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Die
Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Molekulargenetik und Medizin.
Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf das Gebiet
der Gentherapie, insbesondere auf die Gentherapie unter Verwendung
von Viren, insbesondere Adenoviren.
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Bei
der Gentherapie wird zur Zeit genetische Information an eine Wirtszelle
geliefert, um entweder einen genetischen Mangel in der Zelle zu
korrigieren (zu ergänzen)
oder um eine unerwünschte
Funktion in der Zelle zu hemmen oder um die Wirtszelle zu eliminieren.
Natürlich
kann die genetische Information auch dazu vorgesehen sein, die Wirtszelle
mit einer gewünschten
Funktion zu versorgen, z.B. ein sezerniertes Protein zuzuführen, um
andere Zellen des Wirtes zu behandeln, usw.
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Es
gibt also im Grunde drei verschiedene Ansätze in der Gentherapie; davon
ist einer auf die Kompensierung eines bei einem (Säuger-)Wirt
vorhandenen Mangels gerichtet, der zweite ist auf die Entfernung
oder Beseitigung von unerwünschten
Substanzen (Organismen oder Zellen) gerichtet, und der dritte ist
darauf gerichtet, eine Zelle mit einer gewünschten Funktion zu versehen.
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Für Gentherapiezwecke
wurden Adenoviren als geeignete Träger vorgeschlagen, um Gene
an den Wirt abzugeben. Von Adenoviren abgeleitete Genübertragungsvektoren
(sogenannte adenovirale Vektoren) haben mehrere Merkmale, aufgrund
derer sie für
die Genübertragung
besonders gut geeignet sind. 1) Die Biologie der Adenoviren ist
im Einzelnen charakterisiert worden; 2) das Adenovirus ist nicht
mit schlimmen Krankheiten beim Menschen assoziiert; 3) das Virus
ist äußerst effizient
bei der Einführung
seiner DNA in die Wirtszelle; 4) das Virus kann eine Vielzahl von
Zellen infizieren und hat ein breites Wirtsspektrum; 5) das Virus kann
in großen
Mengen mit hohen Virustitern hergestellt werden; und 6) das Virus
kann durch Deletion des Early-Bereichs 1 (E1) des viralen Genoms
replikationsunfähig
gemacht werden (Brody et al., 1994).
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Mit
der Verwendung von adenoviralen Vektoren sind jedoch immer noch
Nachteile verbunden. Typischerweise rufen Adenoviren, insbesondere
die gut untersuchten Serotypen, bei einem Wirt, in den sie eingeführt werden,
eine Immunantwort hervor. Außerdem
hat das Virus zwar allgemein ein breites Infektionsspektrum, doch
gibt es ein Problem bei der Ansteuerung bestimmter Zellen und Gewebe.
Außerdem
sind die Replikation und andere Funktionen des Adenovirus nicht
immer sehr gut für
die Zellen geeignet, die mit dem zusätzlichen genetischen Material
versehen werden sollen.
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Das
Adenovirusgenom ist ein lineares doppelsträngiges DNA-Molekül aus ungefähr 36 000
Basenpaaren. Die Adenovirus-DNA enthält identische invertierte terminale
Wiederholungssequenzen (inverted terminal repeats; ITR) von ungefähr 90-140
Basenpaaren, wobei die genaue Länge
vom Serotyp abhängt.
Die viralen Replikationsstartpunkte liegen innerhalb der ITRs genau
an den Enden des Genoms. Die meisten adenoviralen Vektoren, die
zur Zeit in der Gentherapie verwendet werden, weisen eine Deletion
im E1-Bereich auf, wo neue genetische Information eingeführt werden
kann. Durch die E1-Deletion ist das rekombinante Virus replikationsunfähig (Levrero
et al., 1991). Es wurde ausführlich
nachgewiesen, dass rekombinantes Adenovirus, insbesondere Serotyp
5, für
eine effiziente Übertragung
von Genen in vivo an die Leber, das Atemwegsepithel und feste Tumoren
in Tiermodellen und humanen Xenotransplantaten in immunschwachen
Mäusen
geeignet ist (Bout 1996; Blaese et al. 1995). Daher machen sich
bevorzugte Verfahren zur in-vivo-Genübertragung in Zielzellen adenovirale
Vektoren als Genabgabeträger
zu Nutze.
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Zur
Zeit wurden sechs verschiedene Untergruppen von humanen Adenoviren
vorgeschlagen, die insgesamt 51 verschiedene Adenovirus-Serotypen
umfassen (siehe Tabelle 1). Neben diesen humanen Adenoviren wurde
eine große
Zahl von tierischen Adenoviren identifiziert (siehe Ishibashi et
al., 1983).
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Ein
Serotyp wird auf der Basis seiner immunologischen Eigenart definiert,
die durch quantitative Neutralisation mit tierischem Antiserum (Pferd,
Kaninchen) bestimmt wird. Wenn die Neutralisation einen gewissen Grad
der Kreuzreaktion zwischen zwei Viren zeigt, wird die Eigenart des
Serotyps angenommen, wenn A) die Hämagglutinine nicht miteinander
verwandt sind, was sich durch ein Fehlen einer Kreuzreaktion auf
die Hämagglutinationshemmung
zeigt, oder B) es erhebliche biophysikalische/biochemische Unterschiede
in der DNA gibt (Francki et al., 1991). Die neun zuletzt identifizierten
Serotypen (42-51) wurden zuerst aus HIV-infizierten Patienten isoliert
(Hierholzer et al., 1988; Schnurr et al., 1993; De Jong et al.,
1998). Aus nicht gut verstandenen Gründen verbreiten die meisten
dieser immungeschwächten
Patienten Adenoviren, die aus immunkompetenten Individuen selten
oder nie isoliert wurden (Hierholzer et al., 1988, 1992; Khoo et
al., 1995; De Jong et al., 1998).
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Neben
Unterschieden bezüglich
der Empfindlichkeit verschiedener Adenovirus-Serotypen gegenüber neutralisierenden Antikörpern wurde
auch gezeigt, dass Adenoviren der Untergruppe C, wie Ad2 und Ad5,
an andere Rezeptoren binden als Adenoviren der Untergruppe B, wie
Ad3 (Defer et al., 1990). Ähnlich
wurde auch nachgewiesen, dass die Rezeptorspezifität geändert werden
kann, indem man das Ad3- mit dem Ad5-Knob-Protein austauscht und
umgekehrt (Krasnykh et al., 1996; Stevenson et al., 1995, 1997).
Der Adenovirus-Serotyp 5 wird für
Gentherapiezwecke am verbreitetsten verwendet. Ähnlich wie die Serotypen 2,
4 und 7 hat auch Serotyp 5 eine natürliche Affinität zu Lungenepithel
und anderen Geweben der Atemwege. Dagegen ist zum Beispiel bekannt,
dass die Serotypen 40 und 41 eine natürliche Affinität zum Magen-Darm-Trakt haben.
Wegen eines detaillierten Überblicks
der Krankheitsassoziation der verschiedenen Adenovirus-Serotypen siehe Tabelle
2. Die oben beschriebenen Serotypen unterscheiden sich wenigstens
in Bezug auf die Capsidproteine (Pentonbase, Hexon), die Proteine,
die für
die Zellbindung verantwortlich sind (Faserprotein) und die Proteine,
die an der Replikation des Adenovirus beteiligt sind.
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Eines
der Hauptprobleme der Adenovirus-Gentherapie besteht also darin,
dass keiner der oben beschriebenen Serotypen ideal geeignet ist,
um zusätzliches
genetisches Material an Wirtszellen zu liefern. Einige haben ein
etwas beschränktes
Wirtsspektrum, haben aber den Vorteil, weniger immunogen zu sein,
und bei einigen ist es umgekehrt. Einige haben das Problem, dass
sie nur eine beschränkte
Virulenz aufweisen, aber ein breites Wirtsspektrum und/oder eine
reduzierte Immunogenität
haben. Um die Dinge noch komplizierter zu machen, hängt diese
Variation bei den Adenovirus-Serotypen auch stark von dem zu behandelnden
Wirt ab. Einige Wirte sind bestimmten Serotypen vielleicht schon
begegnet und produzieren daher eine starke Immunantwort gegen den
Serotyp oder einen verwandten Serotyp. Der Fachmann weiß, dass
es noch viele andere Variationen über dieses Thema gibt.
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Die
vorliegende Erfindung macht sich nun die Tatsache zu Nutze, dass
einige Adenoviren eine geringere Immunogenität haben als andere, wobei diese
anderen typischerweise hervorragend in einer der anderen Anforderungen
für eine
effiziente Gentherapie sind, wie einer hohen Spezifität für eine bestimmte
Gruppe von Wirtszellen, einer guten Replikationsmaschinerie in solchen
Wirtszellen, einer hohen Infektionsrate bei bestimmten Wirtszellen
usw. Die Erfindung stellt also chimärische Adenoviren bereit, die
die nützlichen
Eigenschaften von wenigstens zwei Adenoviren unterschiedlicher Serotypen
aufweisen. Typischerweise sind mehr als zwei Anforderungen aus der
obigen nicht umfassenden Liste erforderlich, um ein Adenovirus zu
erhalten, das effizient zusätzliches
Material auf eine Wirtszelle übertragen
kann, und daher stellt die Erfindung von Adenoviren abgeleitete
Vektoren bereit, die als Cassetten verwendet werden können, um
verschiedene adenovirale Gene aus unterschiedlichen adenoviralen
Serotypen an den erforderlichen Stellen einzusetzen, um einen Vektor
zu erhalten, der ein chimärisches
Adenovirus exprimieren kann, wodurch selbstverständlich auch ein interessierendes
Gen zum Beispiel an der Stelle von E1 des ursprünglichen Adenovirus, von dem
der Vektor abgeleitet ist, eingesetzt werden kann. Auf diese Weise
kann das zu produzierende chimärische
Adenovirus an die Anforderungen und Bedürfnisse bestimmter Wirte, die
eine Gentherapie bestimmter Störungen
benötigen,
angepasst werden. Um diese Produktion zu ermöglichen, wird selbstverständlich im
Allgemeinen eine Verpackungszelle notwendig sein, um eine ausreichende
Menge unbedenklicher chimärischer
Adenoviren zu produzieren.
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Chimärische adenovirale
Vektoren sind in der Technik bekannt. WO 98/22609 offenbart chimärische adenovirale
Vektoren, bei denen wenigstens ein Gen (das Faser, Hexon oder Penton
codiert) oder ein Teil davon durch das entsprechende Gen oder ein
Teil davon aus einem zweiten Adenovirus, das zu einem anderen Serotyp
gehört,
ersetzt ist. WO 96/26281 offenbart ein rekombinantes Adenovirus,
das ein Faserprotein eines anderen Serotyps umfasst. In keinem dieser
Dokumente wird offenbart oder nahegelegt, chimärische Adenoviren mit einem
geänderten
Infektionswirtsspektrum herzustellen, bei denen das Faserprotein
eine Knob-Domäne
eines Adenovirus Serotyp 12, 16, 32, 40-S, 40-L, 49 oder 51 umfasst.
Die Dokumente offenbaren auch keine rekombinanten adenoviralen Vektoren
für die
Produktion solcher Viren.
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In
einer Ausführungsform
stellt die Erfindung also ein chimärisches Adenovirus bereit,
das wenigstens einen Teil eines Faserproteins und/oder ein Protein,
das an der Replikation eines Adenovirus-Serotyps beteiligt ist,
umfasst, wodurch das chimärische
Virus mit einem gewünschten
Wirtsspektrum und/oder verbesserten Replikationseigenschaften und
wenigstens einem Teil eines Penton- oder Hexonproteins aus einem
anderen, weniger antigenen Adenovirus-Serotyp versehen wird, was
zu einem weniger antigenen chimärischen
Adenovirus führt.
Typischerweise wird ein solches Virus mit Hilfe eines Vektors (typischerweise
ein Plasmid, ein Cosmid oder Baculovirussystem) produziert, wobei
der Vektor selbstverständlich
ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist. Ein bevorzugter
Vektor ist ein Vektor, der verwendet werden kann, um ein chimärisches rekombinantes
Virus herzustellen, das speziell an den zu behandelnden Wirt und
die zu behandelnde Störung angepasst
ist. Ein solcher Vektor stellt eine weitere Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung dar. Die Erfindung stellt also einen rekombinanten Vektor
bereit, der von einem Adenovirus abgeleitet ist, das wenigstens ein
ITR und ein Verpackungssignal umfasst, eine Insertionsstelle für eine interessierende
Nucleinsäuresequenz
aufweist und weiterhin eine Insertionsstelle aufweist, um ein Gen
funktionell einzusetzen, das ein Penton- und/oder ein Hexonprotein eines ersten
Adenovirus-Serotyps codiert, und eine Insertionsstelle für ein Gen aufweist,
das ein Faserprotein eines zweiten Adenovirus eines anderen Serotyps
codiert, und/oder eine Insertionsstelle für ein Gen aufweist, das von
einem Serotyp abgeleitet ist, der verbesserte Merkmale in der Funktion
aufweist, die von diesem Gen oder seinem Produkt ausgeübt wird.
Typischerweise stellt die Erfindung Cassetten bereit, die die Produktion
jedes gewünschten
chimärischen
Adenovirus ermöglichen,
wenn es nur von zwei Serotypen abgeleitet ist, oder von so vielen,
wie benötigt
werden, um die gewünschten
Merkmale zu erhalten, wobei es nicht immer notwendig ist, dass alle
Merkmale die besten sind, wenn man sie als einzelne Eigenschaften
betrachtet. Es ist zum Beispiel vielleicht nicht einmal notwendig,
stets das Penton und/oder Hexon zusammen mit einem anderen Teil
der Adenovirus-Gene zu verändern.
Zuweilen braucht die Immunogenität
nicht zusammen mit anderen Eigenschaften verändert zu werden. Es wird jedoch
bevorzugt, Penton- und/oder Hexon-Gene von weniger immunogenen Adenovirus-Serotypen
zu verwenden. Ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung das
Mittel zur Produktion des chimärischen
Virus. Typischerweise möchte
man keine Adenoviruscharge an die Wirtszelle verabreichen, die replikationskompetentes
Adenovirus enthält,
obwohl dies nicht immer gilt. Im Allgemeinen möchte man daher mehrere Gene
(aber wenigstens eines) aus dem adenoviralen Genom auf dem Vektor,
der das chimärische
Virus codiert, weglassen und diese Gene in das Genom der Zelle einfügen, in
die der Vektor eingebracht wird, wobei ein chimärisches Adenovirus entsteht.
Eine solche Zelle wird gewöhnlich
eine "Verpackungszelle" genannt. Die Erfindung
stellt also auch eine Verpackungszelle zur Herstellung eines chimärischen
Adenovirus gemäß der Erfindung
bereit, die in trans alle Elemente, die für die Adenoviruserzeugung notwendig
sind, aber auf dem adenoviralen Vektor gemäß der Erfindung nicht vorhanden
sind, umfasst. Typischerweise müssen
der Vektor und die Verpackungszelle aneinander angepasst werden,
so dass sie alle notwendigen Elemente aufweisen, aber keine überlappenden
Elemente aufweisen, die durch Rekombination zu einem replikationskompetenten
Virus führen.
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Die
Erfindung stellt also einen Kit bereit, der eine Verpackungszelle
gemäß der Erfindung
und einen rekombinanten Vektor gemäß der Erfindung umfasst, wobei
es im Wesentlichen keine Sequenzüberlappung, die
zu einer Rekombination führt,
welche zur Produktion von replikationskompetentem Adenovirus führen würde, zwischen
der Zelle und dem Vektor gibt.
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Um
den viralen Vektor nach Belieben genau anpassen und das chimärische Virus
mit den gewünschten
Eigenschaften versehen zu können,
wird vorzugsweise eine Bibliothek von adenoviralen Genen bereitgestellt,
wobei sich die Gene zwischen Restriktionsstellen befinden. Typischerweise
ist es bevorzugt, dieselben Arten von Genen von verschiedenen Serotypen
zwischen denselben Restriktionsstellen zu haben und dieselbe Restriktionsstelle
auch in dem adenoviralen Vektor zu haben, der zur Herstellung des
chimärischen
Virus verwendet wird. Wenn alle Stellen für unterschiedliche Gene einzigartig
sind, hat man ein System, aus dem man gezielt auswählen kann.
Man kann ein Penton-Gen aus dem gewünschten Serotyp aus der Bibliothek ausschneiden
und es an derselben Stelle im Vektor einsetzen. Dann kann man ein
anderes Restriktionsenzym verwenden, um ein Replikations-Gen mit
Hilfe eines anderen Restriktionsenzyms aus der Bank eines anderen Serotyps
auszuschneiden und dieses Gen an der entsprechenden Restriktionsstelle
in den chimärischen
Vektor einzusetzen. Es ist also zu bevorzugen, einen Vektor gemäß der Erfindung
zu haben, bei dem die Insertionsstellen verschiedene und vorzugsweise
einzigartige Restriktionsstellen sind. Vorzugsweise wird dieser Vektor
mit einer Bibliothek kombiniert, die die entsprechenden Gene innerhalb
derselben Restriktionsstellen aufweist. Verfahren zur Verwendung
dieser Bibliothek und des Vektors unterliegen dem fachmännischen
Können
und sind Bestandteil der vorliegenden Erfindung. Typischerweise
umfasst ein solches Verfahren mehrere Restriktions- und Ligierungsschritte
und die Expression des Ergebnisses in einer Verpackungszelle. Außerdem kann
man auch eine Bibliothek verwenden, aus der die verschiedenen gewünschten adenoviralen
Gene durch homologe Rekombination oder eine Kombination von Restriktion
und Rekombination erhalten werden. Die Erfindung stellt also ein
Verfahren zur Herstellung eines chimärischen Adenovirus bereit,
das ein gewünschtes Wirtsspektrum
und eine reduzierte Antigenität
aufweist, wobei das Verfahren das Bereitstellen eines Vektors gemäß der Erfindung,
der die gewünschten
Insertionsstellen aufweist, das Einsetzen wenigstens eines funktionellen
Teils eines Penton- oder Hexonproteins, das von einem Adenovirus-Serotyp
mit relativ geringer Antigenität
abgeleitet ist, in den Vektor, das Einsetzen wenigstens eines funktionellen
Teils eines Faserproteins, das von einem Adenovirus-Serotyp mit
dem gewünschten
Wirtsspektrum abgeleitet ist, und das Transfizieren einer Verpackungszelle
gemäß der Erfindung
mit dem Vektor und Ermöglichen
der Produktion von chimärischen
Viruspartikeln. Selbstverständlich
können
auch andere Kombinationen von anderen viralen Genen, die aus verschiedenen
Serotypen stammen, eingesetzt werden, wie es oben offenbart ist.
Eine immunogene Antwort auf Adenovirus, die typischerweise auftritt,
ist die Produktion von neutralisierenden Antikörpern durch den Wirt. Dies
ist typischerweise ein Grund dafür,
dass man ein Penton-, Hexon und/oder eine Faser eines weniger immunogenen
Serotyps auswählt.
Selbstverständlich
ist es vielleicht nicht notwendig, chimärische Adenoviren herzustellen,
die vollständige
Proteine von verschiedenen Serotypen aufweisen. Es liegt wohl im
Bereich des fachmännischen
Könnens,
chimärische
Proteine herzustellen; zum Beispiel ist es im Falle von Faserproteinen sehr
wohl möglich,
die Basis von einem Serotyp und den Schaft und den Knob von einem
anderen Serotyp zu verwenden. Auf diese Weise wird es möglich, dass
die Teile des Proteins, die für
den Zusammenbau von Viruspartikeln verantwortlich sind, von demselben
Serotyp stammen, wodurch die Produktion von intakten Viruspartikeln
verstärkt
wird. Die Erfindung stellt also auch ein chimärisches Adenovirus gemäß der Erfindung
bereit, bei dem die Hexon-, Penton- und/oder Faserproteine chimärische Proteine
sind, die von verschiedenen Adenovirus-Serotypen stammen. Neben
der Erzeugung von chimärischen
Adenoviren durch Austauschen von ganzen Wildtyp-Hexon-, -Penton-,
-Faser(protein)-Genen usw. oder Teilen davon liegt es auch innerhalb
des Umfangs der vorliegenden Erfindung, Hexon-, Penton-, Faser(protein)-Gene usw.
einzusetzen, die Mutationen, wie Punktmutationen, Deletionen, Insertionen
usw., tragen und die leicht in Bezug auf bevorzugte Merkmale, wie
Temperaturstabilität,
Zusammenbau, Verankerung, umgeleitete Infektion, veränderte Immunantwort usw.,
durchmustert werden können.
Wiederum können
auch andere chimärische
Kombinationen erzeugt werden und liegen innerhalb des Umfangs der
vorliegenden Erfindung.
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Die
Verfügbarkeit
einer Bibliothek von Nucleinsäuren,
die von verschiedenen Serotypen abgeleitet sind, ermöglicht unter
anderem die Erzeugung einer Bibliothek von chimärischen Adenoviren. Die Erfindung stellt
daher weiterhin eine Bibliothek von chimärischen Adenoviren bereit.
In einer Ausführungsform
stellt die Erfindung eine Bibliothek von chimärischen Adenoviren bereit,
wobei die Adenoviren chimärische
Kapside umfassen, d.h. Kapsidproteine umfassen, die wenigstens zum
Teil von wenigstens zwei verschiedenen Adenovirus-Serotypen abgeleitet
sind. Vorzugsweise sind in der (chimärischen) Adenovirus-Bibliothek
Nucleinsäuren und/oder
Proteine oder Teile davon von wenigstens einem repräsentativen
Adenovirus von jeder Adenovirus-Untergruppe repräsentiert. Vorzugsweise sind
die Nucleinsäuren
und/oder Proteine oder Teile davon von mehr als einem Vertreter
jeder Adenovirus-Untergruppe abgeleitet. Am meisten bevorzugt umfasst
die Bibliothek Nucleinsäuren
und/oder Proteine oder Teile davon von im Wesentlichen jedem bekannten
Vertreter jeder Adenovirus-Untergruppe.
Nucleinsäuren
und/oder Proteine oder Teile davon, die von mehr als einem repräsentativen
Adenovirus von jeder Adenovirus-Untergruppe in der (chimärischen)
Bibliothek abgeleitet sind, sind erwünscht, da eine wünschenswerte
Eigenschaft möglicherweise
keine allgemeine Eigenschaft einer Untergruppe ist. Außerdem kann
eine wünschenswerte
Eigenschaft einer Adenovirus-Untergruppe
bei den verschiedenen Vertretern der Untergruppe auch in verschiedenen
Mengen exprimiert werden. Zu gewährleisten, dass
mehr als ein Vertreter einer Untergruppe in der Bibliothek repräsentiert
ist, garantiert also die Auswahl desjenigen Vertreters, der die
gewünschte
Eigenschaft am besten exprimiert.
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Typischerweise
wird eine Bibliothek von chimärischen
Adenoviren oder ein Teil davon in Screening-Assays verwendet, um
Eigenschaften der chimärischen
Adenoviren zu bestimmen. Dadurch kann jedes besondere chimärische Adenovirus,
das besonders wünschenswerte
Eigenschaften umfasst, identifiziert und anschließend zum
Beispiel bei der Entwicklung eines verbesserten Nucleinsäure-Abgabeträgers verwendet werden.
Wünschenswerte
Eigenschaften, nach denen die chimärische Adenovirus-Bibliothek
durchmustert werden kann, sind unter anderem Zielzellspezifität, reduzierte
Immunogenität,
erhöhte
Immunogenität,
umgeleitete Neutralisation, umgeleitete Hämagglutination, verbesserte
Infektionseffizienz, reduzierte Toxizität, verbesserte Replikation
und/oder verbesserte Pharmakokinetik, wie veränderte Gewebeverteilung nach
in-vivo-Verabreichung. Ein Vergleich von Eigenschaften von verschiedenen
chimärischen
Adenoviren kann zur Beschreibung von Adenovirus-Elementen führen, die
daran beteiligt sind, ein Adenovirus mit dieser Eigenschaft zu versehen.
Dieses Wissen kann dann verwendet werden, um Nucleinsäure-Abgabeträger weiter
zu optimieren. In einem Aspekt stellt die Erfindung eine Auswahl
von (chimärischen)
Adenoviren mit einer im Vergleich zu Adenovirus 5 verbesserten Fähigkeit
bereit, makrophagen- oder fibroblastenartige Zellen zu transduzieren, und
vorzugsweise umfassen diese (chimärischen) Adenoviren wenigstens
einen Teil eines Gewebetropismus-bestimmenden Teils eines Faserproteins
eines Adenovirus der Untergruppe B oder eines Derivats und/oder
Analogons des Faserproteins. Die Erfindung stellt weiterhin eine
Auswahl von (chimärischen)
Adenoviren mit einer im Vergleich zu Adenovirus 5 verbesserten Fähigkeit
bereit, Zellen der glatten Muskulatur zu transduzieren, und vorzugsweise
umfassen diese (chimärischen)
Adenoviren wenigstens einen Teil eines Gewebetropismus-bestimmenden
Teils eines Faserproteins eines Adenovirus der Untergruppe B oder
eines Derivats und/oder Analogons des Faserproteins. Eine chimärische Adenovirus-Bibliothek
der Erfindung kann weiterhin verwendet werden, um Adenovirus-Biologie
zu untersuchen. Eine solche Bibliothek ist zum Beispiel sehr gut
geeignet, um Unterschiede in der Biologie der verschiedenen Adenovirus-Serotypen
zu untersuchen. In einem Aspekt stellt die Erfindung eine Auswahl
von (chimärischen)
Adenoviren bereit, die eine CAR-negative Zelle transduzieren können. Vorzugs weise
ist die CAR-negative Zelle eine Zelle der Amnionflüssigkeit
oder ein Abkömmling
davon. Vorzugsweise ist die Zelle der Amnionflüssigkeit eine Chorionzottenzelle
oder ein Abkömmling
davon. Vorzugsweise handelt es sich bei der CAR-negativen Zelle
um eine CAR-negative blutbildende Zelle, wie zum Beispiel eine Erythroid-Vorläuferzelle
und/oder eine Monocyten-Vorläuferzelle
und/oder Abkömmlinge
davon. Vorzugsweise umfassen die (chimärischen) Adenoviren, die eine
CAR-negative Zelle transduzieren können, wenigstens einen Adenovirus-Rezeptor-bindenden
Teil eines Faserproteins von einem Adenovirus der Untergruppe D
oder F.
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In
einem Aspekt stellt die Erfindung ein chimärisches Adenovirus bereit,
das ein im Vergleich zu Adenovirus 5 umgeleitetes Neutralisationsmuster
umfasst. Umgeleitete Neutralisation ist in mehreren Fällen nützlich,
unter anderem zum Beispiel zur Umgehung von bereits vorhandenen
neutralisierenden Antikörpern
bei einem Patienten, dem das chimärische Adenovirus verabreicht
wird. Bereits vorhandene neutralisierende Antikörper würden das Adenovirus neutralisieren
und dadurch die effektive Menge des verabreichten Virus senken.
Dieser Effekt ist gewöhnlich
zum Beispiel bei Gentherapieansätzen,
bei denen eine Nucleinsäure
an Zielzellen abgegeben werden soll, unerwünscht. Bereits vorhandene neutralisierende
Antikörper
können
jedoch zum Beispiel bei anderen Gentherapieanwendungen von Vorteil
sein, wenn die durch das chimärische
Adenovirus abgegebene interessierende Nucleinsäure nicht an Zellen im gesamten
Körper
abgegeben werden soll. Eine lokale Abgabe, zum Beispiel durch Verwendung
einer Nadel in ein festes Gewebe, kombiniert mit der Anwesenheit
von neutralisierenden Antikörpern
im Blut, die austretendes chimärisches
Adenovirus neutralisieren können,
kann in diesem Fall dabei helfen, die Transduktion auf einen bestimmten
Bereich zu beschränken.
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In
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein chimärisches
Adenovirus bereit, das ein im Vergleich zu Adenovirus 5 umgeleitetes
Hämagglutinationsmuster
umfasst. Umgeleitete Hämagglutination
ist in mehreren Fällen
nützlich.
Hämagglutiniertes
Material wird präferentiell
von Makrophagen und deren Ab kömmlingen und/oder
Vorläufern
aufgenommen. Eine solcherart verstärkte Hämagglutination eines chimärischen
Adenovirus ist in dem Fall bevorzugt, dass eine verstärkte Abgabe
von Nucleinsäure
an die Makrophagen gewünscht wird.
Im Allgemeinen jedoch wird es sich bei den Zielzellen nicht um die
Makrophagen handeln, so dass in diesen Fällen eine reduzierte Hämagglutination
erwünscht
ist. Ein chimärisches
Adenovirus mit umgeleiteter Hämagglutination
ist erwünscht.
Ein chimärisches
Adenovirus mit umgeleiteter Hämagglutination
ist für
viele Anwendungen geeignet, die dem Fachmann jetzt einfallen, und
somit bilden sie einen integralen Bestandteil der vorliegenden Erfindung.
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Ausführliche
Beschreibung
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Bei
Mäusen
wurde nachgewiesen, dass nach systemischer in-vivo-Abgabe von rekombinantem
Adenovirus Serotyp 5 für
Gentherapiezwecke ungefähr
99% des Virus in der Leber abgefangen werden (Herz et al., 1993).
Daher ist die Änderung
des Adenovirus-Serotyp-5-Wirtszellenspektrums, so dass es in vivo
andere Organe ansteuern kann, ein Hauptanliegen der Erfindung, insbesondere
in Kombination mit anderen Veränderungen,
insbesondere der Immunogenität.
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Der
einleitende Schritt für
eine erfolgreiche Infektion ist die Bindung des Adenovirus an seine
Zielzelle, ein Vorgang, der über
das Faserprotein vermittelt wird. Das Faserprotein hat eine trimere
Struktur (Stouten et al. 1992) mit unterschiedlicher Länge, die
vom Serotyp des Virus abhängt
(Signas et al. 1985; Kidd et al. 1993). Verschiedene Serotypen weisen
Polypeptide mit strukturell ähnlichen
N- und C-Termini, aber unterschiedlichen Mittelstammbereichen auf.
Die ersten 30 Aminosäuren
am N-Terminus sind an der Verankerung der Faser an der Pentonbasis
beteiligt (Chroboczek et al. 1995), insbesondere der konservierte
FNPVYP-Bereich im Schwanz (Arnberg et al. 1997). Der C-Terminus
oder Knob ist für
die einleitende Wechselwirkung mit dem zellulären Adenovirusrezeptor verantwortlich.
Es wird vorgeschlagen, dass nach dieser einleitenden Bindung eine sekundäre Bindung
zwischen der Pentonbasis des Kapsids und Integrinen der Zelloberfläche zu einer
Internalisierung von viralen Partikeln in Stachelsaumgrübchen (coated
pits) und zur Endocytose (Morgan et al., 1969; Svensson et al.,
1984; Varga et al., 1992; Greber et al., 1993; Wickham et al., 1994)
führt.
Integrine sind αβ-Heterodimere,
von denen wenigstens 14 α-Untereinheiten
und 8 β-Untereinheiten
identifiziert wurden (Hynes et al., 1992). Die Anordnung von Integrinen,
die in Zellen exprimiert werden, ist komplex und variiert zwischen den
Zelltypen und je nach der zellulären
Umgebung. Obwohl der Knob einige konservierte Bereiche enthält, zeigen
die Knob-Proteine zwischen den Serotypen einen hohen Grad der Variabilität, was darauf
hinweist, dass es unterschiedliche Adenovirusrezeptoren gibt. Zum
Beispiel wurde nachgewiesen, dass Adenoviren der Untergruppe C (Ad2,
Ad5) und Adenoviren der Untergruppe B (Ad3) an verschiedene Rezeptoren
binden (Defner et al., 1990). Das Faserprotein enthält auch
das typspezifische γ-Antigen,
das zusammen mit dem ε-Antigen
des Hexons die Serotyp-Spezifität
bestimmt. Das γ-Antigen befindet
sich auf der Faser, und es ist bekannt, dass es aus 17 Aminosäuren besteht
(Eiz et al., 1997). Die Anti-Faser-Antikörper des Wirts sind daher gegen die
trimere Struktur des Knob gerichtet. Die Anti-Faser-Antikörper zusammen
mit Antikörpern,
die gegen die Pentonbase und Hexonproteine gerichtet sind, sind
für die
Neutralisation von Adenoviruspartikeln verantwortlich. Zuerst enthüllen die
Anti-Faser-Antikörper
die Adenoviruspartikel, und danach ist die Pentonbase für die Anti-Pentonbase-Antikörper zugänglich (Gahery-Segard
et al., 1998). Obwohl dies ein sehr effektiver Weg zu sein scheint,
um Adenoviruspartikel zu neutralisieren, haben andere beschrieben,
dass die Anti-Hexon-Antikörper bezüglich der
Neutralisation der Partikel am effektivsten sind (Gall et al., 1996.
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Um
eine umgeleitete Infektion von rekombinantem Adenovirus Serotyp
5 zu erhalten, sind mehrere Ansätze
untersucht worden oder werden immer noch untersucht. Wickham et
al. hat das RGD-Motiv (Arg, Gly, Asp) in der Pentonbase geändert, die
vermutlich für
die Bindung des αvβ3- und αvβ5-Integrins an die Pentonbase verantwortlich
ist. Sie haben dieses RGD-Motiv durch ein anderes Peptidmotiv ersetzt,
das spezifisch für den α4β1-Rezeptor
ist. Auf diese Weise konnte eine Zielsteuerung des Adenovirus zu
einer spezifischen Zielzelle erreicht werden (Wickham et al., 1995,
1996). Krasnykh et al. haben sich die im Knob verfügbare HI-Schleife
zu Nutze gemacht. Diese Schleife befindet sich auf der Grundlage
von Röntgenkristallographie
auf der Außenseite
der trimeren Knob-Struktur
und trägt
daher vermutlich nicht zu den intramolekularen Wechselwirkungen
im Knob bei (Krasnykh et al., 1998). Es wurde jedoch keine vollständige CAR-unabhängige Infektion
beobachtet.
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Es
ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und ein Mittel
anzugeben, mit dem Adenoviren mit einer veränderten Immunantwort oder mit
fehlender oder reduzierter Infektion in antigenpräsentierenden Zellen,
wie dendritischen Zellen oder Makrophagen, gebaut werden können. Es
ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur
Erzeugung von chimärischen
Adenoviren, wie sie oben beschrieben sind und die in vitro zu spezifischen
Zelltypen zielgesteuert werden können
sowie in vivo einen veränderten
Tropismus zu bestimmten Zelltypen aufweisen, anzugeben. Es ist ein
weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und Mittel
anzugeben, mit dem ein solches Adenovirus als Protein- oder Nucleinsäureabgabeträger zu einem
spezifischen Zelltyp oder Gewebe verwendet werden kann.
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Die
Erzeugung von chimärischen
Adenoviren auf der Basis von Adenovirus Serotyp 5 mit modifizierten späten Genen
wird beschrieben. Zu diesem Zweck wurden drei Plasmide aufgebaut,
die zusammen das vollständige
Adenovirus-Serotyp-5-Genom
enthalten. Aus diesen Plasmiden wurde die DNA, die das Pentonbase-Protein,
Hexonprotein und Faserprotein des Adenovirus Serotyp 5 codiert,
entfernt und durch Linker-DNA-Sequenzen ersetzt, die die Klonierung
erleichtern. Diese Plasmide dienten anschließend als Matrize für die Insertion
von DNA, die das Pentonbase-Protein, Hexonprotein und Faserprotein
codiert, die von verschiedenen Adenovirus-Serotypen (human oder
tierisch) stammen. Die von den verschiedenen Serotypen abgeleiteten
DNAs wurden mit Hilfe der Technik der Polymerase-Kettenreaktion
in Kombination mit (degenerierten) Oligonucleotiden erhalten. An
der früheren
E1-Stelle im Genom von Adenovirus Serotyp 5 kann jedes interessierende
Gen kloniert werden. Ein einziger Transfektionsvorgang mit den drei
Plasmiden zusammen führte
zur Bildung eines rekombinanten chimärischen Adenovirus. Diese neue
Technik für
Bibliotheken, die aus chimärischen
Adenoviren besteht, ermöglicht
also eine schnelle Durchmusterung nach verbesserten rekombinanten
adenoviralen Vektoren für
in-vitro- und in-vivo-Gentherapiezwecke.
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Zwar
wurde die erfolgreiche Einführung
von Änderungen
in die Faser und Pentonbasis von Adenovirus Serotyp 5 bereits beschrieben,
doch sind solche Zielsteuerungsansätze aufgrund der komplexen
Struktur des Knob und der begrenzten Kenntnisse über die genauen Aminosäuren, die
mit CAR wechselwirken, mühsam und
schwierig. Um die oben beschriebenen Beschränkungen zu überwinden, verwendeten wir
bereits vorhandene Adenovirusfasern, Pentonbaseproteine und Hexonproteine,
die von anderen Adenovirus-Serotypen abgeleitet sind. Indem wir
Bibliotheken von chimärischem
Adenovirus Serotyp 5 erzeugten, die Strukturproteine von alternativen
Adenovirus-Serotypen enthielten, haben wir eine Technik entwickelt,
die eine schnelle Suche nach einem rekombinanten adenoviralen Vektor
mit bevorzugten Merkmalen ermöglicht.
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In
einem Aspekt beschreibt diese Erfindung die Verwendung von chimärischen
Adenoviren, um eine natürlich
vorkommende oder induzierte neutralisierende Aktivität des Wirts
gegen rekombinante Adenoviren, die in vivo für therapeutische Anwendungen
verabreicht werden, zu überwinden.
Die Wirtsimmunantwort ist vorwiegend gegen Pentonbase- und Hexonproteine
gerichtet, die im adenoviralen Kapsid vorhanden sind, und ist in
geringerem Grad gegen die Faser gerichtet. Die Adenovirus-Serotypen
sind durch die Unfähigkeit
definiert, eine Kreuzreaktion mit neutralisierenden Antikörpern in
Tierseren einzugehen. Daher rufen chimärische Viren, die zum Beispiel
auf Adenovirus Serotyp 5 beruhen, aber chimärisch in Bezug auf Pentonbase-Protein und/oder
Hexonprotein sind, eine veränderte,
weniger heftige Immunantwort hervor. Die Notwendigkeit solcher chimärischer
Adenoviren wird durch die Beobachtungen betont, dass 1) eine wiederholte
systemische Abgabe von rekombinantem Adenovirus Serotyp 5 aufgrund
von hohen Titern von neutralisierenden Antikörpern gegen das rekom binante
Adenovirus Serotyp 5 (Schulick et al., 1997) erfolglos ist, und
2) bereits vorhandene natürliche
Immunität.
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Dieser
Aspekt der Erfindung umgeht daher die Unfähigkeit, die Verabreichung
eines Adenovirus für Gentherapiezwecke
zu wiederholen. Vorzugsweise sind die Pentonbase-, Hexon- und Faserproteine
von Adenoviren in der Untergruppe B und D abgeleitet und gehören insbesondere
zum Adenovirus-Serotyp 16, 24, 33, 36, 38, 39, 42 und 50. Der Grund
dafür ist,
dass diese Serotypen selten aus Menschen isoliert werden, was darauf
hinweist, dass niedrige Titer von zirkulierenden neutralisierenden
Antikörpern
gegen diese Serotypen vorhanden sind.
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In
einem anderen Aspekt beschreibt diese Erfindung chimärische Adenoviren
und Verfahren zur Erzeugung dieser Viren, die einen veränderten
Tropismus aufweisen, der von demjenigen von Adenovirus Serotyp 5
verschieden ist, zum Beispiel Viren auf der Basis von Adenovirus
Serotyp 5, die jedoch irgendeine in der Natur vorkommende Adenovirusfaser
aufweisen. Dieses chimärische
Adenovirus Serotyp 5 kann bestimmte Zelltypen in vitro und in vivo
effizienter oder weniger effizient infizieren als das Adenovirus
Serotyp 5. Zu diesen Zellen gehören
unter anderem Endothelzellen, Zellen der glatten Muskulatur, dendritische
Zellen, neuronale Zellen, Gliazellen, Synovialzellen, Lungenepithelzellen,
hämatopoetische
Stammzellen, Monocyten/Makrophagen usw.
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In
einem anderen Aspekt beschreibt diese Erfindung Verfahren, die chimärische Adenoviren
identifizieren, die eine verbesserte in-vitro-Amplifikation in statischen
oder Suspensionszellkulturen aufweisen. Aus verschiedenen Untergruppen
abgeleitete Adenoviren, aber auch Adenoviren innerhalb einer Untergruppe,
weisen eine hohe Variabilität
bei der produktiven Infektion von Zelltypen auf, die für die Produktion
von rekombinantem Adenovirus verwendet werden. Tabelle 2 gibt einen Überblick über verschiedene
Adenovirus-Serotypen und ihre Verbindung mit menschlichen Krankheiten,
was beweist, dass die Replikation eines gegebenen Adenovirus-Serotyps
in bestimmten Zelltypen verstärkt
ist. Für
die Produktion von rekombinanten Adenoviren für Gentherapiezwecke stehen
mehrere Zelllinien zur Verfügung.
Dazu gehören
unter anderem PER.C6, 911, 293 und E1 A549. Diese Adenoviren erzeugenden
Zellen sind vielleicht nicht die am besten geeigneten Zelltypen,
um Viren auf der Basis von Adenovirus Serotyp 5 zu amplifizieren.
Daher suchen wir in diesem Aspekt der Erfindung Adenoviren von verschiedenen
Serotypen auf der Basis ihrer Fähigkeit
aus, sich zum Beispiel auf PER.C6 zu vermehren, und verwenden ihre
frühen
Gene (ohne E1) und ITRs, um chimärische
Viren aufzubauen, die in Bezug auf die Vermehrung überlegen
sind und somit höhere
Titer ergeben als das gemeinhin verwendete Adenovirus Serotyp 2
oder 5.
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In
einem anderen Aspekt beschreibt die Erfindung den Aufbau und die
Verwendung von Bibliotheken, die aus unterschiedlichen Teilen von
Adenovirus Serotyp 5 bestehen, bei denen ein oder mehrere Gene oder Sequenzen
durch DNA ersetzt ist, die von alternativen humanen oder tierischen
Serotypen abgeleitet ist. Diese Menge von Konstrukten, die insgesamt
das vollständige
Adenovirusgenom umfassen, ermöglicht
die Konstruktion von einzigartigen chimärischen Adenoviren, die für eine bestimmte
Gruppe von Patienten oder sogar ein einzelnes Individuum maßgeschneidert
sind.
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In
allen Aspekten der Erfindung können
die chimärischen
Adenoviren Deletionen im E1-Bereich und Insertionen von heterologen
Genen, die entweder mit einem Promotor verknüpft sind oder auch nicht, enthalten
oder auch nicht. Weiterhin können
chimärische
Adenoviren Deletionen im E3-Bereich und Insertionen von heterologen
Genen, die mit einem Promotor verknüpft sind, enthalten oder auch
nicht. Weiterhin können
chimärische
Adenoviren Deletionen im E2- und/oder E4-Bereich und Insertionen von heterologen
Genen, die mit einem Promotor verknüpft sind, enthalten oder auch
nicht. Im letzteren Fall sind E2- und/oder E4-komplementierende
Zelllinien erforderlich, um rekombinante Adenoviren zu erzeugen.
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Beispiel 1. Erzeugung
von Klonen genomischer Plasmide von Adenovirus Serotyp 5.
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Das
vollständige
Genom von Adenovirus Serotyp 5 wurden in verschiedene Plasmide oder
Cosmide einkloniert, was eine leichte Modifikation von Teilen des
Adenovirus-Serotyp-5-Genoms ermöglicht,
wobei die Fähigkeit
zur Erzeugung von rekombinantem Virus erhalten bleibt. Zu diesem
Zweck wurden die folgenden Plasmide erzeugt:
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1. pBr/Ad.Bam-rITR (ECACC-Hinterlegung
P97082122)
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Um
die Klonierung der ITR-Sequenzen mit glatten Enden zu erleichtern
wurde Wildtyp-Human-Adenovirus-Typ-5-(Ad5)-DNA in Gegenwart von überschüssigem dNTP
mit Klenow-Enzym behandelt. Nach der Inaktivierung des Klenow-Enzyms
und der Reinigung durch Phenol/Chloroform-Extraktion mit anschließender Ethanolfällung wurde
die DNA mit BamHI abgebaut. Dieses DNA-Präparat wurde ohne weitere Reinigung
in einer Ligierungsreaktion mit von pBr322 abgeleiteter Vektor-DNA,
die wie folgt hergestellt wurde, verwendet: pBr322-DNA wurde mit
EcoRV und BamHI abgebaut, durch Behandlung mit TSAP-Enzym (Life
Technologies) dephosphoryliert und auf LMP-Agarose-Gel (SeaPlaque
GTG) gereinigt. Nach der Transformation in kompetentes E. coli DH5α (Life Techn.)
und Analyse der Ampicillin-resistenten Kolonien wurde ein Klon ausgewählt, der
ein Abbaumuster zeigte, wie es für
einen Insert, der sich von der BamHI-Stelle in Ad5 bis zum rechten
ITR erstreckt, erwartet wurde. Eine Sequenzanalyse der Klonierungsgrenze
am rechten ITR zeigte, dass der am weitesten 3' liegende G-Rest des ITR fehlte, und
der Rest des ITR erwies sich als korrekt. Dieser fehlende G-Rest
wird während
der Replikation durch den anderen ITR ergänzt.
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2. pBr/Ad.Sal-rITR (ECACC-Hinterlegung
P97082119)
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pBr/Ad.Bam-rITR
wurde mit BamHI und SalI abgebaut. Das Vektorfragment einschließlich des
Adenovirus-Inserts wurde in LMP-Agarose (SeaPlaque GTG) isoliert
und mit einem 4,8 kb großen
SalI-BamHI-Fragment ligiert, was von Wildtyp-Ad5-DNA erhalten und
mit dem Geneclean-II-Kit (Bio 101, Inc.) gereinigt wurde. Ein Klon
wurde ausgewählt,
und die Integrität
der Ad5-Sequenzen wurde durch Restriktionsenzym-Analyse bestimmt.
Der Klon pBr/Ad.Sal-rITR enthält
Adeno-Typ-5-Sequenzen von der SalI-Stelle bei bp 16746 bis zu einschließlich dem
rechten ITR (wobei der am weitesten 3' liegende G-Rest fehlt).
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3. pBr/Ad.Cla-Bam (ECACC-Hinterlegung
P97082117)
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Wildtyp-Adenovirus-Typ-5-DNA
wurde mit ClaI und BamHI abgebaut, und das 20,6-kb-Fragment wurde
durch Elektroelution aus dem Gel isoliert. pBr322 wurde mit denselben
Enzymen abgebaut und mit Geneclean aus dem Agarose-Gel gereinigt. Beide
Fragmente wurden ligiert und in kompetente DH5α transformiert. Der resultierende
Klon pBr/Ad.Cla-Bam wurde durch Abbau mit Restriktionsenzym analysiert,
und es zeigte sich, dass er ein Insert mit Adenovirussequenzen von
bp 919 bis 21566 enthielt.
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4. pBr/Ad.AflII-Bam (ECACC-Hinterlegung
P97082114)
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Der
Klon pBr/Ad.Cla-Bam wurde mit EcoRI (in pBr322) linearisiert und
mit AflII partiell abgebaut. Nach 20 Minuten Hitzeinaktivierung
von AflII bei 65 °C
wurden die Fragmentenden mit Klenow-Enzym aufgefüllt. Dann wurde die DNA mit
einem glatten doppelsträngigen
Oligolinker ligiert, der eine PacI-Stelle enthielt (5'-AATTGTCTTAATTAACCGCTTAA-3'). Dieser Linker wurde hergestellt durch
Assoziieren der folgenden beiden Oligonucleotide: 5'-AATTGTCTTAATTAACCGC-3' und 5'-AATTGCGGTTAATTAAGAC-3', gefolgt von der Glättung der
Enden mit Klenow-Enzym. Nach der Fällung der ligierten DNA unter
Wechsel des Puffers wurden die Ligierungen mit überschüssigem PacI-Enzym abgebaut,
um Concatamere des Oligonucleotids zu entfernen. Das 22016 bp große partielle
Fragment, das Ad5-Sequenzen von bp 3534 bis zu 21566 und die Vektorsequenzen
enthielt, wurde in LMP-Agarose (SeaPlaque GTG) isoliert, religiert
und in kompetente DH5α transformiert.
Ein Klon, von dem sich zeigte, dass er die PacI-Stelle enthielt und der das große Adeno-Fragment beibehalten
hatte, wurde ausgewählt
und am 5'-Ende sequenziert,
um die korrekte Einfügung
des PacI-Linkers in
die (verlorene) AflII-Stelle zu überprüfen.
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5. pBr/Ad.Bam-rITRpac#2
(ECACC-Hinterlegung P97082120) und pBr/Ad.Bam-rITRpac#8 (ECACC-Hinterlegung P97082121)
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Um
die Einfügung
einer PacI-Stelle in der Nähe
des ITR von Ad5 im Klon pBr/Ad.Bam-rITR zu ermöglichen, wurden etwa 190 Nucleotide
zwischen der ClaI-Stelle im pBr322-Gerüst und dem Beginn der ITR-Sequenzen
entfernt. Dies geschah wie folgt: pBr/Ad.Bam-rITR wurde mit ClaI
abgebaut und unterschiedlich lange (2 min, 5 min, 10 min und 15
min) mit der Nuclease Bal31 behandelt. Das Ausmaß der Nucleotidentfernung wurde
durch getrennte Reaktionen auf pBr322-DNA (die ebenfalls an der
ClaI-Stelle abgebaut war) unter Verwendung von identischen Puffern
und Bedingungen verfolgt. Das Bal31-Enzym wurde durch 10 min Inkubation bei
75 °C inaktiviert,
die DNA wurde gefällt
und in einem kleineren Volumen TE-Puffer resuspendiert. Um glatte Enden
zu gewährleisten,
wurden die DNAs weiter mit T4-DNA-Polymerase in Gegenwart von überschüssigen dNTPs
behandelt. Nach dem Abbau der (Kontroll-)pBr322-DNA mit SalI wurde
bei den Proben, die 10 min oder 15 min lang behandelt wurden, ein
befriedigender Abbau (ca. 150 bp) beobachtet. Dann wurden die 10
min oder 15 min lang behandelten pBr/Ad.Bam-rITR-Proben mit den
oben beschriebenen PacI-Linkern mit den glatten Enden (siehe pBr/Ad.AflII-Bam)
ligiert. Die Ligierungsprodukte wurden durch Fällung gereinigt, mit überschüssigem PacI
abgebaut und auf einem LMP-Agarose-Gel von den Linkern abgetrennt.
Nach der Religierung wurden die DNAs in kompetente DH5α transformiert,
und die Kolonien wurden analysiert. Zehn Klone, die eine Deletion
von ungefähr
der gewünschten
Länge zeigten,
wurden ausgewählt
und durch T-Track-Sequenzierung (T7 Sequencing Kit, Pharmacia Biotech)
weiter analysiert. Zwei Klone wurden gefunden, bei denen der PacI-Linker
unmittelbar stromabwärts
des rITR eingefügt
war. Nach dem Abbau mit PacI wiesen Klon Nr. 2 28 bp und Klon Nr.
8 27 bp auf, die an den ITR gebunden waren.
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pWE/Ad.AflII-rITR (ECACC-Hinterlegung
P97082116)
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Der
Cosmidvektor pWE15 (Clontech) wurde verwendet, um größere Ad5-Inserts
zu klonieren. Zuerst wurde ein Linker, der eine einzigartige PacI-Stelle
enthielt, in die EcoRI-Stellen von pWE15 eingefügt, wobei pWE.pac entstand.
Zu diesem Zweck wurde das doppelsträngige PacI-Oligomer, wie es
für pBr/Ad.AflII-BamHI beschrieben
wurde, verwendet, jetzt aber mit seinen überstehenden EcoRI-Enden. Dann wurden
die folgenden Fragmente durch Elektroelution von Agarose-Gel isoliert: mit
PacI abgebautes pWE.pac, mit PacI und BamHI abgebautes pBr/AflII-Bam
und mit BamHI und PacI abgebautes pBr/Ad.Bam-rITR#2. Diese Fragmente wurden
miteinander ligiert und unter Verwendung von λ-Phage-Verpackungsextrakten (Stratagene) gemäß den Anweisungen
des Herstellers verpackt. Nach der Infektion von Wirtsbakterien
wurden Kolonien auf Platten gezüchtet
und auf die Gegenwart des vollständigen
Inserts hin analysiert. pWE/Ad.AflII-rITR enthält alle Adenovirus-Typ-5-Sequenzen
von bp 3534 (AflII-Stelle)
bis einschließlich
zum rechten ITR (wobei der am weitesten 3' liegende G-Rest fehlt).
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pBr/Ad.lITR-Sal(9.4) (ECACC-Hinterlegung
P97082115)
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Adenovirus-5-Wildtyp-DNA
wurde in Anwesenheit von überschüssigen dNTPs
mit Klenow-Enzym behandelt und anschließend mit SalI abgebaut. Zwei
der resultierenden Fragmente, die als LinksITR-Sal(9.4) bzw. Sal(16.7)-RechtsITR
bezeichnet werden, wurden in LMP-Agarose (Seaplaque GTG) isoliert.
pBr322-DNA wurde mit EcoRV und SalI abgebaut und mit Phosphatase
(Life Technologies) behandelt. Das Vektorfragment wurde mit Hilfe
des Geneclean-Verfahrens (BIO 101, Inc.) isoliert und mit den Ad5-SalI-Fragmenten
ligiert. Nur die Ligierung mit dem 9,4-kb-Fragment ergab Kolonien
mit einem Insert. Nach der Analyse und Sequenzierung der Klonierungsgrenze
wurde ein Klon, der die volle ITR-Sequenz enthielt, gewählt und
bis zur SalI-Stelle bei bp 9462 verlängert.
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pBr/Ad.lITR-Sal(16.7)
(ECACC-Hinterlegung P97082118)
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pBr/Ad.lITR-Sal(9.4)
wird mit SalI abgebaut und dephosphoryliert (TSAP, Life Technologies).
Um diesen Klon bis zur dritten SalI-Stelle in Ad5 zu verlängern, wurde
pBr/Ad.Cla-Bam mit BamHI linearisiert und mit SalI partiell abgebaut.
Ein 7,3-kb-SalI-Fragment, das Adenovirussequenzen von 9462-16746
enthält, wurde
in LMP-Agarose-Gel isoliert und mit dem SalI-abgebauten pBr/Ad.lITR-Sal(9.4)-Vektorfragment
ligiert.
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pWE/Ad.AflII-EcoRI
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pWE.pac
wurde mit ClaI abgebaut, und die überstehenden 5'-Enden wurden mit
Hilfe von Klenow-Enzym aufgefüllt.
Dann wurde die DNA mit PacI abgebaut und aus Agarose-Gel isoliert.
pWE/AflII-rITR wurde mit EcoRI abgebaut und nach der Behandlung
mit Klenow-Enzym mit PacI abgebaut. Das große 24-kb-Fragment, das die
adenoviralen Sequenzen enthielt, wurde von Agarose-Gel isoliert
und mit dem ClaI-abgebauten und mit glatten Enden versehenen pWE.pac-Vektor
ligiert, wobei man den Ligation ExpressTM Kit
von Clontech verwendete. Nach der Transformation von ultrakompetenten
XL10-Gold-Zellen von Stratagene wurden Klone identifiziert, die
das erwartete Insert enthielten. pWE/AflII-EcoRI enthält Ad5-Sequenzen
von bp 3534 bis 27336.
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Konstruktion
von neuen Adapterplasmiden
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Das
Fehlen einer Sequenzüberlappung
zwischen dem rekombinanten Adenovirus und den E1-Sequenzen in der
Verpackungszelllinie ist für
eine sichere, RCA-freie Erzeugung und Vermehrung von neuen rekombinanten
Viren essentiell. Das Adapterplasmid pMLPI.TK (1)
ist ein Beispiel für
ein Adapterplasmid, das für
die Verwendung gemäß der Erfindung
in Kombination mit den verbesserten Verpackungszelllinien der Erfindung
bestimmt ist. Dieses Plasmid wurde als Ausgangsmaterial verwendet,
um einen neuen Vektor herzustellen, bei dem Nucleinsäuremoleküle, die
spezifische Promotor- und Gensequenzen umfassen, leicht ausgetauscht
werden können.
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Zuerst
wurde ein PCR-Fragment aus pZipΔMo+PyF101(N–)-Matrizen-DNA
(beschrieben in PCT/NL 96/00195) mit den folgenden Primern erzeugt:
LTR-1: 5'-CTG TAG GTA CCA GTG
CAC TGG CCT AGG CAT GGA AAA ATA CAT AAC TG-3' und LTR-2: 5'-GCG GAT CCT TCG AAC CAT GGT AAG CTT
GGT ACC GCT AGC GTT AAC CGG GCG ACT CAG TCA ATC G-3'. Pwo-DNA-Polymerase
(Boehringer Mannheim) wurde nach den Anweisungen des Herstellers
mit den folgenden Temperaturzyklen verwendet: einmal 5 min bei 95 °C, 3 min
bei 55 °C
und 1 min bei 72 °C
und 30 Zyklen von 1 min bei 95 °C,
1 min bei 60 °C,
1 min bei 72 °C, dann
einmal 10 min bei 72 °C.
Dann wurde das PCR-Produkt mit BamHI abgebaut und in pMLP10-Vektor
(Levrero et al. 1991), der mit PvuII und BamHI abgebaut worden war,
ligiert, wodurch der Vektor pLTR10 entstand. Dieser Vektor enthält adenovirale
Sequenzen von bp 1 bis zu bp 454, gefolgt von einem Promotor, der
aus einem Teil des Mo-MuLV-LTR bestand, dessen Wildtyp-Enhancer-Sequenzen
durch den Enhancer aus einem mutanten Polyomvirus (PyF101) ersetzt
sind. Das Promotorfragment wurde als L420 bezeichnet. Dann wurde der
codierende Bereich des murinen HSA-Gens eingefügt. pLTR10 wurde mit BstBI
abgebaut, und dann erfolgte Klenow-Behandlung und Abbau mit NcoI.
Das HSA-Gen wurde durch PCR-Amplifikation an pUC18-HSA (Kay et al.
1990) erhalten, wobei die folgenden Primer verwendet wurden: HSA1,
5'-GCG CCA CCA TGG
GCA GAG CGA TGG TGG C-3' und
HSA2, 5'-GTT AGA
TCT AAG CTT GTC GAG ATC GAT CTA CTA ACA GTA GAG ATG TAG AA-3'. Das 269 bp große amplifizierte
Fragment wurde unter Verwendung der NcoI- und der BglII-Stelle in
einen Shuttle-Vektor subkloniert. Durch Sequenzieren wurde der Einbau
der korrekten Codierungssequenz des HSA-Gens bestätigt, aber
mit einer zusätzlichen
TAG-Einfügung
direkt nach dem TAG-Stopcodon. Dann wurde der codierende Bereich
des HSA-Gens einschließlich
der TAG-Duplikation als NcoI(klebrig)-SalI(glatt)-Fragment herausgeschnitten
und in das 3,5 kb große
NcoI(klebrig)/BstBI(glatt)-Fragment aus pLTR10 kloniert, was zu
pLTR-HSA10 führte.
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Schließlich wurde
pLTR-HSA10 mit EcoRI und BamHI abgebaut, und danach wurde das Fragment, das
den linken ITR, das Verpackungssignal, den L420-Promotor und das HSA-Gen enthielt, in
den Vektor pMLPI.TK, der mit denselben Enzymen abgebaut worden war,
eingefügt,
wodurch die Promotor- und die Gensequenz ersetzt wurden. Dies führte zu
dem neuen Adapterplasmid pAd/L420-HSA (2), das
zweckmäßige Erkennungsstellen
für verschiedene
Restriktionsenzyme um die Promotor- und die Gensequenz herum enthält. SnaBI
und AvrII können
mit HpaI, NheI, KpnI, HindIII kombiniert werden, um Promotorsequenzen
auszutauschen, während
die letzteren Stellen mit den ClaI- oder BamHI-Stellen 3' von dem HSA-codierenden
Bereich kombiniert werden können,
um Gene in diesem Konstrukt zu ersetzen.
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Ein
weiteres Adapterplasmid, das so entworfen wurde, dass ein leichter
Austausch von Nucleinsäuremolekülen ermöglicht wird,
wurde hergestellt, indem man die Promotor-, Gen- und Poly-A-Sequenz
in pAd/L420-HSA durch den CMV-Promotor,
eine multiple Klonierungsstelle, ein Intron und ein Poly-A-Signal
ersetzte. Zu diesem Zweck wurde pAd/L420-HSA mit AvrII und BglII
abgebaut, und danach erfolgte eine Behandlung mit Klenow-Enzym;
so dass man glatte Enden erhielt. Das 5,1-kb-Fragment mit dem pBr322-Vektor
und den adenoviralen Sequenzen wurde isoliert und mit einem glatten
1570 bp großen
Fragment von pcDNA1/amp (Invitrogen) ligiert, das durch Abbau mit
HhaI und AvrII und anschließende
Behandlung mit T4-DNA-Polymerase erhalten wurde. Dieses Adapterplasmid
wurde pCLIP.LUC genannt (3).
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Erzeugung
von rekombinanten Adenoviren
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Um
E1-deletierte rekombinante Adenoviren mit dem neuen System auf Plasmidbasis
zu erzeugen, werden die folgenden Konstrukte hergestellt: a) ein
Adapterkonstrukt, das die Expressionscassette mit dem interessierenden
Gen enthält,
die mit einem Restriktionsenzym, das an der 3'-Stelle des überlappenden adenoviralen Genomfragments
schneidet, linearisiert ist und vorzugsweise keinerlei pBr322-Vektorsequenzen enthält; und
b) ein ergänzendes
adenovirales Genomkonstrukt pWE/Ad.AflII-rITR, das mit PacI abgebaut
ist. Diese beiden DNA-Moleküle
werden durch Phenol/(Chloroform-Extraktion und EtOH-Fällung weiter
gereinigt. Durch Cotransfektion dieser Plasmide in eine Adenovirus-Verpackungszelllinie,
vorzugsweise eine Zelllinie gemäß der Erfindung,
entstehen rekombinante, replikationsunfähige Adenoviren durch eine
einstufige homologe Rekombination zwischen dem Adapter und dem ergänzenden
Konstrukt (4).
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Alternativ
dazu können
anstelle von pWE/Ad.AflII-rITR auch andere Fragmente verwendet werden, z.B.
mit EcoRI und BamHI abgebautes pBr/Ad.Cla-Bam oder mit PacI und
BamHI abgebautes pBr/Ad.AflII-BamHI kann mit pBr/Ad.Sal-rITR, das
mit SalI abgebaut wurde, kombiniert werden. In diesem Fall werden drei
Plasmide miteinander kombiniert, und zwei homologe Rekombinationen
werden benötigt,
um ein rekombinantes Adenovirus zu erhalten (5). Man
sollte sich darüber
im Klaren sein, dass der Fachmann auch andere Kombinationen von
Adapter- und ergänzenden
Plasmiden verwenden kann, ohne von der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
Eine allgemeine Anweisung, wie sie im Folgenden skizziert und als
nichteinschränkendes
Beispiel für
die vorliegende Erfindung gemeint ist; wurde durchgeführt, wobei
unter Verwendung verschiedener Adapterplasmide und des Ad.AflII-rITR-Fragments
mehrere rekombinante Adenoviren entstehen. Adenovirus-Verpackungszellen
(PER.C6) wurden in Kolben von ca. 25 cm2 ausgesät, und am
nächsten Tag,
als sie eine Konfluenz von etwa 80% erreichten, wurden sie mit einem
Gemisch von DNA und Lipofectamin-Reagens (Life Techn.) transfiziert,
wie es vom Hersteller beschrieben wurde. Routinemäßig werden
40 μl Lipofectamin,
4 μg Adapterplasmid
und 4 μg
des ergänzenden
Adenovirusgenomfragments AflII-rITR (oder 2 μg aller drei Plasmide für die doppelte
homologe Rekombination) verwendet. Unter diesen Bedingungen werden
Effizienzen der transienten Transfektion von ca. 50% (48 h nach
der Transfektion) erhalten, die mit Kontrolltransfektionen unter
Verwendung eines pAd/CMV-LacZ-Adapters bestimmt wurden. Zwei Tage
später
werden Zellen in Kolben von ca. 80 cm2 übergeführt und
weiterkultiviert. Ungefähr
fünf (für die einzelne
homologe Rekombination) bis elf Tage (für die doppelte homologe Rekombination)
später
beobachtet man eine cytopathogene Wirkung (CPE), was darauf hinweist,
dass ein funktionelles Adenovirus entstanden ist. Bei voller CPE werden
Zellen und Medium geerntet, und rekombinantes Virus wird durch Frieren-Tauen
freigesetzt. Ein zusätzlicher
Amplifikationsschritt in einem Kolben von 80 cm2 wird
routinemäßig durchgeführt, um
die Ausbeute zu erhöhen,
da sich zeigt, dass die Titer im Anfangsstadium trotz des Auftretens
der vollen CPE variabel sind. Nach der Amplifikation werden Viren
geerntet und an PER.C6-Zellen Plaque-gereinigt. Einzelne Plaques
werden auf Viren mit aktiven Transgenen getestet.
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Neben
einem Ersatz im E1-Bereich ist es auch möglich, den E3-Bereich (oder
einen Teil davon) in dem Adenovirus zu deletieren oder zu ersetzen,
da E3-Funktionen
für die
Replikation, Verpackung und Infektion des (rekombinanten) Virus
nicht notwendig sind. Dadurch wird die Möglichkeit geschaffen, einen
größeren Insert
zu verwenden oder mehr als ein Gen einzufügen, ohne die maximale Verpackungsgröße (ungefähr 105% der
Wildtyp-Genomlänge)
zu überschreiten.
Dies kann zum Beispiel dadurch erfolgen, dass man einen Teil des E3-Bereichs
im pBr/Ad.Bam-rITR-Klon durch Abbau mit XbaI und Religierung deletiert.
Dadurch werden die Ad5-Wildtyp-Sequenzen 28592-30470 einschließlich aller
bekannten E3-codierenden Bereiche entfernt. Ein weiteres Beispiel
ist der genaue Ersatz des codierenden Bereichs von gp19K im E3-Bereich
durch einen Polylinker, was die Insertion von neuen Sequenzen erlaubt.
Dadurch 1) bleiben alle anderen codierenden Bereiche intakt und
2) wird die Notwendigkeit eines heterologen Promotors vermieden,
da das Transgen durch die E3-Promotor-
und pA-Sequenzen getrieben wird, was mehr Raum für codierende Sequenzen lässt.
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Zu
diesem Zweck wurde das 2,7 kb große EcoRI-Fragment aus Wildtyp-Ad5,
das den 5'-Teil
des E3-Bereichs enthält,
in die EcoRI-Stelle von pBluescript (KS–)
(Stratagene) kloniert. Dann wurde die HindIII-Stelle in dem Polylinker
durch Abbau mit EcoRV und HincII und anschließende Religierung entfernt.
Der resultierende Klon pBS.Eco-Eco/ad5DHIII wurde verwendet, um
den gp19K-codierenden
Bereich zu deletieren. Die Primer 1 (5'-GGG TAT TAG GCC AA AGG CGC A-3') und 2 (5'-GAT CCC ATG GAA
GCT TGG GTG GCG ACC CCA GCG-3')
wurden verwendet, um eine Sequenz aus pBS.Eco-Eco/Ad5DHIII, die
den Sequenzen 28511 bis 28734 in Wildtyp-Ad5-DNA entsprach, zu amplifizieren.
Die Primer 3 (5'-GAT
CCC ATG GGG ATC CTT TAC TAA GTT ACA AAG CTA-3') und 4 (5'-GTC GCT GTA GTT GGA CTG G-3') wurden an derselben DNA
verwendet, um Ad5-Sequenzen von 29217 bis 29476 zu amplifizieren.
Die beiden resultierenden PCR-Fragmente wurden anhand der neu eingeführten NcoI-Stelle
miteinander ligiert und anschließend mit XbaI und MunI abgebaut.
Dann wurde dieses Fragment in den pBS.Eco-Eco/ad5ΔHIII-Vektor
ligiert, der mit XbaI (partiell) und MunI abgebaut wurde, wobei
pBS.Eco-Eco/ad5ΔHIII.Δgp19K entstand.
Um die Insertion von Fremd-Genen in die HindIII- und BamHI-Stelle
zu ermöglichen,
wurde in pBS.Eco-Eco/ad5ΔHIII.Δgp19K eine
XbaI-Deletion vorgenommen, um die BamHI-Stelle im Bluescript-Polylinker
zu entfernen. Das resultierende Plasmid pB5.Eco-Eco/ad5ΔHIII.Δgp19KΔXbaI enthält einzigartige
HindIII- und BamHI-Stellen, die den Sequenzen 28733 (HindIII) und
29218 (BamHI) in Ad5 entsprechen. Nach der Einführung eines Fremd-Gens in diese
Stellen wird entweder das deletierte XbaI-Fragment wieder eingeführt, oder
das Insert wird erneut in pBS.Eco-Eco/ad5ΔHIII.Δgp19K kloniert, wobei man HindIII
und zum Beispiel MunI verwendet. Mit Hilfe dieses Verfahrens haben
wir Plasmide erzeugt, die HSV-TK, hIL-1a, Ratten-IL-3, Luciferase
oder LacZ exprimieren. Die einzigartigen SrfI- und NotI-Stellen
im Plasmid pBS.Eco-Eco/ad5ΔHIII.Δgp19K (mit
oder ohne eingesetztes interessierendes Gen) werden verwendet, um
den bereich, der das interessierende Gen umfasst, in den entsprechenden
Bereich von pBr/Ad.Bam-rITR zu übertragen,
was das Konstrukt pBr/Ad.Bam-rITRΔgp19K (mit
oder ohne eingesetztes interessierendes Gen) ergab. Dieses Konstrukt
wird gemäß der obigen
Beschreibung verwendet, um rekombinante Adenoviren zu erzeugen.
Im viralen Kontext wird die Expression von eingefügten Genen
durch den Adenovirus-E3-Promotor getrieben.
-
Rekombinante
Viren, die sowohl E1- als auch E3-deletiert sind, werden durch ein
doppeltes homologes Rekombinationsverfahren; wie es oben für E1-Ersatz-Vektoren beschrieben
wurde, erzeugt, wobei man ein System auf Plasmidbasis verwendet,
das aus Folgendem besteht:
- a) einem Adapterplasmid
für E1-Ersatz
gemäß der Erfindung
mit oder ohne Insertion eines ersten interessierenden Gens;
- b) dem pWE/Ad.AflII-EcoRI-Fragment; und
- c) dem pBr/Ad.Bam-rITRΔgp19K-Plasmid
mit oder ohne Insertion eines zweiten interessierenden Gens.
-
Neben
Manipulationen im E3-Bereich können
in pBr/Ad.Bam-rITR auch leicht Veränderungen des E4-Bereichs (oder
Teilen davon) bewerkstelligt werden. Die Erzeugung und Vermehrung
eines solchen Virus erfordert aber in einigen Fällen eine in-trans-Komplementierung.
-
Beispiel 2. Erzeugung
von Viren auf der Basis von Adenovirus Serotyp 5 mit chimärischen
Faserproteinen.
-
Das
im Folgenden beschriebene Verfahren zur Erzeugung rekombinanter
Adenoviren erfolgt durch Cotransfektion von zwei oder mehr getrennten
klonierten Adenovirus-Sequenzen. Diese klonierten Adenovirus-Sequenzen
wurden anschließend
verwendet, um spezifische Adenovirus-Serotyp-5-Sequenzen zu entfernen,
um "Matrizenklone" zu erzeugen, die
die leichte Einführung
von DNA-Sequenzen
ermöglichen,
die von anderen Adenovirus-Serotypen abgeleitet sind. Als Beispiel
für diese
Matrizenklone ist im Folgenden der Aufbau von Plasmiden angegeben,
die einen Austausch von DNA, die für Faserprotein codiert, ermöglichen.
-
Erzeugung von Adenovirus-Matrizenklonen,
denen für
Faser codierende DNA fehlt
-
Die
fasercodierende Sequenz von Adenovirus Serotyp 5 befindet sich zwischen
den Nucleotiden 31042 und 32787. Um die fasercodierende Adenovirus-Serotyp-5-DNA zu entfernen,
begannen wir mit dem Konstrukt pBr/Ad.Bam-rITR. Zuerst wurde eine
NdeI-Stelle aus diesem Konstrukt entfernt. Zu diesem Zweck wurde
pBr322-Plasmid-DNA mit NdeI abgebaut, und danach wurden vorstehende
Enden unter Verwendung von Klenow-Enzym aufgefüllt. Dieses pBr322-Plasmid
wurde dann religiert, mit NdeI abgebaut und in E. coli DH5α transformiert.
Das erhaltene pBr/ΔNdeI-Plasmid
wurde mit ScaI und SalI abgebaut, und das resultierende, 3198 bp
große
Vektorfragment wurde mit dem von pBr/Ad.BamrITR abgeleiteten, 15349
großen
ScaI-SalI-Fragment ligiert, was zum Plasmid pBr/Ad.Bam-rITRΔNdeI führte, das
somit eine einzigartige NdeI-Stelle enthielt. Dann wurde eine PCR
durchgeführt
mit den Oligonucleotiden NY-up: 5'-CGA CAT ATG TAG ATG CAT TAG TTT GTG TTA TGT TTC AAC GTG-3' und NY-down: 5'-GGA GAG CAC TGC CAT GTT-3' (6).
Während
der Amplifikation wurden sowohl eine NdeI- (halbfett) als auch eine
NsiI-Restriktionsstelle (unterstrichen) eingeführt, um die Klonierung der
amplifizierten Faser-DNAs zu erleichtern. Die Amplifikation bestand
aus 25 Zyklen von jeweils 45 s bei 94 °C, 1 min bei 60 °C und 45
s bei 72 °C.
Die PCR-Reaktion enthielt 25 pmol der Oligonucleotide NY-up oder
NY-down, 2 mM dNTO, PCR-Puffer mit 1,5 mM MgCl2 und
1 Einheit der hitzestabilen Polymerase Elongase (Gibco, Niederlande).
Ein Zehntel des PCR-Produkts
wurde auf einem Agarose-Gel laufen gelassen, was bewies, dass das
erwartete DNA-Fragment von ± 2200
bp amplifiziert wurde. Dieses PCR-Fragment wurde anschließend unter
Verwendung des Geneclean-Kit-Systems (Bio 101 Inc.) gereinigt. Dann
wurden sowohl das Konstrukt pBr/Ad.Bam-rITRΔNdeI
als auch das PCR-Produkt mit den Restriktionsenzymen NdeI und SbfI
abgebaut. Das PCR-Fragment wurde anschließend mit Hilfe von T4-Ligase-Enzym in das mit
NdeI und SbfI abgebaute pBr/Ad.Bam-rITRΔNdeI kloniert, wobei pBr/Ad.BamRΔFib entstand. Dieses
Plasmid ermöglicht
die Insertion einer beliebigen PCR-amplifizierten Fasersequenz durch
die einzigartigen NdeI- und NsiI-Stellen, die anstelle der entfernten
Fasersequenz eingefügt
werden. Viren können
durch die im Folgenden beschriebene doppelte homologe Rekombination
in Verpackungszellen erzeugt werden, wobei man ein Adapterplasmid,
das mit PacI und EcoRI abgebaute Konstrukt pBr/Ad.AflII-EcoRI und
ein pBr/Ad.BamRΔFib-Konstrukt,
in das heterologe Fasersequenzen eingefügt wurden, verwendet. Um die
Effizienz der Viruserzeugung zu erhöhen, wurde das Konstrukt pBr/Ad.BamRΔFib so modifiziert,
dass eine PacI-Stelle entstand, die das rechte ITR flankiert. Dazu
wurde pBr/Ad.BamRΔFib
mit AvrII abgebaut, und das 5 kb große Adenofragment wurde isoliert
und in den Vektor pBr/Ad.Bam-rITR.pac#8
eingeführt,
wo es das entsprechende AvrII-Fragment ersetzte. Das resultierende
Konstrukt wurde pBr/Ad.BamRΔFib.pac
genannt. Sobald eine heterologe Fasersequenz in pBr/Ad.BamRΔFib.pac eingesetzt
ist, kann der fasermodifizierte rechte Adenovirus-Klon in einen
großen
Cosmidklon eingeführt
werden, wie es in Beispiel 1 für
pWE/Ad.AflII-rITR beschrieben ist. Ein solcher großer Cosmidklon
erlaubt die Bildung von Adenovirus durch nur eine einzige homologe
Rekombination, so dass der Vorgang äußerst effizient ist.
-
Amplifikation
von Fasersequenzen von Adenovirus-Serotypen
-
Um
eine Amplifikation der DNAs zu ermöglichen, die Faserprotein codieren,
das von alternativen Serotypen abgeleitet ist, wurden degenerierte
Oligonucleotide synthetisiert. Zu diesem Zweck wurden zuerst bekannte
DNA-Sequenzen, die für
ein Faserprotein von alternativen Serotypen codierten, aneinander
ausgerichtet, um konservierte Bereiche sowohl im Schwanzbereich
als auch im Knob-Bereich des Faserproteins zu identifizieren. Aus
der Ausrichtung, die die Nucleotidsequenz von 19 verschiedenen Serotypen
enthielt, die alle 6 Untergruppen darstellten, wurden (degenerierte)
Oligonucleotide synthetisiert (siehe Tabelle 3). Ebenso in Tabelle
3 gezeigt ist die Kombination von Oligonucleotiden, die verwendet
wird, um die DNA, welche Faserprotein eines speziellen Serotyps
codiert, zu amplifizieren. Die Amplifikationsreaktion (50 μl) enthielt
2 mM dNTPs, 25 pmol von jedem Oligonucleotid, Standard-1x-PCR-Puffer,
1,5 mM MgCl2 und 1 Einheit der hitzestabilen
Polymerase Pwo (Boehringer Mannheim) pro Reaktion. Das Cyclerprogramm
enthielt 20 Zyklen, die jeweils aus 30 s bei 94 °C, 60 s bei 60–64 °C und 120
s bei 72 °C
bestanden. Ein Zehntel des PCR-Produkts wurde auf einem Agarose-Gel
laufen gelassen, was nachwies, dass ein DNA-Fragment amplifiziert
worden war. Von den verschiedenen Matrizen wurden jeweils zwei unabhängige PCR-Reaktionen
durchgeführt,
und danach wurden die erhaltenen unabhängigen PCR-Fragmente sequenziert,
um die Nucleotidsequenz zu bestimmen. Von 11 verschiedenen Serotypen
konnte die Nucleotidsequenz mit in Genbank vorhandenen Sequenzen
verglichen werden. Von allen anderen Serotypen war die DNA, die
das Faserprotein codiert, zuvor unbekannt und wurde daher mit bekannten
Sequenzen von anderen Vertretern der Untergruppe abgeglichen, um
Homologie, d.h. Sequenzdivergenz, zu bestimmen. Von den bisher bekannten
51 humanen Serotypen wurden alle Fasersequenzen außer bei
den Serotypen 1, 6, 18 und 26 amplifiziert und sequenziert. Die
Proteinsequenzen der Faser aus verschiedenen Adenovirus-Serotypen
ist in 7 angegeben.
-
Erzeugung
von faserchimärischen
adenoviralen DNA-Konstrukten
-
Alle
amplifizierten Faser-DNAs sowie der Vektor (pBr/Ad.BamRΔFib) wurden
mit NdeI und NsiI abgebaut. Die abgebauten DNAs wurden anschließend auf
einem Agarose-Gel laufen gelassen, und danach wurden die Fragmente
aus dem Gel isoliert und mit Hilfe des Geneclean-Kits (Bio 101 Inc.)
gereinigt. Die PCR-Fragmente
wurden dann in die NdeI- und NsiI-Stelle von pBr/AdBamRΔFib einkloniert,
so dass pBr/AdBamRFibXX entstand (wobei XX die Nummer des Serotyps
ist, von dem die Faser-DNA isoliert wurde). Bisher wurde die Fasersequenz
der Serotypen 5/7/8/9/10/11/12/13/14/16/17/19/21/24/27/28/29/30/32/33/34/35/36/37/38/40-S/40-L/41-S/42/45/47/49/51
in pBr/AdBamRFibXX kloniert. Aus pBr/AdBamRFibXX (wobei XX = 5/8/9/10/11/13/16/17/24/27/30/32/33/34/35/38/40-S/40-L/45/47/49/51
ist) wurde ein 6-kb-AvrII-Fragment, das die Fasersequenz umfasste,
durch Gel-Elektrophorese
und GeneClean isoliert. Dieses AvrII-Fragment wurde anschließend in
das Plasmid pBr/Ad.Bam-rITR.pac (siehe Beispiel 1) kloniert, das
mit AvrII bis zu Ende verdaut und phosphoryliert wurde, wie es oben
beschrieben ist, was zur Erzeugung des Plasmids pBr/Ad.Bam-rITR.pac.fibXX
führte.
Dieses Plasmid wurde anschließend
verwendet, um einen Cosmidklon mit einer modifizierten Faser zu
erzeugen, wobei die Konstrukte pWE.pac, pBr/AflII-Bam und pBr/Ad.Bam-rITR.pac.fibXX
verwendet wurden. Diese Cosmidklonierung führte zur Bildung des Konstrukts pWE/Ad.AflII-rITR/FibXX
(wobei XX die Nummer des Serotyps ist, von dem die Faser-DNA isoliert
wurde).
-
Erzeugung
von pAd5/L420.HSA, pAd5/Clip und pAd5/Clipsal pMLPI-TK wurde zur
Herstellung eines neuen Vektors verwendet, bei dem Nucleinsäuremoleküle, die
spezielle Promoter- und Gensequenzen umfassen, leicht ausgetauscht
werden können.
-
Zuerst
wurde ein PCR-Fragment aus pZipΔMo+PyF101(N–)-Matrizen-DNA
(beschrieben in PCT/NL 96/00195) mit den folgenden Primern erzeugt:
LTR-1: 5'-CTG TAC GTA CCA GTG
CAC TGG CCT AGG CAT GGA AAA ATA CAT AAC TG-3' und LTR-2: 5'-GCG GAT CCT TCG AAC CAT GGT AAG CTT
GGT ACC GCT AGC GTT AAC CGG GCG ACT CAG TCA ATC G-3'. Pwo-DNA-Polymerase
(Boehringer Mannheim) wurde nach den Anweisungen des Herstellers
mit den folgenden Temperaturzyklen verwendet: einmal 5 min bei 95 °C, 3 min
bei 55 °C
und 1 min bei 72 °C
und 30 Zyklen von 1 min bei 95 °C,
1 min bei 60 °C,
1 min bei 72 °C, dann
einmal 10 min bei 72 °C.
Dann wurde das PCR-Produkt mit BamHI abgebaut und in pMLP10 (Levrero
et al., 1991; Gene 101, 195-202), das mit PvuII und BamHI abgebaut
worden war, ligiert, wodurch der Vektor pLTR10 entstand. Dieser
Vektor enthält
adenovirale Sequenzen von bp 1 bis zu bp 454, gefolgt von einem
Promotor, der aus einem Teil des Mo-MuLV-LTR bestand, dessen Wildtyp-Enhancer-Sequenzen
durch den Enhancer aus einem mutanten Polyomvirus (PyF101) ersetzt
sind. Das Promotorfragment wurde als L420 bezeichnet. Durch Sequenzieren
wurde die korrekte Amplifikation des LTR-Fragments bestätigt, doch
die meisten 5'-Basen
im PCR-Fragment fehlten, so dass die PvuII-Stelle nicht wiederhergestellt
wurde. Dann wurde der codierende Bereich des murinen HSA-Gens eingefügt. pLTR10
wurde mit BstBI abgebaut, und dann erfolgte Klenow-Behandlung und
Abbau mit NcoI. Das HSA-Gen wurde durch PCR-Amplifikation an pUC18-HSA (Kay et al.,
1990; J. Immunol. 145, 1952-1959) erhalten, wobei die folgenden
Primer verwendet wurden: HSA1, 5'-GCG
CCA CCA TGG GCA GAG CGA TGG TGG C-3' und HSA2, 5'-GTT AGA TCT AAG CTT GTC GAG ATC GAT
CTA CTA ACA GTA GAG ATG TAG AA-3'.
Das 269 bp große
amplifizierte Fragment wurde unter Verwendung der NcoI- und der
BglII-Stelle in einen Shuttle-Vektor subkloniert. Durch Sequenzieren
wurde der Einbau der korrekten codierenden Sequenz des HSA-Gens
bestätigt,
aber mit einer zusätzlichen
TAG-Einfügung
direkt nach dem TAG-Stopcodon. Dann wurde der codierende Bereich
des HSA-Gens einschließlich
der TAG-Duplikation als NcoI(klebrig)-SalI(glatt)-Fragment herausgeschnitten
und in das 3,5 kb große
NcoI(klebrig)/BstBI(glatt)-Fragment aus pLTR10 kloniert, was zu
pLTR-HSA10 führte.
-
Schließlich wurde
pLTR-HSA10 mit EcoRI und BamHI abgebaut, und danach wurde das Fragment, das
den linken ITR, das Verpackungssignal, den L420-Promotor und das HSA-Gen enthielt, in
den Vektor pMLPI.TK, der mit denselben Enzymen abgebaut worden war,
eingefügt,
wodurch die Promotor- und die Gensequenz ersetzt wurden. Dies führte zu
dem neuen Adapterplasmid pAd/L420-HSA, das zweckmäßige Erkennungsstellen für verschiedene
Restriktionsenzyme um die Promotor- und die Gensequenz herum enthält. SnaBI
und AvrII können
mit HpaI, NheI, KpnI, HindIII kombiniert werden, um Promotorsequenzen
auszutauschen, während
die letzteren Stellen mit den ClaI- oder BamHI-Stellen 3' von dem HSA-codierenden
Bereich kombiniert werden können,
um Gene in diesem Konstrukt zu ersetzen.
-
Ein
weiteres Adapterplasmid, das so entworfen wurde, dass ein leichter
Austausch von Nucleinsäuremolekülen ermöglicht wird,
wurde hergestellt, indem man die Promotor-, Gen- und Poly-A-Sequenz
in pAd/L420-HSA durch den CMV-Promotor,
eine multiple Klonierungsstelle, ein Intron und ein Poly-A-Signal
ersetzte. Zu diesem Zweck wurde pAd/L420-HSA mit AvrII und BglII
abgebaut, und danach erfolgte eine Behandlung mit Klenow-Enzym,
so dass man glatte Enden erhielt. Das 5,1-kb-Fragment mit dem pBr322-Vektor
und den adenoviralen Sequenzen wurde isoliert und mit einem glatten
1570 bp großen
Fragment von pcDNA1/amp (Invitrogen) ligiert, das durch Abbau mit
HhaI und AvrII und anschließende
Behandlung mit T4-DNA-Polymerase erhalten wurde. Dieses Adapterplasmid
wurde pAd5/Clip genannt. Um die Entfernung von Vektorsequenzen aus
dem adenoviralen Fragment zu ermöglichen,
wurde pAd5/Clip teilweise mit EcoRI aufgeschlossen, und das lineare
Fragment wurde isoliert. Ein Oligonucleotid der Sequenz 5'-TTAAGTCGAC-3' wurde mit sich selbst
assoziiert, was zu einem Linker mit einer SalI-Stelle und einem
EcoRI-Überhang
führte.
Der Linker wurde an den teilweise aufgeschlossenen pAd5/Clip-Vektor
ligiert, und es wurden Klone ausgewählt, bei denen der Linker in
die EcoRI-Stelle 23 bp stromaufwärts
von der linken adenoviralen ITR in pAd5/Clip insertiert war, was
zu pAd5/Clipsal führte.
-
Erzeugung von pAd5ClipLacZ,
pAd5Clip.Luc, pAd5Clip.TK und pAd5Clipsal.Luc
-
Das
Adapterplasmid pAd5/Clip.LacZ wurde wie folgt erzeugt: Das E.-coli-LacZ-Gen wurde durch PCR mit
den Primern 5'-GGGGTGGCCAGGGTACCTCTAGGCTTTTGCAA
und 5'-GGGGGGATCCATAAACAAGTTCAGAATCC
aus dem Plasmid pMLP.nlsLacZ (EP 95-202 213) amplifiziert. Die PCR-Reaktion
wurde mit Ex Taq (Takara) gemäß den Vorschriften
des Herstellers mit dem folgenden Amplifikationsprogramm durchgeführt: 5 Minuten
bei 94 °C,
1 Zyklus; 45 Sekunden bei 94 °C
und 30 Sekunden bei 60 °C
und 2 Minuten bei 72 °C,
5 Zyklen; 45 Sekunden bei 94 °C
und 30 Sekunden bei 65 °C
und 2 Minuten bei 72 °C,
25 Zyklen; 10 Minuten bei 72 °C;
45 Sekunden bei 94 °C
und 30 Sekunden bei 60 °C
und 2 Minuten bei 72 °C,
5 Zyklen, I Zyklus. Das PCR-Produkt wurde anschließend mit
Kpn1 und BamHI abgebaut, und das abgebaute DNA-Fragment wurde in
mit KpnI/BamHI abgebautes pcDNA3 (Invitrogen) ligiert, was zu pcDNA3.nlsLacZ
führte.
Dann wurde das Plasmid pAd5/Clip mit SpeI abgebaut. Das große Fragment,
das einen Teil des 5'-Teils
des CMV-Promotors enthielt, und die adenoviralen Sequenzen wurden
isoliert. Das Plasmid pcDNA3.nlsLacZ wurde mit SpeI abgebaut, und
das Fragment, das den 3'-Teil
des CMV-Promotors
und das lacZ-Gen enthielt, wurde isoliert. Anschließend wurden
die Fragmente miteinander ligiert, was zu pAd/Clip.LacZ führte. Die
Rekonstitution des CMV-Promotors wurde durch Restriktionsabbau bestätigt.
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Das
Adapterplasmid pAd5/Clip.Luc wurde wie folgt erzeugt: Das Plasmid
pCMV.Luc (EP 95-202 213) wurde mit HindIII und BamHI abgebaut. Das
DNA-Fragment, das
das Luciferase-Gen enthielt, wurde isoliert. Das Adapterplasmid
pAd5/Clip wurde mit HindIII und BamHI abgebaut, und das große Fragment
wurde isoliert. Dann wurden die isolierten DNA-Fragmente miteinander
ligiert, was zu pAd5/Clip.Luc führte.
Der Adapter pClipsal.Luc wurde in derselben Weise erzeugt, aber
unter Verwendung des mit HIII und BamHI abgebauten Adapters pClipsal
als Vektorfragment. Ähnlich
wurde TK, das das HIII-BamHI-Fragment aus pCMV.TK (EP 95-202 213)
enthielt, in pClipsal eingesetzt, wobei pAd5/Clip.TK entstand. Die
Anwesenheit der SalI-Stelle unmittelbar stromaufwärts des
linken ITR ermöglicht
die Freisetzung von Vektorsequenzen aus dem adenoviralen Insert.
Durch die Entfernung dieser Vektorsequenzen wird die Häufigkeit
der Vektorerzeugung während
der homologen Rekombination in PER.C6 erhöht.
-
Erzeugung von rekombinantem
Adenovirus, das chimärisch
in Bezug auf Faserprotein ist
-
Um
rekombinantes Ad5-Virus zu erzeugen, das die Faser von Serotyp 12,
16, 28, 40-L, 51 und 5 trägt, wurden
drei Konstrukte, pCLIP.Luc, pWE/AdAflII-Eco und pBr/AdBamrITR.pac/fibXX
(XX = 12, 16, 28, 40-L, 51 und 5) in Adenovirus produzierende Zellen
transformiert. Um rekombinantes Ad5-Virus zu erzeugen, das die Faser
von 5/7/8/9/10/11/12/13/14/16/17/19/21/24/27/28/29/30/32/33/34/35/36/37/38/40-S/40-L/41-S/42/45/47/49/51 trägt, wurden
zwei Konstrukte, pCLIP.Luc und pWE/Ad.AflII-rITR/FibXX, in Adenovirus
produzierende Zellen transformiert.
-
Für die Transfektion
wurden 2 μg
pCLIP.Luc und 4 μg
sowohl pWE/AdAflII-Eco als auch pBr/AdBamrITR.pac/fibXX (oder im
Falle von Cosmiden: 4 μg
pCLIP.Luc plus 4 μg
pWE/Ad.AflII-rITR/FibXX) in serumfreiem DMEM auf 100 μl Gesamtvolumen
verdünnt.
Zu dieser DNA-Suspension wurden 100 μl 1× verdünntes Lipofectamin (Gibco)
gegeben. Nach 30 min bei Raumtemperatur wurde die DNA-Lipofectamin-Komplexlösung zu
2,5 ml serumfreiem DMEM gegeben, das anschließend zu einem T25-cm2-Gewebekulturkolben gegeben wurde. Dieser
Kolben enthielt 2 × 106 PER.C6-Zellen, die 24 Stunden vor der Transfektion
ausgesät
wurden. Zwei Stunden später
wurde das den DNA-Lipofectamin-Komplex enthaltende Medium einmal
durch Zugabe von 2,4 ml DMEM verdünnt, das mit 20% fetalem Kälberserum
ergänzt
war. Wieder 24 Stunden später
wurde das Medium durch frisches DMEM ersetzt, das mit 10% fetalem
Kälberserum
ergänzt
war. Die Zellen wurden 6–8
Tage lang kultiviert, anschließend
geerntet und drei Frier/Tau-Cyclen unterzogen. Zelltrümmer wurden durch
5 min Zentrifugation mit 3000 U/min bei Raumtemperatur entfernt.
Vom Überstand
(12,5 ml) wurden 3–5 ml
verwendet, um wiederum PER.C6-Zellen (T80-cm2-Gewebekulturkolben)
zu infizieren. Diese Reinfektion führt 5–6 Tage nach der Ernte des
Adenovirus zur vollen cytopathogenen Wirkung (CPE), wie oben beschrieben
wurde. Mit der erzeugten Viruscharge wurden zwei Assays routinemäßig durchgeführt. 1)
20 μl Virusüberstand,
durch Zugabe von 1980 μl
DMEM auf das Zehnfache verdünnt,
wurde verwendet, um A549-Zellen zu infizieren, die 24 Stunden vor
der Infektion in einer Konzentration von 105 Zellen
pro Napf von 6-Napf-Platten ausgesät wurden. 48 Stunden später wurden
Proteinlysate hergestellt, die anschließend verwendet wurden, um die
Expression von Marker-Gen (Luciferase-Aktivität) zu messen. 2) 20 μl Virusüberstand
wird verwendet, um den Virustiter bei humanen 911-Zellen zu bestimmen.
Zu diesem Zweck werden 911-Zellen in einer Konzentration von 4 × 104 Zellen pro Napf in 96-Napf-Platten ausgesät. Drei
bis vier Stunden nach dem Aussäen wurde
das Medium durch Adenovirus-Überstand
(Verdünnungsbereich:
2 μl bis
5 × 10–9 μl) ersetzt.
Die Virustiter des faserchimärischen
Adenovirus Serotyp 5 überschritten
stets 1 × 108 infektiöse
Einheiten pro ml.
-
Beispiel 3 Herstellung,
Reinigung und Titration von chimärischen
Adenoviren
-
Typischerweise
10 ml des von transfizierten PER.C6-Zellen erhaltenen Überstands
wurden verwendet, um einen 1-Liter-Fermenter zu beimpfen, der 1
bis 1,5 × 106 PER.C6-Zellen/ml enthielt, die speziell
zum Wachsen in Suspension geeignet waren. Drei Tage nach der Beimpfung
wurden die Zellen geerntet und durch 10 min Zentrifugieren mit 1750
U/min bei Raumtemperatur sedimentiert. Die in den sedimentierten
Zellen vorhandenen chimärischen
Adenoviren wurden anschließend
extrahiert und unter Verwendung der folgenden Vorschrift zur nachgeschalteten
Verarbeitung gereinigt. Das Sediment wurde in 50 ml 10 mM NaPO4 – gelöst und bei –20 °C eingefroren. Nach dem Auftauen
bei 37 °C
wurden 5,6 ml Desoxycholat (5% w/v) hinzugefügt, und danach wurde die Lösung homogenisiert.
Die Lösung
wurde anschließend
15 Minuten lang bei 37 °C
inkubiert, um die Zellen aufzuschließen. Nach dem Homogenisieren
der Lösung wurden
1875 μl
1 M MgCl2 – und 5
ml 100% Glycerin hinzugefügt.
Nach der Zugabe von 375 μl
DNase (10 mg/ml) wurde die Lösung
30 Minuten lang bei 37 °C
inkubiert. Zelltrümmer
wurden durch 30 Minuten Zentrifugation mit 1880 × g bei Raumtemperatur mit
abgeschalteter Bremse entfernt. Der Überstand wurde anschließend durch
Aufgeben auf 10 ml Freon von Proteinen gereinigt. Nach 15 Minuten
Zentrifugation mit 2000 U/min ohne Bremse bei Raumtemperatur sind
drei Banden sichtbar, von denen die obere Bande das Adenovirus darstellt.
Diese Bande wurde durch Pipettieren isoliert, und danach wurde sie
auf einen mit Tris/HCl (1 M) gepufferten Cäsiumchlorid-Blockgradienten (Bereich: 1,2 bis 1,4
g/ml) aufgegeben. Nach 2,5 Stunden Zentrifugation mit 21000 U/min
bei 10 °C
wurde das Virus von restlichem Protein und Zelltrümmern gereinigt,
da das Virus im Gegensatz zu den anderen Komponenten nicht in die
1,4 g/ml Cäsiumchloridlösung wandert.
Die Virusbande wird isoliert, und danach wird eine zweite Reinigung
durchgeführt,
wobei man einen mit Tris/HCl (1 M) gepufferten kontinuierlichen
Gradienten von 1,33 g/ml Cäsiumchlorid
verwendet. Nach dem Aufgeben des Virus auf diesen Gradienten wird
das Virus 17 Stunden lang mit 55 000 U/min bei 10 °C zentrifugiert.
Anschließend
wird die Virusbande isoliert, und nach der Zugabe von 30 μl Saccharose
(50% w/v) wird überschüssiges Cäsiumchlorid
durch drei Dialyserunden entfernt, wobei jede Runde 1 Stunde dauert.
Für die
Dialyse wird das Virus auf Dialysecassetten (Slide-a-lyzer, Schwelle
10 000 kDa, Pierce, USA) übertragen.
Die für
die Dialyse verwendeten Puffer sind PBS-Puffer, die mit einer zunehmenden
Konzentration von Saccharose ergänzt
sind (Runde 1 bis 3: 30 ml, 60 ml und 150 ml Saccharose (50% w/v)/1,5
Liter PBS, alle ergänzt
mit 7,5 ml 2% (w/v) CaMgCl2). Nach der Dialyse
wird das Virus aus dem Slide-a-lyzer entnommen, und danach wird
es in Portionen von 25 und 100 μl
aliquotiert, woraufhin das Virus bei –85 °C gelagert wird.
-
Um
die Zahl der Viruspartikel pro ml zu bestimmen, werden 50 μl der Viruscharge
auf einem Hochdruck-Flüssigkeitschromatographen
(HPLC) laufen gelassen. Das Adenovirus wird an die Säule gebunden (Anionaustausch),
und danach wird es mit Hilfe eines NaCl-Gradienten (Bereich 300–600 mM)
eluiert. Durch Be stimmung der Fläche
unter dem Viruspeak kann die Zahl der Viruspartikel berechnet werden.
Um die Zahl der infektiösen
Einheiten (IE) pro ml zu bestimmen, die in einer Viruscharge vorhanden
sind, werden Titrationen mit 911-Zellen durchgeführt. Zu diesem Zweck werden
4 × 104 911-Zellen pro Napf von 96-Napf-Platten in den
Reihen B, D und F in einem Gesamtvolumen von 100 μl pro Napf
ausgesät.
Drei Stunden nach der Aussaat werden die Zellen an dem Kunststoffträger befestigt,
und danach kann das Medium entfernt werden. Zu den Zellen wird ein
Volumen von 200 μl
gegeben, in zwei Parallelversuchen, die unterschiedliche Verdünnungen
des Virus enthielten (Bereich: 102-mal verdünnt auf
2 × 109). Durch Screening in Bezug auf CPE wird
von der höchsten
Virusverdünnung,
die nach 14 Tagen noch zu CPE führt,
angenommen, dass sie wenigstens eine infektiöse Einheit enthält. Mit
Hilfe dieser Beobachtung zusammen mit der berechneten Menge des
Virusvolumens, das in diesen Näpfen
vorhanden ist, erhält
man die Zahl der infektiösen
Einheiten pro ml einer gegebenen Viruscharge. Die Produktionsergebnisse,
d.h. die Viruspartikel pro ml und die IE pro ml für die bisher
produzierten chimärischen
Adenoviren sind in Tabelle 4 gezeigt.
-
Beispiel 4: Umgeleitete
Infektion von chimärischen
Adenoviren
-
Um
eine umgeleitete Infektion der in Bezug auf Faserprotein chimärischen
Adenoviren in vitro nachzuweisen, wurde ein Sortiment von humanen
Zelllinien unterschiedlicher Herkunft verwendet. Diese Menge umfasst
unter anderem humane hepatische Zellen, primäre Fibroblasten, von hämatopoetischen
Zellen abgeleitete Zelllinien, primäre Zellen der glatten Muskulatur,
primäre
Synoviocyten und primäre
Zellen, die von der Amnionflüssigkeit
abgeleitet sind, wie Amniocyten, und Chorionzotten. Diese Zelltypen
wurden mit einem Sortiment von chimärischen Adenoviren infiziert,
die sich in Bezug auf das Faserprotein voneinander unterscheiden.
Zu diesem Zweck werden Zielzellen in einer Konzentration von 105
Zellen pro Napf von 6-Napf-Platten in 2 ml Dulbeccos modifiziertem
Eagle-Medium (DMEM, Life Technologies, Niederlande), das mit 10%
fetalem Kälberserum
versetzt war, ausgesät.
24 Stunden später
wird das Medium durch frisches Medium ersetzt, das die verschiedenen
chimärischen Adenoviren
mit einem steigenden MOI von 0, 10, 50, 250, 1250, 2500, 500 enthielt
(MOI: Multiplizität
der Infektion, bezogen auf Viruspartikel pro Zelle). Ungefähr 2 Stunden
nach der Zugabe von Virus wird das Medium, welches das Virus enthält, verworfen,
die Zellen werden einmal mit PBS gewaschen, und anschließend werden
2 ml frisches Medium (das kein Virus enthält) in jeden Napf gegeben.
48 Stunden später
werden die Zellen geerntet, gewaschen und durch 5 Minuten Zentrifugieren
mit 1500 U/min sedimentiert. Die Zellen werden anschließend in
0,1 ml Lysepuffer (1% Triton X-100, 15% Glycerin, 2 mM EDTA, 2 mM
DTT und 25 mM MgCl2 in Tris-Phosphat-Puffer,
pH 7,8) lysiert, und danach wird die Gesamtproteinkonzentration
des Lysats gemessen (Biorad, Proteinstandard II). Um die Expression
des Markergens (Luciferase-Aktivität) zu bestimmen werden 20 μl der Proteinprobe
mit 100 μl
eines Luciferase-Substrats (Luciferine, Promega, Niederlande) gemischt
und anschließend
auf einer Lumat-LB-9507-Apparatur
(EG & G Berthold, Niederlande)
gemessen. Die Ergebnisse dieser Infektionsexperimente sind in Tabelle
5 gezeigt und als Menge der Luciferase-Aktivität (RLU) pro μg Protein
angegeben. Diese Ergebnisse beweisen eindeutig, dass eine Veränderung
des Faserproteins zu einer Veränderung
des Wirtsspektrums des Adenovirus Serotyp 5 führt.
-
Beispiel 5: Rezeptorverwendung
von faserchimärischen
Adenoviren
-
Um
zu bestimmen, welche zellulären
Moleküle
von den faserchimärischen
Adenoviren verwendet werden, wurde die Expression von Proteinen
gemessen, die bekanntermaßen
an der Adenovirus-Serotyp-5-Infektion beteiligt sind, d.h. Coxsackie-Adenovirus-Rezeptor
(CAR), MHC Klasse I und Integrine αvβ3, αvβ5). Zu diesem
Zweck wurden 1 × 105 Zielzellen in Röhrchen übergeführt (4 Röhrchen pro Zelltyp), die für die Durchflusscytometrie
vorgesehen sind. Die Zellen wurden einmal mit PBS/0,5% BSA gewaschen,
und danach wurden die Zellen 5 Minuten lang durch Zentrifugation
mit 1750 U/min bei Raumtemperatur sedimentiert. Anschließend wurden
10 μl eines
hundertfach verdünnten αvβ3-Antikörpers (Mab
1961, Brunswick Chemie, Amsterdam, Niederlande), eines hundertfach
verdünnten αvβ5-Antikörpers (Mab
1976, Brunswick Chemie, Amsterdam, Niederlande) oder eines 2000fach
verdünnten
CAR-Antikörpers
(eine Spende von Dr. Bergelson, Harvard Medical School, Boston,
USA (Hsu et al.)) zu dem Zellsediment gegeben, und danach wurden
die Zellen 30 Minuten lang bei 4 °C
in einer dunklen Umgebung inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden
die Zellen zweimal mit PBS/0,5% BSA gewaschen und wiederum durch
5 Minuten Zentrifugation mit 1750 U/min bei Raumtemperatur sedimentiert.
Um die Zellen zu markieren, wurden 10 μl mit Phycoerythrin (PE) markiertes
Ratten-Anti-Maus-IgG1
zu dem Zellsediment gegeben, und danach wurden die Zellen wiederum
30 Minuten lang bei 4 °C
in einer dunklen Umgebung inkubiert. Schließlich wurden die Zellen zweimal
mit PBS/0,5% BSA gewaschen und mit einem Durchflusscytometer analysiert.
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle 6 gezeigt. Außerdem ist
in Tabelle 6 die Infektionseffizienz eines Adenovirus von Untergruppe
A, B, C, D und F eingearbeitet. Diese Daten zeigen eindeutig, dass
die Infektion eines Adenovirus der Untergruppe C mit der Expression
von CAR korreliert. Die Daten beweisen auch, dass die chimärischen
Adenoviren, die eine Faser eines Adenovirus der Untergruppe B, D
oder F tragen, Zellen infizieren können, die keine messbaren Mengen des
CAR-Proteins exprimieren, und somit in der Lage sind, Zellen über andere
(CAR-unabhängige)
Wege zu infizieren.
-
Beispiel 6: Radioaktive
Markierung von Adenoviruspartikeln
-
Um
eine Nachverfolgung der Infektion der Wildtyp-Adenovirus-Serotypen
zu ermöglichen,
wurden diese Viren vor der Infektion mit radioaktivem 125I/125I oder mit fluoreszierenden Sonden markiert.
Mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie oder durch Messen der Radioaktivität wird die
Effizienz der Infektion von verschiedenen Serotypen in bestimmte
Zelltypen bestimmt. Um die umgeleitete Infektion des in Bezug auf
Faserprotein chimärischen
Adenovirus in vivo nachzuweisen, wurden 1 × 109 infektiöse Partikel
durch die Schwanzvene in CBA/ca-Mäuse injiziert (2 Mäuse für jedes
chimärische
Adenovirus). Der Nachweis der Adenovirus-Infektion in spezifische
Gewebe wird auf zwei verschiedenen Ebenen überwacht: 1) Die Bindung des
chimärischen
Adenovirus wird durch radioaktive Markierung des Adenovirus überwacht
(Eisenlohr et al., 1987; Matlin et al., 1981; Richman et al., 1998).
Eine Stunde nach der systemischen in-vivo-Abgabe durch die Schwanzvene
werden die Mäuse
getötet
und danach vorzugsweise durch Messen der Radioaktivität in verschiedenen
Organen bzw. Geweben untersucht. 2) Die erfolgreiche Infektion wird
anhand der Genexpression des Markergens, d.h. lacZ oder Luciferase-Aktivität, durch
das Adenovirus überwacht.
Vier Tage nach der Verabreichung werden die Mäuse getötet, und danach werden Organe
und Gewebe isoliert. Zu den Proben gehörten die Leber, Milz, Magen-Darm-Trakt, peripheres
Blut, Knochenmark, Aorta, Muskeln usw. Mit Hilfe dieser Strategie
kann die bevorzugte Bindung eines chimärischen Adenovirus an interessierende
Gewebe untersucht werden. Außerdem kann
mit Hilfe dieser Strategie die bevorzugte Infektion von chimärischem
Adenovirus in spezifische Zellen von bestimmten Organen bestimmt
werden.
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80 μCi 123I (Cygne BV, Niederlande) oder 125I (Amersham) wurden durch sechs Minuten
Inkubation bei RT in einem mit Iodogen vorbeschichteten Röhrchen (Pierce)
in 100 μl
Iodierungspuffer (25 mM Tris, pH 8, 0,4 M NaCl) aktiviert. Die Reaktion
der radioaktiven Markierung wurde gestartet, indem man das aktivierte
Iodid in ein Eppendorf-Röhrchen überführte, das
1,5·1010 Adenoviruspartikel in 100 μl Iodierungspuffer
enthielt. Man ließ die
Reaktion neun Minuten lang bei RT fortschreiten, und danach wurde
der eingebaute Marker durch Gelfiltration unter Verwendung einer
Sephadex-25-Säule
(P-10, Pharmacia) von freiem Marker abgetrennt. Zu diesem Zweck
wurde eine P-10-Säule
mit 10 ml PBS-Puffer vorgewaschen und anschließend mit der Reaktion der radioaktiven
Markierung, die mit 2 ml Iodierungspuffer versetzt war, beladen.
Nachdem die erste durchfließende
Lösung
verworfen wurde, wurde die Säule
in 0,5-ml-Schritten mit PBS-Puffer
eluiert, und die unterschiedlichen Fraktionen wurden in getrennten
Röhrchen
aufgefangen. Freier Marker, der von der Säule verlangsamt wird, war in
den Fraktionen 10–16
konzentriert. Radioaktiv markierte Viruspartikel häuften sich
vorwiegend in den Fraktionen 4, 5 und 6 an, die einem eluierten
Gesamtvolumen von 2–3
ml entsprachen. Die Radioaktivität
dieser virushaltigen Fraktionen wurde gemessen und als Zählereignisse
pro Minute (cpm) ausgedrückt,
was bis zu 5·106 cpm pro 1010 Viruspartikel
ergab.
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Mehrere
Kontrollexperimente wurden durchgeführt, um die Integrität der Viruspartikel
nach den verschiedenen Manipulationen zu gewährleisten. Zum Beispiel war
eine Reaktion dabei, bei der die Viruspartikel einer identischen
Behandlung unterzogen wurden, wobei jedoch das radioaktive Iodid
weggelassen wurde. Anschließend
wurden die eluierten Viruspartikel verwendet, um A549-Zellen zu
infizieren. Die Menge der infizierten Zellen wurde anhand der Expression
eines visuellen Markergens, wie LacZ, festgestellt. Außerdem wurden
kleine Aliquote dieser eluierten Fraktionen, die radioaktiv markiertes
Adenovirus darstellten, verwendet, um A549-Zellen zu infizieren
und dadurch die Expression des Transgens zu testen, die als Hinweis
auf die Lebensfähigkeit
de Virus der speziellen verwendeten Viruscharge angesehen wurde.
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Die
radioaktiv markierten Viruspartikel können anschließend für verschiedene
in-vitro- und in-vivo-Studien
verwendet werden, um die Affinität
zu verschiedenen Zelltypen oder zu verschiedenen Organen zu bestimmen.
Für in-vitro-Studien
werden verschiedene Zelllinien, wie zum Beispiel HUVEC (humane Nabelschnur-Endothelzellen) oder
SMC (Zellen der glatten Muskulatur) in 24-Napf-Platten in dem geeigneten
Kulturmedium ausgesät
und mit radioaktiv markierten Adenoviruspartikeln mit einer Multiplizität der Infektion
von 10, 100 bzw. 1000 infiziert. Als Kontrolle werden die Zellen
mit einer ähnlichen
Menge an freiem Iodid inkubiert. Zwei Stunden nach der Infektion
werden die Zellen gründlich
mit PBS-Puffer gewaschen,
und die restliche Radioaktivität
wurde gemessen. Die Menge der Radioaktivität, die mit den Zellen verbunden
bleibt, korrigiert um die Menge der Radioaktivität der mit freiem Marker inkubierten
Kontrollzellen ist ein direktes Maß für die Menge an Virus, die an
die Zellen gebunden ist oder in diese eingedrungen ist.
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Für in-vivo-Studien
wurde die Bioverteilung von Adenoviren, die sich nur bezüglich der
Herkunft ihrer Faserproteine voneinander unterscheiden, verglichen.
Zu diesem Zweck wurden Ratten unter Vollnarkose gesetzt, und 0,1– 2 MBq radioaktiv
markierte Adenoviruspartikel wurden intravenös (iv) in die Schwanzvene verabreicht.
Als Kontrolle erhielt eine Ratte eine vergleichbare Dosis mit nur
freiem Iodid. Die Tiere wurden anschließend auf einen Gammascanner
gesetzt und 10 Minuten lang gescannt, um die Quelle der Gammastrahlung
zu lokalisieren und somit die in-vivo-Bioverteilung von systemisch
eingeführtem
Adenovirus zu bestimmen. Nach einer Stunde wurde die Tiere getötet, und
die größeren Organe
wurden zum Wiegen und zur genauen Quantifizierung der Radioaktivität mit Hilfe
eines Szintillationszählers
entnommen. Die Verteilung der Radioaktivität in verschiedenen Organen
nach der iv-Injektion ist in 8 gezeigt
und als cpm pro Gramm Gewebe ausgedrückt.
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Beispiel 7: Infektion
von humanen primären
Zellen aus Amnionflüssigkeit
-
In
Tabelle 5 (Beispiel 4) sind Infektionsergebnisse sowohl für Amnionzellen
als auch für
Chorionzotten gezeigt. Diese Zelltypen werden aus der Amnionflüssigkeit
isoliert und ex vivo unter Standardbedingungen (Roest et al., 1996)
kultiviert. Solche Zellen sind ideale Ziele zur Verwendung bei der
pränatalen
Diagnose. Zum Beispiel ist die pränatale Diagnose von muskulärem Dystrophin
in manchen Fällen
(ungefähr
50–100
jährlich)
unter Verwendung von Standardtechniken wie RT-PCR oder DNA-PCR nicht
möglich,
da die Mutationen im Dystrophin-Gen unbekannt sind und die Menge
des in undifferenzierten Chorionzotten- oder Amnionzottenzellen
produzierten Dystrophins sehr gering ist. In diesen Fällen wird
eine Isolierung und Schnelldifferenzierung von vorwiegend Chorionzottenzellen
durchgeführt.
Diese Chorionzotten werden anschließend mit einem Retrovirus (Roest
et al., 1996) oder einem Adenovirus, das die MyoD-DNA trägt (Roest
et al., 1999), infiziert, das nach der Transduktion innerhalb einer
Woche die Differenzierung der Chorionzotten zu Zellen der gestreiften
Muskulatur auslöst.
Nach der vollständigen
Differenzierung können
diese Zellen dann für
Western-Analyse oder Immunhistochemie verwendet werden, um zu bestimmen,
ob das Dystrophin-Protein exprimiert wird. Bisher war die Infektionseffizienz
von Chorionzottenzellen enttäuschend,
wobei nur 2–5%
der Zellen mit einem Retro virus transduziert waren (Roest et al.,
1996). Unter Verwendung eines Serotyp-5-Adenovirus, um die MyoD-cDNA an Chorionzotten
abzugeben, können
ungefähr
10%–20%
(Roest et al., 1999) der Zellen transduziert werden, aber nur, wenn
man eine hohe Multiplizität
der Infektion (MOI) verwendet, was zu unerwünschter Toxizität und damit
Zelltod führt.
Die Ergebnisse in Tabelle 5 beweisen eindeutig, dass das Adenovirus
Serotyp 5 kein idealer Kandidat zum Transduzieren von Charionzottenzellen
ist, da bei der höchsten
getesteten MOI (MOI = 5000 Viruspartikel pro Zelle) nur eine marginale
Luciferase-Aktivität
gemessen wird (75 RLU/μg
Protein). Diese Ergebnisse werden mit Hilfe von Durchflusscytometrie
in Bezug auf die Anwesenheit des Coxsackie-Adenovirus-Rezeptors (CAR) und
der Integrine bestätigt,
was beweist, dass die Rezeptoren für Adenovirus Serotyp 5 auf
Chorionzotten nur marginal vorhanden sind (Tabelle 6). Überraschenderweise
transduziert der auf Adenovirus Serotyp 5 beruhende Vektor, der
eine Faser entweder von Untergruppe B (Faser 16 und/oder 51) oder
Untergruppe F (Faser 40-L) enthält,
die Chorionzotten mit hoher Effizienz. Der Vektor, der auf der Grundlage
der Luciferase-Aktivität
das beste Ergebnis zeigt, ist das Adenovirus 5 mit der Faser 40-L, das
zu 1 688 028 relativen Lichteinheiten pro μg Protein führt, einer > 20 000fach erhöhten Transgenexpression im
Vergleich zu Adenovirus Serotyp 5. Dieser Vektor kann also verwendet
werden, um in der Amnionflüssigkeit
vorhandene Zellen so zu transduzieren, dass eine schnelle Differenzierung
für die
oben beschriebenen Zwecke ermöglicht
wird, oder er kann zur Hemmung der Genexpression während der
pränatalen
Entwicklung oder zum Übertragen
und Exprimieren einer interessierenden Nucleinsäure auf die Amnionflüssigkeit
verwendet werden.
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Beispiel 8: Erzeugung
von auf Adenovirus Serotyp 5 beruhenden Viren mit chimärischem
Hexonprotein
-
Das
Verfahren zur Erzeugung von rekombinanten Adenoviren durch Cotransfektion
von zwei oder mehr getrennten klonierten Adenovirussequenzen ist
unten beschrieben. Diese klonierten adenoviralen Sequenzen wurden
anschließend
verwendet, um spezifische Adenovirus-Serotyp-5-Sequenzen zu entfernen
und dadurch Matrizenklone zu erzeugen, die eine leichte Einführung von
DNA-Sequenzen, die
von anderen Adenovirus-Serotypen abgeleitet sind, ermöglichen.
Als Beispiel für
diese Matrizenklone ist die Konstruktion von Plasmiden angegeben,
die einen Austausch von DNA, die für Hexonprotein codiert, ermöglichen.
-
Erzeugung
von Adenovirus-Matrizenklonen, denen für Hexon codierende DNA fehlt
-
Für Hexon
codierende Sequenzen von Adenovirus Serotyp 5 befinden sich zwischen
den Nucleotiden 18841 und 21697. Um den Austausch von hexoncodierenden
Sequenzen von alternativen Adenovirus-Serotypen in das Gerüst von Adenovirus
Serotyp 5 zu erleichtern, wurde zuerst ein Shuttle-Vektor erzeugt.
Dieser Unterklon mit dem Code pBr/Ad.Eco-PmeI wurde erzeugt, indem
man zuerst das Plasmid pBr322 mit EcoRI und EcoRV abbaute und dann
das 14-kb-PmeI-EcoRI-Fragment
aus pWE/Ad.AflII-Eco einsetzte. In diesem Shuttle-Vektor wurde eine
Deletion eines SanDI-Fragments mit 1430 bp durch einen Aufschluss
mit SanDI und eine erneute Ligierung durchgeführt, wodurch pBr/Ad.Eco-PmeIΔSanDI erhalten
wurde. Das entfernte Fragment enthält einzigartige SpeI- und MunI-Stellen.
Aus pBr/Ad.Eco-PmeIΔSanDI
wurde das die Adenovirus-Serotyp-5-DNA codierende Hexon deletiert.
Dazu wurden die Hexon-flankierenden Sequenzen mittels PCR amplifiziert
und miteinander verbunden, wodurch einzigartige Restriktionsstellen
erzeugt wurden, die die das Hexon codierende Region ersetzten. Für diese
PCR-Reaktionen waren vier verschiedene Oligonucleotide erforderlich: Δhex1–Δhex4.
- Δhex1: 5'- CCT GGT GCT GCC
AAC AGC-3'
- Δhex2:
5'- CCG GAT CCA
CTA GTG GAA AGC GGG CGC GCG-3'
- Δhex3:
5'- CCG GAT CCA
ATT GAG AAG CAA GCA ACA TCA ACA AC-3'
- Δhex4:
5'- GAG AAG GGC
ATG GAG GCT G-3'
(siehe 9).
Das amplifizierte DNA-Produkt von ± 1100 bp, das mit den Oligonucleotiden Δhex1 und Δhex2 erhalten
wurde, wurde mit BamHI und FseI aufgeschlossen. Das amplifizierte
DNA-Produkt von ± 1600
bp, das mit den Oligonucleotiden Δhex3
und Δhex4
erhalten wurde, wurde mit BamHI und SbfI aufgeschlossen. Diese aufgeschlossenen
PCR-Fragmente wurden anschließend
vom Agarosegel gereinigt und in einer dreiteiligen Ligierungsreaktion
unter Verwendung von T4-Ligaseenzym mit pBr/Ad.Eco-PmeI ΔSanDI, das
mit FseI und SbfI aufgeschlossen war, verbunden. Das resultierende
Konstrukt erhielt den Code pBr/Ad.Eco-PmeΔHexon. Dieses Konstrukt wurde
teilweise sequenziert, um die richtige Nucleotidsequenz und das
Vorhandensein der einzigartigen Restriktionsstellen MunI und SpeI
zu bestätigen.
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Amplifikation
von Hexonsequenzen aus Adenovirus-Serotypen
-
Um
die Amplifikation der DNAs, die von alternativen Serotypen abgeleitetes
Hexonprotein codieren, zu ermöglichen,
wurden degenerierte Oligonucleotide synthetisiert. Zu diesem Zweck
wurden zuerst bekannte DNA-Sequenzen, die Hexonprotein von alternativen
Serotypen codieren, miteinander abgeglichen, um konservierte Bereiche
sowohl im N-Terminus als auch im C-Terminus des Hexonproteins zu
identifizieren. Aus dem Abgleich, der die Nucleotidsequenz von 9
verschiedenen Serotypen enthielt, die 5 der 6 bekannten Untergruppen
darstellten, wurden (degenerierte) Oligonucleotide synthetisiert.
Diese Oligonucleotide erhielten den Code HEX-up (5'-GG ACG TGT AAG ATG
GCY ACC CCH TCG ATG MTG-3')
und HEX-down (5'-CCA TCG
ATG GTT ATG TKG TKG CGT TRC CGG C-3'). Die Amplifikationsreaktion (50 μl) enthielt
2 mM dNTPs, 25 pmol jedes Oligonucleotids, Standard-1x-PCR-Puffer,
1,5 mM MgCl2 und 1 Einheit hitzestabile
Pwo-Polymerase (Boehringer) pro Reaktion. Das Cycler-Programm enthielt
20 Zyklen, die jeweils aus 30 s bei 94 °C, 60 s bei 60–64 °C und 120
s bei 72 °C
bestanden. Ein Zehntel des PCR-Produkts wurde auf einem Agarose-Gel laufen gelassen,
was bewies, dass ein DNA-Fragment amplifiziert wurde. Von den verschiedenen
Matrizen wurden jeweils zwei unabhängige PCR-Reaktionen durchgeführt, und
danach wurden die erhaltenen unabhängigen PCR-Fragmente sequenziert,
um die Nucleotidsequenz zu bestimmen. Von 9 verschiedenen Serotypen
konnte die Nucleotidsequenz mit in GenBank vorhandenen Sequenzen
verglichen werden. Von allen anderen Serotypen ist die das Hexonprotein
codierende Nucleotidsequenz nicht bekannt. Bisher wurde von jedem
Serotyp außer
den Serotypen 1, 8, 13 und 18 die Hexonsequenz durch PCR amplifiziert.
Die Proteinsequenz des Hexons der Serotypen 34, 35, 36 und 41 ist
in 10 angegeben.
-
Erzeugung
von hexonchimärischen
adenoviralen DNA-Konstrukten
-
Alle
amplifizierten Hexon-DNAs sowie der Vektor (pBr/Ad.Eco-PmeΔHexon) wurden
mit MunI und SpeI abgebaut. Die abgebauten DNAs wurden anschließend auf
einem Agarose-Gel laufen gelassen, und danach wurden die Fragmente
von dem Gel isoliert und unter Verwendung des Geneclean Kit (Bio101
Inc.) gereinigt. Dann wurden die PCR-Fragmente in die MunI- und
SpeI-Stellen von pBr/Ad.Eco-PmeΔHexon
kloniert, wodurch pBr/Ad.Eco-PmeΔHexXX
entstand (wobei XX die Nummer des Serotyps ist, von dem die Faser-DNA isoliert
wurde). Bisher wurde die Hexonsequenz der Serotypen 2, 3, 4, 5,
7, 9, 10, 11, 14, 15, 16, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30,
31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 46, 47, 48, 49,
50, 51 in pBr/Ad.Eco-PmeΔHexXX
kloniert. Aus pBr/Ad.Eco-PmeΔHexXX
(wobei XX = 20, 25, 26, 28, 30, 34, 35 ist) wurde ein 9,6-kb-AscI-Fragment,
das die Hexonsequenz umfasste, durch Gel-Elektrophorese und eine
Agarose-Vorschrift (Boehringer Mannheim, Niederlande) isoliert.
Dieses AscI-Fragment wurde anschließend in das Cosmid pWE/Ad.AflII-rITRsp (siehe Beispiel
1) kloniert, das mit AscI bis zu Ende verdaut und dephosphoryliert
wurde, wie es oben beschrieben ist. Diese Cosmidklonierung führte zur
Bildung des Konstrukts pWE/Ad.AflII-rITR/HexXX (wobei XX die Nummer
des Serotyps ist, von dem die Hexon-DNA isoliert wurde).
-
Erzeugung
von rekombinantem in Bezug auf Hexonprotein chimärischem Adenovirus
-
Zur
Erzeugung von rekombinantem Ad5-Virus, das das Hexon von alternativen
Serotypen trägt,
wurden Adenovirus erzeugende Zellen mit zwei Konstrukten, pCLIP.Luc
und pWE/Ad.AflII-rITR/HexXX, transfiziert. Für die Transfektion wurden 4 μg pCLIP.Luc
und 4 μg
pWE/Ad.AflII-rITR/HexXX in serumfreiem DMEM auf 100 μl Gesamtvolumen
verdünnt.
Zu dieser DNA-Suspension wurden 100 μl auf 2/3 verdünntes Lipofectamin
(Gibco) gegeben. Nach 30 min bei Raumtemperatur wurde die DNA-Lipofectamin-Komplexlösung zu
2,5 ml serumfreiem DMEM gegeben, das anschließend zu einem T25-cm2-Gewebekulturkolben gegeben wurde (die Zellen
wurden vor der Zugabe von DNA-Lipofectamin-Komplex mit 5 ml serumfreiem Medium
gewaschen). Dieser Kolben enthielt 3 × 106 PER.C6-Zellen,
die 24 Stunden vor der Transfektion ausgesät wurden. Zwei Stunden später wurde
das den DNA-Lipofectamin-Komplex enthaltende Medium einmal durch
Zugabe von 2,5 ml DMEM verdünnt,
das mit 20% fetalem Kälberserum
ergänzt
war. Wieder 24 Stunden später
wurde das Medium durch frisches DMEM ersetzt, das mit 10% fetalem
Kälberserum
ergänzt
war. Die Zellen wurden 6–8
Tage lang kultiviert, anschließend
geerntet und einem Frier/Tau-Vorgang unterzogen. Zelltrümmer wurden durch
5 min Zentrifugation mit 3000 U/min bei Raumtemperatur entfernt.
Vom Überstand
(12,5 ml) wurden 3–5 ml
verwendet, um wiederum PER.C6-Zellen (T80-cm2-Gewebekulturkolben)
zu infizieren.
-
Zu hexonchimärischem
Adenovirus umgeleitete Neutralisation
-
Um
eine veränderte
Immunantwort auf chimärische
Adenoviren nachzuweisen, testeten wir zuerst 75 Seren, die von menschlichen
Patienten stammten (25 Krebspatienten, 50 Patienten mit rheumatoider
Arthritis), auf Toxizität
gegenüber
humanen 911-Zellen. Zu diesem Zweck wurden 911-Zellen in einer Konzentration
von 3 × 104 Zellen pro Napf in 96-Napf-Mikrotiterplatten
ausgesät.
24 Stunden später
wurde das Medium aller Näpfe
außer
der Näpfe
A1-H1, A5-H5 und A9-H9 durch 50 μl
DMEM ersetzt, das mit 5% fetalem Kälberserum ergänzt war.
In die Näpfe
A1, A2, B1 und B2 wurden 50 μl
Patientenserum 1 gegeben. Ähnlich
wurden in die Näpfe
C1, C2, D1 und D2 50 μl
Patientenserum 2 gegeben, usw. Anschließend wurden 50 μl aus den
Näpfen A2-H2
in A3-H3 übergeführt, und
danach wurden 50 μl
aus den Näpfen
A3-H3 in A4-H4 übergeführt. Dieses Testschema
führte
also zu einer Serumkverdünnung
von 0x, 2x, 4x und 8x für
jedes Patientenserum. Die identische Behandlung der Näpfe A5-H5
bis A8-H8 und A9-H9
bis A12-H12 führt
zu 12 getesteten Seren pro 96-Napf- Mikrotiterplatte. Von 75 insgesamt getesteten
Patientenseren wurden 25, die keine erkennbare Toxizität auf humane
911-Zellen zeigten, anschließend
auf die Anwesenheit von Antikörpern
getestet, die eine Infektion durch chimärisches Adenovirus neutralisieren
können.
Zu diesem Zweck wurden 96-Napf-Mikrotiterplatten mit 50 μl DMEM gefüllt, das
mit 5% fetalem Kälberserum
versetzt war, außer
die Näpfe
A1-H1. In die Näpfe
A1, A2, B1 und B2 wurden 50 μl
Patientenserum 1 gegben. Ähnlich
wurden in die Näpfe
C1, C2, D1 und D2 50 μl
Patientenserum 2 gegeben, usw. Anschließend wurden 50 μl aus den
Näpfen
A2-H2 in die Näpfe A3-H3 übergeführt, und
danach wurden 50 μl
aus A3-H3 in A4-H4 übergeführt, usw.
bis A12-H12 (Verdünnungsbereich:
0 – 1/2048).
Aus den Näpfen
A12-H12 wurden 50 μl
verworfen. Dann wurden 50 μl
Virus hinzugefügt,
und danach wurden die Mikrotiterplatten 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert.
Nach Zugabe von 50 μl 911-Zellsuspension
(3 × 104 Zellen/Napf) wurden die Platten 7–9 Tage
lang inkubiert, und danach wurde die Neutralisationsfähigkeit
anhand der Abwesenheit, Anwesenheit oder Schwere der CPE bewertet.
Als Kontrollen während
dieser Experimente wurden Abwesenheit von Serum, Abwesenheit von
Virus und Abwesenheit von Serum und Virus genommen. Auf der Grundlage
dieser Experimente werden mehrere chimärische Viren identifiziert,
gegen die vom Menschen nur wenig neutralisierende Antikörper erzeugt
werden. Ähnliche
Experimente, wie sie oben beschrieben sind, werden mit Wildtyp-Adenovirus-Serotypen
sowohl vom Menschen als auch von Tieren durchgeführt, um nach Serotypen zu suchen,
die weniger anfällig
für eine
Neutralisierung durch das Abwehrsystem des Wirts sind. Diese Experimente
sind zwar ähnlich,
werden jedoch in einer solchen Weise entwickelt, dass ein Hochdurchsatz-Screening
von vielen Proben auf einmal möglich
ist. Dieser Assay ist im Folgenden beschrieben.
-
Hochdurchsatz-Assay zum
Nachweis einer neutralisierenden Wirkung in humanem Serum
-
Um
ein Screening einer großen
Menge an humanem Serum auf das Vorhandensein neutralisierender Antikörper gegen
alle Adenovirus-Serotypen zu ermöglichen,
wurde ein automatisierter Assay für 96 Näpfe entwickelt.
-
Humane Seren
-
Eine
Gruppe von 100 Personen wurde ausgewählt. Freiwillige (50% männlich,
50% weiblich) waren gesunde Individuen mit einem Alter zwischen
20 und 60 und ohne Einschränkungen
hinsichtlich der Rasse. Alle Freiwilligen unterschrieben ein Einverständnisformular.
Personen, die berufsmäßig mit
der Adenovirus-Forschung
zu tun haben, wurden ausgeschlossen.
-
Etwa
60 ml Blut wurde in trockene Röhrchen
abgezogen. Innerhalb von 2 h nach der Probennahme wurde das Blut
10 min lang mit 2500 U/min zentrifugiert. Etwa 30 ml Serum wurden
in Polypropylenröhrchen übertragen
und gefroren bei –20 °C bis zur
Weiterverwendung aufbewahrt.
-
Serum
wurde aufgetaut und 10 min lang bei 56 °C durch Wärme inaktiviert und dann aliquot
aufgeteilt, um wiederholte Gefrier-/Tau-Zyklen zu vermeiden. Ein
Teil wurde zur Herstellung von fünf
Stufen von zweifachen Verdünnungen
in einem Medium (DMEM, Gibco BRL) in einer Menge, die zum Füllen von
etwa 70 Platten mit je 96 Näpfen
ausreichend war, verwendet. Aliquote Teile von unverdünnten und
verdünnten
Seren wurden in Platten mit tiefen Näpfen (Format mit 96 Näpfen) pipettiert
und unter Verwendung eines programmierten PlateMate als aliquote
100-μl-Teile
Platten mit 96 Näpfen
zudosiert. Auf diese Weise wurden die Platten nach dem unten aufgeführten Schema
mit acht verschiedenen Seren in duplo (100 μl/Napf) beladen:
-
-
Während S1/2
bis S8/2 in den Spalten 1 und 6 ein Mal verdünnte Seren darstellen, stellen
Sx/4, Sx/8, Sx/16 und Sx/32 die zweifachen seriellen Verdünnungen
dar. Die letzten Platten enthielten auch vier Näpfe, die mit 100 μl fetalem
Kalbsserum als Negativkontrolle befüllt waren. Die Platten wurden
bis zur Weiterverwendung bei –20 °C gehalten.
-
Herstellung
von humanem Adenovirus-Ausgangsmaterial
-
Prototypen
aller bekannten humanen Adenoviren wurden in T25-Kolben, die mit
PER.C6-Zellen (Fallaux et al., 1998) beimpft waren, inokuliert und
nach vollständiger
CPE geerntet. Nach einem Gefrieren/Auftauen wurden 1–2 ml der
rohen Lysate zum Inokulieren eines T80-Kolbens mit PER.C6-Zellen
verwendet, und das Virus wurde bei vollständiger CPE geerntet. Der Zeitrahmen
zwischen der Inokulierung und dem Auftreten der CPE sowie die Virusmenge,
die zum Reinfizieren einer neuen Kultur erforderlich war, variierte
zwischen den Serotypen. Adenovirus-Ausgangsmaterialien wurden durch
Gefrieren/Auftauen hergestellt und zum Inokulieren von 3–4 T175-cm2-Dreischichtkolben mit PER.C6-Zellen verwendet.
Beim Auftreten der CPE wurden Zellen durch ein Rütteln des Kolbens geerntet,
sedimentiert, und Virus wurde isoliert und mittels eines zweistufigen
CsCl-Gradienten wie folgt gereinigt. Zellsedimente wurden in 50
ml eines Puffers aus 10 mM NaPO4 (pH-Wert
7,2) gelöst
und bei –20 °C eingefroren.
Nach Auftauen bei 37 °C
wurden 5,6 ml Natriumdeoxycholat (5% Gew./Vol.) zugegeben. Die Lösung wurde
vorsichtig gemischt und 5–15
min lang bei 37 °C
inkubiert, um die Zellen vollständig
zu lysieren. Nach einem Homogenisieren der Lösung wurden 1875 μl 1 M MgCl2 zugegeben. Nach der Zugabe von 375 μl DNase (10
mg/ml) wurde die Lösung
30 min lang bei 37 °C
inkubiert. Zellrückstände wurden
durch ein 30minütiges,
bei RT ohne Bremse erfolgendes Zentrifugieren bei 1880 × g entfernt.
Der Überstand
wurde anschließend
durch Extraktion mit Freon (3×)
von Proteinen gereinigt. Der geklärte Überstand wurde auf einen mit
1 M Tris/HCl gepufferten Cäsiumchlorid-Blockgradienten
(Bereich: 1,2/1,4 g/ml) aufgegeben und 2,5 h lang bei 10 °C mit 21
000 U/min zentrifugiert. Die Virusbande wird isoliert, wonach eine zweite
Reinigung mittels eines mit 1M Tris/HCl gepufferten kontinuierlichen
Gradienten von 1,33 g/ml Cäsiumchlorid
durchgeführt
wurde. Das Virus wurde dann 17 h lang bei 10 °C mit 55 000 U/min zentrifugiert.
Die Virusbande wird isoliert, und Saccharose (50% Gew./Vol.) wird
bis zu einer Endkonzentration von 1% zugegeben. Überschüssiges Cäsiumchlorid wird durch Dialyse
(drei Mal 1 h bei Raumtemperatur) in Dialyse-Objektträgern (Slide-a-lizer,
Ausschlussgrenze 10 000 kDa, Pierce, USA) gegen 1,5 l PBS, ergänzt mit
CaCl2 (0,9 mM), MgCl2 (0,5
mM) und eine steigende Saccharosekonzentration (1, 2, 5%) entfernt.
Nach der Dialyse wird das Virus aus dem Slide-a-lizer entfernt,
wonach es in Portionen von 25 und 100 μl aliquot aufgeteilt wird, wonach
das Virus bei –85 °C aufbewahrt
wird.
-
Zur
Bestimmung der Anzahl Viruspartikel pro Milliliter werden 50 μl der Viruscharge
gemäß der Beschreibung
von Shabram et al. (1997) in einen Hochdruck-Flüssigchromatographen
(HPLC) aufgegeben. Viren wurden unter Verwendung eines von 0 bis
600 mM reichenden NaCl-Gradienten eluiert. Wie in Tabelle I gezeigt,
variierte die NaCl-Konzentration, bei der die Viren eluiert wurden,
signifikant zwischen den Serotypen.
-
Die
meisten humanen Adenoviren vermehrten sich in PER.C6-Zellen mit
einigen Ausnahmen gut. Die Adenovirustypen 8 und 40 wurden in 911-E4-Zellen
(He et al., 1998) gezüchtet.
Gereinigte Ausgangsmaterialien enthielten zwischen 5 × 1010 und 5 × 1012 Viruspartikel/ml
(VP/ml).
-
Titration
von gereinigten humanen Adenovirus-Ausgangsmaterialien
-
Adenoviren
wurden in PER.C6-Zellen titriert, um die Virusmenge zu bestimmen,
die erforderlich ist, um einen vollen CPE innerhalb von 5 Tagen,
der Zeitdauer des Neutralisationsassays, zu erhalten. Dazu wurden 100 μl Medium
in jeden Napf von Platten mit 96 Näpfen dosiert. 25 μl Adenovirus-Ausgangsmaterialien,
die um 104, 105,
106 oder 107 Mal
vorverdünnt
waren, wurden in die 2. Längsreihe
einer Platte mit 96 Näpfen
gegeben und durch ein 10maliges Herauf- und Herunterpipettieren
vermischt. Dann wurden 25 μl
von der 2. Längsreihe in
die 3. Längsreihe übertragen
und erneut vermischt. Dies wurde bis zur 11. Längsreihe wiederholt, wonach 25 μl aus der
11. Längsreihe
verworfen wurden. Auf diese Weise wurden ausgehend von einem vorverdünnten Ausgangsmaterial
serielle Verdünnungen
in 5er-Schritten erhalten. Dann wurden 3 × 104 PER.C6-Zellen in einem 100-μl-Volumen
zugegeben, und die Platten wurden fünf oder sechs Tage lang bei
37 °C, 5%
CO2 inkubiert. Die CPE wurde mikroskopisch überwacht.
Zur Berechnung der eine 50-%ige Hemmung der Zellkultur bewirkenden
Dosis (CCID50) wurde das Verfahren von Reed und Muensch verwendet.
-
Parallel
wurden identische Platten eingerichtet, die mittels des MTT-Assays
(Promega) analysiert wurden. Bei diesem Assay werden lebende Zellen
durch eine kolorimetrische Färbung
quantifiziert. Dazu wurden 20 μl
MTT (7,5 mg/ml in PBS) in die Näpfe
gegeben und 2 h lang bei 37 °C,
5% CO2, inkubiert. Der Überstand wurde entfernt, und
100 μl einer
20:1-Lösung
von Isopropanol/Triton-X100
wurden in die Näpfe
gegeben. Die Platten wurden 3–5
min lang auf einen Schüttler
für 96
Näpfe gegeben,
um ausgefallenes angefärbtes
Material löslich
zu machen. Die Extinktion wurde bei 540 nm und bei 690 nm (Hintergrund)
gemessen. Mit diesem Assay können
Näpfe mit
fortschreitender CPE oder voller CPE unterschieden werden.
-
Neutralisationsassay
-
Platten
mit 96 Näpfen
mit verdünnten
Proben von humanem Serum wurden bei 37 °C, 5% CO2 aufgetaut.
Adenovirus-Ausgangsmaterial, das auf 200 CCID50 pro 50 μl verdünnt war,
wurde hergestellt, und 50-μl-Aliquote
wurden zu den Längsreihen
1–11 der
Platten mit Serum gegeben. Die Platten wurden 1 h lang bei 37 °C, 5% CO2, inkubiert. Dann wurden allen Näpfen 50 μl PER.C6-Zellen
mit 6 × 105/ml zudosiert und 1 d lang bei 37 °C, 5% CO2, inkubiert. Der Überstand wurde mit frischen
Pipettenspitzen für
jede Querreihe entfernt, und 200 μl
frisches Medium wurde allen Näpfen
zugegeben, um toxische Wirkungen des Serums zu vermeiden. Platten
wurden weitere 4 Tage lang bei 37 °C, 5% CO2,
inkubiert. Darüber
hinaus wurden parallele Kontrollplatten mit verdünnten positiven Kontrollseren,
die in Kaninchen erzeugt wurden und für jeden zu testenden Serotyp
spezifisch waren, in Duplikat in den Längsreihen A und B und mit dem
negativen Kontrollserum (FCS) in den Längsreihen C und D eingerichtet.
Auch in jeder der Längsreihen
E-H wurde eine Titration wie oben beschrieben in Schritten von fünffachen
Verdünnungen
durchgeführt,
wobei mit 200 CCID50 eines jeden zu testenden Virus begonnen wurde.
Am 5. Tag wurde eine der Kontrollplatten mikroskopisch und mit dem MTT-Assay
analysiert. Der experimentelle Titer wurde anhand der mikroskopisch
betrachteten Kontroll-Titrationsplatte
berechnet. Wenn gefunden wurde, dass dei CPE vollständig war,
d.h. die erste Verdünnung
in dem mittels MTT analysierten Kontroll-Titrationsexperiment zeigt
einen klaren Zelltod, wurden alle Assayplatten verarbeitet. War
dies nicht der Fall, wurde der Assay für einen bis mehrere Tage fortgesetzt,
bis vollständige
CPE erkennbar war, wonach alle Platten verarbeitet wurden. In den
meisten Fällen
wurde der Assay am 5. Tag beendet. Eine Serumprobe wird als nicht
neutralisierend betrachtet, wenn bei der höchsten Serumkonzentration im
Vergleich zu den Kontrollen ohne Serum ein maximaler Schutz von
40% zu sehen ist.
-
Beispiel 9: Erzeugung
von auf Ad5 beruhenden Viren mit chimärischen Pentonproteinen
-
Das
Verfahren zur Erzeugung von rekombinanten Adenoviren durch Cotransfektion
von zwei oder mehr getrennten klonierten Adenovirussequenzen ist
unten beschrieben. Diese klonierten adenoviralen Sequenzen wurden
anschließend
verwendet, um spezifische Adenovirus-Serotyp-5-Sequenzen zu entfernen
und dadurch Matrizenklone zu erzeugen, die eine leichte Einführung von
DNA-Sequenzen, die
von anderen Adenovirus-Serotypen abgeleitet sind, ermöglichen.
Als Beispiel für
diese Matrizenklone ist die Konstruktion von Plasmiden angegeben,
die einen Austausch von DNA, die für Pentonprotein codiert, ermöglichen.
-
Erzeugung
von Adenovirus-Matrizenklonen, denen für Penton codierende DNA fehlt
-
Zuerst
wurde ein Shuttle-Vektor für
Pentonsequenzen durch Einsetzen des 7,2 kb großen NheI-EcoRV-Fragments aus
dem Konstrukt pWE/Ad.AflII-EcoRI (in Beispiel 1 beschrieben) in
mit denselben Enzymen verdautes pBr322 hergestellt. Der resultierende
Vektopr wurde pBr/XN genannt. Aus diesem Plasmid wurden Ad5-Pentonsequenzen
deletiert und durch einzigartige Restriktionsstellen ersetzt, die
dann verwendet werden, um neue Pentonsequenzen von anderen Serotypen
einzuführen.
Hierzu wurden die linken flankierenden Sequenzen von Penton in pBr/XN
mittels PCR amplifiziert, wobei die folgenden Primer verwendet wurden:
DP5-F:
5'- CTG TTG CTG
CTG CTA ATA GC-3' und
DP5-R:
5'- CGC GGA TCC TGT ACA ACT AAG GGG AAT ACA AG-3'
-
DP5-R
hat eine BamHI-Stelle (unterstrichen) für die Ligierung mit der rechten
flankierenden Sequenz und führt
auch eine einzigartige BsrGI-Stelle (halbfett) am 5'-Ende des früheren Ad5-Pentonbereichs
ein.
-
Die
rechte flankierende Sequenz wurde amplifiziert unter Verwendung
von:
DP3-F: 5'-CGC
GGA TCC CTT AAG GCA AGC ATG TCC ATC CTT-3' und
DP3-3R: 5'- AAA ACA CGT TTT ACG CGT CGA CCT TTC-3'
-
DP3-F
hat eine BamHI-Stelle (unterstrichen) für die Ligierung mit der linken
flankierenden Sequenz und führt
auch eine einzigartige AflII-Stelle (halbfett) am 3'-Ende des früheren Ad5-Pentonbereichs
ein. Die zwei resultierenden PCR-Fragmente
wurden mit BamHI verdaut und miteinander ligiert. Dann wurde dieses Ligierungsgemisch
mit AvrII und BglII abgebaut. pBr/XN wurde ebenfalls mit AvrII und
BglII abgebaut, und das Vektorfragment wurde mit den abgebauten
ligierten PCR-Fragmenten ligiert. Der resultierende Klon wurde pBr/Ad.Δpenton genannt.
Pentoncodierende Sequenzen von anderen Serotypen als Ad5 wurden
durch PCR amplifiziert, so dass die 5'- und 3'-Enden die BsrGI- bzw. AflII-Stelle enthielten. Bei der
Einführung
dieser heterologen Pentonsequenzen in pBr/Ad.Δpenton entstehen Konstrukte,
die pBr/Ad.pentonXX genannt werden, wobei XX die Nummer des Serotyps
darstellt, die dem Serotyp entspricht, der zum Amplifizieren der
eingesetzten Pentonsequenzen verwendet wurde. Anschließend wurden
die neuen Pentonsequenzen in das Konstrukt pWE/Ad.AflII-rITR eingeführt, indem
man das gemeinsame FseI-Fragment austauschte.
-
Was
wichtig ist: Es ist auch möglich,
anstelle von pWE/Ad.AflII-rITR das FseI-Fragment von pBr/Ad.pentonXX in einen
pWE/Ad.AflII-rITR/HexXX- oder einen pWE/Ad.AflII-rITR/FibXX-Vektor
mit einer modifizierten Hexon- bzw. Fasersequenz einzusetzen. Auf
diese Weise ermöglicht
das auf Plasmiden beruhende System zur Erzeugung von Adenoviren
eine flexible Gestaltung irgendeines Adenovirus mit irgendeinem
gewünschten
Merkmal bezüglich
der Effizienz und Spezifität
der Infektion der Zielzelle sowie bezüglich Immunogenität.
-
Amplifikation
von Pentonsequenzen aus Adenovirus-Serotypen
-
Um
die Amplifikation der DNAs, die von alternativen Serotypen abgeleitetes
Pentonprotein codieren, zu ermöglichen,
wurden degenerierte Oligonucleotide synthetisiert. Von jeder Adenovirus-Untergruppe
ist bisher erst die Pentonsequenz von nur einem Vertreter bekannt.
Daher wurden Oligonucleotide auf der Basis der bekannten Sequenzen
entworfen. Für
die Amplifikation von Pentonsequenzen der Untergruppe C wurden also die
Oligonucleotide P5-for (5'-gctcgatgtacaatgcggcgcgcggcgatgtat-3') und P5-rev (5'-gctcgacttaagtcaaaaagtgcggctcgatag-3') verwendet. Für die Amplifikation
von Pentonsequenzen der Untergruppe B wurden die Oligonucleotide
P3-for (5'gctcgatgtacaatgaggagacgagccgtgcta-3') und P3-rev (5'-gctcgacttaagttagaaagtgcggcttgaaag-3') verwendet. Für die Amplifikation
von Pentonsequenzen der Untergruppe D wurden die Oligonucleotide
P17-for (5'gctcgatgtacaatgaggcgtgcggtggtgtcttc-3') und P17-rev (5'-gctcgacttaagttagaaggtgcgactggaaagc-3') verwendet. Für die Amplifikation
von Pentonsequenzen der Untergruppe F wurden die Oligonucleotide
PF-for (5'-gctcgatgtacaatgagacgtgcggtgggagtg-3') und PF-rev (5'-gctcgacttaagttaaaacgtgcggctagacag-3') verwendet. Alle
oben beschriebenen Forward-Oligonucleotide enthalten eine BsrGI-Restriktionsstelle
an ihrem 5'-Ende,
und alle Reverse-Oligonucleotide
enthalten eine AflII-Restriktionsstelle am 5'-Ende.
-
Die
Amplifikationsreaktion (50 μl)
enthielt 2 mM dNTPs, 25 pmol jedes Oligonucleotids, Standard-1x-PCR-Puffer,
1,5 mM MgCl2 und 1 Einheit hitzestabile
Pwo-Polymerase (Boehringer)
pro Reaktion. Das Cycler-Programm enthielt 20 Zyklen, die jeweils
aus 30 s bei 94 °C,
60 s bei 60–64 °C und 120
s bei 72 °C bestanden.
Ein Zehntel des PCR-Produkts wurde auf einem Agarose-Gel laufen
gelassen, was bewies, dass ein DNA-Fragment amplifiziert wurde.
Von den verschiedenen Matrizen wurden jeweils zwei unabhängige PCR-Reaktionen
durchgeführt,
und danach wurden die erhaltenen unabhängigen PCR-Fragmente sequenziert,
um die Nucleotidsequenz zu bestimmen. Von 51 humanen Serotypen wurden
20 Pentonsequenzen amplifiziert.
-
Erzeugung von pentonchimärischen
adenoviralen DNA-Konstrukten
-
Alle
amplifizierten Penton-DNAs sowie der Vektor (pBr/Ad.Δpenton) wurden
mit BsrGI und AflII abgebaut. Die abgebauten DNAs wurden anschließend auf
einem Agarose-Gel laufen gelassen, und danach wurden die Fragmente
von dem Gel isoliert und unter Verwendung des Geneclean Kit (Bio101
Inc.) gereinigt. Dann wurden die PCR-Fragmente in die BsrGI- und
AflII-Stellen von pBr/Ad.Δpenton
kloniert, wodurch pBr/Ad.pentonXX entstand (wobei XX die Nummer
des Serotyps ist, von dem die Penton-DNA isoliert wurde). Bisher
wurde die Pentonsequenz der Serotypen 2, 3, 5, 6, 7, 11, 21, 26,
35, 39, 40, 41, 42, 47, 48, 49 und 51 in pBr/Ad.pentonXX kloniert.
Aus pBr/Ad.pentonXX wurde ein 5,1-kb- FseI-Fragment, das die Pentonsequenz umfasste,
durch Gel-Elektrophorese und Geneclean isoliert. Dieses FseI-Fragment
wurde anschließend
in das Cosmid pWE/Ad.AflII-rITR (siehe Beispiel 1) kloniert, das
mit FseI bis zu Ende verdaut und dephosphoryliert wurde, wie es
oben beschrieben ist. Diese Cosmidklonierung führte zur Bildung des Konstrukts
pWE/Ad.AflII-rITR/PentonXX (wobei XX die Nummer des Serotyps ist,
von dem die Penton-DNA isoliert wurde).
-
Erzeugung
von rekombinantem, in Bezug auf Pentonprotein chimärischem
Adenovirus
-
Zur
Erzeugung von rekombinantem Ad5-Virus, das das Penton von alternativen
Serotypen trägt,
wurden Adenovirus erzeugende Zellen mit zwei Konstrukten, pCLIP.Luc
und pWE/Ad.AflII-rITR/PenXX, transfiziert.
-
Für die Transfektion
wurden 4 μg
pCLIP.Luc und 4 μg
pWE/Ad.AflII-rITR/PentonXX
in serumfreiem DMEM auf 100 μl
Gesamtvolumen verdünnt.
Zu dieser DNA-Suspension wurden 100 μl 1× verdünntes Lipofectamin (Gibco)
gegeben. Nach 30 min bei Raumtemperatur wurde die DNA-Lipofectamin-Komplexlösung zu 2,5
ml serumfreiem DMEM gegeben, das anschließend zu einem T25-cm2-Gewebekulturkolben gegeben wurde. Dieser
Kolben enthielt 2 × 106 PER.C6-Zellen, die 24 Stunden vor der Transfektion
ausgesät
wurden. Zwei Stunden später
wurde das den DNA-Lipofectamin-Komplex enthaltende Medium einmal
durch Zugabe von 2,5 ml DMEM verdünnt, das mit 20% fetalem Kälberserum
ergänzt
war. Wieder 24 Stunden später
wurde das Medium durch frisches DMEM ersetzt, das mit 10% fetalem
Kälberserum
ergänzt
war. Die Zellen wurden 6–8
Tage lang kultiviert, anschließend
geerntet und dreimal einem Frier/Tau-Vorgang unterzogen. Zelltrümmer wurden durch
5 min Zentrifugation mit 3000 U/min bei Raumtemperatur entfernt.
Vom Überstand
(12,5 ml) wurden 3–5 ml
verwendet, um wiederum PER.C6-Zellen (T80-cm2-Gewebekulturkolben)
zu infizieren. Diese Neuinfektion führt nach 5–6 Tagen zu einer vollen cytopathogenen
Wirkung (CPE), und danach wird das Adenovirus so geerntet, wie es
oben beschrieben ist.
-
Die
oben beschriebenen Beispiele 1–9
umfassen die Konstruktion von rekombinanten adenoviralen Vektoren,
die chimärisch
in Bezug auf Faserprotein oder Hexonprotein sind, was zu einem veränderten
Infektionswirtsspektrum oder einer veränderten Immunantwort auf adenovirale
Vektoren führt.
Diese chimärischen adenoviralen
Vektoren werden zur Genübertragung
und für
rekombinante DNA-Impfstoffe erzeugt. Es muss hervorgehoben werden,
dass analog zur Beschreibung in Beispiel 1–9 chimärische adenovirale Vektoren
für Penton
konstruiert werden und für
alle anderen Adenovirus-Proteine konstruiert werden können, einschließlich unter
anderem DNA, die für
kleine Proteine codiert, die für
den Adenovirus-Zusammenbau erforderlich sind, und Sequenzen, die
für die
Adenovirus-Replikation erforderlich sind. Außerdem muss betont werden,
dass mit dieser Technik doppelte, dreifache, vierfache usw. chimärische adenovirale
Vektoren aufgebaut werden können,
mit dem Ziel, Teile von vorhandenen Adenovirus-Serotypen miteinander
zu kombinieren und dadurch Vektoren mit für jede gegebene Zielzelle oder
Zielkrankheit bevorzugten Merkmalen zu erzeugen.
-
Legenden zu Figuren und
Tabellen
-
- Tabelle 1: Zusammenfassung der Klassifizierung
von bekannten humanen Adenovirus-Serotypen nach dem Prinzip der
Hämagglutination.
- Tabelle 2: Assoziation von humanen Adenovirus-Serotypen mit
menschlichen Krankheiten.
- Tabelle 3: Oligonucleotide und degenerierte Oligonucleotid,
die für
die Amplifikation von DNA verwendet werden, die Faserprotein codiert,
das von alternativen humanen Adenovirus-Serotypen abgeleitet ist.
Halbfett gedruckte Buchstaben in den Oligonucleotiden A-E stellen
eine NdeI-Restriktionsstelle dar. Halbfett gedruckte Buchstaben
in den Oligonucleotiden 1-6 und 8 stellen eine NsiI-Restriktionsstelle
dar. Halbfett gedruckte Buchstaben im Oligonucleotid 7 stellen eine
PacI-Restriktionsstelle dar.
- Tabelle 4: Produktionsergebnisse von faserchimärischen
Adenoviren. Die Zahl der Viruspartikel pro ml wurde mit Hilfe von
HPLC bestimmt. Die Zahl der infektiösen Einheiten (IU) pro Milliliter
wurde durch Titration mit humanen 911-Zellen bestimmt. Für Infektionsexperimente wird
die Zahl der Viruspartikel pro Milliliter von allen chimärischen
Adenoviren genommen, da IE/ml einen rezeptorvermittelten Vorgang
widerspiegelt.
- Tabelle 5: Transduktionsergebnisse von humanen Zelllinien und
primären
Zellen. A549: humane Lungenkarzinom-Zelllinie (ATCC, CCL-1185).
K562: Humane erythroide Leukämie
(ATCC, CCL-243). SupT1: humane Lymphoblasten Hybrid B und T (ATCC,
CRL-1991). GM09503: Humane primäre
Fibroblasten. HEPG2: Humanes Leberkarzinom (ATCC, HB8065). CEM:
humane Lymphoblastenzellen (ATCC, CRL-1992). HeLa: Humanes Zervixkarzinom
(ATCC, CCL-2). Primäre
Amniocyten und Chorionzottenzellen wurden vom Department of Anthropogenetics,
Leiden, Niederlande, erhalten. Primäre Zellen der glatten Muskulatur
und Synoviocyten wurden von der TNO-PG, Leiden, Niederlande, erhalten.
Gezeigt ist die Luciferase-Aktivität (in relativen Lichteinheiten
(RLU) pro μg
Protein) bei Messungen an Zellen, die mit einer MOI von 5000 Viruspartikeln
pro Zelle infiziert wurden.
- Tabelle 6: Expression der Integrine αvβ3 und αvβ5, des Coxsackie-Adenovirus-Rezeptors (CAR) und
MHC Klasse I auf den Membranen von Zielzellen. Außer den
in Tabelle 5 beschriebenen Zellen: HUVEC: humane Nabelschnur-Endothelzellen
wurden von der TNO-PG, Leiden, Niederlande, erhalten. Gezeigt ist
der Prozentsatz an Zellen, die eines der Moleküle auf ihrer Membran exprimieren.
Der auf Ad5 beruhende Vektor, der eine Faser von einem Vertreter
jeder Untergruppe trägt,
und die Effizienz der Infektion sind auf der rechten Seite der Tabelle
gezeigt. ND: nicht bestimmt. 0% bedeutet nicht nachweisbare Expression
des Moleküls
auf der Membran der Zelle mit Hilfe von Durchflusscytometrie. 100%
bedeutet eine hohe Expression des Moleküls auf der Zellmembran.
-
1:
Schematische Darstellung des Adapterplasmids pMLPI.TK.
-
2:
Schematische Darstellung des Adapterplasmids pAd/L420-HSA.
-
3:
Schematische Darstellung des Adapterplasmids pAd5/CLIP.
-
4:
Schematische Darstellung eines Zwei-Plasmiden-Systems für die Erzeugung
von rekombinanten Adenoviren.
-
5:
Schematische Darstellung eines Drei-Plasmiden-Systems für die Erzeugung
von rekombinanten Adenoviren.
-
6:
Schematische Darstellung der Erzeugung des Plasmids pBr/AdBamR-DeltaFib, bei dem
ein Teil der Adenovirus-Typ-5-Faser-DNA durch ein kurzes DNA-Stück ersetzt
ist, das eine einzigartige NsiI-Stelle enthält.
-
7:
Faserproteinsequenzen der Adenovirus-Serotypen 8, 9, 13, 14,20,
23, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 42,
43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 und 51. Halbfett gedruckte Buchstaben
stellen einen Teil des Schwanzes von Adenovirus Serotyp 5 dar. Wenn
keine halbfett gedruckten Buchstaben vorhanden sind, bedeutet dies,
dass ein PCR-Fragment sequenziert wurde, das den Ad5-Schwanz nicht
enthielt. Ein X, das in der Sequenz vorhanden ist, bedeutet eine
unidentifizierte Aminosäure
aufgrund eines unidentifizierten Nucleotids. Am Ende der Sequenz
ist das Stopcodon der Faser durch einen Punkt dargestellt.
-
8:
Vergleich der in-vivo-Bioverteilung von 123I-markiertem
Adenovirus Serotyp 5 und eines in Bezug auf Faserprotein chimärischen
Adenovirus. Das radioaktiv markierte Adenovirus (1010 Viruspartikel,
0,1–2 MBq)
wurde intravenös
in die Schwanzvene verabreicht. Als Kontrolle wurde eine ähnliche
Menge freier Marker in das Kontrolltier injiziert. Die Ratten wurden
nach einer Stunde getötet,
und die Organe wurden geeicht. Die Radioaktivität der in der Figur angegebenen
Organe wurde mit einem Szintillationszähler gemessen und ist als Zählereignisse
pro Minute pro Gramm Gewebe ausgedrückt.
-
9:
Schematische Darstellung der Erzeugung des Plasmids pBr/Ad.Eco-PmeΔHexon. Ebenfalls gezeigt
ist die Sequenz der Oligonucleotide delta hex 1-4, die verwendet
wurden, um die DNA, die für
das Hexon des Adenovirus-Serotyp-5-Proteins
codiert, zu deletieren.
-
10: Hexonproteinsequenzen der Adenovirus-Serotypen
34, 35, 36 und 41. Ein in der Sequenz vorhandenes X bedeutet eine
unidentifizierte Aminosäure
aufgrund eines unidentifizierten Nucleotids. Am Ende der Sequenz
ist das Stopcodon des Hexons durch einen Punkt dargestellt.
-
Literatur
-
- Arnberg N., Mei Y. und Wadell G., 1997. Fiber genes of adenoviruses
with tropism for the eye and the genital tract. Virology 227: 239-244.
- Bout A., 1997. Gene therapy, S. 167-182. In: D.J.A. Crommelin
und R.D. Sindelar (Hrsg.), Pharmaceutical biotechnology, Harwood
Academic Publishers.
- Bout, A. 1996. Prospects for human hene therapy. Eur. J. Drug
Met. and Pharma. 2, 175-179.
- Blaese et al., Cancer Gene Ther., 2 (1995): 291-297.
- Brody und Crystal, Ann. N. Y. Acad. Sci. 716 (1994): 90-101.
- Chroboczek J., Ruigrok R.W.H. und Cusack S., 1995. Adenovirus
fiber, S. 163-200.
In: W. Doerfler und P. Bohm (Hrsg.), The molecular repertoire of
adenoviruses, I. Springer-Verlag, Berlin.
- Defer C., Belin M., Caillet-Boudin M. und Boulanger P., 1990.
Human adenovirus-host cell interactions; comparative study with
members of subgroup B and C. Journal of Virology 64 (8): 3661-3673.
- De Jong, J.C., Wermenbol, A.G., Verweij-Uijterwaal, M.W., Slaterus,
K.W., Wertheim-van Dillen, P., van Doornum, G.J.J., Khoo, S.H. und
Hierholzer, J.C. (1998) Adenoviruses from HIV-infected patients,
including two new candidate serotypes Ad50 and Ad51 of Subgenus
D and B1 respectively. In Vorbereitung.
- Eisenlohr, L.C., Gerard, W. und Hackett, C.J. (1987). Role of
receptor-binding activity of the viral hemagglutin molecule in the
presentation of influenza virus antigens to helper T-cells. J. Virol
61, 1375-1383.
- Eiz B und Pring-Åkerblom
P., 1997. Molecular characterization of the typespecific g-determinant
located on the adenovirus fiber. Journal of Virology 71: 6576-6581.
- Francki, R.I.B., Fauquet, C.M., Knudson, D.L. und Brown, F.
(1991) Classification and nomenclature of viruses. Fifth report
of the international Committee on taxonomy of viruses. Arch. Virol.
Suppl. 2, 140-144.
- Gahery-Segard H., Farace F., Godfrin D., Gaston J., Lengagne
R., Tursz T., Boulanger P. und Guillet J., 1998. Immune response
to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber
and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing
activity. Journal of Virology 72: 2388-2397.
- Gall J., Kass-Eisler A., Leinwand L. und Falck-Pedersen E.,
1996. Adenovirus type 5 and 7 capsid chimera: fiber replacement
alters receptor tropism without affecting primary immune neutralization
epitopes. Journal of Virology 70 (4): 2116-2123.
- Greber, U.F., Willets, M., Webster, P. und Helenius, A. (1993).
Stepwise dismanteling of adenovirus 2 during entry into cells. Cell
75, 477-486.
- Hynes, R.O. (1992) Integrins: versatility, modulation and signalling
in cell adhesion. Cell 69, 11-25.
- Herz und Gerard, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96 (1993): 2812-2816.
Hierholzer, J.C. (1992) Adenovirus in the immunocompromised host.
Clin.
- Microbial Rev. 5, 262-274.
- Hierholzer, J.C., Wigand, R., Anderson, L.J., Adrian, T. und
Gold, J.W.M. (1988) Adenoviruses from patients with AIDS: a plethora
of serotypes and a description of five new serotypes of subgenus
D (types 43-47). J. Infect. Dis. 158, 804-813.
- Ishibashi, M. und Yasue (1983) in Adenoviruses of Animals, Kapitel
12, 5. 497-561.
- Kay, R., Takei, F. und Humphries, R.K. (1990). Expression cloning
of a cDNA encoding M1/69-J11d heat-stable antigens. J. Immunol.
145 (6), 1952-1959. Khoo, S.H., Bailey, A.S., De Jong, J.C. und
Mandal, B.K. (1995). Adenovirus infections in human immunodeficiency
virus-positive patients: Clinical features and molecular epidemiology.
J. Infect. Dis 172, 629-637.
- Kidd, A.H., Chrboczek, J., Cusack, 5. und Ruigrok, R.W.H. (1993)
Adenovirus type 40 virions contain two distinct fibers. Virology
192, 73-84.
- Krasnykh V.N., Mikheeva G.V., Douglas J.T. und Curiel D.T.,
1996. Generation of recombinant adenovirus vectors with modified
fibers for altering viral tropism. Journal of Virology 70(10): 6839-6846.
- Krasnykh V., Dmitriev I., Mikheeva G., Miller C. R., Belousova
N. und Curiel D.T., 1998. Characterization of an adenovirus vector
containing a heterologous peptide epitope in the HI loop of the
fiber knob. Journal of Virology 72(3): 1844-1852.
- Leopold, P.L., Ferris, B., Grinberg, I., Worgall, S., Hackett,
N.R. und Crystal, R.G. (1998). Fluorescent virions: Dynamic tracking
of the pathway of adenoviral vectors in living cells. Hum. Gene
Ther. 9, 367-378.
- Levrero, M., Barban, V., Manteca, S., Ballay, A., Balsamo, C.,
Avantaggiata, M.L., Natoli, G., Skellekens, H., Tiollais, P. und
Perricaudet, M. (1991). Defective and non-defective adenovirus vectors
for expression foreign genes in vitro and in vivo. Gene 101, 195-202.
- Matlin, K.S., Reggio, H., Helenius, A. und Simons, K. (1981).
Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell
line. J. Cell Biol. 91, 601-613. Morgan, C., Rozenkrantz, H.S. und
Mednis, B. (1969) Structure and development of viruses as observed
in the electron microscope. X. Entry and uncoating of adenovirus. J.
Virol. 4, 777-796.
- Roest, P.A.M., Bout, M., van der Tuijn, A.C., Ginjaar, I.B.,
Bakker, E., Hogervorst, F.B.L., van Ommen, G-J.B., den Dunnen, J.T.
(1996). J. Med. Genet. 33, 935-939.
- Roest P.A.M., van der Tuijn, A.C., Ginjaar, I.B., Hoeben, R.C.,
Hogervorst, F.B.L., Bakker, E, den Dunnen, J.T., van Ommen, G-J.B.
(1996). Neuromusc. Disord. 6 (Nr. 3), 195-202.
- Roest P.A.M., van der Tuijn, A.C., Ginjaar, I.B., Hoeben, R.C.,
Hogervorst, F.B.L., Bakker, E., den Dunnen, J.T., van Ommen, G-J.B.
(1999). Lancet 353, 727-728.
- Richman, D.D., Hostetler, K.Y., Yazaki, P.J. und Clark, S. (1986).
Fate of influenza A virion proteins after entry into subcellular
fractions of LLC cells and the effect of amantadine. Virology 151,
200-210.
- Stevenson S.C., Rollence M., White B., Weaver L. und McClelland
A., 1995. Human adenovirus serotypes 3 and 5 bind to two different
cellular receptors via the fiber head domain. Journal of Virology
69(5): 2850-2857.
- Stevenson S.C., Rollence M., Marshall-Neff J. und McClelland
A., 1997. Selective targeting of human cells by a chimaeric adenovirus
vector containing a modified fiber protein. Journal of Virology
71(6): 4782-4790.
- Signas, G., Akusjarvi, G. und Petterson, U. (1985). Adenovirus
3 fiberpolypeptide gene: Complications for the structure of the
fiber protein. J. Virol. 53, 672-678.
- Stouten, P.W.F., Sander, C., Ruigrok, R.W.H. und Cusack, S.
(1992) New triple helical model for the shaft of the adenovirus
fiber. J. Mol. Biol. 226, 1073-1084.
- Schulick, A.H., Vassalli, G., Dunn, P.F., Dong, G., Rade, J.J.,
Zamarron, C. und Dichek, D.A. (1997). Established immunity precludes
adenovirus-mediated gene transfer inrat carotid arteries.
- Schnurr, D. und Dondero, M.E. (1993) Two new candidate adenovirus
serotypes Intervirol. 36, 79-83.
- Svensson, V. und Persson, R. (1984). Entry of adenovirus 2 into
Hela cells. J.
- Virol. 51, 687-694.
- Varga, M.J., Weibull, C. und Everitt, E. (1991). Infectious
entry pathway of adenovirus type 2. J. Virol 65, 6061-6070.
- Wickham T.J., Carrion M.E. und Kovesdi I., 1995. Targeting of
adenovirus penton base to new receptors through replacement of its
RGD motif with other receptor-specific peptide motifs. Gene Therapy
2: 750-756.
- Wickham T.J., Segal, D.M., Roelvink, P.W., Carrion M.E., Lizonova,
A., Lee, G-M. und Kovesdi, I. (1996). Targeted adenovirus gene transfer
to endothelial and smooth muscle cells by using bispecific antibodies.
J. Virol. 70 (10), 6831-6838. Wickham, T.J., Mathias, P., Cherish,
D.A. und Nemerow, G.R. (1993) Integrins avb3 and avb5 promote adenovirus
internalisation but not virus attachment. Cell 73, 309-319.
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
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