriert. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (30 ml) gelöst und mit Wasser (20 ml) gewaschen. Die wässrige Schicht wurde mit Dichlormethan (2 × 20 ml) extrahiert, und die vereinigte organische Phase wurde getrocknet, filtriert und konzentriert. Die reine Verbindung 9 (0,50 g, 76% von 7) wurde nach Reinigung über Silicagel-Säulenchromatographie (0–2% MeOH in Dichlormethan) als Schaum erhalten: ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 2,2–2,3 (m, 1H, H-2'), 2,8–2,9 (m, 1H, H-2''), 3,1–3,2 (m, 2H, H-5' und H-5''), 3,64 und 3,65 (2s, 6H, 2 × OCH₃), 3,97 (pq, 1H, H-4'), 4,4–4,5 (m, 1H, H-3'), 5,36 (d, 1H, OH-3', J_H,OH = 4,5 Hz), 6,34 (t, 1H, H-1', J_1',2' = J_1',2'' = 6,4 Hz), 6,8–6,9 und 7,1–7,4 (2m, 29H, 2 MMTr und NH-6), 7,81 und 8,32 (2s, 2H, H-2 und H-8); ms: Matrix G/T, (FAB⁺) m/z 796 [M+H]⁺, 408 [BH₂]⁺, (FAB^–) m/z 794 [M–H]^–, 406 [B]^–; UV (95% Ethanol): λ_max 276 nm (ε 42600), λ_min 248 nm (ε 23300); [α]_D ²⁰ = +29 (c 1,05, DMSO).
2'-Deoxy-β-L-adenosin (β-L-dA)
Verbindung 9 (0,44 g, 0,56 mmol) wurde mit einer wässrigen Lösung von Essigsäure 80% (17 ml) 5 h bei Raumtemperatur behandelt. Das Gemisch wurde zur Trockene konzentriert, der Rückstand wurde in Wasser (20 ml) gelöst und mit Diethylether (2 × 15 ml) gewaschen. Die wässrige Schicht wurde konzentriert und mit Toluol und Methanol zusammen eingedampft. Das gewünschte 2'-Deoxy-β-L-adenosin (β-L-dA) (0,12 g, 83%) wurde nach Reinigung über Silicagel-Säulenchromatographie (0–12% MeOH in Dichlormethan) und Filtration über eine Millex HV-4-Einheit (0,45 μ, Millipore) erhalten: Fp. 193–194°C (kristallisiert aus Wasser) (Lit. 184–185°C für das L-Enantiomer [Ref.: Robins, M. J.; Khwaja, T.A.; Robins, R.K. J. Org. Chem. 1970, 35, 636–639] und 187–189°C für das D-Enantiomer [Ref.: Ness, R.K. in Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry; Zorbach, W. W., Tipson, R.S., Eds.; J. Wiley and sons: New York, 1968; Bd. 1, SS. 183–187]; ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 2,2–2,3 und 2,6–2,7 (2m, 2H, H-2' und H-2''), 3,4–3,6 (2m, 2H, H-5' und H-5''), 3,86 (pq, 1H, H-4'), 4,3–4,4 (m, 1H, H-3'), 5,24 (t, 1H, OH-5', J_H,OH = 5,8 Hz), 5,30 (d, 1H, OH-3', J_H,OH = 4,0 Hz), 6,32 (dd, 1H, H-1', J_1',2' = 6,2 Hz, J_1',2'' = 7,8 Hz), 7,3 (br s, 2H, NH₂-6), 8,11 und 8,32 (2s, 2H, H-2 und H-8); ms: Matrix G/T, (FAB⁺) m/z 252 [M+H]⁺, 136 [BH₂]⁺, (FAB)^– m/z 250 [M–H]^–, 134 [B]^–; UV (95% Ethanol): λ_max 258 nm (ε 14300), λ_min 226 nm (ε 2100); [α]_D ²⁰ = +25 (c 1,03, H₂O), (Lit. [α]_D ²⁰ = +23 (c 1,0, H₂O) für das L-Enantiomer [Ref.: Robins, M. J.; Khwaja, T.A.; Robins, R. K. J. Org. Chem. 1970, 35, 636–639] und [α]_D ²⁰ = 25 (c 0,47, H₂O) für das D-Enantiomer [Ref.: Ness, R. K. in Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry; Zorbach, W. W., Tipson, R. S., Eds.; J. Wiley and sons: New York, 1968; Bd. 1, SS. 183–187]). Anal. ber. für C₁₀H₁₃N₅O₃ + 1,5 H₂O (M = 278,28): C, 43,16; H, 5,80; N, 25,17, gefunden: C, 43,63; H, 5,45; N, 25,33. Referenzbeispiel 2 Stereoselektive Synthese von 2'-Deoxy-β-L-adenosin (β-L-dA)
Reaktion 1:

Vorläufer: L-Ribose (Cultor Science Food, CAS [24259-59-4], Charge RIB9711013)
Reaktanten: Schwefelsäure (95–97%) (Merck; Ref. 1.00731.1000); Benzylchlorid (Fluka; Ref. 12930); Natriumsulfat (Prolabo; Ref. 28111.365)
Lösungsmittel: Methanol P.A. (Prolabo; Ref. 20847.295); Pyridin 99% (Acros; Ref. 131780025); Dichlormethan P.A. (Merck; Ref. 1.06050.6025); Essigsäure P.A. (Carlo Erba; Ref. 20104298); Essigsäureanhydrid (Fluka; Ref. 45830); Ethanol 95 (Prolabo; Ref. 20823.293)
Referenzen: Recondo, E. F. und Rinderknecht, H., Eine neue einfache Synthese des 1-O-Acetyl-2,3,5-Tri-O-β-D-Ribofuranosides. Helv. Chim. Acta, 1171–1173 (1959).

Eine Lösung von L-Ribose 140 (150 g, 1 mol) in Methanol (2 l) wurde mit Schwefelsäure (12 ml) behandelt und 12 h bei +4°C stehengelassen und anschließend mit Pyridin (180 ml) neutralisiert. Das Eindampfen ergab ein α,β-Gemisch von Methylribofuranosiden 141 als Sirup. Eine Lösung dieses anomeren Gemisches in Pyridin (1,3 l) wurde unter Kühlen und mechanischem Rühren mit Benzoylchlorid (580 ml, 5 mol) behandelt. Die Lösung wurde 12 h bei Raumtemperatur stehen gelassen und sodann unter fortgesetztem Rühren auf Eis (etwa 10 l) gegossen. Das Gemisch (ein Öl in Wasser) wurde über ein Cellite-Bett filtriert. Das resultierende Öl auf dem Cellite- Bett wurde mit Wasser (3 × 3 l) gewaschen und anschließend in Ethylacetat (3 l) gelöst. Die organische Phase wurde mit einer 5% NaHCO₃-Lösung (2 l) und Wasser (2 l) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter Erhalt von 1-O-Methyl-2,3,5-tri-O-benzoyl-α/β-L-ribofuranose 142 als dicker Sirup eingedampft. Das Öl wurde in Essigsäureanhydrid (560 ml) und Essigsäure (240 ml) gelöst. Die Lösung wurde nach Zutropfen von konzentrierter Schwefelsäure (80 ml) unter mechanischem Rühren 10 h in der Kälte (+4°C) gehalten. Anschließend wurde die Lösung unter mechanischem Rühren auf Eis (etwa 10 l) gegossen. Das Gemisch (ölige Verbindung in Wasser) wurde über ein Cellite-Bett filtriert. Der resultierende gummiartige Feststoff auf dem Cellite-Bett wurde mit Wasser (3 × 3 l) gewaschen und sodann in Dichlormethan (2,5 l) gelöst. Die organische Phase wurde mit 5% NaHCO₃ (1 l) und Wasser (2 × 2 l) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter Erhalt eines gummiartigen Feststoffes 143, der aus Ethanol 95 (Ausbeute 225 g, 44%) kristallisiert wurde, eingedampft.
Analyse von 1-O-Acetyl-2,3,5-tri-O-benzoyl-β-L-ribofuranose 143:

Fp. 129–130°C (EtOH 95 (Lit.(1) Fp. 130–131°C)
¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃): δ 8,09–7,87 (m, 6H, H_Arom), 7,62–7,31 (m, 9H, H_Arom), 6,43 (s, 1H, H₁), 5,91 (dd, 1H, H₃, J_3,4 6,7 Hz; J_3,2 4,9 Hz), 5,79 (pd, 1H, H₂, J_2,3 4,9 Hz; J_1,2 < 1), 4,78 (m, 2H, H₄ und H₅), 4,51 (dd, 1H, H₅, J_5,5' 3,1 Hz, J_5',4 5,5 Hz), 2,00 (s, 3H, CH₃CO); (entspricht handelsüblicher 1-O-Acetyl-2,3,5-tri-O-benzoyl-β-D-ribofuranose)
Massenanalyse (FAB+, GT) m/z 445 (M-OAc)+
Elementaranalyse C₂₈H₂₄O₉ berechnet C 66,66 H 4,79; gefunden C H

Reaktion 2:

Vorläufer: Adenin (Pharma-Waldhof; Ref. 400134.001 Charge 45276800)
Reaktanten: Zinn(II)-chlorid (rauchend) (Fluka; Ref. 96558); NH₃/Methanol (Methanol gesättigt mit NH₃; siehe Seite 5); Natriumsulfat (Prolabo; Ref. 28111.365)
Lösungsmittel: Acetonitril (Riedel-de Hean; Ref. 33019; destilliert über CaH₂); reines Chloroform (Acros; Ref. 22706463); reines Ethylacetat (Carlo Erba; Ref. 528299)
Referenzen: Saneyoshi, M., und Satoh, E., Synthetic Nucleosides and Nucleotides. XIII. Stannic Chloride Catalyzed Ribosylation of Serveral 6-Substituted Purines. Chem; Pharm. Bull., 27, 2518–2521 (1979); Nakayama C, and Saneyoshi M., Synthetic Nucleosides and Nucleotides. XX. Synthesis of Various 1-β-Xylofuranosyl-5-Alkyluracils and Related Nucleosides, Nucleosides, Nucleotides, 1, 139–146 (1982).

Adenin (19,6 g, 144 mmol) wurde in Acetonitril (400 ml) mit 1-O-Acetyl-2,3,5-tri-O-benzoyl-β-L-ribofuranose 143 (60 g, 119 mmol) suspendiert. Dieser Suspension wurde Zinn(II)-chlorid (rauchend) (22 ml, 187 mmol) zugesetzt. Nach 12 h wurde die Umsetzung auf ein kleines Volumen (etwa 100 ml) konzentriert, und Natriumhydrogencarbonat (110 g) und Wasser (120 ml) wurden zugesetzt. Der resultierende weiße Feststoff (Zinnsalze) wurde mit heißem Chloroform (5 × 200 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über ein Cellite-Bett filtriert. Die organische Phase wurde mit einer 5% NaHCO₃-Lösung und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter Erhalt von Verbindung 144 (60 g, farbloser Schaum) eingedampft. Der Schaum wurde mit Methanol, gesättigt mit Ammoniak (220 ml), bei Raumtemperatur vier Tage unter Rühren in einem verschlossenen Gefäß behandelt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck eingedampft, und das resultierende Pulver wurde 1 h unter Rückfluss in Ethylacetat (400 ml) suspendiert. Nach der Filtration wurde das Pulver unter Erhalt von L-Adenosin 145 (24 g, Kristalle, 75%) aus Wasser (220 ml) umkristallisiert.
Analysen für β-L-Adenosin:

Fp. 233–234°C (Wasser) (lit.(4) Fp. 235°–238°C)
¹H-NMR (200 MHz, DMSO-D₆): δ 8,34 und 8,12 (2s, 2H, H₂ und H₈), 7,37 (Is, 2H, NH₂), 5,86 (d, 1H, H_1', J_1',2' 6,2 Hz), 5,43 (m, 2H, OH_2' und OH_5'), 5,19 (d, 1H, OH_3', J 3,7 Hz), 4,60 (m, H_2'), 4,13 (m, 1H, H_3'), 3,94 (m, 1H, H_4'), 3,69–3,49 (m, 2H, H_5'a und H_5'b), (entspricht handelsüblichem D-Adenosin)
Massenanalyse (FAB+, GT) m/z 268 (M+H)⁺, 1,36(BH₂)⁺

Reaktion 3:

Reaktanten: 1,3-Dichlor-1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxan (Fluka; Ref 36520); Natriumsulfat (Prolabo; ref 28111.365)
Lösungsmittel: Pyridin 99% (Acros; Ref. 131780025); reines Ethylacetat (Carlo Erba; Ref. 528299); Acetonitril (Riedel-de Haen; Ref. 33019) Referenzen: Robins, M.J., et al., Nucleic Acid Related Compounds. 42. A General Procedure for the Efficient Deoxygenation of Secondary Alcohols. Regiospecific and Stereoselective Conversion of Ribonucleosides to 2'-Deoxynucleosides. J. Am. Chem. Soc. 105, 4059–4065 (1983).

Zu L-Adenosin 145 (47,2 g, 177 mmol), suspendiert in Pyridin (320 ml), wurde 1,3-Dichlor-1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxan (63 ml, 201 mmol) zugesetzt, und das Gemisch wurde 12 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Pyridin wurde eingedampft, und der Rückstand wurde zwischen Ethylacetat (1 l) und einer 5%igen NaHCO₃-Lösung (600 ml) verteilt. Die organische Phase wurde mit einer 0,5 N HCl-Lösung (2 × 500 ml) und Wasser (500 ml) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zur Trockene eingedampft. Der resultierende Feststoff wurde unter Erhalt von Verbindung 146 (81 g, 90%) aus Acetonitril kristallisiert.
Analysen für 3',5'-O-(1,1,3,3-Tetraisopropyl-1,3-disiloxanyl)-β-L-adenosin 146:

Fp. 97–98°C (Acetonitril) (Lit. (5) D-Enantiomer Fp. 98°C)
¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃): δ 8,28 und 7,95 (2s, 2H, H₂ und H₈), 5,96 (d, 1H, J_1',2' 1,1 Hz), 5,63 (s, 2H, NH₂), 5,10 (dd, 1H, H_3', J_3',4' 7,6 Hz, J_3',2' 5,5 Hz), 4,57 (dd, 1H, H_2', J_2',1' 1,2 Hz; J_2',3' 7,6 Hz), 4,15–3,99 (m, 3H, H_4', H_5'a und H_5'b), 3,31 (sl, 1H, OH_2'), 1,06 (m, 28H, Isopropyl-Protonen)
Massenanalyse (FAB-, GT) m/z 508 (M–H)^–, 134 (B)^–; (FAB+, GT) m/z 510 (m+H)⁺, 136 (BH₂)⁺

Reaktion 4:

Reaktanten: Dimethylaminopyridin 99% (Acros; Ref. 1482702050); Phenylchlorthiocarbonat 99% (Acros; Ref. 215490050); Tris(trimethylsilyl)silan
"TTMSS" (Fluka; Ref. 93411); α,α'-Azoisobutyronitril "AIBN" (Fluka, Ref. 11630); Natriumsulfat (Prolabo; ref 28111.365)
Lösungsmittel: Acetonitril (Riedel-de Haen; Ref. 33019); reines Ethylacetat (Carlo Erba; Ref. 528299); Dioxan p.a. (Merck; Ref. 1.09671.1000); Dichlormethan (Merck; Ref. 1.06050.6025); Methanol (Carlo Erba; Ref. 309002);
Referenz: Robins, M. J., Wilson, J.S., and Hansske, F., Nucleic Acid Related Compounds. 42. A General Procedure for the Efficient Deoxygenation of Secondary Alcohols. Regiospecific and Stereoselective Conversion of Ribonucleosides to 2'-Deoxynucleosides. J. Am. Chem. Soc., 105, 4059–4065 (1983).

Zu Verbindung 146 (34 g, 67 mmol) wurden Acetonitril (280 ml), DMAP (16,5 g, 135 mmol) und Phenylchlorthionocarbonat (10,2 ml, 73 mmol) zugesetzt. Die Lösung wurde 12 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde zwischen Ethylacetat (400 ml) und einer 0,5 N HCl-Lösung (400 ml) verteilt. Die organische Schicht wurde mit einer 0,5 N HCl-Lösung (400 ml) und Wasser (2 × 400 ml) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter Erhalt der Zwischenstufe als blassgelber Feststoff zur Trockene eingedampft. Das rohe 147 wurde in Dioxan (ml) gelöst und AIBN (3,3 g, 20 mmol) und TTMSS (33 ml, 107 mmol) wurden zugesetzt. Die Lösung wurde nacheinander unter Rückfluss erhitzt und 2 h gerührt. Die Umsetzung wurde bis auf ein gelbes Öl konzentriert, das chromatographiert wurde (Elutionsmittel Dichlormethan/Methanol 95/5), um Verbindung 148 (23 g, farbloser Schaum, 70%) zu ergeben. Ein Aliquot wurde aus Ethanol/Petrolether umkristallisiert.
Analysen für 3',5'-O-(1,1,3,3-Tetraisopropyl-1,3-disiloxanyl)-2'-deoxy-β-L-adenosin 148:

Fp. 110–111°C (EtOH/Petrolether) (Lit.(5)Fp. 113–114°C (EtOH))
¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃): δ 8,33 und 8,03 (2s, 2H, H₂ und H₈), 6,30 (dd, 1H, H_1', J 2,85 Hz, J 7,06 Hz), 5,63 (sl, 2H, NH₂), 4,96 (m, 1H, H_3'), 4,50 (m, 2H, H_5'a und H_5'b), 2,68 (m, 2H, H_2'a und H_2'b), 1,08 (m, 28H, Isopropylprotonen)
Massenanalyse (FAB+, GT) m/z 494 (M+H)⁺, 136 (BH₂)⁺

Reaktion 5:

Reaktanten: Ammoniumfluorid (Fluka; Ref. 09742); Silicagel (Merck; Ref 1.07734.2500)
Lösungsmittel: Methanol p.a. (Prolabo; Ref. 20847.295; Dichlormethan p.a. (Merck; Ref. 1.06050.6025); Ethanol 95 (Prolabo; Ref. 20823.293)
Referenz: Zhang, W. and Robins, M. J., Removal of Silyl Protecting Groups from Hydroxyl-Functions with Ammonium Fluoride in Methanol. Tetrahedron Lett., 33, 1177–1180 (192).

Eine Lösung von 3',5'-O-(1,1,3,3-Tetraisopropyl-1,3-disiloxanyl)-2'-deoxy-L-adenosin 148 (32 g, 65 mmol) und Ammoniumfluorid (32 g, mmol) in Methanol wurde unter Rückfluss 2 h gerührt. Kieselgel wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde gut eingedampft, um ein weißes Pulver zu ergeben. Dieses Pulver wurde auf eine Silicagelsäule aufgegeben, die mit Dichlormethan/Methanol 9/1 eluiert wurde. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und unter Erhalt eines weißen Pulvers, das aus Ethanol 95 (12,1 g, 75%) kristallisiert wurde, eingedampft.
Analysen für 2'-Deoxy-β-L-adenosin 149:

Fp. 189–190°C (EtOH 95) (entspricht handelsüblichem 2'Deoxy-D-adenosin)
¹H-NMR (200 MHz, DMSO-D₆): δ 8,35 und 8,14 (2s, 2H, H₂ und H₈), 7,34 (sl, 2H, NH₂), 6,35 (dd, 1H, H_1', J 6,1 Hz, J 7,85 Hz), 5,33 (d, 1H, OH_2', J 4,0 Hz) 5,28 (dd, 1H, H_3', J 4,95 Hz; J 6,6 Hz), 4,42 (m, 1H, OH5'), 3,88 (m, 1H, H_4'), 3,63–3,52 (m, 2H, H_5'a und H_5'b), 2,71 (m, 1H, H_2'a), 2,28 (m, 1H, H_2'b) (entspricht handelsüblichem 2'-Deoxy-D-adenosin)
α_D +26° (c 0,5 Wasser (handelsübliches 2'-Deoxy-D-adenosin –25° (c 0,5 Wasser)).
UV λ_max 260 nm (ε 14100) (H₂O).
Massenanalyse (FAB+, GT) m/z 252 (M+H)⁺, 136 (BH₂)⁺

Beispiel 1 Stereospezifische Synthese von 2'-Deoxy-β-L-cytidin
1-(3,5-Di-O-benzoyl-β-L-xylofuranosyl)uracil (11)
Hydrazinhydrat (1,4 ml, 28,7 mmol) wurde einer Lösung von 1-(2-O-Acetyl-3,5-di-O-benzoyl-β-L-xylofuranosyl)uracil 10 [Ref.: Gosselin, G.; Bergogne, M.-C.; Imbach, J.-L., "Synthesis and Antiviral Evaluation of β-L-Xylofuranosyl Nucleosides of the Five Naturually Occuring Nucleic Acid Bases", Journal of Heterocyclic Chemistry, 1993, 30 (Oct.–Nov.), 1229–1233] (4,79 g, 9,68 mmol) in Pyridin (60 ml) und Essigsäure (15 ml) zugesetzt. Die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Aceton (35 ml) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde 30 min gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck eingedampft. Der resultierende Rückstand wurde durch Silicagel-Säulenchromatographie [Elutionsmittel: Stufengradient von Methanol (0–4%) in Dichlormethan] gereinigt, um 11 (3,0 g, 68%) zu ergeben, das aus Cyclohexan/Dichlormethan kristallisiert wurde: Fp. = 111–114°C; ¹H-NMR (200 MHz, DMSO-d₆): δ 11,35 (br s, 1H, NH), 7,9–7,4 (m, 11H, 2 C₆H₅CO, H-6), 6,38 (d, 1H, OH-2', J_OH-2' = 4,2 Hz), 5,77 (d, 1H, H-1', J_1',2' = 1,9 Hz), 5,55 (d, 1H, H-5, J_5-6 = 8 Hz), 5,54 (dd, 1H, H-3', J_3'–2' = 3,9 Hz und J_3'–4' = 1,8 Hz), 4,8 (m, 1H, H-4'), 4,7 (m, 2H, H-5' und H-5''), 4,3 (m, 1H, H-2');
MS: FAB > 0 (Matrix GT) m/z 453 (M+H)⁺, 105 (C₆H₅CO)⁺; FAB<0 (Matrix GT) m/z 451 (M–H)^–, 121 (C₆H₅CO₂)^–, 111 (B)^–; Anal. ber. für C₂₃H₂₀N₂O₈·H₂O: C, 58,09; H, 4,76; N, 5,96. Gefunden: C, 57,71; H, 4,42; N, 5,70.
1-(3,5-Di-O-benzoyl-β-L-arabinofuranosyl)uracil (12)
Einer Lösung von 1-(3,5-Di-O-benzoyl-β-L-xylofuranosyl)uracil 11 (8 g, 17,7 ml) in einem wasserfreiem Benzol-DMSO-Gemisch (265 ml, 6:4, Vol./Vol.) wurden wasserfreies Pyridin (1,4 ml), Dicyclohexylcarbodiimid (10,9 g, 53 mmol) Dichloressigsäure (0,75 ml) zugesetzt. Das resultierende Gemisch wurde 4 h bei Raumtemperatur gerührt, anschließend mit Ethylacetat (400 ml) verdünnt, und eine Lösung von Oxalsäure (4,8 g, 53 mmol) in Methanol (14 ml) wurde zugesetzt. Nach 1 h Rühren wurde die Lösung filtriert. Das Filtrat wurde mit einer gesättigten NaCl-Lösung (2 × 500 ml), 3% NaHCO₃-Lösung (2 × 500 ml) und Wasser (2 × 500 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Na₂SO₄ getrocknet, anschließend unter reduziertem Druck eingedampft. Sodann wurde der resultierende Rückstand in einem Gemisch von absolutem EtOH-Benzol (140 ml, 2:1, Vol./Vol.) gelöst. Dieser Lösung wurde bei 0°C NaBH₄ (0,96 g, 26,5 mmol) zugesetzt. Nach 1 h Rühren wurde die Lösung mit Ethylacetat (400 ml) verdünnt und dann filtriert. Das Filtrat wurde mit einer gesättigten NaCl-Lösung (400 ml) und Wasser (400 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Na₂SO₄ getrocknet, anschließend unter reduziertem Druck eingedampft. Das resultierende Roh material wurde durch Silicagel-Säulenchromatographie [Elutionsmittel: Stufengradient von Methanol (0–3%) in Dichlormethan] gereinigt, um 12 (5,3 g, 66%) zu ergeben, das aus Acetonitril umkristallisiert wurde; Fp. = 182–183°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 11,35 (br s, 1H, NH), 8,0–7,5 (m, 11H, 2 C₆H₅CO, H-6), 6,23 (br s, 1H, OH-2'), 6,15 (d, 1H, H-1', J_1',2' = 4Hz), 5,54 (d, 1H, H-5, J₅_₆ = 8,1 Hz), 5,37 (t, 1H, H-3', J_3'–2' = J_3'–4' = 2,6 Hz), 4,7–4,6 (m, 2H, H-5' und H-5''), 4,5 (m, 1H, H-4'), 4,4 (m, 1H, H-2'); MS: FAB > 0 (Matrix GT) m/z 453 (M+H)⁺, 341 (S)⁺, 113 (BH₂)⁺, 105 (C₆H₅CO)⁺; FAB < 0 (Matrix GT) m/z 451 (M–H)^–, 121 (C₆H₅CO₂)^–, 111 (B)^–; Anal. ber. für C₂₃H₂₀N₂O₈: C, 61,06; H, 4,46; N, 6,19, gefunden: C, 60,83; H, 4,34; N, 6,25.
1-(3,5-Di-O-benzoyl-2-deoxy-β-L-erythro-pentofuranosyl)uracil (13)
Einer Lösung von 1-(3,5-Di-O-benzoyl-β-L-arabinofuranosyl 12 (5,2 g, 11,4 mmol) in wasserfreiem 1,2-Dichlorethan (120 ml) wurden Phenoxythiocarbonylchlorid (4,7 ml, 34,3 ml) und 4-(Dimethylamino)pyridin (DMAP, 12,5 g, 102,6 mmol) zugesetzt. Die resultierende Lösung wurde 1 h bei Raumtemperatur unter einer Argonatmosphäre gerührt und sodann unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (300 ml) gelöst, und die organische Lösung wurde nacheinander mit eiskalter 0,2 N Chlorwasserstoffsäurelösung (3 × 200 ml) und Wasser (2 × 200 ml) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und anschließend unter vermindertem Druck eingedampft. Das Rohmaterial wurde zusammen mit wasserfreiem Dioxan mehrmals eingedampft und in diesem Lösungsmittel (110 ml) gelöst. Der resultierenden Lösung wurden unter Argon Tris(trimethylsilyl)silanhydrid (4,2 ml, 13,7 mmol) und α,α'-Azoisobutyronitril (AIBN, 0,6 g, 3,76 mmol) zugesetzt. Das resultierende Gemisch wurde erhitzt und bei 100°C 1 h unter Argon gerührt, anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt und unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde durch Silicagel-Säulenchromatographie [Elutionsmittel: Stufengradient von Methanol (0–5%)] gereinigt, um 13 (2,78 g, 56%) zu ergeben, das aus EtOH umkristallisiert wurde: Fp. = 223–225°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 11,4 (br s, 1H, NH), 8,0–7,5 (m, 11H, 2 C₆H₅CO, H-6), 6,28 (t, 1H, H-1', J = 7 Hz), 5,5 (m, 2H, H-1' und H-5), 4,6–4,4 (m, 3H, H-4', H-5' und H-5''), 2,6 (m, 2H, H-2' und H-2''); MS: FAB > 0 (Matrix GT) m/z 437 (M+H)⁺, 3325 (S)⁺; FAB < 0 (Matrix GT) m/z 435 (M–H)^–, 111 (B)^–; Anal. ber. für C₂₃H₂₀N₂O₇: C, 63,30; H, 4,62; N, 6,42, gefunden: C, 62,98; H, 4,79; N, 6,40.
2'-Deoxy-β-L-cytidin (β-L-dC)
Lawesson-Reagens (1,72 g, 4,26 mmol) unter Argon wurde einer Lösung von 1-(3,5-Di-O-benzoyl-2-deoxy-β-L-erythro-pentofuranosyl)uracil 13 (2,66 g, 6,1 mmol) in wasserfreiem 1,2-Dichlorethan (120 ml) zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde 2 h unter Rückfluss gerührt. Das Lösungsmittel wurde anschließend unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie [Elutionsmittel: Stufengradient von Ethylacetat (0–8%) in Dichlormethan] eingedampft, um die 4-Thio-Zwischenstufe als gelben Schaum zu ergeben. Eine Lösung dieser Thio-Zwischenstufe (1,5 g, 3,31 mmol) in methanolischem Ammoniak (zuvor bei –10°C gesättigt und fest verschlossen) (50 ml) wurde bei 100°C in einem Edelstahlzylinder 3 h erhitzt und sodann auf 0°C abgekühlt. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck eingedampft. Das resultierende Rohmaterial wurde durch Silicagel-Säulenchromatographie [Elutionsmittel: Stufengradient von Methanol (0–20%) in Dichlormethan] gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, über eine Millex HV-4-Einheit (0,45 μm, Millipore) filtriert und unter reduziertem Druck eingedampft, um das gewünschte 2'-Deoxy-β-L-cytidin (β-L-dC) als Schaum (0,6 g, 80%) bereitzustellen, der aus absolutem Ethanol umkristallisiert wurde: Fp. = 198–199°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 7,77 (D, 1H, H-6, J_6-5 = 7,4 Hz), 7,10 (br d, 2H, NH_–2), 6,13 (t, 1H, H-1', J = 6,7 Hz), 5,69 (d, 1H, H-5, J_5-6 = 7,4 Hz), 5,19 (d, 1H, OH-3', J_OH-3 = 4,1 Hz), 4,96 (t, 1H, OH-5', J_OH-5' = J_OH-5'' = 5,2 Hz), 4,1 (m, 1H, H-3'), 3,75 (m, 1H, H-4'), 3,5 (m, 2H, H-5' und H-5''), 2,0 (m, 1H, H-2'), 1,9 (m, 1H, H-2''); MS: FAB > 0 (Matrix GT) m/z 228 (M+H)⁺, 112 (BH₂)⁺; FAB < 0 (Matrix GT) m/z 226 (M–H)^–; [α]²⁰ _D = –69 (c 0,52, DMSO) [[α]²⁰ _D = +76 (c 0,55, DMSO) für ein handelsübliches Hydrochloridsalz des D-Enantiomers]. Anal. ber. C₉H₁₃N₃O₄: C, 47,57; H, 5,77; N, 18,49, gefunden: C, 47,35; H, 5,68; N, 18,29.
Beispiel 2 Stereoselektive Synthese von 2'-Deoxy-β-L-cytidin (β-L-dC)
2-Amino-β-L-arabinofurano[1',2':4,5]oxazolin (1)
Ein Gemisch von L-Arabinose (170 g, 113 mol), Cyanamid (100 g, 2,38 mol), Methanol (300 ml) und 6M-NH₄OH (50 ml) wurde drei Tage bei Raumtempe ratur gerührt und sodann über Nacht bei –10°C gehalten. Das Produkt wurde durch Absaugen gesammelt, nacheinander mit Methanol und Ether gewaschen und in vacuo getrocknet. Ausbeute: 130 g (66,0%) der analytisch reinen Verbindung 1, Fp. 170–172°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ ppm 6,35 (br s, 2H, NH₂), 5,15 (d, 1H, H-1, J = 5,6 Hz), 5,45 (br s, 1H, OH-3), 4,70 (br s, 1H, OH-5), 4,55 (d, 1H, H-2, J = 5,6 Hz), 4,00 (br s, 1H, H-3), 3,65 (m, 1H, H-4), 3,25 (m, 2H, H-5, H-5').
Reagentien:

L-Arabinose: Fluka, > 99,5%, Ref. 10839
Cyanamid: Fluka, > 98%, Ref. 28330

O^2,2'-Anhydro-β-L-uridin (2)
Eine Lösung von Verbindung 1 (98,8 g, 0,57 mol) und Methylpropiolat (98 ml) in 50% wässrigem Ethanol (740 ml) wurde 5 h unter Rückfluss erhitzt, anschließend abgekühlt und unter vermindertem Druck auf die Hälfte des ursprünglichen Volumens konzentriert. Nach Ausfällen mit Aceton (600 ml) wurde das Produkt durch Absaugen gesammelt, mit Ethanol und Ether gewaschen und getrocknet. Die Mutterlauge wurde teilweise konzentriert, das Konzentrat mit Aceton (1000 ml) ausgefällt, der Feststoff durch Absaugen gesammelt und mit Aceton und Ether gewaschen, um eine weitere Ausbeute des Produkts zu liefern. Gesamtausbeute 80 g (62%) von Verbindung 2, Fp. 236–240°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ ppm 7,87 (d, 1H, H-6, J = 7,4 Hz), 6,35 (d, 1H, H-1', J = 5,7 Hz), 5,95 (d, 1H, H-5, J = 7,4 Hz), 5,90 (d, 1H, OH-3'), 5,20 (d, 1H, H-2', J = 5,7 Hz), 5,00 (m, 1H, OH-3'), 4,44 (br, s, 1H, H-3'), 4,05 (m, 1H, H-4'), 3,25 (m, 2H, H-5, H-5').
Reagens:

Methylpropionat: Fluka, > 97%, Ref. 81863

3',5'-Di-O-benzoyl-O^2,2'-anhydro-β-L-uridin (3)
Einer Lösung von Verbindung 2 (71,1 g, 0,31 mol) in wasserfreiem Pyridin (1200 ml) wurde bei 0 °C unter Argon Benzoylchlorid (80,4 ml) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 5 h bei Raumtemperatur unter Ausschluss von atmosphärischer Feuchtigkeit gerührt und durch Zugabe von Ethanol gestoppt. Die Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck eingedampft, und der resultierende Rückstand wurde zusammen mit Toluol und absolutem Methanol eingedampft. Das rohe Gemisch wurde sodann mit Ethanol verdünnt und der Niederschlag durch Absaugen gesammelt, nacheinander mit Methanol und Ether gewaschen und getrocknet. Ausbeute 129 g (95,8%) von Verbindung 3, Fp. 254°C; ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ ppm 8,1–7,4 (m, 11H, C₆H₅CO, H-6), 6,50 (d, 1H, H-1', J = 5,7 Hz), 5,90 (d, 1H, H-5, J = 7,5 Hz), 5,80 (d, 1H, H-2', J = 5,8 Hz), 5,70 (d, 1H, H-3'), 4,90 (m, 1H, H-4'), 4,35 (m, 2H, H-5, H-5').
Reagens:

Benzoylchlorid: Fluka, p.a., Ref. 12930

3',5'-Di-O-benzoyl-2'-chlor-2'-deoxy-β-L-uridin (4)
Einer Lösung von Verbindung 3 (60,3 g, 0,139 mol) in Dimethylformamid (460 ml) wurde bei 0°C eine 3,2 N HCl/DMF-Lösung (208 ml, hergestellt in situ durch Zugabe von 47,2 ml Acetylchlorid bei 0°C zu einer Lösung von 27,3 ml Methanol und 133,5 ml Dimethylformamid) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Ausschluss von atmosphärischer Feuchtigkeit 1 h bei 100°C gerührt, abgekühlt und in Wasser (4000 ml) gegossen. Der Niederschlag der Verbindung 4 wurde durch Absaugen gesammelt, mit Wasser gewaschen und aus Ethanol umkristallisiert. Die Kristalle wurden gesammelt, mit kaltem Ethanol und Ether gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 60,6 g (92,6%) von Verbindung 4, Fp. 164–165°C; ¹H- NMR (DMSO-d₆): δ ppm 8,7 (br s, 1H, NH), 8,1–7,3 (m, 11H, C₆H₅CO, H-6), 6,15 (d, 1H, H-1', J = 4,8 Hz), 5,50 (m, 2H, H-5, H-2'), 4,65 (m, 4H, H-3', H-4',
Reagens:

Acetylchlorid: Fluka, p.a., Ref. 00990

3',5'-Di-O-benzoyl-2'-deoxy-β-L-uridin (5)
Ein Gemisch von Verbindung 4 (60,28 g, 0,128 mol), Tri-n-butylzinnhydrid (95 ml) und Azabisisobutyronitril (0,568 g) in trockenem Toluol (720 ml) wurde unter Rühren 5 h unter Rückfluss erhitzt und abgekühlt. Der Feststoff wurde durch Absaugen gesammelt und mit kaltem Toluol und Petrolether gewaschen. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck konzentriert und mit Petrolether verdünnt, um eine zusätzliche Ausbeute an Verbindung 5 auszufällen. Ausbeute 54,28 g (97,2%) von Verbindung 5; Fp. 220–221°C; ¹H-NMR (CDCl₃): δ ppm 8,91 (br s, 1H NH), 8,1–7,5 (m, 11H, C₆H₅CO und H-6), 6,43 (q, 1H, H-1', J_1',2' = 5,7 Hz und J_1',2'' = 8,3 Hz), 5,7–5,6 (m, 2H, H-3' und H-5), 4,8–4,6 (m, 3H, H-5', H-5'' und H-4'), 2,8–2,7 (m, 1H, H-2'), 2,4–2,3 (m, 1H, H-2'').
Reagentien:

Tri-n-butylzinnhydrid: Fluka, > 98%, Ref. 90915
Azabisisobutyronitril: Fluka, > 98%, Ref. 11630

3',5'-Di-O-benzoyl-2'-deoxy-β-L-4-thio-uridin (6)
Einer Lösung von Verbindung 5 (69 g, 0,158 mol) und Lawesson-Reagens (74 g) in wasserfreiem Methylchlorid (3900 ml) wurde über Nacht unter Argon unter Rückfluss erhitzt. Nach Eindampfen des Lösungsmittels wurde der rohe Rückstand durch Silicagel-Säulenchromatographie [Elutionsmittel: Gradient von Methanol (0–2%) in Methylenchlorid] gereinigt, um die reine Verbindung 6 (73 g) in quantitativer Ausbeute zu ergeben; ¹H-NMR (CDCl₃): δ ppm 9,5 (br s, 1H, NH), 8,1–7,4 (m, 10H, C₆H₅CO), 7,32 (d, 1H, H-6, J = 7,7 Hz), 6,30 (dd, 1H, H-1', J = 5,6 Hz und J = 8,2 Hz), 6,22 (d, 1H, H-5, J = 7,7 Hz), 5,6 (m, 1H, H-3'), 4,7 (m, 2H, H-5', H-5''), 4,5 (m, 1H, H-4'), 2,8 (m, 1H, H-2'), 2,3 (m, 1H, H-2'').
Reagens:

Lawesson-Reagens: Fluka, >98%, Ref. 61750

2'-Deoxy-β-L-cytosin
Einer Lösung von Verbindung 6 (7,3 g, 0,016 mol) in Methanol, gesättigt mit Ammoniak (73 ml), wurde 3 h bei 100°C in einem Edelstahlzylinder erhitzt. Nach sorgfältigem Abkühlen wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck eingedampft. Eine wässrige Lösung des Rückstands wurde mit Ethylacetat gewaschen und zur Trockene eingedampft. Eine solche Verfahrensweise wurde an 9 weiteren Proben (jeweils 7,3 g) von Verbindung 6 (Gesamtmenge von 6 = 73 g) durchgeführt. Die 10 Rückstände wurden vereinigt, mit absolutem Methanol verdünnt und unter Erhalt von 7 als Kristalle abgekühlt. Spuren von Benzamid wurden aus den Kristallen von 6 durch ein Fest-Flüssig-Extraktionsverfahren (1 h unter Rückfluss in Ethylacetat) beseitigt. Ausbeute 28,75 g (78,6%) von Verbindung 6; Fp. 141–145°C; ¹H-NMR (DMSO): δ ppm 8,22 und 8,00 (2 br s, 2H, NH₂), 7,98 (d, 1H, H-6, J = 7,59 Hz), 6,12 (t, 1H, H-1', J = 6,5 Hz und J = 7,6 Hz), 5,89 (d, 1H, H-5, J = 7,59 Hz), 5,3 (br s, 1H, OH-3'), 5,1 (br s, 1H, OH-5'), 4,2 (m, 1H, H-3'), 3,80 (q, 1H, H-4', J = 3,6 Hz und J = 6,9 Hz), 3,6–3,5 (m, 2H, H-5', H-5''), 2,2–2,0 (m, 2H, H-2', H-2''); FAB < 0, (GT) m/e 226 (M–H)^–, 110 (B)^–; FAB > 0 (GT) 228 (M+H)⁺; 112 (B+2H)⁺ [α]_D ²⁰ –56,48 (c = 1,08 in DMSO); UV (pH 7) λ_max = 270 nm (ε = 10000).
Reagens:

Methanolisches Ammoniak: vorher bei –5°C gesättigt, fest verschlossen und in einem Gefrierschrank aufbewahrt.

Beispiel 3 Stereoselektive Synthese von 2'-Deoxy-β-L-Thymidin (β-L-dT)
3',5'-Di-O-benzoyl-2'-deoxy-5-iodo-β-L-uridin (7)
Ein Gemisch von Verbindung 5 (105,8 g, 0,242 mol), Iod (76,8 g), CAN (66,4 g) und Acetonitril (2550 ml) wurde 3 h bei 80°C gerührt, und anschließend wurde das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur abgekühlt, was zur Auskristallisation von Verbindung 7 (86,6 g, 63,5%) führte; Fp. 192–194°C; ¹H-NMR (DMSO): δ ppm 8,34 (s, 1H, NH), 8,2–7,2 (m, 11H, 2 C₆H₅CO, H-6), 6,31 (q, 1H, H-1', J = 5,5 Hz und J = 8,7 Hz), 5,5 (m, 1H, H-3'), 4,7 (m, 2H, H-5', H-5''), 4,5 (m, 1H, H-4'), 2,7 (m, 1H, H-2'), 2,3 (m, 1H, H-2''); FAB < 0, (GT)m/e 561 (M–H)^–, 237/B)^–; FAB > 0 (GT) 563 (M+H)⁺; [α]_D ²⁰ +39.05 (c = 1,05 in DMSO); UV (EtOH 95) λ_max = 281 nm (ε = 9000), λ_min = .254 nm (ε = 4000), λ_max = 229 nm (ε = 31000); Anal. ber. für C₂₃H₁₉IN₂O₇: C, 49,13 H, 3,41 N, 4,98 I, 22,57, gefunden: C, 49,31 H, 3,53 N, 5,05 I, 22,36.
Reagens:

Iodin: Fluka, 99,8%, Ref. 57650
Cerammoniumnitrat (CAN): Aldrich, > 98,5%, Ref. 21,547-3

3',5'-Di-O-benzoyl-2'-deoxy-3-N-Toluol-β-L-thymidin (9)
Einer Lösung von Verbindung 7 (86,6 g, 0,154 mol) in wasserfreiem Pyridin (1530 ml), enthaltend N-Ethyldiisopropylamin (53,6 ml), wurde portionsweise bei 0 °C p-Toluolchlorid (40,6 ml) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt, anschließend wurde zum Stoppen der Umsetzung Wasser zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Phase wurde mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter Erhalt von rohem 3',5'-Di-O-benzoyl-2'-deoxy-3-N-toluoyl-5-iod-β-L-uridin (8) zur Trockene eingedampft, welches im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet werden kann.
Eine Lösung des rohen Gemisches 8, Palladiumacetat (3,44 g), Triphenylphosphin (8,0 g) in N-Methylpyrrolidinon (1375 ml) mit Triethylamin (4,3 ml) wurde 45 min bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde bei 0°C unter Argon Tetramethylzinn (42,4 ml) zugetropft. Nach Rühren bei 100–110°C über Nacht wurde das Reaktionsgemisch in Wasser gegossen und mit Diethylether extrahiert. Die organische Lösung wurde über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch Silicagel-Säulenchromatographie [Elutionsmittel: Stufengradient von Ethylacetat (0–10%) in Toluol] gereinigt, um Verbindung 9 als Schaum (42,3 g, 48,3% für die 2 Stufen) zu ergeben.
¹H-NMR (DMSO) δ ppm 8,3–7,2 (m, 15H,2 C₆H₅CO, 1 CH₃C₆H₄CO, H-6), 6,29 (t, 1H, H-1', J = 7,0 Hz), 5,7 (m, 1H, H-3'), 4,7–4,5 (m, 3H, H-5', H-5'',H- 4'), 2,7–2,6 (m, 2H, H-2', H-2''); FAB < 0, (GT) m/e 567 (M–H)^–, 449 (M-CH₃C₆H₄CO)'', 243 (B)^–, 121 (C₆H₅COO)^–; FAB > 0 (GT) 1137 (2M+H)⁺, 569 (M+H)⁺, 325 (M–B)^–, 245 (B+2H)⁺, 119 (CH₃C₆H₅CO)⁺.
Reagentien:

p-Toluoylchlorid, Aldrich, 98%, Ref. 10,663-1
Diisopropylethylamin: Aldrich, > 99,5%, Ref. 38,764-9
N-Methylpyrrolidinon: Aldrich, > 99%, Ref. 44,377-8
Palladiumacetat: Alrich, > 99,98%, Ref. 37,987-5
Triphenylphosphin: Fluka, > 97%, Ref. 93092
Tetramethylzinn: Aldrich, > 99%, Ref. 14,647-1

2'-Deoxy-b-L-thymidin
Eine Lösung von Verbindung 9 (42,3 g, 0,074 mol) in Methanol, gesättigt mit Ammoniak (1850 ml), wurde 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Nach Eindampfen des Lösungsmittels wurde der Rückstand mit Wasser verdünnt und mehrmals mit Ethylacetat gewaschen. Die wässrige Schicht wurde abgetrennt, unter vermindertem Druck eingedampft, und der Rückstand wurde durch Silicagel-Säulenchromatographie [Elutionsmittel: Stufengradient von Methanol (0–10%) in Methylenchlorid] gereinigt, um reines 2'-Deoxy-β-L-thymdin (11,62 g, 64,8%) zu ergeben, welches aus Ethanol umkristallisiert wurde: Fp. 185–188°C.
¹H-NMR (DMSO): δ ppm 11,3 (s, 1H, NH), 7,70 (s, 1H, H-6), 6,2 (pt, 1H, H-1'), 5,24 (d, 1H, OH-3', J = 4,2 Hz), 5,08 (t, 1H, OH-5', J = 5,1 Hz), 4,2 (m, 1H, H-3'), 3,7 (m, 1H, H-4'), 3,5–3,6 (m, 2H, H-5', H-5''), 2,1–2,0 (m, 2H, H-2', H-2''); FAB < 0, (GT) m/e 483 (2M–H)^–, 349 (M+T–H)^–, 241 (M–H)^–, 125 (B)^–; FAB > 0 (GT) 243 (M+H)⁺, 127 (B+2H)⁺;)⁺; [α]_D ²⁰ –13,0 (c = 1,0 in DMSO); UV (pH 1) λ_max = 267 nm (ε = 9700), λ_min = 234 nm (ε = 2000).
Reagens:

Referenzbeispiel 3 Stereoselektive Synthese von 2'-Deoxy-β-L-inosin (β-L-dI)
β-L-dI wurde durch Deaminierung von 2'-Deoxy-β-L-adenosin (β-L-dA), unter Befolgung der zuvor in der 9-D-Glucopyranosyl-Reihe beschriebenen Vorgehensweise (Ref: I. Iwai, T. Nishimura und B. Shimizu, Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry, W. W. Aorbach und R.S. Tipson, Hrsg. John Wiley & Sons, Inc. New York, Bd. 1, SS. 135–138 (1968)) synthetisiert.
Somit wurde eine Lösung von β-L-dA (200 ml) in einem Gemisch von Essigsäure (0,61 ml) und Wasser (19 ml) mit Natriumnitrit (495 mg) erhitzt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Anschließend wurde die Lösung unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Eine wässrige Lösung des Rückstands wurde auf eine Säule von IR-120 (H⁺)-Ionenaustauscherharz aufgetragen, und die Säule wurde mit Wasser eluiert. Die entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt und unter Erhalt von reinem β-L-dI zur Trockene eingedampft, welches aus Methanol (106 mg, 53% Ausbeute nicht optimiert) kristallisiert wurde: Fp. = 209°–211°C; UV (H₂O), λ_max = 247 nm; ¹H-NMR (DMSO-d₆) = 8,32 und 8,07 (2s, jeweils 1H, H-2 und H-8), 6,32 (pt, 1H, H-1; J = 6,7 Hz), 4,4 (m, 1H, H-3'), 3,9 (m, 1H, H-4'), 3,7–3,4 (m, 2H teilweise verdeckt durch HOD, H-5', 5''), 2,6 und 2,3 (2m, jeweils 1H, H-2' und H-2''); Massenspektren (gereift, Glycerin-Thioglycerin, 1:1, Vol./Vol.), FAB > 0: 253 (M+H)⁺, 137 (Base + 2H)⁺; FAB < 0: 251 (M–H)^–, 135 (Base)^–; [α]_D ²⁰ = +19,3 (–c 0,88, H₂O).
Anti-HBV-Aktivität der aktiven Verbindungen
Die Fähigkeit der aktiven Verbindungen zur Hemmung des Viruswachstums in 2.2.15-Cellkulturen (HepG2-Zellen, transformiert mit dem Hepatitis-Virion), kann wie nachstehend ausführlich beschrieben bewertet werden.
Eine Zusammenfassung und Beschreibung des Tests auf die antiviralen Wirkungen in diesem Kultursystem und der Analyse von HBV-DNA wurden bereits beschrieben (Korba und Milman, 1991, Antiviral Res., 15: 217). Die antivirale Bewertung werden an zwei getrennten Zell-Durchgängen durchgeführt. Sämtliche Vertiefungen auf allen Platten werden in der gleichen Dichte und zur gleichen Zeit angesät.
Aufgrund der von Natur aus vorhandenen Schwankungen in den Konzentrationen sowohl von intrazellulärer als auch extrazellulärer HBV-DNA, werden nur Absenkungen von größer als 3,5-fach (für HBV-Virion-DNA) oder von 3,0-fach (für HBV-DNA-Replikationszwischenstufen) von der durchschnittlichen Konzentratation dieser HBV-DNA-Formen in unbehandelten Zellen als statistisch signifikant (P < 0,05) betrachtet. Die Konzentratationen von integrierter HBV-DNA in jeder zellulären DNA-Präparation (die auf der Grundlage pro Zelle bei diesen Experimenten konstant bleiben) werden zur Berechnung der Konzentratationen der intrazellulären HBV-DNA-Formen verwendet, um dadurch sicherzustellen, dass zwischen getrennten Proben gleiche Mengen von zellulärer DNA verglichen werden.
Typische Werte für extrazelluläre HBV-Virion-DNA in unbehandelten Zellen reichen von 50 bis 150 pg/ml Kulturmedium (Mittelwert von etwa 76 pg/ml). Intrazelluläre HBV-DNA-Replikationszwischenstufen in unbehandelten Zellen reichen von 50 bis 100 μg/pg Zell-DNA (Mittelwert etwa 74 pg/μg Zell-DNA).
Im Allgemeinen sind die Absenkungen in den Konzentrationen der intrazellulären HBV-DNA aufgrund einer Behandlung mit antiviralen Verbindungen weniger prominent und treten langsamer auf als Absenkungen in den Konzentrationen der HBV-Virion-DNA (Korba an Milman, 1991, Antiviral Res., 15: 217).
Die Art, auf die die Hybridisierungsanalysen für diese Experimente durchgeführt wurden, ergibt eine Äquivalenz von etwa 1,0 pg intrazellulärer HBV-DNA gegenüber 2–3 Genomkopien pro Zelle und 1,0 pg/ml extrazellulärer HBV-DNA zu 3 × 10⁵ Virus-Partikel/ml.
Beispiel 4
Die Fähigkeit der Triphosphat-Derivate von β-L-dA, β-L-dC, β-L-dU, β-L-2'-dG, β-L-dI und β-L-dT zur Hemmung von Hepatitis B wurde getestet. Tabelle 1 beschreibt die inhibitorischen Vegleichsaktivitäten der Triphosphate von β-L-dT (β-L-dT-TP), β-L-dC (β-L-dC-TP), β-L-dU (β-L-dU-TP) und β-L-dA (β-L-dA-TP) auf Woodchuck-Hepatitis-Virus (WHV)-DNA-Polymerase und die menschlichen DNA-Polymerasen α, β und γ.
Tabelle 1

^aIC₅₀: 50% Inhibitorkonzentration
^bK_i-Wert wurde bestimmt unter Verwendung von Kälberthymus-aktivierter DNA als Templat-Primer und dATP als Substrat. Die Inhibitoren wurden durch die Dixon-Plot-Analyse analysiert. Unter diesen Bedingungen betrug der berechnete Mittelwert K_m der menschlichen DNA-Polymerase α für dATP etwa 2,6 μM. Menschliche DNA-Polymerase β zeigte einen Gleichgewichtszustand K_m von 3,33 μM für dATP. Menschliche DNA-Polymerase γ zeigte einen Gleichgewichtszustand K_m von 5,2 μM.

Beispiel 5
Die anti-Hepatitis-B-Virusaktivität von β-L-dA, β-L-dC, β-L-dU, β-L-2'-dG und β-L-dT wurde in transfizierten Hep G-2 (2.2.15)-Zellen getestet. Tabelle 2 erläutert die Wirkung von β-L-dA, β-L-dC, β-L-dU und β-L-dT auf die Hepatitis-B-Virusreplikation in transfizierten Hep-G-2 (2.2.15)-Zellen.
Tabelle 2

^aextrazelluläre DNA
^breplikative Zwischenstufen (intrazelluläre DNA)

Beispiel 6
Die Wirkung von β-L-dA, β-L-dC und β-L-dT wurde in Kombination auf das Wachstum von Hepatitis B in 2.2.15-Zellen gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 bereitgestellt.
Tabelle 3
Jede Kombination erzeugte eine anti-HBV-Aktivität, die synergistisch war. Zusätzlich war auch die Kombination von L-dA + L-dC + L-dT in diesem Modell synergistisch.
Beispiel 7
Die Hemmung der Hepatitis-B-Replikation in 2.2.15-Zellen durch β-L-dA und β-L-dC allein und in Kombination wurden gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4

^aβ-L-2'-Deoxy-adenosin: IC₅₀ = 0,09 μM
^bβ-L-2'Deoxy-cytidin: IC₅₀ = 0,06 μM
^cDie kombinierten Indexwerte geben eine synergistische Wirkung (< 1), eine additive Wirkung (= 1) und eine antagonistische Wirkung (> 1) an.

Beispiel 8

Die Wirksamkeit von L-dA, L-dT und L-dC gegen eine Hepadnavirus-Infektion in Murmeltieren (Marmota monax), die mit dem Murmeltier- Hepatitis-Virus (WHV) chronisch infiziert waren, wurde bestimmt. Dieses Tiermodel der HBV-Infektion ist weithin akzeptiert und hat sich zur Bewertung von gegen HBV gerichteten antiviralen Mitteln als geeignet erwiesen. Protokoll: Experimentelle Gruppen (n = 3 Tiere/Arzneimittelgruppe, n = 4 Tiere/Kontrolle)

Gruppe 1	Vehikelkontrolle
Gruppe 2	Lamivudin (3TC) (10 mg/kg/Tag)
Gruppen 3–6	L-dA (0,01, 0,1, 1,0, 10 mg/kg/Tag
Gruppen 7–10	L-dT (0,01, 0,1, 1,0, 10 mg/kg/Tag)
Gruppen 11–14	L-dC (0,01, 0,1, 1,0, 10 mg/kg/Tag)

Die Arzneimittel wurden durch orale, einmal tägliche Gabe verabreicht und Blutproben wurden an den Tagen 0, 1, 3, 7, 14, 21, 28 und an den Tagen +1, +3, +7, +14, +28 und +56 nach der Behandlung genommen. Die Bewertung von Aktivität und Toxizität beruhte auf der Reduktion von WHV-DNA im Serum: Dot-Blot, quantitative PCR.
Die Ergebnisse sind in 3 und Tabelle 5 erläutert. Tabelle 5 Antivirale Aktivität von LdA, LdT, LdC im Murmeltier-Modell der chronischen HBV-Infektion

¹LdA, LdT, LdC, einmal täglich mit 10 mg/kg oral verabreicht
²die Nachweisgrenze beträgt 1 ng/ml WHV-DNA pro ml Serum

Die Daten zeigen, dass L-dA, L-dT und L-dC in diesem in vivo Modell hochwirksam sind. Erstens wird die Virus-Befrachtung auf nicht nachweisbare (L-dT) oder nahezu nicht nachweisbare (L-dA, L-dC)-Spiegel reduziert. Zweitens hat sich gezeigt, dass L-dA, L-dT und L-dC in diesem Modell aktiver sind als 3TC (Lamivudin). Drittens wird für mindestens zwei Wochen nach dem Absetzen von L-dT kein Aufleben des Virus nachgewiesen. Viertens legen die Dosis-Reaktionskurven nahe, dass eine moderate Zunahme in der Dosis von L-dA und L-dC eine L-dT entsprechende antivirale Aktivität zeigt. Fünftens nahmen sämtliche Tiere, die das Arzneimittel erhielten, an Gewicht zu, und es wurde keine mit dem Arzneimittel zusammenhängende Toxizität nachgewiesen.
Toxizität der Verbindungen
Die Toxizitätsanalyse wurde durchgeführt, um zu bewerten, ob die beobachteten antiviralen Wirkungen auf einer allgemeinen Wirkung auf die Zell-Überlebensfähigkeit beruhen. Das angewandte Verfahren besteht in der Messung der Wirkung von β-L-dA, β-L-dC und β-L-dT auf das Zellwachstum in Chlorogentests mit menschlichem Knochenmark im Vergleich zu Lamuvidin. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 bereitgestellt.
Tabelle 6
Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen
Menschen, die an einer der hier beschriebenen Störungen einschließlich Hepatitis B leiden, können durch Verabreichung an den Patienten einer wirksamen Menge eines β-L-2'-Deoxycytidins oder β-L-2'-Deoxythymidins oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon in Gegenwart eines pharmazeutisch verträglichen Trägers oder Verdünnungsmittels behandelt werden. Die aktiven Materialien können durch jeden geeigneten Weg verabreicht werden, beispielsweise oral, parenteral, intravenös, intradermal, subkutan oder topisch, in flüssiger oder fester Form.
Die aktive Verbindung wird in den pharmazeutisch verträglichen Träger oder das pharmazeutisch verträgliche Verdünnungsmittel in einer Menge eingeschlossen, die ausreicht, um an einen Patienten eine therapeutisch wirksame Menge der Verbindung abzugeben, um die Virus-Replikation in vivo zu hemmen, ohne in dem behandelten Patienten gravierende toxische Wirkungen herbeizuführen. "Inhibitorische Menge" bedeutet eine Menge an Wirkstoff, die ausreicht, um eine inhibitorische Wirkung auszuüben, wie bei spielsweise durch einen Test gemessen, wie diejenigen, die hier beschrieben sind.
Eine bevorzugte Dosis der Verbindung für alle der oben erwähnten Bedingungen liegen im Bereich von etwa 1 bis 50 mg/kg, vorzugsweise von etwa 1 bis 20 mg/kg Körpergewicht pro Tag, allgemeiner von 0,1 bis etwa 100 mg/kg Körpergewicht des Empfängers pro Tag.
Zweckmäßigerweise wird die Verbindung in jeder zweckmäßigen Darreichungsform verabreicht, einschließlich einer, die 7 bis 3000 mg, vorzugsweise 70 bis 1400 mg Wirkstoff pro Dosierungseinheitsform enthält, jedoch nicht darauf beschränkt ist. In der Regel ist eine orale Dosis von 50 bis 1000 mg zweckmäßig.
Idealerweise sollte der Wirkstoff verabreicht werden, um Plasma-Peak-Konzentrationen der aktiven Verbindung von etwa 0,2 bis 70 μM, vorzugsweise von etwa 1,0 bis 10 μM, zu erreichen. Dies kann beispielsweise durch intravenöse Injektion einer 0,1 bis 5%igen Lösung des Wirkstoffs, gegebenenfalls in Salzlösung oder durch Verabreichung des aktiven Wirkstoffs als Bolus, erreicht werden.
Die Konzentration der wirksamen Verbindung in der Arzneimittelzubereitung hängt von der Absorption, Inaktivierung und von den Ausscheidungsgeschwindigkeiten des Arzneimittels sowie anderen Faktoren, die den Fachleuten bekannt sind, ab. Anzumerken ist, dass die Dosierungsgrößen ebenfalls mit der Schwere des zu lindernden Zustands variieren. Es ist ferner selbstverständlich, dass für jedes bestimmte Individuum spezielle Dosierungsvorgaben je nach individuellem Bedürfnis und fachlicher Bewertung der verabreichenden Person oder der die Verabreichung der Zubereitungen überwachenden Person zeitlich eingestellt werden sollten und dass die hier angegebenen Konzentrationsbereiche nur beispielhaft sind und nicht den Umfang oder die Praxis der beanspruchten Zubereitung einschränken sollen. Der Wirkstoff kann auf einmal verabreicht werden, oder er kann in eine Anzahl von kleineren Dosen, die in verschiedenen Zeitintervallen verabreicht werden, aufgeteilt sein.
Eine bevorzugte Verabreichungsweise der wirksamen Verbindung ist oral. Orale Zubereitungen umfassen im Allgemeinen ein inertes Verdünnungsmittel oder einen essbaren Träger. Sie können in Gelatinekapseln eingeschlossen oder zu Tabletten verdichtet sein. Für den Zweck der oralen therapeutischen Verabreichung kann die wirksame Verbindung in Exzipientien eingearbeitet sein und in Form von Tabletten, Lutschpastillen oder Kapseln eingesetzt werden. Pharmazeutisch kompatible Bindemittel und/oder Hilfsmaterialien können als Teil der Zubereitung eingeschlossen sein.
Die Tabletten, Pillen, Kapseln, Lutschpastillen und dergleichen können jeden der folgenden Bestandteile oder Verbindungen von ähnlicher Natur enthalten: ein Bindemittel, wie mikrokristalline Cellulose, Tragacanth oder Gelatine. Ein Excipiens, wie Stärke oder Lactose, eine Zerfallshilfe, wie Alginsäure, Primogel oder Stärke; ein Gleitmittel, wie Magnesiumstearat oder Sterote; ein Gleitmittel, wie kolloidales Siliciumdioxid; ein Süßungsmittel, wie Saccharose oder Saccharin; oder ein Aromastoff, wie Pfefferminze, Methylsalicylat oder Orangengeschmack. Wenn die Darreichungsform eine Kapsel ist, kann sie zusätzlich zu dem Material des obigen Typs einen flüssigen Träger, wie eine Fettsäureöl, enthalten. Zusätzlich können die Darreichungsformen verschiedene andere Materialien enthalten, die die physikalische Form der Darreichungsform modifiziert, beispielsweise Überzüge aus Zucker, Schellack oder anderen magensaftresistenten Mitteln.
Die Verbindung kann als Bestandteil eines Elixiers, einer Suspension, eines Sirups, einer Waffel, eines Kaugummis oder dergleichen verabreicht werden. Ein Sirup kann zusätzlich zu den wirksamen Verbindungen Saccharose als Süßungsmittel und bestimmte Konservierungsstoffe, Farbstoffe, Farbmittel und Aromastoffe enthalten.
Die Verbindung oder ein pharmazeutisch verträgliches Derivat oder Salze davon können auch mit anderen wirksamen Materialien, die die gewünschte Wirkung nicht beeinträchtigen oder mit Materialien, die die gewünschte Wirkung ergänzen, wie Antibiotika, Fungizide, Entzündungshemmer, Proteasehemmer oder andere Nucleosid- oder nichtnucleosidische antivirale Mittel, vermischt werden. Lösungen oder Suspensionen, die zur parenteralen, intradermalen, subkutanen oder topischen Anwendungen verwendet werden, können die folgenden Bestandteile enthalten: ein steriles Verdünnungsmittel, wie Wasser zur Injektion, Salzlösung, nichtflüssige Öle, Polyethylenglycole, Glycerin, Propylenglycol oder andere synthetische Lösungsmittel; antibakterielle Mittel, wie Benzylalkohol oder Methylparabene; Antioxidantien, wie Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit; Chelatbildner, wie Ethylendiamintetraessigsäure, Puffer, wie Acetate, Citrate oder Phosphate und Mittel zur Einstellung der Tonizität, wie Natriumchlorid oder Dextrose. Die parenterale Präparation kann in Ampullen, Einmalspritzen oder in aus Glas oder Kunststoff hergestellten Mehrdosisröhrchen eingeschlossen sein.
Bei intravenöser Verabreichung sind physiologische Salzlösung oder phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) bevorzugte Träger.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die wirksamen Verbindungen mit Trägern hergestellt, die die Verbindung gegen schnelles Ausscheiden aus dem Körper schützen, wie eine kontrolliert freisetzende Formulierung, einschließlich von Implantaten und mikroverkapselten Abgabesystemen. Es können biologisch abbaubare biokompatible Polymere verwendet werden, wie Ethylvinylacetat, Polyanhydride, Polyglycolsäure, Collagen, Polyorthoester und Polymilchsäure. Verfahren zur Herstellung solcher Formulierungen sind den Fachleuten bekannt. Die Materialien können auch von Alza Corporation im Handel bezogen werden.
Liposomen-Suspensionen (einschließlich Liposomen, die auf infizierte Zellen gerichtet sind, mit monoklonalen Antikörpern gegen virale Antigene) sind ebenfalls als pharmazeutisch verträgliche Träger bevorzugt. Diese können nach den Fachleuten bekannten Verfahren hergestellt werden, beispielsweise wie in der U.S.-Patentschrift Nr. 4,522,811 beschrieben. Beispielsweise können Liposomenformulierungen durch Auflösen entsprechender Lipid(e) (wie Stearoylphosphatidylethanolamin, Stearoylphosphatidylcholin, Arachadoylphosphatidylcholin und Cholesterin) in einem anorganischen Lösungsmittel hergestellt werden, das dann verdampft wird, wobei ein Dünnfilm oder getrocknetes Lipid auf der Oberfläche des Behälters zurückbleibt. Anschließend wird eine wässrige Lösung der wirksamen Verbindung oder ihres Monophosphat-, Diphosphat- und/oder Triphosphatderivats in den Behälter eingebracht. Der Behälter wird sodann per Hand geschwenkt, um Lipidmaterial von den Seiten des Behälters freizusetzen und um Lipidaggregate zu dispergieren, wobei sich die Liposomen-Suspension bildet.

Claims

Verwendung einer wirksamen Menge eines β-L-2'-Deoxynucleosids der Formel
oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Hepatitis B-Virusinfektion in einem Wirt.
Verwendung einer wirksamen Menge eines β-L-2'-Deoxynucleosids der Formel
oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Hepatitis B-Virusinfektion in einem Wirt.
Verwendung einer wirksamen Menge einer Kombination der folgenden β-L-2'-Deoxynucleoside
oder pharmazeutisch verträglicher Salze davon bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Hepatitis B-Virusinfektion in einem Wirt.
Verwendung einer wirksamen Menge eines β-L-2'-Deoxynucleosids der Formel
oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon in Kombination oder abwechselnd mit einer wirksamen Menge einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus β-L-2-Hydroxymethyl-5-(cytosin-1-yl)-1,3-oxathiolan (3TC), cis-2-Hydroxymethyl-5-(5-fluorocytosin-1-yl)-1,3-oxathiolan (FTC), β-L-2'-Fluor-5-methylarabinofuranolyl-uridin (L-FMAU), β-D-2,6-Diaminopurindioxolan (DAPD), Famiciclovir, Penciclovir, 2-Amino-1,9-dihydro-9-[4-hydroxy-3-(hydroxymethyl)-2-methylencyclopentyl]-6H-purin-6-on (Entecavir, BMS-200475), 9-[2-(Phosphonomethoxy)ethyl]adenin (PMEA, Adefovir, Dipivoxil); Lobucavir, Ganciclovir und Ribavirin; bei der Herstellung eines neuen Medikaments zur Behandlung einer Hepatitis B-Virusinfektion in einem Wirt.
Verwendung einer wirksamen Menge eines β-L-2'-Deoxynucleosids der Formel
oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon in Kombination oder abwechselnd mit einer wirksamen Menge einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus β-L-2-Hydroxymethyl-5-(cytosin-1-yl)-1,3-oxathiolan (3TC), cis-2-Hydroxymethyl-5-(5-fluorocytosin-1-yl)-1,3-oxathiolan (FTC), β-L-2'-Fluor-5-methylarabinofuranolyl-uridin (L-FMAU), β-D-2,6-Diaminopurindioxolan (DAPD), Famiciclovir, Penciclovir, 2-Amino-1,9-dihydro-9-[4-hydroxy-3-(hydroxymethyl)-2-methylencyclopentyl]-6H-purin-6-on (Entecavir, BMS-200475), 9-[2-(Phosphonomethoxy)ethyl]adenin (PMEA, Adefovir, Dipivoxil); Lobucavir, Ganciclovir und Ribavirin; bei der Herstellung eines neuen Medikaments zur Behandlung einer Hepatitis B-Virusinfektion in einem Wirt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das β-L-2'-Deoxynucleosid zu mindestens 95% in seiner bezeichneten enantiomeren Form vorliegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das β-L-2'-Deoxynucleosid in einem pharmazeutisch verträglichen Träger verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei der pharmazeutisch verträgliche Träger zur oralen Abgabe geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei der pharmazeutisch verträgliche Träger zur intravenösen Abgabe geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei der pharmazeutisch verträgliche Träger zur parenteralen Abgabe geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei der pharmazeutisch verträgliche Träger zur intradermalen Abgabe geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei der pharmazeutisch verträgliche Träger zur subkutanen Abgabe geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei der pharmazeutisch verträgliche Träger zur topischen Abgabe geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das β-L-2'-Deoxynucleosid in Form einer Dosierungseinheit vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Dosierungseinheit 10 bis 1500 mg des β-L-2'-Deoxynucleosids enthält.
Verwendung nach Anspruch 14 oder 15, wobei die Dosierungseinheit eine Tablette oder Kapsel ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei der Wirt ein Mensch ist.