DE69930269T2

DE69930269T2 - Wasserlösslische prodrugs von gehinderten phenolen

Info

Publication number: DE69930269T2
Application number: DE69930269T
Authority: DE
Inventors: J. Valentino Lawrence STELLA; J. Jan Longmont ZYGMUNT; Gunda Ingrid Lawrence GEORG; S. Muhammed SAFADI
Original assignee: University of Kansas
Current assignee: University of Kansas
Priority date: 1998-08-07
Filing date: 1999-08-06
Publication date: 2006-12-07
Anticipated expiration: 2019-08-07
Also published as: US6451776B2; HUP0200317A3; PL198141B1; US20050090431A1; UA73479C2; CZ2001479A3; US6872838B2; PT1102776E; EP1102776B1; RU2235727C2; ZA200101039B; HUP0200317A2; TR200100772T2; CY1105043T1; US7244718B2; NO330357B1; HK1047939B; IL141316A0; ATE319723T1; CN1198834C

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue wasserlösliche Prodrugs von aliphatischen und aromatischen gehinderte Hydroxylgruppe-enthaltenden Pharmazeutika. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung neue wasserlösliche Phosphonooxymethylether von gehinderten Alkohol- und Phenol-enthaltenden Pharmazeutika, wie z.B. Camptothecin, Propofol, Etoposid, Vitamin E und Cyclosporin A. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Intermediate, die zur Herstellung der letztlich erhaltenen Prodrugs verwendet werden, sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, die die neuen Verbindungen enthalten.
2. Hintergrund der Erfindung
Die erfolgreiche Abgabe eines Pharmazeutikums an einen Patienten ist von kritischer Wichtigkeit bei der Behandlung von Erkrankungen. Die Verwendung zahlreicher klinischer Wirkstoffe mit bekannten Eigenschaften ist jedoch durch ihre sehr geringe Wasserlöslichkeit begrenzt. Infolge der geringen Wasserlöslichkeit müssen diese Wirkstoffe in Co-Lösungsmitteln als pharmazeutische Träger, einschließlich Tensiden, formuliert werden. Es ist gezeigt worden, dass diese Tenside bei Menschen zu ernsten Nebenwirkungen führen, die die klinische Sicherheit dieser Wirkstoffe und deshalb die Behandlung verschiedener Erkrankungen beschränken.
Camptothecin z.B. ist ein Naturstoff, der aus der Rinde des chinesischen Camtothecabaums, Camptotheca accuminata, isoliert wird. Es ist gezeigt worden, dass dieser Stoff in verschiedenen in vivo-Tiermodellen starke Antitumoraktivität besitzt, einschließlich wichtiger Tumorarten, wie z.B. Lungen-, Brust-, Eierstock-, Speicheldrüsen-, Darm- und Magenkrebs, sowie bösartige Melanome. Camptothecin inhibiert das celluläre Enzym DNA-Topoisomerase I und löst eine Kaskade von Ereignissen aus, die zur Apoptose und zum programmierten Zelltod führen. Topoisomerase I ist ein essentielles nukleares Enzym, das für die Organisation und Modulation der topologischen Merkmale von DNA verantwortlich ist, so dass eine Zelle sich replizieren, transkribieren und genetische Information reparieren kann.
Figur 1 – Camptothecin
Der ernste Nachteil von Camptothecin ist dessen sehr geringe Wasserlöslichkeit. Für biologische Untersuchungen ist es erforderlich, die Verbindung in einem starken organischen Lösungsmittel (DMSO) aufzulösen oder den Wirkstoff als Suspension in Tween 80: Kochsalz lösung zu formulieren, was für die Behandlung von Menschen eine unerwünschte Wirkstoffformulierung ist. In den Vereinigten Staaten sind in neuerer Zeit zwei Analoga von Camptothecin mit moderater Wasserlöslichkeit zur Behandlung von fortgeschrittenem Eierstockkrebs (Hycamtin) und Enddarmkrebs (Camptosar) zugelassen worden.
Andere Wirkstoff, wie Camptothecin, die ähnliche Probleme aufweisen, sind Cyclosporin A (CsA), Propofol, Etoposid und Vitamin E (alpha-Tocopherol). So wie Camptothecin, besitzt CsA innerhalb seiner Struktur eine sterisch gehinderte Alkoholgruppe, in diesem Fall eine sekundäre Alkoholkgruppe. CsA wird in einem CremophorEL/Ethanol-Gemisch formuliert.
Cyclosporin A
Ein Beispiel für ein sterisch gehindertes schlecht wasserlösliches Phenol ist Propofol, ein Anästhetikum.
Profofol (2,6-Diisopropylphenol)
Propofol wird für die i.v. klinische Anwendung als o/w-Emulsion formuliert. Propofol ist nicht nur schlecht wasserlöslich, sondern es verursacht auch Schmerzen am Ort der Injektion. Diese Schmerzen müssen unter Verwendung von Lidocain gelindert werden. Aufgrund der Tatsache, dass es als Emulsion formuliert wird, ist es schwierig und fragwürdig, andere Wirkstoffe zu der Formulierung zu geben, und physikalische Veränderungen der Formulierung, wie z.B. eine Vergrößerung der Öltröpfchengröße, kann zu Lungenembolien usw. führen. Ein wasserlösliches und chemisch stabiles Prodrug von Propofol würde verschiedene Vorteile bieten. Eine solche Formulierung könnte eine einfache wässrige Lösung sein, der andere Wirkstoffe beigemischt werden könnten. Sofern das Prodrug selbst schmerzfrei wäre, wäre das Prodrug Patienten-freundlicher und schließlich sollte keine Toxizität aufgrund des Trägers auftreten. Weitere schlechte wasserlösliche, sterisch gehinderte Phenole sind der Antikrebs-Wirkstoff Etoposid und Vitamin E (alpha-Tocopherol).
Die vorliegende Erfindung stellt eine wasserlösliche Form von Alkohol- und Phenol-enthaltenden Wirkstoffen, wie z.B. Propofol, bereit. Alle erfindungsgemäßen Prodrugs zeigen überlegene Wasserlöslichkeit im Vergleich zu ihren jeweiligen Mutterwirkstoffen. Die für die erfindungsgemäßen Verbindungen entwickelten Verfahren können für die Umwandlung von zahlreichen anderen wasserunlöslichen medizinischen Mitteln mit aliphatischen oder aromatischen gehinderten Hydroxylgruppen in wasserlösliche Derivate nützlich sein.
Zusammenfassung der Erfindung
Die hierin beschriebene Erfindung betrifft neue Stoffzusammensetzungen. Die Erfindung betrifft die wasserlöslichen Phosphonooxymethylderivate von Phenol-enthaltenden Pharmazeutika, die durch die allgemeine Formel I dargestellt werden:
worin
R-O- ein Rest einer phenolhaltigen pharmazeutischen Verbindung ist,
R¹ ein Wasserstoff oder Alkalimetallion oder ein protoniertes Amin oder eine protonierte Aminosäure ist,
R² Wasserstoff oder ein Alkalimetallion oder ein protoniertes Amin oder eine protonierte Aminosäure ist, und
n eine Ganzzahl von 1 oder 2 ist;
m eine Ganzzahl von mindestens 1 ist;
sowie deren pharmazeutisch verträglichen Salze.
Die obige Formel I ist das Derivat von ROH, worin ROH einen Phenol-enthaltenden Wirkstoff darstellt, wie z.B. Propofol, Etoposid, Vitamin E. Wenn n 2 ist, ist ROH bevorzugt ein Phenol-enthaltendes Pharmazeutikum, wie z.B. Propofol. Auch umfasst sind einige Wirkstoffe für die injizierbare Formen aufgrund ihrer inhärent schlechten Wasserlöslichkeit nicht möglich sind. Diese umfassen Danazol, Methyltestosteron, Iodchinol und Atovaquon. R¹ ist Wasserstoff oder ein Alkalimetallion, einschließlich Natrium, Kalium oder Lithium, oder ein protoniertes Amin oder eine protonierte Aminosäure oder jedes andere pharmazeutisch annehmbare Kation. R² ist Wasserstoff oder ein Alkalimetallion, einschließlich Natrium, Kalium oder Lithium, oder ein protoniertes Amin oder eine protonierte Aminosäure oder jedes andere pharmazeutisch annehmbare Kation. Nach intravenöser oder oraler Verabreichung werden die Derivate nach Formel I durch Hydrolyse und/oder Phosphatase zurück in die Mutterwirkstoffe umgewandelt.
Demgemäß besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, Derivate von wasserunlöslichen Wirkstoffen zu entwickeln, die gute Aktivität und Wasserlöslichkeit zeigen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, pharmazeutische Zusammensetzungen dieser wasserlöslichen Verbindungen zu entwickeln, die eine Menge der Verbindung der Formel I und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthalten.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Wirkstoffderivate zu entwickeln, die gute Stabilität bei für die Herstellung von pharmazeutischen Formulierungen geeigneten pH-Werten besitzen, unter physiologischen Bedingungen in vivo, jedoch schnell abgebaut werden, um potentiell als Prodrug zu wirken.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Zeichnungen der vorliegenden Anmeldung werden wie folgt erläutert:
1 illustriert eine in vitro-enzymatische Umwandlung von Propofol-Prodrug in Propofol.
2 illustriert die Veränderung der Blutkonzentration von Propofol als Funktion der Zeit ab der Verabreichung des Propofol-Prodrug oder von Diprivan^® bei einer Untersuchung an Hunden.
Genaue Beschreibung der Erfindung
In der vorliegenden Beschreibung gelten die folgenden Definitionen, sofern nichts anderes angegeben ist oder im Kontext:
„Phosphono-„ bedeutet die Gruppe -P(O)(OH)₂ und „Phosphonooxymethoxy" oder „Phosphonooxymethylether" bedeutet generisch die Gruppe -OCH₂OP(O)(OH)₂. "Methylthiomethyl" bezieht sich auf die Gruppe -CH₂SCH₃. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Verbindungen, worin n = 2, so dass ein „Phosphonodi(oxymethyl)ether" generisch die Gruppe -OCH₂OCH₂OP(O)(OH)₂ bedeutet.
Hierbei versteht sich, dass die vorliegende Erfindung auf mehr als eine Hydroxylgruppe angewendet werden kann. Dies kann erreicht werden, indem die zusätzliche Hydroxylgruppe vor der Derivatisierung geschützt wird.
„Phosphono-Schutzgruppe" bedeutet Gruppierungen, die verwendet werden können, um die funktionelle Phosphonogruppe zu blockieren oder zu schützen. Solche Schutzgruppen sind bevorzugt diejenigen, die durch Verfahren entfernt werden können, die den Rest des Moleküls nicht merklich beeinflussen. Geeignete Phosphonooxy-Schutzgruppen umfassen z.B. Benzyl- (bezeichnet durch „Bn"), t-Butyl- und Allylgruppen.
„Pharmazeutisch annehmbares Salz" bedeutet ein Metall- oder ein Aminsalz der sauren Phosphonogruppe, bei dem das Kation nicht signifikant zur Toxizität oder biologischen Aktivität der aktiven Verbindung beiträgt. Geeignete Metallsalze umfassen Lithium-, Kalium-, Natrium-, Calcium-, Barium-, Magnesium-, Zink- und Aluminiumsalze. Bevorzugte Salze sind Natrium- und Kaliumsalze. Geeignete Aminsalze sind z.B. Ammoniak, Tromethamin, Triethanolamin, Ethylendiamin, Glucamin, N-Methylglucamin, Glycin, Lysin, Ornithin, Arginin, Etha nolamin, um nur einige wenige zu nennen. Bevorzugte Aminsalze sind Lysin-, Arginin-, N-Methylglucamin- und Tromethaminsalze.
In der Beschreibung und in den Ansprüchen soll die Bezeichnung -OCH₂OP(O)(OH)₂ sowohl die freie Säure als auch ihre pharmazeutisch annehmbaren Salze umfassen, sofern sich nicht aus dem Kontext speziell ergibt, dass die freie Säure gemeint ist.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt Derivate von Alkohol- und Phenol-enthaltenden Pharmazeutika dar, wie in der oben definierten Formel I gezeigt ist.
Die Derivate der Formel I können nach der in Schema 1 gezeigten Reaktionssequenz hergestellt werden: Schema 1
worin ROH für einen Phenol-enthaltenden Wirkstoff, wie z.B. Propofol, Etoposid, Vitamin E, steht. Es versteht sich, dass der oben angegebene Weg nur einer von verschiedenen alternativen Wegen ist. Diese alternativen Wege werden anhand der folgenden Offenbarung und Beispiele ersichtlich.
Das allgemeine Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I wird in Schema 2 näher dargestellt, wobei die Bezugsverbindung Camptothecin als Beispiel verwendet wird:
Schema 2
In dem ersten Schritt wird die freie Hydroxygruppe des Camptothecins in die entsprechende Methylthiomethylether-(OCH₂SCH₃)-Gruppe umgewandelt. Diese Umwandlung kann erreicht werden durch Umsetzung mit Dimethylsulfoxid in Gegenwart von Essigsäureanhydrid und Essigsäure. Dieses Verfahren, das allgemein als Pummer-Reaktion bekannt ist, wurde von Bristol-Myers Squibb erfolgreich zur Methylthiomethylierung von Taxol angewendet (europäisches Patent 0604910A1, Bioorg. Med. Chem. Lett., 6, 1837, 1996; siehe auch Europ. Pat. 0639577A). Die Reaktion wird im Allgemeinen bei Raumtemperatur und über einen Zeitraum von 24–72 Stunden durchgeführt, um den Methylthiomethylether herzustellen.
In dem zweiten Schritt der Reaktionssequenz wird der Methylthiomethylether in den entsprechenden geschützten Phosphonooxymethylether umgewandelt. Diese wohlbekannte Umwandlung wurde von Bristol-Myers Squibb erfolgreich zur Phosphonooxymethylierung von Taxol angewendet (Europ. Pat. 0604910A1, Bioorg. Med. Chem. Lett., 6, 1837, 1996). Eine Verbindung der Formel III wird demgemäß mit N-Iodsuccinamid und geschützter Phosphorsäure, wie z.B. Dibenzylphosphat, behandelt. Die Umsetzung wird in einem inerten organischen Lösungsmittel, wie z.B. Tetrahydrofuran, und halogeniertem Kohlenwasserstoff, wie z.B. Methylenchlorid, und in Gegenwart eines Molekularsiebs durchgeführt. Die Umsetzung wird bei Raumtemperatur durchgeführt. N-Iodsuccinimid und geschützte Phosphorsäure werden im Überschuss (3–5 Äquivalente), bezogen auf den Methylthiomethylether, eingesetzt.
In dem dritten Schritt der Reaktionssequenz werden die Phosphono-Schutzgruppen entfernt. Die Deblockierung wird nach herkömmlichen, im Stand der Technik wohlbekannten Verfahren erreicht, wie z.B. durch Säure- oder Base-katalysierte Hydrolyse, Hydrogenolyse, Reduktion und dergleichen. Z.B. kann die katalytische Hydrogenolyse verwendet werden, um die Benzyl-Phosphono-Schutzgruppe zu entfernen. Schutzgruppenentfernungsverfahren sind in Standardnachschlagewerken angegeben, wie z.B. T. W. Green und P. G. M. Wutz, Protective groups in organic synthesis, J. Wiley, Hrsg., New York, NY, 1991, S. 47–67.
Die Basesalze einer Verbindung der Formel II können durch herkömmliche Techniken gebildet werden, wobei eine freie Säureverbindung der Formel II mit einer Metallbase oder einem Amin in Kontakt gebracht wird. Geeignete Metallbasen umfassen Hydroxide, Carbonate und Bicarbonate von Natrium, Kalium, Lithium, Calcium, Barium, Magnesium, Zink und Aluminium; und geeignete Amine umfassen Triethylamin, Ammoniak, Lysin, Arginin, N-Methylglucamin, Ethanolamin, Procain, Benzathin, Dibenzylamin, Tromethamin (TRIS), Chlorprocain, Cholin, Diethanolamin, Triethanolamin und dergleichen. Die Basesalze können weiter gereinigt werden durch Chromatographie, gefolgt von Lyophilisierung oder Kristallisation.
Erfindungsgemäße Verbindungen sind Phosphonooxymethylether-Pharmazeutika, wie z.B. Camptothecin, Propofol, Etoposid, Tocopherol usw. Die pharmazeutisch annehmbaren Salzformen zeigen verbesserte Wasserlöslichkeit im Vergleich zu den Mutterverbindungen, wodurch eine leichtere pharmazeutische Formulierung möglich wird. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass die erfindungsgemäßen Phosphonooxymethylether Prodrugs der Mutterpharmazeutika sind; wobei die Phosphonooxyethylgruppierung bei Kontakt mit Phosphatase in vivo abgespalten wird, um anschließend die Mutterverbindung zu erzeugen. Wie voranstehend gezeigt wurde, sind erfindungsgemäße Verbindungen wirksame Pharmazeutika oder therapeutische Mittel.
Z.B. können erfindungsgemäße Verbindungen der Formel II in ähnlicher Weise wie der von Camptothecin verwendet werden. Die Struktur des Camptothecin-Prodrugs ist oben gezeigt. Ein auf dem Gebiet der Krebsbehandlung erfahrener Onkologe ist deshalb in der Lage, ohne unzumutbare Versuche ein geeignetes Behandlungsprotokoll zur Verabreichung einer erfindungsgemäßen Verbindung zu ermitteln. Die Dosierung, die Art und der Zeitplan der Verabreichung von erfindungsgemäßen Verbindungen sind nicht besonders beschränkt und hängen von der jeweils eingesetzten Verbindung ab. Eine Verbindung der Formel II kann somit über jeden geeigneten Verabreichungsweg, insbesondere parenteral, verabreicht werden; die Dosierung kann z.B. im Bereich von etwa 0,1 bis 100 mg/kg Körpergewicht oder etwa 5 bis 500 mg/m² liegen. Verbindungen der Formel II können auch oral verabreicht werden; die orale Dosis kann im Bereich von etwa 5 bis 500 mg/kg Körpergewicht liegen. Die tatsächlich verwendete Dosis ist abhängig von der speziellen formulierten Zusammensetzung, dem Verabreichungsweg und dem speziellen Ort, dem Wirt und der Art des behandelten Tumors. Bei der Bestimmung der Dosis sind zahlreiche Faktoren, die die Wirkung des Wirkstoffs modifizieren, zu berücksichtigen, einschließlich des Alters, des Geschlechts, der Ernährung und des physischen Zustands des Patienten.
Ein weiteres Beispiel ist das erfindungsgemäße Propofol-Prodrug der Formel I. Die Struktur des Propofol-Prodrugs ist nachfolgend gezeigt:
Propofol-Prodrug
In der voranstehenden Formel für das Propofol-Prodrug ist Z genauso definiert wie für Formel II. Deshalb wird ein auf dem Gebiet der Anästhesie erfahrener Anästhesist in der Lage sein, ohne unzumutbare Versuche ein geeignetes Behandlungsprotokoll zur Verabreichung einer erfindungsgemäßen Verbindung zu bestimmen. Die Dosierung, die Art und der Zeitplan der Verabreichung von erfindungsgemäßen Verbindungen sind nicht besonders beschränkt und hängen von der speziellen eingesetzten Verbindung ab. Eine Verbindung der Formel I, wie z.B. das Propofol-Prodrug, kann somit über jeden geeigneten Verabreichungsweg, bevorzugt parenteral, verabreicht werden; die Dosis kann z.B. im Bereich von 0,5 bis 10 mg/kg liegen, verabreicht nach Verfahren zur Induktion der Vollnarkose oder zur Aufrechterhaltung der Vollnarkose. Alternativ kann die Verbindung der Formel I durch parenterale Infusion verabreicht werden, die Dosis kann z.B. im Bereich von 2 μg/kg/min bis 800 μg/kg/min liegen, verabreicht nach Verfahren zur Aufrechterhaltung der Vollnarkose, Initiierung und Aufrechterhaltung von MAC-Sedation oder Initiierung und Aufrechterhaltung von ICU-Sedation.
Die vorliegende Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die eine pharmazeutisch wirksame Menge einer Verbindung der Formel I in Kombination mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Hilfsstoffen, Verdünnungsmitteln oder Adjuvantien enthalten. Z.B. können erfindungsgemäße Verbindungen in Form von Tabletten, Pillen, Pulvergemischen, Kapseln, Injektionslösungen, Lösungen, Zäpfchen, Emulsionen, Dispersionen, Nahrungsmittelvormischungen und in anderen geeigneten Formen formuliert werden. Sie können auch hergestellt werden in Form von sterilen festen Zusammensetzungen, z.B., gefriergetrocknet und, falls gewünscht, kombiniert mit anderen pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoffen. Solche festen Zusammensetzungen können mit sterilem Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder einem Gemisch aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel, wie z.B. Propylenglykol, Ethanol und dergleichen, oder einem sterilen injizierbaren Medium unmittelbar vor der Verwendung der parenteralen Verabreichung rekonstituiert werden.
Typische pharmazeutisch annehmbare Träger sind z.B. Mannitol, Harnstoff, Dextrane, Lactose, nicht-reduzierende Zucker, Kartoffel- und Maisstärken, Magnesiumstearat, Talk, Pflanzenöle, Polyalkylenglykole, Ethylcellulose, Poly(vinylpyrrolidon), Calciumcarbonat, Ethyloleat, Isopropylmyristat, Benzylbenzoat, Natriumcarbonat, Gelatine, Kaliumcarbonat, Kieselsäure. Die pharmazeutische Zubereitung kann auch nicht-toxische Hilfssubstanzen, wie z.B. Emulgierungs-, Konservierungs-, Benetzungsmittel und dergleichen, wie z.B. Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat, Polyoxyethylenmonostearat, Glyceryltripalmitat, Dioctylnatriumsulfosuccinat und dergleichen enthalten.
Bei den folgenden experimentellen Verfahren sind alle Temperaturen, wenn nicht anders angegeben, in Grad Celsius (C) zu verstehen. Die NMR-Daten beziehen sich auf die chemische Verschiebung (δ), ausgedrückt in ppm, bezogen auf Tetramethylsilan (TMS) als Bezugsstandard. Die angegebenen relativen Flächen der verschiedenen Verschiebungen bei den Protonen-NMR-Spektraldaten entsprechen der Anzahl von Wasserstoffatomen eines speziell funktionellen Typs in dem Molekül. Die Natur der Verschiebung bezüglich der Multiplizität ist angegeben als breites Singulett (bs), breites Doublett (bd), breites Triplett (bt), breites Quartett (bq), Singulett (s), Multiplett (m), Doublett (d), Quartett (q), Triplett (t), Doublett von Doublett (dd), Doublet von Triplett (dt) und Doublett von Quartetts (dq). Die zur Aufnahme der NMR-Spektren verwendeten Lösungsmittel sind Aceton-d6 (deuteriertes Aceton), DMSO-d6 (Perdeuterodimethylsulfoxid), D₂O (deuteriertes Wasser), CDCl₃ (Deuterochloroform) und andere herkömmliche deuterierte Lösungsmittel.
Die hier verwendeten Abkürzungen sind übliche Abkürzungen, die auf dem technischen Gebiet allgemein gebräuchlich sind. Einige dieser Abkürzungen sind: MS (Massenspektrometrie); HRMS (hoch-aufgelöste Massenspektrometrie); Ac (Acetyl); Ph (Phenyl); FAB (fast atom bombardment); min (Minute), h oder hs (Stunde(n)); NIS (N-Iodsuccinimid); DMSO (Dimethylsulfoxid); THF (Tetrahydrofuran).
Die folgenden Beispiele werden angegeben, um die Synthese repräsentativer erfindungsgemäßer Verbindungen zu erläutern und sollen nicht als den Bereich der Erfindung in irgendeiner Weise beschränkend verstanden werden. Der Fachmann wird diese Verfahren ohne unzumutbare Versuche an die Synthese von Verbindungen im Bereich der Erfindung, die hier jedoch nicht speziell offenbart sind, anpassen können. Zum Beispiel werden in den folgenden Beispielen spezielle Salze eingesetzt; diese Salze sind jedoch nicht als beschränkend zu verste hen. Ein Beispiel für diese Situation ist die wiederholte Verwendung eines Silbersalzes von Dibenzylphosphat. Tetralkylammoniumsalze, wie z.B. Tetramethylammoniumsalze, oder andere Alkalimetallsalze können anstelle des Silbersalzes verwendet werden. Die Beispiele I, II, IV und V beziehen auf erfindungsgemäße Verbindungen, während die übrigen Beispiele Bezugsbeispiele sind.
BEISPIELE I. Synthese von O-Phosphonooxymethylpropofol
Ia. Synthese von O-Methylthiomethylpropofol:
Zu einer gerührten Suspension von Natriumhydrid (150 mg, 6,2 mmol) in trockenem HMPA (10 ml), die unter einer Argonatmosphäre gehalten wurde, wurde über einen Zeitraum von 15 Minuten tropfenweise Propofol (1,1 ml 97%, 5,7 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend weitere 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Zu diesem Gemisch wurde tropfenweise Chlormethylmethylsulfid (550 μl 95%, 6,2 mmol) zugegeben und anschließend bei Raumtemperatur gerührt. Nach 20 Stunden wurde das Reaktionsgemisch unter Rühren zwischen Wasser (10 ml) und Benzol (20 ml) verteilt. Die wässrige Schicht wurde abgetrennt und mit Benzol (10 ml) extrahiert. Die Benzolfraktionen wurden kombiniert, mit Wasser (2 × 3 ml) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der resultierende ölige Rückstand wurde der Säulenchromatographie (Silicagel, Hexan, dann 4:1 Hexan/Chloroform) unterworfen, um 1,15 g (85% Ausbeute) der oben genannten Verbindung als farbloses Öl zu ergeben.
EIMS: [M+], m/z 238.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃, δ): 1,24 (d, J = 6,9 Hz, 12H), 2,37 (s, 3H), 3,37 (Hept, J = 6,9 Hz, 2H), 4,86 (s, 2H), 7,12 (s, 3H). ¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃, δ): 15,40, 23,98, 26,68, 78,12, 124,04, 125,05, 141,74, 152,20.
Ib. Synthese von O-Chlormethylpropofol:
Zu einer gerührten Lösung von O-Methylthiomethylpropofol (3,00 g, 12,5 mmol) in trockenem Methylenchlorid (30 ml), die unter einer Argonatmosphäre gehalten wurde, wurde eine 1 M-Lösung von SO₂Cl₂ in trockenem Methylenchlorid (12,2 ml, 12,2 mmol) über einen Zeitraum von fünf Minuten bei 5°C zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten lang bei dieser Temperatur und anschließend drei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck eingedampft und der braune Rückstand wurde durch Säulenchromatographie (Silicagel, 1:20 Hexan/Ethylacetat) gereinigt, um 2,36 g (83% Ausbeute) der oben genannten Verbindung als gelbes Öl zu ergeben.
CIMS (NH₃): [M]⁺, m/z 226, [MH + NH₃]⁺, m/z 244.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃, δ): 1,22 (d, J = 6,9 Hz, 12H), 3,35 (Hept, J = 6,9 Hz, 2H), 5,76 (s, 2H), 7,15 (m, 3H). ¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃, δ): 23,93, 26,84, 83,34, 124,34, 125,95, 141,34, 150,93.
Ic. Synthese von O-Phosphonooxymethylpropofoldibenzylester (Weg 1):
Ein Gemisch aus O-Chlormethylpropofol (2,20 g, 9,7 mmol), Silberdibenzylphosphat (3,85 g, 10,0 mmol) und trockenem Toluol (50 ml) wurde unter Argonatmosphäre 45 Minuten lang zum Rückfluss erhitzt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und filtriert. Nach Verdampfen des Lösungsmittels in vacuo wurde der ölige Rückstand durch Säulenchromatographie an Silicagel (9:1 Hexan/Ethylacetat und anschließend 1:1 Hexan/Ethylacetat) gereinigt, um 4,43 g (98% Ausbeute) der oben genannten Verbindung als gelbes Öl zu ergeben.
CIMS (NH₃): [M]⁺, m/z 469, [MH + NH₃]⁺, m/z 486.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃, δ): 1,17 (d, J = 6,8 Hz, 12H), 3,33 (Hept, J = 6,9 Hz, 2H), 5,00 (d, J = 7,8 Hz, 2H), 5,01 (d, J = 7,8 Hz, 2H), 5,42 (d, J = 9,9 Hz, 2H), 7,12 (m, 3H), 7,32 (m, 10H). ¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃, δ): 23,79, 26,57, 69,15, 69,23, 94,14, 94,20, 124,07, 125,62, 127,70, 128,44, 135,42, 135,51, 141,50, 151,07.
Ic. Synthese von O-Phosphonooxymethylpropofoldibenzylester (alternativer Weg 1):
Zu einer gerührten Lösung von O-Methylthiomethylpropofol (1,45 g, 6,08 mmol) in trockenem Methylenchlorid (15 ml) unter Argonatmosphäre bei 0–5°C wurde eine 1 M-Lösung von SO₂Cl₂ in trockenem Methylenchlorid (6,5 ml, 6,5 mmol) über einen Zeitraum von fünf Minuten zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei 5°C und drei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck eingedampft. Das zurückbleibende Öl wurde in Toluol (ACS-Grad, 20 ml) aufgelöst; Silberdibenzylphosphat (3,50 g, 9,1 mmol) wurde zugegeben und das resultierende Gemisch wurde 45 Minuten lang zum Rückfluss erhitzt. Das braune Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und filtriert. Nach Verdampfen des Lösungsmittels in vacuo wurde der ölige Rückstand durch Silicagel Flash-Säulenchromatographie (9:1 Hexan/Ethylacetat, anschließend 1:1 Hexan/Ethylacetat) gereinigt, um 2,41 g (85% Ausbeute) der oben genannten Verbindung als gelbes Öl zu ergeben. Dieses Produkt besaß denselben Rf-Wert (TLC) und dasselbe ¹H-NMR-spektrum (300 MHz, CDCl₃) wie eine authentische Probe.
Ic. Synthese von O-Phosphonooxymethylpropofoldibenzylester (alternativer Weg 2):
Zu einer gerührten Suspension von Natriumhydrid (41 mg 60% Dispersion in Mineralöl, 1,02 mmol) in trockenem Dimethoxyethan (1,5 ml) unter Argonatmosphäre wurde tropfenweise über einen Zeitraum von 5 Minuten Propofol (200 μl 97%, 1,04 mmol) zugegeben und das resultierende Gemisch wurde weitere 15 Minuten lang gerührt. Die resultierende homogene Lösung wurde tropfenweise zu einer gerührten Lösung von Chloriodmethan (4,0 ml, 53 mmol) in trockenem Dimethoxyethan (4 ml) über einen Zeitraum von 15 Minuten zugegeben. Dieses Reaktionsgemisch wurde zwei Stunden gerührt, filtriert und das Lösungsmittel und der Überschuss an Chloriodmethan wurden verdampft. Das zurückbleibende Öl wurde in Toluol aufgelöst (HPLC-Grad, 10 ml). Zu dieser Lösung wurde Silberdibenzylphosphat (400 mg, 1,04 mmol) zugegeben und das resultierende Gemisch wurde 10 Minuten zum Rückfluss erhitzt. Nachdem das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abgekühlt und filtriert worden war, wurde das Lösungsmittel in vacuo verdampft. Der ölige Rückstand wurde durch Silicagel Flash-Säulenchromatographie (9:1 Hexan/Ethylacetat und anschließend 1:1 Hexan/Ethylacetat) gereinigt, um 205 mg (42% Ausbeute) der Titelverbindung als gelbes Öl zu ergeben. Dieses Produkt hatte denselben Rf-Wert (TLC) und dasselbe ¹H-NMR-Spektrum (300 MHz, CDCl₃) wie eine authentische Probe.
In Zusammenhang mit der obigen Reaktion Ic (alternativer Weg-2) versteht sich, dass in Abhängigkeit von dem gewünschten Produkt andere Reagentien verwendet werden können. Zum Beispiel kann das Chloriodmethan mit einer Verbindung, wie z.B. X-CH₂-O-CH₂-Cl, worin X eine gute Abgangsgruppe ist, ersetzt werden, wenn eine Verbindung der Formel I, worin n = 2, gewünscht wird.
Ic. Synthese von O-Phosphonooxymethylpropofoldibenzylester (alternativer Weg 3):
Zu einer gerührten Lösung von O-Methylthiomethylpropofol (91 mg, 0,38 mmol) in trockenem Methylchlorid (2 ml) unter Argonatmosphäre wurden gepulverte, aktivierte 4 Å-Molekularsiebe (100 mg) und anschließend eine Lösung von Dibenzylphosphat (127 mg, 0,45 mmol) und N-Iodsuccinimid (102 mg 95%, 0,43 mmol) in Tetrahydrofuran (2 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt, filtriert und mit Methylenchlorid (30 ml) verdünnt. Die resultierende Lösung wurde mit einer Lösung von Natriumthiosulfat (2 ml einer 1 M-Lösung), einer gesättigten Lösung von Natriumbicarbonat (3 ml), Kochsalzlösung (5 ml) gewaschen, über einem Gemisch von Natriumsulfat und Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und in vacuo konzentriert. Der ölige Rückstand wurde durch Silicagel Flash-Säulenchromatographie (1:1 Hexan/Ethylacetat) gereinigt, um 120 mg (67% Ausbeute) der oben genannten Verbindung als gelbes Öl zu ergeben. Dieses Produkt hatte denselben R_f-Wert (TLC) und dasselbe ¹H-NMR-Spektrum (300 MHz, CDCl₃) wie eine authentische Probe.
Ic. Synthese von O-Phosphonooxymethylpropofoldibenzylester (alternativer Weg 4):
Zu einer Lösung von Propofol (38 mg 97%, 0,21 mmol) in Methylchlorid (1 ml) wurden Tetrabutylammoniumbromid (10 mg, 0,03 mmol) und eine Lösung von Natriumhydroxid (40 mg, 1 mmol) in Wasser (0,2 ml) zugegeben. Das heterogene Gemisch wurde 15 Minuten lang gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von Chlormethyldibenzylphosphat (104 mg, 0,32 mmol) in Methylenchlorid (1 ml) zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde acht Stunden lang kräftig gerührt. Das Gemisch wurde anschließend mit Methylenchlorid (10 ml) verdünnt, mit Wasser (2 ml), gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und in vacuo verdampft. Der ölige Rückstand wurde durch Silicagel Flash-Säulenchromatographie (Hexan, 20:1 Hexan/Ethylacetat und 10:1 Hexan/Ethylacetat) gereinigt, um 44 mg (45% Ausbeute) der oben genannten Verbindung als gelbes Öl zu ergeben. Dieses Produkt hatte denselben R_f-Wert (TLC) und dasselbe ¹H-NMR-Spektrum (300 MHz, CDCl₃) wie eine authentische Probe.
In Zusammenhang mit der oben genannten Reaktion Ic (alternativer Weg 4) versteht sich, dass das Regens:
generisch dargestellt werden kann durch die folgende Formel:
worin X eine Abgangsgruppe darstellt, R³ und R⁴ jeweils ein Wasserstoffatom, eine organische Gruppe oder eine anorganische Gruppe sind, und Y eine Phosphatschutzgruppe ist. Beispiele für Abgangsgruppen umfassen Chlor, Brom, Iod, Tosylat und jede andere geeignete Abgangsgruppe. Beispiele für Phosphatschutzgruppen umfassen Schutzgruppen, die die Reaktivität der Phosphatgruppe temporär blockieren und selektive Substitutionen durch die nukleophile Substitutionsreaktion ermöglichen. Beispiele für solche Blockierungsgruppen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Benzyl, Allyl, tertiäres Butyl und Isopropyl, Ethyl und β-Cyanoethyl.
Ic. Synthese von O-Phosphonooxymethylpropofoldibenzylester (alternativer Weg 5):
Zu einer gerührten Suspension von Natriumhydrid (36 mg einer 60%igen Dispersion in Mineralöl, 0,91 mmol) in trockenem Dimethoxyethan (2 ml) unter Argonatmosphäre wurde über einen Zeitraum von fünf Minuten tropfenweise Propofol (172 μl 97%, 0,90 mmol) zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur weitere 20 Minuten lang gerührt. Zu dem Gemisch wurde anschließend die Lösung von Formaldehyd-bis-(dibenzylphosphono)acetal (500 mg, 0,88 mmol) in trockenem Dimethoxyethan (3 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur und anschließend 2,5 Stunden bei 70°C gerührt. Das Gemisch wurde anschließend filtriert und das Lösungsmittel in vacuo verdampft. Der ölige Rückstand wurde durch Silicagel Flash-Säulenchromatographie (Hexan, 10:1 Hexan/Ethylacetat und anschließend 1:1 Hexan/Ethylacetat) gereinigt, um 29 mg (7% Ausbeute) der oben genannten Verbindung als gelbes Öl zu ergeben. Dieses Produkt hatte denselben R_f-Wert (TLC) und dasselbe ¹H-NMR-Spektrum (300 MHz, CDCl₃) wie eine authentische Probe.
Id. Synthese von O-Phosphonooxymethylpropofol:
Zu einer Lösung von O-Phosphonooxymethylpropofoldibenzylester (115 mg, 0,245 mmol) in Methanol (10 ml) wurde Palladium-auf-Kohlenstoff (10%, 20 mg) zugegeben. Dieses Gemisch wurde unter einer Wasserstoffatmosphäre (1 atm) 1,5 Stunden lang gerührt. Der Katalysator wurde durch Filtration durch Celite entfernt und das Filtrat unter vermindertem Druck verdampft, um 70,5 mg (100% Ausbeute) der oben genannten Verbindung als farbloses Öl, das beim Stehen bei Raumtemperatur instabil ist, zu ergeben.
FABMS – (GLY): [M – H]^–, m/z 287.
¹H-NMR (300 MHz, Aceton-d₆, δ): 1,19 (d, J = 6,8 Hz, 12H), 3,46 (Sext., J = 6,8 Hz, 2H), 5,45 (d, J = 9,7 Hz, 2H), 7,15 (m, 3H). ¹³C-NMR (75 MHz, Aceton-d₆, δ): 24,2178, 27,1496, 94,63, 94,65, 124,08, 126,3, 142,46, 152,32.
Ie. Synthese von O-Phosphonooxymethylpropofoldinatriumsalz:
Zu einer Lösung von O-Phosphonooxymethylpropofoldibenzylester (1,05 g, 2,24 mmol) in Tetrahydrofuran (100 ml) wurden Wasser (5 ml) und Palladium-auf-Kohlenstoff (10%, 300 mg) zugegeben. Dieses Gemisch wurde unter Wasserstoff (1 atm) eine Stunde lang gerührt. Der Katalysator wurde durch Filtration durch Celite entfernt und das Filtrat wurde mit einer Lösung von Natriumcarbonathydrat (263 mg in 3 ml Wasser, 2,12 mmol) behandelt. Das THF wurde unter vermindertem Druck entfernt und die verbleibende wässrige Lösung wurde mit Ether (3 × 3 ml) extrahiert. Die wässrige Schicht wurde zur Trockenheit eingedampft (Argonstrom oder Rotationsverdampfer) und der resultierende Feststoff wurde über Nacht in vacuo getrocknet, mit Ether (4 × 4 ml), Hexan (2 × 4 ml) gewaschen und wiederum in vacuo getrocknet, um 655 mg (93% Ausbeute) der oben genannten Verbindung als weißes Pulver zu ergeben. FABMS – (GLY): [M – 2Na + H]^–, m/z 287.
¹H-NMR (300 MHz, D₂O, δ): 1,22 (d, J = 7,0 Hz, 12H), 3,46 (Hept, J = 6,9 Hz, 2H), 5,27 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,28 (m, 3H).
II. Synthese von O-Phosphonooxymethyl-alpha-tocopherol:
IIa. Synthese von O-Phosphonooxymethyl-alpha-tocopheroldibenzylester:
Zu einer Lösung von Chlormethyldibenzylphosphat (323 mg, 0,98 mmol), alpha-Tocopherol (409 mg 97%, 0,92 mmol) und Tetrabutylammoniumbromid (301 mg, 0,92 mmol) in Benzol (5 ml) wurde eine wässrige Lösung von Natriumhydroxid (150 mg in 0,2 ml Wasser, 3,7 mmol) zugegeben. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur zwei Stunden lang unter Argonatmosphäre kräftig gerührt. Das Gemisch wurde anschließend mit Benzol (10 ml) verdünnt, mit Wasser (3 × 3 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck eingedampft. Der braune ölige Rückstand wurde durch Silicagel Flash-Säulenchromatographie (10:1 Hexan/Ethylacetat) gereinigt, um 336 mg (51% Ausbeute) der oben genannten Verbindung als gelbes Öl zu ergeben.
FABMS + (NBA): [M]⁺, m/z 720.
¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃, δ): 0,85 (m, 12H), 1,21 (s, 3H), 1,27 (m, 24H), 1,75 (m, 2H), 2,06 (s, 3H), 2,11 (s, 3H), 2,14 (s, 3H), 2,54 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 4,97 (m, 4H), 5,20 (d, J = 9,3 Hz, 2H), 7,31 (m, 10H).
IIb. Synthese von O-Phosphonooxymethyl-alpha-tocopherol:
Zu einer Lösung von O-Phosphonooxymethyl-alpha-tocopheroldibenzylester (88 mg, 0,12 mmol) in Tetrahydrofuran (10 ml) wurde Palladium-auf-Kohlenstoff (10%, 15 mg) zugegeben. Das Gemisch wurde unter einer Atmosphäre von Wasserstoff (1 atm) 10 Minuten lang gerührt (gemäß TLC war die Umsetzung nach 5 Minuten vollständig). Der Katalysator wurde durch Filtration durch Celite entfernt, das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingedampft und anschließend in vacuo getrocknet. Die oben genannte Verbindung wurde in einer Menge von 70 mg (100% Ausbeute) als bräunliches Öl erhalten, das bei Raumtemperatur instabil war.
FABMS + (NBA): [M]⁺, m/z 540, [M + Na]⁺, m/z 563; (NBA + Li): [M + Li]⁺, m/z 547
IIc. Synthese von Synthese von O-Phosphonooxymethyl-alpha-tocopheroldinatriumsalz:
Zu einer Lösung von O-Phosphonooxymethyl-alpha-tocopheroldibenzylester (100 mg, 0,14 mmol) in Tetrahydrofuran (10 ml) wurde Palladium-auf-Kohlenstoff (10%, 18 mg) zugegeben. Das Gemisch wurde unter einer Atmosphäre von Wasserstoff (1 atm) 5 Minuten lang gerührt. Der Katalysator wurde durch Filtration durch Celite entfernt, das Filtrat wurde bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck eingedampft und der resultierende Rückstand in Ether (2 ml) aufgelöst. Die Etherlösung wurde anschließend mit einer wässrigen Lösung von Natriumhydroxid (11,2 mg in 100 ml Wasser, 0,28 mmol) behandelt und das resultierende Gemisch wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Etherphase wurde entfernt und die wässrige Phase mit Ether (3 × 3 ml) gewaschen und anschließend 20 Stunden lang in vacuo getrocknet, um 73 mg (89% Ausbeute) der oben genannten Verbindung als grauen Feststoff zu ergeben.
FABMS + (TG/G): [M]⁺, m/z 585, [M + Na]⁺, m/z 607
Die Synthese von wasserlöslichen Derivaten von Camptothecin wird nachfolgend ebenfalls näher beschrieben:
III. Synthese von 20-O-Phosphonooxymethylcamptothecin:
IIIa. Synthese von 20-O-Methylthiomethylcamptothecin:
Zu einer Suspension von Camptothecin (5,0 g, 14,3 mmol) in Dimethylsulfoxid (250 ml) wurden Essigsäureanhydrid (125 ml) und Essigsäure (35 ml) zugegeben. Das heterogene Gemisch wurde bei Raumtemperatur 24 Stunden lang kräftig gerührt, auf Eis (800 ml) gegossen, 30 Minuten lang gerührt und anschließend mit Methylenchlorid (4 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten Methylenchloridextrakte wurden mit Wasser (2 × 100 ml) gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Methylenchlorid wurde unter vermindertem Druck entfernt, um einen bräunlichen Feststoff zu ergeben. Der Feststoff wurde in einer minimalen Menge Methylenchlorid aufgelöst. Diese Lösung wurde filtriert und mit einem 10fachen Überschuss Hexan verdünnt und über Nacht in einem Kühlschrank aufbewahrt. Der ausgefällte Feststoff wurde abfiltriert, mehrere Male mit Hexan gewaschen und getrocknet, um 5,38 g (92% Ausbeute) der oben genannten Verbindung als hellbraunes Pulver zu ergeben. α^D ₂₀ –123,6° (c 0,55, CHCl₃).
FABMS + (NBA): [M]⁺, m/z 409.
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃, δ): 0,93 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 2,11 (Sext, J = 7,6 Hz, 1H), 2,29 (Sext, J = 7,6 Hz, 1H), 2,30 (s, 3H), 4,58 (s, 2H), 5,33, (s, 2H), 5,40 (d, J = 17,2 Hz, 1H), 5,62 (d, J = 17,3 Hz, 1H), 7,48 (s, 1H), 7,69 (t, J = 7,1 Hz, 1H), 7,86 (t, J = 7,1 Hz, 1H), 7,96 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 8,25 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 8,42 (s, 1H).
¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃, δ): 7,76, 14,89, 33,90, 49,92, 66,68, 71,02, 76,57, 97,51, 122,63, 128,02, 128,09, 128,30, 129,71, 130,64, 131,11, 145,14, 146,10, 148,88, 152,27, 157,43, 169,34, 169,73.
IIIb. Synthese von 20-O-Phosphonooxymethylcamptothecindibenzylester:
Zu einer gut gerührten Suspension von 20-O-Methylthiomethylcamptothecin (1,00 g, 2,44 mmol) und pulverisiertem, aktivierten 4 Ǻ-Molekularsieb (5 g) in Tetrahydrofuran (20 ml) wurde eine Suspension von N-Iodsuccinimid (2,00 g 95%, 8,44 mmol) und Dibenzylphosphat (2,20 g, 7,83 mmol) in Methylenchlorid (12 ml) zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten lang kräftig gerührt, filtriert und mit Ethylacetat (300 ml) verdünnt. Die Lösung wurde mit wässrigem Natriumthiosulfat (10%, 2 × 15 ml), Wasser (2 × 20 ml), Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Gemisch wurde filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck eingedampft. Der braune ölige Rückstand wurde durch Silicagel Flash-Säulenchromatographie (98:2 Ethylacetat/Methanol) gereinigt und über Nacht in vacuo getrocknet, um 1,19 g (76% Ausbeute) der oben genannten Verbindung als gelben Schaum zu ergeben. α^D ₂₀ –43,1° (c 0,55, CHCl₃).
FABMS + (NBA): [M]⁺, m/z 639.
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃, δ): 0,91 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 2,09 (Sext, J = 7,4 Hz, 1H), 2,26 (Sext, J = 7,4 Hz, 1H), 5,06 (m, 4H), 5,28 (m, 3H), 5,35 (d, J = 17,0 Hz, 1H), 5,48 (2 × d, J = 10,5 Hz, 1H), 5,64 (d, J = 17,3 Hz, 1H), 7,59 (s, 1H), 7,67 (t, J = 7,0 Hz, 1H), 7,80 (t, J = 7,1 Hz, 1H), 7,94 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 8,13 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 8,35 (s, 1H).
¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃, δ): 7,73, 29,53, 32,49, 49,86, 66,74, 69,37, 69,44, 78,48, 88,99, 89,04, 98,09, 121,55, 127,65, 127,70, 127,90, 128,01, 128,25, 128,35, 128,36, 129,62, 130,48, 130,97, 135,45, 135,55, 145,47, 145,82, 148,76, 152,15, 157,18, 168,67.
IIIc. Synthese von 20-O-Phosphonooxymethylcamptothecin:
Zu einer Lösung von 20-O-Phosphonooxymethylcamptothecindibenzylester (500 mg, 0,78 mmol) in Tetrahydrofuran (100 ml) und Wasser (5 ml) wurde Palladium-auf-Kohlenstoff (10%, 500 mg) zugegeben. Dieses Gemisch wurde unter einer Atmosphäre aus Wasserstoff (1 atm) 35 Minuten lang gerührt. Der Katalysator wurde durch Filtration durch Celite entfernt. Das Celite wurde anschließend mit Tetrahydrofuran (300 ml) gewaschen und die vereinigten Filtrate wurden unter vermindertem Druck eingedampft. Der resultierende grüne Feststoff wurde mit Ether (2 × 20 ml), Hexan (50 ml) gewaschen, in vacuo getrocknet und anschließend in heißem Methanol (60 ml) aufgelöst. Die Lösung wurde filtriert, unter vermindertem Druck auf ein Volumen von ~10 ml konzentriert. Nach einstündigem Stehen bei Raumtemperatur wurde die Lösung über Nacht in den Kühlschrank gestellt. Der kristalline Niederschlag, der sich über Nacht gebildet hatte, wurde abfiltriert und in vacuo getrocknet, um 155 mg der oben genannten Verbindung als gelben Feststoff zu ergeben. Das Filtrat wurde auf ein Volumen von ~1 ml konzentriert und eine Stunde lang im Kühlschrank aufbewahrt, um zusätzliche 28 mg des Produkts zu ergeben. Gesamtausbeute: 183 mg (51%).
FABMS + (NBA): [M]⁺, m/z 459, [M + Na]⁺, m/z 481.
¹H-NMR (400 MHz, D₂O, δ): 0,95 (t, J = 7,5 Hz, 3H), 2,25 (m, 2H), 4,98 (d, J = 5,0 Hz, 2H), 5,14 (2 × d, J = 9,3 Hz, 1H), 5,22 (2 × d, J = 8,9 Hz, 1H), 5,48 (d, J = 17,0 Hz, 1H), 5,60 (d, J = 16,9 Hz, 1H), 7,54 (s, 1H), 7,56 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 7,77 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 7,86 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 8,01 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 8,44 (s, 1H).
Die chemische Struktur und Reinheit des Produkts wurden auch bestätigt durch ¹H-NMR-Spektroskopie des Dinatriumsalzes, das aus der Säure und zwei Moläquivalenten Natriumbicarbonat in D₂O gebildet wurde.
IIIc. Synthese von 20-O-Phosphonooxymethylcamptothecin (alternative Durchführung):
Zu einer Lösung von 20-O-Phosphonooxymethylcamptothecindibenzylester (500 mg, 0,78 mmol) in Tetrahydrofuran (100 ml) und Wasser (5 ml) wurde Palladium-auf-Kohlenstoff (10%, 500 mg) zugegeben. Das Gemisch wurde unter einer Atmosphäre von Wasserstoff (1 atm) 30 Minuten lang gerührt. Der Katalysator wurde durch Filtration durch Celite entfernt. Das Celite wurde mit Tetrahydrofuran (2 × 100 ml) gewaschen und die vereinigten Filtrate wurden mit einer wässrigen Lösung von Natriumcarbonathydrat (97 mg in 2 ml Wasser, 0,78 mmol) behandelt. Das THF wurde unter vermindertem Druck abgedampft und der heterogene wässrige Rückstand wurde mit Wasser (10 ml) verdünnt und mit Ethylacetat (2 × 3 ml) extrahiert. Die resultierende gelbe homogene Lösung wurde mit Salzsäure (10%) auf pH = 1 angesäuert. Der resultierende Niederschlag wurde abfiltriert und über Nacht in vacuo getrocknet, um 145 mg (41% Ausbeute) der oben genannten Verbindung als gelben Feststoff zu ergeben.
IIId. Synthese von 20-O-Phosphonooxymethylcamptothecindinatriumsalz:
Zu einer Suspension von 20-O-Phosphonooxymethylcamptothecin (5 mg, 10,9 μmol) in Deuteriumoxid (0,5 ml) wurde eine Deuteriumoxid-Lösung von Natriumbicarbonat (50 μl einer 0,44 M-Lösung = 22 μmol) zugegeben. Das heterogene Gemisch wurde einige Minuten lang mit Ultraschall behandelt, um eine gelbe homogene Lösung des oben genannten Produkts zu ergeben.
¹H-NMR (400 MHz, D₂O, nach 10 min, 96% Lacton, 4% Carboxylat, δ): 1,05 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 2,27 (m, 2H), 4,57 (d, J = 18,8 Hz, 1H), 4,70 (d, J = 18,9 Hz, 1H), 5,06 (dd, J = 8,3, J = 5,4 Hz, 1H), 5,18 (dd, J = 7,6, J = 5,5 Hz, 1H), 5,45 (d, J = 16,7 Hz, 1H), 5,59 (d, J = 16,8 Hz, 1H), 7,34 (t, J = 7,1 Hz, 1H), 7,41 (s, 1H), 7,60 (m, 2H), 7,81 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 8,17 (s, 1H).
IIId. Synthese von 20-O-Phosphonooxymethylcamptothecindinatriumsalz (alternative Durchführung 1):
Zu einer Lösung von 20-O-Phosphonooxymethylcamptothecindibenzylester (78 mg, 0,122 mmol) in Tetrahydrofuran (10 ml) und Wasser (3 ml) wurde Palladium-auf-Kohlenstoff (10%, 80 mg) zugegeben. Das Gemisch wurde unter einer Atmosphäre von Wasserstoff (1 atm) 30 Minuten lang gerührt. Der Katalysator wurde durch Filtration durch Celite entfernt und das Filtrat wurde mit einer wässrigen Lösung von Natriumbicarbonat (20 mg in 0,5 ml Wasser, 0,238 mmol) behandelt. Der gelbe Feststoff wurde abfiltriert, mit Methylenchlorid gewaschen und in vacuo getrocknet, um 35 mg (57% Ausbeute) der oben genannten Verbindung (leicht brauner Feststoff) als ein Gemisch seiner Lactonform (82%) und seiner Carboxylatform (18%) (gemäß ¹H-NMR) zu ergeben.
IIId. Synthese von 20-O-Phosphonooxymethylcamptothecindinatriumsalz (alternative Durchführung 2):
Zu einer Lösung von 20-O-Phosphonooxymethylcamptothecindibenzylester (500 mg, 0,78 mmol) in Tetrahydrofuran (100 ml) und Wasser (5 ml) wurde Palladium-auf-Kohlenstoff (10%, 500 mg) zugegeben. Dieses Gemisch wurde unter einer Atmosphäre von Wasserstoff (1 atm) 30 Minuten lang gerührt. Der Katalysator wurde durch Filtration durch Celite entfernt. Celite wurde mit Tetrahydrofuran (50 ml) gewaschen und die vereinigten Filtrate wurden mit einer wässrigen Lösung von Natriumcarbonathydrat (90 mg in 2 ml Wasser, 0,72 mmol) behandelt. Tetrahydrofuran wurde unter vermindertem Druck abgedampft und der Rückstand wurde in Wasser (15 ml) aufgelöst. Das heterogene Gemisch wurde mit Ethylacetat (2 × 15 ml) und Ether (20 ml) extrahiert und die resultierende wässrige homogene Lösung wurde unter einem Argonstrom bei Raumtemperatur zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wurde über Nacht in vacuo getrocknet, um 290 mg (80% Ausbeute) der oben genannten Verbindung (orangefarbener Feststoff) als ein Gemisch ihrer Lactonform (60%), ihrer Carboxylatform (40%) und einer geringen Menge von Nebenprodukten (gemäß ¹H-NMR) zu ergeben.
IIIe. Synthese von 20-O-Phosphonooxymethylcamptothecinmononatriumsalz:
Zu einer kontinuierlich mit Ultraschall behandelten Suspension von 20-O-Phosphonooxymethylcamptothecin (5 mg, 10 μmol) in Deuteriumoxid (0,5 ml) wurde tropfenweise eine Deuteriumoxidlösung von Natriumbicarbonat zugegeben, bis die vollständige Homogenisierung erreicht worden war (21 μl einer 0,44 M-Lösung = 9,2 μmol). Es wurde eine gelbe homogene Lösung der obigen Verbindung erhalten.
¹H-NMR (400 MHz, D₂O, δ): 1,00 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 2,23 (m, 2H), 4,40 (d, J = 18,8 Hz, 1H); 4,50 (d, J = 18,8 Hz, 1H), 5,10 (dd, J = 9,7, J = 5,9 Hz, 1H), 5,26 (dd, J = 9,0, J = 6,1 Hz, 1H), 5,39 (d, J = 16,7 Hz, 1H), 5,50 (d, J = 16,7 Hz, 1H), 7,20 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 7,28 (s, 1H), 7,46 (m, 2H), 7,66 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 8,02 (s, 1H).
IIIf. Synthese von 20-O-Phosphonooxymethylcamptothecinlysinsalz:
Zu einer kontinuierlich mit Ultraschall behandelten Suspension von 20-O-Phosphonooxymethylcamptothecin (5 mg, 10 μmol) in Deuteriumoxid (0,5 ml) wurde tropfenweise eine Deuteriumoxidlösung von L-Lysin (25 μl einer 0,43 M-Lösung = 10,7 μmol) zugegeben, bis die vollständige Homogenisierung erreicht worden war. Es wurde eine gelbe homogene Lösung der oben genannten Verbindung erhalten.
¹H-NMR (400 MHz, D₂O, 94% Lacton, 6% Carboxylat, δ): 1,02 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 1,49 (m, 2H), 1,73 (m, 2H), 1,88 (m, 2H), 2,25 (m, 2H), 3,03 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 3,76 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 4,43 (d, J = 19,0 Hz, 1H), 4,52 (d, J = 18,9 Hz, 1H), 5,11 (dd, J = 9,7, J = 5,8 Hz, 1H), 5,27 (dd, J = 9,2, J = 5,8 Hz, 1H), 5,41 (d, J = 16,7 Hz, 1H), 5,53 (d, J = 16,7 Hz, 1H), 7,23 (t, J = 7,4 Hz, 1H), 7,30 (s, 1H), 7,49 (m, 2H), 7,68 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,04 (s, 1H).
IIIg. Synthese von 20-O-Phosphonooxymethylcamptothecinargininsalz:
Zu einer kontinuierlich mit Ultraschall behandelten Suspension von 20-O-Phosphonooxymethylcamptothecin (5 mg, 10 μmol) in Deuteriumoxid (0,5 ml) wurde tropfenweise eine Deuteriumoxidlösung von L-Arginin (27 μl 0,40 M, 10,8 μmol) zugegeben, bis die vollständige Homogenisierung erreicht worden war. Es wurde eine gelbe homogene Lösung der oben genannten Verbindung erhalten.
¹H-NMR (400 MHz, D₂O, δ): 1,02 (t, J = 7,1 Hz, 1H), 1,66 (m, 2), 1,89 (m, 2H), 2,25 (m, 2H), 3,20 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 3,77 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 4,40 (d, J = 19,0 Hz, 1H), 4,49 (d, J = 18,8 Hz, 1H), 5,12 (dd, J = 9,7, J = 6,0 Hz, 1H), 5,29 (dd, J = 8,8, J = 6,1 Hz, 1H), 5,40 (d, J = 16,7 Hz, 1H), 5,51 (d, J = 16,7 Hz, 1H), 7,20 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 7,29 (s, 1H), 7,47 (m, 2H), 7,66 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 8,03 (s, 1H).
IIIh. Synthese von 20-O-Phosphonooxymethylcamptothecin-N-methylglucaminsalz:
Zu einer kontinuierlich mit Ultraschall behandelten Suspension von 20-O-Phosphonooxymethylcamptothecin (5 mg, 10,9 μmol) in Deuteriumoxid (0,5 ml) wurde tropfenweise eine Deuteriumoxidlösung von (D)-N-Methylglucamin (21 μl einer 0,51 M-Lösung = 10,7 μmol) zugegeben, bis die vollständige Homogenisierung erreicht worden war. Es wurde eine gelbe homogene Lösung der oben genannten Verbindung erhalten.
¹H-NMR (400 MHz, D₂O, δ): 1,02 (t, J = 7,3 Hz, 3H); 2,25 (m, 2H), 2,78 (s, 3H), 3,20 (m, 2H), 3,65 (m, 2H), 3,80 (m, 3H), 4,11 (m, 1H), 4,44 (d, J = 18,9 Hz, 1H), 4,53 (d, J = 19,0 Hz, 1H), 5,12 (dd, J = 9,8, J = 5,9 Hz, 1H), 5,27 (dd, J = 9,2, J = 5,9 Hz, 1H), 5,41 (d, J = 16,7 Hz, 1H), 5,53 (d, J = 16,7 Hz, 1H), 7,23 (t, J = 7,4 Hz, 1H), 7,49 (m, 2H), 7,69 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 8,05 (s, 1H).
IV. Synthese von 4'-O-Phosphonooxymethyletoposid:
IVa. Synthese von 4'-O-Phosphonooxymethyletoposiddibenzylester:
Zu einer Lösung von Chlormethyldibenzylphosphat (670 mg, 2,05 mmol), Etoposid (300 mg, 0,51 mmol) und Tetrabutylammoniumbromid (164,4 mg, 0,51 mmol) in Tetrahydrofuran (0,5 ml) wurde pulverisiertes Kaliumcarbonat (352,4 mg, 2,55 mmol) zugegeben. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 35 Minuten lang kräftig gerührt. Das Gemisch wurde anschließend direkt durch Silicagel Flash-Säulenchromatographie (30:1 Methylenchlorid/Methanol) gereinigt, um 272 mg (61% Ausbeute) der oben genannten Verbindung als weißen Feststoff zu ergeben, wobei mehr als 95% der Trans-Stereochemie erhalten blieben.
FABMS + (NBA): [MH]⁺, m/z 879.
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃, δ): 1,41 (d, J = 5,0 Hz, 3H), 2,79 (br s, 1H), 2,86 (m, 1H), 2,97 (br s, 1H), 3,30 (dd, J = 14,2, J = 5,3 Hz, 1H), 3,35 (m, 2H), 3,45 (t, J = 8,5, J = 8,0 Hz, 1H), 3,59 (m, 1H), 3,66 (s, 6H), 3,74 (m, 1H), 4,19 (m, 1H), 4,20 (t, J = 8,5, J = 8,0 Hz, 1H), 4,42 (dd, J = 10,3, J = 9,1 Hz, 1H), 4,60 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 4,64 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 4,76 (q, J = 5,0 Hz, 1H), 4,92 (d, J = 3,4 Hz, 1H), 5,03 (dd, J = 7,3, J = 4,3 Hz, 4H), 5,54 (dd, J = 11,7, J = 5,1 Hz, 1H), 5,59 (dd, J = 11,3, J = 5,1 Hz, 1H), 5,99 (d, J = 3,5 Hz, 2H), 6,26 (s, 2H), 6,51 (s, 1H), 6,84 (s, 1H), 7,33 (m, 10H).
¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃, δ): 20,21, 37,49, 41,00, 43,78, 56,07, 66,32, 67,87, 67,97, 69,06, 69,14, 73,01, 73,29, 74,47, 79,70, 92,55, 92,62, 99,70, 101,57, 101,72, 107,89, 109,13, 110,55, 127,82, 127,97, 128,15, 128,35, 128,43, 132,40, 133,08, 135,68, 135,78, 136,49, 147,14, 148,73, 152,18, 174,90.
IVb. Synthese von 4'-O-Phosphonooxymethyletoposid:
Zu einer Lösung von 4'-O-Phosphonooxymethyletoposiddibenzylester (20,5 mg, 0,023 mmol) in Tetrahydrofuran (2 ml) wurde Palladium-auf-Kohlenstoff (10%, 5 mg) zugegeben. Das Gemisch wurde unter einer Atmosphäre von Wasserstoff (1 atm) 10 Minuten lang gerührt. Der Katalysator wurde durch Filtration durch Celite entfernt und das Tetrahydrofuran wurde unter vermindertem Druck verdampft. Der resultierende Rückstand wurde in vacuo getrocknet, um 16 mg (100% Ausbeute) der oben genannten Verbindung als weißen Feststoff zu ergeben.
FABMS + (NBA): [MH]⁺, m/z 699.
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃/DMSO-d₆, δ): 1,29 (d, J = 5,0 Hz, 3H), 2,78 (m, 1H), 3,21 (m, 2H), 3,29 (t, J = 8,6, J = 7,8 Hz, 1H), 3,37 (dd, J = 14,0, J = 5,3 Hz, 1H), 3,52 (m, 2H), 3,62 (s, 6H), 4,09 (m, 1H), 4,17 (t, J = 8,1 Hz, 1H), 4,38 (dd, J = 8,8, J = 8,7 Hz, 1H), 4,44 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 4,48 (d, J = 5,3 Hz, 1H), 4,66 (q, J = 5,0 Hz, 1H), 4,88 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 5,05 (br s, 7H), 5,40 (dd, J = 10,7, J = 7,8 Hz, 1H), 5,43 (dd, J = 10,4, J = 7,5 Hz, 1H), 5,89 (dd, J = 8,8 Hz, 1H), 6,18 (s, 2H), 6,41 (s, 1H), 6,78 (s, 1H).
IVc. Synthese von 4'-O-Phosphonooxymethyletoposiddinatriumsalz:
Zu einer Lösung von 4'-O-Phosphonooxymethyletoposiddibenzylester (200 mg, 0,227 mmol) in Tetrahydrofuran (10 ml) wurde Palladium-auf-Kohlenstoff (10%, 45 mg) zugegeben. Das Gemisch wurde unter einer Atmosphäre von Wasserstoff (1 atm) 25 Minuten lang gerührt. Der Katalysator wurde durch Filtration durch Celite entfernt. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand in vacuo getrocknet. Der resultierende weiße Feststoff wurde in einer wässrigen Lösung von Natriumbicarbonat (2,9 ml 0,136 M = 0,394 mmol) aufgelöst. Das resultierende heterogene Gemisch wurde mit Aktivkohle vermischt, einige Minuten lang gerührt und sodann durch eine 40 μm-Filtereinheit filtriert. Das homogene farblose Filtrat wurde lyophilisiert, um 140 mg (96% Ausbeute) der oben genannten Verbindung als weißen Feststoff zu ergeben, wobei mehr als 95% der Trans-Stereochemie erhalten blieben.
FABMS + (NBA): [MH]⁺, m/z 743, [M – Na + 2H]⁺, m/z 721, [M – 2Na + 3H]⁺, m/z 699.
¹H-NMR (400 MHz, D₂O, δ): 1,37 (d, J = 5,1 Hz, 3H), 3,10 (m, 1H), 3,37 (dd, J = 8,9, J = 8,0 Hz, 1H), 3,48 (m, 2H), 3,65 (m, 3H), 3,75 (s, 6H), 4,29 (dd, J = 10,4, J = 4,5 Hz, 1H), 4,41 (t, J = 8,3, J = 8,0 Hz, 1H), 4,49 (dd, J = 10,5, J = 8,9 Hz, 1H), 4,68 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 4,74 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,91 (q, J = 5,0 Hz, 1H), 5,13 (d, J = 3,0 Hz, 1H), 5,26 (2 × d, J = 5,3, J = 3,3 Hz, 1H), 5,28 (2 × d, J = 5,3, J = 3,3 Hz, 1H), 5,98 (d, J = 10,5 Hz, 2H), 6,40 (s, 2H), 6,58 (s, 1H), 7,00 (s, 1H).
¹³C-NMR (125 MHz, D₂O, δ): 22,13, 40,74, 43,56, 46,11, 59,12, 68,70, 70,41, 72,40, 75,46, 75,95, 76,95, 82,46, 94,87, 102,88, 103,66, 104,62, 111,14, 112,82, 113,23, 130,73, 135,45, 135,74, 140,22, 149,56, 151,43, 154,94, 166,36, 181,61.
³¹P-NMR (200 MHz, D₂O, δ): s (2,19).
V. Synthese von Phosphonooxymethylierungsmitteln Va. Synthese von Chlormethyldibenzylphosphat
Zu einer unter Rückfluss erhitzten Lösung von Chloriodmethan (25 g 97%, 0,14 mol) in Toluol (HLPC-Grad, 30 ml) wurde Silberdibenzylphosphat (7,0 g, 0,018 mol) in mehreren Portionen über einen Zeitraum von 20 Minuten zugegeben. Das Erhitzen unter Rückfluss wurde eine Stunde lang fortgesetzt. Nach Abkühlen des Reaktionsgemisches auf Raumtemperatur und Filtrieren wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck verdampft. Der ölige Rückstand wurde durch Silicagel Flash-Säulenchromatographie (7:3 Hexan/Ethylacetat) gereinigt, um 3,63 g (62% Ausbeute) der oben genannten Verbindung als gelbes Öl zu ergeben.
FABMS + (NBA): [MH]⁺, m/z 327
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃, δ): 5,10 (d, J = 8,0 Hz, 4H), 5,63 (d, J = 15,7 Hz, 2H), 7,36 (s, 10H).
¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃, δ): 69,68, 69,75, 73,33, 73,42, 127,93, 128,51, 128,63, 135,07.
Vb. Synthese von Dibenzyl(p-toluolsulfonmethyl)phosphat:
Zu einer gerührten Lösung von Silber-p-toluolsulfonat (600 mg, 2,15 mmol) in trockenem Acetonitril (3 ml) wurde Chlormethyldibenzylphosphat (150 mg, 0,46 mmol) unter einer Argonatmosphäre zugegeben. Nachdem das Reaktionsgemisch 21 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand mit Ether (3 × 3 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden filtriert, eingedampft und in vacuo getrocknet, um 210 mg (99% Ausbeute) der oben genannten Verbindung als weißen Feststoff zu ergeben.
EIMS: [MH]⁺, m/z 463.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃, δ): 2,37 (s, 3H), 4,91 (2 × d, J = 7,9 Hz, 4H), 5,61 (d, J = 14,2 Hz, 2H), 7,29 (m, 12H), 7,78 (d, J = 8,4 Hz, 2H).
In Zusammenhang mit der obigen Reaktion Vb kann, wie voranstehend unter Ic erklärt, das Reagens:
generisch dargestellt werden durch die folgende Formel:
worin alle Symbole so wie oben definiert sind.
Vc. Synthese von Formaldehyd bis(dibenzyloxyphosphono)acetal:
Zu einer Lösung von Diiodmethan (4 ml, 50 mmol) in trockenem Toluol (15 ml) wurde Silberdibenzylphosphat (3,0 g, 7,8 mmol) zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde unter einer Argonatmosphäre 15 Minuten lang unter Rückfluss erhitzt. Das Gemisch wurde anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt und filtriert. Das Lösungsmittel wurde sodann in vacuo verdampft. Der ölige Rückstand wurde durch Silicagel Flash-Säulenchromatographie (1:1 Hexan/Ethylacetat und anschließend Ethylacetat) gereinigt, um ein gelbliches Öl zu ergeben, das anschließend kristallisierte, um 1,97 g (90% Ausbeute) der oben genannten Verbindung als weißen Feststoff, Schmp. 39–42°C, zu ergeben.
CIMS (NH₃): [MH]⁺, m/z 569.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃, δ): 5,03 (d, J = 7,9 Hz, 8H), 5,49 (t, J = 14,3 Hz, 2H), 7,30 (m, 20H).
¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃, δ): 69,54, 69,61, 86,48, 127,88, 128,48, 128,55, 135,10, 135,20.
VI – Synthese von O-Phosphonooxymethylcyclosporin A:
VIa. Synthese von O-Methylthiomethylcyclosporin A:
Zu einer Suspension von Cyclosporin A in Dimethylsulfoxid (250 ml) werden Essigsäureanhydrid (125 ml) und Essigsäure (35 ml) zugegeben. Das heterogene Gemisch wird 24 Stunden bei Raumtemperatur kräftig gerührt, auf Eis (800 ml) gegossen, 30 Minuten lang gerührt und anschließend mit Methylenchlorid (4 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten Methylenchloridextrakte werden mit Wasser (2 × 100 ml) gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Methylenchlorid wird unter vermindertem Druck entfernt, um ein Produkt zu ergeben. Das Produkt wird durch Silicagelchromatographie weiter gereinigt.
VIb. Synthese von O-Phosphonooxymethylcyclosporin A-dibenzylester:
Zu einer gut gerührten Suspension von O-Methylthiomethylcyclosporin A und pulverisiertem, aktiviertem 4 Å-Molekularsieb (5 g) in Tetrahydrofuran (20 ml) wird eine Suspension von N-Iodsuccinimid (2,00 g 95%, 8,44 mmol) und Dibenzylphosphat (2,20 g, 7,83 mmol) in Methylenchlorid (12 ml) zugegeben. Das resultierende Gemisch wird bei Raumtemperatur 30 Minuten lang kräftig gerührt, filtriert und mit Ethylacetat (300 ml) verdünnt. Die Lösung wird mit wässrigem Natriumthiosulfat (10%, 2 × 15 ml), Wasser (2 × 20 ml), Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Gemisch wird fltriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck verdampft. Der Rückstand wird durch Silicagel Flash-Säulenchromatographie gereinigt.
VIc. Synthese von O-Phosphonooxymethylcyclosporin A:
Zu einer Lösung von O-Phosphonooxymethylcyclosporin-A-dibenzylester in Tetrahydrofuran (100 ml) und Wasser (5 ml) wird Palladium-auf-Kohlenstoff (10%, 500 mg) zugegeben. Dieses Gemisch wird unter einer Atmosphäre von Wasserstoff (1 atm) 35 Minuten lang gerührt. Der Katalysator wird durch Filtration durch Celite entfernt. Das Celite wird anschließend mit Tetrahydrofuran (300 ml) gewaschen und die vereinigten Filtrate werden unter vermindertem Druck eingedampft. Der resultierende Feststoff wird mit Ether (2 × 20 ml), Hexan (50 ml) gewaschen, in vacuo getrocknet und anschließend in heißem Methanol (60 ml) aufgelöst. Die Lösung wird filtriert, unter vermindertem Druck auf ein Volumen von ~10 ml konzentriert. Nach einstündigem Stehen bei Raumtemperatur wird die Lösung über Nacht in einen Kühlschrank gestellt. Der über Nacht gebildete kristalline Niederschlag wird abfiltriert und in vacuo getrocknet, um die oben genannte Verbindung als einen Feststoff zu ergeben. Das Filtrat wird auf ein Volumen von ~1 ml konzentriert und eine Stunde lang in einem Kühlschrank aufbewahrt, um zusätzliches Produkt zu ergeben.
BIOLOGISCHE BEWERTUNG
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind neue pharmazeutische Mittel; repräsentative Verbindungen der Formel I sind in in vitro- und in in vivo-Umwandlungsuntersuchungen untersucht worden. Bei allen diesen Untersuchungen wurden die Prodrugs in ihre pharmazeutisch aktiven Mutterverbindungen umgewandelt.
(1) Abschätzung der Löslichkeit von Propofolprodrug in Wasser
Die Wasserlöslichkeit von Propofolprodrug beträgt etwa 500 mg/ml auf der Grundlage der HPLC-Analyse einer gesättigten wässrigen Lösung.
(2) In vitro-Umwandlung von Propofolprodrug in Propofol
Die in vitro-Umwandlung von Propofolprodrug in Propofol wurde unter Verwendung von alkalischer Phosphatase in Glycinpuffermedium pH 10,4 durchgeführt. 25 ml einer 100 μg/ml-Propofolprodruglösung in Glycinpuffer wurden hergestellt. Ein Milliliter wurde als Nullpunkt zurückbehalten und die restlichen 24 ml wurden in ein 37°C-Wasserbad gegeben. 960 μl einer 0,1 mg/ml-Lösung von alkalischer Phosphatase in Glycinpuffer wurden zu den 24 ml der Propofolprodruglösung zugegeben, vermischt und wieder in das Wasserbad gegeben. Proben von 1,5 ml wurden nach 5, 10, 20, 30, 40, 60, 90, 120, 180, 240, 300 und 360 Minuten entnommen. Zu jeder Probe wurden sofort 10 μl Eisessig zugegeben, um die enzymatische Reaktion zu unterbrechen. Die Proben wurden durch HPLC analysiert, um die Konzentration des Propofolprodrugs und des Propofols zu bestimmen. Die Ergebnisse der in vitro-Umwandlung sind in 1 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Propofolprodrug ein Substrat für alkalische Phosphatase ist.
(3) Bewertung der Gesamttoxizität bei Ratten
Propofolprodrug wurde für die i.v.-Injektion zubereitet in einer Konzentration von 68 mg/ml in 0,9% Natriumchlorid für Injektionszwecke, USP. Diese Konzentration entspricht 36 mg/ml Propofol. Die Propofolprodruglösung wurde vor der Verabreichung durch eine 0,22 μm-Nylonmembran filtriert.
Die Bewertung des Propofolprodrugs an Ratten wurde mit zwei männlichen Harlen-Sprague-Dawley-Ratten durchgeführt, die 820 und 650 g wogen. Die 820 g wiegende Ratte erhielt 200 μl der Propofolprodrug i.v.-Formulierung (äquivalent 9 mg/kg Propofol) und zwar in die Schwanzvene. Nach etwa 12 Minuten wurde aus der Schwanzvene (mit einer heparinisierten Spritze) eine Blutprobe entnommen. Die 650 g wiegende Ratte erhielt eine Dosis des milden Sedativums Metaphane^®, bevor sie die Propofolprodrugformulierung erhielt. Die 650 g wiegende Ratte wurde mit 125 μl der Propofolprodrugformulierung in die Schwanzvene injiziert und eine Blutprobe wurde aus der Schwanzvene (mit einer heparinisierten Spritze) nach etwa sechs Minuten entnommen. Die Blutproben von beiden Ratten wurden durch HPLC bezüglich Propofol analysiert.
Die Ergebnisse der Propofolprodruginjektion bei beiden Ratten waren ähnlich. Beide Ratten wurden nach ein paar Minuten unruhig, verloren jedoch nie ihren Aufrichtreflex. Auf Grundlage visueller Beobachtung erholten sich die Ratten vollständig von den Propofolprodruginjektionen. Blut, das beiden Ratten entnommen wurde, bestätigte das Vorhandensein von Pro pofol durch HPLC-Analyse. Die Ratten zeigten keine Zeichen von Unwohlsein aufgrund des Propofolprodrugs.
(4) Pharmakokinetische Bewertung bei Hunden
Eine pharmakokinetische Bewertung mit Diprivan^® oder dem Propofolprodrug wurde bei Hunden durchgeführt, und zwar mit einer ausreichenden „Washout"-Zeit zwischen den Untersuchungen. Die Blutkonzentrationen wurden unter Verwendung von HPLC mit Fluoreszenzdetektion bestimmt, während die Gehirnaktivität durch Elektroenzephalographie (EEG) mit zwei Leitungen gemessen wurde. Vor der Verabreichung an die Hunde wurden den Hunden die Augen verbunden, Watte in ihre Ohren gesteckt und die Pfoten der Hunde wurden zusammengebunden, um ihre Bewegung und andere äußere Reize zu minimieren, so dass der Einfluss des Propofols auf die Gehirnwellenaktivität der Hunde am effizientesten gemessen werden konnte.
Die Untersuchung der Propofol-Blutkonzentration als Funktion der Zeit wurde mit einem Beagle, der ~13 kg wog, durchgeführt. Vor der Injektion wurden etwa 8 ml Blut entnommen, um Standardkurven herzustellen und als Ausgangsniveau zum Zeitpunkt null. Die Hunde erhielten ein Volumen Diprivan^® oder Propofolprodrugformulierung, das 7 mg/kg Propofol entsprach, und zwar durch Injektion in die Kopfvene.
Zwei ml-Blutproben wurden entweder über die Kopfvene (nicht die gleiche Vene wie für die Injektion), die Drosselvene oder die Rosenvene (mit einer heparinisierten Spritze) entnommen, und zwar nach 1, 3, 5, 10, 15, 20 und 30 Minuten nach der Injektion. Blutproben wurden auch nach 60, 90, 120, 180, 240, 300, 360, 480 und 1440 Minuten entnommen. Die Blutproben wurden unmittelbar nach der Entnahme aus dem Hund extrahiert, um das Propofol zu entfernen. Vor Verabreichung des Diprivan^® oder der Propofolprodrugformulierung wurden die Hunde etwa 20 Stunden lang fasten gelassen. Nachdem die Probe nach 120 Minuten genommen worden war, durfte der Hund Wasser trinken. Futter wurde dem Hund gegeben, nachdem die Blutprobe nach 480 Minuten erhalten worden war. Das normale Futter des Hundes war Hills' Science Diet Maintenance. Der Hund wurde unter einem Hell-/Dunkel-Zyklus von 12 Stunden Licht pro Tag gehalten.
Die Konzentration des Propofols in den Blutproben wurde unter Verwendung von HPLC mittels Fluoreszenzdetektion bestimmt. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Die Blutextraktion und das HPLC-Verfahren, die verwendet wurden, beruhten auf der von Plummer (1987) veröffentlichten Arbeit mit geringfügigen Abwandlungen. Die verwendete Probenvorbereitung und das Testverfahren waren wie folgt:
Zu einer 1 ml-Blutprobe wurden 10 μl Thymol als interner Standard (20 μg/ml) und 1 ml Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,2) zugegeben, wobei nach jeder Zugabe zur Vermischung verwirbelt wurde. Sodann wurden fünf ml Cyclohexan zugegeben und die Proben wurden bei 75 UpM 20–30 Minuten lang vermischt. Die organische Schicht wurde durch 1-minütiges Zentrifugieren bei etwa 2000 UpM abgetrennt. Etwa 4,5 ml der organischen Schicht wurden in ein Rohr überführt, das 50 μl verdünnte Tetramethylammoniumhydroxid-(TMAH)-Lösung von etwa 1,8% (Gew./Vol.) enthielt. Das Lösungsmittel wurde unter einem Strom von Stickstoff zur Trockenheit eingedampft und mit 200 μl Mobile Phase A rekonstituiert. Die Proben wurden 30 Sekunden lang bei 15.000 UpM zentrifugiert, um etwaige Teilchen zu entfernen, und der Überstand wurde in die HPLC injiziert. Standardkurvenproben wurden hergestellt durch „Spiken" von 1 ml-Teilvolumina des ursprünglichen Blutes mit Propofol in Konzentrationen von 5, 1, 0,5, 0,1 und 0,01 μg/ml. Diese Standards wurden auf die gleiche Weise behandelt wie die Proben.
Das HPLC-System bestand aus den folgenden Shimadzu-Komponenten: LC-10AT-Pumpen, SCL-10A-Systemkontroller, RF 353-Fluoreszenzdetektor und SIL-10A-Autoprobennehmer. Die HPLC-Parameter waren wie folgt: Anregung bei 275 nm und Emission bei 320 nm; Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min; das Injektionsvolumen betrug 3–30 μl in Abhängigkeit von der Propofolkonzentration. Die HPLC-Säule war eine Zorbax RX-C18, 15 cm × 4,5 mm Innendurchmesser, 5 μm Teilchengröße. Mobile Phase A war 60:40 (Vol./Vol.) Acetonitril: 25 mM Phosphat, 15 mM TBAP-Puffer pH 7,1. Mobile Phase B war 80:10:10 (Vol./Vol./Vol.) Acetonitril:Wasser:THF. Mobile Phase B wurde verwendet, um die Säule zu reinigen, nachdem das Thymol und Propofol unter Verwendung der mobilen Phase A eluierten (4,2 bzw. 7,4 Minuten).
Auf der Grundlage visueller Beobachtung und von EEG-Mustern zeigte der Hund nach der Injektion beider Formulierungen Zeichen der Narkose. Der Hund erholte sich von der Narkose durch beide Formulierungen innerhalb von 20–30 Minuten. Die Propofolblutkonzentrationen, die sich bei Injektion des Propofolprodrugs ergeben, sind ähnlich denen, die sich bei Injektion von Diprivan^® ergeben.

Claims

Verbindung der Formel: I
worin R-O- ein Rest einer phenolhaltigen pharmazeutischen Verbindung ist, R¹ Wasserstoff oder ein Alkalimetallion oder ein protoniertes Amin oder eine protonierte Aminosäure ist, R² Wasserstoff oder ein Alkalimetallion oder ein protoniertes Amin oder eine protonierte Aminosäure ist, und n eine Ganzzahl von 1 oder 2 ist; m eine Ganzzahl von mindestens 1 ist; sowie deren pharmazeutisch verträglichen Salze.
Verbindung nach Anspruch 1, worin die phenolhaltige Verbindung aus der Gruppe bestehend aus Propofol, Etoposid und Vitamin E ausgewählt ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin die Alkalimetallionen von R¹ und R² unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus Natrium, Kalium und Lithium ausgewählt sind.
Verbindung nach Anspruch 1, worin die Verbindung aus der Gruppe bestehend aus:
ausgewählt ist, worin Z aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkalimetallion und Amin ausgewählt ist, sowie deren pharmazeutisch verträglichen Salzen.
Verbindung nach Anspruch 4, worin Z jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus Natrium, Tromethamin, Triethanolamin, Triethylamin, Arginin, Lysin, Ethanolamin und N-Methylglucamin ausgewählt ist.
Verbindung der Formel III:
worin R-O- ein Rest einer phenolhaltigen pharmazeutischen Verbindung ist, sowie deren pharmazeutisch verträglichen Salze.
Verbindung nach Anspruch 6, worin die Verbindung aus der Gruppe bestehend aus:
ausgewählt ist.
Verbindung der Formel IV:
worin R-O- ein Rest einer phenolhaltigen pharmazeutischen Verbindung ist, Y eine Phosphono-schützende Gruppe ist, und n eine Ganzzahl von 1 oder 2 ist; sowie deren pharmazeutisch verträglichen Salze.
Verbindung nach Anspruch 8, worin die Verbindung aus der Gruppe bestehend aus:
ausgewählt ist, worin Y eine Phosphono-schützende Gruppe ist.
Verbindung nach Anspruch 8, worin die Phosphono-schützende Gruppe aus der Gruppe bestehend aus einer Benzylgruppe, einer t-Butylgruppe, einer Allylgruppe und anderen verträglichen Phosphat-schützenden Gruppen ausgewählt ist.
Pharmazeutische Zubereitung, umfassend: eine effektive Menge einer Verbindung nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 4, umfassend: die Entfernung einer Phosphono-schützenden Gruppe aus einer Verbindung einer der folgenden Formeln:
worin Y eine Phosphono-schützende Gruppe ist; und Isolierung des Produktes.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 6, umfassend: Reaktion einer Verbindung der Formel R-O-H, worin R-O- ein Rest einer phenolhaltigen pharmazeutischen Verbindung ist, sowie deren pharmazeutisch verträglichen Salze, mit Dimethylsulfoxid in Gegenwart von Essigsäureanhydrid und Essigsäure; und Isolierung des Produktes.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 8, umfassend: Reaktion einer Verbindung der Formel III:
worin R-O- ein Rest einer phenolhaltigen pharmazeutischen Verbindung ist, und deren pharmazeutisch verträglichen Salze, mit N-Iodsuccinamid und einer geschützten Phosphorsäure der Formel HOP(O)(OY)₂, worin Y eine Phosphono-schützende Gruppe ist; und Isolierung des Produktes.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die Phosphono-schützende Gruppe aus der Gruppe bestehend aus einer Benzylgruppe, einer t-Butylgruppe und einer Allylgruppe ausgewählt ist.
Zubereitung nach Anspruch 11 zur Verwendung als Medikament.
Verwendung einer Verbindung nach der Formel I wie in Anspruch 1 definiert zur Herstellung eines Medikaments.
Verwendung nach Anspruch 17, worin das Medikament zur oralen Verabreichung vorgesehen ist.
Verwendung nach Anspruch 17, worin das Medikament zur parenteralen Verabreichung vorgesehen ist.
Verwendung nach Anspruch 17, worin die Verbindung ein Propofol-Derivat ist, und das Medikament ein anästhetischen Effekt erzeugt.
Verwendung nach Anspruch 17, worin das Medikament Anti-Tumor-Aktivität zeigt.
Verbindung nach Anspruch 1 der Formel I,
worin R-O ein Rest von Propofol ist, R¹ Wasserstoff oder ein Alkalimetallion oder ein protoniertes Amin oder eine protonierte Aminosäure ist, R² Wasserstoff oder ein Alkalimetallion oder ein protoniertes Amin oder eine protonierte Aminosäure ist, n eine Ganzzahl von 1 oder 2 ist, m eine Ganzzahl von mindestens 1 ist; sowie deren pharmazeutisch verträglichen Salze.
Verbindung nach Anspruch 22, worin das Alkalimetallion von R¹ und R² unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus Natrium, Kalium und Lithium ausgewählt ist.
Verbindung nach Anspruch 1 der Formel
worin Z aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkalimetallion und protoniertem Amin ausgewählt sind, und deren pharmazeutisch verträglichen Salzen.
Verbindung nach Anspruch 24, worin n 1 ist, und Z unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus Natrium, Tromethamin, Triethanolamin, Triethylamin, Arginin, Lysin, Ethanolamin und N-Methylglucamin ausgewählt ist.
Verbindung nach Anspruch 8 der Formel IV, worin R-O ein Rest von Propofol ist, Y eine Phosphono-schützende Gruppe ist und n eine Ganzzahl von 1 oder 2 ist; sowie deren pharmazeutisch verträglichen Salze.
Verbindung nach Anspruch 26 der Formel
worin Y eine Phosphono-schützende Gruppe ist.
Verbindung nach Anspruch 27, worin die Phosphono-schützende Gruppe aus der Gruppe bestehend aus einer Benzylgruppe, einer t-Butylgruppe, einer Allylgruppe und anderen verträglichen Phosphat-schützenden Gruppen ausgewählt ist.
Pharmazeutische Zubereitung, umfassend eine effektive Menge der Verbindung nach Anspruch 22 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verbindung der Formel
worin R aus der Gruppe bestehend aus Etoposid und Vitamin E ausgewählt ist, und Z aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkalimetallion und protoniertem Amin ausgewählt ist; und deren pharmazeutisch verträglichen Salzen.
Verbindung der Formel
worin R aus der Gruppe bestehend aus Etoposid und Vitamin E ausgewählt ist, und Y eine Phosphono-schützende Gruppe ist.
Verbindung nach Anspruch 1 der Formel I
worin R-O ein Rest von Etoposid ist, R¹ Wasserstoff oder ein Alkalimetallion oder ein protoniertes Amin oder eine protonierte Aminosäure ist, R² Wasserstoff oder ein Alkalimetallion oder ein protoniertes Amin oder eine protonierte Aminosäure ist, n eine Ganzzahl von 1 oder 2 ist, m eine Ganzzahl von mindestens 1 ist; sowie deren pharmazeutisch verträglichen Salze.
Verwendung der Verbindung nach Anspruch 32 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung mit Anti-Tumor Aktivität.