-
BEREICH DER ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zum
Stimulieren einer B-Zell-Immunreaktion in vivo. Neue biologische
Werkzeuge, Therapeutika und Prophylaktika, umfassend chimäre oder
konjugierte virusähnliche
Partikel, und Verfahren, die für
das vorher Genannte von Nutzen sind, werden für die Untersuchung, Behandlung
und Verhinderung von einer menschlichen Krankheit geliefert.
-
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
-
Es
ist gut etabliert, dass die Wirts-Immunabwehr zu verschiedenen Stadien
einer menschlichen Erkrankung in Erscheinung treten. Während einer
viralen Infektion können
zum Beispiel Antikörper,
die als Reaktion auf frühere
Immunisierung stimuliert wurden, eindringende Viren vor dem Anheften
und Penetrieren von empfänglichen
Zielzellen neutralisieren. In dem Fall, dass Zellen infiziert werden
und Virus-assoziierte Antigene auf ihren Oberflächen zeigen, können auch
zelluläre
Immunreaktionen aktiviert werden. In diesem letzteren Fall können cytotoxische
T-Zellen infizierte
Zellen abtöten
und dadurch das Fortschreiten der Infektion limitieren. Diese humoralen
und zellulären
Immunreaktionen werden gewöhnlich
gegen eine Infektion durch eine weite Vielzahl von Viren, einschließlich Viren,
die DNA- oder RNA-Genome und äußere Hüllen aufweisen,
die aus Proteinkapsiden oder Membranhüllen zusammengesetzt sind,
eingerichtet.
-
Die
Tatsache, dass Tiere starke Immunreaktionen gegen die meisten fremden
Antigene einrichten können,
ohne auf Komponenten ihrer eigenen Gewebe in ähnlicher Weise zu reagieren,
legte für
Burnet und Fenner (The Production of Antibodies, Macmillan Co.,
Melbourne (1949)) nahe, dass das Immunsystem gewisse Mechanismen
zum Unterscheiden von Selbst und Nicht-Selbst entwickelt haben muss.
Es existiert zweifellos ein Status der Selbsttoleranz für zentrale Antigene,
denen das Immunsystem normalerweise ausgesetzt ist. (Siehe Siskind,
G., Fundamental Immunology Hrsg. W.E. Paul, Raven Press, New York,
Kap. 20 (1984)). Ein "zentrales
Antigen" ist ein
Selbstantigen, das gewöhnlich
Zellen des Immunsystems ausgesetzt ist, wohingegen ein "periphäres Antigen" ein Selbstantigen
ist, das gewöhnlich
vom Kontakt mit Zellen des Immunsystems zum Beispiel durch physikalische
Trennung abgeschirmt ist. Das Unvermögen des Immunsystems, Reaktionen
gegen bestimmte Komponenten zum Beispiel des Auges, des Gehirns
und der Hoden einzurichten, resultiert eher von der Trennung dieser
Gewebe vom Wirts-Immunsystem als von Selbsttoleranz. In der Tat
können Autoimmunreaktionen
erfolgen, wenn die physikalischen „Barrieren", die diese periphären Gewebe-Antigene getrennt
von der Immunüberwachung
halten, beeinträchtigt
sind. Bemerkenswerterweise besitzt das Wirbeltier-Genom all die
Information, die benötigt
wird, um Antikörper
zu produzieren, die gegen ein Selbstantigen gerichtet sind; und
spontan hergestellte Antikörper
gegen viele Selbstantigene können
routinemäßig nachgewiesen
werden. Diese Antikörper
haben jedoch niedrige Titer, niedrige Affinität und gehören der IgM-Klasse an.
-
Einige
Forscher glauben, dass Selbsttoleranz das „Lernen" des Immunsystems involviert, um zwischen
selbst- und nicht-selbst-Komponenten zu unterscheiden, ein Ereignis,
das vor der Reifung um den Zeitpunkt der Geburt erfolgt. Es ist
spekuliert worden, dass Aussetzen des lymphoiden Systems gegenüber Selbstantigenen
zum Beispiel während
der fötalen
Entwicklung eine kritische Phase für die Entwicklung einer Toleranz
für Selbstantigene
ist. Entsprechend anderen Modellen werden Lymphocyten, die Zelloberflächenrezeptoren
exprimieren, die spezifisch für
das Selbstantigen sind, eliminiert, unfähig zur Aktivierung gemacht
oder werden „dazu
gebracht", das Antigen „zu tolerieren".
-
Der
Ausdruck „B-Zell-Toleranz" wird oft verwendet,
um einen Status zu beschreiben, in dem das Immunsystem unwirksam
auf die Anwesenheit eines Antigens (z.B. eines Selbstantigens) reagiert
oder spezieller, wenn die B-Zellen des Immunsystems versagen, eine
Reaktion auf ein Antigen hervorzurufen. Dementsprechend wird ein
Antigen, das normalerweise B-Zellen ausgesetzt ist, aber trotzdem
versagt, eine Antikörperreaktion
mit hohem Titer zu induzieren, oder das mit einer normalen nicht-Reaktion
durch B-Zellen assoziiert ist (z.B. ein Selbstantigen), als ein „Tolerogen" bezeichnet, da das
Immunsystem seine Anwesenheit „toleriert". Klarerweise sind
Selbstantigene Tolerogene, aber fremde Antigene können auch
Tolerogene werden, wenn B-Zellen scheitern, ausreichend auf das
Antigen zu reagieren. Manche Forscher glauben zum Beispiel, dass
chronische virale Infektionen erfolgen (z.B. virale Persistenz in
Säuglingen,
die von Hepatitis B-Virus (HBV)-tragenden Müttern geboren werden), weil
das Immunsystem dazu gebracht wurde, virale Antigene zu tolerieren.
(Takashima et al., Immunology, 75:398 (1992)). Tolerogene sind nicht
notwendigerweise ganze Moleküle,
sondern können
Teile von Molekülen
(z.B. Peptidfragmente von Proteinen) in potenziell immundominanten
Regionen eines Moleküls
sein. Obwohl Forscher Erfolg gehabt hatten, Toleranz in Tieren durch
verschiedene Techniken zu induzieren, steckt unser Verstehen der
Arten, Antikörper
gegen Tolerogene zu erzeugen, noch in Kinderschuhen.
-
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
-
Die
Erfinder haben Zusammensetzungen und Verfahren zum Erhöhen der
Titer von Antikörpern
gegen Tolerogene (z.B. Selbstantigene und fremde Antigene) über jene
Titer, die routinemäßig spontan
oder nach konventionellen Verfahren der Impfung hergestellt werden,
entdeckt. In einigen Ausführungsformen
wird die B-Zell-Toleranzbrechung
durch die Verwendung einer Unterlage oder einer kapsomeren Struktur
erzielt, die einen geordneten Aufbau bzw. eine geordnete Zusammenlagerung
von Untereinheiten oder Kapsidproteinen, die an mindestens ein B-Zell-Epitop
eines Tolerogens gebunden sind, aufweist, wobei das Tolerogen in
einer regelmäßigen, sich
wiederholenden Anordnung präsentiert
wird. In manchen Aspekten der Erfindung sind das Tolerogen und das
virale Kapsidprotein von unterschiedlichen Organismen, Viren oder
infektiösen
Agenzien abgeleitet. Die Unterlage kann eine Kugel, eine Lipidmembran
oder ein Proteinpolymer sein. Die kapsomere Struktur kann ikosaedrische
oder helikale Symmetrie aufweisen. In erwünschten Zusammensetzungen umfasst
die kapsomere Struktur jedoch virale Kapsidproteine, die sich selbst
zusammenlagern, um eine organisierte Struktur zu bilden, die als „virusähnliches
Partikel" oder VLPs
bezeichnet wird.
-
In
manchen Ausführungsformen
sind die viralen Kapsidproteine Hybridmoleküle oder sind auf andere Weise
modifiziert. Daher sind manche Ausführungsformen „chimäre virusähnliche
Partikel (VLPs)" und
andere sind „konjugierte
virusähnliche
Partikel (VLPs)",
wobei „chimäre VLPs" ein Tolerogen haben,
das an das virale Kapsidprotein (oder sein Homolog) durch Genmanipulation
(z.B. Bildung einer Tolerogen/Kapsidprotein-Fusion) gebunden ist,
und „konjugierte
VLPs" ein Tolerogen
aufweisen, das an das virale Kapsidprotein (oder sein Homolog) durch
chemische, physikalische oder andere Modifikation des Kapsidproteins
oder des Tolerogens oder von beiden (z.B. Biotin/Streptavidin, Biotin/Avidin,
andere Liganden/Rezeptor-Sequenzen) gebunden ist. Daher schließen Aspekte
der Erfindung eine Zusammensetzung ein, die eine Unterlage umfasst,
die einen geordneten Aufbau aus Untereinheiten und zumindest ein
B-Zell-Epitop eines Tolerogens aufweist, das an die Unterlage gebunden
ist, um ein Tolerogenpräsentierendes
Immunogen zu bilden, wobei das Tolerogen-präsentierende Immunogen das Tolerogen
in einer regelmäßigen, sich
wiederholenden Anordnung präsentiert. Andere
Zusammensetzungen der Erfindung umfassen eine kapsomere Struktur,
die einen symmetrischen Aufbau Kapsidproteinen und mindestens ein
B-Zell-Epitop eines
Tolerogens aufweist, das an die kapsomere Struktur gebunden ist,
um ein Tolerogen-präsentierendes
virusähnliches
Partikel (VLP) zu bilden, wobei das Tolerogen-präsentierende VLP das Tolerogen
in einer geordneten, sich wiederholenden Anordnung präsentiert.
Eine andere Ausführungsform
der Erfindung betrifft einen isolierten Komplex, umfassend eine
dieser Zusammensetzungen, gebunden an eine Zelle des Immunsystems.
Darüber
hinaus sind Pharmazeutika, die diese Zusammensetzungen umfassen,
Ausführungsformen
der Erfindung.
-
Verfahren
zum Herstellen von Antikörpern
gegen ein Tolerogen sind auch Teil der Erfindung. Durch ein Verfahren
werden Antikörper
gegen ein Tolerogen durch Identifizieren eines Individuums, das
Antikörper
gegen ein Tolerogen benötigt,
und Liefern einer ausreichenden Menge einer der oben beschriebenen
Zusammensetzungen an das Individuum hergestellt, um Antikörper gegen
das Tolerogen herzustellen. Ein anderer Ansatz involviert die Identifizierung
von Agenzien, die Auto-Antikörper
herstellen. Dementsprechend wird eine der obigen Zusammensetzungen
an ein Individuum geliefert, Antikörper werden von dem Individuum
isoliert, der Titer der in Schritt (b) isolierten Antikörper, die
an das Tolerogen binden, wird bestimmt, und das Agens wird durch
die Fähigkeit,
Antikörper
mit hohen Titern zu erzeugen, identifiziert. Zusätzlich ist ein Verfahren zum Herstellen
von monoclonalen Antikörpern
gegen ein Tolerogen im Bereich der Erfindung. Durch diesen Ansatz wird
eine der oben beschriebenen Zusammensetzungen an ein Individuum
geliefert, und ein Hybridom wird mit einer B-Zelle des Individuums hergestellt. Andere
Verfahren schließen
ein Verfahren zur Verstärkung
der Antikörperproduktion
gegen eine normal immunogene Verbindung ein, umfassend die Schritte
des Selektierens eines Antigens, das eine Antikörperreaktion mit niedrigem
Titer in einem Individuum hervorruft, Binden dieses Antigens an
ein modifiziertes VLP, so dass ein konjugiertes VLP gebildet wird,
wobei das konjugierte VLP das Antigen in einer regelmäßigen, sich
wiederholenden Anordnung präsentiert,
und Liefern des konjugierten VLPs an ein Individuum, wodurch Antikörper mit
hohem Titer hergestellt werden.
-
KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
-
Die 1A und 1B sind
Linien-Graphiken, die die Serum-Antikörperreaktivität in einem
ELISA-Test zeigen. 1A zeigt die IgG-Antikörperreaktivität gegen
ein BSA-gekoppeltes CCR5-Peptid. 1B zeigt
die IgG-Antikörperreaktivität gegen
BPV-1-VLPs. Die Symbole repräsentieren
die Ergebnisse unter Verwendung von Seren von Mäusen, die mit L1-CCR5-Partikeln
(), denaturierten L1-CCR5-Partikeln () oder BPV-1-VLPs () in der
Anwesenheit von Freundschem Adjuvans oder L1-CCR5-Partikeln in der
Abwesenheit von Adjuvans () beimpft worden sind.
-
Die 2A–2G sind
Histogramme, die die durchflusscytometrische Analyse des Antikörpers, der an
transient transfizierte HeLa-MAGI-Zellen bindet, veranschaulichen.
Konstrukte, die CCR5-DNA codieren (dicke, durchgehende Linie) oder
Vektor allein (schattiertes Histogramm) als eine Kontrolle für die Hintergrundfärbung wurden
2 Tage vor der Färbung
in die Zellen transfiziert. (2A–2D).
Zellen, transfiziert mit Maus-CCR5 oder Vektor-DNA. (2E–2G).
Zellen, transfiziert mit einer Mensch/Maus-CCR5-Chimäre (HMHH)
oder Vektor-DNA. Die Zellen wurden mit aufgereinigtem IgG von L1-CCR5-immunisierten
Mäusen (2A und 2E),
aufgereinigtem IgG von BPV-1-VLP-immunisierten Mäusen (2B und 2F)
oder aufgereinigtem IgG von KLH-gekoppeltem CCR5-Peptid-immunisierten
Mäusen
(2D) inkubiert. Als eine Kontrolle wurden die Zellen
auch mit einem Fluoresceinmarkierten monoclonalen Antikörper gegen
die 2. EC-Schleife von menschlichem CCR5 gefärbt (2C und 2F).
-
3 ist
eine Säulengraphik,
die die Verdrängung
von iodiertem menschlichem RANTES durch Seren zeigt. HeLa-MAGI-Zellen
wurden transient mit mCCR5 transfiziert. Drei Tage nach der Transfektion
wurden die Zellen mit 0,5 nM iodiertem RANTES in der Abwesenheit
oder Anwesenheit von Verdünnungen
der Mausseren inkubiert. Maximal gebundenes iodiertes RANTES wurde
durch Testen auf die Bindung in der Abwesenheit von Seren bestimmt
und entspricht mit ungefähr
2550 ZpM (angezeigt durch die gestrichelte Linie). Nicht-spezifische
Bindung von iodiertem RANTES (ungefähr 1300 ZpM) wurde durch Testen
auf die Bindung in einem 1000-fachen Überschuss (500 nM) von kaltem
(nicht-iodiertem) menschlichem RANTES bestimmt. Die Daten repräsentieren
den Durchschnitt von Vertiefungen in doppelter Ausführung von
einem Experiment. Dieser Test wurde zweimal wiederholt, um die Reproduzierbarkeit
sicherzustellen.
-
4 ist
eine Liniengraphik, die die Inhibition einer HIV-1-BaL-Infektion
unter Verwendung von Verdünnungen
von L1-CCR5-Seren, BPV-1-VLP-Seren oder einem monoclonalen Antikörper gegen
die zweite EC-Schleife von menschlichem CCR5 (mAB182) zeigt. Seren
von drei Tieren wurden gepoolt. HeLa-MAGI-Zellen, eine HIV-1-Indikator-Zelllinie,
in der sich die Kerne von infizierten Zellen blau färben, wurden
transient mit einer Mensch-Maus-CCR5-Chimäre (HMHH) transfiziert, die
die erste EC-Schleife von Maus-CCR5 in einem Hintergrund des menschlichen
CCR5-Gens enthält. Drei
Tage nach der Transfektion wurden die Zellen mit Verdünnungen
von gepoolten Mausseren oder dem Antikörper für 30 Minuten bei 4°C inkubiert.
Die Zellen wurden dann mit dem M-tropischen Isolat HIV-1-BaL herausgefordert.
Drei Tage nach der Infektion wurden die infizierten Zellen durch
Zählen
der Anzahl von blauen Zellen in jeder Vertiefung bewertet. Inhibition
der HIV-1-BaL-Infektion wurde durch Vergleichen der Anzahl von blauen
(infizierten) Kernen in der Anwesenheit von Seren mit der Anzahl
von blauen Kernen in der Abwesenheit von Seren bestimmt. Die Daten
repräsentieren
den Durchschnitt von Vertiefungen in doppelter Ausführung von
einem Experiment. Um die Reproduzierbarkeit abzusichern, wurde dieser
Test zumindest zweimal mit ähnlichen
Ergebnissen wiederholt. Seren von () L1-CCR5-beimpften Mäusen, () BPV-1-VLP-beimpften
Mäusen
oder () mAB182.
-
5 ist
eine Liniengraphik, die die Antikörperreaktivität von Primatenserum
in einem ELISA-Test zeigt. Die Symbole repräsentieren die Ergebnisse unter Verwendung
von Seren von Makaken, die mit L1-CCR5-Partikeln mit Adjuvans ()
oder Wildtyp-BPV-1-VLPs in der Abwesenheit von Adjuvans (♢)
beimpft wurden.
-
6 ist
eine Liniengraphik, die die Bindung von Streptavidin an biotinylierte
und nicht-biotinylierte VLPs zeigt. Die Symbole repräsentieren
(⎕) biotinylierte VLPs, konjugiert mit Wildtyp-Streptavidin
(SA), (o) biotinylierte VLPs, konjugiert mit SA-TNF-α,
() nicht-biotinylierte VLPs, konjugiert mit Wildtyp-SA und (•) nicht-biotinylierte
VLPs, konjugiert mit SA-TNF-α.
-
7 ist
eine Säulengraphik,
die die Ergebnisse eines TNF-α-Cytotoxizitätstests
zeigt. Seren von Mäusen,
die mit einem Streptavidin-TNF-α-Fusionsprotein (SA-TNF-α), gebunden
an ein biotinyliertes VLP, beimpft wurden, wurden mit einer TNF-α-empfindlichen
Zelllinie (L929) in der Anwesenheit von TNF-α inkubiert. Seren von Mäusen, die
mit Streptavidin, gebunden an biotinyliertes VLP, beimpft wurden,
wurden als eine Kontrolle verwendet. Die Fähigkeit der Zellen. Serum von
SA-TNF-α-beimpften
Mäusen
(z.B. in einer 5%-Konzentration) zeigte einen dreifachen Anstieg
der Zahl von überlebenden
Zellen im Vergleich zu den Hintergrundspiegeln.
-
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
-
Die
hierin beschriebene Erfindung betrifft Zusammensetzungen zum Erhöhen der
Titer von Antikörpern
gegen „Tolerogene", einschließlich Selbstantigene
und fremde Antigene, über
jene Titer, die routinemäßig spontan
oder nach konventionellen Verfahren der Impfung hergestellt werden.
Mit „Antikörperreaktion
mit niedrigem Titer" wird
eine B-Zell-Reaktion gemeint, die in einer unzureichenden Menge
von Antikörpern,
um eine physiologisch wirksame in vivo-Immunreaktion hervorzurufen,
resultiert, wohingegen eine „Antikörperreaktion mit
hohem Titer" eine
ausreichende Menge von Antikörpern,
um eine physiologisch wirksame Immunreaktion in vivo hervorzurufen,
bezeichnet. Die Begriffe „Antikörperreaktion
mit niedrigem Titer" und „Antikörperreaktion mit
hohem Titer" werden
auch entsprechend der Konzentration und Avidität des produzierten Antikörpers definiert.
Das heißt,
ob ein Antigen eine „Antikörperreaktion
mit niedrigem Titer" oder
eine „Antikörperreaktion
mit hohem Titer" produziert,
hängt von
der Verdünnung
von Antikörper-enthaltenden
Seren ab, bei der das Antigen in einem ELISA-Test nicht mehr nachweisbar
ist, wobei typischerweise 200 ng des Zielantigens in einer 1:1000- Verdünnung eines
sekundären
Antikörpers
verwendet werden. Daher ist eine „Antikörperreaktion mit niedrigem
Titer" typischerweise
weniger als etwa eine 1:10000-Verdünnung unter den oben beschriebenen
Bedingungen für
ELISA, und eine „Antikörperreaktion
mit hohem Titer" ist
typischerweise größer oder
gleich einer 1:10000-Verdünnung.
Es sollte verstanden werden, dass der Ausdruck „Tolerogen" im gesamten Verlauf dieser Offenbarung
verwendet wird, um ein Selbstantigen oder ein fremdes Antigen (Peptid,
Nucleinsäure,
Kohlenhydrat oder Lipid) zu bezeichnen, das entweder mit völliger B-Zell-Nichtreaktivität oder limitierter
B-Zell-Reaktivität
so assoziiert ist, dass das Antigen nur eine Antikörperreaktion
mit niedrigem Titer hervorruft, die die normale in vivo-Aktivität des Antigens
nicht im Wesentlichen beeinflusst.
-
In
einigen Ausführungsformen
wird die B-Zell-Toleranzbrechung durch die Verwendung einer Unterlage
oder einer kapsomeren Struktur erreicht, die einen geordneten Aufbau
von Untereinheiten oder Kapsidproteinen aufweist, die an mindestens
ein B-Zell-Epitop eines Tolerogens gebunden ist, wobei das Tolerogen
in einer regelmäßigen, sich
wiederholenden Anordnung präsentiert
wird. In manchen Aspekten der Erfindung sind das Tolerogen und das
virale Kapsidprotein von unterschiedlichen Organismen, Viren oder
infektiösen Agenzien
abgeleitet. Die Unterlage kann eine Kugel, eine Lipidmembran oder
ein Proteinpolymer sein. Die kapsomere Struktur kann ikosaedrische
oder helikale Symmetrie aufweisen. In erwünschten Zusammensetzungen umfasst
die kapsomere Struktur jedoch virale Kapsidproteine, die sich selbst
zusammenlagern, um eine geordnete Struktur zu bilden. Solche viralen
Kapsid-Aufbauten werden als „virusähnliches
Partikel" oder VLPs
bezeichnet.
-
In
manchen Ausführungsformen
sind die viralen Kapsidproteine Hybridmoleküle oder sind auf andere Weise
modifiziert. Der Ausdruck „virusähnliches
Partikel" oder „kapsomere
Struktur" wird oft
verwendet, um eine geordnete Struktur zu bezeichnen, die sich selbst
zusammenlagernde, geordnete Anordnungen von Kapsidproteinen umfasst,
die kein virales Genom einschließen. In dieser Hinsicht sind
manche Ausführungsformen „chimäre virusähnliche
Partikel (VLPs)",
und andere sind „konjugierte
virusähnliche
Partikel (VLPs)".
Der Ausdruck „chimäres VLP" bezeichnet ein VLP,
bei dem das Tolerogen an das virale Kapsidprotein (oder sein Homolog)
durch Genmanipulation (z.B. Bildung einer Tolerogen/Kapsidprotein-Fusion)
gebunden ist. Daher wird die Tolerogen/Kapsidprotein-Fusion oft
als ein „Hybridhüllenprotein" bezeichnet, weil
das virale Hüllenprotein mit
einer Aminosäuresequenz
des B-Zell-Epitops eines Tolerogens chimärisiert wird. Entsprechend
der hierin verwendeten Nomenklatur wird ein Hybridhüllenprotein
durch den Namen des viralen Hüllenproteins
und die Quelle des Tolerogens, das in Verbindung mit dem viralen
Hüllenprotein
dargelegt wird, identifiziert. Der Ausdruck „konjugiertes VLP" wird verwendet,
um ein VLP zu bezeichnen, in dem das Tolerogen an das virale Kapsidprotein
(oder sein Homolog) durch chemische, physikalische oder andere Modifikation
des Kapsidproteins oder des Tolerogens oder von beiden (z.B. Biotin/Streptavidin,
Biotin/Avidin, andere Liganden/Rezeptor-Sequenzen) gebunden ist.
-
Das
Hybridhüllenprotein
kann die Aminosäuresequenz
des Tolerogens in seine Primärstruktur,
wie durch Inserieren der Aminosäuresequenz
des Tolerogens in die Aminosäuresequenz
des viralen Hüllenproteins
oder durch Ersetzen der Aminosäuresequenz
des viralen Hüllenproteins
mit der Aminosäuresequenz
des Tolerogens inkorporieren. Die Stelle der Chimärisierung
hängt oftmals
von der äußeren Oberfläche des
VLPs und den Regionen des viralen Hüllenproteins, die in die Selbstzusammenlagerung
involviert sind, ab. Diese Stelle kann zum Beispiel der Stelle eines
virusneutralisierenden Epitops entsprechen. Es muss verstanden werden,
dass das Hybridhüllenprotein
in bestimmten Ausführungsformen
der Erfindung die Form eines einzigen Hüllenproteins, in anderen Ausführungsformen
die eines Kapsomers (5 Hüllenproteine,
die in einem Pentamer angeordnet sind) oder in bevorzugten Ausführungsformen
die eines VLPs, das aus multiplen Kapsidproteinen zusammengesetzt
ist, die als eine partikuläre
Struktur angeordnet sind, annehmen kann.
-
Das
virale Kapsidprotein, das die kapsomere Struktur eines VLP umfasst,
kann von vielen verschiedenen Typen von Viren stammen, aber wünschenswerte
Ausführungsformen
haben Proteine, die in einem Virus, das eine ikosaedrische Struktur
(z.B. T = 7) aufweist, und in Viren, deren natürlicher Reservoir-Wirt ein Säuger ist,
und in Viren, die aus den Familien der Papillomavirinae, Polyomavirinae
oder Parvoviridae ausgewählt
werden, gefunden werden. Bevorzugte Zusammensetzungen haben einen
Kapsidaufbau, der eine Vielzahl von Papillomavirus-Hybrid- oder
modifizierten L1-Proteinen aufweist.
-
Durch
Anwenden der hierin offenbarten chimären und konjugierten VLP-Technologie können einige Ansätze verwendet
werden, um ein Tolerogen an eine Unterlage zu binden, um viele neue
Zusammensetzungen zu bilden. In den meisten Ausführungsformen ist die Zusammensetzung
eine „multimere" Unterlage, in der mehr
als ein Tolerogen-Molekül
an die Unterlage angehängt
ist. In manchen Ausführungsformen
wird jedoch eine „multimere" Unterlage geliefert,
in der der Tolerogen-Teil der Zusammensetzung eine Vielzahl der
selben Tolerogen-Domäne,
als Tandem fusioniert, umfasst. Darüber hinaus sind multimere Zusammensetzungen,
die multimerisierte Tolerogene aufweisen, auch Ausführungsformen
der Erfindung. In anderen Ausführungsformen
ist die Zusammensetzung eine „zusammengesetzte" Unterlage, in der
mehr als ein Typ von Tolerogen vorhanden ist. Ein Fachmann wird
auch anerkennen, dass zusammengesetzte Unterlagen multimer sein
können
und multimerisierte Tolerogene einschließen können. Vorzugsweise binden die
multimeren Zusammensetzungen, multimerisierten Zusammensetzungen
und zusammengesetzten Zusammensetzungen und Kombinationen davon
Tolerogene auf eine Weise an die Unterlage, die die Präsentation
für Zellen
des Immunsystems optimiert. Zum Beispiel präsentieren die Ausführungsformen
die Tolerogene in einer geordneten, eng aneinanderliegenden, sich
wiederholenden Anordnung. Zusätzlich
schließen
manche Ausführungsformen
Linker ein, die zwischen die Unterlage und das virale Kapsidprotein
(oder sein Homolog) oder zwischen das Tolerogen und das virale Kapsidprotein
(oder sein Homolog) oder beide eingebaut werden, um sterische Behinderung
zu reduzieren und optimale Immunreaktion anzuregen. Daher haben
manche Zusammensetzungen ein virales Kapsidprotein (oder sein Homolog)
oder ein Tolerogen oder beides, das durch einen Linker an die Unterlage gebunden
ist.
-
Viele
unterschiedliche Tolerogene können
an die Unterlage gebunden werden, einschließlich Peptide, Nucleinsäuren, Kohlenhydrate
und Lipide. In manchen Ausführungsformen
ist das Tolerogen ein Selbstantigen. Das Tolerogen kann zum Beispiel
ein Ligand wie ein Protein auf der Oberfläche einer neoplastischen Zelle oder
ein Wachstumsfaktor wie ein Protein, das mit Angiogenese assoziiert
ist, oder ein viraler Rezeptor wie der Chemokin-Rezeptor CCR5 und
Cytokine wie TNF-α sein.
Fragmente von diesen „Volllängen"-Tolerogenen sind
auch für
manche Ausführungsformen
wünschenswert.
Das heißt,
in manchen Ausführungsformen kann das
Tolerogen ein ganzen Molekül
(z.B. Volllänge)
sein, aber meistens umfasst das Tolerogen nur einen Teil oder ein
Fragment des Volllängen-Moleküls (z.B.
Teillänge).
Erwünschte
Tolerogene umfassen mindestens 5 bis 500 aufeinanderfolgende Aminosäuren des
Volllängen-Moleküls, vorteilhaft
5 bis 200 und vorzugsweise 5 bis 50. Vorzugsweise werden das Tolerogen
und das virale Kapsidprotein von verschiedenen Organismen, Viren
oder infektiösen
Agenzien abgeleitet. Andere Ausführungsformen
schließen
einen isolierten Komplex, der eine der oben beschriebenen Zusammensetzungen,
die an eine Zelle des Immunsystems (z.B. eine B-Zelle, eine T-Zelle
oder eine dentritische Zelle) gebunden ist, umfasst, und ein Pharmazeutikum,
das eine der oben beschriebenen Zusammensetzungen umfasst, ein.
-
Die
Zusammensetzungen, isolierten Komplexe und Pharmazeutika der Erfindung
werden als biologische Werkzeuge, Therapeutika und Prophylaktika
für die
Untersuchung der B-Zell-Toleranz, die Identifizierung von Agenzien,
die Auto-Antikörper herstellen,
und die Behandlung und Prävention
von menschlichen Erkrankungen wie einer viralen Infektion, einer
chronischen Entzündung
und Krebs verwendet. In einer Ausführungsform wird zum Beispiel
ein Verfahren zum Identifizieren von Agenzien, die Auto-Antikörper herstellen,
geliefert. Durch diesen Ansatz wird eine Zusammensetzung der Erfindung
an ein Individuum geliefert, Antikörper werden dann von dem Individuum
isoliert und eine Bestimmung wird durchgeführt, ob die isolierten Antikörper mit dem
Tolerogen, das durch die Zusammensetzung präsentiert wird, interagieren.
In der Folge wird das Immunogen als eines identifiziert, das die
B-Zell-Toleranz durch die Fähigkeit
der isolierten Antikörper,
mit dem Tolerogen zu interagieren, bricht. In einer anderen Ausführungsform
wird ein Verfahren zum Herstellen von Antikörpern gegen ein Tolerogen geliefert,
in dem ein Individuum, das Antikörper
gegen ein Tolerogen benötigt, identifiziert
wird, und dann wird eine therapeutisch günstige Menge einer Zusammensetzung
der Erfindung geliefert. Zusätzlich
werden Verfahren der Behandlung und Prävention einer HIV-Infektion,
einer chronischen viralen Infektion, von Krebs und einer Entzündung geliefert,
die den Schritt des Bereitstellens eines Pharmazeutikums, das eine
Zusammensetzung der Erfindung umfasst, involvieren. Zum Beispiel
können
Brustkrebs und rheumatoide Arthritis durch Induzieren der Produktion
von Antikörpern,
die gegen ErbB-2 beziehungsweise TNF gerichtet sind, behandelt werden.
(Maini, R.N. et al., Imm. Reviews, 144:195–223 (1995); Baselga, J. et al.,
J. Clin. Oncol., 14:737–44
(1996)). Darüber
hinaus sind polyclonale und monoclonale Antikörper, die gegen Epitope auf
den chimären
und konjugierten VLPs der Erfindung gerichtet sind, Ausführungsformen.
-
Ein
Beweis unserer Entdeckung wird in den zwei Gruppen von Experimenten,
die unten geliefert werden, geliefert. In einer ersten beispielhaften
Demonstration wurde die B-Zell-Toleranz gegenüber dem zentralen Maus-Chemokinrezeptor
(mCCR5)-Antigen durch Immunisieren der Mäuse mit chimären VLPs,
die das mCCR5-Tolerogen aufwiesen, aufgehoben. In diesen Experimenten
wurde ein Peptid, das eine extrazelluläre Schleife des Maus-Chemokinrezeptors
CCR5 repräsentiert,
in ein neutralisierendes Epitop des Virus-L1-Hüllenproteins des Rinder-Papillomavirus (BPV-1)
durch konventionelle Clonierungstechnologien inkorporiert. L1 hat
die intrinsische Kapazität,
sich selbst zu virusähnlichen
Partikeln (VLPs) zusammenlagern, die sogar ohne Adjuvans hohe Spiegel
von neutralisierenden Antikörpern
induzieren. (Kirnbauer, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA,
89:12180–12184
(1992); Greenstone, H.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 95:1800–1805 (1998)).
Der CCR5-Rezeptor wird in zahlreichen Zelltypen und Geweben, einschließlich der
T-Gedächtniszellen
und Makrophagen exprimiert. (Zhang, L. et al., J. Virol., 72:5035–5045 (1998)).
Rekombinant produzierte chimäre
Proteine, genannt „L1-CCR5", lagern sich selbst
zu partikulären
Strukturen zusammen, die eine geordnete Anordnung von Kapsomeren
haben (hier nachstehend als virusähnliche Partikel oder VLPs
bezeichnet), die als Immunogene verwendet wurden. Fachleuten wird
bewusst sein, dass von CCR5 bekannt ist, dass er der Co-Rezeptor
für M-tropische Stämme von
HIV ist und dass monoclonale Antikörper gegen menschlichen CCR5
eine HIV-Infektion in menschlichen Zellen in vitro blockieren.
-
Wie
unten detailliert ausgeführt
wird, produzierten Mäuse,
denen das L1-CCR5-Immunogen
verabreicht wurde, Auto-Antikörper,
die an das natürliche
Maus-CCR5 banden,
inhibierten die Bindung des RANTES-Liganden und blockierten eine
HIV-1-Infektion einer Indikator-Zelllinie, die eine Mensch-Maus-CCR5-Chimäre exprimierte.
Wir zeigen auch, dass die Langzeit-Effekte des Behandlungsprotokolls
bei Mäusen
minimal waren. Darüber
hinaus zeigen wir, dass Auto-Antikörper gegen CCR5 in Primaten
produziert werden können. Diese
Experimente liefern einen Hinweis, dass die B-Zell-Toleranz für ein Zelloberflächen-Selbstantigen,
das sich gemeinsam mit einem Immunsystem entwickelt hat, gebrochen
werden kann. Diese neuen Zusammensetzungen können in Pharmazeutika inkorporiert
werden und können
verwendet werden, um eine HIV-Infektion zu behandeln und/oder zu
verhindern.
-
In
einer zweiten Gruppe von Experimenten liefern wir einen Hinweis,
dass die Produktion von Auto-Antikörpern gegen den Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) durch Beimpfen
eines Individuums mit einem konjugierten VLP, das ein Fragment von
TNF-α umfasst,
induziert werden kann. Das Immunogen wurde durch Binden eines Streptavidin/TNF-α-Fusionsproteins
(SA-TNF-α)
an biotinylierte L1-VLPs gebildet. Mäuse, die mit SA-TNF-α-VLP-Konjugaten
beimpft wurden, produzierten Auto-Antikörper, die die Wirkungen von
TNF-α auf eine
TNF-α-empfindliche
Zelllinie (L929-Zellen) neutralisierten. Diese neuen Zusammensetzungen
können
in Pharmazeutika inkorporiert werden und können verwendet werden, um eine
chronische, entzündliche
Erkrankung und andere Erkrankungen, die mit übermäßiger Freisetzung von TNF-α assoziiert
sind, einschließlich, aber
nicht limitiert auf rheumatoide Arthritis, Crohn-Krankheit, ulzerative
Colitis, Krebs, disseminierte Sklerose, Diabetes, Psoriasis, Osteoporose
und Asthma, zu behandeln und/oder zu verhindern. In der untenstehenden Offenbarung
und den Beispiele, die folgen, diskutieren wir diese zwei Gruppen
von Experimenten detaillierter.
-
Ein chimäres VLP,
das die Immuntoleranz bricht und eine HIV-Infektion inhibiert
-
Während wir
untersuchen, ob Auto-Antikörper
gegen ein Selbstantigen induziert werden können, entdeckten wir, dass
die B-Zell-Toleranz durch Platzieren des Antigens in einen Zusammenhang,
der die geordnete Oberfläche
eines viralen Partikels nachahmt, aufgehoben werden kann. In unseren
anfänglichen
Experimenten inserierten wir den Maus-Chemokinrezeptor mCCR5 in
eine immundominante Stelle des Rinder-Papillomavirus-L1-Hüllenproteins.
Das rekombinante Protein wurde „L1-CCR5" genannt, was ein sich selbst zusammenlagerndes
chimäres
L1-Protein ist, das eine Vielzahl von Aminosäuren einschließt, die
ein CCR5-Epitop codieren. Papillomaviren wurden ausgewählt, weil
sie hoch-spezifische Immunogene sind. Jede Wirbeltier-Spezies wird
durch eine ausgeprägte
Gruppe von Papillomaviren infiziert, wobei jede Gruppe einige Papillomavirus-Typen
umfasst. Neutralisierende Antikörper
gegen die Virionen eines Papillomavirus-Typs verleihen gewöhnlich keine
Immunität
gegen einen anderen Typ.
-
Papillomaviren
sind Beispiele von Viren ohne Hülle,
die sich in den Epithelien einer breiten Vielzahl von Tierarten
vermehren, um in der Bildung von gutartigen epithelialen und fibro-epithelialen
Tumoren oder Warzen zu resultieren. Papillomavirus-Partikel haben
einen Durchmesser von etwa 55 nm und kapseln ein doppelsträngiges,
ungefähr
8 kb-DNA-Genom ein, das in einem Nucleohiston-Kern enthalten ist
(Baker et al., Biophys J., 60:1445 (1991)). Die Kapside sind aus
den zwei viral codierten Proteinen L1 und L2 zusammengesetzt, die
auf SDS-PAGE-Gelen
bei ungefähr
55 kDa beziehungsweise 75 kDa wandern (Mose Larson et al., J. Virol.,
61:3596 (1987)). Das L1-Hauptkapsidprotein ist in 72 Pentameren
angeordnet, die mit der T = 7-ikosaedrischen Symmetrie assoziieren.
Es gibt ungefähr
12 L2-Kapsidproteine
pro Virion. (Baker et al., Biophys J., 60:1445 (1991)).
-
Das
L1-Protein hat die Kapazität,
sich selbst so zusammenzulagern, dass große Mengen von virusähnlichen
Partikeln (VLPs) durch die Expression des L1-Proteins von einem bestimmten Papillomavirus
in einer Vielzahl von rekombinanten Expressionssystemen hergestellt
werden können.
(Kirnbauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:12180 (1992) (BPV-1,
Baculovirus-Expressionssystem); Hagensee et al., J. Virol., 67:315
(1993) (HPV-1, Vacciniavirus-Expressionssystem); Kirnbauer et al.,
J. Virol., 67:6929 (1993) (HPV-16, Baculovirus-Expressionssystem);
Rose et al., J. Virol., 67:1936 (1993) (HPV-11, Baculovirus-Expressionssystem);
Sasagawa et al., Virol., 206:126 (1995) (HPV-16, Hefe-Expressionssystem);
Nardinelli-Haefliger et al., Infection and Immunity, 65:3328 (1997)
(HPV-16, bakterielles Expressionssystem)). Obwohl es für den Aufbau nicht
benötigt
wird, wird L2 in die VLPs inkorporiert, wenn es mit L1 (L1/L2-VLPs)
in Zellen co-exprimiert wird.
-
Immunisierung
von Kaninchen mit den natürlichen
Virionen oder L1-VLPs, aber nicht mit denaturierten L1-Proteinen,
induziert hohe Titer von neutralisierenden Serumantikörpern (Christensen
et al., J. Virol., 64:3151 (1990); Kirnbauer et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 89:12180 (1992); Pilacinski et al., Bio/Technology, 2:356
(1984); Segre et al., Am. J. Vet. Res., 16:517 (1955)). Die polyclonalen
und monoclonalen neutralisierenden Antikörper, die gegen natürliche Partikel
hergestellt werden, erkennen konformationsabhängige Epitope (Christensen
et al., Virus Res, 28:195 (1993); Christensen et al., Virology,
181:572 (1991)). Obwohl das Wesen der humoralen Immunreaktion gegen
Papillomavirus-Antigene gut etabliert ist, war sich niemand bewusst oder
hat niemand erwartet, dass die geordnete Geometrie von L1-VLPs ausgenutzt werden
könnte,
um ein Tolerogen dem Immunsystem in einer Weise zu präsentieren,
die eine wirksame Immunreaktion fördert und so die B-Zell-Toleranz bricht.
-
Die
Herstellung von chimären
L1-CCR5-Partikeln benötigte
die Insertion des CCR5-Peptids in eine Region von L1, die die Fähigkeit
von L1, Partikel zu formen, nicht stören würde. (Siehe Beispiel 1). Obwohl
die genaue strukturelle Lokalisierung und Funktion der meisten L1-Aminosäuren nicht
bekannt sind, sind Aminosäure-Änderungen, die die neutralisierenden
Epitope von verschiedenen menschlichen Papillomaviren stören, ohne
den Kapsid-Aufbau zu beeinträchtigen,
auf drei nicht-benachbarten
Regionen von L1 kartiert worden. (Ludmerer, S.W., Benincasa, D. & Mark III, G.E.,
J. Virol., 70:4791–4794
(1996); Ludmerer, S.W. et al., J. Virol., 71:3834–3839 (1997);
Roden, R.B. et al., J. Virol., 71:6247–6252 (1997)). Da es wahrscheinlich
war, dass die Aminsäuren
an diesen Stellen auf der Oberfläche
des Kapsids waren, wurden die analogen Stellen in BPV-1-L1 für die Peptidinsertion
angezielt. Daher wurden drei L1-CCR5-Chimären konstruiert, in denen die L1-Sequenz bei den BPV-1-L1-Aminosäuren 130–136, 275–285 oder
344–350
mit einer Sequenz ersetzt wurden, von der vorhergesagt wurde, dass
sie ein 16 Aminosäure-Peptid codiert, das
der ersten EC-Schleife von Maus-CCR5 (mCCR5) von C57BI/6 (B6)-Mäusen entspricht.
Diese Chimären
wurden als L1-CCR5-Chimären-1,
-2 beziehungsweise -3 bezeichnet.
-
Rekombinante
Baculoviren, die L1-CCR5-Chimären
enthalten, wurden hergestellt, und die resultierenden L1-CCR5-Partikel
wurden durch Gradienten-Zentrifugation
aufgereinigt. (Kirnbauer, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
89:12180-12184 (1992)). Um festzustellen, ob die chimären L1-CCR5-Moleküle sich
zu VLPs, Kapsomeren oder anderen partikulären Formen zusammenlagern,
wurde eine Superose-6-Gelfiltrations-Chromatographie mit Präparationen
der drei L1-CCR5-Chimären durchgeführt. (Siehe
Beispiel 2). Nur Präparationen
der L1-CCR5-Chimäre-1 eluierten
in einer Fraktion, die auf eine zusammengelagerte partikuläre Struktur hinweist.
Daher wurde die weitere Analyse auf diese Chimäre limitiert. Die Untersuchung
von Chimäre-1-Partikeln
durch Elektronenmikroskopie legte viele Partikel offen, die kleiner
waren als die Wildtyp-L1-VLPs, ungefähr 28 nm im Vergleich zu 55
nm. Morphologisch spiegelten die chimären L1-CCR5 Partikel Polyomavirus-12-ICOSA-Hüllen (T
= 1-Partikel) wider, die aus einer regelmäßigen Anordnung von 12 pentameren
Kapsomeren des Polyomavirus-Haupthüllenproteins VP1 zusammengesetzt
sind, und können
bei erneuter in vitro-Zusammenlagerung von VP1-Kapsomeren bei hoher
ionischer Stärke
hergestellt werden. (Salunke, D., Caspar, D.L.D. & Garcea, R.L.,
Biophysical Journal, 56:887-900 (1989)). Kleine Partikel von ähnlicher
Größe wie die
L1-CCR5-Partikel werden oft als eine Weben-Komponente von Wildtyp-BPV-1-L1-VLP-Präparationen gefunden.
-
Um
zu untersuchen, ob die chimären
CC1R5-Partikel anti-CCR5-Antikörper
induzieren könnten,
wurden C57B1/6-Mäuse
(ein Stamm, der die identische CCR5-Sequenz wie die Insertionssequenz codiert)
mit L1-CCR5-Partikeln, denaturiertem L1-CCR5-Protein oder Wildtyp-VLPs
geimpft. (Siehe Beispiel 3). Seren von diesen Mäusen wurden auf die Reaktivität gegenüber dem
CCR5-Peptid und den Wildtyp-VLPs
durch ELISA getestet (1A). Seren von Kontrollmäusen, die
mit Wildtyp-VLPs
beimpft wurden, hatten keine anti-CCR5-ELISA-Reaktivität, aber
Beimpfung mit L1-CCR5-Partikeln induzierte Seren mit hohen anti-CCR5-ELISA-Titern.
Diese Titer reichten in den drei Tieren, die in Kombination mit
Freundschem Adjuvans beimpft wurden, von 3 × 103 bis
3 × 104 und betrugen in den zwei Tieren, die ohne
Adjuvans beimpft wurden, 3 × 103. Im Gegensatz dazu wurden in Mäusen, die
mit denaturierten L1-CCR5-Partikeln in Kombination mit Adjuvans
beimpft wurden, keine CCR5-Peptid-spezifischen Antikörper nachgewiesen.
Das Fehlen der Reaktivität
der denaturierten L1-CCR5-Partikel war auf das CCR5-Peptid beschränkt, da
das denaturierte Material hohe Titer von anti-L1-Antikörpern hervorrief
(1B).
-
Während diese
Ergebnisse einen Hinweis lieferten, dass die L1-CCR5-Partikel Antikörper gegen
das CCR5-Peptid hervorrufen, bestand die Möglichkeit, dass diese Antikörper das
Peptid in seiner natürlichen
Konformation als ein Teil des Membranassoziierten mCCR5 nicht erkennen
könnten.
Um diese Möglichkeit
zu eliminieren, wurde ein Experiment durchgeführt, in dem die Fähigkeit
von anti-CCR5-Antikörpern,
an mCCR5 auf Zellen zu binden, durch durchflusscytometrische (FACS)
Analyse getestet wurde. (Siehe Beispiel 4). Die Bindung von L1-CCR5-Partikel-Seren
an mCCR5, das auf primären
Maus-T-Zellen und Macrophagen exprimiert wird, konnte wegen hoher
Spiegel von nicht-spezifischer Maus-IgG-Bindung an diese Zellen
nicht bewertet werden. Alternativ wurde cloniertes mCCR5 von B6-Mäusen transient
in HeLa-MAGI-Zellen durch Transfektion exprimiert, und die Bindung
von aufgereinigtem Maus-IgG wurde im Vergleich zu Vektor-transfizierten
Zellen gemessen (2A–2G). Durch
diesen Test band IgG von L1-CCR5-immunisierten Mäusen spezifisch an die mCCR5-transfizierten
Zellen (2A), wohingegen es keine signifikante
Bindung mit aufgereinigtem IgG von Wildtyp-BPV-VLP-Seren (2B)
oder mit einem monoclonalen Antikörper (mAB182), der an die zweite EC-Schleife von menschlichem
(h) CCR5 bindet (2C), gab. Als eine Kontrolle
für die
Antikörper-Spezifität wurden
Mäuse mit
dem mCCR5-Peptid, gekoppelt an KLH („keyhole limpet hemocyanin),
beimpft. Während diese
Mäuse eine
anti-CCR5-Peptid-Antikörperreaktion
mit ELISA-Titer von 105 gegen das CCR5-Peptid,
gekoppelt an Rinder-Serumalbumin (BSA), erzeugten, scheiterte das
IgG, das von den Seren von diesen Mäusen aufgereinigt wurde, mCCR5-exprimierende
Zellen zu binden (2D). So wirken die L1-CCR5-induzierten
Antikörper
im Gegensatz zu jenen, die durch das KLH-gekoppelte Peptid induziert
wurden, als wahre Auto-Antikörper, dadurch,
dass sie natürlichen
mCCR5 binden.
-
Als
einen anderen Ansatz, die Fähigkeit
der Antikörper,
natürliches
mCCR5 zu binden, zu untersuchen, untersuchten wir, ob die L1-CCR5-Seren
mit einem Chemokin-Liganden für
mCCR5 um die Bindung an HeLa-MAGI-Zellen, die transient mit mCCR5
transfiziert wurden, konkurrieren könnten (3). (Siehe
Beispiel 5). Die Maus-Chemokine MIP-1, MIP-1β und RANTES sind Liganden für mCCR5.
Zusätzlich
sind die menschlichen Homologe von MIP-1β und RANTES in der Lage, an
mCCR5 zu binden. (Meyer, A. et al., J. Biol. Chem., 271:14445–14451 (1996);
Nibbs, R.J.B. et al., J. Biol. Chem., 272:12495–12504 (1997)). Im Konkurrenz-Test wurde
kommerziell erhältliches
iodiertes menschliches RANTES verwendet. Eine 1:30-Verdünnung von L1-CCR5-Seren
verdrängte
ungefähr
66% des iodierten menschlichen RANTES (ähnlich zu der Verdrängung, die
unter Verwendung eines 100-fachen Überschusses von kaltem RANTES
beobachtet wurde), im Vergleich zu 37% Verdrängung mit einer 1:30-Verdünnung von
Wildtyp-L1-VLP-Seren. Die 1:75- und
1:150-Verdünnungen
von L1-CCR5-Seren verdrängten
25% beziehungsweise 17% des iodierten RANTES, wohingegen bei Verwendung
von Kontrollseren in diesen Verdünnungen
keine signifikante Verdrängung
beobachtet wurde. Vorherige Untersuchungen haben gezeigt, dass MIP-1,
MIP-1β und
RANTES an die zweite EC- Schleife
von hCCR5 binden, da ihre Bindung durch einen monoclonalen Antikörper gegen
diese Schleife, aber nicht durch einen Antikörper gegen den Amino-Terminus
von hCCR5 blockiert wurde. (Wu, L. et al., J. Exp. Med., 186:1373–1381 (1997)).
Unsere Ergebnisse von diesen Experimenten liefern einen Hinweis,
dass Antikörper, die
an die erste EC-Schleife von mCCR5 binden, die zwischen diesen zwei
Stellen lokalisiert ist, teilweise RANTES-Bindung blockieren können, vielleicht
auf Grund der Nähe
dieser Schleife zu der zweiten EC-Schleife.
-
Die
Fähigkeit
von L1-CCR5-induzierten Antikörpern,
eine M-tropische HIV-1-Infektion
zu blockieren, wurde auch getestet (Siehe Beispiel 6). Die Interaktion
zwischen der HIV-1-Hülle
und hCCR5 ist komplex, wahrscheinlich Stamm-abhängig und involviert wahrscheinlich
einige EC-Regionen von CCR5. Spezifisch haben monoclonale Antikörper-Untersuchungen
die zweite EC-Schleife und die NH2-terminale Region
von hCCR5 damit in Verbindung gebracht, und Studien von chimären Rezeptoren
haben darauf hingewiesen, das die ersten und dritten EC-Schleifen von hCCR5
auch zu seiner Interaktion mit HIV-1 beitragen. (Wu, L. et al., J.
Exp. Med., 186:1373–1381
(1997); Rucker, J. et al., Cell, 87:437–446 (1996); Atchison, R.E.
et al., Science, 274:1924–1926
(1996); Alkhatib, G. et al., J. Biol. Chem., 272:19771–19776 (1997);
Picard, L. et al., J. Virol., 71:5003–5011 (1997); Ross, T.M., Bieniasz,
P.D. & Cullen,
B.R., J. Virol., 72:1918–1924
(1998)). Obwohl mCCR5 nicht als ein HIV-1-Corezeptor wirkt, hat
ein chimärer
Mensch-Maus-Rezeptor
(HMHH), der die erste EC-Schleife von rnCCR5 (die B6-Maus-Sequenz)
in einem Hintergrund von hCCR5 enthält, Co-Rezeptor-Aktivität (wenn
auch in niedriger Wirksamkeit), wenn er in menschlichen Zelllinien
exprimiert wird. (Kuhmann, S.E. et al., J. Virol., 71:8642–8656 (1997)).
Wir verwendeten diesen chimären
Rezeptor, um zu testen, ob L1-CCR5-Seren eine M-tropische HIV-1-Infektion
blockieren könnten.
Um zu bestätigen,
dass IgG, das von L1-CCR5-Seren aufgereinigt wurde, HMHH binden
würde,
wurde eine FACS-Analyse auf HeLa-MAGI-Zellen, die transient mit
HMHH transfiziert wurden, durchgeführt. Eine positive Bindung
wurde mit IgG von L1-CCR5-Mäusen
und mit einem monoclonalen Positivkontroll-Antikörper, der an die zweite EC-Schleife
von menschlichem CCR5 bindet, erzielt, während IgG von Wildtyp-L1-VLP-Mäusen HMHH
nicht band (2E–2G).
-
Basierend
auf diesen Ergebnissen wurden Seren von L1-CCR5-Mäusen auf
ihre Fähigkeit,
die Infektion des M-tropischen BaL-Stamms von HIV-1 zu inhibieren, in
einem Einmalreplikationszyklus-Test unter Verwendung der MAGI-Indikator-Zelllinie getestet.
(Kimpton, J. & Emerman,
M., J. Virol., 66:2232–2239
(1992)). Wenn die Indikatorzellen, die transient mit HMHH transfiziert
wurden, mit HIV-1-BaL in der Anwesenheit von L1-CCR5-Seren infiziert
wurden, zeigten Verdünnungen
von 1:15, 1:30 und 1:75 65%, 50% beziehungsweise 45% Neutralisierung
der Infektiosität
(4). In den selben Verdünnungen zeigten Kontrollseren
von Wildtyp-L1-VLP-Mäusen
eine gewisse nicht-spezifischen Neutralisierung, aber sie war nur
25% bei der 1:15-Verdünnung und
15% bei 1:30 und 1:75. Im Vergleich zeigten Indikatorzellen, die
mit HIV-1-BaL in der Anwesenheit von Verdünnungen von hCCR5-bindendem
monoclonalen Antikörper
(mAB182) (in einer anfänglichen Konzentration
von 1 μg/μl) infiziert
und als eine Positivkontrolle verwendet wurden, eine ähnliche
Neutralisierungskurve (5). Die L1-CCR5-Seren wurden
auch auf die Neutralisierungs-Aktivität gegen das T-Zell-tropische
Isolat HIV-1-LAI getestet und versagten, wie erwartet, jegliche
Neutralisierung über
die Hintergrundspiegel gegen dieses Isolat zu zeigen.
-
Ein
Bedenken der Auto-Antikörper-Induktion
ist, dass solche Vorgehensweisen schädliche Langzeit-Konsequenzen
für das
immunisierte Tier haben können,
möglicherweise
einschließlich
unkontrollierter antigenischer Stimulation von natürlichem
CCR5-Protein. In den drei Mäusen,
die über
einen Zeitraum von sechs Monaten nach der L1-CCR5-Partikel-Beimpfung überwacht
wurden, beobachteten wir jedoch ein zwei- bis achtfaches Absinken
des Titers von CCR5-spezifischen Antikörpern über diesen Zeitraum; dieses
Absinken war grob äquivalent
zu einem parallelen Absinken des Titers von L1-spezifischen Antikörpern. Zwei
der Tiere zeigten zweifache Abnahmen der anti-CCR5-Antikörpertiter
und dreifache Abnahmen der anti-L1-Antikörpertiter. Das dritte Tier
zeigte eine achtfache Abnahme seiner anti-CCR5-Titer und eine zehnfache
Abnahme seiner anti-L1-Antikörpertiter.
Diese Ergebnisse liefern einen Hinweis, dass fortgesetztes Ausgesetztsein
gegenüber
natürlichem
CCR5 nicht zu fortgesetzter B-Zell-Induktion führt, vermutlich weil das zelluläre Protein
in einem Zusammenhang bleibt, der durch das Immunsystem ignoriert
wird, und darüber
hinaus, weil die anti-CCR5-Reaktion ausschließlich vom Ausgesetztsein gegenüber dem
CCR5-Peptid auf L1-CCR5-Partikeln abhängt. Die
immunisierten Mäuse
behielten das selbe Gewicht wie Kontrollmäuse bei, und Autopsien, die sechs
Monate nach der letzten Auffrischung bei zwei der Mäuse durchgeführt wurden,
legten keine groben pathologischen Veränderungen offen.
-
In
Menschen wird CCR5 vorwiegend auf T-Gedächtniszellen (CD3+,
CD4+, CD26hi) exprimiert.
Zusätzlich
exprimieren 1 bis 10% der Makrophagen im Thymus, in der Milz und
den Lymphknoten CCR5. (Zang, L. et al., J. Virol., 72:5035–5045 (1998)).
FACS-Analyse von mononucleären
Mauszellen von Milz, Thymus und peripherem Blut wiesen darauf hin,
dass es keine Abnahme in der Milz oder dem peripheren Blutmakrophagen und
T-Zell-Untergruppen, die CCR5 exprimieren, im Vergleich zu Kontrollmäusen gab.
Daher erlitten die Mäuse,
die mit L1-CCR5-Partikeln
immunisiert wurden, gemäß unserer
Analyse keine groben pathologischen Veränderungen während des Beobachtungszeitraums.
-
Mehr
Hinweise, die die Vorteile der Verwendung von chimären VLPs
für die
B-Zell-Toleranzbrechung in
Menschen und spezifisch für
die Behandlung und Verhinderung einer HIV-Infektion unterstützten, wurden von
Primaten-Untersuchungen
erhalten, in denen Auto-Antikörper
gegen ein Makaken-CCR5-Polypeptid
produziert wurden. (Siehe Beispiel 7). In diesen Experimenten wurde
ein rekombinantes Expressionskonstrukt hergestellt, das ein Makaken-L1-CCR5-Fusionsprotein codiert.
Wir clonierten das korrespondierende Mensch/Makaken-CCR5-Peptid (sie
sind die selben) in die identische Stelle im L1-Hauptkapsidprotein,
wie es im Maus-Experiment verwendet wurde. Als Nächstes bewerteten wir die Kapsidpartikel-Selbstzusammenlagerung.
Im Vergleich zu unseren früheren
Experimenten mit Maus-L1-CCR5 war die Partikel-Bildung mit dem chimären Makaken-L1-CCR5
ineffizient. Nichtsdestotrotz waren wir in der Lage, ausreichend
Partikel aufzureinigen, um Schweineschwanz-Makaken zu immunisieren.
Vier der fünf
Tiere, die dreimal mit dem Präparat
in der Anwesenheit von Titer Max-Adjuvans geimpft wurden, produzierten
eindeutig CCR5-spezifische Antikörper, was
in einem ELISA-Test gemessen wurde (5). Wir
glauben, dass ein besseres VLP-basierendes
Immunogen zur Herstellung von Auto-Antikörpern gegen Mensch/Makaken-CCR5
durch das Finden einer anderen Stelle für die Insertion des CCR5-Peptids
hergestellt werden kann, das sowohl das fremde Peptid auf der VLP-Oberfläche zeigen
würde und
kompatibler mit der Selbstzusammenlagerung sein würde. Zusätzlich glauben
wir, wie unten beschrieben, dass konjugierte VLPs, die ein Mensch/Makaken-CCR5-Tolerogen
aufweisen, eine bessere Immunreaktion induzieren werden.
-
Die
Ergebnisse der ersten Gruppe von Experimenten zeigen, dass die Inkorporation
eines Peptids vom EC-Teil des zentralen Antigens mCCR5 in die regelmäßige Anordnung
eines Papillomavirus-Partikels, gefolgt von Immunisierung mit diesen
Partikeln, Auto-Antikörper
induzieren kann, die an den Rezeptor binden und den Liganden und
die HIV-1-Bindung blockieren. Auto-Antikörper gegen mCCR5 sanken mit
der Zeit in einer Rate ab, die ähnlich
war zu dem Absinken von L1-spezifischen
Antikörpern,
was nahe legt, dass B-Zell-Stimulierung nicht durch endogenes Zelloberflächen-CCR5
induziert wurde.
-
Die
anti-Selbstantikörper,
die durch L1-CCR5-Partikel induziert wurden, banden wirksam mCCR5,
das auf der Zelloberfläche
exprimiert wurde, was darauf hinweist, dass sie als wahre Auto-Antikörper wirken.
Im Gegensatz dazu scheiterten Antikörper, die durch KLH-gekoppeltes
CCR5-Peptid induziert wurden, an natürliches mCCR5 zu binden. Es
ist wahrscheinlich, dass bindende Auto-Antikörper nicht nur diese bestimmte
Aminosäurensequenz
erkennen, sondern die Tolerogensequenz in ihrer natürlichen
Konformation. Darüber
hinaus blockiert das IgG von L1-CCR5-immunisierten Mäusen die Bindung eines CCR5-Liganden
und inhibiert eine HIV-1-Infektion
durch ein chimäres
CCR5-Protein, das das Maus-CCR5-Peptid enthält, was weiter die Spezifität dieser
Auto-Antikörper
und die therapeutische Nützlichkeit
von Aspekten der Erfindung demonstriert. Die Inhibition, die in
diesen Tests beobachtet wurde, war konsistent, wiederholbar, spezifisch
und ähnlich
einem monoclonalen Kontrollantikörper
gegen die zweite EC-Schleife von menschlichem CCR5.
-
Die
erste EC-Schleife von mCCR5 wurde für unsere anfänglichen
Untersuchungen gewählt,
weil sie uns ermöglichte,
simultan unseren Ansatz für
die B-Zell-Toleranzbrechung zu testen und ein neues Verfahren zum
Induzieren des Körpers
eines Individuums, eine HIV-1-Infektion zu inhibieren, zu liefern.
Da HIV-1-infizierte
Individuen, die heterozygot für
ein inaktives CCR5-Allel sind, ein verzögertes Fortschreiten zu AIDS
haben, kann sogar eine teilweise Reduktion der CCR5-Expression klinisch
signifikante Wirkungen haben. (Liu, R. et al., Cell, 86:367–77 (1996);
Samson, M. et al., Nature (London), 382:722–5 (1996); Winkler, C. et al.,
Science, 279:389–93
(1998)). Unsere Ergebnisse zeigen auch, dass Primaten die Fähigkeit
haben, Antikörper
zu produzieren, die spezifisch gegen CCR5 sind, vorausgesetzt, dass
das Antigen in einem geeigneten Immunogen präsentiert wird.
-
Wir
beobachteten keine schädlichen
Wirkungen der Auto-Antikörper-Induktion
in Mäusen,
die für sechs
Monate nach der anfänglichen
Beimpfung verfolgt wurden. Obwohl wir nicht auf auto-reaktive T-Zellen testeten,
würden
wir nicht erwarten, die T-Zell-Toleranz gegenüber CCR5 zu brechen. Während der
Entwicklung des Immunsystems wird streng gegen T-Zellen, die zentrale
Auto-Antigene erkennen, selektiert. Vermutlich ist die T-Zell-Hilfe,
die für
Immunglobulin-Klassen-Umschaltung nötig ist, um anti-CCR5-IgG zu
produzieren, gegen das gebundene virale Protein gerichtet. Umgekehrt
gibt es in erwachsenen Tieren eine kontinuierliche Herstellung von
Antikörpern
mit neuen Spezifitäten
als ein Ergebnis der RAG-Reaktivierung und des peripheren Editierens
von B-Zell-Rezeptorgenen. (Han, S. et al., Science, 278:301–5 (1998);
Papavasiliou, F. et al., Science, 278:298–301 (1998); Hertz, M. et al.,
Nature, 394:292–5
(1998)).
-
Ein konjugiertes VLP,
das die Immuntoleranz bricht und die TNF-α-Aktivität inhibiert
-
Unser
zweiter Ansatz, die B-Zell-Toleranz zu brechen, involviert die Verwendung
von konjugierten VLPs, die durch die Zugabe von Tolerogenen zu der äußeren Oberfläche von
vorgeformten VLPs konstruiert wurden. Sobald sie zusammengelagert
sind, sind VLPs und kapsomere Strukturen ziemlich stabil, und die
Zugabe von großen
oder kleinen Tolerogenen kann leicht erreicht werden. Im Gegensatz
zum chimären
VLP-Ansatz, bei dem die Größe des Tolerogens
gewöhnlich
auf Grund der Störung
der Selbstzusammenlagerung klein ist, ermöglicht der konjugierte VLP-Ansatz
die Zusammenlagerung von größeren Tolerogenen
zum VLP, was mehrere Antikörper-Epitope
und daher einen diverseren Satz von Auto-Antikörpern liefern würde. Diese
Strategie könnte
auch auf Polypeptide mit verschiedenartigerer Sequenz und Größe anwendbar
sein, als es die genetische Insertion der Sequenzen in das Hauptkapsidprotein
würde.
-
In
unseren ersten Experimenten unter Verwendung des konjugierten VLP-Ansatzes banden wir
das Tolerogen TNF-α durch
eine Biotin-Streptavidin-Interaktion an VLPs. Von L1-VLPs wurde
gezeigt, dass sie unter Verwendung von Sulfo-NHS-Biotin (Pierce) schwer biotinyliert
sind, was exponierte Lysinreste biotinyliert. Unter sättigenden
Bedingungen banden die biotinylierten VLPs Streptavidin in einer
Rate von ungefähr
drei Streptavidin-Tetrameren pro einem L1-Molekül. Dieses Ergebnis lieferte
einen Hinweis, dass ein Streptavidin/Tolerogen-Fusionsprotein dem
Immunsystem als eine dichte, geordnete und eng verpackte Anordnung
von Epitopen präsentiert
werden könnte.
-
Dementsprechend
erzeugten wir in E. coli ein Fusionsprotein, das den Streptavidin-Kern,
gebunden an ein 20 Aminosäuren-langes
Fragment von Maus-TNF-α, umfasst,
bezeichnet als SA-TNF-α.
Das Fusionsprotein wurde als unlösliche
Einschlusskörper
aufgereinigt, in Guanidin-HCl solubilisiert und durch Dialyse gegen
einen physiologischen Puffer neu gefaltet. Das neu gefaltete Fusionsprotein
wurde dann an biotinylierte L1-VLPs gebunden, wie oben beschrieben
präpariert,
um das SA-TNF-α/VLP-Immunogen
zu bilden. Das SA-TNF-α-Fusionsprotein
band mit hoher Besetzung an biotinylierte VLPs (
6).
Als Nächstes
wurde das SA-TNF-α/VLP-Immunogen in Mäuse injiziert,
um eine Auto-Antikörper-Reaktion
hervorzurufen. Zwei Injektionen der konjugierten VLPs in Mäuse (3 × 5 g) induzierten
hohe Titer von Antikörpern,
die natürlichen Maus-TNF
in einem ELISA banden (Siehe Tabelle 1). Im Gegensatz dazu scheiterte
die Immunisierung mit entweder SA-TNF-α alleine oder VLP alleine, eine
konsistente oder hohe Auto-Antikörper-Reaktion
hervorzurufen. (Siehe Tabellen 2 und 3). Nach der dritten Injektion
von SA-TNF-α/VLP
erreichten die Titer von TNF-α-Antikörpern in
allen Mäusen
10
5, TABELLE
1 Maus-Titer
nach zwei Immunisierungen mit dem SA-TNF-α-Protein, gekoppelt an biotinylierte
VLPs
TABELLE
2 Maus-Titer
nach zwei Immunisierungen mit dem SA-TNF-α-Protein alleine
TABELLE
3 Maus-Titer
nach zwei Immunisierungen mit VLPs alleine
-
Diese
Ergebnisse zeigten, dass das SA-TNF-α/VLP-Immunogen wirksam die B-Zell-Toleranz
brach. Mehr Hinweise, dass das konjugierte VLP wirksam die B-Zell-Toleranz brach, wurden
von TNF-α-Cytotoxizitäts-Tests
erhalten. In diesen Experimenten wurde die Fähigkeit des SA-TNF-α/VLP-Immunogens,
TNF-vermittelte Apoptose einer Indikator-Zelllinie (L929-Zellen)
zu verhindern, bestimmt. Seren, die von Mäusen erhalten wurden, die entweder
mit Streptavidin-gebundenen VLPs (Kontrollen) oder SA-TNF-α/VLPs beimpft wurden,
wurden mit TNF-α inkubiert,
und die mit Seren behandelten oder nicht mit Seren behandelten TNF-α-Proben wurden
zu den Zellen in Kultur zugefügt.
Die Fähigkeit
der Seren, die TNF-α-Aktivität zu neutralisieren,
wurde durch einen Anstieg im Protzentsatz der überlebenden Zellen gemessen.
Seren von den SA-TNF-α/VLP-beimpften
Mäusen
(in einer 5%-Lösung)
führten
zu einem dreifachen Anstieg des Zell-Überlebens über die Hintergrundspiegel
(7). Angesichts der viel versprechenden Ergebnisse
mit den Maus-TNF-Fusionsproteinen machten wir ähnliche Streptavidin-Fusionsproteine
für jede
der vier extrazellulären
Domänen
von Makaken-CCR5. Alle vier Fusionsproteine sind von E. coli-Einschlusskörpern hergestellt und
aufgereinigt worden. Wir haben drei der vier so neu falten können, dass
sie biotinylierte VLPs stark binden.
-
Wie
in der obigen Diskussion und den folgenden Beispielen gezeigt wird,
kann eine Peptidsequenz, die einem Tolerogen entspricht, B-Zell-Toleranz
gegenüber
dem natürlichen
Protein aufheben, wenn sie im Zusammenhang einer hoch-organisierten
Anordnung von zusammengelagerten chimären oder konjugierten viralen
Kapsomeren präsentiert
wird. Die Fähigkeit,
die B-Zell-Toleranz unter Verwendung der hierin beschriebenen Vorgehensweisen
aufzuheben, hat zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten. Zum Beispiel kann
diese Technik verwendet werden, um monoclonale Maus-anti-Selbstantikörper herzustellen.
Zusätzlich
ist dieser Ansatz wirksam als ein Mittel zum Modulieren der Aktivität eines
löslichen
Proteins, um seine Funktion in normalen oder Krankheits-Vorgängen in
Versuchstiermodellen zu untersuchen. Darüber hinaus liefert die Induktion von
Auto-Antikörpern
eine wirksame Alternative zur monoclonalen Antikörper-Therapie für menschliche
Krankheiten wie die Behandlung von Brustkrebs und rheumatoider Arthritis
mit Antikörpern,
die gegen ErbB-2 beziehungsweise TNF gerichtet sind (Maini et al.,
Immunol. Rev., 144:195 (1995); Baselga et al., J. Clin. Oncol., 14:737
(1996)). Die untenstehende Diskussion beschreibt mehrere Aspekte,
die die Ausführungsformen
der Erfindung betreffen.
-
Unterlagen und kapsomere
Strukturen
-
Während virusähnliche
Partikel oder kapsomere Strukturen ein bevorzugtes System für die Abgabe von
Selbstpeptiden an das Immunsystem repräsentieren, um die Produktion
von Auto-Antikörpern
zu stimulieren, wollen wir auch, dass die Erfindung andere strukturierte
Zusammenlagerungen behandelt, die ein Tolerogen in einer geordneten,
sich wiederholenden Anordnung mit engem Abstand präsentieren
können.
Diese Unterlagen haben einen geordneten Aufbau aus Untereinheiten
und ermöglichen,
dass zumindest ein B-Zell-Epitop eines Tolerogens in einer regelmäßigen, sich
wiederholenden Anordnung an die Unterlage gebunden wird. Vorzugsweise
sind die Unterlagen und kapsomeren Strukturen in der Lage, ein Antigen
mit einem Abstand von etwa 10–500 Ångström, vorteilhaft
etwa 50–300 Ångström und vorzugsweise
etwa 100 Ångström zu präsentieren.
Modifizierte T-unabhängige Typ-2-Antigene
(TI-2) können
sich in dieser Hinsicht wie VLPs verhalten. Diese schließen ein
Pneumokokken-Polysaccharid, ein polymerisiertes Salmonella-Flagellin,
Dextran und Hapten-konjugiertes Ficol (Polysaccharose) ein.
-
Obwohl
virusähnliche
Partikel von Papillomavirus in der hierin präsentierten beispielhaften Demonstration
angewendet worden sind, werden virusähnliche Partikel von anderen
Papillomaviren und nicht-Papillomaviren auch für die Verwendung zur Stimulation
der Produktion von Auto-Antikörpern
in Betracht gezogen. Infektiöses
Virus wird auch vorgesehen. Abgeschwächte oder von Natur aus nicht-pathogene
Viren können
auf ähnliche
Weise modifiziert und verwendet werden, um Auto-Antikörper herzustellen.
Beispiele von chimären VLPs,
die für
die Verwendung im Zusammenhang mit der Erfindung besonders in Betracht
gezogen werden, sind jene, die in Intervirology, 39:1 (1996) beschrieben
werden und hierin durch Bezugnahme inkorporiert sind. Unter den
chimären
VLPs, die für
die Verwendung zur Stimulierung der Produktion von Auto-Antikörpern in Betracht
gezogen werden, sind: BPV-1, HPV-1, HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18,
HPV-33, HPV-45, CRPV und COPV. Auch in Betracht gezogen werden:
B19-Parvovirus, Hepatitis-B-Virus-Kernpartikel, Hepatitis-B-Virus-Oberfächenantigenpartikel,
HIV-gag-Partikel,
Tabak-Mosaikvirus, Langbohnen-Mosaikvirus, Hefe-Ty-Partikel und
RNA-Phage. Virusähnliche
Partikel sind erzeugt worden, und chimäre VLPs können für SV40, Polyomavirus, Adenovirus,
Herpes simplex, Rotavirus und Norwalk-Virus hergestellt werden.
Bemerkenswerterweise haben Fachleute schon die vollständige Nucleotidsequenz
des gesamten Genoms von vielen Papillomaviren bestimmt, einschließlich: BPV-1,
BPV-2, BPV-4, CRPV, DPV, EPV, HPV-1, HPV-5, HPV-6, HPV-8, HPV-11,
HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 und RhPV. Bevorzugte Kapsidproteine,
die verwendet werden, um die kapsomeren Strukturen von Ausführungsformen
der Erfindung zu konstruieren, schließen jedoch Proteine von ikosaedrischen
Viren oder Viren, die einen natürlichen
Säuger-Reservoirwirt
haben, ein. So sind Polynucleotidsequenzen, die viele unterschiedliche
Haupt- und Neben-Hüllenproteine
codieren, die im Zusammenhang mit den hierin beschriebenen Verfahren
verwendet werden können,
schon bekannt.
-
Es
ist selbstverständlich,
dass VLPs, die Haupt- und/oder Neben-Hüllenproteine
einschließen,
verwendet werden können,
um immunogene Zusammensetzungen gemäß den hierin offenbarten Verfahren
herzustellen. In dem bestimmten Fall des Papillomavirus-L2-Neben-Hüllenproteins
ist es selbstverständlich,
dass L2-Chimäre
das inserierte Antigen auf der Oberfläche aufweisen können. Die
Ziel-Antigene liegen außen.
Bei einer L2/E7-Fusion, die wir verwendet haben, um Papilloma-E7-Antikörper herzustellen,
sind die ersten 110 Aminosäuren
von BPV-L2 an die gesamte HPV16-E7-Polypeptidsequenz fusioniert,
wenn sie in VLPs inkorporiert ist. (Lowy et al., US-Patent Nr. 5,618,536,
das hierin durch Bezugnahme inkorporiert ist.) In diesem Fall wurde
die E7-Sequenz an eine Stelle von L2 fusioniert, von der vorher
gezeigt worden war, dass sie einem virusneutralisierenden Epitop
entspricht (Roden, et al., J. Virol., 68:7570 (1994)). In der untenstehenden
Offenbarung werden einige Ansätze
geliefert, um Tolerogene an die geordneten Zusammenlagerungen der
Erfindung zu binden.
-
Ansätze, um Unterlagen oder kapsomere
Strukturen herzustellen, die Tolerogene präsentieren
-
Wie
oben diskutiert wurde, können
im Allgemeinen zwei unterschiedliche Ansätze angewendet werden, um Tolerogene
in die Strukturen von virusähnlichen
Partikeln zu inkorporieren. Durch einen Ansatz wird zuerst ein genetisches
Konstrukt gebildet, das eine Aminosäuresequenz codiert, die sowohl
die Virus-Hüllenprotein-Sequenzen als auch
die Selbstpeptid-Sequenz von Interesse einschließt. Das resultierende Konstrukt codiert
ein einzelnes chimäres
Polypeptid, das das Selbstpeptid auf einer äußeren Oberfläche eines
Partikels nach der Selbstzusammenlagerung des Hybrid-Hüllenproteins
zeigt, um kapsomere Strukturen oder VLPs zu bilden. Gemäß dem zweiten
Ansatz ist das Selbstpeptid, das auf der äußeren Oberfläche des
VLPs dargelegt wird, direkt oder indirekt an eine Vielzahl von Untereinheits-Proteinen
gebunden, die ein vorgeformtes VLP umfassen. Zum Beispiel kann das
Wildtyp-Papillomavirus-L1-Protein ein rekombinantes Hüllenprotein
sein, das an ein erstes Bindungsagens gekoppelt ist, das eine Assoziationskonstante
für ein
zweites Bindungsagens im Bereich von 107–1010, von 104–108, von 1010–102 oder von 102–106 aufweist. Das zweite Bindungsagens kann für die Kopplung
an das Selbstpeptid angepasst werden. In einer besonders bevorzugten
Ausführungsform
der Erfindung werden zuerst biotinylierte Wildtyp-VLPs produziert.
Dies kann durch Biotinylierung von vorgeformten VLPs erreicht werden.
Als Nächstes
werden die biotinylierten VLPs mit einem Avidin- oder Streptavidin-gebundenen
Selbstpolypeptid kombiniert, um Komplexe zu bilden, die Oberflächen aufweisen,
auf denen das Selbstpeptid präsentiert
wird. Auf diese Weise werden multiple Kopien des Selbstpeptids indirekt
an das VLP gekoppelt, so dass das Selbstpeptid nicht in das Peptid-Rückgrat des
Hüllenproteins
integriert wird. So sollen Zusammensetzungen, die ein Hybridhüllenprotein
einschließen,
das an ein Selbstpeptid entweder als ein integraler Teil der Hybrid-Hüllenprotein-Polypeptidsequenz
oder indirekt wie durch eine Biotinverbindung gebunden ist, in den
Bereich der Erfindung fallen.
-
Ausführungsformen
der Erfindung liefern wünschenswerterweise
Tolerogene in solch einer Form oder auf solche Weise, dass eine
ausreichende Affinität,
Aufhebung der B-Zell-Toleranz oder Inhibition eines Krankheitsstatus
(z.B. eine virale Infektion, Neoplasie oder Entzündung) erzielt wird. Während ein
natürliches
monomerisches Tolerogen (das heißt, ein Tolerogen, dass ein
diskretes Molekül
präsentiert
und so nur eine kleine Anzahl von Epitopen trägt) ausreichend sein kann,
um eine erwünschte
Reaktion zu erreichen, kann ein synthetisches Tolerogen oder ein
multimeres Immunogen (z.B. ein VLP, das multiple Moleküle des Tolerogens
präsentiert
und so eine größere Anzahl
der selben Epitope aufweist) oftmals eine stärkere Immunreaktion hervorrufen.
Es sollte bemerkt werden, dass der Ausdruck „multimer" die Anwesenheit von mehr als einem
identischen Molekül
auf einer Unterlage oder einer kapsomeren Struktur bezeichnet. Zum
Beispiel einige identische Moleküle
von CCR5 oder Fragmente davon, die auf einem VLP präsentiert
sind. Der Ausdruck multimer sollte vom Ausdruck „multimerisiert" unterschieden werden,
der eine Unterlage oder eine kapsomere Struktur bezeichnet, die
an Hybridmoleküle
gebunden sind, wobei jedes Hybridmolekül multiple Kopien des Tolerogens oder
von individuellen Epitopen davon, die in Tandemformation gebunden
sind, umfasst. Zum Beispiel kann jedes individuelle multimerisierte
Tolerogen ein 20 Aminosäuren
langes Fragment von CCR5 umfassen, das zufällig mit oder ohne zwischengelagerte
Linkern (z.B. λ-Phagen-Linker)
wiederholt wird, und eine Vielzahl von multimeren Tolerogenen kann
an eine Unterlage oder eine kapsomere Struktur gebunden sein, um
ein multimerisiertes/multimeres Immunogen zu bilden.
-
Ein
multimeres Immunogen (synthetisch oder natürlich), das wirksam die B-Zell-Toleranz bricht,
kann durch Binden von Tolerogenen an eine Unterlage oder eine kapsomere
Struktur erhalten werden. Unterlagen, die für diesen Zweck geeignet sind,
schließen
Polyacrylamid-Kugeln, Agarose-Kugeln, Polystyrol-Kugeln, magnetische
Kugeln, Latex-Partikel, Kohlenhydrat-Zusammenlagerungen (z.B.
-
Oligosaccharid-basierende
Kugeln oder Zusammenlagerungen), Lipid-Zusammenlagerungen (z.B. Lipidmembranen),
Protein-Zusammenlagerungen oder Polymere (z.B. Poly-L-Lysin oder
Poly-D, L-Alanin) und andere Unterlagen, von denen auf dem Fachgebiet
bekannt ist, dass sie eine geordnete, symmetrische Zusammenlagerung
von Untereinheiten aufweisen, ein, sind aber nicht darauf limitiert.
Anorganische Träger
wie Siliconoxid-Material (z.B. Silica-Gel, Zeolith, Kieselgur oder
aminiertes Glas), an die das Tolerogen kovalent durch eine Hydroxyl-,
Carboxyl- oder Amino-Gruppe gebunden ist, und eine reaktive Gruppe
am Träger
können
auch mit einigen Ausführungsformen
verwendet werden.
-
In
einigen Ausführungsformen
ist das Tolerogen an die Unterlage oder die kapsomere Struktur durch einen
Linker gebunden, der zwischen zwei chemisch reaktiven Spezies, einer
Ligand/Rezeptor-Interaktion oder einem Peptid gebunden werden kann,
das an das Tolerogen gebunden worden ist, um das Anlagern an die
Unterlage oder die kapsomere Struktur zu ermöglichen oder um größere Freiheit
der Assoziierung des Tolerogens mit einer Zelle des Immunsystems
zu liefern. In manchen Ausführungsformen
hat die Unterlage oder die kapsomere Struktur zum Beispiel eine
hydrophobe Oberfläche,
die mit einem Teil des Tolerogens durch eine hydrophobe nicht-kovalente
Interaktion interagiert. In manchen Fällen ist die hydrophobe Oberfläche der Unterlage
ein Polymer wie Plastik oder jegliches andere Polymer, in dem hydrophobe
Gruppen wie Polystyrol, Polyethylen oder Polyvinyl verbunden worden
sind.
-
Zusätzlich kann
das Tolerogen an eine Unterlage oder eine kapsomere Struktur einschließlich Proteinen
und Oligo/Polysacchariden (z.B. Cellulose, Stärke, Glycogen, Chitosan oder
aminierte Sepharose) kovalent gebunden sein. In diesen letzteren
Ausführungsformen
wird eine reaktive Gruppe auf einem Tolerogen wie eine Hydroxyl-
oder eine Amino-Gruppe verwendet, um eine reaktive Gruppe auf der
Unterlage oder der kapsomeren Struktur zu binden, um die kovalente
Bindung zu bilden. Die Ausführungsformen
können
auch eine Unterlage mit einer geladenen Oberfläche umfassen, die mit dem Tolerogen
interagiert. Zusätzliche
Ausführungsformen
umfassen eine Unterlage, die andere reaktive Gruppen aufweist, die
chemisch aktiviert sind, um ein Tolerogen anzulagern. Zum Beispiel
werden Cyanogenbromid-aktivierte Matrices, Epoxid-aktivierte Matrices,
Thiol- und Thiolpropyl-Gele, Nitrophenyl-Chlorformiat- und N-Hydroxysuccinimid-Chlorformiat-Bindungen oder Oxiranacryl-Unterlagen
verwendet. (Sigma).
-
In
anderen Ausführungsformen
wird die Interaktion von Biotin mit avidinähnlichen Molekülen (z.B. Streptavidin
und Neutraavidin) ausgenutzt. VLPs können, wie vorher dargelegt,
biotinyliert sein und können leicht
an Tolerogen/Streptavidin-Fusionsproteine gebunden werden. Durch
das Inserieren von mehreren Lysin- oder Cystein-Molekülen in Kapsidproteine
kann eine größere Biotinylierung
erzielt werden, und so kann mehr Tolerogen auf die Oberfläche eines
VLPs zugefügt
werden. Darüber
hinaus können
durch die Verwendung von ortsspezifischen Mutagenese-Techniken Lysin-
oder Cystein-Moleküle
strategisch inseriert werden, um ein VLP zu etablieren, das eine
dichte und hochgradig organisierte, sich wiederholende Anordnung
von Tolerogenen aufweist. Wie ein Fachmann sofort anerkennt, kann
die Umkehrung auch durchgeführt
werden, das heißt, die
Verwendung von Streptavidin/Kapsidprotein-Fusionen und biotinylierten
Tolerogenen. In einer anderen Ausführungsform werden λ-Linker von
geeigneter Länge
zwischen das Tolerogen und die Unterlage oder die kapsomere Struktur
inseriert, um größere Flexibilität anzuregen
und jegliche sterische Behinderung, die vorhanden sein kann, zu überwinden.
Die Bestimmung einer geeigneten Länge des Linkers, die eine optimale
Immunreaktion ermöglicht,
kann durch Durchmusterung des Tolerogens mit verschiedenen Linkern
in den verschiedenen hierin beschriebenen Tests gemacht werden.
-
Eine
zusammengesetzte Unterlage, die mehr als einen Typ eines Tolerogens
aufweist, ist auch eine Ausführungsform.
Eine „zusammengesetzte
Unterlage" kann
eine makromolekulare Struktur sein, die verwendet wird, um zwei
oder mehrere unterschiedliche Tolerogene zu verbinden oder zu immobilisieren.
Die zusammengesetzten Unterlagen werden auch durch Anwenden von
hydrophoben Interaktionen und kovalenten Bindungen, die durch reaktive
Gruppen gebildet wurden, wie oben detailliert ausgeführt, konstruiert.
Darüber
hinaus werden in manchen Ausführungsformen
die Linker wie λ-Linker
von geeigneter Länge
zwischen den Tolerogenen und der Unterlage inseriert, um eine größere Flexibilität in den
Molekülen
anzuregen und sterische Behinderung zu überwinden. Die Bestimmung einer
geeigneten Länge
des Linkers, der eine optimale Immunreaktion ermöglicht, kann durch Durchmusterung
der Tolerogene mit verschiedenen Linkern in den Tests, die in der
vorliegenden Offenbarung detailliert ausgeführt werden, gemacht werden.
-
In
anderen Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung haben die multimeren und zusammengesetzten
Unterlagen, die oben diskutiert wurden, multimerisierte Tolerogene
angelagert, um eine „multimerisierte-multimere
Unterlage" beziehungsweise
eine „multimerisierte-zusammengesetzte
Unterlage" zu bilden.
Eine Ausführungsform
eines multimerisierten Tolerogens wird zum Beispiel durch Bilden
eines Expressionskonstrukts erhalten, das zwei oder mehrere Nucleotidsequenzen
aufweist, die ein Tolerogen codieren und durch Verwendung von konventionellen
Techniken in der Molekularbiologie miteinander verbunden sind. Das
exprimierte Fusionsprotein ist eine Ausführungsform eines multimerisierten
Agens und wird dann an eine Unterlage gebunden. Eine Unterlage,
die viele solche multimerisierten Agenzien aufweist, wird als eine
multimerisierte-multimere Unterlage bezeichnet. Die multimerisierte
Form eines Tolerogens kann auf Grund der Fähigkeit, ein Agens mit einer
besseren Fähigkeit
zu erhalten, eine Immunantwort zu induzieren und so die B-Zell-Toleranz zu
brechen, für
viele Anwendungen vorteilhaft sein. Die Inkorporation von Linkern
oder Spacern, wie die flexiblen λ-Linker
zwischen den Proteindomänen,
die das multimerisierte Agens ausmachen, kann auch für manche
Ausführungsformen
günstig
sein. Die Insertion von λ-Linkern
mit einer geeigneten Länge
zwischen den Proteinbindungsdomänen
regt zum Beispiel eine größere Flexibilität des Moleküls an und überwindet
sterische Behinderung zwischen den Domänen. In ähnlicher Weise regt die Insertion
von Linkern zwischen den multimerisierten Tolerogenen und der Unterlage
eine größere Flexibilität an und
reduziert sterische Behinderung, die durch die Unterlage oder die
kapsomere Struktur präsentiert
wird. Die Bestimmung einer geeigneten Länge des Linkers, der eine optimale
Immunreaktion ermöglicht,
kann durch Screenen der Tolerogene mit verschiedenen Linkern in
den Tests, die in dieser Offenbarung detailliert dargelegt werden,
erreicht werden. In einer ähnlichen
Weise können
zusammengesetzt-multimerisierte-multimere
Unterlagen mit und ohne Linker durch Binden von mehr als einem unterschiedlichen
multimerisierten Tolerogen an eine Unterlage konstruiert werden.
-
Besonders
bevorzugte Stellen auf virusähnlichen
Partikeln für
die Insertion von Selbstantigenen, gegen die eine Autoimmunreaktion
gewünscht
wird, sind virusneutralisierende Epitope. Dies ist so, weil virusneutralisierende
Epitope typischerweise auf der Oberfläche des Virus angelegt sind
und für
eine Antikörperbindung verfügbar sind.
Diese Eigenschaften sind für
das Präsentieren
der Selbstantigene gegenüber
dem Immunsystem im strukturellen Zusammenhang eines chimären virusähnlichen
Partikels wünschenswert.
Verfahren zum Identifizieren von Papillomavirus-neutralisierenden
Epitopen sind von Ludmerer et al. in J. Virol., 70:4791 (1997);
Ludmerer et al. in J. Virol., 71:3834 (1997) und von Roden et al.
in J. Virol., 71:6247 (1997) beschrieben worden. Im Allgemeinen
können
Verfahren zum Identifizieren von virusneutralisierenden Epitopen
einen monoclonalen Antikörper,
der vorzugsweise an eines von zwei eng verwandten L1-Proteinen bindet,
und dann systematisches Herstellen von Rekombinanten, die die spezifischen
Aminosäure-Unterschiede zwischen
ihnen neu sortieren, anwenden. Alternativ können die Polypeptidsequenzen,
die die L1-Proteine von verwandten Viren, zum Beispiel Papillomaviren,
codieren, aneinander ausgerichtet werden, um Segmente zu identifizieren, die
am unterschiedlichsten in der Länge
sind. Diese hoch variablen Positionen werden wahrscheinlich externe oder
interne Schleifen des Kapsidproteins sein. Die externen Schleifen
werden Kandidaten für
Substitutionen durch Polypeptidsequenzen von Selbstantigenen sein,
für die
eine Autoimmunreaktion gesucht wird. So sind virusneutralisierende
Epitope, die unter Verwendung von Routine-Laborverfahren leicht
identifiziert werden können,
bevorzugte Stellen für
die Anordnung von Selbstpeptiden in den VLPs oder den kapsomeren
Strukturen der Erfindung. Zum Beispiel würde die Stelle eines virusneutralisierenden
Epitops auf BPV-1 eine bevorzugte Stelle für die Anordnung eines Selbstpeptids
auf einem entsprechenden VLP sein. Im unten stehenden Abschnitt
wird eine Diskussion der Größe der Tolerogene
geliefert, die mit Aspekten der Erfindung verwendet werden können.
-
Die Größe eines Tolerogens auf der
Unterlage oder der kapsomeren Struktur
-
Im
Allgemeinen muss die Zahl der Aminosäuren, die das Antigen repräsentieren,
das in die Struktur des viralen Hüllenproteins inkorporiert oder
an die Unterlage oder die kapsomere Struktur gebunden wird, groß genug
sein, um einem Epitop zu entsprechen, das charakteristisch für das Antigen
ist und das in die Antigen-Bindungsstelle eines Antikörpers passen
kann. Da im Allgemeinen akzeptiert wird, dass eine lineare Anordnung
von 5 bis 6 Aminosäuren
ausreichend ist, um an eine Antigen-Bindungsstelle zu binden, wird
es bevorzugt, dass mindestens 5 Aminosäuren des Selbstantigens in
die Struktur des Immunogens inkorporiert sind. Es ist jedoch selbstverständlich,
dass eine größere Anzahl
von Aminosäuren
auch mit guten Ergebnissen verwendet werden kann. Im hierin dargelegten
Beispiel wurden 16 Aminosäuren
des Maus-CCR5-Proteins in die Struktur eines L1-Haupt-Hüllenproteins mit guten Ergebnissen
eingebracht. Längere
Polypeptidsequenzen, die Tolerogene repräsentieren, werden auch für die Integration
in die Struktur der viralen Hülle
für die
Verwendung als Immunogene für
die Induktion von anti-Selbst-Immunreaktionen
in Betracht gezogen. Daher wird es bevorzugt, dass das Immunogene
virusähnliche
Partikel Selbst-Polypeptidsequenzen mit mindestens 5 Aminosäuren Länge inkorporiert,
aber die Länge
des Tolerogens kann größer als
200 Aminosäuren
sein und kann ein Volllängen-Protein
einschließen.
Ein wünschenswerter
Bereich ist von 5 bis 200 Aminosäuren.
-
Es
wird in Erwägung
gezogen, dass biotinylierte VLPs in der Lage sein werden, mit Peptiden,
die wesentlich länger
als 16 Aminosäuren
lang sind, einen Komplex zu bilden und sie dem Immunsystem zu präsentieren.
Es ist auch möglich,
eine Polypeptidsequenz, die ein Volllängen-Protein repräsentiert,
in die Struktur eines Hybrid-Nebenhüllenproteins zu inkorporieren.
Unten beschreiben wir die breite Vielfalt von Tolerogenen, die als
eine Ausführungsform
der Erfindung präsentiert
werden können.
-
Viele Typen von Tolerogenen
können
auf einer Unterlage oder einer kapsomeren Struktur präsentiert
werden
-
Die
Erfindung kann unter Verwendung einer breiten Vielfalt von Tolerogenen
ausgeführt
werden. In bevorzugten Ausführungsformen
sind die Tolerogene Selbstantigene. Bevorzugte Selbstantigene schließen jene ein,
für die
von Antikörpern,
die gegen das Selbstantigen gerichtet sind, gezeigt worden ist,
dass sie ein wirksames therapeutisches Mittel sind. Im Allgemeinen
wird das Selbstantigen einem Selbstantigen des Organismus entsprechen,
der mit der Zusammensetzung, die das Selbstantigen, gebunden an
das VLP, einschließt, immunisiert
wird. Daher kann die Sequenz eines menschlichen Selbstpeptids wie
des menschlichen CCR5-Chemokin-Rezeptors,
in die Struktur eines VLP zur Verwendung für die Immunisierung von Menschen eingebracht
werden. Auf diese Art können
Menschen veranlasst werden, Auto-Antikörper zu produzieren. Bestimmte
Beispiele von Selbstantigenen, die verwendet werden können, sind
zentrale Selbstantigene wie TNF und CTLA-4.
-
TNF
ist mit einer Reihe von menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht
worden, vor allem als der grundsätzliche
lösliche
Effektor bei rheumatoider Arthritis (RA). (Maini et al., Imm. Reviews,
144:195 (1995)). Rheumatoide Arthritis ist eine chronische und schmerzhafte
Erkrankung von multiplen Gelenken, von der angenommen wird, dass
sie rund 1 % der Bevölkerung
weltweit betrifft. Die Symptome der RA werden erfolglos mit Arzneistoff-Therapie
behandelt. Dies hat das Verlangen geweckt, alternative therapeutische
Strategien zu entwickeln, die mehr die Effektoren der Erkrankung
als die Symptome anzielen. Monoclonale anti-TNF-Antikörpertherapie hat eine dramatische
Verbesserung der RA in klinischen Versuchen an Menschen sowohl nach
objektiven als auch subjektiven Maßstäben produziert (Feldman et
al., Annu. Rev. Immunol., 14:397 (1996)). Unglücklicherweise ist bewiesen
worden, dass die Vorteile transient sind, und dieser Verlust der
Wirksamkeit hat mit der Entwicklung von Antikörpern gegen die monoclonalen
Antikörper
korreliert. Gekoppelt mit der Tatsache, dass TNF ein kleines lösliches
Protein ist, das in relative niedrigen Serumkonzentrationen biologisch
aktiv ist, machen diese Beobachtungen TNF zu einem attraktiven Ziel
für einen
Auto-Antikörper-induzierenden
Impfstoff. Darüber
hinaus gibt es ein gutes Mausmodell für TNF-vermittelte RA, in dem
das Konzept getestet werden soll (Thorbecke et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 89:7375 (1992)).
-
CTLA-4
ist ein membrangebundener Rezeptor von T-Zellen, der ein wichtiger
Regulator von B7-vermittelter Co-Stimulierung von T-Zellen zu sein
scheint (Thompson et al., Immunity, 7:445 (1997)). Co-Stimulierung
ist kritisch für
die Erzeugung von wirksamen CD8+-T-Zell-vermittelten cytotoxischen
T-Lymphocyten (CTL)-Reaktionen. Ob CTLA-4 normalerweise wirkt, um
positive oder negative Signale nach B7-Beteiligung zu vermitteln,
ist derzeit ungelöst
(Zheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:6284 (1998)). Antikörper gegen CTLA-4
potenzieren jedoch deutlich die Bildung von CTLs als Reaktion auf
Tumor-Antigene in Maus-Tumormodellen.
So könnte
ein Impfstoff für
die Induzierung von Auto-Antikörpern
gegen CTLA-4 verwendet werden, um die Immunreaktion auf Tumoren
entweder allein oder in Kombination mit Tumor-Antigen-spezifischen
Impfstoffen zu steigern (Leach et al., Science, 271:1734 (1996)).
Besonders können
transiente Autoimmun-Erkrankungssymptome
akzeptierbare Nebenwirkungen bei Patienten sein, die weit verstreute
oder nicht-operierbare Krebsarten aufweisen, die nicht auf konventionelle
Therapien reagieren.
-
Andere
in Betracht gezogene Tolerogene schließen virale Antigene von Viren
ein, die Menschen chronisch infizieren, einschließlich, aber
nicht limitiert auf, Hepatitis C-Virus (HCV), Hepatitis B-Virus
(HBV) und HIV, Chemokine und Moleküle, die mit Neoplasie und Angiogenese
assoziiert sind. Unter Verwendung der hierin beschriebenen Lehren
kann eine Fachperson eine Vielzahl von unterschiedlichen Tolerogenen,
einschließlich
Nucleinsäuren,
Peptiden, Lipiden und Kohlenhydraten, auf biotinylierten VLPs präsentieren.
Zum Beispiel kann ein Sandwich-Ansatz angewendet werden; in dem
eine biotinylierte Nucleinsäure
zuerst an Streptavidin gebunden wird und dann der Nucleinsäure/Streptavidin-Komplex
an ein biotinyliertes VLP gebunden wird. Auf ähnliche Weise können Lipide
unter Verwendung von konventioneller Chemie an Biotin gebunden,
an Streptavidin gebunden und an biotinylierte VLPs gebunden werden.
-
Die
Fähigkeit,
die B-Zell-Toleranz gegenüber
kleinen organischen Verbindungen zu brechen, wurde etabliert, während Experimente
an biotinylierten VLPs durchgeführt
wurden. Biotin ist ein Vitamin und ein Selbst-Tolerogen in Mäusen. Wir
stellten biotinylierte VLPs, wie vorher beschrieben, her und injizierten
diese Immunogene wie vorher in Mäuse.
Die Anwesenheit von anti-Biotin-Antikörpern wurde
durch einen ELISA-Test nachgewiesen, in dem biotinyliertes BSA als
das Ziel-Antigen verwendet wurde. Als eine Negativkontrolle wurde
die Reaktivität
der Seren auf unbiotinyliertes BSA bestimmt. Die anti-Biotin-Antikörper in
den Seren von drei Mäusen
war bei Titern von 100, 100 und 10, und keine Reaktivität auf das
unbiotinylierte BSA wurde nachgewiesen.
-
Die
oben beschriebenen Zusammensetzungen können als biotechnologische
Werkzeuge verwendet werden, zum Beispiel Binden an eine isolierte
Zelle des Immunsystems, das ein Modellsystem für die Studie von B-Zell-Toleranz
liefern kann, werden aber vorzugsweise in Therapeutika und prophylaktische
Pharmazeutika für
die Behandlung und Verhinderung einer menschlichen Erkrankung inkorporiert.
Die untenstehende Offenbarung diskutiert einige der therapeutischen
und prophylaktischen Ausführungsformen
der Erfindung.
-
Therapeutische und prophylaktische
Anwendungen
-
Die
Zusammensetzungen der Erfindung sind geeignet für die Verwendung in der Behandlung
von Individuen entweder als eine präventive Maßnahme, um Erkrankungen wie
Krebs, virale Infektion oder entzündliche Gegebenheiten zu vermeiden,
oder als ein Therapeutikum, um Individuen zu behandeln, die schon
mit diesen Krankheiten geplagt werden. Obwohl jeder mit den Agenzien
der Erfindung als ein Prophylaktikum behandelt werden könnte, sind
die am meisten geeigneten Individuen Personen, die für Erkrankungen
mit Mediatoren, die einer Ak-Bindung zugänglich sind, gefährdet sind.
-
Die
pharmakologisch aktiven Verbindungen dieser Erfindung können in Übereinstimmung
mit konventionellen Verfahren der galenischen Pharmazie verarbeitet
werden, um Medikamente für
die Verabreichung an Patienten, z.B. Säuger einschließlich Menschen,
zu produzieren. Sie können
in ein pharmazeutisches Produkt mit und ohne Modifikation inkorporiert
werden. Darüber
hinaus sind die Herstellung von Pharmazeutika oder therapeutischen
Agenzien, die die Immunogene der Erfindung auf mehreren Wegen abgeben,
Aspekte der Erfindung.
-
Die
Verbindungen dieser Erfindung können
in einer Beimischung mit konventionellen Excipienten, d.h. pharmazeutisch
verträglichen
organischen oder anorganischen Trägersubstanzen, die für parenterale,
enterale (z.B. orale) oder örtliche
Verabreichung geeignet sind und die nicht schädlich mit den Zusammensetzungen der
Erfindung reagieren, angewendet werden. Geeignete pharmazeutisch
verträgliche
Träger
schließen
Wasser, Salzlösungen,
Alkohole, Gummi arabicum, Pflanzenöle, Benzyl-Alkohole, Polyethylenglycole,
Gelatine, Kohlenhydrate wie Lactose, Amylose oder Stärke, Magnesiumstearat,
Talk, Kieselsäure,
visköses
Paraffin, Perfumöl,
Fettsäure-Monoglyceride
und -Diglyceride, Pentaerythrit-Fettsäureester, Hydroxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon,
usw. ein, sind aber nicht darauf limitiert. Die pharmazeutischen
Präparate
können
sterilisiert sein und, wenn gewünscht,
mit Hilfsmitteln, z.B. Gleitmitteln, Konservierungsmitteln, Stabilisierern,
Netzmitteln, Emulgatoren, Salzen für die Beeinflussung des osmotischen
Drucks, Puffern, Farbstoffen, Geschmacksstoffen und/oder aromatischen
Substanzen und dergleichen, die nicht schädlich mit den aktiven Verbindungen
reagieren, gemischt werden.
-
Die
wirksame Dosis und das Verfahren der Verabreichung eines bestimmten
Präparats
kann basierend auf dem individuellen Patienten und dem Stadium der
Krankheit so wie anderen Faktoren, die Fachpersonen bekannt sind,
variieren. Die therapeutische Wirksamkeit und Toxizität solcher
Verbindungen kann durch pharmazeutische Standardvorgehensweisen
in Zellkulturen oder Versuchstieren, z.B. ED50 (die Dosis, die bei 50%
der Population therapeutisch wirksam ist) und LD50 (die Dosis, die
bei 50% der Population letal ist) bestimmt werden. Das Dosis-Verhältnis von
toxischen gegenüber
therapeutischen Wirkungen ist der therapeutische Index, und er kann
als das Verhältnis
ED50/LD50 ausgedrückt
werden. Arzneimittel, die große
therapeutische Indizes zeigen, werden bevorzugt. Die Daten, die
von Zellkultur-Tests und Tier-Studien erhalten werden, werden in
der Präparation
eines Bereichs von Dosierungen für
die Verwendung in Menschen verwendet. Die Dosis von solchen Verbindungen
liegt vorzugsweise im Bereich von zirkulierenden Konzentrationen,
die die ED50 mit geringer oder keiner Toxizität einschließen. Die Dosis variiert in
diesem Bereich in Abhängigkeit
von der angewendeten Dosierungsform, der Empfindlichkeit des Patienten
und dem Weg der Verabreichung.
-
Die
genaue Dosis wird durch den individuellen Arzt angesichts des zu
behandelnden Patienten ausgewählt.
Dosierung und Verabreichung werden angepasst, um ausreichende Spiegel
der aktiven Einheit zu liefern oder um die gewünschte Wirkung beizubehalten.
Zusätzliche
Faktoren, die in Betracht gezogen werden können, schließen die
Schwere der Krankheit, das Alter und Gewicht des Patienten, die
Nahrung, die Zeit und Frequenz der Verabreichung, Arzneistoffkombination(en),
Reaktionsempfindlichkeiten und die Toleranz/Reaktion auf die Therapie
ein.
-
Wege
der Verabreichung schließen
transdermal, parenteral, gastrointestinal, transbronchial und transalveolär ein, sind
aber nicht darauf limitiert. Parenterale Wege der Verabreichung
schließen
elektrische oder direkte Injektion wie direkte Injektion in eine
zentralvenöse
Bahn, intravenöse,
intramusculäre,
intraperitoneale oder subcutane Injektion ein, sind aber nicht darauf
limitiert. Gastrointestinale Wege der Verabreichung schließen Nahrungsaufnahme
und rectal ein, sind aber nicht darauf limitiert. Transbronchiale
und transalveolare Wege der Verabreichung schließen die Inhalation entweder
durch den Mund oder intranasal ein, sind aber nicht darauf limitiert.
-
Zusammensetzungen,
die für
die transdermale Verabreichung geeignet sind, schließen pharmazeutisch
verträgliche
Suspensionen, Öle,
Cremen und Salben ein, die direkt auf die Haut aufgetragen oder
in einen schützenden
Träger
wie einen transdermale Vorrichtung („transdermales Pflaster") inkorporiert werden,
sind aber nicht darauf limitiert. Beispiele von geeigneten Cremen,
Salben usw. können
zum Beispiel in der Physician's
Desk Reference gefunden werden. Beispiele von geeigneten transdermalen
Vorrichtungen werden zum Beispiel im US-Patent Nr. 4,818,540 erteilt
am 4. April 1989 an Chinen, et al., das hierin durch Bezugnahme eingeschlossen
ist, beschrieben.
-
Zusammensetzungen,
die für
die parenterale Verabreichung geeignet sind, schließen pharmazeutisch verträgliche sterile
isotonische Lösungen
ein, sind aber nicht darauf limitiert. Solche Lösungen schließen Salzlösung und
phosphatgepufferte Salzlösung
für die
Injektion in eine zentrale Venenbahn, intravenöse, intramusculäre, intraperitoneale
oder subcutane Injektion ein, sind aber nicht darauf limitiert.
-
Zusammensetzungen,
die für
die transbronchiale und transalveoläre Verabreichung geeignet sind, schließen verschiedene
Typen von Aerosolen zur Inhalation ein, sind aber nicht darauf limitiert.
Vorrichtungen, die für
transbronchiale und transalveoläre
Verabreichung geeignet sind, sind auch Ausführungsformen. Solche Vorrichtungen
schließen
Vernebler und Verdampfer ein, sind aber nicht darauf limitiert.
Viele Formen von derzeit erhältlichen
Verneblern und Verdampfern können
leicht angepasst werden, um die Zusammensetzungen der Erfindung
abzugeben.
-
Zusammensetzungen,
die für
die gastrointestinale Verabreichung geeignet sind, schließen pharmazeutisch
verträgliche
Pulver, Pillen oder Flüssigkeiten
zur Einnahme und Suppositorien zur rectalen Verabreichung ein, sind
aber nicht darauf beschränkt.
Auf Grund der Leichtigkeit der Verwendung ist die gastrointestinale
Verabreichung, besonders oral, die bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung.
-
Einige
Mittel zur Verwendung in der Behandlung und Prävention von menschlichen Erkrankungen
werden geliefert. In diesen Aspekten sind die Zusammensetzungen
der Erfindung in Pharmazeutika inkorporiert und können an
Patienten, die sie benötigen,
verabreicht werden. Durch einen Aspekt wird ein Individuum, das gefährdet ist,
an einer HIV-Infektion oder einer anderen chronischen viralen Infektion
zu erkranken, oder ein Individuum, das schon mit HIV oder einer
anderen chronischen viralen Infektion infiziert ist, durch konventionelle
Diagnosetests identifiziert, und dann wird eine therapeutisch oder
prophylaktisch günstige
Menge eines Pharmazeutikums der Erfindung an das Individuum verabreicht.
Ein ähnlicher
Ansatz kann angewendet werden, um chronische entzündliche
Erkrankungen zu behandeln und/oder zu verhindern. Das heißt, Identifizieren eines
bedürftigen
Individuums und dann Verabreichen eines Pharmazeutikums, das eine
Zusammensetzung der Erfindung umfasst. Andere Verfahren der Erfindung
schließen
einen Ansatz ein, um hohe Titer von neutralisierenden Antikörpern zu
erzeugen. Dementsprechend werden Agenzien (z.B. eine Zusammensetzung
der Erfindung) auf ihre Fähigkeit,
die B-Zell-Toleranz zu brechen, identifiziert und werden danach
an ein Individuum, das sie benötigt,
verabreicht. Zusätzliche
Ausführungsformen
schließen
ein Verfahren zur Herstellung von monoclonalen und polyclonalen
Antikörpern
gegen eine Zusammensetzung der Erfindung ein. Diese neuen Antikörper können auch
für die
Behandlung und Verhinderung einer menschlichen Erkrankung in Pharmazeutika
inkorporiert und an Patienten, die sie benötigen, verabreicht werden.
Die untenstehende Offenbarung liefert eine weitere Diskussion dieser
Ansätze.
-
Herstellung von Antikörpern gegen
chimäre
und konjugierte VLPs
-
Nach
der Konstruktion eines chimären
oder konjugierten VLPs können
diese Zusammensetzungen verwendet werden, um Antikörper herzustellen.
(Siehe Beispiel 10). Antikörper,
die ein chimäres
oder konjugiertes VLP erkennen, haben viele Verwendungen, einschließlich biotechnologische
Anwendungen, therapeutische/prophylaktische Anwendungen und diagnostische
Anwendungen, sind aber nicht darauf limitiert. Solche Antikörper schließen polyclonale,
monoclonale, chimäre,
einzelkettige, Fab-Fragmente und Fragmente, die durch eine Fab-Expressions-Genbank produziert
wurden, ein, sind aber nicht darauf limitiert. Neutralisierende Antikörper, d.h.
jene, die CCR5-vermittelte Adhäsion
inhibieren, werden für
Therapeutika besonders bevorzugt.
-
Für die Produktion
von Antikörpern
können
verschiedene Wirte, einschließlich
Ziegen, Kaninchen, Ratten, Mäuse
usw., durch Injektion mit einem chimären oder konjugierten VLP immunisiert
werden. Abhängig von
der Wirtsspezies können
verschiedene Adjuvanzien verwendet werden, um die immunologische
Reaktion zu verstärken.
Solche Adjuvanzien schließen
Freundsches, Mineralgele wie Aluminiumhydroxid und oberflächenaktive
Substanzen wie Lysolecithin, pluronische Polyalkohole, Polyanionen,
Peptide, Ölemulsionen,
KLH („keyhole
limpet hemocyanin")
und Dinitrophenol ein, sind aber nicht darauf limitiert. BCG (Bacillus
Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum sind potenziell nützliche
Adjuvanzien. VLP-basierende Immunogene können jedoch auch ohne die Zugabe
von Adjuvanzien den Titer der Antikörper gegen Tolerogene erhöhen.
-
Monoclonale
Antikörper
gegen ein chimäres
oder konjugiertes VLP können
unter Verwendung jeglicher Technologie hergestellt werden, die die
Produktion von Antikörper-Molekülen durch
permanente Zelllinien in Kultur liefert. Diese schließen die
Hybridom-Technologie, die ursprünglich
von Köhler
und Milstein beschrieben wurde (Nature, 256:495–497 (1975), die menschliche
B-Zell-Hybridom-Technologie (Kosbor et al., Immunol Today, 4:72
(1983); Cote et al., Proc Natl Acad Sci, 80:2026-2030 (1983) und die EBV-Hybridom-Technologie
(Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss
Inc, New York N.Y., S. 77–96
(1985) ein, sind aber nicht darauf limitiert; alle Artikel sind
hierin durch Bezugnahme eingeschlossen. Zusätzlich können Technologien, die für die Produktion
von „chimären Antikörpern" entwickelt wurden,
das Spleißen
von Maus-Antikörper-Genen
an menschliche Antikörper-Gene,
um ein Molekül
mit einer passenden Antigen-Spezifität und biologischen Aktivität zu erhalten,
verwendet werden. (Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81:6851–6855 (1984);
Neuberger et al., Nature, 312:604–608 (1984); und Takeda et
al., Nature, 314:452–454 (1985);
alle Artikel sind hierin durch Bezugnahme eingeschlossen. Alternativ
können
Technologien, die für
die Produktion von einzelkettigen Antikörpern beschrieben wurden (US-Pat.
Nr. 4,946,778), angepasst werden, um einzelkettige Antikörper zu
produzieren, die gegen ein chimäres
oder konjugiertes VLP gerichtet sind, hierin durch Bezugnahme eingeschlossen.
Antikörper
können
auch durch die Induktion der in vivo-Produktion in der Lymphocyten-Population
oder durch Screenen von rekombinanten Immunglobulin-Genbanken oder Feldern von
hoch-spezifischen Bindungsreagenzien, wie in Orlandi et al., Proc
Natl Acad Sci, 86:3833–3837
(1989), und Winter G. und Milstein C, Nature, 349:293–299 (1991)
offenbart wurde, produziert werden; alle Artikel sind hierin durch
Bezugnahme eingeschlossen.
-
Antikörper-Fragmente,
die spezifische Bindungsstellen für ein chimäres oder konjugiertes VLP enthalten,
können
auch hergestellt werden. Solche Fragmente schließen zum Beispiel die F(ab')2-Fragmente,
die durch Pepsin-Verdau des Antikörpermoleküls produziert werden können, und
die Fab-Fragmente, die durch die Reduzierung der Disulfidbrücken der
F(ab')-Fragmente
hergestellt werden können,
ein, sind aber nicht darauf limitiert. Alternativ können Fab-Expressions-Genbanken
konstruiert werden, um schnelle und leichte Identifizierung von
monoclonalen Fab-Fragmenten
mit der erwünschten
Spezifität
zu ermöglichen.
(Huse W. D. et al., Science, 256:12751281 (1989), hierin durch Bezugnahme
eingeschlossen).
-
Durch
einen Ansatz werden monoclonale Antikörper gegen ein chimäres oder
konjugiertes VLP wie folgt hergestellt. Kurz, eine Maus wird wiederholt
mit ein paar Microgramm des ausgewählten Proteins oder der Peptide,
die davon abgeleitet wurden, über
einen Zeitraum von ein paar Wochen beimpft. Die Maus wird dann getötet, und
die Antikörper-produzierenden
Zellen der Milz werden isoliert. Die Milzzellen werden in der Anwesenheit
von Polyethylenglycol mit Maus-Myelomzellen fusioniert und die überschüssigen nicht-fusionierten
Zellen durch Züchten
des Systems auf selektiven Medien, umfassend Aminopterin (HAT-Medien)
zerstört. Die
erfolgreich fusionierten Zellen werden verdünnt und Aliquote der Verdünnung in
die Vertiefungen einer Microtiterplatte platziert, wo die Züchtung der
Kultur fortgesetzt wird. Antikörper-produzierende
Clone werden durch Nachweis des Antikörpers in der Überstands-Flüssigkeit
von den Vertiefungen durch Immun-Testverfahren wie ELISA, wie ursprünglich von
Engvall, E., Meth. Enzymol., 70:419 (1980) beschrieben, hierin durch
Bezugnahme eingeschlossen, und davon abgeleitete Verfahren identifiziert.
Ausgewählte
positive Clone können expandiert
und ihr monoclonales Antikörperprodukt
für die
Verwendung geerntet werden. Detaillierte Vorgehensweisen für die Produktion
von monoclonalen Antikörpern
sind in Davis, L. et al., Basic Methods in Molecular Biology Elsevier,
New York, Abschnitt 21–2
beschrieben.
-
Polyclonales
Antiserum, das Antikörper
gegen heterogene Epitope eines einzelnen Proteins enthält, kann
durch die oben beschriebene Immunisierung von geeigneten Tieren
mit dem exprimierten Protein oder mit davon abgeleiteten Peptiden,
die unmodifiziert oder modifiziert sein können, um die Immunogenität zu verstärken, hergestellt
werden. Eine wirksame polyclonale Antikörper-Produktion wird durch
viele Faktoren beeinflusst, die sowohl mit dem Antigen als auch
der Wirtsspezies in Verbindung stehen. Die Wirtstiere variieren auch
in der Reaktion auf die Stelle der Beimpfungen und die Dosis, mit
sowohl nicht ausreichenden oder überschüssigen Dosen
des Antigens, die in Antiseren mit niedrigen Titern resultieren.
Kleine Dosen (ng-Bereich) des Antigens, die an multiplen intradermalen
Stellen verabreicht werden, scheinen am verlässlichsten zu sein. Ein wirksames
Immunisierungsprotokoll für
Kaninchen kann in Vaitukaitis, J. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 33:988–991 (1971)
gefunden werden.
-
Auffrischungsinjektionen
können
in regelmäßigen Intervallen
gegeben und Antiserum geerntet werden, wenn der Antikörpertiter
davon zu fallen beginnt, was semi-quantitativ durch zum Beispiel
doppelte Immundiffusion in Agar gegen bekannte Konzentrationen des
Antigens bestimmt wird. Siehe zum Beispiel Ouchterlony, O. et al.,
Kap. 19 in: Handbook of Experimental Immunology D. Wier (Hrsg.)
Blackwell (1973). Eine Plateau-Konzentration des Antikörpers liegt
gewöhnlich
im Bereich von 0,1 bis 0,2 mg/ml Serum (etwa 12 M). Die Affinität von Antiseren
für das
Antigen wird durch Herstellen von kompetitiven Bindungskurven, wie
zum Beispiel von Fisher, D., Kap. 42 in: Manual of Clinical Immunology,
2. Aufl. (Rose und Friedman, Hrsg.) Amer. Soc. For Microbiol., Washington,
D.C. (1980) beschrieben, bestimmt. Antikörper-Präparate, die gemäß eines Protokolls
hergestellt werden, sind für
quantitative Immun-Test nützlich,
die die Konzentrationen von Antigen-tragenden Substanzen in biologischen
Proben nachweisen; sie werden auch semi-quantitativ oder qualitativ
verwendet. Zusätzlich
kann ein chimäres
oder konjugiertes VLP verwendet werden, um eine Antikörper-Produktion
in Menschen zu induzieren, wie es überall in dieser Offenbarung
diskutiert wird. Dementsprechend kann ein chimäres oder konjugiertes VLP an
ein anderes Protein, einen Träger,
eine Unterlage oder ein Adjuvans gebunden oder mit ihm/ihr verabreicht
werden, um ein Pharmazeutikum oder einen Impfstoff herzustellen,
das/der eine potente Immunreaktion induziert.
-
Das
folgende Beispiel beschreibt die Vorgehensweisen, die verwendet
wurden, um ein Polynucleotid, das ein chimäres L1-CCR5-Protein codiert,
das sich selbst zu kapsomeren Strukturen anordnet, herzustellen und
zu exprimieren. Die unten beschriebene Vorgehensweise involviert
das Modifizieren eines L1-codierenden Polynucleotids,
um eine Aminosäuresequenz,
die ein CCR5-Peptidfragment
codiert, zu inkorporieren. In dieser beispielhaften Darlegung wurden
16 Codons der ersten extrazellulären
Schleife von C57BI/6 (B6)-Maus-CCR5 (mCCR5) getrennt in eine von
drei Regionen der BPV-1-L1-Sequenz, die den Stellen der virusneutralisierenden
Epitope entsprechen, inseriert. Die Positionen dieser Epitope waren
vorher durch Ausrichten der Polypeptidsequenzen von verschiedenen
menschlichen Papillomaviren hergeleitet worden. Die drei nicht-fortlaufenden
Regionen von L1, die die CCR5-Sequenz erhielten, sind durch Ludmerer
et al., J. Virol., 70:4791 (1996); durch Ludmerer et al., J. Virol.,
71:3834 (1997) und durch Roden et al., J. Virol., 71:6247 (1997)
beschrieben worden. Da die Aminosäuren an diesen Stellen wahrscheinlich
auf der Kapsidoberfläche
exprimiert wurden, wurden analoge Stellen in BPV-1-L1 für die Peptidinsertion
angezielt. Dies versicherte, dass der Teil des chimären L1-Proteins,
der die CCR5-Peptidsequenz einschloss, Oberflächen-exprimiert und für wirksame
Präsentation
gegenüber
dem humoralen Immunsystem zugänglich
sein würde.
-
Beispiel
1 beschreibt das Verfahren, das verwendet wurde, um ein chimäres L1-CCR5-Protein
zu bilden, das sich selbst zu antigenen Partikeln zusammenlagert.
-
BEISPIEL 1
-
Konstruktion eines chimären Proteins,
das in der Lage ist, sich selbst zu antigenen Partikeln zusammenzulagern
-
Polynucleotide,
die die drei verschiedenen L1-CCR5-Chimären codieren (bezeichnet als „L1-CCR5-Chimäre 1", „L1-CCR5-Chimäre 2" und „L1-CCR5-Chimäre 3"), wurden durch überlappende
Extensions-PCR-Mutagenese im Wesentlichen gemäß der Technik, die von Ho et
al. in Gene, 77:51 (1989) beschrieben wurde, hergestellt. Ein Polynucleotid,
das das BPV-1-L1 codiert (Chen et al., Nature, 299:557 (1982)),
wurde als ein EcoRl/Kpnl-Fragment in die komplementären Stellen
der multiplen Clonierungsstelle des Baculovirus-pFastBac1-Expressionsvektors
(Gibco BRL, Gaithersberg, MD) cloniert. Teile der BPV1-L1- Sequenz in jeder
der drei Chimären
wurden durch eine Sequenz ersetzt, die die erste extrazelluläre Schleife
von C57B1/6-mCCR5 codiert. Die Polypeptidsequenz des mCCR5-Proteins
hatte die Sequenz: His-Tyr-Ala-Ala-Asn-Glu-Trp-Val-Phe-Gly-Asn-Ile-Met-Cys-Lys-Val
(SEQ ID NO:1) (Boring et al., J. Biol. Chem., 271:7551 (1996)).
In der L1-CCR5-Chimäre 1 wurde
die Sequenz, die die L1-Aminosäuren
130–136 codiert,
durch die mCCR5-Sequenz ersetzt. In der L1-CCR5-Chimäre 2 wurde
die Sequenz, die die L1-Aminosäuren 275–285 codiert,
durch die mCCR5-Sequenz ersetzt. In der L1-CCR5-Chimäre
3 wurde die Sequenz, die die L1-Aminosäuren 344–350 codiert, durch die mCCR5-Sequenz
ersetzt. Die endgültigen
Clone wurden durch Restriktionsverdau-Analyse und durch Nucleotidsequenz-Analyse
der PCR-amplifizierten Region bestätigt.
-
Rekombinante
Baculovirus-Stammlösungen,
die die Gene enthielten, die die chimären L1-CCR5-Proteine oder das
Wildtyp-BPV-1-L1 codieren, wurden unter Verwendung des GIBCO BRL
Baculovirus-Systems hergestellt, wie es vom Hersteller beschrieben
wurde. Papillomavirus-ähnliche
Partikel wurde von rekombinanten Baculovirus-infizierten Sf9-Zellen,
wie vorher beschrieben, aufgereinigt. (Kirnbauer, R. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 89:12180–12184
(1992); Greenstone, H.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 95:1800–1805 (1998)).
Die allgemeine Morphologie der Partikel-Präparate wurde durch einen Mobilitätstest unter
Verwendung einer FPLC-Superose-6-Gelfiltrationssäule (Pharmacia Biotech, Uppsala,
Schweden) analysiert. Das Eluat wurde in ein-ml-Fraktionen gesammelt.
Das Hohlraumvolumen dieser Säule
beträgt
8 ml. Vorher wurde nachgewiesen, dass die Wildtyp-L1-VLPs hauptsächlich in
der Fraktion 9 der Säule
eluieren, L1-Kapsomere in
der Fraktion 15 eluieren und L1-Monomere in den Fraktionen 19–21 eluieren
(Okun, M. M. et al., zur Veröffentlichung
eingereicht). Die Säulenfraktionen
wurden durch Western-Blot-Analyse auf die Anwesenheit von L1 getestet.
-
Beispiel
2 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden, um zu bestätigen, dass
ein chimäres L1-CCR5-Protein
sich selbst zu kapsomeren Strukturen anordnete. Interessanterweise
wurde von den unten beschrieben L1-CCR5-Partikeln durch Elekronenmikroskopie
gezeigt, dass sie etwas kleiner sind als VLPs, die von Wildtyp-L1-Proteinen
gebildet werden.
-
BEISPIEL 2
-
Herstellung von chimären kapsomeren
Strukturen
-
Die
drei oben beschriebenen L1-CCR5-Chimären wurden durch FPLC-SUPEROSE-6-Gelfiltrations-Säulenchromatographie
(Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) isoliert. Säulenfraktionen
von je 1 ml wurden durch Western-Blot-Analysen unter Verwendung eines 10%igen
Polyacrylamidgels unter denaturierenden Bedingungen auf die Anwesenheit
von L1 getestet. Kontrollvorgehensweisen wiesen darauf hin, dass Wildtyp-L1-VLPs
vorwiegend in der Säulenfraktion
9 eluierten, dass L1-Kapsomere in der Fraktion 15 eluierten und
dass L1-Monomere in den Fraktionen 19–21 eluierten. Das L1-CCR5-Protein
der Präparationen
der Chimären
2 und 3 wurde vorwiegend in der Fraktion 15 nachgewiesen. Diese
Ergebnisse legten nahe, dass die Proteine der L1-CCR5-Chimäre 2 und
der L1-CCR5-Chimäre
3 scheiterten, sich zu höher
geordneten Strukturen zusammenzulagern. Basierend auf diesen Ergebnissen
wählten
wir die L1-CCR5-Chimäre
1 für die
folgenden Vorgehensweisen aus. Aufgereinigte Partikel wurden unter
Verwendung der Elektronenmikroskopie durch anfängliches Adsorbieren der Partikel
an Kohlenstoff-beschichtete Gitter, Färben mit 1 % Uranylacetat und
dann Untersuchen der Gitter unter Verwendung eines Philips-Elektronenmikroskops
Modell EM 400RT bei 36000-facher Vergrößerung untersucht.
-
Die
Ergebnisse dieser Vorgänge
wiesen darauf hin, dass das Protein der L1-CCR5-Chimäre 1 in einer Säulenfraktion
eluierte, von der bekannt ist, dass sie zusammengelagerte partikuläre Strukturen
enthält.
Die Untersuchung der Partikel von Chimäre 1 durch Elektronenmikroskopie
legte Partikel offen, die Durchmesser von ungefähr 28 nm aufwiesen, während Wildtyp-L1-VLPs
Durchmesser von ungefähr
55 nm aufwiesen. Der 28 nm-Durchmesser legt nahe, dass die Partikel
sich aus 12 Kapsomeren zusammensetzten, während die Strukturen mit größerem Durchmesser,
die von Wildtyp-L1-Proteinen gebildet wurden, sich aus 72 Kapsomeren
zusammensetzten. Morphologisch ähnelten
die Partikel der L1-CCR5-Chimäre 1 den
Polyomavirus-12-ICOSA-Hüllen
(T = 1 Partikel), die sich aus einer regelmäßigen Anordnung von 12 pentameren
Kapsomeren des Polyomavirus-Haupthüllenproteins
VP1 zusammensetzen und durch erneute in vitro-Zusammenlagerung von VP1-Kapsomeren
bei hoher ionischer Stärke
hergestellt werden können
(Salunke, et al., Biophys. J., 56:887 (1989)). Kleine Partikel mit
einer Größe ähnlich den
L1-CCR5-Partikeln wurden als Nebenbestandteile der Wildtyp-BPV-1-L1-VLP-Präparationen
gefunden. Obwohl die L1-CCR5-Partikel kleiner waren als die Wildtyp-VLPs,
besaßen
sie zumindest manche Charakteristika der Wildtyp-VLPs, die den Wildtyp-Kapsomeren fehlen.
Insbesondere hämagglutinierten
L1-CCR5-Partikel
rote Blutkörperchen
von Mäusen
und zeigten ELISA-Reaktivität
auf einen monoclonalen neutralisierenden BPV-1 Antikörper (#9),
der spezifisch an die Partikel, aber nicht an die Kapsomere band
(Roden et al., J. Virol., 68:7570 (1994)).
-
Das
folgende Beispiel veranschaulicht, wie Peptidsequenzen, die sich
als geordnete Anordnungen auf kapsomeren Strukturen darstellten,
humorale Immunreaktionen sogar gegen zentrale Antigene stimulieren können. Wie
unten hingewiesen wird, reagierten Mäuse, denen L1-CCR5-Partikel
verabreicht wurden, mit der Produktion von mCCR5-spezifischen Antikörpern. Signifikanterweise
wiesen die Ergebnisse darauf hin, dass die Immunisierung die B-Zell-Toleranz
gegenüber
dem Peptid überwand,
ohne die Toleranz gegenüber
dem endogenen zellulären
CCR5 zu beeinflussen. Die anti-Selbstantikörper, die durch die immunogenen
Partikel induziert wurden, banden natürliches mCCR5, blockierten
die Bindung eines CCR5-Liganden und inhibierten eine HIV-1-Infektion
durch ein chimäres
CCR5-Protein, das
das mCCR5-Peptid enthielt.
-
Beispiel
3 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden, um zu zeigen,
dass chimäre
L1-CCR5-Partikel als Immunogene verwendet werden könnten, um
anti-CCR5-Antikörper
zu induzieren.
-
BEISPIEL 3
-
Stimulierung einer Toleranz-brechenden
Immunreaktion
-
Um
Antiseren herzustellen, wurden C57BI/6-Mäusen in einem Immunisierungsprotokoll
entweder: L1-CCR5-Partikeln, Wildtyp-BPV-1-L1-VLPs oder ein synthetisches
CCR5-Peptid, das die erste extrazelluläre Schleife von mCCR5 repräsentiert
und an KLH unter Verwendung eines IMJECT-aktivierten Immunogen-Konjugations-Kits
(Pierce, Rockford, IL) gekoppelt wurde, verabreicht. In manchen
Fällen
wurden Mäusen L1-CCR5-Partikel
verabreicht, die durch Kochen für
2 Minuten in der Anwesenheit von 1 % SDS denaturiert worden waren.
Mäuse wurden
intradermal mit 10 μl
Antigen dreimal in zweiwöchigen
Abständen
beimpft. In den meisten Fällen
wurden die Serumproben zwei Wochen nach der letzten Auffrischung gesammelt.
Wenn ein Adjuvans verwendet wurde, wurde das Antigen für die erste
Injektion in komplettem Freundschem Adjuvans und für die folgenden
Injektionen in inkomplettem Freundschem Adjuvans hergestellt. Serumproben
wurden auf die Reaktivität
gegen das CCR5-Peptid und gegen Wildtyp-VLPs unter Verwendung eines
quantitativen ELISA-Protokolls getestet, um IgG-Antikörper gegen
BPV-1-VLPs nachzuweisen. Der ELISA wurde unter Verwendung der von
Kirnbauer et al. in J. Natl. Cancer Inst., 86:494 (1994) beschriebenen
Vorgehensweise durchgeführt.
Ein synthetisches Peptid, das die erste extrazelluläre Schleife
von mCCR5 repräsentiert,
wurde hergestellt und an Rinder-Serumalbumin (BSA) als ein Trägerprotein
gekoppelt. Anti-CCR5-spezifisches IgG wurde durch Binden von 300
ng BSA-gekoppeltem
CCR5-Peptid in 50 μl
phosphatgepufferter Salzlösung (PBS)
an jede Vertiefung einer IMMULON II-Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen
(Dynatech; Chantilly, VA) für 2
Stunden bei 37°C
nachgewiesen. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Vertiefungen
für 2 Stunden
mit 50 μl
PBS, enthaltend 0,5% Magermilchpulver mit 1 % Serum von neugeborenen
Kälbern
bei Zimmertemperatur blockiert. Nach der Blockierung wurden die
Vertiefungen danach wieder dreimal mit PBS gewaschen. Mausserum
wurde in PBS mit 0,5% Magermilchpulver reihenverdünnt. Die
verdünnten
Serumproben (50 μl)
wurden nach dem Entfernen des letzten PBS-Waschschritts den Vertiefungen
verabreicht. Die Platten wurden bei Zimmertemperatur für 2,5 Stunden
unter sanftem Schwenken inkubiert. Nach fünf Waschschritten wurden 50 μl Meerrettichperoxidase-konjugiertes
Ziegen-anti-Maus-IgG
(Boehringer Mannheim; Indianapolis, IN), 1:10 000 verdünnt in 0,5%
Milch-PBS, zu den Vertiefungen zugefügt. Die Platten wurden bei
Zimmertemperatur für
1 Stunde unter sanftem Schwenken inkubiert und dann dreimal gewaschen.
Das ABTS-Peroxidasesubstrat (50 μl)
(Boehringer Mannheim) wurde zu der Platte zugefügt, für 45 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert
und die optischen Dichten (ODs) wurden bei 405 nm unter Verwendung
eines THERMO MAX-Mikroplattenlesers
gelesen. OD405-Werte, die größer als
zweimal der Hintergrund (normalerweise größer als 0,1) waren, wurden
als positiv erachtet.
-
Die
in 1A präsentierten
Ergebnisse wiesen darauf hin, dass die Serumproben von Mäusen, denen L1-CCR5-Partikel
verabreicht wurden, hohe anti-CCR5-ELISA-Titer
hatten. Im Gegensatz dazu hatten Kontrollmäuse, denen Wildtyp-VLPs verabreicht
wurden, wie erwartet, keine ELISA-Reaktivität. Anti-CCR5-Titer reichten
in den drei Mäusen,
denen das Immunogen in Kombination mit Freundschem Adjuvans verabreicht worden
war, von 3 × 103 bis 3 × 104 und betrugen in den zwei Tieren, die das
Immunogen ohne Adjuvans erhalten hatten, 3 × 103.
Mäuse,
denen denaturierte L1-CCR5-Partikel in Kombination mit Adjuvans
verabreicht wurden, zeigten keinen Hinweis auf mCCR5-Peptid-spezifische
Antikörper.
Das Fehlen der Reaktivität
der denaturierten L1-CCR5-Partikel war auf das CCR5-Peptid beschränkt, da,
wie durch die in 1B präsentierten Ergebnisse angedeutet
wird, das denaturierte Material hohe Titer von anti-L1-Antikörpern hervorrief.
Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass erwachsene Säuger die
Fähigkeit
beibehielten, Antikörper
zu produzieren, die spezifisch für
zentrale Selbstantigene sind.
-
Während die
vorangehenden Ergebnisse darauf hinwiesen, dass die L1-CCR5-Partikel Antikörper hervorriefen,
die spezifisch für
das CCR5-Peptid sind, wurde weiteres Testen ausgeführt, um
zu bestätigen,
dass die Antikörper
auch Zellassoziiertes mCCR5-Protein erkannten, wenn es in seiner
natürlichen
Konformation dargelegt wurde. Dies wurde unter Verwendung von durchflusscytometrischer
Analyse (FACS) erzielt, um zu zeigen, dass die anti-CCR5-Antikörper mCCR5
banden, das auf der Zelloberfläche
exprimiert wurde.
-
Beispiel
4 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden, um zu zeigen,
dass Antikörper,
die gegen die L1-CCR5-Partikel hervorgerufen wurden, authentisches
mCCR5-Rezeptorprotein banden, das auf Zelloberflächen exprimiert wurde.
-
BEISPIEL 4
-
Bindung von natürlichem
Antigen durch Auto-Antikörper,
die als Reaktion auf ein Selbstantigen, das in eine kapsomere Struktur
inkorporiert wurde, stimuliert wurde
-
Gesamt-IgG
von gepoolten Mausseren wurde über
eine Protein G-Säule
(Pierce) unter Verwendung von Vorgehensweisen, die Fachleuten bekannt
sein werden, affinitätsaufgereinigt.
Säulenfraktionen,
die IgG enthielten, wurden gepoolt und dann unter Verwendung einer
CENTRICON-30-Spinsäule
(Amicon; Beverly, MA) konzentriert. Antikörperbindungstests wurden unter
Verwendung von transfizierten menschlichen Zellen durchgeführt, die
einen rekombinanten Maus-CCR5-Rezeptor exprimierten. Die Bindung
von Antikörpern,
die gegen L1-CCR5-Partikel errichtet wurden, konnten nicht leicht
unter Verwendung von primären
Kulturen von Mauszellen getestet werden, weil diese Zellen hohe
Spiegel von Fcy-Rezeptoren exprimierten und auf Grund der Interaktionen
mit nicht-spezifischem Maus-IgG hohe Hintergrundspiegel der Bindung
ergaben. Dementsprechend wurde für
die durchflusscytometrische Analyse ein Maus-CCR5-Expressionsvektor
in HeLa-MAGI-Zellen
durch Transfektion unter Verwendung eines LIPOFECTAMINE PLUS-Transfektionskits
(Gibco BRL, Gaithersberg, MD) transient exprimiert. pcDNA3-abgeleitete Plasmide,
die mCCR5, das von B6-Mäusen
cloniert wurde, und eine Mensch-Maus-CCR5-Chimäre enthielten, die die erste
extrazelluläre
Schleife von mCCR5 in einem Hintergrund von menschlichem CCR5 enthielt,
wurden, wie von Kuhmann et al. in J. Virol., 71:8642 (1997) beschrieben,
hergestellt. Einlagige Zellschichten wurden 48 Stunden nach der
Transfektion durch sanftes Abkratzen in der Anwesenheit von 5 mM
EDTA abgelöst.
Die Zellen wurden dreimal in Färbepuffer
(PBS mit 0,5% BSA) gewaschen. Ungefähr 105 Zellen
wurden in 25 μl
Färbepuffer
mit 1 μg
Maus-IgG resuspendiert und dann 45 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurde
dreimal mit Färbepuffer
gewaschen, in 25 μl
Färbepuffer
mit 250 ng Fluorescein (FITC)-markiertem Ziegen-anti-Maus-IgG (Jackson
Immunoresearch; West Grove, PA) resuspendiert und für 30 Minuten
bei 4°C
inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit Färbepuffer gewaschen und schließlich in
Vorbereitung für
die FACS-Analyse in 0,5 ml Färbepuffer
resuspendiert. Als eine Kontrolle wurden Zellen mit 500 ng FITC-markiertem
monoclonalem Maus-anti-Mensch-CCR5-Antikörper (mAB182) (R & D Systems; Minneapolis,
MN) gemäß den Beschreibungen
des Herstellers gefärbt.
FACS-Analyse wurde unter Verwendung einer FACSCALIBUR- und CELLQUEST-Software
(Becton Dickinson; San Jose, CA) durchgeführt. Spezifische Bindung wurde
im Verhältnis
zur Färbung
von Kontrollzellen, die mit dem pcDNA3-Vektor transfiziert wurden,
gemessen.
-
Die
Ergebnisse von diesen Vorgehensweisen wiesen darauf hin, dass Auto-Antikörper als
Reaktion auf die Verabreichung von L1-CCR5 kapsomere Partikel stimulierten,
die spezifisch rekombinante mCCR5-Rezeptoren banden, die auf der
Oberfläche
von transfizierten HeLa-MAGI-Zellen exprimiert wurden. 2A zeigt,
dass IgG von Mäusen,
die mit L1-CCR5 immunisiert wurden, spezifisch mit hoher Affinität an transfizierte Zellen,
die den mCCR5-Rezeptor exprimierten, aber nicht an Zellen, die mit
dem Vektor allein transfiziert wurden, banden. Zellen, die mCCR5 exprimierten,
banden, wie erwartet, nicht wesentlich Antikörper, die als Reaktion auf
die Immunisierung mit virusähnlichen
Partikeln stimuliert wurden, die durch Wildtyp-L1 gebildet wurden (2B),
oder einen monoclonalen Antikörper
(mAB182), der spezifisch für
die zweite extrazelluläre Schleife
von menschlichem CCR5 ist ( 2C). Als
eine Kontrolle für
die Antikörper-Spezifität wurde
Mäusen das
mCCR5-Peptid verabreicht,
das an KLH gekoppelt worden war. Während diese Mäuse mit
der Produktion von anti-CCR5-Peptid-Antikörpern reagierten, die ELISA-Titer
von 105 gegen ein BSA-gekoppeltes, aufgereinigtes
IgG aufwiesen, scheiterte diese, an Zellen zu binden, die mCCR5
exprimierten (2D). Im Ganzen wiesen diese
Ergebnisse darauf hin, dass Antikörper, die als Reaktion auf
die Immunisierung mit kapsomeren L1-CCR5-Patrikeln errichtet wurden,
als wahre Auto-Antikörper
wirkten, weil sie Zelloberflächen-exprimiertes, natürliches
mCCR5 spezifisch banden, im Gegensatz zu den Antikörpern, die
gegen das KLH-CCR5-Peptid errichtet waren.
-
Die
Fähigkeit
der Antikörper,
die gegen L1-CCR5-Partikel hervorgerufen wurden, um natürliches mCCR5
zu binden, wurde weiter durch Testen auf Kompetition mit dem 125I-markierten menschlichen RANTES-Chemokinligand
um die Bindung an transfizierte HeLa-MAGI-Zellen, die CCR5 exprimieren,
untersucht. Die Maus-Chemokine MIP-1, MIP-1β und RANTES sind Liganden für mCCR5.
Zusätzlich
sind die menschlichen Homologe von MIP-1β und RANTES in der Lage, mCCR5
zu binden (Meyer et al., J. Biol. Chem., 271:14445 (1996); Nibbs
et al., J. Biol. Chem., 272:12495 (1997)). Wie im folgenden Beispiel
beschrieben, wurden die Zellen mit 0,5 nM iodiertem RANTES in der
Abwesenheit oder Anwesenheit von Verdünnungen von Mausseren drei
Tage nach der Transfektion mit einem mCCR5-Expressionskonstrukt inkubiert.
-
Beispiel
5 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden, um zu zeigen,
dass Auto-Antikörper,
die gegen den CCR5-Rezeptor hervorgerufen wurden, die Ligandenbindung
an den Rezeptor inhibierten.
-
BEISPIEL 5
-
Auto-Antikörper, die
spezifisch für
einen Rezeptor sind, inhibieren die Ligandenbindun
-
HeLa-MAGI-Zellen
wurden mit dem mCCR5-Expressionsplasmid unter Verwendung eines CaPO4-Transfektionskits, der von Stratagene Cloning
Systems (La Jolla, CA) gekauft wurde, transient transfiziert. Zwei
Tage nach der Transfektion wurden 105 Zellen
in individuelle Vertiefungen einer Gewebekulturplatte mit 24 Vertiefungen übertragen.
Am nächsten
Tag wurden die Zellen zweimal in kaltem PBS gewaschen und dann in
150 μl kaltem
Bindungspuffer (25 mM HEPES (pH 7,2), 5 mM MgCl2,
1 mM CaCl2, 0,5% (Gewicht/Volumen) BSA)
resuspendiert. Die Zellen wurden für 4 Stunden bei 4°C mit 0,5
nM 125I-markiertem menschlichem RANTES (Amersham;
Arlington Heights, IL) in der Abwesenheit oder Anwesenheit von verschiedenen
Verdünnungen
von Mausseren inkubiert. Um kleine Moleküle zu entfernen, wurde der
Puffer der Mausseren durch einen Bindungspuffer unter Verwendung
von MICRO BIO-SPIN CHROMATOGRAPHY-6-Säulen (Bio-Rad, Hercules, CA)
vor dem Durchführen
des Bindungstests ausgetauscht. Als eine Kontrolle wurden manche
Bindungstests in der Anwesenheit von 50 nM oder 500 nM nicht-iodiertem
menschlichem RANTES (R & D
Systems) durchgeführt.
Die Reaktionen wurden durch viermaliges Waschen der Vertiefungen
mit kaltem Bindungspuffer mit 0,5 M NaCl gestoppt. Die Zellen wurden
durch Zugabe von 0,5 ml 1 % SDS lysiert und die Lysate in Zählröhrchen transferiert.
Gebundene Radioaktivität
wurde für
1 Minute in einem Beckmann-Gamma 5500B-Zähler gezählt.
-
Die
Ergebnisse dieser Vorgehensweisen bestätigten, dass Auto-Antikörper, die
gegen die L1-CCR5-Partikel hervorgerufen wurden, spezifisch den
auf der Zelloberfläche
exprimierten CCR5 exprimierte, und Ligandenbindung an den Rezeptor
verhinderten. Genauer zeigten die graphischen Ergebnisse, die in 4 gezeigt
sind, an, dass eine 1:30-Verdünnung
von L1-CCR5-Seren ungefähr
66% des iodierten menschlichen RANTES verdrängte (ähnlich zu dem Verdrängen, das
unter Verwendung eines 100-fachen Überschusses von kaltem RANTES
beobachtet wurde), im Vergleich zu 37% Verdrängen mit einer 1:30-Verdünnung der Wildtyp-L1-VPL-Seren. Die 1:75-
und 1:150-Verdünnungen
der L1-CCR5-Seren verdrängten
25% beziehungsweise 17% des iodierten RANTES, wohingegen bei Verwendung
von Kontrollseren in diesen Verdünnungen
kein signifikantes Verdrängen
beobachtet wurde. Maximal gebundenes iodiertes RANTES wurde durch
Testen auf Bindung in der Abwesenheit von Seren bestimmt und entsprach
ungefähr
2550 ZpM, was durch die gestrichelte horizontale Linie in 3 angezeigt
ist. Nicht-spezifische Bindung von iodiertem RANTES (ungefähr 1300
ZpM) wurde durch Testen auf Bindung in einem 1000-fachen Überschuss
(500 nM) von kaltem (nicht-iodiertem) menschlichem RANTES bestimmt.
Die Daten, die in 4 gezeigt werden, repräsentieren
den Durchschnitt von Vertiefungen in doppelter Ausführung von
einem Experiment. Frühere
Studien haben nahe gelegt, dass MIP-1, MIP-1β und RANTES an die zweite extrazelluläre Schleife
von menschlichem (h) CCR5 binden, da ihre Bindung durch einen monoclonalen
Antikörper
gegen diesen Teil des Moleküls,
aber nicht durch einen Antikörper,
der spezifisch für
das Amino-Ende von hCCR5 ist, blockiert wurde (Wu et al., J. Exp.
Med., 186:1373 (1997)). Die hierin dargestellten Ergebnisse wiesen
darauf hin, dass Antikörper,
die Bindungsspezifität
für die
erste extrazelluläre
Schleife von mCCR5 haben, das zwischen diesen zwei Stellen lokalisiert
ist, vorteilhaft die RANTES-Bindung inhibierten und darüber hinaus
einen Weg lieferten, um die Bildung dieser Autoantikörper in
vivo zu stimulieren.
-
Um
die Nützlichkeit
der oben beschriebenen Auto-Antikörper weiter zu untersuchen,
untersuchten wir, ob die Inhibition der Ligandenbindung, die im
vorhergehenden Beispiel beobachtet wurde, mit der Inhibition der
viralen Infektion von Zielzellen korrelierte. Monoclonale Antikörper-Untersuchungen
haben die zweite extrazelluläre
Schleife und die Amino-terminale Region von hCCR5 damit in Zusammenhang
gebracht, und Studien von chimären
Rezeptoren haben darauf hingewiesen, dass die ersten und dritten
extrazellulären
Schleifen von CCR5 auch zur Rezeptor-Interaktion mit HIV-1 beitragen
(Wu et al., J. Exp. Med., 186:1373 (1997); Rucker et al., Cell,
87:437 (1996); Atchinson et al., Science, 274:1924 (1996); Alkhatib
et al., J. Biol. Chem., 272:19771 (1997); Picard et al., J. Virol.,
71:5003 (1997); Ross et al., J. Virol., 72:1918 (1998)). Obwohl mCCR5
nicht als ein HIV-1-Co-Rezeptor wirkt, hat ein chimärer Mensch-Maus-Rezeptor
(HMHH), der die erste extrazelluläre Schleife von mCCR5 (der
B6-Maus-Sequenz) in einem Hintergrund von hCCR5 enthält, Co-Rezeptoraktivität, wenn
er in menschlichen Zelllinien exprimiert wird (Kuhmann et al., J.
Virol., 71:8642 (1997)). Dementsprechend wurde dieser chimäre Rezeptor
im folgenden Beispiel verwendet, um zu testen, ob anti-L1-CCR5-Seren
eine M-tropische HIV-1-Infektion blockieren könnten.
-
Die
im folgenden Beispiel dargelegten Ergebnisse haben einen starken
Einfluss auf die Inhibition einer HIV-Infektion, weil sogar eine
teilweise Reduktion der CCR5-Expression klinisch signifikante Wirkungen
haben kann. Dies ist wahr, weil HIV-1-infizierte Individuen, die
heterozygot für
ein inaktives CCR5-Allel sind, verzögertes Fortschreiten zu AIDS
zeigen (Liu et al., Cell, 86:367 (1996); Samson et al., Nature,
382:722 (1996); Winkler et al., Science, 279:389 (1998)).
-
Beispiel
6 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden, um zu zeigen,
dass Auto-Antikörper,
die als Reaktion auf L1-CCR5-Partikel errichtet wurden, eine Infektion
von Zielzellen durch M-tropisches HIV-1 inhibierten. Da ein chimärer Maus-Mensch-CCR5-Rezeptor
in diesen Vorgehensweisen verwendet wurde, beinhaltete der erste
Schritt die Bestätigung,
dass die oben beschriebenen anti-CCR5-Auto-Antikörper den chimären Rezeptor
erkannten.
-
BEISPIEL 6
-
Anti-Rezeptor-Auto-Antikörper inhibieren
eine HIV-Infektion von Zielzellen
-
Um
zu bestätigen,
dass IgG, das von L1-CCR5-Seren aufgereinigt wurde, den chimären Mensch-Maus-Rezeptor
band, wurde eine FACS-Analyse an HeLa-MAGI-Zellen durchgeführt, die transient mit dem
HMHH-Expressionskonstrukt transfiziert wurden, das von Kuhmann et
al. in J. Virol., 71:8642 (1997) beschrieben wurde. Das Expressionskonstrukt
wurde 2 Tage vor der Färbung
mit entweder L1-CCR5-IgG, Wildtyp-L1-VLP-IgG oder einem monoclonalen
anti-menschlichen CCR5-Positivkontroll-Antikörper in
Empfängerzellen
transfiziert. Die in den 2E–2G präsentierten
Ergebnisse wiesen darauf hin, dass positive Bindung unter Verwendung
von Serum-IgG von Mäusen
erhalten wurde, denen L1-CCR5-Partikel so wie ein monoclonaler Positivkontroll-Antikörper, der
spezifisch für
die zweite extrazelluläre
Schleife von menschlichem CCR5 ist, verabreicht wurden. IgG von
Mäusen,
denen Wildtyp-L1-VLP verabreicht wurde, banden jedoch wie erwartet
HMHH nicht.
-
Basierend
auf den vorstehenden Ergebnissen wurden Seren von L1-CCR5-Mäusen auf die Fähigkeit, eine
Infektion des M-tropischen BaL-Stamms von HIV-1 zu inhibieren, unter
Verwendung eines Einmalreplikationszyklus-Tests und der HeLa-MAGI-Indikator-Zellinie
getestet. HeLa-MAGI-Zellen, die von Kimpton et al. in J. Virol.,
66:2232 (1992) beschrieben wurden, wurden transient mit dem chimären Mensch-Maus-CCR5-Expressionsvektor
unter Verwendung eines kommerziell erhaltenen CaPO4-Transfektionskits
(Stratagene Cloning Systems) transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion
und am Tag vor der Infektion wurden die Indikatorzellen auf Platten
mit 24 Vertiefungen zu 6,5 × 104 Zellen pro Vertiefung in komplettem DMEM
ausgesät. Manche
Infektionen wurden in der Anwesenheit von gepoolten Mausseren durchgeführt, deren
Puffer gegen PBS unter Verwendung von MICRO BIO-SPIN CHROMATOGRAPHY-6-Säulen (Bio-Rad)
ausgetauscht worden war. Vor der Infektion wurden die Zellen in
einem Gesamtvolumen von 140 μl
in komplettem DMEM mit 10 μg/ml
DEAE-Dextran mit Verdünnungen
von Seren für
30 Minuten bei 4°C
inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Virus zu jeder Vertiefung
zugefügt,
um ein Gesamtvolumen von 150 μl
zu ergeben. Die Zellen wurden für
2 Stunden bei 37°C
inkubiert, dann wurde 1 ml komplettes DMEM zu jeder Vertiefung zugefügt. Drei
Tage nach der Infektion wurden die Zellen mit X-Gal gefärbt, und
eine infektiöse
Dosis wurde durch Zählen
der Zahl von blauen Kernen in den infizierten Vertiefungen bestimmt.
Die Inhibition des viralen Eindringens wurde durch Vergleichen der
durchschnittlichen Zahl von blauen Kernen in der Anwesenheit von
Seren mit der durchschnittlichen Zahl von infektiösen Zentren
in der Abwesenheit von Seren bewertet. Typischerweise wurden in
jeder Infektion genug infektiöse
Virionen verwendet, um zu 50–75
infektiösen
blauen Zentren in den Kontroll (keine Seren)-Vertiefungen zu führen. Alle Tests wurden in
doppelter Ausführung
durchgeführt.
Mit einer Passage sank die Wirksamkeit der Infektion von transfizierten
HeLa-MAGI-Zellen
deutlich ab, vermutlich auf Grund von reduzierter CD4-Expression.
Daher wurden alle Infektionen an kurz vorher aufgetauten HeLa-MAGI-Zellen durchgeführt.
-
Die
Ergebnisse dieser Vorgehensweisen, die in 4 graphisch
dargestellt sind, zeigten, dass Serumantikörper, die gegen das CCR5-Selbstantigen
hervorgerufen wurden und von denen gezeigt wurde, dass sie das natürliche Antigen
erkennen und die Liganden-Rezeptor-Interaktionen inhibierten, auch
eine virale Infektion von Zielzellen inhibierten. Indikatorzellen,
die transient mit dem HMHH-Expressionskonstrukt
transfiziert und mit HIV-1-BaL in der Anwesenheit von L1-CCR5-Seren-Verdünnungen
von 1:15, 1:30 und 1:75 in Kontakt gebracht wurden, zeigten 65%,
50% und 45% Neutralisation der Infektiosität. In den selben Verdünnungen
zeigten Kontrollseren von Wildtyp-L1-VLP-Mäusen eine gewisse nicht-spezifische
Neutralisation, aber nur ein einem Bereich von 25% bei der 1:15-Verdünnung und
15% bei 1:30 und 1:75. Indikatorzellen, die mit HIV-1-Bal in der
Anwesenheit von 50 μg/ml
eines monoclonalen Antikörpers,
der spezifisch für
menschliches CCR5 ist (mAB182) und der als eine Positivkontrolle
verwendet wurde, infiziert wurden, zeigten ungefähr 50% Neutralisation. Daher
inhibierten die anti- CCR5-Auto-Antikörper, die
gemäß der oben
dargelegten Vorgehensweise produziert wurden, wirksam eine Infektion
von empfänglichen
Zellen durch HIV-1.
-
Wir
haben gezeigt, wie man die B-Zell-Toleranz gegenüber einem Selbstantigen durch
sein Präsentieren
in einem Zusammenhang, der die geordneten Oberflächenantigene eines infektiösen Virus
imitiert, bricht. Um dies zu tun, ersetzten wir ein dominantes virusneutralisierendes
Epitop auf der Oberfläche
von Papillomaviurs-L1-VLPs durch eine Peptidsequenz von einem Selbstprotein.
Genauer bauten wir eine Peptidsequenz von 16 Aminosäuren Länge, die
der ersten externen Schleife des Maus-Chemokinrezeptors CCR5 entspricht, in
ein vermutlich neutralisierendes Epitop im L1 des bovinen Papillomavirus-Typ
1 (BPV-1) (Ludmerer et al., J. Virol., 70:4791 (1996)) ein. Dieses
chimäre
L1 lagerte sich zu Partikeln zusammen, die geordnete Anordnungen
von Kapsomeren aufwiesen, die als Immunogene zum Stimulieren von
humoralen Immunreaktionen gegen das chimäre L1-CCR5-Protein verwendet
werden könnten.
-
Mäuse, die
mit VLPs immunisiert wurden, die aus chimären L1-CCR5-Proteinuntereinheiten zusammengesetzt
wurden, wurden am Leben erhalten, um die Langzeiteffekte der Immunisierung,
einschließlich
irgendwelcher pathologischen Folgen der Auto-Antikörperproduktion
nachzuweisen. Sechs Monate nach der Immunisierung wogen die immunisierten
Mäuse das
selbe wie die Kontrolltiere und sie erschienen äußerlich gesund. Eine Autopsie
der Maus mit den höchsten
anti-CCR5-Titern
legte keine Hinweise auf eine Autoimmun-Erkrankung offen. Die CCR5-Antikörpertiter
in den geimpften Tieren waren anfänglich stabil, sanken dann aber
langsam parallel mit den Reaktionen auf L1. Diese Ergebnisse legen
nahe, dass der zelluläre
CCR5 die durch chimäres
VLP induzierte B-Zell-Reaktion auf das CCR5-Peptid weder aktiviert noch toleriert.
-
Das
folgende Beispiel beschreibt, wie Auto-Antikörper, die gegen ein zentrales
Selbstantigen gerichtet sind, in einem anderen Säuger als der Maus stimuliert
werden können.
In dem beispielhaften Fall, der unten veranschaulicht wird, werden
eine Zusammensetzung und ein Verfahren zum Induzieren der Produktion
von anti-Makaken-CCR5-Antikörpern beschrieben.
-
BEISPIEL 7
-
Stimulierung einer Autoimmun-Reaktion
in Makaken
-
Ein
rekombinantes Expressionskonstrukt, das ein chimäres L1-CCR5-Protein codiert,
das einen Teil der Makaken-CCR5-Polypeptidsequenz einschließt, wurde
zuerst im Wesentlichen gemäß der Vorgehensweise,
die unter Beispiel 1 dargelegt ist, hergestellt. Das resultierende
Expressionskonstrukt wurde in Sf9-Empfängerzellen
eingebracht, wo ein Protein, das durch den rekombinanten Vektor
codiert wurde, produziert wurde. Kapsomere Strukturen, die sich
selbst zusammenlagernde Aggregate von chimärem L1-CCR5-Protein repräsentieren,
das in den Empfängerzellen
produziert wurde, wurden durch Saccharose-Gradienten- und CsCl-Gradientenzentrifugation
aufgereinigt. In einer parallelen Vorgehensweise wurden auch Wildtyp-VLPs,
die sich aus Wildtyp-L1-Protein zusammensetzten, hergestellt und
für die
Verwendung als ein Kontroll-Immunogen aufgereinigt. Das Kontroll-Immunogen
enthält
nicht die Makaken-CCR5-Polypeptidsequenz, die in der L1-CCR5-Chimäre vorhanden
ist. Aufgereinigte Wildtyp-VLPs oder chimäres L1-CCR5, kombiniert mit kapsomeren Adjuvans-Strukturen,
ergeben immunogene Kontroll- beziehungsweise Test-Zusammensetzungen. Diese
Zusammensetzungen werden getrennt intradermal gemäß einem
Standard-Immunisierungsprotokoll wie jenem, das unter Beispiel 3
beschrieben wurde, in Makaken injiziert. In einem Fall wurden den
Tieren die immunogenen Zusammensetzungen dreimal in zweiwöchigen Abständen verabreicht.
Serumproben, die von den zwei Tieren periodisch von einem Zeitpunkt
vor der ersten Immunisierung an genommen wurden, zeigten keinen
Hinweis auf CCR5-bindende Antikörper
vor der Immunisierung. Serumproben vom Kontrolltier zeigten sogar
einige Wochen nach der letzten Verabreichung der immunogenen Wildtyp-L1-VLP-Zusammensetzung keinen
Hinweis auf CCR5-bindende
Antikörper.
Im Gegensatz dazu enthalten Serumproben von dem Tier, dem kapsomere
Strukturen, die die L1-CCR5-Chimäre
einschlossen, verabreicht wurden, signifikante Spiegel von anti-CCR5-Antikörpern (5).
Diese Ergebnisse bestätigten,
dass die kapsomeren L1-CCR5-Strukturen die erwünschte Immunogenität aufweisen
und dass die Wirkung Antigen-spezifisch ist.
-
Wir
haben vor kurzem gezeigt, dass die Zugabe von anderen Papillomavirus-Polypeptiden zu den VLPs
als Fusionen des L2-Neben-Kapsidproteins eine starke Zell-vermittelte
Immunreaktion gegen diese viralen Peptide und die Produktion von spezifischen
Antikörpern
gegen das inserierte Peptid induzieren kann (Greenstone et al.,
Proc Natl Acad Sci USA, 95:1800 (1998); H.L. Greenstone, Ph.D-Dissertation
(1998), The John Hopkins University, Baltimore, MD). Sowohl die
Induktion von Antikörperreaktionen
mit hohem Titer als auch MHC-I-beschränkte CTL-Reaktionen können durch
Beimpfen mit einer niedrigen Dosis von VLPs in der Abwesenheit von
Adjuvans induziert werden. In Betracht der oben dargelegten Ergebnisse
steht die Kapazität von
VLPs, potente Immunreaktionen gegen virale Epitope zu induzieren,
wahrscheinlich mit ihrer Fähigkeit
in Beziehung, mit Zelloberflächen
zu interagieren und Epitope als eine geordnete Anordnung einer sich
wiederholenden Struktur zu präsentieren.
-
Wir
waren erfolgreich im Herstellen von L2-Chimären von viralen Proteinen.
Signifikanterweise waren alle Fusionen kompatibel mit der Zusammenlagerung
zu Vollgrößen-L1-VLPs,
die wirksam als Partikel gewonnen werden konnten (Greenstone et
al., Proc Natl Acad Sci USA, 95:1800 (1998)). Große Insertionen
in das L2-Protein, die sogar 42 kDa Volllängen-Proteine repräsentierten,
waren kompatibel mit der VLP-Zusammenlagerung. Die Fähigkeit
des L2, Insertionen dieser Größe zu akzeptieren,
wird der Tatsache zugeschrieben, dass L2 nicht zu der strukturellen
Integrität
des VLP beiträgt
und so wesentliche Modifikationen tolerieren kann, ohne die Partikel-Selbstzusammenlagerung
zu beeinträchtigen.
Während
es wahrscheinlich ist, dass L2 eine geordnete Struktur in den VLPs
aufweist, ist sein Abstand wahrscheinlich nicht so eng wie der Abstand
von L1. Obwohl die Lokalisation von L2 im Papillomavirus-Kapsid
nicht definitiv bestimmt worden ist, haben wir einen experimentellen
Hinweis, der zeigt, dass L2 an den zwölf Eckpunkten des ikosaedrischen
Kapsids lokalisiert ist. Dies würde
L2 und jedes darin inserierte Peptid in einem Wiederholungsabstand
von ungefähr
300 Ångström platzieren.
-
Da
das Papillomavirus-L2-Protein große Insertionen einer fremden
Polypeptidsequenz beherbergen und noch immer in virusähnliche
Partikel inkorporiert werden kann, können L1/L2-Chimären, die
Volllängen-Selbstproteine
aufweisen, die an der Stelle von L2 inseriert wurden, hergestellt
und als Immunogene verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird das Zielpolypeptid an die ersten 110 Aminosäuren des BPV-L2-Proteins fusioniert.
Dies präsentiert
die Insertionssequenz auf dem Kapsid-Äußeren, wenn sie zu L1-VLPs zusammengelagert
wird. In der Tat kann dieser Ansatz verwendet werden, um chimäre VLPs
herzustellen, die als Immunogene für die Stimulierung der Produktion
von Auto-Antikörpern
gegen TNF verwendet werden können.
-
Die
folgenden zwei Beispiele beschreiben, wie man Maus-TNF-VLPs sowohl
als L2-Chimäre
als auch als Streptavidin-Fusionen herstellt. Basierend auf der
bekannten Atom-Struktur des Proteins (Eck et al., J. Biol. Chem.,
264:17595 (1989)) können
L1-Chimären
auch durch Inserieren der TNF-Peptide, die Epitope einschließen, an
die funktionell neutralisierende Antikörper binden, hergestellt werden.
Serum von TNF-VLP-geimpften Mäusen
können
auf die Reaktivität
gegen Maus-TNF in einem ELISA-Test und auf die Inhibition von TNF-induzierter
Cytolyse von L929-Zellen in vitro getestet werden (Takasaki et al.,
Nature Biotech, 15:1266 (1997)). Die VLPs, die die TNF-Polypeptidsequenz
präsentieren,
können
auch verwendet werden, um DBA/1-Mäuse zu impfen, die Kollagen-Typ-II-RA
haben. Die Wirkung dieser Behandlung auf den Verlauf der Krankheit
kann unter Verwendung der Standard-Pfotenschwellung und histologischer
Analysen überwacht
werden (Thorbecke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:7375 (1992)).
-
Beispiel
8 beschreibt ein Verfahren, das verwendet werden kann, um chimäre L1/L2-Partikel
für die Verwendung
als Immunogene herzustellen.
-
BEISPIEL 8
-
Chimäre L1/L2-Partikel, um die Produktion
von Auto-Antikörpern
zu stimulieren
-
Unter
Verwendung von Standardtechniken, die Fachleuten auf dem Gebiet
des molekularen Clonierens bekannt sein werden, werden genetische
Konstrukte, die L2-Maus-TNF-Polypeptid-Chimären codieren, hergestellt und
in transfizierten Zellen als chimäre Proteine exprimiert. Die
chimären
Proteine werden dann zu virusähnlichen
L1-Partikeln zusammengelagert, um in chimären L1/L2-VLPs zu resultieren.
Die L1/L2-VLPs werden aufgereinigt, mit einem Adjuvans kombiniert
und an Testtiere in einem Immunisierungsprotokoll verabreicht. Als
Kontrollen werden das chimäre
L2-TNF-Protein und lösliches
TNF alleine injiziert. Serumproben von den Mäusen, denen die chimäre L1/L2-VLP-Präparation
verabreicht wurde, enthalten anti-TNF-Antikörper, die in einem ELISA-Test
nachweisbar sind. Im Gegensatz dazu enthalten Serumproben von Kontrolltieren
keine anti-TNF-Antikörper.
Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass chimäre L1/L2-Partikel, die chimäre L2-Proteine einschließen, nützlich sind
für die
Stimulierung der Produktion von Auto-Antikörpern.
-
Beispiel
9 beschreibt ein Verfahren zum Erzeugen und Verwenden von immunogenen
virusähnlichen Partikeln,
in denen eine Selbst-Polypeptidsequenz an die Proteine, die das
Partikel ausmachen, durch eine Biotinbindung gebunden ist. In diesem
Fall werden vorgeformte VLPs biotinyliert und dann mit einem Streptavidinverknüpften Selbst-Peptid
in Kontakt gebracht. Diese Manipulation ist möglich, weil Wildtyp-L1-VLPs ziemlich
stabil sind, sobald sie gebildet sind.
-
BEISPIEL 9
-
Virusähnliche Partikel, die Selbst-Polypeptide
durch eine Biotinbindung inkorporieren
-
Aufgereinigte
Wildtyp-L1-VLPs wurden unter Verwendung von Sulfo-NHS-Biotin-Reagenzien
gemäß den Anweisungen
des Herstellers (Pierce) biotinyliert. Biotinylierte VLPs wurden
vom freien Biotin durch Auftrennung auf einem linearen 24%-54% Saccharosegradienten
aufgereinigt. Vorausgehende Experimente zeigten, dass die L1-VLPs
stark biotinyliert waren. Diese Beobachtung wies darauf hin, dass
es zumindest ein exponiertes Lysin für die Anlagerung von Biotin
auf jedem L1 gab. Ein Maus-TNF-α-Polypeptid
wurde an die VLPs als ein Streptavidin-Fusionsprotein konjugiert.
Streptavidin war im Allgemeinen nützlich für wirksames Anheften irgendeines
Polypeptids der Wahl an die biotinylierten VLPs. Die Polypeptidsequenz
des Maus-TNF-α-Proteins
hatte die Sequenz: Ser-Ser-Gln-Asn-Ser-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Val-Val-Ala-Asn-His-Gln-Val-Glu
(SEQ ID NO: 2). Diese Sequenz wurde als eine C-terminale Fusion
in den Streptavidin-Expressionsvektor pTSA-18F cloniert. (Sano, T.
und Cantor, C.R., Biochem. Biophys. Res. Commun., 176:571–577 (1991)).
Die Expression wurde in BL21 (DE3)(pLysS)-Bakterien durchgeführt, die
für 3–6 Stunden
nach der Induktion mit 0,4 mM IPTG inkubiert wurden. Die Aufreinigung
des Proteins von Einschlusskörpern
wurde, wie von Sano und Cantor beschrieben, durchgeführt. (Sano,
T. und Cantor, C.R., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87:142–146 (1990)).
Das Streptavidin-Fusionsprotein wurde mit biotinylierten VLPs in
einem 3:1 Gewicht:Gewicht-Verhältnis
für 1 Stunde
bei Zimmertemperatur umgesetzt. Partikel, die an die Streptavidinfusion
konjugiert waren, wurden durch Zentrifugation auf einem linearen
24%–54%
Saccharosegradienten aufgereinigt. Präparationen von 5 μg VLPs mit
oder ohne angehängtes
Streptavidin-gebundenes Selbst-Polypeptid wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen in
Test- beziehungsweise Kontrollmäuse
injiziert. Zwei Wochen nach der letzten Injektion zeigten Serumproben,
die von den Tieren genommen wurden, denen die Zusammensetzung verabreicht
wurde, die das Selbst-Polypeptid enthielt, Zeichen von anti-Selbst-Polypeptid-Antikörpern. Im
Gegensatz dazu wurden in Serumproben von den Kontrolltieren keine
entsprechenden Antikörper
nachgewiesen.
-
Es
ist gut etabliert, dass monoclonale Maus-Antikörper als therapeutische Mittel
und als Reagenzien für
eine Vielzahl von Basis- und praktischen Untersuchungen nützlich sind.
Da jedoch die meisten monoclonalen Antikörper von Maus oder Ratte stammen,
fehlen dem derzeit erhältlichen
Satz von Antikörpern
jene, die spezifisch Maus- oder Ratten-Epitope erkennen, die auf
der Oberfläche
von zentralen Antigenen in ihrer natürlichen Konformation dargelegt
werden. Dieses Fehlen ist limitierend für menschliche Untersuchungen,
weil Nager Modelle für
die Untersuchung der Säuger-Biologie
sind, und hoch konservierte Aminosäuresequenzen des Proteins typischerweise
wichtige Funktionen haben, die durch die Evolution konserviert sind.
Dementsprechend wird es unter Verwendung der hierin offenbarten
Verfahren möglich
werden, B-Zell-Reaktionen gegen Selbst-Antigene in ihrer natürlichen
Konformation zu stimulieren. Danach wird es möglich sein, Hybridome, die monoclonale
Antikörper
produzieren, die die erwünschte
Bindungsspezifität
aufweisen, herzustellen und auf sie zu durchmustern. Insbesondere
wird das TNF-VLP, das am wirksamsten in der Herstellung von polyclonalen
Antikörpern
gegen TNF ist, in einem Versuch, monoclonale Antikörper herzustellen,
die spezifisch Maus-TNF erkennen und funktionell inaktivieren, verwendet
werden. Das Milzzellen/Myelom-Standard-Fusionsverfahren wird verwendet
werden, um die monoclonalen Antikörper-produzierenden Zellen
herzustellen (Galfre et al., Nature, 266:550 (1977)).
-
Beispiel
10 beschreibt kurz ein Verfahren, das verwendet werden kann, um
monoclonale Maus-Antikörper
gegen TNF zu produzieren.
-
BEISPIEL 10
-
Produktion von monoclonalen
Antikörpern
-
Mäuse werden
zuerst mit virusähnlichen
Partikeln, die auf ihrer Oberfläche
eine Maus-TNF-Polypeptid präsentieren,
das gemäß den oben
beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, immunisiert. Es wird
unter Verwendung eines ELISA-Tests
etabliert, dass das Serum der Mäuse
Antikörper
enthält,
die spezifisch für
natürlichen
TNF sind. Die Mäuse
werden getötet,
und die geernteten Milzzellen werden mit nicht-sezernierenden Myelomzellen
fusioniert, um eine Sammlung von Hybridomen zu produzieren. Die
Hybridome werden durch Verfahren gescreent, die Fachleuten bekannt
sein werden, um jene sezernierenden Antikörper zu identifizieren, die
eine Bindungsspezifität
für natürlichen
TNF haben. Nützliche
Mengen der anti-TNF-Antikörper
werden dann aufgereinigt.
-
BEISPIEL 11
-
Steigern der Antikörperreaktion
auf subdominante virusneutralisierende Epitope
-
Die
Impfung mit Papillomavirus-L1- und -L1/L2-VLPs kann hohe Titer (größer als
100 000), aber nur Typ-spezifische neutralisierende Antiseren herstellen
(Kirnbauer, R. et al., PNAS, 89:12180–4 (1992); Roden, R. et al.,
J. Virol., 70:5875–83
(1996)). Im Gegensatz dazu rufen L2 allein oder Fragmente davon
nur niedrige Titer von neutralisierenden Antiseren (1000 oder weniger)
hervor, aber sie können
unter den Papillomavirus-Typen kreuzneutralisierend sein (Roden,
R. et al., J. Viro., 68:7570–4
(1994); Kawana, K. et al., J. Virol., 73:6188–90 (1999); Roden, R. et al.,
Abstract Book, 17th International Papillomavirus
Conference, S. 61 (1999)). Um die Titer von kreuzneutralisierenden
L2-Antikörpern
zu erhöhen,
werden L2-Peptide in einer Anordnung mit engen Abständen auf
der Oberfläche
von VLPs präsentiert.
Zum Beispiel wird ein Peptid, das die Aminosäuren 108–120 von HPV16-L2 einschließt, genetisch
an den C-Terminus von Streptavidin fusioniert, und das Fusionsprotein
wird, wie in Beispiel 9 beschrieben, produziert. Das Streptavidin-L2-Fusionsprotein wird
mit biotinylierten VLPs und den konjugierten VLPs umgesetzt, die,
wie in Beispiel 9 behandelt, aufgereinigt wurden. Antiseren von
mit Streptavidin-L2-konjugierten
VLP geimpften Säugern
werden unter Verwendung der vorher beschriebenen in vitro-neutralisierenden
Tests (Roden, R. et al., J. Virol., 68:7570–4 (1994); Roden, R. et al.,
Abstract Book, 17th International Papillomavirus
Conference, S. 61 (1999)) auf Antikörper getestet, die Papillomavirus-Pseudovirionen
kreuzneutralisieren. Hohe Titer von kreuzneutralisierenden Antikörpern werden
nachgewiesen.
-