DE69929232T2 - Virusähnliche partikel zur induktion von autoantikörpern - Google Patents

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Description

  • BEREICH DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zum Stimulieren einer B-Zell-Immunreaktion in vivo. Neue biologische Werkzeuge, Therapeutika und Prophylaktika, umfassend chimäre oder konjugierte virusähnliche Partikel, und Verfahren, die für das vorher Genannte von Nutzen sind, werden für die Untersuchung, Behandlung und Verhinderung von einer menschlichen Krankheit geliefert.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Es ist gut etabliert, dass die Wirts-Immunabwehr zu verschiedenen Stadien einer menschlichen Erkrankung in Erscheinung treten. Während einer viralen Infektion können zum Beispiel Antikörper, die als Reaktion auf frühere Immunisierung stimuliert wurden, eindringende Viren vor dem Anheften und Penetrieren von empfänglichen Zielzellen neutralisieren. In dem Fall, dass Zellen infiziert werden und Virus-assoziierte Antigene auf ihren Oberflächen zeigen, können auch zelluläre Immunreaktionen aktiviert werden. In diesem letzteren Fall können cytotoxische T-Zellen infizierte Zellen abtöten und dadurch das Fortschreiten der Infektion limitieren. Diese humoralen und zellulären Immunreaktionen werden gewöhnlich gegen eine Infektion durch eine weite Vielzahl von Viren, einschließlich Viren, die DNA- oder RNA-Genome und äußere Hüllen aufweisen, die aus Proteinkapsiden oder Membranhüllen zusammengesetzt sind, eingerichtet.
  • Die Tatsache, dass Tiere starke Immunreaktionen gegen die meisten fremden Antigene einrichten können, ohne auf Komponenten ihrer eigenen Gewebe in ähnlicher Weise zu reagieren, legte für Burnet und Fenner (The Production of Antibodies, Macmillan Co., Melbourne (1949)) nahe, dass das Immunsystem gewisse Mechanismen zum Unterscheiden von Selbst und Nicht-Selbst entwickelt haben muss. Es existiert zweifellos ein Status der Selbsttoleranz für zentrale Antigene, denen das Immunsystem normalerweise ausgesetzt ist. (Siehe Siskind, G., Fundamental Immunology Hrsg. W.E. Paul, Raven Press, New York, Kap. 20 (1984)). Ein "zentrales Antigen" ist ein Selbstantigen, das gewöhnlich Zellen des Immunsystems ausgesetzt ist, wohingegen ein "periphäres Antigen" ein Selbstantigen ist, das gewöhnlich vom Kontakt mit Zellen des Immunsystems zum Beispiel durch physikalische Trennung abgeschirmt ist. Das Unvermögen des Immunsystems, Reaktionen gegen bestimmte Komponenten zum Beispiel des Auges, des Gehirns und der Hoden einzurichten, resultiert eher von der Trennung dieser Gewebe vom Wirts-Immunsystem als von Selbsttoleranz. In der Tat können Autoimmunreaktionen erfolgen, wenn die physikalischen „Barrieren", die diese periphären Gewebe-Antigene getrennt von der Immunüberwachung halten, beeinträchtigt sind. Bemerkenswerterweise besitzt das Wirbeltier-Genom all die Information, die benötigt wird, um Antikörper zu produzieren, die gegen ein Selbstantigen gerichtet sind; und spontan hergestellte Antikörper gegen viele Selbstantigene können routinemäßig nachgewiesen werden. Diese Antikörper haben jedoch niedrige Titer, niedrige Affinität und gehören der IgM-Klasse an.
  • Einige Forscher glauben, dass Selbsttoleranz das „Lernen" des Immunsystems involviert, um zwischen selbst- und nicht-selbst-Komponenten zu unterscheiden, ein Ereignis, das vor der Reifung um den Zeitpunkt der Geburt erfolgt. Es ist spekuliert worden, dass Aussetzen des lymphoiden Systems gegenüber Selbstantigenen zum Beispiel während der fötalen Entwicklung eine kritische Phase für die Entwicklung einer Toleranz für Selbstantigene ist. Entsprechend anderen Modellen werden Lymphocyten, die Zelloberflächenrezeptoren exprimieren, die spezifisch für das Selbstantigen sind, eliminiert, unfähig zur Aktivierung gemacht oder werden „dazu gebracht", das Antigen „zu tolerieren".
  • Der Ausdruck „B-Zell-Toleranz" wird oft verwendet, um einen Status zu beschreiben, in dem das Immunsystem unwirksam auf die Anwesenheit eines Antigens (z.B. eines Selbstantigens) reagiert oder spezieller, wenn die B-Zellen des Immunsystems versagen, eine Reaktion auf ein Antigen hervorzurufen. Dementsprechend wird ein Antigen, das normalerweise B-Zellen ausgesetzt ist, aber trotzdem versagt, eine Antikörperreaktion mit hohem Titer zu induzieren, oder das mit einer normalen nicht-Reaktion durch B-Zellen assoziiert ist (z.B. ein Selbstantigen), als ein „Tolerogen" bezeichnet, da das Immunsystem seine Anwesenheit „toleriert". Klarerweise sind Selbstantigene Tolerogene, aber fremde Antigene können auch Tolerogene werden, wenn B-Zellen scheitern, ausreichend auf das Antigen zu reagieren. Manche Forscher glauben zum Beispiel, dass chronische virale Infektionen erfolgen (z.B. virale Persistenz in Säuglingen, die von Hepatitis B-Virus (HBV)-tragenden Müttern geboren werden), weil das Immunsystem dazu gebracht wurde, virale Antigene zu tolerieren. (Takashima et al., Immunology, 75:398 (1992)). Tolerogene sind nicht notwendigerweise ganze Moleküle, sondern können Teile von Molekülen (z.B. Peptidfragmente von Proteinen) in potenziell immundominanten Regionen eines Moleküls sein. Obwohl Forscher Erfolg gehabt hatten, Toleranz in Tieren durch verschiedene Techniken zu induzieren, steckt unser Verstehen der Arten, Antikörper gegen Tolerogene zu erzeugen, noch in Kinderschuhen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfinder haben Zusammensetzungen und Verfahren zum Erhöhen der Titer von Antikörpern gegen Tolerogene (z.B. Selbstantigene und fremde Antigene) über jene Titer, die routinemäßig spontan oder nach konventionellen Verfahren der Impfung hergestellt werden, entdeckt. In einigen Ausführungsformen wird die B-Zell-Toleranzbrechung durch die Verwendung einer Unterlage oder einer kapsomeren Struktur erzielt, die einen geordneten Aufbau bzw. eine geordnete Zusammenlagerung von Untereinheiten oder Kapsidproteinen, die an mindestens ein B-Zell-Epitop eines Tolerogens gebunden sind, aufweist, wobei das Tolerogen in einer regelmäßigen, sich wiederholenden Anordnung präsentiert wird. In manchen Aspekten der Erfindung sind das Tolerogen und das virale Kapsidprotein von unterschiedlichen Organismen, Viren oder infektiösen Agenzien abgeleitet. Die Unterlage kann eine Kugel, eine Lipidmembran oder ein Proteinpolymer sein. Die kapsomere Struktur kann ikosaedrische oder helikale Symmetrie aufweisen. In erwünschten Zusammensetzungen umfasst die kapsomere Struktur jedoch virale Kapsidproteine, die sich selbst zusammenlagern, um eine organisierte Struktur zu bilden, die als „virusähnliches Partikel" oder VLPs bezeichnet wird.
  • In manchen Ausführungsformen sind die viralen Kapsidproteine Hybridmoleküle oder sind auf andere Weise modifiziert. Daher sind manche Ausführungsformen „chimäre virusähnliche Partikel (VLPs)" und andere sind „konjugierte virusähnliche Partikel (VLPs)", wobei „chimäre VLPs" ein Tolerogen haben, das an das virale Kapsidprotein (oder sein Homolog) durch Genmanipulation (z.B. Bildung einer Tolerogen/Kapsidprotein-Fusion) gebunden ist, und „konjugierte VLPs" ein Tolerogen aufweisen, das an das virale Kapsidprotein (oder sein Homolog) durch chemische, physikalische oder andere Modifikation des Kapsidproteins oder des Tolerogens oder von beiden (z.B. Biotin/Streptavidin, Biotin/Avidin, andere Liganden/Rezeptor-Sequenzen) gebunden ist. Daher schließen Aspekte der Erfindung eine Zusammensetzung ein, die eine Unterlage umfasst, die einen geordneten Aufbau aus Untereinheiten und zumindest ein B-Zell-Epitop eines Tolerogens aufweist, das an die Unterlage gebunden ist, um ein Tolerogenpräsentierendes Immunogen zu bilden, wobei das Tolerogen-präsentierende Immunogen das Tolerogen in einer regelmäßigen, sich wiederholenden Anordnung präsentiert. Andere Zusammensetzungen der Erfindung umfassen eine kapsomere Struktur, die einen symmetrischen Aufbau Kapsidproteinen und mindestens ein B-Zell-Epitop eines Tolerogens aufweist, das an die kapsomere Struktur gebunden ist, um ein Tolerogen-präsentierendes virusähnliches Partikel (VLP) zu bilden, wobei das Tolerogen-präsentierende VLP das Tolerogen in einer geordneten, sich wiederholenden Anordnung präsentiert. Eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft einen isolierten Komplex, umfassend eine dieser Zusammensetzungen, gebunden an eine Zelle des Immunsystems. Darüber hinaus sind Pharmazeutika, die diese Zusammensetzungen umfassen, Ausführungsformen der Erfindung.
  • Verfahren zum Herstellen von Antikörpern gegen ein Tolerogen sind auch Teil der Erfindung. Durch ein Verfahren werden Antikörper gegen ein Tolerogen durch Identifizieren eines Individuums, das Antikörper gegen ein Tolerogen benötigt, und Liefern einer ausreichenden Menge einer der oben beschriebenen Zusammensetzungen an das Individuum hergestellt, um Antikörper gegen das Tolerogen herzustellen. Ein anderer Ansatz involviert die Identifizierung von Agenzien, die Auto-Antikörper herstellen. Dementsprechend wird eine der obigen Zusammensetzungen an ein Individuum geliefert, Antikörper werden von dem Individuum isoliert, der Titer der in Schritt (b) isolierten Antikörper, die an das Tolerogen binden, wird bestimmt, und das Agens wird durch die Fähigkeit, Antikörper mit hohen Titern zu erzeugen, identifiziert. Zusätzlich ist ein Verfahren zum Herstellen von monoclonalen Antikörpern gegen ein Tolerogen im Bereich der Erfindung. Durch diesen Ansatz wird eine der oben beschriebenen Zusammensetzungen an ein Individuum geliefert, und ein Hybridom wird mit einer B-Zelle des Individuums hergestellt. Andere Verfahren schließen ein Verfahren zur Verstärkung der Antikörperproduktion gegen eine normal immunogene Verbindung ein, umfassend die Schritte des Selektierens eines Antigens, das eine Antikörperreaktion mit niedrigem Titer in einem Individuum hervorruft, Binden dieses Antigens an ein modifiziertes VLP, so dass ein konjugiertes VLP gebildet wird, wobei das konjugierte VLP das Antigen in einer regelmäßigen, sich wiederholenden Anordnung präsentiert, und Liefern des konjugierten VLPs an ein Individuum, wodurch Antikörper mit hohem Titer hergestellt werden.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die 1A und 1B sind Linien-Graphiken, die die Serum-Antikörperreaktivität in einem ELISA-Test zeigen. 1A zeigt die IgG-Antikörperreaktivität gegen ein BSA-gekoppeltes CCR5-Peptid. 1B zeigt die IgG-Antikörperreaktivität gegen BPV-1-VLPs. Die Symbole repräsentieren die Ergebnisse unter Verwendung von Seren von Mäusen, die mit L1-CCR5-Partikeln (), denaturierten L1-CCR5-Partikeln () oder BPV-1-VLPs () in der Anwesenheit von Freundschem Adjuvans oder L1-CCR5-Partikeln in der Abwesenheit von Adjuvans () beimpft worden sind.
  • Die 2A–2G sind Histogramme, die die durchflusscytometrische Analyse des Antikörpers, der an transient transfizierte HeLa-MAGI-Zellen bindet, veranschaulichen. Konstrukte, die CCR5-DNA codieren (dicke, durchgehende Linie) oder Vektor allein (schattiertes Histogramm) als eine Kontrolle für die Hintergrundfärbung wurden 2 Tage vor der Färbung in die Zellen transfiziert. (2A–2D). Zellen, transfiziert mit Maus-CCR5 oder Vektor-DNA. (2E–2G). Zellen, transfiziert mit einer Mensch/Maus-CCR5-Chimäre (HMHH) oder Vektor-DNA. Die Zellen wurden mit aufgereinigtem IgG von L1-CCR5-immunisierten Mäusen (2A und 2E), aufgereinigtem IgG von BPV-1-VLP-immunisierten Mäusen (2B und 2F) oder aufgereinigtem IgG von KLH-gekoppeltem CCR5-Peptid-immunisierten Mäusen (2D) inkubiert. Als eine Kontrolle wurden die Zellen auch mit einem Fluoresceinmarkierten monoclonalen Antikörper gegen die 2. EC-Schleife von menschlichem CCR5 gefärbt (2C und 2F).
  • 3 ist eine Säulengraphik, die die Verdrängung von iodiertem menschlichem RANTES durch Seren zeigt. HeLa-MAGI-Zellen wurden transient mit mCCR5 transfiziert. Drei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen mit 0,5 nM iodiertem RANTES in der Abwesenheit oder Anwesenheit von Verdünnungen der Mausseren inkubiert. Maximal gebundenes iodiertes RANTES wurde durch Testen auf die Bindung in der Abwesenheit von Seren bestimmt und entspricht mit ungefähr 2550 ZpM (angezeigt durch die gestrichelte Linie). Nicht-spezifische Bindung von iodiertem RANTES (ungefähr 1300 ZpM) wurde durch Testen auf die Bindung in einem 1000-fachen Überschuss (500 nM) von kaltem (nicht-iodiertem) menschlichem RANTES bestimmt. Die Daten repräsentieren den Durchschnitt von Vertiefungen in doppelter Ausführung von einem Experiment. Dieser Test wurde zweimal wiederholt, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen.
  • 4 ist eine Liniengraphik, die die Inhibition einer HIV-1-BaL-Infektion unter Verwendung von Verdünnungen von L1-CCR5-Seren, BPV-1-VLP-Seren oder einem monoclonalen Antikörper gegen die zweite EC-Schleife von menschlichem CCR5 (mAB182) zeigt. Seren von drei Tieren wurden gepoolt. HeLa-MAGI-Zellen, eine HIV-1-Indikator-Zelllinie, in der sich die Kerne von infizierten Zellen blau färben, wurden transient mit einer Mensch-Maus-CCR5-Chimäre (HMHH) transfiziert, die die erste EC-Schleife von Maus-CCR5 in einem Hintergrund des menschlichen CCR5-Gens enthält. Drei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen mit Verdünnungen von gepoolten Mausseren oder dem Antikörper für 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden dann mit dem M-tropischen Isolat HIV-1-BaL herausgefordert. Drei Tage nach der Infektion wurden die infizierten Zellen durch Zählen der Anzahl von blauen Zellen in jeder Vertiefung bewertet. Inhibition der HIV-1-BaL-Infektion wurde durch Vergleichen der Anzahl von blauen (infizierten) Kernen in der Anwesenheit von Seren mit der Anzahl von blauen Kernen in der Abwesenheit von Seren bestimmt. Die Daten repräsentieren den Durchschnitt von Vertiefungen in doppelter Ausführung von einem Experiment. Um die Reproduzierbarkeit abzusichern, wurde dieser Test zumindest zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Seren von () L1-CCR5-beimpften Mäusen, () BPV-1-VLP-beimpften Mäusen oder () mAB182.
  • 5 ist eine Liniengraphik, die die Antikörperreaktivität von Primatenserum in einem ELISA-Test zeigt. Die Symbole repräsentieren die Ergebnisse unter Verwendung von Seren von Makaken, die mit L1-CCR5-Partikeln mit Adjuvans () oder Wildtyp-BPV-1-VLPs in der Abwesenheit von Adjuvans (♢) beimpft wurden.
  • 6 ist eine Liniengraphik, die die Bindung von Streptavidin an biotinylierte und nicht-biotinylierte VLPs zeigt. Die Symbole repräsentieren (⎕) biotinylierte VLPs, konjugiert mit Wildtyp-Streptavidin (SA), (o) biotinylierte VLPs, konjugiert mit SA-TNF-α, () nicht-biotinylierte VLPs, konjugiert mit Wildtyp-SA und (•) nicht-biotinylierte VLPs, konjugiert mit SA-TNF-α.
  • 7 ist eine Säulengraphik, die die Ergebnisse eines TNF-α-Cytotoxizitätstests zeigt. Seren von Mäusen, die mit einem Streptavidin-TNF-α-Fusionsprotein (SA-TNF-α), gebunden an ein biotinyliertes VLP, beimpft wurden, wurden mit einer TNF-α-empfindlichen Zelllinie (L929) in der Anwesenheit von TNF-α inkubiert. Seren von Mäusen, die mit Streptavidin, gebunden an biotinyliertes VLP, beimpft wurden, wurden als eine Kontrolle verwendet. Die Fähigkeit der Zellen. Serum von SA-TNF-α-beimpften Mäusen (z.B. in einer 5%-Konzentration) zeigte einen dreifachen Anstieg der Zahl von überlebenden Zellen im Vergleich zu den Hintergrundspiegeln.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die hierin beschriebene Erfindung betrifft Zusammensetzungen zum Erhöhen der Titer von Antikörpern gegen „Tolerogene", einschließlich Selbstantigene und fremde Antigene, über jene Titer, die routinemäßig spontan oder nach konventionellen Verfahren der Impfung hergestellt werden. Mit „Antikörperreaktion mit niedrigem Titer" wird eine B-Zell-Reaktion gemeint, die in einer unzureichenden Menge von Antikörpern, um eine physiologisch wirksame in vivo-Immunreaktion hervorzurufen, resultiert, wohingegen eine „Antikörperreaktion mit hohem Titer" eine ausreichende Menge von Antikörpern, um eine physiologisch wirksame Immunreaktion in vivo hervorzurufen, bezeichnet. Die Begriffe „Antikörperreaktion mit niedrigem Titer" und „Antikörperreaktion mit hohem Titer" werden auch entsprechend der Konzentration und Avidität des produzierten Antikörpers definiert. Das heißt, ob ein Antigen eine „Antikörperreaktion mit niedrigem Titer" oder eine „Antikörperreaktion mit hohem Titer" produziert, hängt von der Verdünnung von Antikörper-enthaltenden Seren ab, bei der das Antigen in einem ELISA-Test nicht mehr nachweisbar ist, wobei typischerweise 200 ng des Zielantigens in einer 1:1000- Verdünnung eines sekundären Antikörpers verwendet werden. Daher ist eine „Antikörperreaktion mit niedrigem Titer" typischerweise weniger als etwa eine 1:10000-Verdünnung unter den oben beschriebenen Bedingungen für ELISA, und eine „Antikörperreaktion mit hohem Titer" ist typischerweise größer oder gleich einer 1:10000-Verdünnung. Es sollte verstanden werden, dass der Ausdruck „Tolerogen" im gesamten Verlauf dieser Offenbarung verwendet wird, um ein Selbstantigen oder ein fremdes Antigen (Peptid, Nucleinsäure, Kohlenhydrat oder Lipid) zu bezeichnen, das entweder mit völliger B-Zell-Nichtreaktivität oder limitierter B-Zell-Reaktivität so assoziiert ist, dass das Antigen nur eine Antikörperreaktion mit niedrigem Titer hervorruft, die die normale in vivo-Aktivität des Antigens nicht im Wesentlichen beeinflusst.
  • In einigen Ausführungsformen wird die B-Zell-Toleranzbrechung durch die Verwendung einer Unterlage oder einer kapsomeren Struktur erreicht, die einen geordneten Aufbau von Untereinheiten oder Kapsidproteinen aufweist, die an mindestens ein B-Zell-Epitop eines Tolerogens gebunden ist, wobei das Tolerogen in einer regelmäßigen, sich wiederholenden Anordnung präsentiert wird. In manchen Aspekten der Erfindung sind das Tolerogen und das virale Kapsidprotein von unterschiedlichen Organismen, Viren oder infektiösen Agenzien abgeleitet. Die Unterlage kann eine Kugel, eine Lipidmembran oder ein Proteinpolymer sein. Die kapsomere Struktur kann ikosaedrische oder helikale Symmetrie aufweisen. In erwünschten Zusammensetzungen umfasst die kapsomere Struktur jedoch virale Kapsidproteine, die sich selbst zusammenlagern, um eine geordnete Struktur zu bilden. Solche viralen Kapsid-Aufbauten werden als „virusähnliches Partikel" oder VLPs bezeichnet.
  • In manchen Ausführungsformen sind die viralen Kapsidproteine Hybridmoleküle oder sind auf andere Weise modifiziert. Der Ausdruck „virusähnliches Partikel" oder „kapsomere Struktur" wird oft verwendet, um eine geordnete Struktur zu bezeichnen, die sich selbst zusammenlagernde, geordnete Anordnungen von Kapsidproteinen umfasst, die kein virales Genom einschließen. In dieser Hinsicht sind manche Ausführungsformen „chimäre virusähnliche Partikel (VLPs)", und andere sind „konjugierte virusähnliche Partikel (VLPs)". Der Ausdruck „chimäres VLP" bezeichnet ein VLP, bei dem das Tolerogen an das virale Kapsidprotein (oder sein Homolog) durch Genmanipulation (z.B. Bildung einer Tolerogen/Kapsidprotein-Fusion) gebunden ist. Daher wird die Tolerogen/Kapsidprotein-Fusion oft als ein „Hybridhüllenprotein" bezeichnet, weil das virale Hüllenprotein mit einer Aminosäuresequenz des B-Zell-Epitops eines Tolerogens chimärisiert wird. Entsprechend der hierin verwendeten Nomenklatur wird ein Hybridhüllenprotein durch den Namen des viralen Hüllenproteins und die Quelle des Tolerogens, das in Verbindung mit dem viralen Hüllenprotein dargelegt wird, identifiziert. Der Ausdruck „konjugiertes VLP" wird verwendet, um ein VLP zu bezeichnen, in dem das Tolerogen an das virale Kapsidprotein (oder sein Homolog) durch chemische, physikalische oder andere Modifikation des Kapsidproteins oder des Tolerogens oder von beiden (z.B. Biotin/Streptavidin, Biotin/Avidin, andere Liganden/Rezeptor-Sequenzen) gebunden ist.
  • Das Hybridhüllenprotein kann die Aminosäuresequenz des Tolerogens in seine Primärstruktur, wie durch Inserieren der Aminosäuresequenz des Tolerogens in die Aminosäuresequenz des viralen Hüllenproteins oder durch Ersetzen der Aminosäuresequenz des viralen Hüllenproteins mit der Aminosäuresequenz des Tolerogens inkorporieren. Die Stelle der Chimärisierung hängt oftmals von der äußeren Oberfläche des VLPs und den Regionen des viralen Hüllenproteins, die in die Selbstzusammenlagerung involviert sind, ab. Diese Stelle kann zum Beispiel der Stelle eines virusneutralisierenden Epitops entsprechen. Es muss verstanden werden, dass das Hybridhüllenprotein in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung die Form eines einzigen Hüllenproteins, in anderen Ausführungsformen die eines Kapsomers (5 Hüllenproteine, die in einem Pentamer angeordnet sind) oder in bevorzugten Ausführungsformen die eines VLPs, das aus multiplen Kapsidproteinen zusammengesetzt ist, die als eine partikuläre Struktur angeordnet sind, annehmen kann.
  • Das virale Kapsidprotein, das die kapsomere Struktur eines VLP umfasst, kann von vielen verschiedenen Typen von Viren stammen, aber wünschenswerte Ausführungsformen haben Proteine, die in einem Virus, das eine ikosaedrische Struktur (z.B. T = 7) aufweist, und in Viren, deren natürlicher Reservoir-Wirt ein Säuger ist, und in Viren, die aus den Familien der Papillomavirinae, Polyomavirinae oder Parvoviridae ausgewählt werden, gefunden werden. Bevorzugte Zusammensetzungen haben einen Kapsidaufbau, der eine Vielzahl von Papillomavirus-Hybrid- oder modifizierten L1-Proteinen aufweist.
  • Durch Anwenden der hierin offenbarten chimären und konjugierten VLP-Technologie können einige Ansätze verwendet werden, um ein Tolerogen an eine Unterlage zu binden, um viele neue Zusammensetzungen zu bilden. In den meisten Ausführungsformen ist die Zusammensetzung eine „multimere" Unterlage, in der mehr als ein Tolerogen-Molekül an die Unterlage angehängt ist. In manchen Ausführungsformen wird jedoch eine „multimere" Unterlage geliefert, in der der Tolerogen-Teil der Zusammensetzung eine Vielzahl der selben Tolerogen-Domäne, als Tandem fusioniert, umfasst. Darüber hinaus sind multimere Zusammensetzungen, die multimerisierte Tolerogene aufweisen, auch Ausführungsformen der Erfindung. In anderen Ausführungsformen ist die Zusammensetzung eine „zusammengesetzte" Unterlage, in der mehr als ein Typ von Tolerogen vorhanden ist. Ein Fachmann wird auch anerkennen, dass zusammengesetzte Unterlagen multimer sein können und multimerisierte Tolerogene einschließen können. Vorzugsweise binden die multimeren Zusammensetzungen, multimerisierten Zusammensetzungen und zusammengesetzten Zusammensetzungen und Kombinationen davon Tolerogene auf eine Weise an die Unterlage, die die Präsentation für Zellen des Immunsystems optimiert. Zum Beispiel präsentieren die Ausführungsformen die Tolerogene in einer geordneten, eng aneinanderliegenden, sich wiederholenden Anordnung. Zusätzlich schließen manche Ausführungsformen Linker ein, die zwischen die Unterlage und das virale Kapsidprotein (oder sein Homolog) oder zwischen das Tolerogen und das virale Kapsidprotein (oder sein Homolog) oder beide eingebaut werden, um sterische Behinderung zu reduzieren und optimale Immunreaktion anzuregen. Daher haben manche Zusammensetzungen ein virales Kapsidprotein (oder sein Homolog) oder ein Tolerogen oder beides, das durch einen Linker an die Unterlage gebunden ist.
  • Viele unterschiedliche Tolerogene können an die Unterlage gebunden werden, einschließlich Peptide, Nucleinsäuren, Kohlenhydrate und Lipide. In manchen Ausführungsformen ist das Tolerogen ein Selbstantigen. Das Tolerogen kann zum Beispiel ein Ligand wie ein Protein auf der Oberfläche einer neoplastischen Zelle oder ein Wachstumsfaktor wie ein Protein, das mit Angiogenese assoziiert ist, oder ein viraler Rezeptor wie der Chemokin-Rezeptor CCR5 und Cytokine wie TNF-α sein. Fragmente von diesen „Volllängen"-Tolerogenen sind auch für manche Ausführungsformen wünschenswert. Das heißt, in manchen Ausführungsformen kann das Tolerogen ein ganzen Molekül (z.B. Volllänge) sein, aber meistens umfasst das Tolerogen nur einen Teil oder ein Fragment des Volllängen-Moleküls (z.B. Teillänge). Erwünschte Tolerogene umfassen mindestens 5 bis 500 aufeinanderfolgende Aminosäuren des Volllängen-Moleküls, vorteilhaft 5 bis 200 und vorzugsweise 5 bis 50. Vorzugsweise werden das Tolerogen und das virale Kapsidprotein von verschiedenen Organismen, Viren oder infektiösen Agenzien abgeleitet. Andere Ausführungsformen schließen einen isolierten Komplex, der eine der oben beschriebenen Zusammensetzungen, die an eine Zelle des Immunsystems (z.B. eine B-Zelle, eine T-Zelle oder eine dentritische Zelle) gebunden ist, umfasst, und ein Pharmazeutikum, das eine der oben beschriebenen Zusammensetzungen umfasst, ein.
  • Die Zusammensetzungen, isolierten Komplexe und Pharmazeutika der Erfindung werden als biologische Werkzeuge, Therapeutika und Prophylaktika für die Untersuchung der B-Zell-Toleranz, die Identifizierung von Agenzien, die Auto-Antikörper herstellen, und die Behandlung und Prävention von menschlichen Erkrankungen wie einer viralen Infektion, einer chronischen Entzündung und Krebs verwendet. In einer Ausführungsform wird zum Beispiel ein Verfahren zum Identifizieren von Agenzien, die Auto-Antikörper herstellen, geliefert. Durch diesen Ansatz wird eine Zusammensetzung der Erfindung an ein Individuum geliefert, Antikörper werden dann von dem Individuum isoliert und eine Bestimmung wird durchgeführt, ob die isolierten Antikörper mit dem Tolerogen, das durch die Zusammensetzung präsentiert wird, interagieren. In der Folge wird das Immunogen als eines identifiziert, das die B-Zell-Toleranz durch die Fähigkeit der isolierten Antikörper, mit dem Tolerogen zu interagieren, bricht. In einer anderen Ausführungsform wird ein Verfahren zum Herstellen von Antikörpern gegen ein Tolerogen geliefert, in dem ein Individuum, das Antikörper gegen ein Tolerogen benötigt, identifiziert wird, und dann wird eine therapeutisch günstige Menge einer Zusammensetzung der Erfindung geliefert. Zusätzlich werden Verfahren der Behandlung und Prävention einer HIV-Infektion, einer chronischen viralen Infektion, von Krebs und einer Entzündung geliefert, die den Schritt des Bereitstellens eines Pharmazeutikums, das eine Zusammensetzung der Erfindung umfasst, involvieren. Zum Beispiel können Brustkrebs und rheumatoide Arthritis durch Induzieren der Produktion von Antikörpern, die gegen ErbB-2 beziehungsweise TNF gerichtet sind, behandelt werden. (Maini, R.N. et al., Imm. Reviews, 144:195–223 (1995); Baselga, J. et al., J. Clin. Oncol., 14:737–44 (1996)). Darüber hinaus sind polyclonale und monoclonale Antikörper, die gegen Epitope auf den chimären und konjugierten VLPs der Erfindung gerichtet sind, Ausführungsformen.
  • Ein Beweis unserer Entdeckung wird in den zwei Gruppen von Experimenten, die unten geliefert werden, geliefert. In einer ersten beispielhaften Demonstration wurde die B-Zell-Toleranz gegenüber dem zentralen Maus-Chemokinrezeptor (mCCR5)-Antigen durch Immunisieren der Mäuse mit chimären VLPs, die das mCCR5-Tolerogen aufwiesen, aufgehoben. In diesen Experimenten wurde ein Peptid, das eine extrazelluläre Schleife des Maus-Chemokinrezeptors CCR5 repräsentiert, in ein neutralisierendes Epitop des Virus-L1-Hüllenproteins des Rinder-Papillomavirus (BPV-1) durch konventionelle Clonierungstechnologien inkorporiert. L1 hat die intrinsische Kapazität, sich selbst zu virusähnlichen Partikeln (VLPs) zusammenlagern, die sogar ohne Adjuvans hohe Spiegel von neutralisierenden Antikörpern induzieren. (Kirnbauer, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:12180–12184 (1992); Greenstone, H.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 95:1800–1805 (1998)). Der CCR5-Rezeptor wird in zahlreichen Zelltypen und Geweben, einschließlich der T-Gedächtniszellen und Makrophagen exprimiert. (Zhang, L. et al., J. Virol., 72:5035–5045 (1998)). Rekombinant produzierte chimäre Proteine, genannt „L1-CCR5", lagern sich selbst zu partikulären Strukturen zusammen, die eine geordnete Anordnung von Kapsomeren haben (hier nachstehend als virusähnliche Partikel oder VLPs bezeichnet), die als Immunogene verwendet wurden. Fachleuten wird bewusst sein, dass von CCR5 bekannt ist, dass er der Co-Rezeptor für M-tropische Stämme von HIV ist und dass monoclonale Antikörper gegen menschlichen CCR5 eine HIV-Infektion in menschlichen Zellen in vitro blockieren.
  • Wie unten detailliert ausgeführt wird, produzierten Mäuse, denen das L1-CCR5-Immunogen verabreicht wurde, Auto-Antikörper, die an das natürliche Maus-CCR5 banden, inhibierten die Bindung des RANTES-Liganden und blockierten eine HIV-1-Infektion einer Indikator-Zelllinie, die eine Mensch-Maus-CCR5-Chimäre exprimierte. Wir zeigen auch, dass die Langzeit-Effekte des Behandlungsprotokolls bei Mäusen minimal waren. Darüber hinaus zeigen wir, dass Auto-Antikörper gegen CCR5 in Primaten produziert werden können. Diese Experimente liefern einen Hinweis, dass die B-Zell-Toleranz für ein Zelloberflächen-Selbstantigen, das sich gemeinsam mit einem Immunsystem entwickelt hat, gebrochen werden kann. Diese neuen Zusammensetzungen können in Pharmazeutika inkorporiert werden und können verwendet werden, um eine HIV-Infektion zu behandeln und/oder zu verhindern.
  • In einer zweiten Gruppe von Experimenten liefern wir einen Hinweis, dass die Produktion von Auto-Antikörpern gegen den Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) durch Beimpfen eines Individuums mit einem konjugierten VLP, das ein Fragment von TNF-α umfasst, induziert werden kann. Das Immunogen wurde durch Binden eines Streptavidin/TNF-α-Fusionsproteins (SA-TNF-α) an biotinylierte L1-VLPs gebildet. Mäuse, die mit SA-TNF-α-VLP-Konjugaten beimpft wurden, produzierten Auto-Antikörper, die die Wirkungen von TNF-α auf eine TNF-α-empfindliche Zelllinie (L929-Zellen) neutralisierten. Diese neuen Zusammensetzungen können in Pharmazeutika inkorporiert werden und können verwendet werden, um eine chronische, entzündliche Erkrankung und andere Erkrankungen, die mit übermäßiger Freisetzung von TNF-α assoziiert sind, einschließlich, aber nicht limitiert auf rheumatoide Arthritis, Crohn-Krankheit, ulzerative Colitis, Krebs, disseminierte Sklerose, Diabetes, Psoriasis, Osteoporose und Asthma, zu behandeln und/oder zu verhindern. In der untenstehenden Offenbarung und den Beispiele, die folgen, diskutieren wir diese zwei Gruppen von Experimenten detaillierter.
  • Ein chimäres VLP, das die Immuntoleranz bricht und eine HIV-Infektion inhibiert
  • Während wir untersuchen, ob Auto-Antikörper gegen ein Selbstantigen induziert werden können, entdeckten wir, dass die B-Zell-Toleranz durch Platzieren des Antigens in einen Zusammenhang, der die geordnete Oberfläche eines viralen Partikels nachahmt, aufgehoben werden kann. In unseren anfänglichen Experimenten inserierten wir den Maus-Chemokinrezeptor mCCR5 in eine immundominante Stelle des Rinder-Papillomavirus-L1-Hüllenproteins. Das rekombinante Protein wurde „L1-CCR5" genannt, was ein sich selbst zusammenlagerndes chimäres L1-Protein ist, das eine Vielzahl von Aminosäuren einschließt, die ein CCR5-Epitop codieren. Papillomaviren wurden ausgewählt, weil sie hoch-spezifische Immunogene sind. Jede Wirbeltier-Spezies wird durch eine ausgeprägte Gruppe von Papillomaviren infiziert, wobei jede Gruppe einige Papillomavirus-Typen umfasst. Neutralisierende Antikörper gegen die Virionen eines Papillomavirus-Typs verleihen gewöhnlich keine Immunität gegen einen anderen Typ.
  • Papillomaviren sind Beispiele von Viren ohne Hülle, die sich in den Epithelien einer breiten Vielzahl von Tierarten vermehren, um in der Bildung von gutartigen epithelialen und fibro-epithelialen Tumoren oder Warzen zu resultieren. Papillomavirus-Partikel haben einen Durchmesser von etwa 55 nm und kapseln ein doppelsträngiges, ungefähr 8 kb-DNA-Genom ein, das in einem Nucleohiston-Kern enthalten ist (Baker et al., Biophys J., 60:1445 (1991)). Die Kapside sind aus den zwei viral codierten Proteinen L1 und L2 zusammengesetzt, die auf SDS-PAGE-Gelen bei ungefähr 55 kDa beziehungsweise 75 kDa wandern (Mose Larson et al., J. Virol., 61:3596 (1987)). Das L1-Hauptkapsidprotein ist in 72 Pentameren angeordnet, die mit der T = 7-ikosaedrischen Symmetrie assoziieren. Es gibt ungefähr 12 L2-Kapsidproteine pro Virion. (Baker et al., Biophys J., 60:1445 (1991)).
  • Das L1-Protein hat die Kapazität, sich selbst so zusammenzulagern, dass große Mengen von virusähnlichen Partikeln (VLPs) durch die Expression des L1-Proteins von einem bestimmten Papillomavirus in einer Vielzahl von rekombinanten Expressionssystemen hergestellt werden können. (Kirnbauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:12180 (1992) (BPV-1, Baculovirus-Expressionssystem); Hagensee et al., J. Virol., 67:315 (1993) (HPV-1, Vacciniavirus-Expressionssystem); Kirnbauer et al., J. Virol., 67:6929 (1993) (HPV-16, Baculovirus-Expressionssystem); Rose et al., J. Virol., 67:1936 (1993) (HPV-11, Baculovirus-Expressionssystem); Sasagawa et al., Virol., 206:126 (1995) (HPV-16, Hefe-Expressionssystem); Nardinelli-Haefliger et al., Infection and Immunity, 65:3328 (1997) (HPV-16, bakterielles Expressionssystem)). Obwohl es für den Aufbau nicht benötigt wird, wird L2 in die VLPs inkorporiert, wenn es mit L1 (L1/L2-VLPs) in Zellen co-exprimiert wird.
  • Immunisierung von Kaninchen mit den natürlichen Virionen oder L1-VLPs, aber nicht mit denaturierten L1-Proteinen, induziert hohe Titer von neutralisierenden Serumantikörpern (Christensen et al., J. Virol., 64:3151 (1990); Kirnbauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:12180 (1992); Pilacinski et al., Bio/Technology, 2:356 (1984); Segre et al., Am. J. Vet. Res., 16:517 (1955)). Die polyclonalen und monoclonalen neutralisierenden Antikörper, die gegen natürliche Partikel hergestellt werden, erkennen konformationsabhängige Epitope (Christensen et al., Virus Res, 28:195 (1993); Christensen et al., Virology, 181:572 (1991)). Obwohl das Wesen der humoralen Immunreaktion gegen Papillomavirus-Antigene gut etabliert ist, war sich niemand bewusst oder hat niemand erwartet, dass die geordnete Geometrie von L1-VLPs ausgenutzt werden könnte, um ein Tolerogen dem Immunsystem in einer Weise zu präsentieren, die eine wirksame Immunreaktion fördert und so die B-Zell-Toleranz bricht.
  • Die Herstellung von chimären L1-CCR5-Partikeln benötigte die Insertion des CCR5-Peptids in eine Region von L1, die die Fähigkeit von L1, Partikel zu formen, nicht stören würde. (Siehe Beispiel 1). Obwohl die genaue strukturelle Lokalisierung und Funktion der meisten L1-Aminosäuren nicht bekannt sind, sind Aminosäure-Änderungen, die die neutralisierenden Epitope von verschiedenen menschlichen Papillomaviren stören, ohne den Kapsid-Aufbau zu beeinträchtigen, auf drei nicht-benachbarten Regionen von L1 kartiert worden. (Ludmerer, S.W., Benincasa, D. & Mark III, G.E., J. Virol., 70:4791–4794 (1996); Ludmerer, S.W. et al., J. Virol., 71:3834–3839 (1997); Roden, R.B. et al., J. Virol., 71:6247–6252 (1997)). Da es wahrscheinlich war, dass die Aminsäuren an diesen Stellen auf der Oberfläche des Kapsids waren, wurden die analogen Stellen in BPV-1-L1 für die Peptidinsertion angezielt. Daher wurden drei L1-CCR5-Chimären konstruiert, in denen die L1-Sequenz bei den BPV-1-L1-Aminosäuren 130–136, 275–285 oder 344–350 mit einer Sequenz ersetzt wurden, von der vorhergesagt wurde, dass sie ein 16 Aminosäure-Peptid codiert, das der ersten EC-Schleife von Maus-CCR5 (mCCR5) von C57BI/6 (B6)-Mäusen entspricht. Diese Chimären wurden als L1-CCR5-Chimären-1, -2 beziehungsweise -3 bezeichnet.
  • Rekombinante Baculoviren, die L1-CCR5-Chimären enthalten, wurden hergestellt, und die resultierenden L1-CCR5-Partikel wurden durch Gradienten-Zentrifugation aufgereinigt. (Kirnbauer, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:12180-12184 (1992)). Um festzustellen, ob die chimären L1-CCR5-Moleküle sich zu VLPs, Kapsomeren oder anderen partikulären Formen zusammenlagern, wurde eine Superose-6-Gelfiltrations-Chromatographie mit Präparationen der drei L1-CCR5-Chimären durchgeführt. (Siehe Beispiel 2). Nur Präparationen der L1-CCR5-Chimäre-1 eluierten in einer Fraktion, die auf eine zusammengelagerte partikuläre Struktur hinweist. Daher wurde die weitere Analyse auf diese Chimäre limitiert. Die Untersuchung von Chimäre-1-Partikeln durch Elektronenmikroskopie legte viele Partikel offen, die kleiner waren als die Wildtyp-L1-VLPs, ungefähr 28 nm im Vergleich zu 55 nm. Morphologisch spiegelten die chimären L1-CCR5 Partikel Polyomavirus-12-ICOSA-Hüllen (T = 1-Partikel) wider, die aus einer regelmäßigen Anordnung von 12 pentameren Kapsomeren des Polyomavirus-Haupthüllenproteins VP1 zusammengesetzt sind, und können bei erneuter in vitro-Zusammenlagerung von VP1-Kapsomeren bei hoher ionischer Stärke hergestellt werden. (Salunke, D., Caspar, D.L.D. & Garcea, R.L., Biophysical Journal, 56:887-900 (1989)). Kleine Partikel von ähnlicher Größe wie die L1-CCR5-Partikel werden oft als eine Weben-Komponente von Wildtyp-BPV-1-L1-VLP-Präparationen gefunden.
  • Um zu untersuchen, ob die chimären CC1R5-Partikel anti-CCR5-Antikörper induzieren könnten, wurden C57B1/6-Mäuse (ein Stamm, der die identische CCR5-Sequenz wie die Insertionssequenz codiert) mit L1-CCR5-Partikeln, denaturiertem L1-CCR5-Protein oder Wildtyp-VLPs geimpft. (Siehe Beispiel 3). Seren von diesen Mäusen wurden auf die Reaktivität gegenüber dem CCR5-Peptid und den Wildtyp-VLPs durch ELISA getestet (1A). Seren von Kontrollmäusen, die mit Wildtyp-VLPs beimpft wurden, hatten keine anti-CCR5-ELISA-Reaktivität, aber Beimpfung mit L1-CCR5-Partikeln induzierte Seren mit hohen anti-CCR5-ELISA-Titern. Diese Titer reichten in den drei Tieren, die in Kombination mit Freundschem Adjuvans beimpft wurden, von 3 × 103 bis 3 × 104 und betrugen in den zwei Tieren, die ohne Adjuvans beimpft wurden, 3 × 103. Im Gegensatz dazu wurden in Mäusen, die mit denaturierten L1-CCR5-Partikeln in Kombination mit Adjuvans beimpft wurden, keine CCR5-Peptid-spezifischen Antikörper nachgewiesen. Das Fehlen der Reaktivität der denaturierten L1-CCR5-Partikel war auf das CCR5-Peptid beschränkt, da das denaturierte Material hohe Titer von anti-L1-Antikörpern hervorrief (1B).
  • Während diese Ergebnisse einen Hinweis lieferten, dass die L1-CCR5-Partikel Antikörper gegen das CCR5-Peptid hervorrufen, bestand die Möglichkeit, dass diese Antikörper das Peptid in seiner natürlichen Konformation als ein Teil des Membranassoziierten mCCR5 nicht erkennen könnten. Um diese Möglichkeit zu eliminieren, wurde ein Experiment durchgeführt, in dem die Fähigkeit von anti-CCR5-Antikörpern, an mCCR5 auf Zellen zu binden, durch durchflusscytometrische (FACS) Analyse getestet wurde. (Siehe Beispiel 4). Die Bindung von L1-CCR5-Partikel-Seren an mCCR5, das auf primären Maus-T-Zellen und Macrophagen exprimiert wird, konnte wegen hoher Spiegel von nicht-spezifischer Maus-IgG-Bindung an diese Zellen nicht bewertet werden. Alternativ wurde cloniertes mCCR5 von B6-Mäusen transient in HeLa-MAGI-Zellen durch Transfektion exprimiert, und die Bindung von aufgereinigtem Maus-IgG wurde im Vergleich zu Vektor-transfizierten Zellen gemessen (2A–2G). Durch diesen Test band IgG von L1-CCR5-immunisierten Mäusen spezifisch an die mCCR5-transfizierten Zellen (2A), wohingegen es keine signifikante Bindung mit aufgereinigtem IgG von Wildtyp-BPV-VLP-Seren (2B) oder mit einem monoclonalen Antikörper (mAB182), der an die zweite EC-Schleife von menschlichem (h) CCR5 bindet (2C), gab. Als eine Kontrolle für die Antikörper-Spezifität wurden Mäuse mit dem mCCR5-Peptid, gekoppelt an KLH („keyhole limpet hemocyanin), beimpft. Während diese Mäuse eine anti-CCR5-Peptid-Antikörperreaktion mit ELISA-Titer von 105 gegen das CCR5-Peptid, gekoppelt an Rinder-Serumalbumin (BSA), erzeugten, scheiterte das IgG, das von den Seren von diesen Mäusen aufgereinigt wurde, mCCR5-exprimierende Zellen zu binden (2D). So wirken die L1-CCR5-induzierten Antikörper im Gegensatz zu jenen, die durch das KLH-gekoppelte Peptid induziert wurden, als wahre Auto-Antikörper, dadurch, dass sie natürlichen mCCR5 binden.
  • Als einen anderen Ansatz, die Fähigkeit der Antikörper, natürliches mCCR5 zu binden, zu untersuchen, untersuchten wir, ob die L1-CCR5-Seren mit einem Chemokin-Liganden für mCCR5 um die Bindung an HeLa-MAGI-Zellen, die transient mit mCCR5 transfiziert wurden, konkurrieren könnten (3). (Siehe Beispiel 5). Die Maus-Chemokine MIP-1, MIP-1β und RANTES sind Liganden für mCCR5. Zusätzlich sind die menschlichen Homologe von MIP-1β und RANTES in der Lage, an mCCR5 zu binden. (Meyer, A. et al., J. Biol. Chem., 271:14445–14451 (1996); Nibbs, R.J.B. et al., J. Biol. Chem., 272:12495–12504 (1997)). Im Konkurrenz-Test wurde kommerziell erhältliches iodiertes menschliches RANTES verwendet. Eine 1:30-Verdünnung von L1-CCR5-Seren verdrängte ungefähr 66% des iodierten menschlichen RANTES (ähnlich zu der Verdrängung, die unter Verwendung eines 100-fachen Überschusses von kaltem RANTES beobachtet wurde), im Vergleich zu 37% Verdrängung mit einer 1:30-Verdünnung von Wildtyp-L1-VLP-Seren. Die 1:75- und 1:150-Verdünnungen von L1-CCR5-Seren verdrängten 25% beziehungsweise 17% des iodierten RANTES, wohingegen bei Verwendung von Kontrollseren in diesen Verdünnungen keine signifikante Verdrängung beobachtet wurde. Vorherige Untersuchungen haben gezeigt, dass MIP-1, MIP-1β und RANTES an die zweite EC- Schleife von hCCR5 binden, da ihre Bindung durch einen monoclonalen Antikörper gegen diese Schleife, aber nicht durch einen Antikörper gegen den Amino-Terminus von hCCR5 blockiert wurde. (Wu, L. et al., J. Exp. Med., 186:1373–1381 (1997)). Unsere Ergebnisse von diesen Experimenten liefern einen Hinweis, dass Antikörper, die an die erste EC-Schleife von mCCR5 binden, die zwischen diesen zwei Stellen lokalisiert ist, teilweise RANTES-Bindung blockieren können, vielleicht auf Grund der Nähe dieser Schleife zu der zweiten EC-Schleife.
  • Die Fähigkeit von L1-CCR5-induzierten Antikörpern, eine M-tropische HIV-1-Infektion zu blockieren, wurde auch getestet (Siehe Beispiel 6). Die Interaktion zwischen der HIV-1-Hülle und hCCR5 ist komplex, wahrscheinlich Stamm-abhängig und involviert wahrscheinlich einige EC-Regionen von CCR5. Spezifisch haben monoclonale Antikörper-Untersuchungen die zweite EC-Schleife und die NH2-terminale Region von hCCR5 damit in Verbindung gebracht, und Studien von chimären Rezeptoren haben darauf hingewiesen, das die ersten und dritten EC-Schleifen von hCCR5 auch zu seiner Interaktion mit HIV-1 beitragen. (Wu, L. et al., J. Exp. Med., 186:1373–1381 (1997); Rucker, J. et al., Cell, 87:437–446 (1996); Atchison, R.E. et al., Science, 274:1924–1926 (1996); Alkhatib, G. et al., J. Biol. Chem., 272:19771–19776 (1997); Picard, L. et al., J. Virol., 71:5003–5011 (1997); Ross, T.M., Bieniasz, P.D. & Cullen, B.R., J. Virol., 72:1918–1924 (1998)). Obwohl mCCR5 nicht als ein HIV-1-Corezeptor wirkt, hat ein chimärer Mensch-Maus-Rezeptor (HMHH), der die erste EC-Schleife von rnCCR5 (die B6-Maus-Sequenz) in einem Hintergrund von hCCR5 enthält, Co-Rezeptor-Aktivität (wenn auch in niedriger Wirksamkeit), wenn er in menschlichen Zelllinien exprimiert wird. (Kuhmann, S.E. et al., J. Virol., 71:8642–8656 (1997)). Wir verwendeten diesen chimären Rezeptor, um zu testen, ob L1-CCR5-Seren eine M-tropische HIV-1-Infektion blockieren könnten. Um zu bestätigen, dass IgG, das von L1-CCR5-Seren aufgereinigt wurde, HMHH binden würde, wurde eine FACS-Analyse auf HeLa-MAGI-Zellen, die transient mit HMHH transfiziert wurden, durchgeführt. Eine positive Bindung wurde mit IgG von L1-CCR5-Mäusen und mit einem monoclonalen Positivkontroll-Antikörper, der an die zweite EC-Schleife von menschlichem CCR5 bindet, erzielt, während IgG von Wildtyp-L1-VLP-Mäusen HMHH nicht band (2E–2G).
  • Basierend auf diesen Ergebnissen wurden Seren von L1-CCR5-Mäusen auf ihre Fähigkeit, die Infektion des M-tropischen BaL-Stamms von HIV-1 zu inhibieren, in einem Einmalreplikationszyklus-Test unter Verwendung der MAGI-Indikator-Zelllinie getestet. (Kimpton, J. & Emerman, M., J. Virol., 66:2232–2239 (1992)). Wenn die Indikatorzellen, die transient mit HMHH transfiziert wurden, mit HIV-1-BaL in der Anwesenheit von L1-CCR5-Seren infiziert wurden, zeigten Verdünnungen von 1:15, 1:30 und 1:75 65%, 50% beziehungsweise 45% Neutralisierung der Infektiosität (4). In den selben Verdünnungen zeigten Kontrollseren von Wildtyp-L1-VLP-Mäusen eine gewisse nicht-spezifischen Neutralisierung, aber sie war nur 25% bei der 1:15-Verdünnung und 15% bei 1:30 und 1:75. Im Vergleich zeigten Indikatorzellen, die mit HIV-1-BaL in der Anwesenheit von Verdünnungen von hCCR5-bindendem monoclonalen Antikörper (mAB182) (in einer anfänglichen Konzentration von 1 μg/μl) infiziert und als eine Positivkontrolle verwendet wurden, eine ähnliche Neutralisierungskurve (5). Die L1-CCR5-Seren wurden auch auf die Neutralisierungs-Aktivität gegen das T-Zell-tropische Isolat HIV-1-LAI getestet und versagten, wie erwartet, jegliche Neutralisierung über die Hintergrundspiegel gegen dieses Isolat zu zeigen.
  • Ein Bedenken der Auto-Antikörper-Induktion ist, dass solche Vorgehensweisen schädliche Langzeit-Konsequenzen für das immunisierte Tier haben können, möglicherweise einschließlich unkontrollierter antigenischer Stimulation von natürlichem CCR5-Protein. In den drei Mäusen, die über einen Zeitraum von sechs Monaten nach der L1-CCR5-Partikel-Beimpfung überwacht wurden, beobachteten wir jedoch ein zwei- bis achtfaches Absinken des Titers von CCR5-spezifischen Antikörpern über diesen Zeitraum; dieses Absinken war grob äquivalent zu einem parallelen Absinken des Titers von L1-spezifischen Antikörpern. Zwei der Tiere zeigten zweifache Abnahmen der anti-CCR5-Antikörpertiter und dreifache Abnahmen der anti-L1-Antikörpertiter. Das dritte Tier zeigte eine achtfache Abnahme seiner anti-CCR5-Titer und eine zehnfache Abnahme seiner anti-L1-Antikörpertiter. Diese Ergebnisse liefern einen Hinweis, dass fortgesetztes Ausgesetztsein gegenüber natürlichem CCR5 nicht zu fortgesetzter B-Zell-Induktion führt, vermutlich weil das zelluläre Protein in einem Zusammenhang bleibt, der durch das Immunsystem ignoriert wird, und darüber hinaus, weil die anti-CCR5-Reaktion ausschließlich vom Ausgesetztsein gegenüber dem CCR5-Peptid auf L1-CCR5-Partikeln abhängt. Die immunisierten Mäuse behielten das selbe Gewicht wie Kontrollmäuse bei, und Autopsien, die sechs Monate nach der letzten Auffrischung bei zwei der Mäuse durchgeführt wurden, legten keine groben pathologischen Veränderungen offen.
  • In Menschen wird CCR5 vorwiegend auf T-Gedächtniszellen (CD3+, CD4+, CD26hi) exprimiert. Zusätzlich exprimieren 1 bis 10% der Makrophagen im Thymus, in der Milz und den Lymphknoten CCR5. (Zang, L. et al., J. Virol., 72:5035–5045 (1998)). FACS-Analyse von mononucleären Mauszellen von Milz, Thymus und peripherem Blut wiesen darauf hin, dass es keine Abnahme in der Milz oder dem peripheren Blutmakrophagen und T-Zell-Untergruppen, die CCR5 exprimieren, im Vergleich zu Kontrollmäusen gab. Daher erlitten die Mäuse, die mit L1-CCR5-Partikeln immunisiert wurden, gemäß unserer Analyse keine groben pathologischen Veränderungen während des Beobachtungszeitraums.
  • Mehr Hinweise, die die Vorteile der Verwendung von chimären VLPs für die B-Zell-Toleranzbrechung in Menschen und spezifisch für die Behandlung und Verhinderung einer HIV-Infektion unterstützten, wurden von Primaten-Untersuchungen erhalten, in denen Auto-Antikörper gegen ein Makaken-CCR5-Polypeptid produziert wurden. (Siehe Beispiel 7). In diesen Experimenten wurde ein rekombinantes Expressionskonstrukt hergestellt, das ein Makaken-L1-CCR5-Fusionsprotein codiert. Wir clonierten das korrespondierende Mensch/Makaken-CCR5-Peptid (sie sind die selben) in die identische Stelle im L1-Hauptkapsidprotein, wie es im Maus-Experiment verwendet wurde. Als Nächstes bewerteten wir die Kapsidpartikel-Selbstzusammenlagerung. Im Vergleich zu unseren früheren Experimenten mit Maus-L1-CCR5 war die Partikel-Bildung mit dem chimären Makaken-L1-CCR5 ineffizient. Nichtsdestotrotz waren wir in der Lage, ausreichend Partikel aufzureinigen, um Schweineschwanz-Makaken zu immunisieren. Vier der fünf Tiere, die dreimal mit dem Präparat in der Anwesenheit von Titer Max-Adjuvans geimpft wurden, produzierten eindeutig CCR5-spezifische Antikörper, was in einem ELISA-Test gemessen wurde (5). Wir glauben, dass ein besseres VLP-basierendes Immunogen zur Herstellung von Auto-Antikörpern gegen Mensch/Makaken-CCR5 durch das Finden einer anderen Stelle für die Insertion des CCR5-Peptids hergestellt werden kann, das sowohl das fremde Peptid auf der VLP-Oberfläche zeigen würde und kompatibler mit der Selbstzusammenlagerung sein würde. Zusätzlich glauben wir, wie unten beschrieben, dass konjugierte VLPs, die ein Mensch/Makaken-CCR5-Tolerogen aufweisen, eine bessere Immunreaktion induzieren werden.
  • Die Ergebnisse der ersten Gruppe von Experimenten zeigen, dass die Inkorporation eines Peptids vom EC-Teil des zentralen Antigens mCCR5 in die regelmäßige Anordnung eines Papillomavirus-Partikels, gefolgt von Immunisierung mit diesen Partikeln, Auto-Antikörper induzieren kann, die an den Rezeptor binden und den Liganden und die HIV-1-Bindung blockieren. Auto-Antikörper gegen mCCR5 sanken mit der Zeit in einer Rate ab, die ähnlich war zu dem Absinken von L1-spezifischen Antikörpern, was nahe legt, dass B-Zell-Stimulierung nicht durch endogenes Zelloberflächen-CCR5 induziert wurde.
  • Die anti-Selbstantikörper, die durch L1-CCR5-Partikel induziert wurden, banden wirksam mCCR5, das auf der Zelloberfläche exprimiert wurde, was darauf hinweist, dass sie als wahre Auto-Antikörper wirken. Im Gegensatz dazu scheiterten Antikörper, die durch KLH-gekoppeltes CCR5-Peptid induziert wurden, an natürliches mCCR5 zu binden. Es ist wahrscheinlich, dass bindende Auto-Antikörper nicht nur diese bestimmte Aminosäurensequenz erkennen, sondern die Tolerogensequenz in ihrer natürlichen Konformation. Darüber hinaus blockiert das IgG von L1-CCR5-immunisierten Mäusen die Bindung eines CCR5-Liganden und inhibiert eine HIV-1-Infektion durch ein chimäres CCR5-Protein, das das Maus-CCR5-Peptid enthält, was weiter die Spezifität dieser Auto-Antikörper und die therapeutische Nützlichkeit von Aspekten der Erfindung demonstriert. Die Inhibition, die in diesen Tests beobachtet wurde, war konsistent, wiederholbar, spezifisch und ähnlich einem monoclonalen Kontrollantikörper gegen die zweite EC-Schleife von menschlichem CCR5.
  • Die erste EC-Schleife von mCCR5 wurde für unsere anfänglichen Untersuchungen gewählt, weil sie uns ermöglichte, simultan unseren Ansatz für die B-Zell-Toleranzbrechung zu testen und ein neues Verfahren zum Induzieren des Körpers eines Individuums, eine HIV-1-Infektion zu inhibieren, zu liefern. Da HIV-1-infizierte Individuen, die heterozygot für ein inaktives CCR5-Allel sind, ein verzögertes Fortschreiten zu AIDS haben, kann sogar eine teilweise Reduktion der CCR5-Expression klinisch signifikante Wirkungen haben. (Liu, R. et al., Cell, 86:367–77 (1996); Samson, M. et al., Nature (London), 382:722–5 (1996); Winkler, C. et al., Science, 279:389–93 (1998)). Unsere Ergebnisse zeigen auch, dass Primaten die Fähigkeit haben, Antikörper zu produzieren, die spezifisch gegen CCR5 sind, vorausgesetzt, dass das Antigen in einem geeigneten Immunogen präsentiert wird.
  • Wir beobachteten keine schädlichen Wirkungen der Auto-Antikörper-Induktion in Mäusen, die für sechs Monate nach der anfänglichen Beimpfung verfolgt wurden. Obwohl wir nicht auf auto-reaktive T-Zellen testeten, würden wir nicht erwarten, die T-Zell-Toleranz gegenüber CCR5 zu brechen. Während der Entwicklung des Immunsystems wird streng gegen T-Zellen, die zentrale Auto-Antigene erkennen, selektiert. Vermutlich ist die T-Zell-Hilfe, die für Immunglobulin-Klassen-Umschaltung nötig ist, um anti-CCR5-IgG zu produzieren, gegen das gebundene virale Protein gerichtet. Umgekehrt gibt es in erwachsenen Tieren eine kontinuierliche Herstellung von Antikörpern mit neuen Spezifitäten als ein Ergebnis der RAG-Reaktivierung und des peripheren Editierens von B-Zell-Rezeptorgenen. (Han, S. et al., Science, 278:301–5 (1998); Papavasiliou, F. et al., Science, 278:298–301 (1998); Hertz, M. et al., Nature, 394:292–5 (1998)).
  • Ein konjugiertes VLP, das die Immuntoleranz bricht und die TNF-α-Aktivität inhibiert
  • Unser zweiter Ansatz, die B-Zell-Toleranz zu brechen, involviert die Verwendung von konjugierten VLPs, die durch die Zugabe von Tolerogenen zu der äußeren Oberfläche von vorgeformten VLPs konstruiert wurden. Sobald sie zusammengelagert sind, sind VLPs und kapsomere Strukturen ziemlich stabil, und die Zugabe von großen oder kleinen Tolerogenen kann leicht erreicht werden. Im Gegensatz zum chimären VLP-Ansatz, bei dem die Größe des Tolerogens gewöhnlich auf Grund der Störung der Selbstzusammenlagerung klein ist, ermöglicht der konjugierte VLP-Ansatz die Zusammenlagerung von größeren Tolerogenen zum VLP, was mehrere Antikörper-Epitope und daher einen diverseren Satz von Auto-Antikörpern liefern würde. Diese Strategie könnte auch auf Polypeptide mit verschiedenartigerer Sequenz und Größe anwendbar sein, als es die genetische Insertion der Sequenzen in das Hauptkapsidprotein würde.
  • In unseren ersten Experimenten unter Verwendung des konjugierten VLP-Ansatzes banden wir das Tolerogen TNF-α durch eine Biotin-Streptavidin-Interaktion an VLPs. Von L1-VLPs wurde gezeigt, dass sie unter Verwendung von Sulfo-NHS-Biotin (Pierce) schwer biotinyliert sind, was exponierte Lysinreste biotinyliert. Unter sättigenden Bedingungen banden die biotinylierten VLPs Streptavidin in einer Rate von ungefähr drei Streptavidin-Tetrameren pro einem L1-Molekül. Dieses Ergebnis lieferte einen Hinweis, dass ein Streptavidin/Tolerogen-Fusionsprotein dem Immunsystem als eine dichte, geordnete und eng verpackte Anordnung von Epitopen präsentiert werden könnte.
  • Dementsprechend erzeugten wir in E. coli ein Fusionsprotein, das den Streptavidin-Kern, gebunden an ein 20 Aminosäuren-langes Fragment von Maus-TNF-α, umfasst, bezeichnet als SA-TNF-α. Das Fusionsprotein wurde als unlösliche Einschlusskörper aufgereinigt, in Guanidin-HCl solubilisiert und durch Dialyse gegen einen physiologischen Puffer neu gefaltet. Das neu gefaltete Fusionsprotein wurde dann an biotinylierte L1-VLPs gebunden, wie oben beschrieben präpariert, um das SA-TNF-α/VLP-Immunogen zu bilden. Das SA-TNF-α-Fusionsprotein band mit hoher Besetzung an biotinylierte VLPs (6). Als Nächstes wurde das SA-TNF-α/VLP-Immunogen in Mäuse injiziert, um eine Auto-Antikörper-Reaktion hervorzurufen. Zwei Injektionen der konjugierten VLPs in Mäuse (3 × 5 g) induzierten hohe Titer von Antikörpern, die natürlichen Maus-TNF in einem ELISA banden (Siehe Tabelle 1). Im Gegensatz dazu scheiterte die Immunisierung mit entweder SA-TNF-α alleine oder VLP alleine, eine konsistente oder hohe Auto-Antikörper-Reaktion hervorzurufen. (Siehe Tabellen 2 und 3). Nach der dritten Injektion von SA-TNF-α/VLP erreichten die Titer von TNF-α-Antikörpern in allen Mäusen 105, TABELLE 1 Maus-Titer nach zwei Immunisierungen mit dem SA-TNF-α-Protein, gekoppelt an biotinylierte VLPs
    Figure 00230001
    TABELLE 2 Maus-Titer nach zwei Immunisierungen mit dem SA-TNF-α-Protein alleine
    Figure 00240001
    TABELLE 3 Maus-Titer nach zwei Immunisierungen mit VLPs alleine
    Figure 00240002
  • Diese Ergebnisse zeigten, dass das SA-TNF-α/VLP-Immunogen wirksam die B-Zell-Toleranz brach. Mehr Hinweise, dass das konjugierte VLP wirksam die B-Zell-Toleranz brach, wurden von TNF-α-Cytotoxizitäts-Tests erhalten. In diesen Experimenten wurde die Fähigkeit des SA-TNF-α/VLP-Immunogens, TNF-vermittelte Apoptose einer Indikator-Zelllinie (L929-Zellen) zu verhindern, bestimmt. Seren, die von Mäusen erhalten wurden, die entweder mit Streptavidin-gebundenen VLPs (Kontrollen) oder SA-TNF-α/VLPs beimpft wurden, wurden mit TNF-α inkubiert, und die mit Seren behandelten oder nicht mit Seren behandelten TNF-α-Proben wurden zu den Zellen in Kultur zugefügt. Die Fähigkeit der Seren, die TNF-α-Aktivität zu neutralisieren, wurde durch einen Anstieg im Protzentsatz der überlebenden Zellen gemessen. Seren von den SA-TNF-α/VLP-beimpften Mäusen (in einer 5%-Lösung) führten zu einem dreifachen Anstieg des Zell-Überlebens über die Hintergrundspiegel (7). Angesichts der viel versprechenden Ergebnisse mit den Maus-TNF-Fusionsproteinen machten wir ähnliche Streptavidin-Fusionsproteine für jede der vier extrazellulären Domänen von Makaken-CCR5. Alle vier Fusionsproteine sind von E. coli-Einschlusskörpern hergestellt und aufgereinigt worden. Wir haben drei der vier so neu falten können, dass sie biotinylierte VLPs stark binden.
  • Wie in der obigen Diskussion und den folgenden Beispielen gezeigt wird, kann eine Peptidsequenz, die einem Tolerogen entspricht, B-Zell-Toleranz gegenüber dem natürlichen Protein aufheben, wenn sie im Zusammenhang einer hoch-organisierten Anordnung von zusammengelagerten chimären oder konjugierten viralen Kapsomeren präsentiert wird. Die Fähigkeit, die B-Zell-Toleranz unter Verwendung der hierin beschriebenen Vorgehensweisen aufzuheben, hat zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten. Zum Beispiel kann diese Technik verwendet werden, um monoclonale Maus-anti-Selbstantikörper herzustellen. Zusätzlich ist dieser Ansatz wirksam als ein Mittel zum Modulieren der Aktivität eines löslichen Proteins, um seine Funktion in normalen oder Krankheits-Vorgängen in Versuchstiermodellen zu untersuchen. Darüber hinaus liefert die Induktion von Auto-Antikörpern eine wirksame Alternative zur monoclonalen Antikörper-Therapie für menschliche Krankheiten wie die Behandlung von Brustkrebs und rheumatoider Arthritis mit Antikörpern, die gegen ErbB-2 beziehungsweise TNF gerichtet sind (Maini et al., Immunol. Rev., 144:195 (1995); Baselga et al., J. Clin. Oncol., 14:737 (1996)). Die untenstehende Diskussion beschreibt mehrere Aspekte, die die Ausführungsformen der Erfindung betreffen.
  • Unterlagen und kapsomere Strukturen
  • Während virusähnliche Partikel oder kapsomere Strukturen ein bevorzugtes System für die Abgabe von Selbstpeptiden an das Immunsystem repräsentieren, um die Produktion von Auto-Antikörpern zu stimulieren, wollen wir auch, dass die Erfindung andere strukturierte Zusammenlagerungen behandelt, die ein Tolerogen in einer geordneten, sich wiederholenden Anordnung mit engem Abstand präsentieren können. Diese Unterlagen haben einen geordneten Aufbau aus Untereinheiten und ermöglichen, dass zumindest ein B-Zell-Epitop eines Tolerogens in einer regelmäßigen, sich wiederholenden Anordnung an die Unterlage gebunden wird. Vorzugsweise sind die Unterlagen und kapsomeren Strukturen in der Lage, ein Antigen mit einem Abstand von etwa 10–500 Ångström, vorteilhaft etwa 50–300 Ångström und vorzugsweise etwa 100 Ångström zu präsentieren. Modifizierte T-unabhängige Typ-2-Antigene (TI-2) können sich in dieser Hinsicht wie VLPs verhalten. Diese schließen ein Pneumokokken-Polysaccharid, ein polymerisiertes Salmonella-Flagellin, Dextran und Hapten-konjugiertes Ficol (Polysaccharose) ein.
  • Obwohl virusähnliche Partikel von Papillomavirus in der hierin präsentierten beispielhaften Demonstration angewendet worden sind, werden virusähnliche Partikel von anderen Papillomaviren und nicht-Papillomaviren auch für die Verwendung zur Stimulation der Produktion von Auto-Antikörpern in Betracht gezogen. Infektiöses Virus wird auch vorgesehen. Abgeschwächte oder von Natur aus nicht-pathogene Viren können auf ähnliche Weise modifiziert und verwendet werden, um Auto-Antikörper herzustellen. Beispiele von chimären VLPs, die für die Verwendung im Zusammenhang mit der Erfindung besonders in Betracht gezogen werden, sind jene, die in Intervirology, 39:1 (1996) beschrieben werden und hierin durch Bezugnahme inkorporiert sind. Unter den chimären VLPs, die für die Verwendung zur Stimulierung der Produktion von Auto-Antikörpern in Betracht gezogen werden, sind: BPV-1, HPV-1, HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-33, HPV-45, CRPV und COPV. Auch in Betracht gezogen werden: B19-Parvovirus, Hepatitis-B-Virus-Kernpartikel, Hepatitis-B-Virus-Oberfächenantigenpartikel, HIV-gag-Partikel, Tabak-Mosaikvirus, Langbohnen-Mosaikvirus, Hefe-Ty-Partikel und RNA-Phage. Virusähnliche Partikel sind erzeugt worden, und chimäre VLPs können für SV40, Polyomavirus, Adenovirus, Herpes simplex, Rotavirus und Norwalk-Virus hergestellt werden. Bemerkenswerterweise haben Fachleute schon die vollständige Nucleotidsequenz des gesamten Genoms von vielen Papillomaviren bestimmt, einschließlich: BPV-1, BPV-2, BPV-4, CRPV, DPV, EPV, HPV-1, HPV-5, HPV-6, HPV-8, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 und RhPV. Bevorzugte Kapsidproteine, die verwendet werden, um die kapsomeren Strukturen von Ausführungsformen der Erfindung zu konstruieren, schließen jedoch Proteine von ikosaedrischen Viren oder Viren, die einen natürlichen Säuger-Reservoirwirt haben, ein. So sind Polynucleotidsequenzen, die viele unterschiedliche Haupt- und Neben-Hüllenproteine codieren, die im Zusammenhang mit den hierin beschriebenen Verfahren verwendet werden können, schon bekannt.
  • Es ist selbstverständlich, dass VLPs, die Haupt- und/oder Neben-Hüllenproteine einschließen, verwendet werden können, um immunogene Zusammensetzungen gemäß den hierin offenbarten Verfahren herzustellen. In dem bestimmten Fall des Papillomavirus-L2-Neben-Hüllenproteins ist es selbstverständlich, dass L2-Chimäre das inserierte Antigen auf der Oberfläche aufweisen können. Die Ziel-Antigene liegen außen. Bei einer L2/E7-Fusion, die wir verwendet haben, um Papilloma-E7-Antikörper herzustellen, sind die ersten 110 Aminosäuren von BPV-L2 an die gesamte HPV16-E7-Polypeptidsequenz fusioniert, wenn sie in VLPs inkorporiert ist. (Lowy et al., US-Patent Nr. 5,618,536, das hierin durch Bezugnahme inkorporiert ist.) In diesem Fall wurde die E7-Sequenz an eine Stelle von L2 fusioniert, von der vorher gezeigt worden war, dass sie einem virusneutralisierenden Epitop entspricht (Roden, et al., J. Virol., 68:7570 (1994)). In der untenstehenden Offenbarung werden einige Ansätze geliefert, um Tolerogene an die geordneten Zusammenlagerungen der Erfindung zu binden.
  • Ansätze, um Unterlagen oder kapsomere Strukturen herzustellen, die Tolerogene präsentieren
  • Wie oben diskutiert wurde, können im Allgemeinen zwei unterschiedliche Ansätze angewendet werden, um Tolerogene in die Strukturen von virusähnlichen Partikeln zu inkorporieren. Durch einen Ansatz wird zuerst ein genetisches Konstrukt gebildet, das eine Aminosäuresequenz codiert, die sowohl die Virus-Hüllenprotein-Sequenzen als auch die Selbstpeptid-Sequenz von Interesse einschließt. Das resultierende Konstrukt codiert ein einzelnes chimäres Polypeptid, das das Selbstpeptid auf einer äußeren Oberfläche eines Partikels nach der Selbstzusammenlagerung des Hybrid-Hüllenproteins zeigt, um kapsomere Strukturen oder VLPs zu bilden. Gemäß dem zweiten Ansatz ist das Selbstpeptid, das auf der äußeren Oberfläche des VLPs dargelegt wird, direkt oder indirekt an eine Vielzahl von Untereinheits-Proteinen gebunden, die ein vorgeformtes VLP umfassen. Zum Beispiel kann das Wildtyp-Papillomavirus-L1-Protein ein rekombinantes Hüllenprotein sein, das an ein erstes Bindungsagens gekoppelt ist, das eine Assoziationskonstante für ein zweites Bindungsagens im Bereich von 107–1010, von 104–108, von 1010–102 oder von 102–106 aufweist. Das zweite Bindungsagens kann für die Kopplung an das Selbstpeptid angepasst werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden zuerst biotinylierte Wildtyp-VLPs produziert. Dies kann durch Biotinylierung von vorgeformten VLPs erreicht werden. Als Nächstes werden die biotinylierten VLPs mit einem Avidin- oder Streptavidin-gebundenen Selbstpolypeptid kombiniert, um Komplexe zu bilden, die Oberflächen aufweisen, auf denen das Selbstpeptid präsentiert wird. Auf diese Weise werden multiple Kopien des Selbstpeptids indirekt an das VLP gekoppelt, so dass das Selbstpeptid nicht in das Peptid-Rückgrat des Hüllenproteins integriert wird. So sollen Zusammensetzungen, die ein Hybridhüllenprotein einschließen, das an ein Selbstpeptid entweder als ein integraler Teil der Hybrid-Hüllenprotein-Polypeptidsequenz oder indirekt wie durch eine Biotinverbindung gebunden ist, in den Bereich der Erfindung fallen.
  • Ausführungsformen der Erfindung liefern wünschenswerterweise Tolerogene in solch einer Form oder auf solche Weise, dass eine ausreichende Affinität, Aufhebung der B-Zell-Toleranz oder Inhibition eines Krankheitsstatus (z.B. eine virale Infektion, Neoplasie oder Entzündung) erzielt wird. Während ein natürliches monomerisches Tolerogen (das heißt, ein Tolerogen, dass ein diskretes Molekül präsentiert und so nur eine kleine Anzahl von Epitopen trägt) ausreichend sein kann, um eine erwünschte Reaktion zu erreichen, kann ein synthetisches Tolerogen oder ein multimeres Immunogen (z.B. ein VLP, das multiple Moleküle des Tolerogens präsentiert und so eine größere Anzahl der selben Epitope aufweist) oftmals eine stärkere Immunreaktion hervorrufen. Es sollte bemerkt werden, dass der Ausdruck „multimer" die Anwesenheit von mehr als einem identischen Molekül auf einer Unterlage oder einer kapsomeren Struktur bezeichnet. Zum Beispiel einige identische Moleküle von CCR5 oder Fragmente davon, die auf einem VLP präsentiert sind. Der Ausdruck multimer sollte vom Ausdruck „multimerisiert" unterschieden werden, der eine Unterlage oder eine kapsomere Struktur bezeichnet, die an Hybridmoleküle gebunden sind, wobei jedes Hybridmolekül multiple Kopien des Tolerogens oder von individuellen Epitopen davon, die in Tandemformation gebunden sind, umfasst. Zum Beispiel kann jedes individuelle multimerisierte Tolerogen ein 20 Aminosäuren langes Fragment von CCR5 umfassen, das zufällig mit oder ohne zwischengelagerte Linkern (z.B. λ-Phagen-Linker) wiederholt wird, und eine Vielzahl von multimeren Tolerogenen kann an eine Unterlage oder eine kapsomere Struktur gebunden sein, um ein multimerisiertes/multimeres Immunogen zu bilden.
  • Ein multimeres Immunogen (synthetisch oder natürlich), das wirksam die B-Zell-Toleranz bricht, kann durch Binden von Tolerogenen an eine Unterlage oder eine kapsomere Struktur erhalten werden. Unterlagen, die für diesen Zweck geeignet sind, schließen Polyacrylamid-Kugeln, Agarose-Kugeln, Polystyrol-Kugeln, magnetische Kugeln, Latex-Partikel, Kohlenhydrat-Zusammenlagerungen (z.B.
  • Oligosaccharid-basierende Kugeln oder Zusammenlagerungen), Lipid-Zusammenlagerungen (z.B. Lipidmembranen), Protein-Zusammenlagerungen oder Polymere (z.B. Poly-L-Lysin oder Poly-D, L-Alanin) und andere Unterlagen, von denen auf dem Fachgebiet bekannt ist, dass sie eine geordnete, symmetrische Zusammenlagerung von Untereinheiten aufweisen, ein, sind aber nicht darauf limitiert. Anorganische Träger wie Siliconoxid-Material (z.B. Silica-Gel, Zeolith, Kieselgur oder aminiertes Glas), an die das Tolerogen kovalent durch eine Hydroxyl-, Carboxyl- oder Amino-Gruppe gebunden ist, und eine reaktive Gruppe am Träger können auch mit einigen Ausführungsformen verwendet werden.
  • In einigen Ausführungsformen ist das Tolerogen an die Unterlage oder die kapsomere Struktur durch einen Linker gebunden, der zwischen zwei chemisch reaktiven Spezies, einer Ligand/Rezeptor-Interaktion oder einem Peptid gebunden werden kann, das an das Tolerogen gebunden worden ist, um das Anlagern an die Unterlage oder die kapsomere Struktur zu ermöglichen oder um größere Freiheit der Assoziierung des Tolerogens mit einer Zelle des Immunsystems zu liefern. In manchen Ausführungsformen hat die Unterlage oder die kapsomere Struktur zum Beispiel eine hydrophobe Oberfläche, die mit einem Teil des Tolerogens durch eine hydrophobe nicht-kovalente Interaktion interagiert. In manchen Fällen ist die hydrophobe Oberfläche der Unterlage ein Polymer wie Plastik oder jegliches andere Polymer, in dem hydrophobe Gruppen wie Polystyrol, Polyethylen oder Polyvinyl verbunden worden sind.
  • Zusätzlich kann das Tolerogen an eine Unterlage oder eine kapsomere Struktur einschließlich Proteinen und Oligo/Polysacchariden (z.B. Cellulose, Stärke, Glycogen, Chitosan oder aminierte Sepharose) kovalent gebunden sein. In diesen letzteren Ausführungsformen wird eine reaktive Gruppe auf einem Tolerogen wie eine Hydroxyl- oder eine Amino-Gruppe verwendet, um eine reaktive Gruppe auf der Unterlage oder der kapsomeren Struktur zu binden, um die kovalente Bindung zu bilden. Die Ausführungsformen können auch eine Unterlage mit einer geladenen Oberfläche umfassen, die mit dem Tolerogen interagiert. Zusätzliche Ausführungsformen umfassen eine Unterlage, die andere reaktive Gruppen aufweist, die chemisch aktiviert sind, um ein Tolerogen anzulagern. Zum Beispiel werden Cyanogenbromid-aktivierte Matrices, Epoxid-aktivierte Matrices, Thiol- und Thiolpropyl-Gele, Nitrophenyl-Chlorformiat- und N-Hydroxysuccinimid-Chlorformiat-Bindungen oder Oxiranacryl-Unterlagen verwendet. (Sigma).
  • In anderen Ausführungsformen wird die Interaktion von Biotin mit avidinähnlichen Molekülen (z.B. Streptavidin und Neutraavidin) ausgenutzt. VLPs können, wie vorher dargelegt, biotinyliert sein und können leicht an Tolerogen/Streptavidin-Fusionsproteine gebunden werden. Durch das Inserieren von mehreren Lysin- oder Cystein-Molekülen in Kapsidproteine kann eine größere Biotinylierung erzielt werden, und so kann mehr Tolerogen auf die Oberfläche eines VLPs zugefügt werden. Darüber hinaus können durch die Verwendung von ortsspezifischen Mutagenese-Techniken Lysin- oder Cystein-Moleküle strategisch inseriert werden, um ein VLP zu etablieren, das eine dichte und hochgradig organisierte, sich wiederholende Anordnung von Tolerogenen aufweist. Wie ein Fachmann sofort anerkennt, kann die Umkehrung auch durchgeführt werden, das heißt, die Verwendung von Streptavidin/Kapsidprotein-Fusionen und biotinylierten Tolerogenen. In einer anderen Ausführungsform werden λ-Linker von geeigneter Länge zwischen das Tolerogen und die Unterlage oder die kapsomere Struktur inseriert, um größere Flexibilität anzuregen und jegliche sterische Behinderung, die vorhanden sein kann, zu überwinden. Die Bestimmung einer geeigneten Länge des Linkers, die eine optimale Immunreaktion ermöglicht, kann durch Durchmusterung des Tolerogens mit verschiedenen Linkern in den verschiedenen hierin beschriebenen Tests gemacht werden.
  • Eine zusammengesetzte Unterlage, die mehr als einen Typ eines Tolerogens aufweist, ist auch eine Ausführungsform. Eine „zusammengesetzte Unterlage" kann eine makromolekulare Struktur sein, die verwendet wird, um zwei oder mehrere unterschiedliche Tolerogene zu verbinden oder zu immobilisieren. Die zusammengesetzten Unterlagen werden auch durch Anwenden von hydrophoben Interaktionen und kovalenten Bindungen, die durch reaktive Gruppen gebildet wurden, wie oben detailliert ausgeführt, konstruiert. Darüber hinaus werden in manchen Ausführungsformen die Linker wie λ-Linker von geeigneter Länge zwischen den Tolerogenen und der Unterlage inseriert, um eine größere Flexibilität in den Molekülen anzuregen und sterische Behinderung zu überwinden. Die Bestimmung einer geeigneten Länge des Linkers, der eine optimale Immunreaktion ermöglicht, kann durch Durchmusterung der Tolerogene mit verschiedenen Linkern in den Tests, die in der vorliegenden Offenbarung detailliert ausgeführt werden, gemacht werden.
  • In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung haben die multimeren und zusammengesetzten Unterlagen, die oben diskutiert wurden, multimerisierte Tolerogene angelagert, um eine „multimerisierte-multimere Unterlage" beziehungsweise eine „multimerisierte-zusammengesetzte Unterlage" zu bilden. Eine Ausführungsform eines multimerisierten Tolerogens wird zum Beispiel durch Bilden eines Expressionskonstrukts erhalten, das zwei oder mehrere Nucleotidsequenzen aufweist, die ein Tolerogen codieren und durch Verwendung von konventionellen Techniken in der Molekularbiologie miteinander verbunden sind. Das exprimierte Fusionsprotein ist eine Ausführungsform eines multimerisierten Agens und wird dann an eine Unterlage gebunden. Eine Unterlage, die viele solche multimerisierten Agenzien aufweist, wird als eine multimerisierte-multimere Unterlage bezeichnet. Die multimerisierte Form eines Tolerogens kann auf Grund der Fähigkeit, ein Agens mit einer besseren Fähigkeit zu erhalten, eine Immunantwort zu induzieren und so die B-Zell-Toleranz zu brechen, für viele Anwendungen vorteilhaft sein. Die Inkorporation von Linkern oder Spacern, wie die flexiblen λ-Linker zwischen den Proteindomänen, die das multimerisierte Agens ausmachen, kann auch für manche Ausführungsformen günstig sein. Die Insertion von λ-Linkern mit einer geeigneten Länge zwischen den Proteinbindungsdomänen regt zum Beispiel eine größere Flexibilität des Moleküls an und überwindet sterische Behinderung zwischen den Domänen. In ähnlicher Weise regt die Insertion von Linkern zwischen den multimerisierten Tolerogenen und der Unterlage eine größere Flexibilität an und reduziert sterische Behinderung, die durch die Unterlage oder die kapsomere Struktur präsentiert wird. Die Bestimmung einer geeigneten Länge des Linkers, der eine optimale Immunreaktion ermöglicht, kann durch Screenen der Tolerogene mit verschiedenen Linkern in den Tests, die in dieser Offenbarung detailliert dargelegt werden, erreicht werden. In einer ähnlichen Weise können zusammengesetzt-multimerisierte-multimere Unterlagen mit und ohne Linker durch Binden von mehr als einem unterschiedlichen multimerisierten Tolerogen an eine Unterlage konstruiert werden.
  • Besonders bevorzugte Stellen auf virusähnlichen Partikeln für die Insertion von Selbstantigenen, gegen die eine Autoimmunreaktion gewünscht wird, sind virusneutralisierende Epitope. Dies ist so, weil virusneutralisierende Epitope typischerweise auf der Oberfläche des Virus angelegt sind und für eine Antikörperbindung verfügbar sind. Diese Eigenschaften sind für das Präsentieren der Selbstantigene gegenüber dem Immunsystem im strukturellen Zusammenhang eines chimären virusähnlichen Partikels wünschenswert. Verfahren zum Identifizieren von Papillomavirus-neutralisierenden Epitopen sind von Ludmerer et al. in J. Virol., 70:4791 (1997); Ludmerer et al. in J. Virol., 71:3834 (1997) und von Roden et al. in J. Virol., 71:6247 (1997) beschrieben worden. Im Allgemeinen können Verfahren zum Identifizieren von virusneutralisierenden Epitopen einen monoclonalen Antikörper, der vorzugsweise an eines von zwei eng verwandten L1-Proteinen bindet, und dann systematisches Herstellen von Rekombinanten, die die spezifischen Aminosäure-Unterschiede zwischen ihnen neu sortieren, anwenden. Alternativ können die Polypeptidsequenzen, die die L1-Proteine von verwandten Viren, zum Beispiel Papillomaviren, codieren, aneinander ausgerichtet werden, um Segmente zu identifizieren, die am unterschiedlichsten in der Länge sind. Diese hoch variablen Positionen werden wahrscheinlich externe oder interne Schleifen des Kapsidproteins sein. Die externen Schleifen werden Kandidaten für Substitutionen durch Polypeptidsequenzen von Selbstantigenen sein, für die eine Autoimmunreaktion gesucht wird. So sind virusneutralisierende Epitope, die unter Verwendung von Routine-Laborverfahren leicht identifiziert werden können, bevorzugte Stellen für die Anordnung von Selbstpeptiden in den VLPs oder den kapsomeren Strukturen der Erfindung. Zum Beispiel würde die Stelle eines virusneutralisierenden Epitops auf BPV-1 eine bevorzugte Stelle für die Anordnung eines Selbstpeptids auf einem entsprechenden VLP sein. Im unten stehenden Abschnitt wird eine Diskussion der Größe der Tolerogene geliefert, die mit Aspekten der Erfindung verwendet werden können.
  • Die Größe eines Tolerogens auf der Unterlage oder der kapsomeren Struktur
  • Im Allgemeinen muss die Zahl der Aminosäuren, die das Antigen repräsentieren, das in die Struktur des viralen Hüllenproteins inkorporiert oder an die Unterlage oder die kapsomere Struktur gebunden wird, groß genug sein, um einem Epitop zu entsprechen, das charakteristisch für das Antigen ist und das in die Antigen-Bindungsstelle eines Antikörpers passen kann. Da im Allgemeinen akzeptiert wird, dass eine lineare Anordnung von 5 bis 6 Aminosäuren ausreichend ist, um an eine Antigen-Bindungsstelle zu binden, wird es bevorzugt, dass mindestens 5 Aminosäuren des Selbstantigens in die Struktur des Immunogens inkorporiert sind. Es ist jedoch selbstverständlich, dass eine größere Anzahl von Aminosäuren auch mit guten Ergebnissen verwendet werden kann. Im hierin dargelegten Beispiel wurden 16 Aminosäuren des Maus-CCR5-Proteins in die Struktur eines L1-Haupt-Hüllenproteins mit guten Ergebnissen eingebracht. Längere Polypeptidsequenzen, die Tolerogene repräsentieren, werden auch für die Integration in die Struktur der viralen Hülle für die Verwendung als Immunogene für die Induktion von anti-Selbst-Immunreaktionen in Betracht gezogen. Daher wird es bevorzugt, dass das Immunogene virusähnliche Partikel Selbst-Polypeptidsequenzen mit mindestens 5 Aminosäuren Länge inkorporiert, aber die Länge des Tolerogens kann größer als 200 Aminosäuren sein und kann ein Volllängen-Protein einschließen. Ein wünschenswerter Bereich ist von 5 bis 200 Aminosäuren.
  • Es wird in Erwägung gezogen, dass biotinylierte VLPs in der Lage sein werden, mit Peptiden, die wesentlich länger als 16 Aminosäuren lang sind, einen Komplex zu bilden und sie dem Immunsystem zu präsentieren. Es ist auch möglich, eine Polypeptidsequenz, die ein Volllängen-Protein repräsentiert, in die Struktur eines Hybrid-Nebenhüllenproteins zu inkorporieren. Unten beschreiben wir die breite Vielfalt von Tolerogenen, die als eine Ausführungsform der Erfindung präsentiert werden können.
  • Viele Typen von Tolerogenen können auf einer Unterlage oder einer kapsomeren Struktur präsentiert werden
  • Die Erfindung kann unter Verwendung einer breiten Vielfalt von Tolerogenen ausgeführt werden. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Tolerogene Selbstantigene. Bevorzugte Selbstantigene schließen jene ein, für die von Antikörpern, die gegen das Selbstantigen gerichtet sind, gezeigt worden ist, dass sie ein wirksames therapeutisches Mittel sind. Im Allgemeinen wird das Selbstantigen einem Selbstantigen des Organismus entsprechen, der mit der Zusammensetzung, die das Selbstantigen, gebunden an das VLP, einschließt, immunisiert wird. Daher kann die Sequenz eines menschlichen Selbstpeptids wie des menschlichen CCR5-Chemokin-Rezeptors, in die Struktur eines VLP zur Verwendung für die Immunisierung von Menschen eingebracht werden. Auf diese Art können Menschen veranlasst werden, Auto-Antikörper zu produzieren. Bestimmte Beispiele von Selbstantigenen, die verwendet werden können, sind zentrale Selbstantigene wie TNF und CTLA-4.
  • TNF ist mit einer Reihe von menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht worden, vor allem als der grundsätzliche lösliche Effektor bei rheumatoider Arthritis (RA). (Maini et al., Imm. Reviews, 144:195 (1995)). Rheumatoide Arthritis ist eine chronische und schmerzhafte Erkrankung von multiplen Gelenken, von der angenommen wird, dass sie rund 1 % der Bevölkerung weltweit betrifft. Die Symptome der RA werden erfolglos mit Arzneistoff-Therapie behandelt. Dies hat das Verlangen geweckt, alternative therapeutische Strategien zu entwickeln, die mehr die Effektoren der Erkrankung als die Symptome anzielen. Monoclonale anti-TNF-Antikörpertherapie hat eine dramatische Verbesserung der RA in klinischen Versuchen an Menschen sowohl nach objektiven als auch subjektiven Maßstäben produziert (Feldman et al., Annu. Rev. Immunol., 14:397 (1996)). Unglücklicherweise ist bewiesen worden, dass die Vorteile transient sind, und dieser Verlust der Wirksamkeit hat mit der Entwicklung von Antikörpern gegen die monoclonalen Antikörper korreliert. Gekoppelt mit der Tatsache, dass TNF ein kleines lösliches Protein ist, das in relative niedrigen Serumkonzentrationen biologisch aktiv ist, machen diese Beobachtungen TNF zu einem attraktiven Ziel für einen Auto-Antikörper-induzierenden Impfstoff. Darüber hinaus gibt es ein gutes Mausmodell für TNF-vermittelte RA, in dem das Konzept getestet werden soll (Thorbecke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:7375 (1992)).
  • CTLA-4 ist ein membrangebundener Rezeptor von T-Zellen, der ein wichtiger Regulator von B7-vermittelter Co-Stimulierung von T-Zellen zu sein scheint (Thompson et al., Immunity, 7:445 (1997)). Co-Stimulierung ist kritisch für die Erzeugung von wirksamen CD8+-T-Zell-vermittelten cytotoxischen T-Lymphocyten (CTL)-Reaktionen. Ob CTLA-4 normalerweise wirkt, um positive oder negative Signale nach B7-Beteiligung zu vermitteln, ist derzeit ungelöst (Zheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:6284 (1998)). Antikörper gegen CTLA-4 potenzieren jedoch deutlich die Bildung von CTLs als Reaktion auf Tumor-Antigene in Maus-Tumormodellen. So könnte ein Impfstoff für die Induzierung von Auto-Antikörpern gegen CTLA-4 verwendet werden, um die Immunreaktion auf Tumoren entweder allein oder in Kombination mit Tumor-Antigen-spezifischen Impfstoffen zu steigern (Leach et al., Science, 271:1734 (1996)). Besonders können transiente Autoimmun-Erkrankungssymptome akzeptierbare Nebenwirkungen bei Patienten sein, die weit verstreute oder nicht-operierbare Krebsarten aufweisen, die nicht auf konventionelle Therapien reagieren.
  • Andere in Betracht gezogene Tolerogene schließen virale Antigene von Viren ein, die Menschen chronisch infizieren, einschließlich, aber nicht limitiert auf, Hepatitis C-Virus (HCV), Hepatitis B-Virus (HBV) und HIV, Chemokine und Moleküle, die mit Neoplasie und Angiogenese assoziiert sind. Unter Verwendung der hierin beschriebenen Lehren kann eine Fachperson eine Vielzahl von unterschiedlichen Tolerogenen, einschließlich Nucleinsäuren, Peptiden, Lipiden und Kohlenhydraten, auf biotinylierten VLPs präsentieren. Zum Beispiel kann ein Sandwich-Ansatz angewendet werden; in dem eine biotinylierte Nucleinsäure zuerst an Streptavidin gebunden wird und dann der Nucleinsäure/Streptavidin-Komplex an ein biotinyliertes VLP gebunden wird. Auf ähnliche Weise können Lipide unter Verwendung von konventioneller Chemie an Biotin gebunden, an Streptavidin gebunden und an biotinylierte VLPs gebunden werden.
  • Die Fähigkeit, die B-Zell-Toleranz gegenüber kleinen organischen Verbindungen zu brechen, wurde etabliert, während Experimente an biotinylierten VLPs durchgeführt wurden. Biotin ist ein Vitamin und ein Selbst-Tolerogen in Mäusen. Wir stellten biotinylierte VLPs, wie vorher beschrieben, her und injizierten diese Immunogene wie vorher in Mäuse. Die Anwesenheit von anti-Biotin-Antikörpern wurde durch einen ELISA-Test nachgewiesen, in dem biotinyliertes BSA als das Ziel-Antigen verwendet wurde. Als eine Negativkontrolle wurde die Reaktivität der Seren auf unbiotinyliertes BSA bestimmt. Die anti-Biotin-Antikörper in den Seren von drei Mäusen war bei Titern von 100, 100 und 10, und keine Reaktivität auf das unbiotinylierte BSA wurde nachgewiesen.
  • Die oben beschriebenen Zusammensetzungen können als biotechnologische Werkzeuge verwendet werden, zum Beispiel Binden an eine isolierte Zelle des Immunsystems, das ein Modellsystem für die Studie von B-Zell-Toleranz liefern kann, werden aber vorzugsweise in Therapeutika und prophylaktische Pharmazeutika für die Behandlung und Verhinderung einer menschlichen Erkrankung inkorporiert. Die untenstehende Offenbarung diskutiert einige der therapeutischen und prophylaktischen Ausführungsformen der Erfindung.
  • Therapeutische und prophylaktische Anwendungen
  • Die Zusammensetzungen der Erfindung sind geeignet für die Verwendung in der Behandlung von Individuen entweder als eine präventive Maßnahme, um Erkrankungen wie Krebs, virale Infektion oder entzündliche Gegebenheiten zu vermeiden, oder als ein Therapeutikum, um Individuen zu behandeln, die schon mit diesen Krankheiten geplagt werden. Obwohl jeder mit den Agenzien der Erfindung als ein Prophylaktikum behandelt werden könnte, sind die am meisten geeigneten Individuen Personen, die für Erkrankungen mit Mediatoren, die einer Ak-Bindung zugänglich sind, gefährdet sind.
  • Die pharmakologisch aktiven Verbindungen dieser Erfindung können in Übereinstimmung mit konventionellen Verfahren der galenischen Pharmazie verarbeitet werden, um Medikamente für die Verabreichung an Patienten, z.B. Säuger einschließlich Menschen, zu produzieren. Sie können in ein pharmazeutisches Produkt mit und ohne Modifikation inkorporiert werden. Darüber hinaus sind die Herstellung von Pharmazeutika oder therapeutischen Agenzien, die die Immunogene der Erfindung auf mehreren Wegen abgeben, Aspekte der Erfindung.
  • Die Verbindungen dieser Erfindung können in einer Beimischung mit konventionellen Excipienten, d.h. pharmazeutisch verträglichen organischen oder anorganischen Trägersubstanzen, die für parenterale, enterale (z.B. orale) oder örtliche Verabreichung geeignet sind und die nicht schädlich mit den Zusammensetzungen der Erfindung reagieren, angewendet werden. Geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger schließen Wasser, Salzlösungen, Alkohole, Gummi arabicum, Pflanzenöle, Benzyl-Alkohole, Polyethylenglycole, Gelatine, Kohlenhydrate wie Lactose, Amylose oder Stärke, Magnesiumstearat, Talk, Kieselsäure, visköses Paraffin, Perfumöl, Fettsäure-Monoglyceride und -Diglyceride, Pentaerythrit-Fettsäureester, Hydroxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, usw. ein, sind aber nicht darauf limitiert. Die pharmazeutischen Präparate können sterilisiert sein und, wenn gewünscht, mit Hilfsmitteln, z.B. Gleitmitteln, Konservierungsmitteln, Stabilisierern, Netzmitteln, Emulgatoren, Salzen für die Beeinflussung des osmotischen Drucks, Puffern, Farbstoffen, Geschmacksstoffen und/oder aromatischen Substanzen und dergleichen, die nicht schädlich mit den aktiven Verbindungen reagieren, gemischt werden.
  • Die wirksame Dosis und das Verfahren der Verabreichung eines bestimmten Präparats kann basierend auf dem individuellen Patienten und dem Stadium der Krankheit so wie anderen Faktoren, die Fachpersonen bekannt sind, variieren. Die therapeutische Wirksamkeit und Toxizität solcher Verbindungen kann durch pharmazeutische Standardvorgehensweisen in Zellkulturen oder Versuchstieren, z.B. ED50 (die Dosis, die bei 50% der Population therapeutisch wirksam ist) und LD50 (die Dosis, die bei 50% der Population letal ist) bestimmt werden. Das Dosis-Verhältnis von toxischen gegenüber therapeutischen Wirkungen ist der therapeutische Index, und er kann als das Verhältnis ED50/LD50 ausgedrückt werden. Arzneimittel, die große therapeutische Indizes zeigen, werden bevorzugt. Die Daten, die von Zellkultur-Tests und Tier-Studien erhalten werden, werden in der Präparation eines Bereichs von Dosierungen für die Verwendung in Menschen verwendet. Die Dosis von solchen Verbindungen liegt vorzugsweise im Bereich von zirkulierenden Konzentrationen, die die ED50 mit geringer oder keiner Toxizität einschließen. Die Dosis variiert in diesem Bereich in Abhängigkeit von der angewendeten Dosierungsform, der Empfindlichkeit des Patienten und dem Weg der Verabreichung.
  • Die genaue Dosis wird durch den individuellen Arzt angesichts des zu behandelnden Patienten ausgewählt. Dosierung und Verabreichung werden angepasst, um ausreichende Spiegel der aktiven Einheit zu liefern oder um die gewünschte Wirkung beizubehalten. Zusätzliche Faktoren, die in Betracht gezogen werden können, schließen die Schwere der Krankheit, das Alter und Gewicht des Patienten, die Nahrung, die Zeit und Frequenz der Verabreichung, Arzneistoffkombination(en), Reaktionsempfindlichkeiten und die Toleranz/Reaktion auf die Therapie ein.
  • Wege der Verabreichung schließen transdermal, parenteral, gastrointestinal, transbronchial und transalveolär ein, sind aber nicht darauf limitiert. Parenterale Wege der Verabreichung schließen elektrische oder direkte Injektion wie direkte Injektion in eine zentralvenöse Bahn, intravenöse, intramusculäre, intraperitoneale oder subcutane Injektion ein, sind aber nicht darauf limitiert. Gastrointestinale Wege der Verabreichung schließen Nahrungsaufnahme und rectal ein, sind aber nicht darauf limitiert. Transbronchiale und transalveolare Wege der Verabreichung schließen die Inhalation entweder durch den Mund oder intranasal ein, sind aber nicht darauf limitiert.
  • Zusammensetzungen, die für die transdermale Verabreichung geeignet sind, schließen pharmazeutisch verträgliche Suspensionen, Öle, Cremen und Salben ein, die direkt auf die Haut aufgetragen oder in einen schützenden Träger wie einen transdermale Vorrichtung („transdermales Pflaster") inkorporiert werden, sind aber nicht darauf limitiert. Beispiele von geeigneten Cremen, Salben usw. können zum Beispiel in der Physician's Desk Reference gefunden werden. Beispiele von geeigneten transdermalen Vorrichtungen werden zum Beispiel im US-Patent Nr. 4,818,540 erteilt am 4. April 1989 an Chinen, et al., das hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist, beschrieben.
  • Zusammensetzungen, die für die parenterale Verabreichung geeignet sind, schließen pharmazeutisch verträgliche sterile isotonische Lösungen ein, sind aber nicht darauf limitiert. Solche Lösungen schließen Salzlösung und phosphatgepufferte Salzlösung für die Injektion in eine zentrale Venenbahn, intravenöse, intramusculäre, intraperitoneale oder subcutane Injektion ein, sind aber nicht darauf limitiert.
  • Zusammensetzungen, die für die transbronchiale und transalveoläre Verabreichung geeignet sind, schließen verschiedene Typen von Aerosolen zur Inhalation ein, sind aber nicht darauf limitiert. Vorrichtungen, die für transbronchiale und transalveoläre Verabreichung geeignet sind, sind auch Ausführungsformen. Solche Vorrichtungen schließen Vernebler und Verdampfer ein, sind aber nicht darauf limitiert. Viele Formen von derzeit erhältlichen Verneblern und Verdampfern können leicht angepasst werden, um die Zusammensetzungen der Erfindung abzugeben.
  • Zusammensetzungen, die für die gastrointestinale Verabreichung geeignet sind, schließen pharmazeutisch verträgliche Pulver, Pillen oder Flüssigkeiten zur Einnahme und Suppositorien zur rectalen Verabreichung ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Auf Grund der Leichtigkeit der Verwendung ist die gastrointestinale Verabreichung, besonders oral, die bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
  • Einige Mittel zur Verwendung in der Behandlung und Prävention von menschlichen Erkrankungen werden geliefert. In diesen Aspekten sind die Zusammensetzungen der Erfindung in Pharmazeutika inkorporiert und können an Patienten, die sie benötigen, verabreicht werden. Durch einen Aspekt wird ein Individuum, das gefährdet ist, an einer HIV-Infektion oder einer anderen chronischen viralen Infektion zu erkranken, oder ein Individuum, das schon mit HIV oder einer anderen chronischen viralen Infektion infiziert ist, durch konventionelle Diagnosetests identifiziert, und dann wird eine therapeutisch oder prophylaktisch günstige Menge eines Pharmazeutikums der Erfindung an das Individuum verabreicht. Ein ähnlicher Ansatz kann angewendet werden, um chronische entzündliche Erkrankungen zu behandeln und/oder zu verhindern. Das heißt, Identifizieren eines bedürftigen Individuums und dann Verabreichen eines Pharmazeutikums, das eine Zusammensetzung der Erfindung umfasst. Andere Verfahren der Erfindung schließen einen Ansatz ein, um hohe Titer von neutralisierenden Antikörpern zu erzeugen. Dementsprechend werden Agenzien (z.B. eine Zusammensetzung der Erfindung) auf ihre Fähigkeit, die B-Zell-Toleranz zu brechen, identifiziert und werden danach an ein Individuum, das sie benötigt, verabreicht. Zusätzliche Ausführungsformen schließen ein Verfahren zur Herstellung von monoclonalen und polyclonalen Antikörpern gegen eine Zusammensetzung der Erfindung ein. Diese neuen Antikörper können auch für die Behandlung und Verhinderung einer menschlichen Erkrankung in Pharmazeutika inkorporiert und an Patienten, die sie benötigen, verabreicht werden. Die untenstehende Offenbarung liefert eine weitere Diskussion dieser Ansätze.
  • Herstellung von Antikörpern gegen chimäre und konjugierte VLPs
  • Nach der Konstruktion eines chimären oder konjugierten VLPs können diese Zusammensetzungen verwendet werden, um Antikörper herzustellen. (Siehe Beispiel 10). Antikörper, die ein chimäres oder konjugiertes VLP erkennen, haben viele Verwendungen, einschließlich biotechnologische Anwendungen, therapeutische/prophylaktische Anwendungen und diagnostische Anwendungen, sind aber nicht darauf limitiert. Solche Antikörper schließen polyclonale, monoclonale, chimäre, einzelkettige, Fab-Fragmente und Fragmente, die durch eine Fab-Expressions-Genbank produziert wurden, ein, sind aber nicht darauf limitiert. Neutralisierende Antikörper, d.h. jene, die CCR5-vermittelte Adhäsion inhibieren, werden für Therapeutika besonders bevorzugt.
  • Für die Produktion von Antikörpern können verschiedene Wirte, einschließlich Ziegen, Kaninchen, Ratten, Mäuse usw., durch Injektion mit einem chimären oder konjugierten VLP immunisiert werden. Abhängig von der Wirtsspezies können verschiedene Adjuvanzien verwendet werden, um die immunologische Reaktion zu verstärken. Solche Adjuvanzien schließen Freundsches, Mineralgele wie Aluminiumhydroxid und oberflächenaktive Substanzen wie Lysolecithin, pluronische Polyalkohole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, KLH („keyhole limpet hemocyanin") und Dinitrophenol ein, sind aber nicht darauf limitiert. BCG (Bacillus Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum sind potenziell nützliche Adjuvanzien. VLP-basierende Immunogene können jedoch auch ohne die Zugabe von Adjuvanzien den Titer der Antikörper gegen Tolerogene erhöhen.
  • Monoclonale Antikörper gegen ein chimäres oder konjugiertes VLP können unter Verwendung jeglicher Technologie hergestellt werden, die die Produktion von Antikörper-Molekülen durch permanente Zelllinien in Kultur liefert. Diese schließen die Hybridom-Technologie, die ursprünglich von Köhler und Milstein beschrieben wurde (Nature, 256:495–497 (1975), die menschliche B-Zell-Hybridom-Technologie (Kosbor et al., Immunol Today, 4:72 (1983); Cote et al., Proc Natl Acad Sci, 80:2026-2030 (1983) und die EBV-Hybridom-Technologie (Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc, New York N.Y., S. 77–96 (1985) ein, sind aber nicht darauf limitiert; alle Artikel sind hierin durch Bezugnahme eingeschlossen. Zusätzlich können Technologien, die für die Produktion von „chimären Antikörpern" entwickelt wurden, das Spleißen von Maus-Antikörper-Genen an menschliche Antikörper-Gene, um ein Molekül mit einer passenden Antigen-Spezifität und biologischen Aktivität zu erhalten, verwendet werden. (Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81:6851–6855 (1984); Neuberger et al., Nature, 312:604–608 (1984); und Takeda et al., Nature, 314:452–454 (1985); alle Artikel sind hierin durch Bezugnahme eingeschlossen. Alternativ können Technologien, die für die Produktion von einzelkettigen Antikörpern beschrieben wurden (US-Pat. Nr. 4,946,778), angepasst werden, um einzelkettige Antikörper zu produzieren, die gegen ein chimäres oder konjugiertes VLP gerichtet sind, hierin durch Bezugnahme eingeschlossen. Antikörper können auch durch die Induktion der in vivo-Produktion in der Lymphocyten-Population oder durch Screenen von rekombinanten Immunglobulin-Genbanken oder Feldern von hoch-spezifischen Bindungsreagenzien, wie in Orlandi et al., Proc Natl Acad Sci, 86:3833–3837 (1989), und Winter G. und Milstein C, Nature, 349:293–299 (1991) offenbart wurde, produziert werden; alle Artikel sind hierin durch Bezugnahme eingeschlossen.
  • Antikörper-Fragmente, die spezifische Bindungsstellen für ein chimäres oder konjugiertes VLP enthalten, können auch hergestellt werden. Solche Fragmente schließen zum Beispiel die F(ab')2-Fragmente, die durch Pepsin-Verdau des Antikörpermoleküls produziert werden können, und die Fab-Fragmente, die durch die Reduzierung der Disulfidbrücken der F(ab')-Fragmente hergestellt werden können, ein, sind aber nicht darauf limitiert. Alternativ können Fab-Expressions-Genbanken konstruiert werden, um schnelle und leichte Identifizierung von monoclonalen Fab-Fragmenten mit der erwünschten Spezifität zu ermöglichen. (Huse W. D. et al., Science, 256:12751281 (1989), hierin durch Bezugnahme eingeschlossen).
  • Durch einen Ansatz werden monoclonale Antikörper gegen ein chimäres oder konjugiertes VLP wie folgt hergestellt. Kurz, eine Maus wird wiederholt mit ein paar Microgramm des ausgewählten Proteins oder der Peptide, die davon abgeleitet wurden, über einen Zeitraum von ein paar Wochen beimpft. Die Maus wird dann getötet, und die Antikörper-produzierenden Zellen der Milz werden isoliert. Die Milzzellen werden in der Anwesenheit von Polyethylenglycol mit Maus-Myelomzellen fusioniert und die überschüssigen nicht-fusionierten Zellen durch Züchten des Systems auf selektiven Medien, umfassend Aminopterin (HAT-Medien) zerstört. Die erfolgreich fusionierten Zellen werden verdünnt und Aliquote der Verdünnung in die Vertiefungen einer Microtiterplatte platziert, wo die Züchtung der Kultur fortgesetzt wird. Antikörper-produzierende Clone werden durch Nachweis des Antikörpers in der Überstands-Flüssigkeit von den Vertiefungen durch Immun-Testverfahren wie ELISA, wie ursprünglich von Engvall, E., Meth. Enzymol., 70:419 (1980) beschrieben, hierin durch Bezugnahme eingeschlossen, und davon abgeleitete Verfahren identifiziert. Ausgewählte positive Clone können expandiert und ihr monoclonales Antikörperprodukt für die Verwendung geerntet werden. Detaillierte Vorgehensweisen für die Produktion von monoclonalen Antikörpern sind in Davis, L. et al., Basic Methods in Molecular Biology Elsevier, New York, Abschnitt 21–2 beschrieben.
  • Polyclonales Antiserum, das Antikörper gegen heterogene Epitope eines einzelnen Proteins enthält, kann durch die oben beschriebene Immunisierung von geeigneten Tieren mit dem exprimierten Protein oder mit davon abgeleiteten Peptiden, die unmodifiziert oder modifiziert sein können, um die Immunogenität zu verstärken, hergestellt werden. Eine wirksame polyclonale Antikörper-Produktion wird durch viele Faktoren beeinflusst, die sowohl mit dem Antigen als auch der Wirtsspezies in Verbindung stehen. Die Wirtstiere variieren auch in der Reaktion auf die Stelle der Beimpfungen und die Dosis, mit sowohl nicht ausreichenden oder überschüssigen Dosen des Antigens, die in Antiseren mit niedrigen Titern resultieren. Kleine Dosen (ng-Bereich) des Antigens, die an multiplen intradermalen Stellen verabreicht werden, scheinen am verlässlichsten zu sein. Ein wirksames Immunisierungsprotokoll für Kaninchen kann in Vaitukaitis, J. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 33:988–991 (1971) gefunden werden.
  • Auffrischungsinjektionen können in regelmäßigen Intervallen gegeben und Antiserum geerntet werden, wenn der Antikörpertiter davon zu fallen beginnt, was semi-quantitativ durch zum Beispiel doppelte Immundiffusion in Agar gegen bekannte Konzentrationen des Antigens bestimmt wird. Siehe zum Beispiel Ouchterlony, O. et al., Kap. 19 in: Handbook of Experimental Immunology D. Wier (Hrsg.) Blackwell (1973). Eine Plateau-Konzentration des Antikörpers liegt gewöhnlich im Bereich von 0,1 bis 0,2 mg/ml Serum (etwa 12 M). Die Affinität von Antiseren für das Antigen wird durch Herstellen von kompetitiven Bindungskurven, wie zum Beispiel von Fisher, D., Kap. 42 in: Manual of Clinical Immunology, 2. Aufl. (Rose und Friedman, Hrsg.) Amer. Soc. For Microbiol., Washington, D.C. (1980) beschrieben, bestimmt. Antikörper-Präparate, die gemäß eines Protokolls hergestellt werden, sind für quantitative Immun-Test nützlich, die die Konzentrationen von Antigen-tragenden Substanzen in biologischen Proben nachweisen; sie werden auch semi-quantitativ oder qualitativ verwendet. Zusätzlich kann ein chimäres oder konjugiertes VLP verwendet werden, um eine Antikörper-Produktion in Menschen zu induzieren, wie es überall in dieser Offenbarung diskutiert wird. Dementsprechend kann ein chimäres oder konjugiertes VLP an ein anderes Protein, einen Träger, eine Unterlage oder ein Adjuvans gebunden oder mit ihm/ihr verabreicht werden, um ein Pharmazeutikum oder einen Impfstoff herzustellen, das/der eine potente Immunreaktion induziert.
  • Das folgende Beispiel beschreibt die Vorgehensweisen, die verwendet wurden, um ein Polynucleotid, das ein chimäres L1-CCR5-Protein codiert, das sich selbst zu kapsomeren Strukturen anordnet, herzustellen und zu exprimieren. Die unten beschriebene Vorgehensweise involviert das Modifizieren eines L1-codierenden Polynucleotids, um eine Aminosäuresequenz, die ein CCR5-Peptidfragment codiert, zu inkorporieren. In dieser beispielhaften Darlegung wurden 16 Codons der ersten extrazellulären Schleife von C57BI/6 (B6)-Maus-CCR5 (mCCR5) getrennt in eine von drei Regionen der BPV-1-L1-Sequenz, die den Stellen der virusneutralisierenden Epitope entsprechen, inseriert. Die Positionen dieser Epitope waren vorher durch Ausrichten der Polypeptidsequenzen von verschiedenen menschlichen Papillomaviren hergeleitet worden. Die drei nicht-fortlaufenden Regionen von L1, die die CCR5-Sequenz erhielten, sind durch Ludmerer et al., J. Virol., 70:4791 (1996); durch Ludmerer et al., J. Virol., 71:3834 (1997) und durch Roden et al., J. Virol., 71:6247 (1997) beschrieben worden. Da die Aminosäuren an diesen Stellen wahrscheinlich auf der Kapsidoberfläche exprimiert wurden, wurden analoge Stellen in BPV-1-L1 für die Peptidinsertion angezielt. Dies versicherte, dass der Teil des chimären L1-Proteins, der die CCR5-Peptidsequenz einschloss, Oberflächen-exprimiert und für wirksame Präsentation gegenüber dem humoralen Immunsystem zugänglich sein würde.
  • Beispiel 1 beschreibt das Verfahren, das verwendet wurde, um ein chimäres L1-CCR5-Protein zu bilden, das sich selbst zu antigenen Partikeln zusammenlagert.
  • BEISPIEL 1
  • Konstruktion eines chimären Proteins, das in der Lage ist, sich selbst zu antigenen Partikeln zusammenzulagern
  • Polynucleotide, die die drei verschiedenen L1-CCR5-Chimären codieren (bezeichnet als „L1-CCR5-Chimäre 1", „L1-CCR5-Chimäre 2" und „L1-CCR5-Chimäre 3"), wurden durch überlappende Extensions-PCR-Mutagenese im Wesentlichen gemäß der Technik, die von Ho et al. in Gene, 77:51 (1989) beschrieben wurde, hergestellt. Ein Polynucleotid, das das BPV-1-L1 codiert (Chen et al., Nature, 299:557 (1982)), wurde als ein EcoRl/Kpnl-Fragment in die komplementären Stellen der multiplen Clonierungsstelle des Baculovirus-pFastBac1-Expressionsvektors (Gibco BRL, Gaithersberg, MD) cloniert. Teile der BPV1-L1- Sequenz in jeder der drei Chimären wurden durch eine Sequenz ersetzt, die die erste extrazelluläre Schleife von C57B1/6-mCCR5 codiert. Die Polypeptidsequenz des mCCR5-Proteins hatte die Sequenz: His-Tyr-Ala-Ala-Asn-Glu-Trp-Val-Phe-Gly-Asn-Ile-Met-Cys-Lys-Val (SEQ ID NO:1) (Boring et al., J. Biol. Chem., 271:7551 (1996)). In der L1-CCR5-Chimäre 1 wurde die Sequenz, die die L1-Aminosäuren 130–136 codiert, durch die mCCR5-Sequenz ersetzt. In der L1-CCR5-Chimäre 2 wurde die Sequenz, die die L1-Aminosäuren 275–285 codiert, durch die mCCR5-Sequenz ersetzt. In der L1-CCR5-Chimäre 3 wurde die Sequenz, die die L1-Aminosäuren 344–350 codiert, durch die mCCR5-Sequenz ersetzt. Die endgültigen Clone wurden durch Restriktionsverdau-Analyse und durch Nucleotidsequenz-Analyse der PCR-amplifizierten Region bestätigt.
  • Rekombinante Baculovirus-Stammlösungen, die die Gene enthielten, die die chimären L1-CCR5-Proteine oder das Wildtyp-BPV-1-L1 codieren, wurden unter Verwendung des GIBCO BRL Baculovirus-Systems hergestellt, wie es vom Hersteller beschrieben wurde. Papillomavirus-ähnliche Partikel wurde von rekombinanten Baculovirus-infizierten Sf9-Zellen, wie vorher beschrieben, aufgereinigt. (Kirnbauer, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:12180–12184 (1992); Greenstone, H.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 95:1800–1805 (1998)). Die allgemeine Morphologie der Partikel-Präparate wurde durch einen Mobilitätstest unter Verwendung einer FPLC-Superose-6-Gelfiltrationssäule (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) analysiert. Das Eluat wurde in ein-ml-Fraktionen gesammelt. Das Hohlraumvolumen dieser Säule beträgt 8 ml. Vorher wurde nachgewiesen, dass die Wildtyp-L1-VLPs hauptsächlich in der Fraktion 9 der Säule eluieren, L1-Kapsomere in der Fraktion 15 eluieren und L1-Monomere in den Fraktionen 19–21 eluieren (Okun, M. M. et al., zur Veröffentlichung eingereicht). Die Säulenfraktionen wurden durch Western-Blot-Analyse auf die Anwesenheit von L1 getestet.
  • Beispiel 2 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden, um zu bestätigen, dass ein chimäres L1-CCR5-Protein sich selbst zu kapsomeren Strukturen anordnete. Interessanterweise wurde von den unten beschrieben L1-CCR5-Partikeln durch Elekronenmikroskopie gezeigt, dass sie etwas kleiner sind als VLPs, die von Wildtyp-L1-Proteinen gebildet werden.
  • BEISPIEL 2
  • Herstellung von chimären kapsomeren Strukturen
  • Die drei oben beschriebenen L1-CCR5-Chimären wurden durch FPLC-SUPEROSE-6-Gelfiltrations-Säulenchromatographie (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) isoliert. Säulenfraktionen von je 1 ml wurden durch Western-Blot-Analysen unter Verwendung eines 10%igen Polyacrylamidgels unter denaturierenden Bedingungen auf die Anwesenheit von L1 getestet. Kontrollvorgehensweisen wiesen darauf hin, dass Wildtyp-L1-VLPs vorwiegend in der Säulenfraktion 9 eluierten, dass L1-Kapsomere in der Fraktion 15 eluierten und dass L1-Monomere in den Fraktionen 19–21 eluierten. Das L1-CCR5-Protein der Präparationen der Chimären 2 und 3 wurde vorwiegend in der Fraktion 15 nachgewiesen. Diese Ergebnisse legten nahe, dass die Proteine der L1-CCR5-Chimäre 2 und der L1-CCR5-Chimäre 3 scheiterten, sich zu höher geordneten Strukturen zusammenzulagern. Basierend auf diesen Ergebnissen wählten wir die L1-CCR5-Chimäre 1 für die folgenden Vorgehensweisen aus. Aufgereinigte Partikel wurden unter Verwendung der Elektronenmikroskopie durch anfängliches Adsorbieren der Partikel an Kohlenstoff-beschichtete Gitter, Färben mit 1 % Uranylacetat und dann Untersuchen der Gitter unter Verwendung eines Philips-Elektronenmikroskops Modell EM 400RT bei 36000-facher Vergrößerung untersucht.
  • Die Ergebnisse dieser Vorgänge wiesen darauf hin, dass das Protein der L1-CCR5-Chimäre 1 in einer Säulenfraktion eluierte, von der bekannt ist, dass sie zusammengelagerte partikuläre Strukturen enthält. Die Untersuchung der Partikel von Chimäre 1 durch Elektronenmikroskopie legte Partikel offen, die Durchmesser von ungefähr 28 nm aufwiesen, während Wildtyp-L1-VLPs Durchmesser von ungefähr 55 nm aufwiesen. Der 28 nm-Durchmesser legt nahe, dass die Partikel sich aus 12 Kapsomeren zusammensetzten, während die Strukturen mit größerem Durchmesser, die von Wildtyp-L1-Proteinen gebildet wurden, sich aus 72 Kapsomeren zusammensetzten. Morphologisch ähnelten die Partikel der L1-CCR5-Chimäre 1 den Polyomavirus-12-ICOSA-Hüllen (T = 1 Partikel), die sich aus einer regelmäßigen Anordnung von 12 pentameren Kapsomeren des Polyomavirus-Haupthüllenproteins VP1 zusammensetzen und durch erneute in vitro-Zusammenlagerung von VP1-Kapsomeren bei hoher ionischer Stärke hergestellt werden können (Salunke, et al., Biophys. J., 56:887 (1989)). Kleine Partikel mit einer Größe ähnlich den L1-CCR5-Partikeln wurden als Nebenbestandteile der Wildtyp-BPV-1-L1-VLP-Präparationen gefunden. Obwohl die L1-CCR5-Partikel kleiner waren als die Wildtyp-VLPs, besaßen sie zumindest manche Charakteristika der Wildtyp-VLPs, die den Wildtyp-Kapsomeren fehlen. Insbesondere hämagglutinierten L1-CCR5-Partikel rote Blutkörperchen von Mäusen und zeigten ELISA-Reaktivität auf einen monoclonalen neutralisierenden BPV-1 Antikörper (#9), der spezifisch an die Partikel, aber nicht an die Kapsomere band (Roden et al., J. Virol., 68:7570 (1994)).
  • Das folgende Beispiel veranschaulicht, wie Peptidsequenzen, die sich als geordnete Anordnungen auf kapsomeren Strukturen darstellten, humorale Immunreaktionen sogar gegen zentrale Antigene stimulieren können. Wie unten hingewiesen wird, reagierten Mäuse, denen L1-CCR5-Partikel verabreicht wurden, mit der Produktion von mCCR5-spezifischen Antikörpern. Signifikanterweise wiesen die Ergebnisse darauf hin, dass die Immunisierung die B-Zell-Toleranz gegenüber dem Peptid überwand, ohne die Toleranz gegenüber dem endogenen zellulären CCR5 zu beeinflussen. Die anti-Selbstantikörper, die durch die immunogenen Partikel induziert wurden, banden natürliches mCCR5, blockierten die Bindung eines CCR5-Liganden und inhibierten eine HIV-1-Infektion durch ein chimäres CCR5-Protein, das das mCCR5-Peptid enthielt.
  • Beispiel 3 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden, um zu zeigen, dass chimäre L1-CCR5-Partikel als Immunogene verwendet werden könnten, um anti-CCR5-Antikörper zu induzieren.
  • BEISPIEL 3
  • Stimulierung einer Toleranz-brechenden Immunreaktion
  • Um Antiseren herzustellen, wurden C57BI/6-Mäusen in einem Immunisierungsprotokoll entweder: L1-CCR5-Partikeln, Wildtyp-BPV-1-L1-VLPs oder ein synthetisches CCR5-Peptid, das die erste extrazelluläre Schleife von mCCR5 repräsentiert und an KLH unter Verwendung eines IMJECT-aktivierten Immunogen-Konjugations-Kits (Pierce, Rockford, IL) gekoppelt wurde, verabreicht. In manchen Fällen wurden Mäusen L1-CCR5-Partikel verabreicht, die durch Kochen für 2 Minuten in der Anwesenheit von 1 % SDS denaturiert worden waren. Mäuse wurden intradermal mit 10 μl Antigen dreimal in zweiwöchigen Abständen beimpft. In den meisten Fällen wurden die Serumproben zwei Wochen nach der letzten Auffrischung gesammelt. Wenn ein Adjuvans verwendet wurde, wurde das Antigen für die erste Injektion in komplettem Freundschem Adjuvans und für die folgenden Injektionen in inkomplettem Freundschem Adjuvans hergestellt. Serumproben wurden auf die Reaktivität gegen das CCR5-Peptid und gegen Wildtyp-VLPs unter Verwendung eines quantitativen ELISA-Protokolls getestet, um IgG-Antikörper gegen BPV-1-VLPs nachzuweisen. Der ELISA wurde unter Verwendung der von Kirnbauer et al. in J. Natl. Cancer Inst., 86:494 (1994) beschriebenen Vorgehensweise durchgeführt. Ein synthetisches Peptid, das die erste extrazelluläre Schleife von mCCR5 repräsentiert, wurde hergestellt und an Rinder-Serumalbumin (BSA) als ein Trägerprotein gekoppelt. Anti-CCR5-spezifisches IgG wurde durch Binden von 300 ng BSA-gekoppeltem CCR5-Peptid in 50 μl phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) an jede Vertiefung einer IMMULON II-Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Dynatech; Chantilly, VA) für 2 Stunden bei 37°C nachgewiesen. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Vertiefungen für 2 Stunden mit 50 μl PBS, enthaltend 0,5% Magermilchpulver mit 1 % Serum von neugeborenen Kälbern bei Zimmertemperatur blockiert. Nach der Blockierung wurden die Vertiefungen danach wieder dreimal mit PBS gewaschen. Mausserum wurde in PBS mit 0,5% Magermilchpulver reihenverdünnt. Die verdünnten Serumproben (50 μl) wurden nach dem Entfernen des letzten PBS-Waschschritts den Vertiefungen verabreicht. Die Platten wurden bei Zimmertemperatur für 2,5 Stunden unter sanftem Schwenken inkubiert. Nach fünf Waschschritten wurden 50 μl Meerrettichperoxidase-konjugiertes Ziegen-anti-Maus-IgG (Boehringer Mannheim; Indianapolis, IN), 1:10 000 verdünnt in 0,5% Milch-PBS, zu den Vertiefungen zugefügt. Die Platten wurden bei Zimmertemperatur für 1 Stunde unter sanftem Schwenken inkubiert und dann dreimal gewaschen. Das ABTS-Peroxidasesubstrat (50 μl) (Boehringer Mannheim) wurde zu der Platte zugefügt, für 45 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert und die optischen Dichten (ODs) wurden bei 405 nm unter Verwendung eines THERMO MAX-Mikroplattenlesers gelesen. OD405-Werte, die größer als zweimal der Hintergrund (normalerweise größer als 0,1) waren, wurden als positiv erachtet.
  • Die in 1A präsentierten Ergebnisse wiesen darauf hin, dass die Serumproben von Mäusen, denen L1-CCR5-Partikel verabreicht wurden, hohe anti-CCR5-ELISA-Titer hatten. Im Gegensatz dazu hatten Kontrollmäuse, denen Wildtyp-VLPs verabreicht wurden, wie erwartet, keine ELISA-Reaktivität. Anti-CCR5-Titer reichten in den drei Mäusen, denen das Immunogen in Kombination mit Freundschem Adjuvans verabreicht worden war, von 3 × 103 bis 3 × 104 und betrugen in den zwei Tieren, die das Immunogen ohne Adjuvans erhalten hatten, 3 × 103. Mäuse, denen denaturierte L1-CCR5-Partikel in Kombination mit Adjuvans verabreicht wurden, zeigten keinen Hinweis auf mCCR5-Peptid-spezifische Antikörper. Das Fehlen der Reaktivität der denaturierten L1-CCR5-Partikel war auf das CCR5-Peptid beschränkt, da, wie durch die in 1B präsentierten Ergebnisse angedeutet wird, das denaturierte Material hohe Titer von anti-L1-Antikörpern hervorrief. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass erwachsene Säuger die Fähigkeit beibehielten, Antikörper zu produzieren, die spezifisch für zentrale Selbstantigene sind.
  • Während die vorangehenden Ergebnisse darauf hinwiesen, dass die L1-CCR5-Partikel Antikörper hervorriefen, die spezifisch für das CCR5-Peptid sind, wurde weiteres Testen ausgeführt, um zu bestätigen, dass die Antikörper auch Zellassoziiertes mCCR5-Protein erkannten, wenn es in seiner natürlichen Konformation dargelegt wurde. Dies wurde unter Verwendung von durchflusscytometrischer Analyse (FACS) erzielt, um zu zeigen, dass die anti-CCR5-Antikörper mCCR5 banden, das auf der Zelloberfläche exprimiert wurde.
  • Beispiel 4 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden, um zu zeigen, dass Antikörper, die gegen die L1-CCR5-Partikel hervorgerufen wurden, authentisches mCCR5-Rezeptorprotein banden, das auf Zelloberflächen exprimiert wurde.
  • BEISPIEL 4
  • Bindung von natürlichem Antigen durch Auto-Antikörper, die als Reaktion auf ein Selbstantigen, das in eine kapsomere Struktur inkorporiert wurde, stimuliert wurde
  • Gesamt-IgG von gepoolten Mausseren wurde über eine Protein G-Säule (Pierce) unter Verwendung von Vorgehensweisen, die Fachleuten bekannt sein werden, affinitätsaufgereinigt. Säulenfraktionen, die IgG enthielten, wurden gepoolt und dann unter Verwendung einer CENTRICON-30-Spinsäule (Amicon; Beverly, MA) konzentriert. Antikörperbindungstests wurden unter Verwendung von transfizierten menschlichen Zellen durchgeführt, die einen rekombinanten Maus-CCR5-Rezeptor exprimierten. Die Bindung von Antikörpern, die gegen L1-CCR5-Partikel errichtet wurden, konnten nicht leicht unter Verwendung von primären Kulturen von Mauszellen getestet werden, weil diese Zellen hohe Spiegel von Fcy-Rezeptoren exprimierten und auf Grund der Interaktionen mit nicht-spezifischem Maus-IgG hohe Hintergrundspiegel der Bindung ergaben. Dementsprechend wurde für die durchflusscytometrische Analyse ein Maus-CCR5-Expressionsvektor in HeLa-MAGI-Zellen durch Transfektion unter Verwendung eines LIPOFECTAMINE PLUS-Transfektionskits (Gibco BRL, Gaithersberg, MD) transient exprimiert. pcDNA3-abgeleitete Plasmide, die mCCR5, das von B6-Mäusen cloniert wurde, und eine Mensch-Maus-CCR5-Chimäre enthielten, die die erste extrazelluläre Schleife von mCCR5 in einem Hintergrund von menschlichem CCR5 enthielt, wurden, wie von Kuhmann et al. in J. Virol., 71:8642 (1997) beschrieben, hergestellt. Einlagige Zellschichten wurden 48 Stunden nach der Transfektion durch sanftes Abkratzen in der Anwesenheit von 5 mM EDTA abgelöst. Die Zellen wurden dreimal in Färbepuffer (PBS mit 0,5% BSA) gewaschen. Ungefähr 105 Zellen wurden in 25 μl Färbepuffer mit 1 μg Maus-IgG resuspendiert und dann 45 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurde dreimal mit Färbepuffer gewaschen, in 25 μl Färbepuffer mit 250 ng Fluorescein (FITC)-markiertem Ziegen-anti-Maus-IgG (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA) resuspendiert und für 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit Färbepuffer gewaschen und schließlich in Vorbereitung für die FACS-Analyse in 0,5 ml Färbepuffer resuspendiert. Als eine Kontrolle wurden Zellen mit 500 ng FITC-markiertem monoclonalem Maus-anti-Mensch-CCR5-Antikörper (mAB182) (R & D Systems; Minneapolis, MN) gemäß den Beschreibungen des Herstellers gefärbt. FACS-Analyse wurde unter Verwendung einer FACSCALIBUR- und CELLQUEST-Software (Becton Dickinson; San Jose, CA) durchgeführt. Spezifische Bindung wurde im Verhältnis zur Färbung von Kontrollzellen, die mit dem pcDNA3-Vektor transfiziert wurden, gemessen.
  • Die Ergebnisse von diesen Vorgehensweisen wiesen darauf hin, dass Auto-Antikörper als Reaktion auf die Verabreichung von L1-CCR5 kapsomere Partikel stimulierten, die spezifisch rekombinante mCCR5-Rezeptoren banden, die auf der Oberfläche von transfizierten HeLa-MAGI-Zellen exprimiert wurden. 2A zeigt, dass IgG von Mäusen, die mit L1-CCR5 immunisiert wurden, spezifisch mit hoher Affinität an transfizierte Zellen, die den mCCR5-Rezeptor exprimierten, aber nicht an Zellen, die mit dem Vektor allein transfiziert wurden, banden. Zellen, die mCCR5 exprimierten, banden, wie erwartet, nicht wesentlich Antikörper, die als Reaktion auf die Immunisierung mit virusähnlichen Partikeln stimuliert wurden, die durch Wildtyp-L1 gebildet wurden (2B), oder einen monoclonalen Antikörper (mAB182), der spezifisch für die zweite extrazelluläre Schleife von menschlichem CCR5 ist ( 2C). Als eine Kontrolle für die Antikörper-Spezifität wurde Mäusen das mCCR5-Peptid verabreicht, das an KLH gekoppelt worden war. Während diese Mäuse mit der Produktion von anti-CCR5-Peptid-Antikörpern reagierten, die ELISA-Titer von 105 gegen ein BSA-gekoppeltes, aufgereinigtes IgG aufwiesen, scheiterte diese, an Zellen zu binden, die mCCR5 exprimierten (2D). Im Ganzen wiesen diese Ergebnisse darauf hin, dass Antikörper, die als Reaktion auf die Immunisierung mit kapsomeren L1-CCR5-Patrikeln errichtet wurden, als wahre Auto-Antikörper wirkten, weil sie Zelloberflächen-exprimiertes, natürliches mCCR5 spezifisch banden, im Gegensatz zu den Antikörpern, die gegen das KLH-CCR5-Peptid errichtet waren.
  • Die Fähigkeit der Antikörper, die gegen L1-CCR5-Partikel hervorgerufen wurden, um natürliches mCCR5 zu binden, wurde weiter durch Testen auf Kompetition mit dem 125I-markierten menschlichen RANTES-Chemokinligand um die Bindung an transfizierte HeLa-MAGI-Zellen, die CCR5 exprimieren, untersucht. Die Maus-Chemokine MIP-1, MIP-1β und RANTES sind Liganden für mCCR5. Zusätzlich sind die menschlichen Homologe von MIP-1β und RANTES in der Lage, mCCR5 zu binden (Meyer et al., J. Biol. Chem., 271:14445 (1996); Nibbs et al., J. Biol. Chem., 272:12495 (1997)). Wie im folgenden Beispiel beschrieben, wurden die Zellen mit 0,5 nM iodiertem RANTES in der Abwesenheit oder Anwesenheit von Verdünnungen von Mausseren drei Tage nach der Transfektion mit einem mCCR5-Expressionskonstrukt inkubiert.
  • Beispiel 5 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden, um zu zeigen, dass Auto-Antikörper, die gegen den CCR5-Rezeptor hervorgerufen wurden, die Ligandenbindung an den Rezeptor inhibierten.
  • BEISPIEL 5
  • Auto-Antikörper, die spezifisch für einen Rezeptor sind, inhibieren die Ligandenbindun
  • HeLa-MAGI-Zellen wurden mit dem mCCR5-Expressionsplasmid unter Verwendung eines CaPO4-Transfektionskits, der von Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA) gekauft wurde, transient transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden 105 Zellen in individuelle Vertiefungen einer Gewebekulturplatte mit 24 Vertiefungen übertragen. Am nächsten Tag wurden die Zellen zweimal in kaltem PBS gewaschen und dann in 150 μl kaltem Bindungspuffer (25 mM HEPES (pH 7,2), 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0,5% (Gewicht/Volumen) BSA) resuspendiert. Die Zellen wurden für 4 Stunden bei 4°C mit 0,5 nM 125I-markiertem menschlichem RANTES (Amersham; Arlington Heights, IL) in der Abwesenheit oder Anwesenheit von verschiedenen Verdünnungen von Mausseren inkubiert. Um kleine Moleküle zu entfernen, wurde der Puffer der Mausseren durch einen Bindungspuffer unter Verwendung von MICRO BIO-SPIN CHROMATOGRAPHY-6-Säulen (Bio-Rad, Hercules, CA) vor dem Durchführen des Bindungstests ausgetauscht. Als eine Kontrolle wurden manche Bindungstests in der Anwesenheit von 50 nM oder 500 nM nicht-iodiertem menschlichem RANTES (R & D Systems) durchgeführt. Die Reaktionen wurden durch viermaliges Waschen der Vertiefungen mit kaltem Bindungspuffer mit 0,5 M NaCl gestoppt. Die Zellen wurden durch Zugabe von 0,5 ml 1 % SDS lysiert und die Lysate in Zählröhrchen transferiert. Gebundene Radioaktivität wurde für 1 Minute in einem Beckmann-Gamma 5500B-Zähler gezählt.
  • Die Ergebnisse dieser Vorgehensweisen bestätigten, dass Auto-Antikörper, die gegen die L1-CCR5-Partikel hervorgerufen wurden, spezifisch den auf der Zelloberfläche exprimierten CCR5 exprimierte, und Ligandenbindung an den Rezeptor verhinderten. Genauer zeigten die graphischen Ergebnisse, die in 4 gezeigt sind, an, dass eine 1:30-Verdünnung von L1-CCR5-Seren ungefähr 66% des iodierten menschlichen RANTES verdrängte (ähnlich zu dem Verdrängen, das unter Verwendung eines 100-fachen Überschusses von kaltem RANTES beobachtet wurde), im Vergleich zu 37% Verdrängen mit einer 1:30-Verdünnung der Wildtyp-L1-VPL-Seren. Die 1:75- und 1:150-Verdünnungen der L1-CCR5-Seren verdrängten 25% beziehungsweise 17% des iodierten RANTES, wohingegen bei Verwendung von Kontrollseren in diesen Verdünnungen kein signifikantes Verdrängen beobachtet wurde. Maximal gebundenes iodiertes RANTES wurde durch Testen auf Bindung in der Abwesenheit von Seren bestimmt und entsprach ungefähr 2550 ZpM, was durch die gestrichelte horizontale Linie in 3 angezeigt ist. Nicht-spezifische Bindung von iodiertem RANTES (ungefähr 1300 ZpM) wurde durch Testen auf Bindung in einem 1000-fachen Überschuss (500 nM) von kaltem (nicht-iodiertem) menschlichem RANTES bestimmt. Die Daten, die in 4 gezeigt werden, repräsentieren den Durchschnitt von Vertiefungen in doppelter Ausführung von einem Experiment. Frühere Studien haben nahe gelegt, dass MIP-1, MIP-1β und RANTES an die zweite extrazelluläre Schleife von menschlichem (h) CCR5 binden, da ihre Bindung durch einen monoclonalen Antikörper gegen diesen Teil des Moleküls, aber nicht durch einen Antikörper, der spezifisch für das Amino-Ende von hCCR5 ist, blockiert wurde (Wu et al., J. Exp. Med., 186:1373 (1997)). Die hierin dargestellten Ergebnisse wiesen darauf hin, dass Antikörper, die Bindungsspezifität für die erste extrazelluläre Schleife von mCCR5 haben, das zwischen diesen zwei Stellen lokalisiert ist, vorteilhaft die RANTES-Bindung inhibierten und darüber hinaus einen Weg lieferten, um die Bildung dieser Autoantikörper in vivo zu stimulieren.
  • Um die Nützlichkeit der oben beschriebenen Auto-Antikörper weiter zu untersuchen, untersuchten wir, ob die Inhibition der Ligandenbindung, die im vorhergehenden Beispiel beobachtet wurde, mit der Inhibition der viralen Infektion von Zielzellen korrelierte. Monoclonale Antikörper-Untersuchungen haben die zweite extrazelluläre Schleife und die Amino-terminale Region von hCCR5 damit in Zusammenhang gebracht, und Studien von chimären Rezeptoren haben darauf hingewiesen, dass die ersten und dritten extrazellulären Schleifen von CCR5 auch zur Rezeptor-Interaktion mit HIV-1 beitragen (Wu et al., J. Exp. Med., 186:1373 (1997); Rucker et al., Cell, 87:437 (1996); Atchinson et al., Science, 274:1924 (1996); Alkhatib et al., J. Biol. Chem., 272:19771 (1997); Picard et al., J. Virol., 71:5003 (1997); Ross et al., J. Virol., 72:1918 (1998)). Obwohl mCCR5 nicht als ein HIV-1-Co-Rezeptor wirkt, hat ein chimärer Mensch-Maus-Rezeptor (HMHH), der die erste extrazelluläre Schleife von mCCR5 (der B6-Maus-Sequenz) in einem Hintergrund von hCCR5 enthält, Co-Rezeptoraktivität, wenn er in menschlichen Zelllinien exprimiert wird (Kuhmann et al., J. Virol., 71:8642 (1997)). Dementsprechend wurde dieser chimäre Rezeptor im folgenden Beispiel verwendet, um zu testen, ob anti-L1-CCR5-Seren eine M-tropische HIV-1-Infektion blockieren könnten.
  • Die im folgenden Beispiel dargelegten Ergebnisse haben einen starken Einfluss auf die Inhibition einer HIV-Infektion, weil sogar eine teilweise Reduktion der CCR5-Expression klinisch signifikante Wirkungen haben kann. Dies ist wahr, weil HIV-1-infizierte Individuen, die heterozygot für ein inaktives CCR5-Allel sind, verzögertes Fortschreiten zu AIDS zeigen (Liu et al., Cell, 86:367 (1996); Samson et al., Nature, 382:722 (1996); Winkler et al., Science, 279:389 (1998)).
  • Beispiel 6 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden, um zu zeigen, dass Auto-Antikörper, die als Reaktion auf L1-CCR5-Partikel errichtet wurden, eine Infektion von Zielzellen durch M-tropisches HIV-1 inhibierten. Da ein chimärer Maus-Mensch-CCR5-Rezeptor in diesen Vorgehensweisen verwendet wurde, beinhaltete der erste Schritt die Bestätigung, dass die oben beschriebenen anti-CCR5-Auto-Antikörper den chimären Rezeptor erkannten.
  • BEISPIEL 6
  • Anti-Rezeptor-Auto-Antikörper inhibieren eine HIV-Infektion von Zielzellen
  • Um zu bestätigen, dass IgG, das von L1-CCR5-Seren aufgereinigt wurde, den chimären Mensch-Maus-Rezeptor band, wurde eine FACS-Analyse an HeLa-MAGI-Zellen durchgeführt, die transient mit dem HMHH-Expressionskonstrukt transfiziert wurden, das von Kuhmann et al. in J. Virol., 71:8642 (1997) beschrieben wurde. Das Expressionskonstrukt wurde 2 Tage vor der Färbung mit entweder L1-CCR5-IgG, Wildtyp-L1-VLP-IgG oder einem monoclonalen anti-menschlichen CCR5-Positivkontroll-Antikörper in Empfängerzellen transfiziert. Die in den 2E–2G präsentierten Ergebnisse wiesen darauf hin, dass positive Bindung unter Verwendung von Serum-IgG von Mäusen erhalten wurde, denen L1-CCR5-Partikel so wie ein monoclonaler Positivkontroll-Antikörper, der spezifisch für die zweite extrazelluläre Schleife von menschlichem CCR5 ist, verabreicht wurden. IgG von Mäusen, denen Wildtyp-L1-VLP verabreicht wurde, banden jedoch wie erwartet HMHH nicht.
  • Basierend auf den vorstehenden Ergebnissen wurden Seren von L1-CCR5-Mäusen auf die Fähigkeit, eine Infektion des M-tropischen BaL-Stamms von HIV-1 zu inhibieren, unter Verwendung eines Einmalreplikationszyklus-Tests und der HeLa-MAGI-Indikator-Zellinie getestet. HeLa-MAGI-Zellen, die von Kimpton et al. in J. Virol., 66:2232 (1992) beschrieben wurden, wurden transient mit dem chimären Mensch-Maus-CCR5-Expressionsvektor unter Verwendung eines kommerziell erhaltenen CaPO4-Transfektionskits (Stratagene Cloning Systems) transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion und am Tag vor der Infektion wurden die Indikatorzellen auf Platten mit 24 Vertiefungen zu 6,5 × 104 Zellen pro Vertiefung in komplettem DMEM ausgesät. Manche Infektionen wurden in der Anwesenheit von gepoolten Mausseren durchgeführt, deren Puffer gegen PBS unter Verwendung von MICRO BIO-SPIN CHROMATOGRAPHY-6-Säulen (Bio-Rad) ausgetauscht worden war. Vor der Infektion wurden die Zellen in einem Gesamtvolumen von 140 μl in komplettem DMEM mit 10 μg/ml DEAE-Dextran mit Verdünnungen von Seren für 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Virus zu jeder Vertiefung zugefügt, um ein Gesamtvolumen von 150 μl zu ergeben. Die Zellen wurden für 2 Stunden bei 37°C inkubiert, dann wurde 1 ml komplettes DMEM zu jeder Vertiefung zugefügt. Drei Tage nach der Infektion wurden die Zellen mit X-Gal gefärbt, und eine infektiöse Dosis wurde durch Zählen der Zahl von blauen Kernen in den infizierten Vertiefungen bestimmt. Die Inhibition des viralen Eindringens wurde durch Vergleichen der durchschnittlichen Zahl von blauen Kernen in der Anwesenheit von Seren mit der durchschnittlichen Zahl von infektiösen Zentren in der Abwesenheit von Seren bewertet. Typischerweise wurden in jeder Infektion genug infektiöse Virionen verwendet, um zu 50–75 infektiösen blauen Zentren in den Kontroll (keine Seren)-Vertiefungen zu führen. Alle Tests wurden in doppelter Ausführung durchgeführt. Mit einer Passage sank die Wirksamkeit der Infektion von transfizierten HeLa-MAGI-Zellen deutlich ab, vermutlich auf Grund von reduzierter CD4-Expression. Daher wurden alle Infektionen an kurz vorher aufgetauten HeLa-MAGI-Zellen durchgeführt.
  • Die Ergebnisse dieser Vorgehensweisen, die in 4 graphisch dargestellt sind, zeigten, dass Serumantikörper, die gegen das CCR5-Selbstantigen hervorgerufen wurden und von denen gezeigt wurde, dass sie das natürliche Antigen erkennen und die Liganden-Rezeptor-Interaktionen inhibierten, auch eine virale Infektion von Zielzellen inhibierten. Indikatorzellen, die transient mit dem HMHH-Expressionskonstrukt transfiziert und mit HIV-1-BaL in der Anwesenheit von L1-CCR5-Seren-Verdünnungen von 1:15, 1:30 und 1:75 in Kontakt gebracht wurden, zeigten 65%, 50% und 45% Neutralisation der Infektiosität. In den selben Verdünnungen zeigten Kontrollseren von Wildtyp-L1-VLP-Mäusen eine gewisse nicht-spezifische Neutralisation, aber nur ein einem Bereich von 25% bei der 1:15-Verdünnung und 15% bei 1:30 und 1:75. Indikatorzellen, die mit HIV-1-Bal in der Anwesenheit von 50 μg/ml eines monoclonalen Antikörpers, der spezifisch für menschliches CCR5 ist (mAB182) und der als eine Positivkontrolle verwendet wurde, infiziert wurden, zeigten ungefähr 50% Neutralisation. Daher inhibierten die anti- CCR5-Auto-Antikörper, die gemäß der oben dargelegten Vorgehensweise produziert wurden, wirksam eine Infektion von empfänglichen Zellen durch HIV-1.
  • Wir haben gezeigt, wie man die B-Zell-Toleranz gegenüber einem Selbstantigen durch sein Präsentieren in einem Zusammenhang, der die geordneten Oberflächenantigene eines infektiösen Virus imitiert, bricht. Um dies zu tun, ersetzten wir ein dominantes virusneutralisierendes Epitop auf der Oberfläche von Papillomaviurs-L1-VLPs durch eine Peptidsequenz von einem Selbstprotein. Genauer bauten wir eine Peptidsequenz von 16 Aminosäuren Länge, die der ersten externen Schleife des Maus-Chemokinrezeptors CCR5 entspricht, in ein vermutlich neutralisierendes Epitop im L1 des bovinen Papillomavirus-Typ 1 (BPV-1) (Ludmerer et al., J. Virol., 70:4791 (1996)) ein. Dieses chimäre L1 lagerte sich zu Partikeln zusammen, die geordnete Anordnungen von Kapsomeren aufwiesen, die als Immunogene zum Stimulieren von humoralen Immunreaktionen gegen das chimäre L1-CCR5-Protein verwendet werden könnten.
  • Mäuse, die mit VLPs immunisiert wurden, die aus chimären L1-CCR5-Proteinuntereinheiten zusammengesetzt wurden, wurden am Leben erhalten, um die Langzeiteffekte der Immunisierung, einschließlich irgendwelcher pathologischen Folgen der Auto-Antikörperproduktion nachzuweisen. Sechs Monate nach der Immunisierung wogen die immunisierten Mäuse das selbe wie die Kontrolltiere und sie erschienen äußerlich gesund. Eine Autopsie der Maus mit den höchsten anti-CCR5-Titern legte keine Hinweise auf eine Autoimmun-Erkrankung offen. Die CCR5-Antikörpertiter in den geimpften Tieren waren anfänglich stabil, sanken dann aber langsam parallel mit den Reaktionen auf L1. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der zelluläre CCR5 die durch chimäres VLP induzierte B-Zell-Reaktion auf das CCR5-Peptid weder aktiviert noch toleriert.
  • Das folgende Beispiel beschreibt, wie Auto-Antikörper, die gegen ein zentrales Selbstantigen gerichtet sind, in einem anderen Säuger als der Maus stimuliert werden können. In dem beispielhaften Fall, der unten veranschaulicht wird, werden eine Zusammensetzung und ein Verfahren zum Induzieren der Produktion von anti-Makaken-CCR5-Antikörpern beschrieben.
  • BEISPIEL 7
  • Stimulierung einer Autoimmun-Reaktion in Makaken
  • Ein rekombinantes Expressionskonstrukt, das ein chimäres L1-CCR5-Protein codiert, das einen Teil der Makaken-CCR5-Polypeptidsequenz einschließt, wurde zuerst im Wesentlichen gemäß der Vorgehensweise, die unter Beispiel 1 dargelegt ist, hergestellt. Das resultierende Expressionskonstrukt wurde in Sf9-Empfängerzellen eingebracht, wo ein Protein, das durch den rekombinanten Vektor codiert wurde, produziert wurde. Kapsomere Strukturen, die sich selbst zusammenlagernde Aggregate von chimärem L1-CCR5-Protein repräsentieren, das in den Empfängerzellen produziert wurde, wurden durch Saccharose-Gradienten- und CsCl-Gradientenzentrifugation aufgereinigt. In einer parallelen Vorgehensweise wurden auch Wildtyp-VLPs, die sich aus Wildtyp-L1-Protein zusammensetzten, hergestellt und für die Verwendung als ein Kontroll-Immunogen aufgereinigt. Das Kontroll-Immunogen enthält nicht die Makaken-CCR5-Polypeptidsequenz, die in der L1-CCR5-Chimäre vorhanden ist. Aufgereinigte Wildtyp-VLPs oder chimäres L1-CCR5, kombiniert mit kapsomeren Adjuvans-Strukturen, ergeben immunogene Kontroll- beziehungsweise Test-Zusammensetzungen. Diese Zusammensetzungen werden getrennt intradermal gemäß einem Standard-Immunisierungsprotokoll wie jenem, das unter Beispiel 3 beschrieben wurde, in Makaken injiziert. In einem Fall wurden den Tieren die immunogenen Zusammensetzungen dreimal in zweiwöchigen Abständen verabreicht. Serumproben, die von den zwei Tieren periodisch von einem Zeitpunkt vor der ersten Immunisierung an genommen wurden, zeigten keinen Hinweis auf CCR5-bindende Antikörper vor der Immunisierung. Serumproben vom Kontrolltier zeigten sogar einige Wochen nach der letzten Verabreichung der immunogenen Wildtyp-L1-VLP-Zusammensetzung keinen Hinweis auf CCR5-bindende Antikörper. Im Gegensatz dazu enthalten Serumproben von dem Tier, dem kapsomere Strukturen, die die L1-CCR5-Chimäre einschlossen, verabreicht wurden, signifikante Spiegel von anti-CCR5-Antikörpern (5). Diese Ergebnisse bestätigten, dass die kapsomeren L1-CCR5-Strukturen die erwünschte Immunogenität aufweisen und dass die Wirkung Antigen-spezifisch ist.
  • Wir haben vor kurzem gezeigt, dass die Zugabe von anderen Papillomavirus-Polypeptiden zu den VLPs als Fusionen des L2-Neben-Kapsidproteins eine starke Zell-vermittelte Immunreaktion gegen diese viralen Peptide und die Produktion von spezifischen Antikörpern gegen das inserierte Peptid induzieren kann (Greenstone et al., Proc Natl Acad Sci USA, 95:1800 (1998); H.L. Greenstone, Ph.D-Dissertation (1998), The John Hopkins University, Baltimore, MD). Sowohl die Induktion von Antikörperreaktionen mit hohem Titer als auch MHC-I-beschränkte CTL-Reaktionen können durch Beimpfen mit einer niedrigen Dosis von VLPs in der Abwesenheit von Adjuvans induziert werden. In Betracht der oben dargelegten Ergebnisse steht die Kapazität von VLPs, potente Immunreaktionen gegen virale Epitope zu induzieren, wahrscheinlich mit ihrer Fähigkeit in Beziehung, mit Zelloberflächen zu interagieren und Epitope als eine geordnete Anordnung einer sich wiederholenden Struktur zu präsentieren.
  • Wir waren erfolgreich im Herstellen von L2-Chimären von viralen Proteinen. Signifikanterweise waren alle Fusionen kompatibel mit der Zusammenlagerung zu Vollgrößen-L1-VLPs, die wirksam als Partikel gewonnen werden konnten (Greenstone et al., Proc Natl Acad Sci USA, 95:1800 (1998)). Große Insertionen in das L2-Protein, die sogar 42 kDa Volllängen-Proteine repräsentierten, waren kompatibel mit der VLP-Zusammenlagerung. Die Fähigkeit des L2, Insertionen dieser Größe zu akzeptieren, wird der Tatsache zugeschrieben, dass L2 nicht zu der strukturellen Integrität des VLP beiträgt und so wesentliche Modifikationen tolerieren kann, ohne die Partikel-Selbstzusammenlagerung zu beeinträchtigen. Während es wahrscheinlich ist, dass L2 eine geordnete Struktur in den VLPs aufweist, ist sein Abstand wahrscheinlich nicht so eng wie der Abstand von L1. Obwohl die Lokalisation von L2 im Papillomavirus-Kapsid nicht definitiv bestimmt worden ist, haben wir einen experimentellen Hinweis, der zeigt, dass L2 an den zwölf Eckpunkten des ikosaedrischen Kapsids lokalisiert ist. Dies würde L2 und jedes darin inserierte Peptid in einem Wiederholungsabstand von ungefähr 300 Ångström platzieren.
  • Da das Papillomavirus-L2-Protein große Insertionen einer fremden Polypeptidsequenz beherbergen und noch immer in virusähnliche Partikel inkorporiert werden kann, können L1/L2-Chimären, die Volllängen-Selbstproteine aufweisen, die an der Stelle von L2 inseriert wurden, hergestellt und als Immunogene verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Zielpolypeptid an die ersten 110 Aminosäuren des BPV-L2-Proteins fusioniert. Dies präsentiert die Insertionssequenz auf dem Kapsid-Äußeren, wenn sie zu L1-VLPs zusammengelagert wird. In der Tat kann dieser Ansatz verwendet werden, um chimäre VLPs herzustellen, die als Immunogene für die Stimulierung der Produktion von Auto-Antikörpern gegen TNF verwendet werden können.
  • Die folgenden zwei Beispiele beschreiben, wie man Maus-TNF-VLPs sowohl als L2-Chimäre als auch als Streptavidin-Fusionen herstellt. Basierend auf der bekannten Atom-Struktur des Proteins (Eck et al., J. Biol. Chem., 264:17595 (1989)) können L1-Chimären auch durch Inserieren der TNF-Peptide, die Epitope einschließen, an die funktionell neutralisierende Antikörper binden, hergestellt werden. Serum von TNF-VLP-geimpften Mäusen können auf die Reaktivität gegen Maus-TNF in einem ELISA-Test und auf die Inhibition von TNF-induzierter Cytolyse von L929-Zellen in vitro getestet werden (Takasaki et al., Nature Biotech, 15:1266 (1997)). Die VLPs, die die TNF-Polypeptidsequenz präsentieren, können auch verwendet werden, um DBA/1-Mäuse zu impfen, die Kollagen-Typ-II-RA haben. Die Wirkung dieser Behandlung auf den Verlauf der Krankheit kann unter Verwendung der Standard-Pfotenschwellung und histologischer Analysen überwacht werden (Thorbecke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:7375 (1992)).
  • Beispiel 8 beschreibt ein Verfahren, das verwendet werden kann, um chimäre L1/L2-Partikel für die Verwendung als Immunogene herzustellen.
  • BEISPIEL 8
  • Chimäre L1/L2-Partikel, um die Produktion von Auto-Antikörpern zu stimulieren
  • Unter Verwendung von Standardtechniken, die Fachleuten auf dem Gebiet des molekularen Clonierens bekannt sein werden, werden genetische Konstrukte, die L2-Maus-TNF-Polypeptid-Chimären codieren, hergestellt und in transfizierten Zellen als chimäre Proteine exprimiert. Die chimären Proteine werden dann zu virusähnlichen L1-Partikeln zusammengelagert, um in chimären L1/L2-VLPs zu resultieren. Die L1/L2-VLPs werden aufgereinigt, mit einem Adjuvans kombiniert und an Testtiere in einem Immunisierungsprotokoll verabreicht. Als Kontrollen werden das chimäre L2-TNF-Protein und lösliches TNF alleine injiziert. Serumproben von den Mäusen, denen die chimäre L1/L2-VLP-Präparation verabreicht wurde, enthalten anti-TNF-Antikörper, die in einem ELISA-Test nachweisbar sind. Im Gegensatz dazu enthalten Serumproben von Kontrolltieren keine anti-TNF-Antikörper. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass chimäre L1/L2-Partikel, die chimäre L2-Proteine einschließen, nützlich sind für die Stimulierung der Produktion von Auto-Antikörpern.
  • Beispiel 9 beschreibt ein Verfahren zum Erzeugen und Verwenden von immunogenen virusähnlichen Partikeln, in denen eine Selbst-Polypeptidsequenz an die Proteine, die das Partikel ausmachen, durch eine Biotinbindung gebunden ist. In diesem Fall werden vorgeformte VLPs biotinyliert und dann mit einem Streptavidinverknüpften Selbst-Peptid in Kontakt gebracht. Diese Manipulation ist möglich, weil Wildtyp-L1-VLPs ziemlich stabil sind, sobald sie gebildet sind.
  • BEISPIEL 9
  • Virusähnliche Partikel, die Selbst-Polypeptide durch eine Biotinbindung inkorporieren
  • Aufgereinigte Wildtyp-L1-VLPs wurden unter Verwendung von Sulfo-NHS-Biotin-Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers (Pierce) biotinyliert. Biotinylierte VLPs wurden vom freien Biotin durch Auftrennung auf einem linearen 24%-54% Saccharosegradienten aufgereinigt. Vorausgehende Experimente zeigten, dass die L1-VLPs stark biotinyliert waren. Diese Beobachtung wies darauf hin, dass es zumindest ein exponiertes Lysin für die Anlagerung von Biotin auf jedem L1 gab. Ein Maus-TNF-α-Polypeptid wurde an die VLPs als ein Streptavidin-Fusionsprotein konjugiert. Streptavidin war im Allgemeinen nützlich für wirksames Anheften irgendeines Polypeptids der Wahl an die biotinylierten VLPs. Die Polypeptidsequenz des Maus-TNF-α-Proteins hatte die Sequenz: Ser-Ser-Gln-Asn-Ser-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Val-Val-Ala-Asn-His-Gln-Val-Glu (SEQ ID NO: 2). Diese Sequenz wurde als eine C-terminale Fusion in den Streptavidin-Expressionsvektor pTSA-18F cloniert. (Sano, T. und Cantor, C.R., Biochem. Biophys. Res. Commun., 176:571–577 (1991)). Die Expression wurde in BL21 (DE3)(pLysS)-Bakterien durchgeführt, die für 3–6 Stunden nach der Induktion mit 0,4 mM IPTG inkubiert wurden. Die Aufreinigung des Proteins von Einschlusskörpern wurde, wie von Sano und Cantor beschrieben, durchgeführt. (Sano, T. und Cantor, C.R., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87:142–146 (1990)). Das Streptavidin-Fusionsprotein wurde mit biotinylierten VLPs in einem 3:1 Gewicht:Gewicht-Verhältnis für 1 Stunde bei Zimmertemperatur umgesetzt. Partikel, die an die Streptavidinfusion konjugiert waren, wurden durch Zentrifugation auf einem linearen 24%–54% Saccharosegradienten aufgereinigt. Präparationen von 5 μg VLPs mit oder ohne angehängtes Streptavidin-gebundenes Selbst-Polypeptid wurden dreimal in zweiwöchigen Abständen in Test- beziehungsweise Kontrollmäuse injiziert. Zwei Wochen nach der letzten Injektion zeigten Serumproben, die von den Tieren genommen wurden, denen die Zusammensetzung verabreicht wurde, die das Selbst-Polypeptid enthielt, Zeichen von anti-Selbst-Polypeptid-Antikörpern. Im Gegensatz dazu wurden in Serumproben von den Kontrolltieren keine entsprechenden Antikörper nachgewiesen.
  • Es ist gut etabliert, dass monoclonale Maus-Antikörper als therapeutische Mittel und als Reagenzien für eine Vielzahl von Basis- und praktischen Untersuchungen nützlich sind. Da jedoch die meisten monoclonalen Antikörper von Maus oder Ratte stammen, fehlen dem derzeit erhältlichen Satz von Antikörpern jene, die spezifisch Maus- oder Ratten-Epitope erkennen, die auf der Oberfläche von zentralen Antigenen in ihrer natürlichen Konformation dargelegt werden. Dieses Fehlen ist limitierend für menschliche Untersuchungen, weil Nager Modelle für die Untersuchung der Säuger-Biologie sind, und hoch konservierte Aminosäuresequenzen des Proteins typischerweise wichtige Funktionen haben, die durch die Evolution konserviert sind. Dementsprechend wird es unter Verwendung der hierin offenbarten Verfahren möglich werden, B-Zell-Reaktionen gegen Selbst-Antigene in ihrer natürlichen Konformation zu stimulieren. Danach wird es möglich sein, Hybridome, die monoclonale Antikörper produzieren, die die erwünschte Bindungsspezifität aufweisen, herzustellen und auf sie zu durchmustern. Insbesondere wird das TNF-VLP, das am wirksamsten in der Herstellung von polyclonalen Antikörpern gegen TNF ist, in einem Versuch, monoclonale Antikörper herzustellen, die spezifisch Maus-TNF erkennen und funktionell inaktivieren, verwendet werden. Das Milzzellen/Myelom-Standard-Fusionsverfahren wird verwendet werden, um die monoclonalen Antikörper-produzierenden Zellen herzustellen (Galfre et al., Nature, 266:550 (1977)).
  • Beispiel 10 beschreibt kurz ein Verfahren, das verwendet werden kann, um monoclonale Maus-Antikörper gegen TNF zu produzieren.
  • BEISPIEL 10
  • Produktion von monoclonalen Antikörpern
  • Mäuse werden zuerst mit virusähnlichen Partikeln, die auf ihrer Oberfläche eine Maus-TNF-Polypeptid präsentieren, das gemäß den oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, immunisiert. Es wird unter Verwendung eines ELISA-Tests etabliert, dass das Serum der Mäuse Antikörper enthält, die spezifisch für natürlichen TNF sind. Die Mäuse werden getötet, und die geernteten Milzzellen werden mit nicht-sezernierenden Myelomzellen fusioniert, um eine Sammlung von Hybridomen zu produzieren. Die Hybridome werden durch Verfahren gescreent, die Fachleuten bekannt sein werden, um jene sezernierenden Antikörper zu identifizieren, die eine Bindungsspezifität für natürlichen TNF haben. Nützliche Mengen der anti-TNF-Antikörper werden dann aufgereinigt.
  • BEISPIEL 11
  • Steigern der Antikörperreaktion auf subdominante virusneutralisierende Epitope
  • Die Impfung mit Papillomavirus-L1- und -L1/L2-VLPs kann hohe Titer (größer als 100 000), aber nur Typ-spezifische neutralisierende Antiseren herstellen (Kirnbauer, R. et al., PNAS, 89:12180–4 (1992); Roden, R. et al., J. Virol., 70:5875–83 (1996)). Im Gegensatz dazu rufen L2 allein oder Fragmente davon nur niedrige Titer von neutralisierenden Antiseren (1000 oder weniger) hervor, aber sie können unter den Papillomavirus-Typen kreuzneutralisierend sein (Roden, R. et al., J. Viro., 68:7570–4 (1994); Kawana, K. et al., J. Virol., 73:6188–90 (1999); Roden, R. et al., Abstract Book, 17th International Papillomavirus Conference, S. 61 (1999)). Um die Titer von kreuzneutralisierenden L2-Antikörpern zu erhöhen, werden L2-Peptide in einer Anordnung mit engen Abständen auf der Oberfläche von VLPs präsentiert. Zum Beispiel wird ein Peptid, das die Aminosäuren 108–120 von HPV16-L2 einschließt, genetisch an den C-Terminus von Streptavidin fusioniert, und das Fusionsprotein wird, wie in Beispiel 9 beschrieben, produziert. Das Streptavidin-L2-Fusionsprotein wird mit biotinylierten VLPs und den konjugierten VLPs umgesetzt, die, wie in Beispiel 9 behandelt, aufgereinigt wurden. Antiseren von mit Streptavidin-L2-konjugierten VLP geimpften Säugern werden unter Verwendung der vorher beschriebenen in vitro-neutralisierenden Tests (Roden, R. et al., J. Virol., 68:7570–4 (1994); Roden, R. et al., Abstract Book, 17th International Papillomavirus Conference, S. 61 (1999)) auf Antikörper getestet, die Papillomavirus-Pseudovirionen kreuzneutralisieren. Hohe Titer von kreuzneutralisierenden Antikörpern werden nachgewiesen.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00630001

Claims (12)

  1. Zusammensetzung zur Toleranzbrechung, umfassend: (a) eine kapsomere Struktur mit einem symmetrischen Aufbau aus Kapsidproteinen; und (b) mindestens ein B-Zell-Epitop eines Tolerogens, das mit der kapsomeren Struktur so verbunden ist, dass eine das Tolerogen präsentierende kapsomere Struktur gebildet wird; wobei die das Tolerogen präsentierende kapsomere Struktur das Tolerogen auf seiner Oberfläche in einer geordneten, sich wiederholenden Anordnung mit einem Abstand von etwa 100 Angström präsentiert.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Kapsidprotein ein Kapsidprotein eines Virus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Papillomavirinae, Polyomavirinae und Parvoviridae ist.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Kapsidprotein ein Papillomavirus-L1-Protein ist.
  4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die kapsomere Struktur ikosaedrisch ist.
  5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Tolerogen mit der kapsomeren Struktur durch einen Linker verbunden ist.
  6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei der Linker Biotin umfasst.
  7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Tolerogen aus der Gruppe bestehend aus einem Peptid, Kohlenhydrat und Lipid ausgewählt ist.
  8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Tolerogen ein Selbstantigen ist.
  9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Tolerogen CCR5 ist.
  10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei Tolerogen Tumornekrosefaktor α (TNF-α) ist.
  11. Arzneimittel umfassend die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
  12. Verwendung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10 für die Herstellung eines Medikaments zur Erzeugung von Antikörpern gegen das Tolerogen.
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