DE69930033T2 - Wasserlösliches Hedgehog-Protein im ionischen Komplex und deren pharmazeutische Verwendung - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung aus einem Polypeptid, die biologisch wirksam ist durch Wechselwirkung mit einem extrazellulären Rezeptor auf der Zellmembran, wobei das Polypeptid in der Zusammensetzung in einem anionischen Komplex mit einer amphiphilen Verbindung vorliegt. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der Zusammensetzung.
  • Die Verwendung amphiphiler Verbindungen als ein Arzneimittelzuführungssystem ist im Stand der Technik allgemein bekannt (vgl. US Patente US-P 5,650,393; US-P 5,688,761; US-P 5,665,328; US-P 5,124,081; US-P 5,109,038). Die Bildung von Komplexen in der Form von Mizellen zwischen oberflächenaktiven Substanzen und pharmazeutischen Mitteln ist z.B. ebenfalls bekannt zur Verbesserung der Transdermal- und Transmembranpenetration des aktiven Mittels (Tomlinson und Davis, J. Colloid. Interf., Sci. 74 (1980) 349). Es ist ebenfalls bekannt, dass pharmazeutische Mittel üblicherweise bessere Transporteigenschaften durch biologische Membranen in ihrer nichtionisierten Form aufweisen als im ionisierten Zustand (Cools und Jansen, J. Pharm. Pharmacol. 35 (1983) 689–691). Es ist ebenfalls bekannt, dass Peptide, die in mehrfach ionisierter Form unter physiologischen pH-Werten vorliegen, ebenfalls nicht optimal sind für den Transport zur Wirkungsstelle (Arzneimittelzuführung), da geladene Moleküle und im Besonderen Polypeptide, eine geringe Löslichkeit in Lipiden aufweisen (Hirai et al., Int. J. Pharm. 7 (1991) 317–325). Es ist bekannt aus Okada et al., J. Pharm. Sci. 72 (1993) 75–78, dass es vorteilhaft ist ein lipophiles Gegenion an den ionischen Teil des Mittels zu binden und dadurch die Wechselwirkung mit der biologischen Membran zu verbessern, um Transport von Proteinen durch Intestinalmembranen zu erleichtern. Zum Beispiel beschreiben Hazzenga und Berner ein verbessertes Verfahren für den Transdermaltransport von zwitterionischen aktiven Mitteln in J. Controlled Release 16 (1991) 77–88.
  • Andere Verfahren zum Verbessern der Wechselwirkung von Mitteln mit biologischen Membranen sind z.B. beschrieben von Lee et al., Critical Rev. Therp. Drug Carrier Systems 8 (1991) 91–192, Morimoto et al., Arch. Int. Pharmacodyn. 302 (1989) 18–26 und Aungst, Int. J. Pharm. 33 (1986) 225–234. Jedoch war in allen diesen Verfahren das Ziel die Verbesserung der Hydrophobizität des aktiven Mittels bzw. Wirkstoffs, um seine Penetration durch biologische Membranen, wie etwa Haut, zu verbessern und das Mittel in die Zelle zuzuführen. Die oberflächenaktiven Substanzen wurden hierfür in einer Konzentration verwendet, die über der kritischen Mizellenkonzentration war (CMC,. Womack et al., Biochim. Biophys. Acta 733 (1983) 210). Ein Nachteil solcher Verfahren ist, dass die hohen Konzentrationen der oberflächenaktiven Substanzen, die verwendet werden, einen massiven Einfluss auf die Zellmembran haben und sie beschädigen können.
  • Aus WO 94/08599 ist bekannt, dass eine homogene Lösung eines aktiven Mittels hergestellt werden kann zur Herstellung von Träger-gebundenen aktiven Mitteln durch Zugabe einer geeigneten Menge eines anionischen Detergenz, um ein Präzipitat zu bilden, Isolieren des Präzipitats und erneutes Lösen in einem organischen Lösungsmittel. Diese homogene Lösung, die einen Komplex zwischen dem anionischen Detergenz und dem aktiven Mittel enthält, kann dann verwendet werden, um das aktive Mittel in einer festen Matrix einzubetten oder zu verteilen. Zusätzlich führt WO 94/08559 an, dass ein Komplex des Proteins mit einem anionischen Detergenz gebildet werden kann und das aktive Mittel von ihm zur kontrollierten Freisetzung eines Proteins freigesetzt werden kann.
  • Es ist bekannt, dass die Aktivität von Proteinen verbessert werden kann durch kovalentes Koppeln an hydrophobe Verbindungen, wie etwa Fettsäuren oder Steroide. Jedoch sind solche Verfahren kompliziert und führen zu inhomogenen Produkten, aufgrund der chemischen Kopplungsreaktion (vgl. in diesem Zusammenhang Ekrami, H. M. et al., FEBS Letters 371 (1995) 283–286; Pepinski, R. B. et al., J. Biol. Chem. 273 (1998) 14037–14045).
  • Der Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung von Zusammensetzungen pharmazeutisch effektiver bzw. wirksamer Polypeptide, die die Aktivität eines darin enthaltenen Polypeptids verbessern.
  • Das Ziel wird erreicht durch ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung als eine wässrige klare Lösung zur lokalen Anwendung bei Menschen durch Aufbauen einer ionischen Wechselwirkung und als eine wesentliche Komponente eines Komplexes aus einem pharmazeutisch wirksamen Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hedgehog-Proteinen, morphogenetischen Knochenproteinen, Wachstumfaktoren, Erythropoietin, Thrombopoietin, G-CSF, Interleukinen und Interferonen, und einer amphiphilen Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem anionischen, zwitterionischen oder kationischen hydrophoben oberflächenaktiven Mittel, einer Fettsäure, einem Alkylsulfonat, einem Phosphatidylserin oder einem Phosphatidat, wobei in der Zusammensetzung die Hilfsverbindung in einer Konzentration vorliegt, die die Wasserlöslichkeit des Polypeptids nicht verstärkt, worin die Zusammensetzung einen pH-Wert aufweist, der sich um mindestens eine halbe pH-Wert-Einheit von den pK-Werten des Polypeptids und der amphiphilen Verbindung unterscheidet, und worin die Molekülstruktur des Polypeptids in ihrem natürlichen aktiven Zustand erhalten bleibt und daher die Aktivität des Polypeptids nicht verringert wird.
  • Die Zusammensetzung enthält kein organisches Lösungsmittel. Für Aufbewahrungszwecke kann die Zusammensetzung lyophylisiert werden.
  • In der Erfindung sind das Polypeptid und die amphiphile Verbindung für sich löslich bei Konzentrationen, die in wässrigen, vorzugsweise gepufferten Lösungen verwendet werden, und es ist nur die Kombination der beiden Substanzen, die zur Bildung eines Komplexes mittels ionischer Wechselwirkungen führt, welcher das Polypeptid hydrophobisiert und daher seine Wasserlöslichkeit verschlechtert oder zumindest nicht verbessert. Es zeigte sich überraschenderweise, dass auf diese Art die Aktivität solcher Polypeptide wesentlich verbessert werden kann.
  • Gemäß der Erfindung werden die Menge und das Verhältnis der amphiphilen Verbindung und des Polypeptids vorzugsweise auf eine solche Art ausgewählt, dass die wässrige Zusammensetzung, die den ionischen Komplex enthält, eine klare Lösung ist. Wenn die Komplexbildung zwischen dem Polypeptid und der amphiphilen Verbindung zu Trübung führt, wird die Lösung filtriert, um eine trübungsfreie Lösung zu ergeben, wenn die Zusammensetzung direkt als eine Lösung zur Verabreichung an einen Patienten verwendet wird. Wenn die Zusammensetzung auf einem Träger vor der Verabreichung an den Patienten immobilisiert werden wird, muss die Trübung nicht vermieden werden.
  • Das pharmazeutisch wirksame Polypeptid ist ein Polypeptid, das in einer ionischen Form vorliegen kann, und das erkannt und gebunden wird durch einen Zelloberflächenrezeptor (extrazellulärer Rezeptor), um seine biologische Aktivität zu entwickeln. Solche Polypeptide sind Wachstumsfaktoren (z.B. NGF, TGF-β, FGF, GDF, Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren), Erythropoietin, Thrombopoietin, G-CSF, Interferone, wie etwa Interferon-α2b, Interleukine, wie etwa Interleukin-2 oder Interleukin-12, morphogenetische Knochenproteine, wie etwa BMP-2 oder Hedgehog-Proteine, wie etwa Sonic-, Indian- oder Desert-Hedgehog-Proteine. Besonders bevorzugt sind Hedgehog-Proteine. Als Polypeptide werden vorzugsweise solche verwendet, die eine Aktivität (therapeutische Wirkung und/oder Proteinaktivität in vitro) aufweisen, die vorzugsweise um das 10-fache oder mehr in dem Komplex gemäß der Erfindung, verglichen mit der unkomplexierten Form, erhöht wird. Die ionische Form des Polypeptids kann erhalten werden indem es in einer Umgebung vorliegt, die vorteilhafterweise sich um mindestens 0,5 pH-Wert-Einheiten von seinem pK-Wert unterscheidet.
  • Die amphiphile Verbindung gemäß der Erfindung versteht sich als ein anionisches, zwitterionisches oder kationisches hydrophobes oberflächenaktives Mittel, eine Fettsäure, ein Alkylsulfonat oder ein Lipid. Bevorzugte anionische oberflächenaktive Mittel sind anionische Detergenzien, wie etwa Steroidtenside, wie z.B. Deoxycholate, Cholate, Taurocholate, Taurodeoxcholate, Dehydrocholate (geeignet für kationische Polypeptide); bevorzugte zwitterionische oberflächenaktive Mittel sind CHAPS (3[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfat) und Zwittergent® (N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat); und bevorzugte kationische Detergenzien sind Cetyltrimethylammoniumbromid oder Dodecylammoniumchlorid (geeignet für anionische Polypeptide); bevorzugte Fettsäuren sind Fettsäuren, wie etwa Palmitinsäure (geeignet für kationische Polypeptide). Bevorzugte Alkylsulfate sind Alkylsulfonate, wie etwa Decylsulfonat (geeignet für kationische Polypeptide); und bevorzugte Lipide sind Lipide, wie etwa Phosphatidylserin (geeignet für anionische Polypeptide) und Phosphatidat (geeignet für kationische Polypeptide).
  • Die amphiphile Verbindung wird zu der Zusammensetzung unter Bedingungen gegeben, die das Polypeptid hydrophobisieren und daher die Wasserlöslichkeit des Polypeptids verringern oder zumindest nicht verbessern. Es ist wichtig, dass gemäß der Erfindung ein wasserlöslicher ionischer Komplex zwischen dem Polypeptid und der amphiphilen Verbindung in diesem Verfahren gebildet wird. Das Verhältnis von Polypeptid zu amphiphiler Verbindung im Komplex hängt von dem pH-Wert, der verwendet wird, und den pK-Werten der beiden Substanzen und dem Konzentrationsverhältnis ab. Vorzugsweise wird ein pH-Wert verwendet, der sich um mindestens eine halbe pH-Wert-Einheit von den pK-Werten des Polypeptids und der Hilfssubstanz unterscheidet. Umso mehr amphiphile Verbindung zugegeben wird, umso mehr amphiphile Verbindung bindet an das Polypeptid und umso hydrophober wird der Komplex. Dies kann zur Präzipitation des Komplexes führen und demzufolge zum Vorliegen von einem Gemisch aus löslichem und unlöslichem Komplex, welches nicht mehr vollständig wasserlöslich ist. Die Zugabe eines nichtionischen Detergenz, wie etwa eines Polyoxamers, wie etwa Tween®, kann jedoch zumindest teilweise die Wasserlöslichkeit des Komplexes wieder aufbauen, oder die Zusammensetzung kann, falls erforderlich, filtriert werden. In diesem Falle kann das nichtionische Detergenz ebenfalls in Konzentrationen vorliegen, welche zu Mizellenbildung führen. Es ist festzuhalten, dass der Typ und die Konzentration der amphiphilen Verbindung so ausgewählt werden, dass, insbesondere bei Proteinen, wie etwa einem Polypeptid, die molekulare Struktur des Polypeptids in seiner natürlichen aktiven Form beibehalten wird und daher die Aktivität des Polypeptids nicht verringert wird. Üblicherweise ist ein 10-facher molarer Überschuss amphiphiler Verbindungen ausreichend für diesen Zweck. Vorzugsweise werden bei einer Proteinmenge von 5 μg Protein pro ml 0,001 bis 0,05% (Gewicht pro Volumen) amphiphile Verbindung zugegeben.
  • Wenn ein denaturierendes oberflächenaktives Mittel, wie etwa Natriumdodecylsulfat (SDS) z.B. gemäß der Erfindung verwendet wird, kann diese Verbindung nur in geringer Konzentration verwendet werden. Es ist bekannt, dass SDS Proteine in hohen Konzentrationen denaturiert, was die Wasserlöslichkeit dieser Proteine erhöht, jedoch in einer denaturierten, inaktiven Form. Solche amphiphilen Verbindungen, wie etwa SDS, können auch Mizellen in höheren Konzentrationen zusätzlich zu den gewünschten Komplexen gemäß der Erfindung bilden, welche umgekehrt die Löslichkeit des Polypeptids erhöhen. Ob die amphiphile Verbindung eine ungewünschte Denaturierung des Polypeptids hervorruft, kann leicht bestimmt werden durch Verfahren, die dem Fachmann in der Technik bekannt sind. Solche Verfahren sind z.B. Aktivitätsbestimmungs- oder physiochemische Verfahren zum Überprüfen der Struktur, wie etwa IR, CD und Fluoreszenzspektroskopie.
  • Eine wässrige, wasserlösliche pharmazeutische Zusammensetzung im Sinne der Erfindung ist zu verstehen als eine Zusammensetzung, die im Wesentlichen keine unlöslichen Teilchen umfasst, die das pharmazeutisch effektive Polypeptid enthalten. Im Besonderen ist eine wässrige pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung als eine Zusammensetzung zu verstehen, die keine sichtbare Trübung aufweist. Solche löslichen Zusammensetzungen sind möglich, wenn der ionische Komplex gemäß der Erfindung vollständig wasserlöslich ist bei den verwendeten Konzentrationen von Polypeptid und oberflächenaktivem Mittel, oder ungelöster Komplex durch Filtration entfernt wird. Gemäß der Erfindung enthält die wässrige Zusammensetzung keine zusätzlichen organischen Lösungsmittel. Darüber hinaus kann es zur Herstellung der Zusammensetzungen erforderlich sein, solche amphiphile Verbindungen, wie etwa Fettsäuren, in einer kleinen Menge organischen Lösungsmittel zu lösen (bis zu 5%, vorzugsweise bis zu 1% des Volumens der Zusammensetzung).
  • Ein zusätzlicher Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Herstellen einer wässrigen pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass ein pharmazeutisch wirksames Polypeptid und eine amphiphile Verbindung, die die Wasserlöslichkeit des pharmazeutisch wirksamen Polypeptids verschlechtert oder zumindest nicht verbessert, kombiniert werden, in einem solchen Konzentrationsverhältnis und bei einem solchen pH-Wert, dass sich ein ionischer Komplex zwischen dem Polypeptid und der Hilfssubstanz durch ionische Wechselwirkung bildet.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung für eine systemische oder lokale Verabreichung an den Körper von Menschen oder Säugern.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Hedgehog-Protein in der pharmazeutischen Zusammensetzung als das pharmazeutisch wirksame Polypeptid verwendet. Es ist bekannt, dass die Aktivität von Hedgehog-Proteinen verbessert werden kann durch kovalente hydrophobe Modifikation (Europäische Patentanmeldung Nr. 99108032.6).
  • Gemäß der Erfindung hat es sich überraschenderweise erwiesen, dass die Aktivität von Hedgehog-Proteinen zu einem beachtlichen Ausmaß erhöht werden kann durch Bilden eines ionischen Komplexes zwischen einem Hedgehog-Protein und einer amphiphilen Verbindung. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Erhöhung der Aktivität des Hedgehog-Proteins (verglichen mit einem rekombinanten Hedgehog-Protein, das durch E. coli produziert wird) um das 10-fache oder mehr erhalten.
  • Folglich ist ein bevorzugter Hauptgegenstand der Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Komplex aus einem Hedgehog-Protein und einer amphiphilen Verbindung, gebildet durch ionische Wechselwirkungen, enthält, worin die Verbindung in einer Konzentration vorliegt, die die Löslichkeit des Hedgehog-Proteins verschlechtert oder zumindest nicht verbessert.
  • Hedgehog (hh)-Proteine sind als eine Familie von sezernierten Signalproteinen zu verstehen, die verantwortlich sind für die Bildung zahlreicher Strukturen in der Embyrogenese (J. C. Smith, Cell 76 (1994) 193–196, N. Perrimon, Cell 80 (1995) 517–520, C. Chiang et al., Nature 83 (1996) 407, M. J. Bitgood et al., Curr. Biol. 6 (1996) 296, A. Vortkamp et al., Science 273 (1996) 613, C. J. Lai et al., Development 121 (1995) 2349). Während seiner Biosynthese werden eine N-terminale 20 kD-Domäne und eine C-terminale 25 kD-Domäne erhalten nach Abspaltung der Signalsequenz und autokatalytische Spaltung. In seiner natürlichen Form ist die N-terminale Domäne modifiziert mit Cholesterol und Palmitoyl (J. A. Porter et al., Science 274 (1996) 255–259 und Pepinski et al., J. Biol. Chem. 273 (1998) 14037–14045). In höheren Lebensformen ist die hh-Familie aufgebaut aus mindestens drei Mitgliedern, nämlich Sonic-, Indian- und Desert-hh (Shh, Ihh, Dhh; M. Fietz et al., Development (Suppl.) (1994) 43–51). Unterschiede in der Aktivität von Hedgehog-Proteinen, die rekombinant produziert werden, wurden beobachtet nach Produktion in Prokaryonten und Eukaryonten (M. Hynes et al., Neuron 15 (1995) 35–44 und T. Nakamura et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 237 (1997) 465–469).
  • Sonic-, Indian- oder Desert-hh werden besonders bevorzugt verwendet (Fietz M. et al., Development (Suppl.) (1994) 43–51). Ein hh-Protein mit einer Sequenz, die in der EMBL-Datenbank unter der Nummer L38518 beschrieben ist, wird vorzugsweise verwendet. Proteine der Hedgehog-Familie haben eine ausgesprochene Homologie in ihrer Aminosäuresequenz, weshalb sie ebenfalls bevorzugt ist zum Exprimieren dieser Nukleinsäuren, die für Hedgehog-Proteine codieren, die 80% oder mehr Homologe aufweisen, zu der oben genannten Sequenz von Sonic-Hedgehog-Protein. Hedgehog-Proteine werden vorzugsweise so verwendet wie sie z.B. beschrieben sind in der Internationalen Anmeldung Nr. WO 99/28454 und in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 99108032.6.
  • Das humane Sonic-Hedgehog-Vorläufprotein besteht aus den Aminosäuren 1–462 der Sequenz, die in der EMBL-Datenbank unter Nr. L38518 beschrieben ist. Die Aminosäuren 1–23 stellen das Signalpeptid dar, die Aminosäuren 24–197 stellen die reife Signaldomäne dar, die Aminosäuren 32–197 stellen die Signaldomäne dar, die um acht Aminosäuren gekürzt ist, und die Aminosäuren 198–462 stellen die autoprozessierte C-terminale Domäne nach autoproteolytischer Spaltung dar.
  • Die pharmazeutische Wirkung des Hedgehog-Proteins versteht sich vorzugsweise als eine neurologische Wirkung auf Nervenzellen, vorzugsweise Osteogenese und/oder Osteoinduktion und im Besonderen vorzugsweise Chondrogenese und/oder Chondroinduktion, wie beschrieben in Kinto et al., FEBS Letters, 404 (1997) 319–323 für Knocheninduktion, von Miao et al. in J. Neurosci. 17 (1997) 5891–5899 für die Wirkung auf Nervenzellen von Stott et al. in J. Cell Sci. 110 (1997) 2691–2701 für Knorpelzellinduktion.
  • Lösungen der Hedgehog-Proteine mit hohen Konzentrationen sind erforderlich, um Trägermatrizes herzustellen, die beschichtet sind oder eingebettet sind in die Komplexe gemäß der Erfindung, auf eine solche Art, dass sie eine geeignete pharmazeutische Wirkung für eine lokale Anwendung haben. Es hat sich gezeigt, dass Träger, die pharmazeutisch verwendet werden können, vorzugsweise eine Konzentration des Hedgehog-Proteins von 0,1 bis 10 mg/ml Träger und mehr aufweisen sollten. Hedgehog-Proteine sind an sich schlecht löslich. Es hat sich jedoch überraschenderweise gezeigt, dass die Löslichkeit von Hedgehog-Proteinen drastisch erhöht wird und die Stabilität von hh-Proteinen verbessert wird bei niederen Konzentrationen (< 1 mg/ml oder weniger) in Lösungen, die Arginin oder Argininiumionen enthalten. Es ist daher bevorzugt, Arginin oder Argininiumionen zu der wässrigen Lösung und zu dem Träger-gebundenen Komplex zu geben.
  • Die Aktivität des Hedgehog-Proteins im Sinne der Erfindung versteht sich als die Aktivität von alkalischer Phosphatase (Stimulation der Expression von alkalischer Phosphatase), welche das Polypeptid in Säugerzellen stimulieren kann (Aktivität in dem alkalische Phosphatase-Test). In diesem Verfahren wird eine Mausfibroblastenzelllinie kultiviert in einem Medium, das fötales Kalbserum enthält. Anschließend wird steril filtrierte Probe zugegeben, die Zellen werden nach ca. 5 Tagen lysiert und alkalische Phosphatase wird in dem Zelllysat mittels der Abspaltung eines chromogenen Substrats bestimmt (pNP, p-Nitrophenol) (J. Asahina, Exp. Cell. Res. 222 (1996) 38–47 und T. Nakamura (1997)).
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung enthält eine pharmakologisch wirksame Dosis des hh-Proteins und kann systemisch oder vorzugsweise lokal verabreicht werden. Es ist bevorzugt, die Proteine gemäß der Erfindung in Kombination mit anderen Proteinen der Hedgehog-Familie oder Knochenwachstumsfaktoren, wie etwa morphogenetischen Knochenproteinen, (BMPs) (Wozney et al., Cell. Mol. Biol. of Bone, Bone Morphogenetic Proteins and their Gene Expression (1993) Academic Press Inc., 131–167) oder Parathyroidhormonen (Karablis et al., Genes and Development 8 (1994) 277–289) oder Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF-I oder II) oder der Familie transformierender Wachstumsfaktoren (TGF-β, GDF) zu verwenden. Diese anderen Proteine können auch, müssen jedoch nicht, in den Komplexen gemäß der Erfindung vorliegen.
  • Folglich ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer vorzugsweise wasserlöslichen pharmazeutischen Zusammensetzung eines Hedgehog-Proteins durch Vereinigen des Hedgehog-Proteins mit einer amphiphilen Verbindung, unter Bedingungen, welche die Bildung eines ionischen Komplexes zwischen dem Hedgehog-Protein und der amphiphilen Verbindung erlauben.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines solchen Komplexes eines Hedgehog-Proteins gemäß der Erfindung zum Herstellen einer pharmazeutischen Zusammensetzung, worin der Komplex als eine wesentliche Komponente der Zusammensetzung verwendet wird, und optional kombiniert wird mit geeigneten zusätzlichen pharmazeutischen Hilfssubstanzen, vorzugsweise in einer gepufferten wässrigen Lösung. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt der Hedgehog-Komplex gemäß der Erfindung in einem Gemisch aus einer gelösten und präzipitierten Form oder nur in einer präzipitierten Form vor, welche eine verzögerte Freisetzung des Hedgehog-Proteins oder eine lokale Anwendung an der Wirkungsstelle in vivo ermöglicht. Die Freisetzung des Proteins an der Wirkungsstelle ist aus diesem Gemisch langsamer als aus einer vollständig gelösten pharmazeutischen Formulierung.
  • Darüber hinaus ist es für die Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung bevorzugt, Hilfssubstanzen, wie etwa Natriumchlorid, Zucker (Mannitol, Sucrose, Lactose, Glucose, Saccharose, Trehalose, vorzugsweise 20–100 mg/ml) oder Aminosäuren, wie etwa Glycin oder Arginin, Methionin, Cystein als auch Antioxidationsmittel, wie etwa EDTA, Citrat, Thioglycerol, Acetylcystein, Polyethylenglykol (1–10% bezüglich des Gewichts), entzündungshemmende Mittel, Lokalanästhetika, Antibiotika und/oder Stabilisierungsmittel zuzugeben.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist eine pharmazeutische Zusammensetzung des Hedgehog-Proteins gemäß der Erfindung, die Suramin enthält, bevorzugt, und diese kann vorteilhaft verwendet werden.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung kann zusätzlich pharmazeutische Hilfssubstanzen enthalten und ist vorzugsweise lyophylisiert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die pharmazeutische Zusammensetzung Hedgehog-Protein in einer Konzentration von 0,1–10 mg/ml, vorzugsweise 0,1–5 mg/ml.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die pharmazeutische Zusammensetzung zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Puffer, der biokompatibel ist, vorzugsweise in einem Bereich zwischen pH-Wert 4 und pH-Wert 10, besonders bevorzugt in einem Bereich zwischen pH-Wert 6 und 8. Die Konzentration des Puffers ist vorzugsweise 10–500 mmol/l, bevorzugter 10–100 mmol/l. Es ist angebracht, die Salzkonzentrationen so auszuwählen, dass sie die Komplexbildung aufgrund zu hoher Ionenstärke nicht stört
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung enthält die pharmazeutische Zusammensetzung den Komplex gemäß der Erfindung eingebettet in einen Träger, der biokompatibel ist, und kann z.B. als ein Implantat verwendet werden. Der Träger ist vorzugsweise ein Polymer, das
    • – nicht das Hedgehog-Protein denaturiert, wenn es in dem Träger eingebettet ist,
    • – ein mittleres Molekulargewicht von mindestens 10.000 Da aufweist.
  • Solche Polymere sind z.B. Hyaluronsäure, Kollagen, Alginat oder organische Polymere, wie etwa PLGA (Copolymere von Polymilchsäure und Glykolsäure) oder Derivate davon. Wenn der Komplex in einem Träger eingebettet ist, ist es nicht notwendig, dass der Komplex vollständig löslich ist in einer Lösung, die geeignet ist für die wässrige pharmazeutische Zusammensetzung, die oben beschrieben ist. Wenn der Träger-gebundene Komplex lokal in dem Körper angewendet wird, vorzugsweise als ein Komplex von Hedgehog-Polypeptid in Knochen oder Knorpel, wird er langsam freigesetzt in löslicher Form aus dem Komplex, wobei seine gewünschte biologische Wirkung erzeugt wird.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Anwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung, die immobilisiert ist auf (reversibel gebunden) einem biokompatiblen Träger, für lokale Anwendung auf den menschlichen Körper oder Lebewesen. Solche biokompatible Träger sind z.B. Hyaluronsäure, Collagen, Alginat oder organische Polymere, wie etwa PLGA oder Derivate davon.
  • Der Komplex gemäß der Erfindung ist vorzugsweise lokalisiert auf einem biokompatiblen Träger, worin der Träger den Komplex lokal in vivo in einer aktiven Form freisetzen kann. Solche Formulierungen sind besonders geeignet für die Reparatur von Knochen- und Knorpelschäden, können jedoch auch verwendet werden, um neuronale Defekte zu reparieren oder für eine systemische Zuführung.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung enthält vorzugsweise ein Polymer, das im Wesentlichen als eine Struktursubstanz wirkt, welche vorzugsweise auch eine Adhäsionsfunktion für Zellen hat. Eine solche Struktursubstanz ist z.B. Kollagen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung verwendet, um systemische Nebenwirkungen außerhalb der gewünschten Wirkungsstelle zu reduzieren bei lokaler Verabreichung. Die lokale Verabreichung eines pharmazeutisch wirksamen Polypeptids, das nicht vollständig immobilisiert ist oder keine extrem kurze lokale Halbwertszeit aufweist, kann zum Verteilen des Polypeptids oder mindestens eines Teils davon über die gewünschte Wirkungsstelle hinaus führen, wobei es zu unerwünschten systemischen Wirkungen führt. Diese unerwünschten systemischen Wirkungen können beachtlich verringert oder sogar vermieden werden durch die Erfindung. Das Verfahren ist geeignet für Polypeptide, welche eine 10-fache oder noch mehr erhöhte Aktivität in dem ionischen Komplex aufweisen, im Vergleich mit der unkomplexierten Form, worin der Komplex eine geringere Löslichkeit in einer gepufferten wässrigen Lösung aufweist als das unkomplexierte Polypeptid. Solche Polypeptide sind vorzugsweise Hedgehog-Proteine, Cytokine und Wachstumsfaktoren, wie etwa NGF.
  • Gemäß der Erfindung wird ein ionischer Komplex des Polypeptids und der amphiphilen Verbindung vorzugsweise lokal in diesem Verfahren angewendet, in einer solchen Menge, dass das Polypeptid eine Aktivität in dem Komplex zeigt, die seiner therapeutischen Dosis (wirksame Dosis) in vivo entspricht. Die Menge des Komplexes muss so ausgewählt sein, dass, wenn der Komplex dissoziiert, was z.B. auftritt, wenn er auf das 10- bis 20-fache unter physiologischen Bedingungen, z.B. in Blut, verdünnt wird, die Aktivität des Polypeptids dann nur 20% oder weniger der therapeutischen Dosis ist. Daher zeigt in solch einer lokalen Anwendung des Komplexes gemäß der Erfindung das pharmazeutisch wirksame Polypeptid seine volle therapeutische Wirkung, wie etwa lokales Knochenwachstum an der gewünschten Wirkungsstelle, wenn das Polypeptid ein Knochenwachstumsfaktor ist, wie etwa eine cytostatische oder Apoptoseinduzierende Wirkung, wenn das Polypeptid ein tumorizides Mittel ist. Wenn der Komplex sich von der Wirkungsstelle aus verteilt, wird der Komplex unter den physiologischen Bedingungen, die außerhalb der Wirkungsstelle vorherrschen, verdünnt, was zu Dissoziation führt. Dies führt zu einer Abnahme der Konzentration des komplexierten Polypeptids und einer Erhöhung der Konzentration von nichtkomplexiertem Polypeptid. Da die Aktivität des nichtkomplexierten Polypeptids beachtlich geringer ist als die des komplexierten Polypeptids, wird seine therapeutische Wirkung außerhalb der Wirkungsstelle ebenfalls verringert.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung für lokale Anwendung bei Menschen, dadurch gekennzeichnet, dass der Komplex in einer solchen Menge verabreicht wird, dass das komplexierte Polypeptid eine Aktivität zeigt, die seiner therapeutischen Dosis entspricht, wobei die gleiche Menge Polypeptid in einer unkomplexierten Form eine Aktivität von 20% oder weniger der therapeutischen Dosis zeigen würde.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur lokalen Verabreichung an Menschen, dadurch gekennzeichnet, dass ein Komplex eines pharmazeutisch wirksamen Polypeptids und einer amphiphilen Verbindung, gebildet durch ionische Wechselwirkung, verwendet wird als eine wesentliche Komponente, worin die Verbindung in einer Konzentration vorliegt, die die Wasserlöslichkeit des pharmazeutisch wirksamen Polypeptids verschlechtert, und der Komplex in einer Menge verabreicht wird, worin das komplexierte Polypeptid eine Aktivität zeigt, die seiner therapeutischen Dosis entspricht, während die gleiche Menge Polypeptid in einer unkomplexierten Form eine Aktivität von 20% oder weniger der therapeutischen Dosis zeigen würde.
  • Die folgenden Beispiele, Veröffentlichungen und die Figuren erklären die Erfindung, deren Schutzbereich sich aus den Patentansprüchen ergibt, noch weiter. Die beschriebenen Verfahren verstehen sich als Beispiele, welche selbst nach Modifikationen immer noch den Gegenstand der Erfindung beschreiben.
  • 1 zeigt die Abhängigkeit der Induktion von alkalischer Phosphatase in einem Zelltest durch shh bei erhöhenden Konzentrationen von Deoxycholat.
  • 2 zeigt die Abhängigkeit der Aggregatbildung von der Konzentration von Deoxycholat.
  • Beispiel 1
  • Analyse der Aktivität verschiedener Hedgehog-Formulierungen in einem Zelltest:
  • Induktion von alkalischer Phosphatase
  • 5000 Zellen der Mesenchymalplutipotentlinie aus Maus C3H10T1/2 (ATCC CCL-226) werden in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen ausgesät. Die Zellen sind in DMEM, 2 mM Glutamin, 100 IU Penicillin/ml, 100 μg Streptomycin/ml und 10% fötalem Kalbserum. Am nächsten Tag wird das Medium ersetzt durch ein Medium, das humanes shh (0, 5 oder 50 μg/ml) in verschiedenen Formulierungen (0, 0,00016, 0,00052, 0,0013, 0,0019 oder 0,01% Natriumdeoxycholat) enthält oder die verschiedenen Hedgehog-Formulierungen werden direkt zugegeben. Der Test wird nach 5 Tagen gestoppt. Hierzu werden die Überstände dekantiert und die Zellen werden einmal mit PBS gewaschen. Die Zellen werden in 50 μl 0,1% Triton® X-100 lysiert und bei –20°C gefroren. Nach Auftauen werden 25 μl Aliquote zur Proteinbestimmung und zum Bestimmen der Aktivität alkalischer Phosphatase verwendet.
  • Proteinbestimmung gemäß den Anweisungen des Herstellers Pierce:
  • 75 μl redestilliertes H2O werden zu dem Gemisch gegeben, dann werden 100 μl BCA-Proteinreagenz (Pierce Micro BCA, Nr. 23225) zugegeben. Die Absorption wird bei 550 nm nach 60 min gemessen.
  • Bestimmen der alkalische Phosphatase-Aktivität gemäß den Anweisungen des Herstellers Sigma:
  • 100 μl Reaktionspuffer (Sigma 221) werden zu dem Gemisch gegeben. Eine Substratkapsel (Sigma 104-40) wird in 10 ml H2O gelöst, dann werden 100 μl mit einer Pipette zu dem Testgemisch gegeben. Die Absorption wird bei 405 nm gemessen. Während der Reaktion wandelt alkalische Phosphatase p-Nitrophenylphosphat in p-Nitrophenol (pNP) um. Die gemessenen Absorptionen werden in nmol pNP mittels Standardkurven übergeführt.
  • Die Aktivitäten verschiedener Hedgehog-Formulierungen in nmol pNP/min/mg Protein sind in 1 aufgetragen. Diese zeigt, dass bei den gleichen Proteinkonzentrationen die Aktivitäten der untersuchten Hedgehog-Formulierungen beachtlich mit zunehmenden Deoxycholatkonzentrationen anstiegen.
  • Beispiel 2
  • Hydrophobe Ionenpaartitration von hshh (Dimer)
  • Rekombinantes humanes Sonic-Hedgehog-Protein (Dimer, 0,8 mg/ml in 50 mM Tris-Cl, pH-Wert 7,4 oder in 0,1% Tween 80, 50 mM Tris-Cl, pH-Wert 7,4) wird mit ansteigenden Konzentrationen Natriumdeoxycholat gemischt. Die Absorption bei 360 nm wird als ein Indikator für die Trübung (Bildung von wasserunlöslichen Aggregaten, die aus ionischen Protein-Detergenz-Komplexen bestehen) gemessen. Aus 2 wird deutlich, dass der Übergang in wasserunlösliche Aggregate über 0,04% Na-Deoxycholat auftritt. Die Bildung wasserunlöslicher Aggregate kann weitgehend verhindert werden in der Gegenwart von 0,1% Tween 80. Die angegebenen Absorptionen sind hinsichtlich Verdünnung nicht korrigiert.
  • Beispiel 3
  • Analyse von NGF-Formulierungen in einer Bioaktivitätsuntersuchung: Spinalganglionneuronenentwicklungs-Untersuchung
  • NGF-Bioaktivität wurde bestimmt durch morphometrische Analyse von Spinalganglion („DRG")-Neuronen, die sich in vitro entwickeln. Kurz dargestellt, wurden Lumbal-DRGs aus E7–E8 Hühnerembyronen herausgeschnitten, von umgebendem Bindegewebe befreit und voneinander gelöst durch Trituration durch eine feuerpolierte Pasteur-Pipette, nachfolgend auf Verdau mit 0,1% Trypsin, für 20 min bei 37°C. Verunreinigende Zellen, wie etwa Fibroblasten, wurden durch Vorplattieren des gesamten Zellpräparats auf Kunststoffgewebekulturplatten für 2 h entfernt. Unter diesen Bedingungen binden Neuronen nicht an das Substrat, während Fibroblasten und andere nichtneuronale Zellen an den Gewebekulturkunststoff anhaften. „Saubere" Neuronen wurden geerntet durch Sammeln des Überstands und plattiert auf Poly-Ornithin/Lamininbeschichteten Kunststoffplatten (48 Vertiefungen), bei einer Dichte von 10.000 Zellen/Vertiefung in HAM's F14-Medium, das 5% FBS enthält. Eine Dosis-Reaktionskurve für NGF wurde titriert von ungefähr 1 pg/ml bis 15 ng/ml. Neurotrophe Aktivität wurde quantifiziert durch Zählen lebensfähiger differenzierter Neuronen, die Neuriten entwickelten, die größer als das Doppelte des Durchmessers des Perikaryon sind, nachfolgend auf 48 h Inkubation mit verschiedenen NGF-Formulierungen. Daten wurden aufgetragen als Mittelwert doppelter Bestimmungen differenzierter Neuronen gegenüber der Konzentration von NGF-Testformulierung und halb-maximale stimulatorische Aktivitäten von NGF (EC50) in mehreren verschiedenen Formulierungen wurden bestimmt (Tabelle 1).
  • Tabelle 1 Halb-maximale stimulatorische Aktivität von NGF-Formulierungen (EC50)
    Figure 00180001
  • Diese Daten zeigen deutlich, dass die spezifische Aktivität von NGF erhöht wird in Formulierungen, die ein amphiphiles Additiv (hier: Natriumdeoxycholat) enthalten.
  • Beispiel 4
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen mit Deoxycholat
  • Zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung werden 100 ml einer wässrigen Lösung von 5 mg/ml oder 1 mg/ml Hshh (humanes Sonic- Hedgehog-Protein) in 50 mmol/l Tris-Puffer, pH-Wert 7,4, gegen Formulierungslösung ohne Deoxycholat für 24 h bei 4°C dialysiert. Nach Dialyse wird Natriumdeoxycholat aus einer Stammlösung unter Rühren zugegeben, um eine wässrige pharmazeutische Zusammensetzung von 1 mg/ml oder 5 mg/ml Hshh in Formulierungslösung zu erhalten. Die Lösung wird steril filtriert und bei 4°C aufbewahrt. 0,05 bis 2 ml der Lösung werden für die Injektion in Menschen oder Tiere verwendet. 4.1 Formulierung von ionisch hydrophobisiertem Hedgehog-Protein in mit wässrigem Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (wenig Natriumdeoxycholat) Formulierungslösung:
    NaCl: 150 mmol/l
    Natriumphosphatpuffer: 10 mmol/l
    Natriumdeoxycholat: 0,05% (Gew./V)
    pH-Wert: 7,4
    4.2 Formulierung von ionisch hydrophobisiertem Hedgehog-Protein in mit wässrigem Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (viel Natriumdeoxycholat) Formulierungslösung:
    NaCl: 150 mmol/l
    Natriumphosphatpuffer: 10 mmol/l
    Natriumdeoxycholat: 0,1% (Gew./V)
    pH-Wert: 7,4
    4.3 Formulierung von ionisch hydrophobisiertem Hedgehog-Protein in Phosphatpuffer mit geringer Ionenstärke (wenig Natriumdeoxycholat) Formulierungslösung
    NaCl: 30 mmol/l
    Kaliumphosphatpuffer: 20 mmol/l
    Natriumdeoxycholat: 0,05% (Gew./V)
    pH-Wert: 6,5
    4.4 Formulierung von ionisch hydrophobisiertem Hedehog-Protein in Phosphatpuffer mit geringer Ionenstärke (viel Natriumdeoxycholat) Formulierungslösung:
    NaCl: 30 mmol/l
    Kaliumphosphatpuffer: 20 mmol/l
    Natriumdeoxycholat: 0,1% (Gew./V)
    pH-Wert: 6,5
  • Beispiel 5
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen von ionisch hydrophobisiertem Hedgehog-Protein in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung mit Lipiden, Fettsäuren oder Steroiden
  • Zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung werden 100 ml einer wässrigen Lösung von 1 mg/ml oder 2 mg/ml Hshh in 50 mmol/l Tris-Puffer, pH-Wert 7,4 gegen Formulierungslösung ohne Lipid, Fettsäure oder Cholat für 24 h bei 4°C dialysiert. Nach Dialyse werden 0,01 g Phosphatidat, 0,01 g Phosphatidylserin, 0,01 g Palmitat, 0,05 g Cholat, 0,05 g Taurodeoxycholat oder 0,05 g Taurocholat aus Stammlösungen unter Rühren zugegeben, um eine wässrige pharmazeutische Zusammensetzung von 1 mg/ml oder 2 mg/ml Hshh in Formulierungslösung zu erhalten. Die Lösung wird steril filtriert und bei 4°C aufbewahrt. 0,05 bis 2 ml der Lösung werden zur Injektion in Menschen oder Tiere verwendet. Formulierungslösung:
    NaCl: 150 mmol/l
    Natriumphosphatpuffer: 10 mmol/l
    Phosphatidat: 0,01% (Gew./V)
    pH-Wert: 7,4
    Formulierungslösung:
    NaCl: 100 mmol/l
    Natriumphosphatpuffer: 10 mmol/l
    Phosphatidylserin: 0,01% (Gew./V)
    pH-Wert: 7,4
    Formulierungslösung:
    NaCl: 150 mmol/l
    Kaliumphosphatpuffer: 20 mmol/l
    Natriumpalmitat: 0,01% (Gew./V)
    pH-Wert: 7,4
    Formulierungslösung:
    NaCl: 150 mmol/l
    Natriumphosphatpuffer: 10 mmol/l
    Natriumcholat: 0,05% (Gew./V)
    pH-Wert: 7,4
    Formulierungslösung:
    NaCl: 100 mmol/l
    Natriumphosphatpuffer: 10 mmol/l
    Natriumtaurodeoxycholat: 0,05% (Gew./V)
    pH-Wert: 7,4
    Formulierungslösung:
    NaCl: 150 mM
    Kaliumphosphatpuffer: 20 mM
    Natriumtaurochlorat: 0,05% (Gew./V)
    pH-Wert: 7,4
  • Beispiel 6
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen von ionisch hydrophobisiertem morphogenen Knochenprotein (BMP-2) in Argininpuffern
  • Zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung wurden 100 ml einer wässrigen Lösung von 0,4 mg/ml BMP-2 gegen 500 mmol/l Arginin in 10 mmol/l Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 6,0, für 24 h bei 4°C dialysiert. Nach Dialyse wurden 0,01 g (Palmitat) oder 0,05 g (Deoxycholat oder Taurodeoxycholat) aus einer Stammlösung unter Rühren zugegeben, um eine wässrige pharmazeutische Zusammensetzung mit 0,4 mg/ml BMP in der Formulierungslösung zu erhalten. Die Lösung wurde steril filtriert und bei 4°C aufbewahrt. 0,05 bis 2 ml der Lösung werden verwendet für die Injektion in Menschen oder Tiere. Formulierungslösung:
    Arginin: 500 mmol/l
    Kaliumphosphatpuffer: 10 mmol/l
    Natriumdeoxycholat: 0,05% (Gew./V)
    pH-Wert: 6,0
    Formulierungslösung:
    Arginin: 500 mmol/l
    Kaliumphosphatpuffer: 10 mmol/l
    Natriumpalmitat: 0,01% (Gew./V)
    pH-Wert: 6,0
    Formulierungslösung:
    Arginin: 500 mmol/l
    Kaliumphosphatpuffer: 10 mmol/l
    Natriumtaurodeoxycholat: 0,05% (Gew./V)
    pH-Wert: 6,0
  • Beispiel 7
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen von ionisch hydrophobisiertem Interleukin-2 in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung
  • Zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung werden 100 ml einer wässrigen Lösung von 1 oder 2 Millionen IU Interleukin-2 in 50 mmol/l Tris-Puffer, pH-Wert 7,4, gegen Formulierungslösung ohne die amphiphile Verbindung für 24 h bei 4°C dialysiert. Nach Dialyse werden 0,05 g Deoxycholat, 0,01 g Phosphatidylserin oder 0,01 g Natriumpalmitat aus Stammlösungen unter Rühren zugegeben, um eine wässrige pharmazeutische Zusammensetzung von 1 oder 2 Millionen IU Interleukin-2 in Formulierungslösung zu erhalten. Die Lösung wird steril filtriert und bei 4°C aufbewahrt. 0,05 bis 2 ml der Lösung werden zur Injektion in Menschen oder Tiere verwendet. Formulierungslösung:
    NaCl: 150 mmol/l
    Natriumphosphatpuffer: 10 mmol/l
    Deoxycholat: 0,05% (Gew./V)
    pH-Wert: 7,4
    Formulierungslösung:
    NaCl: 150 mmol/l
    Natriumphosphatpuffer: 10 mmol/l
    Phosphatidylserin: 0,01% (Gew./V)
    pH-Wert: 7,4
    Formulierungslösung:
    NaCl: 150 mmol/l
    Kaliumphosphatpuffer: 20 mmol/l
    Natriumpalmitat: 0,01% (Gew./V)
    pH-Wert: 7,4
  • Beispiel 8
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen von ionisch hydrophobisiertem alpha-Interferon in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung
  • Zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung werden 100 ml einer wässrigen Lösung mit 4 oder 40 Millionen IU Interferon-α2b in 50 mmol/l Tris-Puffer, pH-Wert 7,4, gegen Formulierungslösung ohne die amphiphile Substanz für 24 h bei 4°C dialysiert. Nach Dialyse werden 0,05 g Deoxycholat, 0,01 g Phosphatidylserin oder 0,05 g Taurodeoxycholat aus einer Stammlösung zugegeben, um eine wässrige pharmazeutische Zusammensetzung mit 4 oder 40 Millionen IU Interferon-α2b in Formulierungslösung zu erhalten. Die Lösung wird steril filtriert und bei 4°C aufbewahrt. 0,05 bis 2 ml der Lösung werden zur Injektion in Menschen oder Tiere verwendet. Formulierungslösung:
    NaCl: 150 mmol/l
    Natriumphosphatpuffer: 10 mmol/l
    Deoxycholat: 0,05% (Gew./V)
    pH-Wert: 7,4
    Formulierungslösung:
    NaCl: 100 mmol/l
    Natriumphosphatpuffer: 10 mmol/l
    Phosphatidylserin: 0,01% (Gew./V)
    pH-Wert: 7,4
    Formulierungslösung:
    NaCl: 150 mmol/l
    Kaliumphosphatpuffer: 20 mmol/l
    Natriumtaurodeoxycholat: 0,05% (Gew./V)
    pH-Wert: 7,4
  • Beispiel 9
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen von ionisch hydrophobisiertem humanem NGF in Acetatpuffern
  • Zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung werden zu 100 ml einer wässrigen Lösung von 1 oder 2 mg/ml humanem NGF in 100 mmol/l Natriumacetatpuffer, pH-Wert 6,0, 0,05 g Deoxycholat, 0,01 g Phosphatidat oder 0,05 g Taurodeoxycholat aus einer Stammlösung unter Rühren gegeben, um wässrige pharmazeutische Zusammensetzungen zu erhalten. Die Lösung wird steril filtriert und bei 4°C aufbewahrt. 0,05 bis 2 ml der Lösung werden zur Injektion in Menschen oder Tiere verwendet. Zusammensetzungen:
    Humanes NGF: 1 mg/ml
    Natriumacetatpuffer: 100 mmol/l
    Deoxycholat: 0,05% (Gew./V)
    pH-Wert: 6,0
    Humanes NGF: 2 mg/ml
    Natriumacetatpuffer: 100 mmol/l
    Phosphatidat: 0,01% (Gew./V)
    pH-Wert: 6,0
    Humanes NGF: 1 mg/ml
    Natriumacetatpuffer: 100 mmol/l
    Natriumtaurodeoxycholat: 0,05% (Gew./V)
    pH-Wert: 6,0
  • Beispiel 10
  • Herstellung eines Alginatgels, das Hedgehog-Proteine enthält
  • Ein Aliquot einer Formulierungslösung von Beispiel 4.1 wird mit 1% (Gew./V) wässriger Natriumalginatstammlösung (Pronova Biopolymer, Norwegen) auf eine solche Art gerührt, dass ein gelatineförmiges Alginatproteingemisch gebildet wird. Das Gel wird direkt als eine injizierbare Matrix in einer Menge von 0,05 bis 2 ml verwendet.
  • Beispiel 11
  • Herstellung eines Kollagengemischs, das BMP-2 enthält
  • 100 μl einer der Formulierungslösungen von Beispiel 6 werden tropfenweise auf Kollagen-Schwämme (Helistat, Integra Life Science, USA) mit einer Größe von 10 × 10 × 3 mm gegeben. Die beladenen Träger werden dann eingefroren (–70°C) und lyophylisiert. Der Schwamm wird lokal zum Heilen von Knochenbrüchen verwendet.
  • Literaturstellen
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Claims (2)

  1. Verfahren zum Herstellen einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur lokalen Anwendung bei Menschen, die eine wässrige klare Lösung ist, und worin eine wesentliche Komponente ein Komplex ist, gebildet durch ionische Wechselwirkung zwischen einem pharmazeutisch wirksamen Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hedgehog-Proteinen, morphogenetischen Knochenproteinen, Wachstumfaktoren, Erythropoietin, Thrombopoietin, G-CSF, Interleukinen und Interferonen, und einer amphiphilen Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem anionischen, zwitterionischen oder kationischen hydrophoben oberflächenaktiven Mittel, einer Fettsäure, einem Alkylsulfonat, einem Phosphatidylserin oder einem Phosphatidat, wobei in der Zusammensetzung die amphiphile Verbindung in einer Konzentration vorliegt, die die Wasserlöslichkeit des Polypeptids nicht verstärkt, worin die Zusammensetzung einen pH-Wert aufweist, der sich um mindestens eine halbe pH-Wert-Einheit von den pK-Werten des Polypeptids und der amphiphilen Verbindung unterscheidet, und worin die Molekülstruktur des Polypeptids in ihrem natürlichen aktiven Zustand erhalten bleibt und daher die Aktivität des Polypeptids nicht verringert wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Komplex auf einem biokompatiblen Träger immobilisiert ist.
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