DE69931112T2

DE69931112T2 - Chimäre Adenoviren

Info

Publication number: DE69931112T2
Application number: DE69931112T
Authority: DE
Inventors: Jans Menzo HAVENGA; Ronald Vogels; Abraham Bout
Original assignee: Crucell Holand BV
Current assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Priority date: 1998-07-08
Filing date: 1999-07-08
Publication date: 2006-12-07
Anticipated expiration: 2019-07-09
Also published as: EP0978566B1; ATE325200T1; WO2000003029A2; CA2303477A1; US20060014276A1; US20030017138A1; EP0978566A3; AU765276B2; CA2303477C; US20030073072A1; ES2263250T3; WO2000003029A3; US7749493B2; AU4935699A; EP0978566A2; JP4472178B2; JP2002520026A; NZ503018A; DE69931112D1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Molekulargenetik und Medizin. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf das Gebiet der Gentherapie, insbesondere auf die Gentherapie unter Verwendung von Viren, insbesondere Adenoviren.
Bei der Gentherapie wird zur Zeit genetische Information an eine Wirtszelle geliefert, um entweder einen genetischen Mangel in der Zelle zu korrigieren (zu ergänzen) oder um eine unerwünschte Funktion in der Zelle zu hemmen oder um die Wirtszelle zu eliminieren. Natürlich kann die genetische Information auch dazu vorgesehen sein, die Wirtszelle mit einer gewünschten Funktion zu versorgen, z.B. ein sezerniertes Protein zuzuführen, um andere Zellen des Wirtes zu behandeln, usw.
Es gibt also im Grunde drei verschiedene Ansätze in der Gentherapie; davon ist einer auf die Kompensierung eines bei einem (Säuger-)Wirt vorhandenen Mangels gerichtet, der zweite ist auf die Entfernung oder Beseitigung von unerwünschten Substanzen (Organismen oder Zellen) gerichtet, und der dritte ist darauf gerichtet, eine Zelle mit einer gewünschten Funktion zu versehen.
Für Gentherapiezwecke wurden Adenoviren als geeignete Träger vorgeschlagen, um Gene an den Wirt abzugeben. Von Adenoviren abgeleitete Genübertragungsvektoren (sogenannte adenovirale Vektoren) haben mehrere Merkmale, aufgrund derer sie für die Genübertragung besonders gut geeignet sind. 1) Die Biologie der Adenoviren ist im Einzelnen charakterisiert worden; 2) das Adenovirus ist nicht mit schlimmen Krankheiten beim Menschen assoziiert; 3) das Virus ist äußerst effizient bei der Einführung seiner DNA in die Wirtszelle; 4) das Virus kann eine Vielzahl von Zellen infizieren und hat ein breites Wirtsspektrum; 5) das Virus kann in großen Mengen mit hohen Virustitern hergestellt werden; und 6) das Virus kann durch Deletion des Early-Bereichs 1 (E1) des viralen Genoms replikationsunfähig gemacht werden (Brody et al., 1994).
Mit der Verwendung von adenoviralen Vektoren sind jedoch immer noch Nachteile verbunden. Typischerweise rufen Adenoviren, insbesondere die gut untersuchten Serotypen, bei einem Wirt, in den sie eingeführt werden, eine Immunantwort hervor. Außerdem hat das Virus zwar allgemein ein breites Infektionsspektrum, doch gibt es ein Problem bei der Ansteuerung bestimmter Zellen und Gewebe. Außerdem sind die Replikation und andere Funktionen des Adenovirus nicht immer sehr gut für die Zellen geeignet, die mit dem zusätzlichen genetischen Material versehen werden sollen.
Das Adenovirusgenom ist ein lineares doppelsträngiges DNA-Molekül aus ungefähr 36 000 Basenpaaren. Die Adenovirus-DNA enthält identische invertierte terminale Wiederholungssequenzen (inverted terminal repeats; ITR) von ungefähr 90-140 Basenpaaren, wobei die genaue Länge vom Serotyp abhängt. Die viralen Replikationsstartpunkte liegen innerhalb der ITRs genau an den Enden des Genoms. Die meisten adenoviralen Vektoren, die zur Zeit in der Gentherapie verwendet werden, weisen eine Deletion im E1-Bereich auf, wo neue genetische Information eingeführt werden kann. Durch die E1-Deletion ist das rekombinante Virus replikationsunfähig (Levrero et al., 1991). Es wurde ausführlich nachgewiesen, dass rekombinantes Adenovirus, insbesondere Serotyp 5, für eine effiziente Übertragung von Genen in vivo an die Leber, das Atemwegsepithel und feste Tumoren in Tiermodellen und humanen Xenotransplantaten in immunschwachen Mäusen geeignet ist (Bout 1996; Blaese et al. 1995). Daher machen sich bevorzugte Verfahren zur in-vivo-Genübertragung in Zielzellen adenovirale Vektoren als Genabgabeträger zu Nutze.
Zur Zeit wurden sechs verschiedene Untergruppen von humanen Adenoviren vorgeschlagen, die insgesamt 51 verschiedene Adenovirus-Serotypen umfassen (siehe Tabelle 1). Neben diesen humanen Adenoviren wurde eine große Zahl von tierischen Adenoviren identifiziert (siehe Ishibashi et al., 1983).
Ein Serotyp wird auf der Basis seiner immunologischen Eigenart definiert, die durch quantitative Neutralisation mit tierischem Antiserum (Pferd, Kaninchen) bestimmt wird. Wenn die Neutralisation einen gewissen Grad der Kreuzreaktion zwischen zwei Viren zeigt, wird die Eigenart des Serotyps angenommen, wenn A) die Hämagglutinine nicht miteinander verwandt sind, was sich durch ein Fehlen einer Kreuzreaktion auf die Hämagglutinationshemmung zeigt, oder B) es erhebliche biophysikalische/biochemische Unterschiede in der DNA gibt (Francki et al., 1991). Die neun zuletzt identifizierten Serotypen (42-51) wurden zuerst aus HIV-infizierten Patienten isoliert (Hierholzer et al., 1988; Schnurr et al., 1993; De Jong et al., 1998). Aus nicht gut verstandenen Gründen verbreiten die meisten dieser immungeschwächten Patienten Adenoviren, die aus immunkompetenten Individuen selten oder nie isoliert wurden (Hierholzer et al., 1988, 1992; Khoo et al., 1995; De Jong et al., 1998).
Neben Unterschieden bezüglich der Empfindlichkeit verschiedener Adenovirus-Serotypen gegenüber neutralisierenden Antikörpern wurde auch gezeigt, dass Adenoviren der Untergruppe C, wie Ad2 und Ad5, an andere Rezeptoren binden als Adenoviren der Untergruppe B, wie Ad3 (Defer et al., 1990). Ähnlich wurde auch nachgewiesen, dass die Rezeptorspezifität geändert werden kann, indem man das Ad3- mit dem Ad5-Knob-Protein austauscht und umgekehrt (Krasnykh et al., 1996; Stevenson et al., 1995, 1997). Der Adenovirus-Serotyp 5 wird für Gentherapiezwecke am verbreitetsten verwendet. Ähnlich wie die Serotypen 2, 4 und 7 hat auch Serotyp 5 eine natürliche Affinität zu Lungenepithel und anderen Geweben der Atemwege. Dagegen ist zum Beispiel bekannt, dass die Serotypen 40 und 41 eine natürliche Affinität zum Magen-Darm-Trakt haben. Wegen eines detaillierten Überblicks der Krankheitsassoziation der verschiedenen Adenovirus-Serotypen siehe Tabelle 2. Die oben beschriebenen Serotypen unterscheiden sich wenigstens in Bezug auf die Capsidproteine (Pentonbase, Hexon), die Proteine, die für die Zellbindung verantwortlich sind (Faserprotein) und die Proteine, die an der Replikation des Adenovirus beteiligt sind.
Eines der Hauptprobleme der Adenovirus-Gentherapie besteht also darin, dass keiner der oben beschriebenen Serotypen ideal geeignet ist, um zusätzliches genetisches Material an Wirtszellen zu liefern. Einige haben ein etwas beschränktes Wirtsspektrum, haben aber den Vorteil, weniger immunogen zu sein, und bei einigen ist es umgekehrt. Einige haben das Problem, dass sie nur eine beschränkte Virulenz aufweisen, aber ein breites Wirtsspektrum und/oder eine reduzierte Immunogenität haben. Um die Dinge noch komplizierter zu machen, hängt diese Variation bei den Adenovirus-Serotypen auch stark von dem zu behandelnden Wirt ab. Einige Wirte sind bestimmten Serotypen vielleicht schon begegnet und produzieren daher eine starke Immunantwort gegen den Serotyp oder einen verwandten Serotyp. Der Fachmann weiß, dass es noch viele andere Variationen über dieses Thema gibt.
Die vorliegende Erfindung macht sich nun die Tatsache zu Nutze, dass einige Adenoviren eine geringere Immunogenität haben als andere, wobei diese anderen typischerweise hervorragend in einer der anderen Anforderungen für eine effiziente Gentherapie sind, wie einer hohen Spezifität für eine bestimmte Gruppe von Wirtszellen, einer guten Replikationsmaschinerie in solchen Wirtszellen, einer hohen Infektionsrate bei bestimmten Wirtszellen usw. Die Erfindung stellt also chimärische Adenoviren bereit, die die nützlichen Eigenschaften von wenigstens zwei Adenoviren unterschiedlicher Serotypen aufweisen. Typischerweise sind mehr als zwei Anforderungen aus der obigen nicht umfassenden Liste erforderlich, um ein Adenovirus zu erhalten, das effizient zusätzliches Material auf eine Wirtszelle übertragen kann, und daher stellt die Erfindung von Adenoviren abgeleitete Vektoren bereit, die als Cassetten verwendet werden können, um verschiedene adenovirale Gene aus unterschiedlichen adenoviralen Serotypen an den erforderlichen Stellen einzusetzen, um einen Vektor zu erhalten, der ein chimärisches Adenovirus exprimieren kann, wodurch selbstverständlich auch ein interessierendes Gen zum Beispiel an der Stelle von E1 des ursprünglichen Adenovirus, von dem der Vektor abgeleitet ist, eingesetzt werden kann. Auf diese Weise kann das zu produzierende chimärische Adenovirus an die Anforderungen und Bedürfnisse bestimmter Wirte, die eine Gentherapie bestimmter Störungen benötigen, angepasst werden. Um diese Produktion zu ermöglichen, wird selbstverständlich im Allgemeinen eine Verpackungszelle notwendig sein, um eine ausreichende Menge unbedenklicher chimärischer Adenoviren zu produzieren.
Chimärische adenovirale Vektoren sind in der Technik bekannt. WO 98/22609 offenbart chimärische adenovirale Vektoren, bei denen wenigstens ein Gen (das Faser, Hexon oder Penton codiert) oder ein Teil davon durch das entsprechende Gen oder ein Teil davon aus einem zweiten Adenovirus, das zu einem anderen Serotyp gehört, ersetzt ist. WO 96/26281 offenbart ein rekombinantes Adenovirus, das ein Faserprotein eines anderen Serotyps umfasst. In keinem dieser Dokumente wird offenbart oder nahegelegt, chimärische Adenoviren mit einem geänderten Infektionswirtsspektrum herzustellen, bei denen das Faserprotein eine Knob-Domäne eines Adenovirus Serotyp 12, 16, 32, 40-S, 40-L, 49 oder 51 umfasst. Die Dokumente offenbaren auch keine rekombinanten adenoviralen Vektoren für die Produktion solcher Viren.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung also ein chimärisches Adenovirus bereit, das wenigstens einen Teil eines Faserproteins und/oder ein Protein, das an der Replikation eines Adenovirus-Serotyps beteiligt ist, umfasst, wodurch das chimärische Virus mit einem gewünschten Wirtsspektrum und/oder verbesserten Replikationseigenschaften und wenigstens einem Teil eines Penton- oder Hexonproteins aus einem anderen, weniger antigenen Adenovirus-Serotyp versehen wird, was zu einem weniger antigenen chimärischen Adenovirus führt. Typischerweise wird ein solches Virus mit Hilfe eines Vektors (typischerweise ein Plasmid, ein Cosmid oder Baculovirussystem) produziert, wobei der Vektor selbstverständlich ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist. Ein bevorzugter Vektor ist ein Vektor, der verwendet werden kann, um ein chimärisches rekombinantes Virus herzustellen, das speziell an den zu behandelnden Wirt und die zu behandelnde Störung angepasst ist. Ein solcher Vektor stellt eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar. Die Erfindung stellt also einen rekombinanten Vektor bereit, der von einem Adenovirus abgeleitet ist, das wenigstens ein ITR und ein Verpackungssignal umfasst, eine Insertionsstelle für eine interessierende Nucleinsäuresequenz aufweist und weiterhin eine Insertionsstelle aufweist, um ein Gen funktionell einzusetzen, das ein Penton- und/oder ein Hexonprotein eines ersten Adenovirus-Serotyps codiert, und eine Insertionsstelle für ein Gen aufweist, das ein Faserprotein eines zweiten Adenovirus eines anderen Serotyps codiert, und/oder eine Insertionsstelle für ein Gen aufweist, das von einem Serotyp abgeleitet ist, der verbesserte Merkmale in der Funktion aufweist, die von diesem Gen oder seinem Produkt ausgeübt wird. Typischerweise stellt die Erfindung Cassetten bereit, die die Produktion jedes gewünschten chimärischen Adenovirus ermöglichen, wenn es nur von zwei Serotypen abgeleitet ist, oder von so vielen, wie benötigt werden, um die gewünschten Merkmale zu erhalten, wobei es nicht immer notwendig ist, dass alle Merkmale die besten sind, wenn man sie als einzelne Eigenschaften betrachtet. Es ist zum Beispiel vielleicht nicht einmal notwendig, stets das Penton und/oder Hexon zusammen mit einem anderen Teil der Adenovirus-Gene zu verändern. Zuweilen braucht die Immunogenität nicht zusammen mit anderen Eigenschaften verändert zu werden. Es wird jedoch bevorzugt, Penton- und/oder Hexon-Gene von weniger immunogenen Adenovirus-Serotypen zu verwenden. Ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung das Mittel zur Produktion des chimärischen Virus. Typischerweise möchte man keine Adenoviruscharge an die Wirtszelle verabreichen, die replikationskompetentes Adenovirus enthält, obwohl dies nicht immer gilt. Im Allgemeinen möchte man daher mehrere Gene (aber wenigstens eines) aus dem adenoviralen Genom auf dem Vektor, der das chimärische Virus codiert, weglassen und diese Gene in das Genom der Zelle einfügen, in die der Vektor eingebracht wird, wobei ein chimärisches Adenovirus entsteht. Eine solche Zelle wird gewöhnlich eine "Verpackungszelle" genannt. Die Erfindung stellt also auch eine Verpackungszelle zur Herstellung eines chimärischen Adenovirus gemäß der Erfindung bereit, die in trans alle Elemente, die für die Adenoviruserzeugung notwendig sind, aber auf dem adenoviralen Vektor gemäß der Erfindung nicht vorhanden sind, umfasst. Typischerweise müssen der Vektor und die Verpackungszelle aneinander angepasst werden, so dass sie alle notwendigen Elemente aufweisen, aber keine überlappenden Elemente aufweisen, die durch Rekombination zu einem replikationskompetenten Virus führen.
Die Erfindung stellt also einen Kit bereit, der eine Verpackungszelle gemäß der Erfindung und einen rekombinanten Vektor gemäß der Erfindung umfasst, wobei es im Wesentlichen keine Sequenzüberlappung, die zu einer Rekombination führt, welche zur Produktion von replikationskompetentem Adenovirus führen würde, zwischen der Zelle und dem Vektor gibt.
Um den viralen Vektor nach Belieben genau anpassen und das chimärische Virus mit den gewünschten Eigenschaften versehen zu können, wird vorzugsweise eine Bibliothek von adenoviralen Genen bereitgestellt, wobei sich die Gene zwischen Restriktionsstellen befinden. Typischerweise ist es bevorzugt, dieselben Arten von Genen von verschiedenen Serotypen zwischen denselben Restriktionsstellen zu haben und dieselbe Restriktionsstelle auch in dem adenoviralen Vektor zu haben, der zur Herstellung des chimärischen Virus verwendet wird. Wenn alle Stellen für unterschiedliche Gene einzigartig sind, hat man ein System, aus dem man gezielt auswählen kann. Man kann ein Penton-Gen aus dem gewünschten Serotyp aus der Bibliothek ausschneiden und es an derselben Stelle im Vektor einsetzen. Dann kann man ein anderes Restriktionsenzym verwenden, um ein Replikations-Gen mit Hilfe eines anderen Restriktionsenzyms aus der Bank eines anderen Serotyps auszuschneiden und dieses Gen an der entsprechenden Restriktionsstelle in den chimärischen Vektor einzusetzen. Es ist also zu bevorzugen, einen Vektor gemäß der Erfindung zu haben, bei dem die Insertionsstellen verschiedene und vorzugsweise einzigartige Restriktionsstellen sind. Vorzugsweise wird dieser Vektor mit einer Bibliothek kombiniert, die die entsprechenden Gene innerhalb derselben Restriktionsstellen aufweist. Verfahren zur Verwendung dieser Bibliothek und des Vektors unterliegen dem fachmännischen Können und sind Bestandteil der vorliegenden Erfindung. Typischerweise umfasst ein solches Verfahren mehrere Restriktions- und Ligierungsschritte und die Expression des Ergebnisses in einer Verpackungszelle. Außerdem kann man auch eine Bibliothek verwenden, aus der die verschiedenen gewünschten adenoviralen Gene durch homologe Rekombination oder eine Kombination von Restriktion und Rekombination erhalten werden. Die Erfindung stellt also ein Verfahren zur Herstellung eines chimärischen Adenovirus bereit, das ein gewünschtes Wirtsspektrum und eine reduzierte Antigenität aufweist, wobei das Verfahren das Bereitstellen eines Vektors gemäß der Erfindung, der die gewünschten Insertionsstellen aufweist, das Einsetzen wenigstens eines funktionellen Teils eines Penton- oder Hexonproteins, das von einem Adenovirus-Serotyp mit relativ geringer Antigenität abgeleitet ist, in den Vektor, das Einsetzen wenigstens eines funktionellen Teils eines Faserproteins, das von einem Adenovirus-Serotyp mit dem gewünschten Wirtsspektrum abgeleitet ist, und das Transfizieren einer Verpackungszelle gemäß der Erfindung mit dem Vektor und Ermöglichen der Produktion von chimärischen Viruspartikeln. Selbstverständlich können auch andere Kombinationen von anderen viralen Genen, die aus verschiedenen Serotypen stammen, eingesetzt werden, wie es oben offenbart ist. Eine immunogene Antwort auf Adenovirus, die typischerweise auftritt, ist die Produktion von neutralisierenden Antikörpern durch den Wirt. Dies ist typischerweise ein Grund dafür, dass man ein Penton-, Hexon und/oder eine Faser eines weniger immunogenen Serotyps auswählt. Selbstverständlich ist es vielleicht nicht notwendig, chimärische Adenoviren herzustellen, die vollständige Proteine von verschiedenen Serotypen aufweisen. Es liegt wohl im Bereich des fachmännischen Könnens, chimärische Proteine herzustellen; zum Beispiel ist es im Falle von Faserproteinen sehr wohl möglich, die Basis von einem Serotyp und den Schaft und den Knob von einem anderen Serotyp zu verwenden. Auf diese Weise wird es möglich, dass die Teile des Proteins, die für den Zusammenbau von Viruspartikeln verantwortlich sind, von demselben Serotyp stammen, wodurch die Produktion von intakten Viruspartikeln verstärkt wird. Die Erfindung stellt also auch ein chimärisches Adenovirus gemäß der Erfindung bereit, bei dem die Hexon-, Penton- und/oder Faserproteine chimärische Proteine sind, die von verschiedenen Adenovirus-Serotypen stammen. Neben der Erzeugung von chimärischen Adenoviren durch Austauschen von ganzen Wildtyp-Hexon-, -Penton-, -Faser(protein)-Genen usw. oder Teilen davon liegt es auch innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, Hexon-, Penton-, Faser(protein)-Gene usw. einzusetzen, die Mutationen, wie Punktmutationen, Deletionen, Insertionen usw., tragen und die leicht in Bezug auf bevorzugte Merkmale, wie Temperaturstabilität, Zusammenbau, Verankerung, umgeleitete Infektion, veränderte Immunantwort usw., durchmustert werden können. Wiederum können auch andere chimärische Kombinationen erzeugt werden und liegen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
Die Verfügbarkeit einer Bibliothek von Nucleinsäuren, die von verschiedenen Serotypen abgeleitet sind, ermöglicht unter anderem die Erzeugung einer Bibliothek von chimärischen Adenoviren. Die Erfindung stellt daher weiterhin eine Bibliothek von chimärischen Adenoviren bereit. In einer Ausführungsform stellt die Erfindung eine Bibliothek von chimärischen Adenoviren bereit, wobei die Adenoviren chimärische Kapside umfassen, d.h. Kapsidproteine umfassen, die wenigstens zum Teil von wenigstens zwei verschiedenen Adenovirus-Serotypen abgeleitet sind. Vorzugsweise sind in der (chimärischen) Adenovirus-Bibliothek Nucleinsäuren und/oder Proteine oder Teile davon von wenigstens einem repräsentativen Adenovirus von jeder Adenovirus-Untergruppe repräsentiert. Vorzugsweise sind die Nucleinsäuren und/oder Proteine oder Teile davon von mehr als einem Vertreter jeder Adenovirus-Untergruppe abgeleitet. Am meisten bevorzugt umfasst die Bibliothek Nucleinsäuren und/oder Proteine oder Teile davon von im Wesentlichen jedem bekannten Vertreter jeder Adenovirus-Untergruppe. Nucleinsäuren und/oder Proteine oder Teile davon, die von mehr als einem repräsentativen Adenovirus von jeder Adenovirus-Untergruppe in der (chimärischen) Bibliothek abgeleitet sind, sind erwünscht, da eine wünschenswerte Eigenschaft möglicherweise keine allgemeine Eigenschaft einer Untergruppe ist. Außerdem kann eine wünschenswerte Eigenschaft einer Adenovirus-Untergruppe bei den verschiedenen Vertretern der Untergruppe auch in verschiedenen Mengen exprimiert werden. Zu gewährleisten, dass mehr als ein Vertreter einer Untergruppe in der Bibliothek repräsentiert ist, garantiert also die Auswahl desjenigen Vertreters, der die gewünschte Eigenschaft am besten exprimiert.
Typischerweise wird eine Bibliothek von chimärischen Adenoviren oder ein Teil davon in Screening-Assays verwendet, um Eigenschaften der chimärischen Adenoviren zu bestimmen. Dadurch kann jedes besondere chimärische Adenovirus, das besonders wünschenswerte Eigenschaften umfasst, identifiziert und anschließend zum Beispiel bei der Entwicklung eines verbesserten Nucleinsäure-Abgabeträgers verwendet werden. Wünschenswerte Eigenschaften, nach denen die chimärische Adenovirus-Bibliothek durchmustert werden kann, sind unter anderem Zielzellspezifität, reduzierte Immunogenität, erhöhte Immunogenität, umgeleitete Neutralisation, umgeleitete Hämagglutination, verbesserte Infektionseffizienz, reduzierte Toxizität, verbesserte Replikation und/oder verbesserte Pharmakokinetik, wie veränderte Gewebeverteilung nach in-vivo-Verabreichung. Ein Vergleich von Eigenschaften von verschiedenen chimärischen Adenoviren kann zur Beschreibung von Adenovirus-Elementen führen, die daran beteiligt sind, ein Adenovirus mit dieser Eigenschaft zu versehen. Dieses Wissen kann dann verwendet werden, um Nucleinsäure-Abgabeträger weiter zu optimieren. In einem Aspekt stellt die Erfindung eine Auswahl von (chimärischen) Adenoviren mit einer im Vergleich zu Adenovirus 5 verbesserten Fähigkeit bereit, makrophagen- oder fibroblastenartige Zellen zu transduzieren, und vorzugsweise umfassen diese (chimärischen) Adenoviren wenigstens einen Teil eines Gewebetropismus-bestimmenden Teils eines Faserproteins eines Adenovirus der Untergruppe B oder eines Derivats und/oder Analogons des Faserproteins. Die Erfindung stellt weiterhin eine Auswahl von (chimärischen) Adenoviren mit einer im Vergleich zu Adenovirus 5 verbesserten Fähigkeit bereit, Zellen der glatten Muskulatur zu transduzieren, und vorzugsweise umfassen diese (chimärischen) Adenoviren wenigstens einen Teil eines Gewebetropismus-bestimmenden Teils eines Faserproteins eines Adenovirus der Untergruppe B oder eines Derivats und/oder Analogons des Faserproteins. Eine chimärische Adenovirus-Bibliothek der Erfindung kann weiterhin verwendet werden, um Adenovirus-Biologie zu untersuchen. Eine solche Bibliothek ist zum Beispiel sehr gut geeignet, um Unterschiede in der Biologie der verschiedenen Adenovirus-Serotypen zu untersuchen. In einem Aspekt stellt die Erfindung eine Auswahl von (chimärischen) Adenoviren bereit, die eine CAR-negative Zelle transduzieren können. Vorzugs weise ist die CAR-negative Zelle eine Zelle der Amnionflüssigkeit oder ein Abkömmling davon. Vorzugsweise ist die Zelle der Amnionflüssigkeit eine Chorionzottenzelle oder ein Abkömmling davon. Vorzugsweise handelt es sich bei der CAR-negativen Zelle um eine CAR-negative blutbildende Zelle, wie zum Beispiel eine Erythroid-Vorläuferzelle und/oder eine Monocyten-Vorläuferzelle und/oder Abkömmlinge davon. Vorzugsweise umfassen die (chimärischen) Adenoviren, die eine CAR-negative Zelle transduzieren können, wenigstens einen Adenovirus-Rezeptor-bindenden Teil eines Faserproteins von einem Adenovirus der Untergruppe D oder F.
In einem Aspekt stellt die Erfindung ein chimärisches Adenovirus bereit, das ein im Vergleich zu Adenovirus 5 umgeleitetes Neutralisationsmuster umfasst. Umgeleitete Neutralisation ist in mehreren Fällen nützlich, unter anderem zum Beispiel zur Umgehung von bereits vorhandenen neutralisierenden Antikörpern bei einem Patienten, dem das chimärische Adenovirus verabreicht wird. Bereits vorhandene neutralisierende Antikörper würden das Adenovirus neutralisieren und dadurch die effektive Menge des verabreichten Virus senken. Dieser Effekt ist gewöhnlich zum Beispiel bei Gentherapieansätzen, bei denen eine Nucleinsäure an Zielzellen abgegeben werden soll, unerwünscht. Bereits vorhandene neutralisierende Antikörper können jedoch zum Beispiel bei anderen Gentherapieanwendungen von Vorteil sein, wenn die durch das chimärische Adenovirus abgegebene interessierende Nucleinsäure nicht an Zellen im gesamten Körper abgegeben werden soll. Eine lokale Abgabe, zum Beispiel durch Verwendung einer Nadel in ein festes Gewebe, kombiniert mit der Anwesenheit von neutralisierenden Antikörpern im Blut, die austretendes chimärisches Adenovirus neutralisieren können, kann in diesem Fall dabei helfen, die Transduktion auf einen bestimmten Bereich zu beschränken.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein chimärisches Adenovirus bereit, das ein im Vergleich zu Adenovirus 5 umgeleitetes Hämagglutinationsmuster umfasst. Umgeleitete Hämagglutination ist in mehreren Fällen nützlich. Hämagglutiniertes Material wird präferentiell von Makrophagen und deren Ab kömmlingen und/oder Vorläufern aufgenommen. Eine solcherart verstärkte Hämagglutination eines chimärischen Adenovirus ist in dem Fall bevorzugt, dass eine verstärkte Abgabe von Nucleinsäure an die Makrophagen gewünscht wird. Im Allgemeinen jedoch wird es sich bei den Zielzellen nicht um die Makrophagen handeln, so dass in diesen Fällen eine reduzierte Hämagglutination erwünscht ist. Ein chimärisches Adenovirus mit umgeleiteter Hämagglutination ist erwünscht. Ein chimärisches Adenovirus mit umgeleiteter Hämagglutination ist für viele Anwendungen geeignet, die dem Fachmann jetzt einfallen, und somit bilden sie einen integralen Bestandteil der vorliegenden Erfindung.
Ausführliche Beschreibung
Bei Mäusen wurde nachgewiesen, dass nach systemischer in-vivo-Abgabe von rekombinantem Adenovirus Serotyp 5 für Gentherapiezwecke ungefähr 99% des Virus in der Leber abgefangen werden (Herz et al., 1993). Daher ist die Änderung des Adenovirus-Serotyp-5-Wirtszellenspektrums, so dass es in vivo andere Organe ansteuern kann, ein Hauptanliegen der Erfindung, insbesondere in Kombination mit anderen Veränderungen, insbesondere der Immunogenität.
Der einleitende Schritt für eine erfolgreiche Infektion ist die Bindung des Adenovirus an seine Zielzelle, ein Vorgang, der über das Faserprotein vermittelt wird. Das Faserprotein hat eine trimere Struktur (Stouten et al. 1992) mit unterschiedlicher Länge, die vom Serotyp des Virus abhängt (Signas et al. 1985; Kidd et al. 1993). Verschiedene Serotypen weisen Polypeptide mit strukturell ähnlichen N- und C-Termini, aber unterschiedlichen Mittelstammbereichen auf. Die ersten 30 Aminosäuren am N-Terminus sind an der Verankerung der Faser an der Pentonbasis beteiligt (Chroboczek et al. 1995), insbesondere der konservierte FNPVYP-Bereich im Schwanz (Arnberg et al. 1997). Der C-Terminus oder Knob ist für die einleitende Wechselwirkung mit dem zellulären Adenovirusrezeptor verantwortlich. Es wird vorgeschlagen, dass nach dieser einleitenden Bindung eine sekundäre Bindung zwischen der Pentonbasis des Kapsids und Integrinen der Zelloberfläche zu einer Internalisierung von viralen Partikeln in Stachelsaumgrübchen (coated pits) und zur Endocytose (Morgan et al., 1969; Svensson et al., 1984; Varga et al., 1992; Greber et al., 1993; Wickham et al., 1994) führt. Integrine sind αβ-Heterodimere, von denen wenigstens 14 α-Untereinheiten und 8 β-Untereinheiten identifiziert wurden (Hynes et al., 1992). Die Anordnung von Integrinen, die in Zellen exprimiert werden, ist komplex und variiert zwischen den Zelltypen und je nach der zellulären Umgebung. Obwohl der Knob einige konservierte Bereiche enthält, zeigen die Knob-Proteine zwischen den Serotypen einen hohen Grad der Variabilität, was darauf hinweist, dass es unterschiedliche Adenovirusrezeptoren gibt. Zum Beispiel wurde nachgewiesen, dass Adenoviren der Untergruppe C (Ad2, Ad5) und Adenoviren der Untergruppe B (Ad3) an verschiedene Rezeptoren binden (Defner et al., 1990). Das Faserprotein enthält auch das typspezifische γ-Antigen, das zusammen mit dem ε-Antigen des Hexons die Serotyp-Spezifität bestimmt. Das γ-Antigen befindet sich auf der Faser, und es ist bekannt, dass es aus 17 Aminosäuren besteht (Eiz et al., 1997). Die Anti-Faser-Antikörper des Wirts sind daher gegen die trimere Struktur des Knob gerichtet. Die Anti-Faser-Antikörper zusammen mit Antikörpern, die gegen die Pentonbase und Hexonproteine gerichtet sind, sind für die Neutralisation von Adenoviruspartikeln verantwortlich. Zuerst enthüllen die Anti-Faser-Antikörper die Adenoviruspartikel, und danach ist die Pentonbase für die Anti-Pentonbase-Antikörper zugänglich (Gahery-Segard et al., 1998). Obwohl dies ein sehr effektiver Weg zu sein scheint, um Adenoviruspartikel zu neutralisieren, haben andere beschrieben, dass die Anti-Hexon-Antikörper bezüglich der Neutralisation der Partikel am effektivsten sind (Gall et al., 1996.
Um eine umgeleitete Infektion von rekombinantem Adenovirus Serotyp 5 zu erhalten, sind mehrere Ansätze untersucht worden oder werden immer noch untersucht. Wickham et al. hat das RGD-Motiv (Arg, Gly, Asp) in der Pentonbase geändert, die vermutlich für die Bindung des α_vβ₃- und α_vβ₅-Integrins an die Pentonbase verantwortlich ist. Sie haben dieses RGD-Motiv durch ein anderes Peptidmotiv ersetzt, das spezifisch für den α₄β₁-Rezeptor ist. Auf diese Weise konnte eine Zielsteuerung des Adenovirus zu einer spezifischen Zielzelle erreicht werden (Wickham et al., 1995, 1996). Krasnykh et al. haben sich die im Knob verfügbare HI-Schleife zu Nutze gemacht. Diese Schleife befindet sich auf der Grundlage von Röntgenkristallographie auf der Außenseite der trimeren Knob-Struktur und trägt daher vermutlich nicht zu den intramolekularen Wechselwirkungen im Knob bei (Krasnykh et al., 1998). Es wurde jedoch keine vollständige CAR-unabhängige Infektion beobachtet.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und ein Mittel anzugeben, mit dem Adenoviren mit einer veränderten Immunantwort oder mit fehlender oder reduzierter Infektion in antigenpräsentierenden Zellen, wie dendritischen Zellen oder Makrophagen, gebaut werden können. Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Erzeugung von chimärischen Adenoviren, wie sie oben beschrieben sind und die in vitro zu spezifischen Zelltypen zielgesteuert werden können sowie in vivo einen veränderten Tropismus zu bestimmten Zelltypen aufweisen, anzugeben. Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und Mittel anzugeben, mit dem ein solches Adenovirus als Protein- oder Nucleinsäureabgabeträger zu einem spezifischen Zelltyp oder Gewebe verwendet werden kann.
Die Erzeugung von chimärischen Adenoviren auf der Basis von Adenovirus Serotyp 5 mit modifizierten späten Genen wird beschrieben. Zu diesem Zweck wurden drei Plasmide aufgebaut, die zusammen das vollständige Adenovirus-Serotyp-5-Genom enthalten. Aus diesen Plasmiden wurde die DNA, die das Pentonbase-Protein, Hexonprotein und Faserprotein des Adenovirus Serotyp 5 codiert, entfernt und durch Linker-DNA-Sequenzen ersetzt, die die Klonierung erleichtern. Diese Plasmide dienten anschließend als Matrize für die Insertion von DNA, die das Pentonbase-Protein, Hexonprotein und Faserprotein codiert, die von verschiedenen Adenovirus-Serotypen (human oder tierisch) stammen. Die von den verschiedenen Serotypen abgeleiteten DNAs wurden mit Hilfe der Technik der Polymerase-Kettenreaktion in Kombination mit (degenerierten) Oligonucleotiden erhalten. An der früheren E1-Stelle im Genom von Adenovirus Serotyp 5 kann jedes interessierende Gen kloniert werden. Ein einziger Transfektionsvorgang mit den drei Plasmiden zusammen führte zur Bildung eines rekombinanten chimärischen Adenovirus. Diese neue Technik für Bibliotheken, die aus chimärischen Adenoviren besteht, ermöglicht also eine schnelle Durchmusterung nach verbesserten rekombinanten adenoviralen Vektoren für in-vitro- und in-vivo-Gentherapiezwecke.
Zwar wurde die erfolgreiche Einführung von Änderungen in die Faser und Pentonbasis von Adenovirus Serotyp 5 bereits beschrieben, doch sind solche Zielsteuerungsansätze aufgrund der komplexen Struktur des Knob und der begrenzten Kenntnisse über die genauen Aminosäuren, die mit CAR wechselwirken, mühsam und schwierig. Um die oben beschriebenen Beschränkungen zu überwinden, verwendeten wir bereits vorhandene Adenovirusfasern, Pentonbaseproteine und Hexonproteine, die von anderen Adenovirus-Serotypen abgeleitet sind. Indem wir Bibliotheken von chimärischem Adenovirus Serotyp 5 erzeugten, die Strukturproteine von alternativen Adenovirus-Serotypen enthielten, haben wir eine Technik entwickelt, die eine schnelle Suche nach einem rekombinanten adenoviralen Vektor mit bevorzugten Merkmalen ermöglicht.
In einem Aspekt beschreibt diese Erfindung die Verwendung von chimärischen Adenoviren, um eine natürlich vorkommende oder induzierte neutralisierende Aktivität des Wirts gegen rekombinante Adenoviren, die in vivo für therapeutische Anwendungen verabreicht werden, zu überwinden. Die Wirtsimmunantwort ist vorwiegend gegen Pentonbase- und Hexonproteine gerichtet, die im adenoviralen Kapsid vorhanden sind, und ist in geringerem Grad gegen die Faser gerichtet. Die Adenovirus-Serotypen sind durch die Unfähigkeit definiert, eine Kreuzreaktion mit neutralisierenden Antikörpern in Tierseren einzugehen. Daher rufen chimärische Viren, die zum Beispiel auf Adenovirus Serotyp 5 beruhen, aber chimärisch in Bezug auf Pentonbase-Protein und/oder Hexonprotein sind, eine veränderte, weniger heftige Immunantwort hervor. Die Notwendigkeit solcher chimärischer Adenoviren wird durch die Beobachtungen betont, dass 1) eine wiederholte systemische Abgabe von rekombinantem Adenovirus Serotyp 5 aufgrund von hohen Titern von neutralisierenden Antikörpern gegen das rekom binante Adenovirus Serotyp 5 (Schulick et al., 1997) erfolglos ist, und 2) bereits vorhandene natürliche Immunität.
Dieser Aspekt der Erfindung umgeht daher die Unfähigkeit, die Verabreichung eines Adenovirus für Gentherapiezwecke zu wiederholen. Vorzugsweise sind die Pentonbase-, Hexon- und Faserproteine von Adenoviren in der Untergruppe B und D abgeleitet und gehören insbesondere zum Adenovirus-Serotyp 16, 24, 33, 36, 38, 39, 42 und 50. Der Grund dafür ist, dass diese Serotypen selten aus Menschen isoliert werden, was darauf hinweist, dass niedrige Titer von zirkulierenden neutralisierenden Antikörpern gegen diese Serotypen vorhanden sind.
In einem anderen Aspekt beschreibt diese Erfindung chimärische Adenoviren und Verfahren zur Erzeugung dieser Viren, die einen veränderten Tropismus aufweisen, der von demjenigen von Adenovirus Serotyp 5 verschieden ist, zum Beispiel Viren auf der Basis von Adenovirus Serotyp 5, die jedoch irgendeine in der Natur vorkommende Adenovirusfaser aufweisen. Dieses chimärische Adenovirus Serotyp 5 kann bestimmte Zelltypen in vitro und in vivo effizienter oder weniger effizient infizieren als das Adenovirus Serotyp 5. Zu diesen Zellen gehören unter anderem Endothelzellen, Zellen der glatten Muskulatur, dendritische Zellen, neuronale Zellen, Gliazellen, Synovialzellen, Lungenepithelzellen, hämatopoetische Stammzellen, Monocyten/Makrophagen usw.
In einem anderen Aspekt beschreibt diese Erfindung Verfahren, die chimärische Adenoviren identifizieren, die eine verbesserte in-vitro-Amplifikation in statischen oder Suspensionszellkulturen aufweisen. Aus verschiedenen Untergruppen abgeleitete Adenoviren, aber auch Adenoviren innerhalb einer Untergruppe, weisen eine hohe Variabilität bei der produktiven Infektion von Zelltypen auf, die für die Produktion von rekombinantem Adenovirus verwendet werden. Tabelle 2 gibt einen Überblick über verschiedene Adenovirus-Serotypen und ihre Verbindung mit menschlichen Krankheiten, was beweist, dass die Replikation eines gegebenen Adenovirus-Serotyps in bestimmten Zelltypen verstärkt ist. Für die Produktion von rekombinanten Adenoviren für Gentherapiezwecke stehen mehrere Zelllinien zur Verfügung. Dazu gehören unter anderem PER.C6, 911, 293 und E1 A549. Diese Adenoviren erzeugenden Zellen sind vielleicht nicht die am besten geeigneten Zelltypen, um Viren auf der Basis von Adenovirus Serotyp 5 zu amplifizieren. Daher suchen wir in diesem Aspekt der Erfindung Adenoviren von verschiedenen Serotypen auf der Basis ihrer Fähigkeit aus, sich zum Beispiel auf PER.C6 zu vermehren, und verwenden ihre frühen Gene (ohne E1) und ITRs, um chimärische Viren aufzubauen, die in Bezug auf die Vermehrung überlegen sind und somit höhere Titer ergeben als das gemeinhin verwendete Adenovirus Serotyp 2 oder 5.
In einem anderen Aspekt beschreibt die Erfindung den Aufbau und die Verwendung von Bibliotheken, die aus unterschiedlichen Teilen von Adenovirus Serotyp 5 bestehen, bei denen ein oder mehrere Gene oder Sequenzen durch DNA ersetzt ist, die von alternativen humanen oder tierischen Serotypen abgeleitet ist. Diese Menge von Konstrukten, die insgesamt das vollständige Adenovirusgenom umfassen, ermöglicht die Konstruktion von einzigartigen chimärischen Adenoviren, die für eine bestimmte Gruppe von Patienten oder sogar ein einzelnes Individuum maßgeschneidert sind.
In allen Aspekten der Erfindung können die chimärischen Adenoviren Deletionen im E1-Bereich und Insertionen von heterologen Genen, die entweder mit einem Promotor verknüpft sind oder auch nicht, enthalten oder auch nicht. Weiterhin können chimärische Adenoviren Deletionen im E3-Bereich und Insertionen von heterologen Genen, die mit einem Promotor verknüpft sind, enthalten oder auch nicht. Weiterhin können chimärische Adenoviren Deletionen im E2- und/oder E4-Bereich und Insertionen von heterologen Genen, die mit einem Promotor verknüpft sind, enthalten oder auch nicht. Im letzteren Fall sind E2- und/oder E4-komplementierende Zelllinien erforderlich, um rekombinante Adenoviren zu erzeugen.
Beispiel 1. Erzeugung von Klonen genomischer Plasmide von Adenovirus Serotyp 5.
Das vollständige Genom von Adenovirus Serotyp 5 wurden in verschiedene Plasmide oder Cosmide einkloniert, was eine leichte Modifikation von Teilen des Adenovirus-Serotyp-5-Genoms ermöglicht, wobei die Fähigkeit zur Erzeugung von rekombinantem Virus erhalten bleibt. Zu diesem Zweck wurden die folgenden Plasmide erzeugt:
1. pBr/Ad.Bam-rITR (ECACC-Hinterlegung P97082122)
Um die Klonierung der ITR-Sequenzen mit glatten Enden zu erleichtern wurde Wildtyp-Human-Adenovirus-Typ-5-(Ad5)-DNA in Gegenwart von überschüssigem dNTP mit Klenow-Enzym behandelt. Nach der Inaktivierung des Klenow-Enzyms und der Reinigung durch Phenol/Chloroform-Extraktion mit anschließender Ethanolfällung wurde die DNA mit BamHI abgebaut. Dieses DNA-Präparat wurde ohne weitere Reinigung in einer Ligierungsreaktion mit von pBr322 abgeleiteter Vektor-DNA, die wie folgt hergestellt wurde, verwendet: pBr322-DNA wurde mit EcoRV und BamHI abgebaut, durch Behandlung mit TSAP-Enzym (Life Technologies) dephosphoryliert und auf LMP-Agarose-Gel (SeaPlaque GTG) gereinigt. Nach der Transformation in kompetentes E. coli DH5α (Life Techn.) und Analyse der Ampicillin-resistenten Kolonien wurde ein Klon ausgewählt, der ein Abbaumuster zeigte, wie es für einen Insert, der sich von der BamHI-Stelle in Ad5 bis zum rechten ITR erstreckt, erwartet wurde. Eine Sequenzanalyse der Klonierungsgrenze am rechten ITR zeigte, dass der am weitesten 3' liegende G-Rest des ITR fehlte, und der Rest des ITR erwies sich als korrekt. Dieser fehlende G-Rest wird während der Replikation durch den anderen ITR ergänzt.
2. pBr/Ad.Sal-rITR (ECACC-Hinterlegung P97082119)
pBr/Ad.Bam-rITR wurde mit BamHI und SalI abgebaut. Das Vektorfragment einschließlich des Adenovirus-Inserts wurde in LMP-Agarose (SeaPlaque GTG) isoliert und mit einem 4,8 kb großen SalI-BamHI-Fragment ligiert, was von Wildtyp-Ad5-DNA erhalten und mit dem Geneclean-II-Kit (Bio 101, Inc.) gereinigt wurde. Ein Klon wurde ausgewählt, und die Integrität der Ad5-Sequenzen wurde durch Restriktionsenzym-Analyse bestimmt. Der Klon pBr/Ad.Sal-rITR enthält Adeno-Typ-5-Sequenzen von der SalI-Stelle bei bp 16746 bis zu einschließlich dem rechten ITR (wobei der am weitesten 3' liegende G-Rest fehlt).
3. pBr/Ad.Cla-Bam (ECACC-Hinterlegung P97082117)
Wildtyp-Adenovirus-Typ-5-DNA wurde mit ClaI und BamHI abgebaut, und das 20,6-kb-Fragment wurde durch Elektroelution aus dem Gel isoliert. pBr322 wurde mit denselben Enzymen abgebaut und mit Geneclean aus dem Agarose-Gel gereinigt. Beide Fragmente wurden ligiert und in kompetente DH5α transformiert. Der resultierende Klon pBr/Ad.Cla-Bam wurde durch Abbau mit Restriktionsenzym analysiert, und es zeigte sich, dass er ein Insert mit Adenovirussequenzen von bp 919 bis 21566 enthielt.
4. pBr/Ad.AflII-Bam (ECACC-Hinterlegung P97082114)
Der Klon pBr/Ad.Cla-Bam wurde mit EcoRI (in pBr322) linearisiert und mit AflII partiell abgebaut. Nach 20 Minuten Hitzeinaktivierung von AflII bei 65 °C wurden die Fragmentenden mit Klenow-Enzym aufgefüllt. Dann wurde die DNA mit einem glatten doppelsträngigen Oligolinker ligiert, der eine PacI-Stelle enthielt (5'-AATTGTCTTAATTAACCGCTTAA-3'). Dieser Linker wurde hergestellt durch Assoziieren der folgenden beiden Oligonucleotide: 5'-AATTGTCTTAATTAACCGC-3' und 5'-AATTGCGGTTAATTAAGAC-3', gefolgt von der Glättung der Enden mit Klenow-Enzym. Nach der Fällung der ligierten DNA unter Wechsel des Puffers wurden die Ligierungen mit überschüssigem PacI-Enzym abgebaut, um Concatamere des Oligonucleotids zu entfernen. Das 22016 bp große partielle Fragment, das Ad5-Sequenzen von bp 3534 bis zu 21566 und die Vektorsequenzen enthielt, wurde in LMP-Agarose (SeaPlaque GTG) isoliert, religiert und in kompetente DH5α transformiert. Ein Klon, von dem sich zeigte, dass er die PacI-Stelle enthielt und der das große Adeno-Fragment beibehalten hatte, wurde ausgewählt und am 5'-Ende sequenziert, um die korrekte Einfügung des PacI-Linkers in die (verlorene) AflII-Stelle zu überprüfen.
5. pBr/Ad.Bam-rITRpac#2 (ECACC-Hinterlegung P97082120) und pBr/Ad.Bam-rITRpac#8 (ECACC-Hinterlegung P97082121)
Um die Einfügung einer PacI-Stelle in der Nähe des ITR von Ad5 im Klon pBr/Ad.Bam-rITR zu ermöglichen, wurden etwa 190 Nucleotide zwischen der ClaI-Stelle im pBr322-Gerüst und dem Beginn der ITR-Sequenzen entfernt. Dies geschah wie folgt: pBr/Ad.Bam-rITR wurde mit ClaI abgebaut und unterschiedlich lange (2 min, 5 min, 10 min und 15 min) mit der Nuclease Bal31 behandelt. Das Ausmaß der Nucleotidentfernung wurde durch getrennte Reaktionen auf pBr322-DNA (die ebenfalls an der ClaI-Stelle abgebaut war) unter Verwendung von identischen Puffern und Bedingungen verfolgt. Das Bal31-Enzym wurde durch 10 min Inkubation bei 75 °C inaktiviert, die DNA wurde gefällt und in einem kleineren Volumen TE-Puffer resuspendiert. Um glatte Enden zu gewährleisten, wurden die DNAs weiter mit T4-DNA-Polymerase in Gegenwart von überschüssigen dNTPs behandelt. Nach dem Abbau der (Kontroll-)pBr322-DNA mit SalI wurde bei den Proben, die 10 min oder 15 min lang behandelt wurden, ein befriedigender Abbau (ca. 150 bp) beobachtet. Dann wurden die 10 min oder 15 min lang behandelten pBr/Ad.Bam-rITR-Proben mit den oben beschriebenen PacI-Linkern mit den glatten Enden (siehe pBr/Ad.AflII-Bam) ligiert. Die Ligierungsprodukte wurden durch Fällung gereinigt, mit überschüssigem PacI abgebaut und auf einem LMP-Agarose-Gel von den Linkern abgetrennt. Nach der Religierung wurden die DNAs in kompetente DH5α transformiert, und die Kolonien wurden analysiert. Zehn Klone, die eine Deletion von ungefähr der gewünschten Länge zeigten, wurden ausgewählt und durch T-Track-Sequenzierung (T7 Sequencing Kit, Pharmacia Biotech) weiter analysiert. Zwei Klone wurden gefunden, bei denen der PacI-Linker unmittelbar stromabwärts des rITR eingefügt war. Nach dem Abbau mit PacI wiesen Klon Nr. 2 28 bp und Klon Nr. 8 27 bp auf, die an den ITR gebunden waren.
pWE/Ad.AflII-rITR (ECACC-Hinterlegung P97082116)
Der Cosmidvektor pWE15 (Clontech) wurde verwendet, um größere Ad5-Inserts zu klonieren. Zuerst wurde ein Linker, der eine einzigartige PacI-Stelle enthielt, in die EcoRI-Stellen von pWE15 eingefügt, wobei pWE.pac entstand. Zu diesem Zweck wurde das doppelsträngige PacI-Oligomer, wie es für pBr/Ad.AflII-BamHI beschrieben wurde, verwendet, jetzt aber mit seinen überstehenden EcoRI-Enden. Dann wurden die folgenden Fragmente durch Elektroelution von Agarose-Gel isoliert: mit PacI abgebautes pWE.pac, mit PacI und BamHI abgebautes pBr/AflII-Bam und mit BamHI und PacI abgebautes pBr/Ad.Bam-rITR#2. Diese Fragmente wurden miteinander ligiert und unter Verwendung von λ-Phage-Verpackungsextrakten (Stratagene) gemäß den Anweisungen des Herstellers verpackt. Nach der Infektion von Wirtsbakterien wurden Kolonien auf Platten gezüchtet und auf die Gegenwart des vollständigen Inserts hin analysiert. pWE/Ad.AflII-rITR enthält alle Adenovirus-Typ-5-Sequenzen von bp 3534 (AflII-Stelle) bis einschließlich zum rechten ITR (wobei der am weitesten 3' liegende G-Rest fehlt).
pBr/Ad.lITR-Sal(9.4) (ECACC-Hinterlegung P97082115)
Adenovirus-5-Wildtyp-DNA wurde in Anwesenheit von überschüssigen dNTPs mit Klenow-Enzym behandelt und anschließend mit SalI abgebaut. Zwei der resultierenden Fragmente, die als LinksITR-Sal(9.4) bzw. Sal(16.7)-RechtsITR bezeichnet werden, wurden in LMP-Agarose (Seaplaque GTG) isoliert. pBr322-DNA wurde mit EcoRV und SalI abgebaut und mit Phosphatase (Life Technologies) behandelt. Das Vektorfragment wurde mit Hilfe des Geneclean-Verfahrens (BIO 101, Inc.) isoliert und mit den Ad5-SalI-Fragmenten ligiert. Nur die Ligierung mit dem 9,4-kb-Fragment ergab Kolonien mit einem Insert. Nach der Analyse und Sequenzierung der Klonierungsgrenze wurde ein Klon, der die volle ITR-Sequenz enthielt, gewählt und bis zur SalI-Stelle bei bp 9462 verlängert.
pBr/Ad.lITR-Sal(16.7) (ECACC-Hinterlegung P97082118)
pBr/Ad.lITR-Sal(9.4) wird mit SalI abgebaut und dephosphoryliert (TSAP, Life Technologies). Um diesen Klon bis zur dritten SalI-Stelle in Ad5 zu verlängern, wurde pBr/Ad.Cla-Bam mit BamHI linearisiert und mit SalI partiell abgebaut. Ein 7,3-kb-SalI-Fragment, das Adenovirussequenzen von 9462-16746 enthält, wurde in LMP-Agarose-Gel isoliert und mit dem SalI-abgebauten pBr/Ad.lITR-Sal(9.4)-Vektorfragment ligiert.
pWE/Ad.AflII-EcoRI
pWE.pac wurde mit ClaI abgebaut, und die überstehenden 5'-Enden wurden mit Hilfe von Klenow-Enzym aufgefüllt. Dann wurde die DNA mit PacI abgebaut und aus Agarose-Gel isoliert. pWE/AflII-rITR wurde mit EcoRI abgebaut und nach der Behandlung mit Klenow-Enzym mit PacI abgebaut. Das große 24-kb-Fragment, das die adenoviralen Sequenzen enthielt, wurde von Agarose-Gel isoliert und mit dem ClaI-abgebauten und mit glatten Enden versehenen pWE.pac-Vektor ligiert, wobei man den Ligation Express^TM Kit von Clontech verwendete. Nach der Transformation von ultrakompetenten XL10-Gold-Zellen von Stratagene wurden Klone identifiziert, die das erwartete Insert enthielten. pWE/AflII-EcoRI enthält Ad5-Sequenzen von bp 3534 bis 27336.
Konstruktion von neuen Adapterplasmiden
Das Fehlen einer Sequenzüberlappung zwischen dem rekombinanten Adenovirus und den E1-Sequenzen in der Verpackungszelllinie ist für eine sichere, RCA-freie Erzeugung und Vermehrung von neuen rekombinanten Viren essentiell. Das Adapterplasmid pMLPI.TK (1) ist ein Beispiel für ein Adapterplasmid, das für die Verwendung gemäß der Erfindung in Kombination mit den verbesserten Verpackungszelllinien der Erfindung bestimmt ist. Dieses Plasmid wurde als Ausgangsmaterial verwendet, um einen neuen Vektor herzustellen, bei dem Nucleinsäuremoleküle, die spezifische Promotor- und Gensequenzen umfassen, leicht ausgetauscht werden können.
Zuerst wurde ein PCR-Fragment aus pZipΔMo+PyF101(N^–)-Matrizen-DNA (beschrieben in PCT/NL 96/00195) mit den folgenden Primern erzeugt: LTR-1: 5'-CTG TAG GTA CCA GTG CAC TGG CCT AGG CAT GGA AAA ATA CAT AAC TG-3' und LTR-2: 5'-GCG GAT CCT TCG AAC CAT GGT AAG CTT GGT ACC GCT AGC GTT AAC CGG GCG ACT CAG TCA ATC G-3'. Pwo-DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim) wurde nach den Anweisungen des Herstellers mit den folgenden Temperaturzyklen verwendet: einmal 5 min bei 95 °C, 3 min bei 55 °C und 1 min bei 72 °C und 30 Zyklen von 1 min bei 95 °C, 1 min bei 60 °C, 1 min bei 72 °C, dann einmal 10 min bei 72 °C. Dann wurde das PCR-Produkt mit BamHI abgebaut und in pMLP10-Vektor (Levrero et al. 1991), der mit PvuII und BamHI abgebaut worden war, ligiert, wodurch der Vektor pLTR10 entstand. Dieser Vektor enthält adenovirale Sequenzen von bp 1 bis zu bp 454, gefolgt von einem Promotor, der aus einem Teil des Mo-MuLV-LTR bestand, dessen Wildtyp-Enhancer-Sequenzen durch den Enhancer aus einem mutanten Polyomvirus (PyF101) ersetzt sind. Das Promotorfragment wurde als L420 bezeichnet. Dann wurde der codierende Bereich des murinen HSA-Gens eingefügt. pLTR10 wurde mit BstBI abgebaut, und dann erfolgte Klenow-Behandlung und Abbau mit NcoI. Das HSA-Gen wurde durch PCR-Amplifikation an pUC18-HSA (Kay et al. 1990) erhalten, wobei die folgenden Primer verwendet wurden: HSA1, 5'-GCG CCA CCA TGG GCA GAG CGA TGG TGG C-3' und HSA2, 5'-GTT AGA TCT AAG CTT GTC GAG ATC GAT CTA CTA ACA GTA GAG ATG TAG AA-3'. Das 269 bp große amplifizierte Fragment wurde unter Verwendung der NcoI- und der BglII-Stelle in einen Shuttle-Vektor subkloniert. Durch Sequenzieren wurde der Einbau der korrekten Codierungssequenz des HSA-Gens bestätigt, aber mit einer zusätzlichen TAG-Einfügung direkt nach dem TAG-Stopcodon. Dann wurde der codierende Bereich des HSA-Gens einschließlich der TAG-Duplikation als NcoI(klebrig)-SalI(glatt)-Fragment herausgeschnitten und in das 3,5 kb große NcoI(klebrig)/BstBI(glatt)-Fragment aus pLTR10 kloniert, was zu pLTR-HSA10 führte.
Schließlich wurde pLTR-HSA10 mit EcoRI und BamHI abgebaut, und danach wurde das Fragment, das den linken ITR, das Verpackungssignal, den L420-Promotor und das HSA-Gen enthielt, in den Vektor pMLPI.TK, der mit denselben Enzymen abgebaut worden war, eingefügt, wodurch die Promotor- und die Gensequenz ersetzt wurden. Dies führte zu dem neuen Adapterplasmid pAd/L420-HSA (2), das zweckmäßige Erkennungsstellen für verschiedene Restriktionsenzyme um die Promotor- und die Gensequenz herum enthält. SnaBI und AvrII können mit HpaI, NheI, KpnI, HindIII kombiniert werden, um Promotorsequenzen auszutauschen, während die letzteren Stellen mit den ClaI- oder BamHI-Stellen 3' von dem HSA-codierenden Bereich kombiniert werden können, um Gene in diesem Konstrukt zu ersetzen.
Ein weiteres Adapterplasmid, das so entworfen wurde, dass ein leichter Austausch von Nucleinsäuremolekülen ermöglicht wird, wurde hergestellt, indem man die Promotor-, Gen- und Poly-A-Sequenz in pAd/L420-HSA durch den CMV-Promotor, eine multiple Klonierungsstelle, ein Intron und ein Poly-A-Signal ersetzte. Zu diesem Zweck wurde pAd/L420-HSA mit AvrII und BglII abgebaut, und danach erfolgte eine Behandlung mit Klenow-Enzym; so dass man glatte Enden erhielt. Das 5,1-kb-Fragment mit dem pBr322-Vektor und den adenoviralen Sequenzen wurde isoliert und mit einem glatten 1570 bp großen Fragment von pcDNA1/amp (Invitrogen) ligiert, das durch Abbau mit HhaI und AvrII und anschließende Behandlung mit T4-DNA-Polymerase erhalten wurde. Dieses Adapterplasmid wurde pCLIP.LUC genannt (3).
Erzeugung von rekombinanten Adenoviren
Um E1-deletierte rekombinante Adenoviren mit dem neuen System auf Plasmidbasis zu erzeugen, werden die folgenden Konstrukte hergestellt: a) ein Adapterkonstrukt, das die Expressionscassette mit dem interessierenden Gen enthält, die mit einem Restriktionsenzym, das an der 3'-Stelle des überlappenden adenoviralen Genomfragments schneidet, linearisiert ist und vorzugsweise keinerlei pBr322-Vektorsequenzen enthält; und b) ein ergänzendes adenovirales Genomkonstrukt pWE/Ad.AflII-rITR, das mit PacI abgebaut ist. Diese beiden DNA-Moleküle werden durch Phenol/(Chloroform-Extraktion und EtOH-Fällung weiter gereinigt. Durch Cotransfektion dieser Plasmide in eine Adenovirus-Verpackungszelllinie, vorzugsweise eine Zelllinie gemäß der Erfindung, entstehen rekombinante, replikationsunfähige Adenoviren durch eine einstufige homologe Rekombination zwischen dem Adapter und dem ergänzenden Konstrukt (4).
Alternativ dazu können anstelle von pWE/Ad.AflII-rITR auch andere Fragmente verwendet werden, z.B. mit EcoRI und BamHI abgebautes pBr/Ad.Cla-Bam oder mit PacI und BamHI abgebautes pBr/Ad.AflII-BamHI kann mit pBr/Ad.Sal-rITR, das mit SalI abgebaut wurde, kombiniert werden. In diesem Fall werden drei Plasmide miteinander kombiniert, und zwei homologe Rekombinationen werden benötigt, um ein rekombinantes Adenovirus zu erhalten (5). Man sollte sich darüber im Klaren sein, dass der Fachmann auch andere Kombinationen von Adapter- und ergänzenden Plasmiden verwenden kann, ohne von der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Eine allgemeine Anweisung, wie sie im Folgenden skizziert und als nichteinschränkendes Beispiel für die vorliegende Erfindung gemeint ist; wurde durchgeführt, wobei unter Verwendung verschiedener Adapterplasmide und des Ad.AflII-rITR-Fragments mehrere rekombinante Adenoviren entstehen. Adenovirus-Verpackungszellen (PER.C6) wurden in Kolben von ca. 25 cm² ausgesät, und am nächsten Tag, als sie eine Konfluenz von etwa 80% erreichten, wurden sie mit einem Gemisch von DNA und Lipofectamin-Reagens (Life Techn.) transfiziert, wie es vom Hersteller beschrieben wurde. Routinemäßig werden 40 μl Lipofectamin, 4 μg Adapterplasmid und 4 μg des ergänzenden Adenovirusgenomfragments AflII-rITR (oder 2 μg aller drei Plasmide für die doppelte homologe Rekombination) verwendet. Unter diesen Bedingungen werden Effizienzen der transienten Transfektion von ca. 50% (48 h nach der Transfektion) erhalten, die mit Kontrolltransfektionen unter Verwendung eines pAd/CMV-LacZ-Adapters bestimmt wurden. Zwei Tage später werden Zellen in Kolben von ca. 80 cm² übergeführt und weiterkultiviert. Ungefähr fünf (für die einzelne homologe Rekombination) bis elf Tage (für die doppelte homologe Rekombination) später beobachtet man eine cytopathogene Wirkung (CPE), was darauf hinweist, dass ein funktionelles Adenovirus entstanden ist. Bei voller CPE werden Zellen und Medium geerntet, und rekombinantes Virus wird durch Frieren-Tauen freigesetzt. Ein zusätzlicher Amplifikationsschritt in einem Kolben von 80 cm² wird routinemäßig durchgeführt, um die Ausbeute zu erhöhen, da sich zeigt, dass die Titer im Anfangsstadium trotz des Auftretens der vollen CPE variabel sind. Nach der Amplifikation werden Viren geerntet und an PER.C6-Zellen Plaque-gereinigt. Einzelne Plaques werden auf Viren mit aktiven Transgenen getestet.
Neben einem Ersatz im E1-Bereich ist es auch möglich, den E3-Bereich (oder einen Teil davon) in dem Adenovirus zu deletieren oder zu ersetzen, da E3-Funktionen für die Replikation, Verpackung und Infektion des (rekombinanten) Virus nicht notwendig sind. Dadurch wird die Möglichkeit geschaffen, einen größeren Insert zu verwenden oder mehr als ein Gen einzufügen, ohne die maximale Verpackungsgröße (ungefähr 105% der Wildtyp-Genomlänge) zu überschreiten. Dies kann zum Beispiel dadurch erfolgen, dass man einen Teil des E3-Bereichs im pBr/Ad.Bam-rITR-Klon durch Abbau mit XbaI und Religierung deletiert. Dadurch werden die Ad5-Wildtyp-Sequenzen 28592-30470 einschließlich aller bekannten E3-codierenden Bereiche entfernt. Ein weiteres Beispiel ist der genaue Ersatz des codierenden Bereichs von gp19K im E3-Bereich durch einen Polylinker, was die Insertion von neuen Sequenzen erlaubt. Dadurch 1) bleiben alle anderen codierenden Bereiche intakt und 2) wird die Notwendigkeit eines heterologen Promotors vermieden, da das Transgen durch die E3-Promotor- und pA-Sequenzen getrieben wird, was mehr Raum für codierende Sequenzen lässt.
Zu diesem Zweck wurde das 2,7 kb große EcoRI-Fragment aus Wildtyp-Ad5, das den 5'-Teil des E3-Bereichs enthält, in die EcoRI-Stelle von pBluescript (KS^–) (Stratagene) kloniert. Dann wurde die HindIII-Stelle in dem Polylinker durch Abbau mit EcoRV und HincII und anschließende Religierung entfernt. Der resultierende Klon pBS.Eco-Eco/ad5DHIII wurde verwendet, um den gp19K-codierenden Bereich zu deletieren. Die Primer 1 (5'-GGG TAT TAG GCC AA AGG CGC A-3') und 2 (5'-GAT CCC ATG GAA GCT TGG GTG GCG ACC CCA GCG-3') wurden verwendet, um eine Sequenz aus pBS.Eco-Eco/Ad5DHIII, die den Sequenzen 28511 bis 28734 in Wildtyp-Ad5-DNA entsprach, zu amplifizieren. Die Primer 3 (5'-GAT CCC ATG GGG ATC CTT TAC TAA GTT ACA AAG CTA-3') und 4 (5'-GTC GCT GTA GTT GGA CTG G-3') wurden an derselben DNA verwendet, um Ad5-Sequenzen von 29217 bis 29476 zu amplifizieren. Die beiden resultierenden PCR-Fragmente wurden anhand der neu eingeführten NcoI-Stelle miteinander ligiert und anschließend mit XbaI und MunI abgebaut. Dann wurde dieses Fragment in den pBS.Eco-Eco/ad5ΔHIII-Vektor ligiert, der mit XbaI (partiell) und MunI abgebaut wurde, wobei pBS.Eco-Eco/ad5ΔHIII.Δgp19K entstand. Um die Insertion von Fremd-Genen in die HindIII- und BamHI-Stelle zu ermöglichen, wurde in pBS.Eco-Eco/ad5ΔHIII.Δgp19K eine XbaI-Deletion vorgenommen, um die BamHI-Stelle im Bluescript-Polylinker zu entfernen. Das resultierende Plasmid pB5.Eco-Eco/ad5ΔHIII.Δgp19KΔXbaI enthält einzigartige HindIII- und BamHI-Stellen, die den Sequenzen 28733 (HindIII) und 29218 (BamHI) in Ad5 entsprechen. Nach der Einführung eines Fremd-Gens in diese Stellen wird entweder das deletierte XbaI-Fragment wieder eingeführt, oder das Insert wird erneut in pBS.Eco-Eco/ad5ΔHIII.Δgp19K kloniert, wobei man HindIII und zum Beispiel MunI verwendet. Mit Hilfe dieses Verfahrens haben wir Plasmide erzeugt, die HSV-TK, hIL-1a, Ratten-IL-3, Luciferase oder LacZ exprimieren. Die einzigartigen SrfI- und NotI-Stellen im Plasmid pBS.Eco-Eco/ad5ΔHIII.Δgp19K (mit oder ohne eingesetztes interessierendes Gen) werden verwendet, um den bereich, der das interessierende Gen umfasst, in den entsprechenden Bereich von pBr/Ad.Bam-rITR zu übertragen, was das Konstrukt pBr/Ad.Bam-rITRΔgp19K (mit oder ohne eingesetztes interessierendes Gen) ergab. Dieses Konstrukt wird gemäß der obigen Beschreibung verwendet, um rekombinante Adenoviren zu erzeugen. Im viralen Kontext wird die Expression von eingefügten Genen durch den Adenovirus-E3-Promotor getrieben.
Rekombinante Viren, die sowohl E1- als auch E3-deletiert sind, werden durch ein doppeltes homologes Rekombinationsverfahren; wie es oben für E1-Ersatz-Vektoren beschrieben wurde, erzeugt, wobei man ein System auf Plasmidbasis verwendet, das aus Folgendem besteht:

a) einem Adapterplasmid für E1-Ersatz gemäß der Erfindung mit oder ohne Insertion eines ersten interessierenden Gens;
b) dem pWE/Ad.AflII-EcoRI-Fragment; und
c) dem pBr/Ad.Bam-rITRΔgp19K-Plasmid mit oder ohne Insertion eines zweiten interessierenden Gens.

Neben Manipulationen im E3-Bereich können in pBr/Ad.Bam-rITR auch leicht Veränderungen des E4-Bereichs (oder Teilen davon) bewerkstelligt werden. Die Erzeugung und Vermehrung eines solchen Virus erfordert aber in einigen Fällen eine in-trans-Komplementierung.
Beispiel 2. Erzeugung von Viren auf der Basis von Adenovirus Serotyp 5 mit chimärischen Faserproteinen.
Das im Folgenden beschriebene Verfahren zur Erzeugung rekombinanter Adenoviren erfolgt durch Cotransfektion von zwei oder mehr getrennten klonierten Adenovirus-Sequenzen. Diese klonierten Adenovirus-Sequenzen wurden anschließend verwendet, um spezifische Adenovirus-Serotyp-5-Sequenzen zu entfernen, um "Matrizenklone" zu erzeugen, die die leichte Einführung von DNA-Sequenzen ermöglichen, die von anderen Adenovirus-Serotypen abgeleitet sind. Als Beispiel für diese Matrizenklone ist im Folgenden der Aufbau von Plasmiden angegeben, die einen Austausch von DNA, die für Faserprotein codiert, ermöglichen.
Erzeugung von Adenovirus-Matrizenklonen, denen für Faser codierende DNA fehlt
Die fasercodierende Sequenz von Adenovirus Serotyp 5 befindet sich zwischen den Nucleotiden 31042 und 32787. Um die fasercodierende Adenovirus-Serotyp-5-DNA zu entfernen, begannen wir mit dem Konstrukt pBr/Ad.Bam-rITR. Zuerst wurde eine NdeI-Stelle aus diesem Konstrukt entfernt. Zu diesem Zweck wurde pBr322-Plasmid-DNA mit NdeI abgebaut, und danach wurden vorstehende Enden unter Verwendung von Klenow-Enzym aufgefüllt. Dieses pBr322-Plasmid wurde dann religiert, mit NdeI abgebaut und in E. coli DH5α transformiert. Das erhaltene pBr/ΔNdeI-Plasmid wurde mit ScaI und SalI abgebaut, und das resultierende, 3198 bp große Vektorfragment wurde mit dem von pBr/Ad.BamrITR abgeleiteten, 15349 großen ScaI-SalI-Fragment ligiert, was zum Plasmid pBr/Ad.Bam-rITRΔNdeI führte, das somit eine einzigartige NdeI-Stelle enthielt. Dann wurde eine PCR durchgeführt mit den Oligonucleotiden NY-up: 5'-CGA CAT ATG TAG ATG CAT TAG TTT GTG TTA TGT TTC AAC GTG-3' und NY-down: 5'-GGA GAG CAC TGC CAT GTT-3' (6). Während der Amplifikation wurden sowohl eine NdeI- (halbfett) als auch eine NsiI-Restriktionsstelle (unterstrichen) eingeführt, um die Klonierung der amplifizierten Faser-DNAs zu erleichtern. Die Amplifikation bestand aus 25 Zyklen von jeweils 45 s bei 94 °C, 1 min bei 60 °C und 45 s bei 72 °C. Die PCR-Reaktion enthielt 25 pmol der Oligonucleotide NY-up oder NY-down, 2 mM dNTO, PCR-Puffer mit 1,5 mM MgCl₂ und 1 Einheit der hitzestabilen Polymerase Elongase (Gibco, Niederlande). Ein Zehntel des PCR-Produkts wurde auf einem Agarose-Gel laufen gelassen, was bewies, dass das erwartete DNA-Fragment von ± 2200 bp amplifiziert wurde. Dieses PCR-Fragment wurde anschließend unter Verwendung des Geneclean-Kit-Systems (Bio 101 Inc.) gereinigt. Dann wurden sowohl das Konstrukt pBr/Ad.Bam-rITRΔNdeI als auch das PCR-Produkt mit den Restriktionsenzymen NdeI und SbfI abgebaut. Das PCR-Fragment wurde anschließend mit Hilfe von T4-Ligase-Enzym in das mit NdeI und SbfI abgebaute pBr/Ad.Bam-rITRΔNdeI kloniert, wobei pBr/Ad.BamRΔFib entstand. Dieses Plasmid ermöglicht die Insertion einer beliebigen PCR-amplifizierten Fasersequenz durch die einzigartigen NdeI- und NsiI-Stellen, die anstelle der entfernten Fasersequenz eingefügt werden. Viren können durch die im Folgenden beschriebene doppelte homologe Rekombination in Verpackungszellen erzeugt werden, wobei man ein Adapterplasmid, das mit PacI und EcoRI abgebaute Konstrukt pBr/Ad.AflII-EcoRI und ein pBr/Ad.BamRΔFib-Konstrukt, in das heterologe Fasersequenzen eingefügt wurden, verwendet. Um die Effizienz der Viruserzeugung zu erhöhen, wurde das Konstrukt pBr/Ad.BamRΔFib so modifiziert, dass eine PacI-Stelle entstand, die das rechte ITR flankiert. Dazu wurde pBr/Ad.BamRΔFib mit AvrII abgebaut, und das 5 kb große Adenofragment wurde isoliert und in den Vektor pBr/Ad.Bam-rITR.pac#8 eingeführt, wo es das entsprechende AvrII-Fragment ersetzte. Das resultierende Konstrukt wurde pBr/Ad.BamRΔFib.pac genannt. Sobald eine heterologe Fasersequenz in pBr/Ad.BamRΔFib.pac eingesetzt ist, kann der fasermodifizierte rechte Adenovirus-Klon in einen großen Cosmidklon eingeführt werden, wie es in Beispiel 1 für pWE/Ad.AflII-rITR beschrieben ist. Ein solcher großer Cosmidklon erlaubt die Bildung von Adenovirus durch nur eine einzige homologe Rekombination, so dass der Vorgang äußerst effizient ist.
Amplifikation von Fasersequenzen von Adenovirus-Serotypen
Um eine Amplifikation der DNAs zu ermöglichen, die Faserprotein codieren, das von alternativen Serotypen abgeleitet ist, wurden degenerierte Oligonucleotide synthetisiert. Zu diesem Zweck wurden zuerst bekannte DNA-Sequenzen, die für ein Faserprotein von alternativen Serotypen codierten, aneinander ausgerichtet, um konservierte Bereiche sowohl im Schwanzbereich als auch im Knob-Bereich des Faserproteins zu identifizieren. Aus der Ausrichtung, die die Nucleotidsequenz von 19 verschiedenen Serotypen enthielt, die alle 6 Untergruppen darstellten, wurden (degenerierte) Oligonucleotide synthetisiert (siehe Tabelle 3). Ebenso in Tabelle 3 gezeigt ist die Kombination von Oligonucleotiden, die verwendet wird, um die DNA, welche Faserprotein eines speziellen Serotyps codiert, zu amplifizieren. Die Amplifikationsreaktion (50 μl) enthielt 2 mM dNTPs, 25 pmol von jedem Oligonucleotid, Standard-1x-PCR-Puffer, 1,5 mM MgCl₂ und 1 Einheit der hitzestabilen Polymerase Pwo (Boehringer Mannheim) pro Reaktion. Das Cyclerprogramm enthielt 20 Zyklen, die jeweils aus 30 s bei 94 °C, 60 s bei 60–64 °C und 120 s bei 72 °C bestanden. Ein Zehntel des PCR-Produkts wurde auf einem Agarose-Gel laufen gelassen, was nachwies, dass ein DNA-Fragment amplifiziert worden war. Von den verschiedenen Matrizen wurden jeweils zwei unabhängige PCR-Reaktionen durchgeführt, und danach wurden die erhaltenen unabhängigen PCR-Fragmente sequenziert, um die Nucleotidsequenz zu bestimmen. Von 11 verschiedenen Serotypen konnte die Nucleotidsequenz mit in Genbank vorhandenen Sequenzen verglichen werden. Von allen anderen Serotypen war die DNA, die das Faserprotein codiert, zuvor unbekannt und wurde daher mit bekannten Sequenzen von anderen Vertretern der Untergruppe abgeglichen, um Homologie, d.h. Sequenzdivergenz, zu bestimmen. Von den bisher bekannten 51 humanen Serotypen wurden alle Fasersequenzen außer bei den Serotypen 1, 6, 18 und 26 amplifiziert und sequenziert. Die Proteinsequenzen der Faser aus verschiedenen Adenovirus-Serotypen ist in 7 angegeben.
Erzeugung von faserchimärischen adenoviralen DNA-Konstrukten
Alle amplifizierten Faser-DNAs sowie der Vektor (pBr/Ad.BamRΔFib) wurden mit NdeI und NsiI abgebaut. Die abgebauten DNAs wurden anschließend auf einem Agarose-Gel laufen gelassen, und danach wurden die Fragmente aus dem Gel isoliert und mit Hilfe des Geneclean-Kits (Bio 101 Inc.) gereinigt. Die PCR-Fragmente wurden dann in die NdeI- und NsiI-Stelle von pBr/AdBamRΔFib einkloniert, so dass pBr/AdBamRFibXX entstand (wobei XX die Nummer des Serotyps ist, von dem die Faser-DNA isoliert wurde). Bisher wurde die Fasersequenz der Serotypen 5/7/8/9/10/11/12/13/14/16/17/19/21/24/27/28/29/30/32/33/34/35/36/37/38/40-S/40-L/41-S/42/45/47/49/51 in pBr/AdBamRFibXX kloniert. Aus pBr/AdBamRFibXX (wobei XX = 5/8/9/10/11/13/16/17/24/27/30/32/33/34/35/38/40-S/40-L/45/47/49/51 ist) wurde ein 6-kb-AvrII-Fragment, das die Fasersequenz umfasste, durch Gel-Elektrophorese und GeneClean isoliert. Dieses AvrII-Fragment wurde anschließend in das Plasmid pBr/Ad.Bam-rITR.pac (siehe Beispiel 1) kloniert, das mit AvrII bis zu Ende verdaut und phosphoryliert wurde, wie es oben beschrieben ist, was zur Erzeugung des Plasmids pBr/Ad.Bam-rITR.pac.fibXX führte. Dieses Plasmid wurde anschließend verwendet, um einen Cosmidklon mit einer modifizierten Faser zu erzeugen, wobei die Konstrukte pWE.pac, pBr/AflII-Bam und pBr/Ad.Bam-rITR.pac.fibXX verwendet wurden. Diese Cosmidklonierung führte zur Bildung des Konstrukts pWE/Ad.AflII-rITR/FibXX (wobei XX die Nummer des Serotyps ist, von dem die Faser-DNA isoliert wurde).
Erzeugung von pAd5/L420.HSA, pAd5/Clip und pAd5/Clipsal pMLPI-TK wurde zur Herstellung eines neuen Vektors verwendet, bei dem Nucleinsäuremoleküle, die spezielle Promoter- und Gensequenzen umfassen, leicht ausgetauscht werden können.
Zuerst wurde ein PCR-Fragment aus pZipΔMo+PyF101(N^–)-Matrizen-DNA (beschrieben in PCT/NL 96/00195) mit den folgenden Primern erzeugt: LTR-1: 5'-CTG TAC GTA CCA GTG CAC TGG CCT AGG CAT GGA AAA ATA CAT AAC TG-3' und LTR-2: 5'-GCG GAT CCT TCG AAC CAT GGT AAG CTT GGT ACC GCT AGC GTT AAC CGG GCG ACT CAG TCA ATC G-3'. Pwo-DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim) wurde nach den Anweisungen des Herstellers mit den folgenden Temperaturzyklen verwendet: einmal 5 min bei 95 °C, 3 min bei 55 °C und 1 min bei 72 °C und 30 Zyklen von 1 min bei 95 °C, 1 min bei 60 °C, 1 min bei 72 °C, dann einmal 10 min bei 72 °C. Dann wurde das PCR-Produkt mit BamHI abgebaut und in pMLP10 (Levrero et al., 1991; Gene 101, 195-202), das mit PvuII und BamHI abgebaut worden war, ligiert, wodurch der Vektor pLTR10 entstand. Dieser Vektor enthält adenovirale Sequenzen von bp 1 bis zu bp 454, gefolgt von einem Promotor, der aus einem Teil des Mo-MuLV-LTR bestand, dessen Wildtyp-Enhancer-Sequenzen durch den Enhancer aus einem mutanten Polyomvirus (PyF101) ersetzt sind. Das Promotorfragment wurde als L420 bezeichnet. Durch Sequenzieren wurde die korrekte Amplifikation des LTR-Fragments bestätigt, doch die meisten 5'-Basen im PCR-Fragment fehlten, so dass die PvuII-Stelle nicht wiederhergestellt wurde. Dann wurde der codierende Bereich des murinen HSA-Gens eingefügt. pLTR10 wurde mit BstBI abgebaut, und dann erfolgte Klenow-Behandlung und Abbau mit NcoI. Das HSA-Gen wurde durch PCR-Amplifikation an pUC18-HSA (Kay et al., 1990; J. Immunol. 145, 1952-1959) erhalten, wobei die folgenden Primer verwendet wurden: HSA1, 5'-GCG CCA CCA TGG GCA GAG CGA TGG TGG C-3' und HSA2, 5'-GTT AGA TCT AAG CTT GTC GAG ATC GAT CTA CTA ACA GTA GAG ATG TAG AA-3'. Das 269 bp große amplifizierte Fragment wurde unter Verwendung der NcoI- und der BglII-Stelle in einen Shuttle-Vektor subkloniert. Durch Sequenzieren wurde der Einbau der korrekten codierenden Sequenz des HSA-Gens bestätigt, aber mit einer zusätzlichen TAG-Einfügung direkt nach dem TAG-Stopcodon. Dann wurde der codierende Bereich des HSA-Gens einschließlich der TAG-Duplikation als NcoI(klebrig)-SalI(glatt)-Fragment herausgeschnitten und in das 3,5 kb große NcoI(klebrig)/BstBI(glatt)-Fragment aus pLTR10 kloniert, was zu pLTR-HSA10 führte.
Schließlich wurde pLTR-HSA10 mit EcoRI und BamHI abgebaut, und danach wurde das Fragment, das den linken ITR, das Verpackungssignal, den L420-Promotor und das HSA-Gen enthielt, in den Vektor pMLPI.TK, der mit denselben Enzymen abgebaut worden war, eingefügt, wodurch die Promotor- und die Gensequenz ersetzt wurden. Dies führte zu dem neuen Adapterplasmid pAd/L420-HSA, das zweckmäßige Erkennungsstellen für verschiedene Restriktionsenzyme um die Promotor- und die Gensequenz herum enthält. SnaBI und AvrII können mit HpaI, NheI, KpnI, HindIII kombiniert werden, um Promotorsequenzen auszutauschen, während die letzteren Stellen mit den ClaI- oder BamHI-Stellen 3' von dem HSA-codierenden Bereich kombiniert werden können, um Gene in diesem Konstrukt zu ersetzen.
Ein weiteres Adapterplasmid, das so entworfen wurde, dass ein leichter Austausch von Nucleinsäuremolekülen ermöglicht wird, wurde hergestellt, indem man die Promotor-, Gen- und Poly-A-Sequenz in pAd/L420-HSA durch den CMV-Promotor, eine multiple Klonierungsstelle, ein Intron und ein Poly-A-Signal ersetzte. Zu diesem Zweck wurde pAd/L420-HSA mit AvrII und BglII abgebaut, und danach erfolgte eine Behandlung mit Klenow-Enzym, so dass man glatte Enden erhielt. Das 5,1-kb-Fragment mit dem pBr322-Vektor und den adenoviralen Sequenzen wurde isoliert und mit einem glatten 1570 bp großen Fragment von pcDNA1/amp (Invitrogen) ligiert, das durch Abbau mit HhaI und AvrII und anschließende Behandlung mit T4-DNA-Polymerase erhalten wurde. Dieses Adapterplasmid wurde pAd5/Clip genannt. Um die Entfernung von Vektorsequenzen aus dem adenoviralen Fragment zu ermöglichen, wurde pAd5/Clip teilweise mit EcoRI aufgeschlossen, und das lineare Fragment wurde isoliert. Ein Oligonucleotid der Sequenz 5'-TTAAGTCGAC-3' wurde mit sich selbst assoziiert, was zu einem Linker mit einer SalI-Stelle und einem EcoRI-Überhang führte. Der Linker wurde an den teilweise aufgeschlossenen pAd5/Clip-Vektor ligiert, und es wurden Klone ausgewählt, bei denen der Linker in die EcoRI-Stelle 23 bp stromaufwärts von der linken adenoviralen ITR in pAd5/Clip insertiert war, was zu pAd5/Clipsal führte.
Erzeugung von pAd5ClipLacZ, pAd5Clip.Luc, pAd5Clip.TK und pAd5Clipsal.Luc
Das Adapterplasmid pAd5/Clip.LacZ wurde wie folgt erzeugt: Das E.-coli-LacZ-Gen wurde durch PCR mit den Primern 5'-GGGGTGGCCAGGGTACCTCTAGGCTTTTGCAA und 5'-GGGGGGATCCATAAACAAGTTCAGAATCC aus dem Plasmid pMLP.nlsLacZ (EP 95-202 213) amplifiziert. Die PCR-Reaktion wurde mit Ex Taq (Takara) gemäß den Vorschriften des Herstellers mit dem folgenden Amplifikationsprogramm durchgeführt: 5 Minuten bei 94 °C, 1 Zyklus; 45 Sekunden bei 94 °C und 30 Sekunden bei 60 °C und 2 Minuten bei 72 °C, 5 Zyklen; 45 Sekunden bei 94 °C und 30 Sekunden bei 65 °C und 2 Minuten bei 72 °C, 25 Zyklen; 10 Minuten bei 72 °C; 45 Sekunden bei 94 °C und 30 Sekunden bei 60 °C und 2 Minuten bei 72 °C, 5 Zyklen, I Zyklus. Das PCR-Produkt wurde anschließend mit Kpn1 und BamHI abgebaut, und das abgebaute DNA-Fragment wurde in mit KpnI/BamHI abgebautes pcDNA3 (Invitrogen) ligiert, was zu pcDNA3.nlsLacZ führte. Dann wurde das Plasmid pAd5/Clip mit SpeI abgebaut. Das große Fragment, das einen Teil des 5'-Teils des CMV-Promotors enthielt, und die adenoviralen Sequenzen wurden isoliert. Das Plasmid pcDNA3.nlsLacZ wurde mit SpeI abgebaut, und das Fragment, das den 3'-Teil des CMV-Promotors und das lacZ-Gen enthielt, wurde isoliert. Anschließend wurden die Fragmente miteinander ligiert, was zu pAd/Clip.LacZ führte. Die Rekonstitution des CMV-Promotors wurde durch Restriktionsabbau bestätigt.
Das Adapterplasmid pAd5/Clip.Luc wurde wie folgt erzeugt: Das Plasmid pCMV.Luc (EP 95-202 213) wurde mit HindIII und BamHI abgebaut. Das DNA-Fragment, das das Luciferase-Gen enthielt, wurde isoliert. Das Adapterplasmid pAd5/Clip wurde mit HindIII und BamHI abgebaut, und das große Fragment wurde isoliert. Dann wurden die isolierten DNA-Fragmente miteinander ligiert, was zu pAd5/Clip.Luc führte. Der Adapter pClipsal.Luc wurde in derselben Weise erzeugt, aber unter Verwendung des mit HIII und BamHI abgebauten Adapters pClipsal als Vektorfragment. Ähnlich wurde TK, das das HIII-BamHI-Fragment aus pCMV.TK (EP 95-202 213) enthielt, in pClipsal eingesetzt, wobei pAd5/Clip.TK entstand. Die Anwesenheit der SalI-Stelle unmittelbar stromaufwärts des linken ITR ermöglicht die Freisetzung von Vektorsequenzen aus dem adenoviralen Insert. Durch die Entfernung dieser Vektorsequenzen wird die Häufigkeit der Vektorerzeugung während der homologen Rekombination in PER.C6 erhöht.
Erzeugung von rekombinantem Adenovirus, das chimärisch in Bezug auf Faserprotein ist
Um rekombinantes Ad5-Virus zu erzeugen, das die Faser von Serotyp 12, 16, 28, 40-L, 51 und 5 trägt, wurden drei Konstrukte, pCLIP.Luc, pWE/AdAflII-Eco und pBr/AdBamrITR.pac/fibXX (XX = 12, 16, 28, 40-L, 51 und 5) in Adenovirus produzierende Zellen transformiert. Um rekombinantes Ad5-Virus zu erzeugen, das die Faser von 5/7/8/9/10/11/12/13/14/16/17/19/21/24/27/28/29/30/32/33/34/35/36/37/38/40-S/40-L/41-S/42/45/47/49/51 trägt, wurden zwei Konstrukte, pCLIP.Luc und pWE/Ad.AflII-rITR/FibXX, in Adenovirus produzierende Zellen transformiert.
Für die Transfektion wurden 2 μg pCLIP.Luc und 4 μg sowohl pWE/AdAflII-Eco als auch pBr/AdBamrITR.pac/fibXX (oder im Falle von Cosmiden: 4 μg pCLIP.Luc plus 4 μg pWE/Ad.AflII-rITR/FibXX) in serumfreiem DMEM auf 100 μl Gesamtvolumen verdünnt. Zu dieser DNA-Suspension wurden 100 μl 1× verdünntes Lipofectamin (Gibco) gegeben. Nach 30 min bei Raumtemperatur wurde die DNA-Lipofectamin-Komplexlösung zu 2,5 ml serumfreiem DMEM gegeben, das anschließend zu einem T25-cm²-Gewebekulturkolben gegeben wurde. Dieser Kolben enthielt 2 × 10⁶ PER.C6-Zellen, die 24 Stunden vor der Transfektion ausgesät wurden. Zwei Stunden später wurde das den DNA-Lipofectamin-Komplex enthaltende Medium einmal durch Zugabe von 2,4 ml DMEM verdünnt, das mit 20% fetalem Kälberserum ergänzt war. Wieder 24 Stunden später wurde das Medium durch frisches DMEM ersetzt, das mit 10% fetalem Kälberserum ergänzt war. Die Zellen wurden 6–8 Tage lang kultiviert, anschließend geerntet und drei Frier/Tau-Cyclen unterzogen. Zelltrümmer wurden durch 5 min Zentrifugation mit 3000 U/min bei Raumtemperatur entfernt. Vom Überstand (12,5 ml) wurden 3–5 ml verwendet, um wiederum PER.C6-Zellen (T80-cm²-Gewebekulturkolben) zu infizieren. Diese Reinfektion führt 5–6 Tage nach der Ernte des Adenovirus zur vollen cytopathogenen Wirkung (CPE), wie oben beschrieben wurde. Mit der erzeugten Viruscharge wurden zwei Assays routinemäßig durchgeführt. 1) 20 μl Virusüberstand, durch Zugabe von 1980 μl DMEM auf das Zehnfache verdünnt, wurde verwendet, um A549-Zellen zu infizieren, die 24 Stunden vor der Infektion in einer Konzentration von 10⁵ Zellen pro Napf von 6-Napf-Platten ausgesät wurden. 48 Stunden später wurden Proteinlysate hergestellt, die anschließend verwendet wurden, um die Expression von Marker-Gen (Luciferase-Aktivität) zu messen. 2) 20 μl Virusüberstand wird verwendet, um den Virustiter bei humanen 911-Zellen zu bestimmen. Zu diesem Zweck werden 911-Zellen in einer Konzentration von 4 × 10⁴ Zellen pro Napf in 96-Napf-Platten ausgesät. Drei bis vier Stunden nach dem Aussäen wurde das Medium durch Adenovirus-Überstand (Verdünnungsbereich: 2 μl bis 5 × 10^–9 μl) ersetzt. Die Virustiter des faserchimärischen Adenovirus Serotyp 5 überschritten stets 1 × 10⁸ infektiöse Einheiten pro ml.
Beispiel 3 Herstellung, Reinigung und Titration von chimärischen Adenoviren
Typischerweise 10 ml des von transfizierten PER.C6-Zellen erhaltenen Überstands wurden verwendet, um einen 1-Liter-Fermenter zu beimpfen, der 1 bis 1,5 × 10⁶ PER.C6-Zellen/ml enthielt, die speziell zum Wachsen in Suspension geeignet waren. Drei Tage nach der Beimpfung wurden die Zellen geerntet und durch 10 min Zentrifugieren mit 1750 U/min bei Raumtemperatur sedimentiert. Die in den sedimentierten Zellen vorhandenen chimärischen Adenoviren wurden anschließend extrahiert und unter Verwendung der folgenden Vorschrift zur nachgeschalteten Verarbeitung gereinigt. Das Sediment wurde in 50 ml 10 mM NaPO₄ ^– gelöst und bei –20 °C eingefroren. Nach dem Auftauen bei 37 °C wurden 5,6 ml Desoxycholat (5% w/v) hinzugefügt, und danach wurde die Lösung homogenisiert. Die Lösung wurde anschließend 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, um die Zellen aufzuschließen. Nach dem Homogenisieren der Lösung wurden 1875 μl 1 M MgCl₂ ^– und 5 ml 100% Glycerin hinzugefügt. Nach der Zugabe von 375 μl DNase (10 mg/ml) wurde die Lösung 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Zelltrümmer wurden durch 30 Minuten Zentrifugation mit 1880 × g bei Raumtemperatur mit abgeschalteter Bremse entfernt. Der Überstand wurde anschließend durch Aufgeben auf 10 ml Freon von Proteinen gereinigt. Nach 15 Minuten Zentrifugation mit 2000 U/min ohne Bremse bei Raumtemperatur sind drei Banden sichtbar, von denen die obere Bande das Adenovirus darstellt. Diese Bande wurde durch Pipettieren isoliert, und danach wurde sie auf einen mit Tris/HCl (1 M) gepufferten Cäsiumchlorid-Blockgradienten (Bereich: 1,2 bis 1,4 g/ml) aufgegeben. Nach 2,5 Stunden Zentrifugation mit 21000 U/min bei 10 °C wurde das Virus von restlichem Protein und Zelltrümmern gereinigt, da das Virus im Gegensatz zu den anderen Komponenten nicht in die 1,4 g/ml Cäsiumchloridlösung wandert. Die Virusbande wird isoliert, und danach wird eine zweite Reinigung durchgeführt, wobei man einen mit Tris/HCl (1 M) gepufferten kontinuierlichen Gradienten von 1,33 g/ml Cäsiumchlorid verwendet. Nach dem Aufgeben des Virus auf diesen Gradienten wird das Virus 17 Stunden lang mit 55 000 U/min bei 10 °C zentrifugiert. Anschließend wird die Virusbande isoliert, und nach der Zugabe von 30 μl Saccharose (50% w/v) wird überschüssiges Cäsiumchlorid durch drei Dialyserunden entfernt, wobei jede Runde 1 Stunde dauert. Für die Dialyse wird das Virus auf Dialysecassetten (Slide-a-lyzer, Schwelle 10 000 kDa, Pierce, USA) übertragen. Die für die Dialyse verwendeten Puffer sind PBS-Puffer, die mit einer zunehmenden Konzentration von Saccharose ergänzt sind (Runde 1 bis 3: 30 ml, 60 ml und 150 ml Saccharose (50% w/v)/1,5 Liter PBS, alle ergänzt mit 7,5 ml 2% (w/v) CaMgCl₂). Nach der Dialyse wird das Virus aus dem Slide-a-lyzer entnommen, und danach wird es in Portionen von 25 und 100 μl aliquotiert, woraufhin das Virus bei –85 °C gelagert wird.
Um die Zahl der Viruspartikel pro ml zu bestimmen, werden 50 μl der Viruscharge auf einem Hochdruck-Flüssigkeitschromatographen (HPLC) laufen gelassen. Das Adenovirus wird an die Säule gebunden (Anionaustausch), und danach wird es mit Hilfe eines NaCl-Gradienten (Bereich 300–600 mM) eluiert. Durch Be stimmung der Fläche unter dem Viruspeak kann die Zahl der Viruspartikel berechnet werden. Um die Zahl der infektiösen Einheiten (IE) pro ml zu bestimmen, die in einer Viruscharge vorhanden sind, werden Titrationen mit 911-Zellen durchgeführt. Zu diesem Zweck werden 4 × 10⁴ 911-Zellen pro Napf von 96-Napf-Platten in den Reihen B, D und F in einem Gesamtvolumen von 100 μl pro Napf ausgesät. Drei Stunden nach der Aussaat werden die Zellen an dem Kunststoffträger befestigt, und danach kann das Medium entfernt werden. Zu den Zellen wird ein Volumen von 200 μl gegeben, in zwei Parallelversuchen, die unterschiedliche Verdünnungen des Virus enthielten (Bereich: 10²-mal verdünnt auf 2 × 10⁹). Durch Screening in Bezug auf CPE wird von der höchsten Virusverdünnung, die nach 14 Tagen noch zu CPE führt, angenommen, dass sie wenigstens eine infektiöse Einheit enthält. Mit Hilfe dieser Beobachtung zusammen mit der berechneten Menge des Virusvolumens, das in diesen Näpfen vorhanden ist, erhält man die Zahl der infektiösen Einheiten pro ml einer gegebenen Viruscharge. Die Produktionsergebnisse, d.h. die Viruspartikel pro ml und die IE pro ml für die bisher produzierten chimärischen Adenoviren sind in Tabelle 4 gezeigt.
Beispiel 4: Umgeleitete Infektion von chimärischen Adenoviren
Um eine umgeleitete Infektion der in Bezug auf Faserprotein chimärischen Adenoviren in vitro nachzuweisen, wurde ein Sortiment von humanen Zelllinien unterschiedlicher Herkunft verwendet. Diese Menge umfasst unter anderem humane hepatische Zellen, primäre Fibroblasten, von hämatopoetischen Zellen abgeleitete Zelllinien, primäre Zellen der glatten Muskulatur, primäre Synoviocyten und primäre Zellen, die von der Amnionflüssigkeit abgeleitet sind, wie Amniocyten, und Chorionzotten. Diese Zelltypen wurden mit einem Sortiment von chimärischen Adenoviren infiziert, die sich in Bezug auf das Faserprotein voneinander unterscheiden. Zu diesem Zweck werden Zielzellen in einer Konzentration von 105 Zellen pro Napf von 6-Napf-Platten in 2 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, Life Technologies, Niederlande), das mit 10% fetalem Kälberserum versetzt war, ausgesät. 24 Stunden später wird das Medium durch frisches Medium ersetzt, das die verschiedenen chimärischen Adenoviren mit einem steigenden MOI von 0, 10, 50, 250, 1250, 2500, 500 enthielt (MOI: Multiplizität der Infektion, bezogen auf Viruspartikel pro Zelle). Ungefähr 2 Stunden nach der Zugabe von Virus wird das Medium, welches das Virus enthält, verworfen, die Zellen werden einmal mit PBS gewaschen, und anschließend werden 2 ml frisches Medium (das kein Virus enthält) in jeden Napf gegeben. 48 Stunden später werden die Zellen geerntet, gewaschen und durch 5 Minuten Zentrifugieren mit 1500 U/min sedimentiert. Die Zellen werden anschließend in 0,1 ml Lysepuffer (1% Triton X-100, 15% Glycerin, 2 mM EDTA, 2 mM DTT und 25 mM MgCl₂ in Tris-Phosphat-Puffer, pH 7,8) lysiert, und danach wird die Gesamtproteinkonzentration des Lysats gemessen (Biorad, Proteinstandard II). Um die Expression des Markergens (Luciferase-Aktivität) zu bestimmen werden 20 μl der Proteinprobe mit 100 μl eines Luciferase-Substrats (Luciferine, Promega, Niederlande) gemischt und anschließend auf einer Lumat-LB-9507-Apparatur (EG & G Berthold, Niederlande) gemessen. Die Ergebnisse dieser Infektionsexperimente sind in Tabelle 5 gezeigt und als Menge der Luciferase-Aktivität (RLU) pro μg Protein angegeben. Diese Ergebnisse beweisen eindeutig, dass eine Veränderung des Faserproteins zu einer Veränderung des Wirtsspektrums des Adenovirus Serotyp 5 führt.
Beispiel 5: Rezeptorverwendung von faserchimärischen Adenoviren
Um zu bestimmen, welche zellulären Moleküle von den faserchimärischen Adenoviren verwendet werden, wurde die Expression von Proteinen gemessen, die bekanntermaßen an der Adenovirus-Serotyp-5-Infektion beteiligt sind, d.h. Coxsackie-Adenovirus-Rezeptor (CAR), MHC Klasse I und Integrine α_vβ3, α_vβ5). Zu diesem Zweck wurden 1 × 10⁵ Zielzellen in Röhrchen übergeführt (4 Röhrchen pro Zelltyp), die für die Durchflusscytometrie vorgesehen sind. Die Zellen wurden einmal mit PBS/0,5% BSA gewaschen, und danach wurden die Zellen 5 Minuten lang durch Zentrifugation mit 1750 U/min bei Raumtemperatur sedimentiert. Anschließend wurden 10 μl eines hundertfach verdünnten α_vβ3-Antikörpers (Mab 1961, Brunswick Chemie, Amsterdam, Niederlande), eines hundertfach verdünnten α_vβ5-Antikörpers (Mab 1976, Brunswick Chemie, Amsterdam, Niederlande) oder eines 2000fach verdünnten CAR-Antikörpers (eine Spende von Dr. Bergelson, Harvard Medical School, Boston, USA (Hsu et al.)) zu dem Zellsediment gegeben, und danach wurden die Zellen 30 Minuten lang bei 4 °C in einer dunklen Umgebung inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden die Zellen zweimal mit PBS/0,5% BSA gewaschen und wiederum durch 5 Minuten Zentrifugation mit 1750 U/min bei Raumtemperatur sedimentiert. Um die Zellen zu markieren, wurden 10 μl mit Phycoerythrin (PE) markiertes Ratten-Anti-Maus-IgG1 zu dem Zellsediment gegeben, und danach wurden die Zellen wiederum 30 Minuten lang bei 4 °C in einer dunklen Umgebung inkubiert. Schließlich wurden die Zellen zweimal mit PBS/0,5% BSA gewaschen und mit einem Durchflusscytometer analysiert. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle 6 gezeigt. Außerdem ist in Tabelle 6 die Infektionseffizienz eines Adenovirus von Untergruppe A, B, C, D und F eingearbeitet. Diese Daten zeigen eindeutig, dass die Infektion eines Adenovirus der Untergruppe C mit der Expression von CAR korreliert. Die Daten beweisen auch, dass die chimärischen Adenoviren, die eine Faser eines Adenovirus der Untergruppe B, D oder F tragen, Zellen infizieren können, die keine messbaren Mengen des CAR-Proteins exprimieren, und somit in der Lage sind, Zellen über andere (CAR-unabhängige) Wege zu infizieren.
Beispiel 6: Radioaktive Markierung von Adenoviruspartikeln
Um eine Nachverfolgung der Infektion der Wildtyp-Adenovirus-Serotypen zu ermöglichen, wurden diese Viren vor der Infektion mit radioaktivem ¹²⁵I/¹²⁵I oder mit fluoreszierenden Sonden markiert. Mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie oder durch Messen der Radioaktivität wird die Effizienz der Infektion von verschiedenen Serotypen in bestimmte Zelltypen bestimmt. Um die umgeleitete Infektion des in Bezug auf Faserprotein chimärischen Adenovirus in vivo nachzuweisen, wurden 1 × 10⁹ infektiöse Partikel durch die Schwanzvene in CBA/ca-Mäuse injiziert (2 Mäuse für jedes chimärische Adenovirus). Der Nachweis der Adenovirus-Infektion in spezifische Gewebe wird auf zwei verschiedenen Ebenen überwacht: 1) Die Bindung des chimärischen Adenovirus wird durch radioaktive Markierung des Adenovirus überwacht (Eisenlohr et al., 1987; Matlin et al., 1981; Richman et al., 1998). Eine Stunde nach der systemischen in-vivo-Abgabe durch die Schwanzvene werden die Mäuse getötet und danach vorzugsweise durch Messen der Radioaktivität in verschiedenen Organen bzw. Geweben untersucht. 2) Die erfolgreiche Infektion wird anhand der Genexpression des Markergens, d.h. lacZ oder Luciferase-Aktivität, durch das Adenovirus überwacht. Vier Tage nach der Verabreichung werden die Mäuse getötet, und danach werden Organe und Gewebe isoliert. Zu den Proben gehörten die Leber, Milz, Magen-Darm-Trakt, peripheres Blut, Knochenmark, Aorta, Muskeln usw. Mit Hilfe dieser Strategie kann die bevorzugte Bindung eines chimärischen Adenovirus an interessierende Gewebe untersucht werden. Außerdem kann mit Hilfe dieser Strategie die bevorzugte Infektion von chimärischem Adenovirus in spezifische Zellen von bestimmten Organen bestimmt werden.
80 μCi ¹²³I (Cygne BV, Niederlande) oder ¹²⁵I (Amersham) wurden durch sechs Minuten Inkubation bei RT in einem mit Iodogen vorbeschichteten Röhrchen (Pierce) in 100 μl Iodierungspuffer (25 mM Tris, pH 8, 0,4 M NaCl) aktiviert. Die Reaktion der radioaktiven Markierung wurde gestartet, indem man das aktivierte Iodid in ein Eppendorf-Röhrchen überführte, das 1,5·10¹⁰ Adenoviruspartikel in 100 μl Iodierungspuffer enthielt. Man ließ die Reaktion neun Minuten lang bei RT fortschreiten, und danach wurde der eingebaute Marker durch Gelfiltration unter Verwendung einer Sephadex-25-Säule (P-10, Pharmacia) von freiem Marker abgetrennt. Zu diesem Zweck wurde eine P-10-Säule mit 10 ml PBS-Puffer vorgewaschen und anschließend mit der Reaktion der radioaktiven Markierung, die mit 2 ml Iodierungspuffer versetzt war, beladen. Nachdem die erste durchfließende Lösung verworfen wurde, wurde die Säule in 0,5-ml-Schritten mit PBS-Puffer eluiert, und die unterschiedlichen Fraktionen wurden in getrennten Röhrchen aufgefangen. Freier Marker, der von der Säule verlangsamt wird, war in den Fraktionen 10–16 konzentriert. Radioaktiv markierte Viruspartikel häuften sich vorwiegend in den Fraktionen 4, 5 und 6 an, die einem eluierten Gesamtvolumen von 2–3 ml entsprachen. Die Radioaktivität dieser virushaltigen Fraktionen wurde gemessen und als Zählereignisse pro Minute (cpm) ausgedrückt, was bis zu 5·10⁶ cpm pro 10¹⁰ Viruspartikel ergab.
Mehrere Kontrollexperimente wurden durchgeführt, um die Integrität der Viruspartikel nach den verschiedenen Manipulationen zu gewährleisten. Zum Beispiel war eine Reaktion dabei, bei der die Viruspartikel einer identischen Behandlung unterzogen wurden, wobei jedoch das radioaktive Iodid weggelassen wurde. Anschließend wurden die eluierten Viruspartikel verwendet, um A549-Zellen zu infizieren. Die Menge der infizierten Zellen wurde anhand der Expression eines visuellen Markergens, wie LacZ, festgestellt. Außerdem wurden kleine Aliquote dieser eluierten Fraktionen, die radioaktiv markiertes Adenovirus darstellten, verwendet, um A549-Zellen zu infizieren und dadurch die Expression des Transgens zu testen, die als Hinweis auf die Lebensfähigkeit de Virus der speziellen verwendeten Viruscharge angesehen wurde.
Die radioaktiv markierten Viruspartikel können anschließend für verschiedene in-vitro- und in-vivo-Studien verwendet werden, um die Affinität zu verschiedenen Zelltypen oder zu verschiedenen Organen zu bestimmen. Für in-vitro-Studien werden verschiedene Zelllinien, wie zum Beispiel HUVEC (humane Nabelschnur-Endothelzellen) oder SMC (Zellen der glatten Muskulatur) in 24-Napf-Platten in dem geeigneten Kulturmedium ausgesät und mit radioaktiv markierten Adenoviruspartikeln mit einer Multiplizität der Infektion von 10, 100 bzw. 1000 infiziert. Als Kontrolle werden die Zellen mit einer ähnlichen Menge an freiem Iodid inkubiert. Zwei Stunden nach der Infektion werden die Zellen gründlich mit PBS-Puffer gewaschen, und die restliche Radioaktivität wurde gemessen. Die Menge der Radioaktivität, die mit den Zellen verbunden bleibt, korrigiert um die Menge der Radioaktivität der mit freiem Marker inkubierten Kontrollzellen ist ein direktes Maß für die Menge an Virus, die an die Zellen gebunden ist oder in diese eingedrungen ist.
Für in-vivo-Studien wurde die Bioverteilung von Adenoviren, die sich nur bezüglich der Herkunft ihrer Faserproteine voneinander unterscheiden, verglichen. Zu diesem Zweck wurden Ratten unter Vollnarkose gesetzt, und 0,1– 2 MBq radioaktiv markierte Adenoviruspartikel wurden intravenös (iv) in die Schwanzvene verabreicht. Als Kontrolle erhielt eine Ratte eine vergleichbare Dosis mit nur freiem Iodid. Die Tiere wurden anschließend auf einen Gammascanner gesetzt und 10 Minuten lang gescannt, um die Quelle der Gammastrahlung zu lokalisieren und somit die in-vivo-Bioverteilung von systemisch eingeführtem Adenovirus zu bestimmen. Nach einer Stunde wurde die Tiere getötet, und die größeren Organe wurden zum Wiegen und zur genauen Quantifizierung der Radioaktivität mit Hilfe eines Szintillationszählers entnommen. Die Verteilung der Radioaktivität in verschiedenen Organen nach der iv-Injektion ist in 8 gezeigt und als cpm pro Gramm Gewebe ausgedrückt.
Beispiel 7: Infektion von humanen primären Zellen aus Amnionflüssigkeit
In Tabelle 5 (Beispiel 4) sind Infektionsergebnisse sowohl für Amnionzellen als auch für Chorionzotten gezeigt. Diese Zelltypen werden aus der Amnionflüssigkeit isoliert und ex vivo unter Standardbedingungen (Roest et al., 1996) kultiviert. Solche Zellen sind ideale Ziele zur Verwendung bei der pränatalen Diagnose. Zum Beispiel ist die pränatale Diagnose von muskulärem Dystrophin in manchen Fällen (ungefähr 50–100 jährlich) unter Verwendung von Standardtechniken wie RT-PCR oder DNA-PCR nicht möglich, da die Mutationen im Dystrophin-Gen unbekannt sind und die Menge des in undifferenzierten Chorionzotten- oder Amnionzottenzellen produzierten Dystrophins sehr gering ist. In diesen Fällen wird eine Isolierung und Schnelldifferenzierung von vorwiegend Chorionzottenzellen durchgeführt. Diese Chorionzotten werden anschließend mit einem Retrovirus (Roest et al., 1996) oder einem Adenovirus, das die MyoD-DNA trägt (Roest et al., 1999), infiziert, das nach der Transduktion innerhalb einer Woche die Differenzierung der Chorionzotten zu Zellen der gestreiften Muskulatur auslöst. Nach der vollständigen Differenzierung können diese Zellen dann für Western-Analyse oder Immunhistochemie verwendet werden, um zu bestimmen, ob das Dystrophin-Protein exprimiert wird. Bisher war die Infektionseffizienz von Chorionzottenzellen enttäuschend, wobei nur 2–5% der Zellen mit einem Retro virus transduziert waren (Roest et al., 1996). Unter Verwendung eines Serotyp-5-Adenovirus, um die MyoD-cDNA an Chorionzotten abzugeben, können ungefähr 10%–20% (Roest et al., 1999) der Zellen transduziert werden, aber nur, wenn man eine hohe Multiplizität der Infektion (MOI) verwendet, was zu unerwünschter Toxizität und damit Zelltod führt. Die Ergebnisse in Tabelle 5 beweisen eindeutig, dass das Adenovirus Serotyp 5 kein idealer Kandidat zum Transduzieren von Charionzottenzellen ist, da bei der höchsten getesteten MOI (MOI = 5000 Viruspartikel pro Zelle) nur eine marginale Luciferase-Aktivität gemessen wird (75 RLU/μg Protein). Diese Ergebnisse werden mit Hilfe von Durchflusscytometrie in Bezug auf die Anwesenheit des Coxsackie-Adenovirus-Rezeptors (CAR) und der Integrine bestätigt, was beweist, dass die Rezeptoren für Adenovirus Serotyp 5 auf Chorionzotten nur marginal vorhanden sind (Tabelle 6). Überraschenderweise transduziert der auf Adenovirus Serotyp 5 beruhende Vektor, der eine Faser entweder von Untergruppe B (Faser 16 und/oder 51) oder Untergruppe F (Faser 40-L) enthält, die Chorionzotten mit hoher Effizienz. Der Vektor, der auf der Grundlage der Luciferase-Aktivität das beste Ergebnis zeigt, ist das Adenovirus 5 mit der Faser 40-L, das zu 1 688 028 relativen Lichteinheiten pro μg Protein führt, einer > 20 000fach erhöhten Transgenexpression im Vergleich zu Adenovirus Serotyp 5. Dieser Vektor kann also verwendet werden, um in der Amnionflüssigkeit vorhandene Zellen so zu transduzieren, dass eine schnelle Differenzierung für die oben beschriebenen Zwecke ermöglicht wird, oder er kann zur Hemmung der Genexpression während der pränatalen Entwicklung oder zum Übertragen und Exprimieren einer interessierenden Nucleinsäure auf die Amnionflüssigkeit verwendet werden.
Beispiel 8: Erzeugung von auf Adenovirus Serotyp 5 beruhenden Viren mit chimärischem Hexonprotein
Das Verfahren zur Erzeugung von rekombinanten Adenoviren durch Cotransfektion von zwei oder mehr getrennten klonierten Adenovirussequenzen ist unten beschrieben. Diese klonierten adenoviralen Sequenzen wurden anschließend verwendet, um spezifische Adenovirus-Serotyp-5-Sequenzen zu entfernen und dadurch Matrizenklone zu erzeugen, die eine leichte Einführung von DNA-Sequenzen, die von anderen Adenovirus-Serotypen abgeleitet sind, ermöglichen. Als Beispiel für diese Matrizenklone ist die Konstruktion von Plasmiden angegeben, die einen Austausch von DNA, die für Hexonprotein codiert, ermöglichen.
Erzeugung von Adenovirus-Matrizenklonen, denen für Hexon codierende DNA fehlt
Für Hexon codierende Sequenzen von Adenovirus Serotyp 5 befinden sich zwischen den Nucleotiden 18841 und 21697. Um den Austausch von hexoncodierenden Sequenzen von alternativen Adenovirus-Serotypen in das Gerüst von Adenovirus Serotyp 5 zu erleichtern, wurde zuerst ein Shuttle-Vektor erzeugt. Dieser Unterklon mit dem Code pBr/Ad.Eco-PmeI wurde erzeugt, indem man zuerst das Plasmid pBr322 mit EcoRI und EcoRV abbaute und dann das 14-kb-PmeI-EcoRI-Fragment aus pWE/Ad.AflII-Eco einsetzte. In diesem Shuttle-Vektor wurde eine Deletion eines SanDI-Fragments mit 1430 bp durch einen Aufschluss mit SanDI und eine erneute Ligierung durchgeführt, wodurch pBr/Ad.Eco-PmeIΔSanDI erhalten wurde. Das entfernte Fragment enthält einzigartige SpeI- und MunI-Stellen. Aus pBr/Ad.Eco-PmeIΔSanDI wurde das die Adenovirus-Serotyp-5-DNA codierende Hexon deletiert. Dazu wurden die Hexon-flankierenden Sequenzen mittels PCR amplifiziert und miteinander verbunden, wodurch einzigartige Restriktionsstellen erzeugt wurden, die die das Hexon codierende Region ersetzten. Für diese PCR-Reaktionen waren vier verschiedene Oligonucleotide erforderlich: Δhex1–Δhex4.

Δhex1: 5'- CCT GGT GCT GCC AAC AGC-3'
Δhex2: 5'- CCG GAT CCA CTA GTG GAA AGC GGG CGC GCG-3'
Δhex3: 5'- CCG GAT CCA ATT GAG AAG CAA GCA ACA TCA ACA AC-3'
Δhex4: 5'- GAG AAG GGC ATG GAG GCT G-3'

9

Amplifikation von Hexonsequenzen aus Adenovirus-Serotypen
Um die Amplifikation der DNAs, die von alternativen Serotypen abgeleitetes Hexonprotein codieren, zu ermöglichen, wurden degenerierte Oligonucleotide synthetisiert. Zu diesem Zweck wurden zuerst bekannte DNA-Sequenzen, die Hexonprotein von alternativen Serotypen codieren, miteinander abgeglichen, um konservierte Bereiche sowohl im N-Terminus als auch im C-Terminus des Hexonproteins zu identifizieren. Aus dem Abgleich, der die Nucleotidsequenz von 9 verschiedenen Serotypen enthielt, die 5 der 6 bekannten Untergruppen darstellten, wurden (degenerierte) Oligonucleotide synthetisiert. Diese Oligonucleotide erhielten den Code HEX-up (5'-GG ACG TGT AAG ATG GCY ACC CCH TCG ATG MTG-3') und HEX-down (5'-CCA TCG ATG GTT ATG TKG TKG CGT TRC CGG C-3'). Die Amplifikationsreaktion (50 μl) enthielt 2 mM dNTPs, 25 pmol jedes Oligonucleotids, Standard-1x-PCR-Puffer, 1,5 mM MgCl₂ und 1 Einheit hitzestabile Pwo-Polymerase (Boehringer) pro Reaktion. Das Cycler-Programm enthielt 20 Zyklen, die jeweils aus 30 s bei 94 °C, 60 s bei 60–64 °C und 120 s bei 72 °C bestanden. Ein Zehntel des PCR-Produkts wurde auf einem Agarose-Gel laufen gelassen, was bewies, dass ein DNA-Fragment amplifiziert wurde. Von den verschiedenen Matrizen wurden jeweils zwei unabhängige PCR-Reaktionen durchgeführt, und danach wurden die erhaltenen unabhängigen PCR-Fragmente sequenziert, um die Nucleotidsequenz zu bestimmen. Von 9 verschiedenen Serotypen konnte die Nucleotidsequenz mit in GenBank vorhandenen Sequenzen verglichen werden. Von allen anderen Serotypen ist die das Hexonprotein codierende Nucleotidsequenz nicht bekannt. Bisher wurde von jedem Serotyp außer den Serotypen 1, 8, 13 und 18 die Hexonsequenz durch PCR amplifiziert. Die Proteinsequenz des Hexons der Serotypen 34, 35, 36 und 41 ist in 10 angegeben.
Erzeugung von hexonchimärischen adenoviralen DNA-Konstrukten
Alle amplifizierten Hexon-DNAs sowie der Vektor (pBr/Ad.Eco-PmeΔHexon) wurden mit MunI und SpeI abgebaut. Die abgebauten DNAs wurden anschließend auf einem Agarose-Gel laufen gelassen, und danach wurden die Fragmente von dem Gel isoliert und unter Verwendung des Geneclean Kit (Bio101 Inc.) gereinigt. Dann wurden die PCR-Fragmente in die MunI- und SpeI-Stellen von pBr/Ad.Eco-PmeΔHexon kloniert, wodurch pBr/Ad.Eco-PmeΔHexXX entstand (wobei XX die Nummer des Serotyps ist, von dem die Faser-DNA isoliert wurde). Bisher wurde die Hexonsequenz der Serotypen 2, 3, 4, 5, 7, 9, 10, 11, 14, 15, 16, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 46, 47, 48, 49, 50, 51 in pBr/Ad.Eco-PmeΔHexXX kloniert. Aus pBr/Ad.Eco-PmeΔHexXX (wobei XX = 20, 25, 26, 28, 30, 34, 35 ist) wurde ein 9,6-kb-AscI-Fragment, das die Hexonsequenz umfasste, durch Gel-Elektrophorese und eine Agarose-Vorschrift (Boehringer Mannheim, Niederlande) isoliert. Dieses AscI-Fragment wurde anschließend in das Cosmid pWE/Ad.AflII-rITRsp (siehe Beispiel 1) kloniert, das mit AscI bis zu Ende verdaut und dephosphoryliert wurde, wie es oben beschrieben ist. Diese Cosmidklonierung führte zur Bildung des Konstrukts pWE/Ad.AflII-rITR/HexXX (wobei XX die Nummer des Serotyps ist, von dem die Hexon-DNA isoliert wurde).
Erzeugung von rekombinantem in Bezug auf Hexonprotein chimärischem Adenovirus
Zur Erzeugung von rekombinantem Ad5-Virus, das das Hexon von alternativen Serotypen trägt, wurden Adenovirus erzeugende Zellen mit zwei Konstrukten, pCLIP.Luc und pWE/Ad.AflII-rITR/HexXX, transfiziert. Für die Transfektion wurden 4 μg pCLIP.Luc und 4 μg pWE/Ad.AflII-rITR/HexXX in serumfreiem DMEM auf 100 μl Gesamtvolumen verdünnt. Zu dieser DNA-Suspension wurden 100 μl auf 2/3 verdünntes Lipofectamin (Gibco) gegeben. Nach 30 min bei Raumtemperatur wurde die DNA-Lipofectamin-Komplexlösung zu 2,5 ml serumfreiem DMEM gegeben, das anschließend zu einem T25-cm²-Gewebekulturkolben gegeben wurde (die Zellen wurden vor der Zugabe von DNA-Lipofectamin-Komplex mit 5 ml serumfreiem Medium gewaschen). Dieser Kolben enthielt 3 × 10⁶ PER.C6-Zellen, die 24 Stunden vor der Transfektion ausgesät wurden. Zwei Stunden später wurde das den DNA-Lipofectamin-Komplex enthaltende Medium einmal durch Zugabe von 2,5 ml DMEM verdünnt, das mit 20% fetalem Kälberserum ergänzt war. Wieder 24 Stunden später wurde das Medium durch frisches DMEM ersetzt, das mit 10% fetalem Kälberserum ergänzt war. Die Zellen wurden 6–8 Tage lang kultiviert, anschließend geerntet und einem Frier/Tau-Vorgang unterzogen. Zelltrümmer wurden durch 5 min Zentrifugation mit 3000 U/min bei Raumtemperatur entfernt. Vom Überstand (12,5 ml) wurden 3–5 ml verwendet, um wiederum PER.C6-Zellen (T80-cm²-Gewebekulturkolben) zu infizieren.
Zu hexonchimärischem Adenovirus umgeleitete Neutralisation
Um eine veränderte Immunantwort auf chimärische Adenoviren nachzuweisen, testeten wir zuerst 75 Seren, die von menschlichen Patienten stammten (25 Krebspatienten, 50 Patienten mit rheumatoider Arthritis), auf Toxizität gegenüber humanen 911-Zellen. Zu diesem Zweck wurden 911-Zellen in einer Konzentration von 3 × 10⁴ Zellen pro Napf in 96-Napf-Mikrotiterplatten ausgesät. 24 Stunden später wurde das Medium aller Näpfe außer der Näpfe A1-H1, A5-H5 und A9-H9 durch 50 μl DMEM ersetzt, das mit 5% fetalem Kälberserum ergänzt war. In die Näpfe A1, A2, B1 und B2 wurden 50 μl Patientenserum 1 gegeben. Ähnlich wurden in die Näpfe C1, C2, D1 und D2 50 μl Patientenserum 2 gegeben, usw. Anschließend wurden 50 μl aus den Näpfen A2-H2 in A3-H3 übergeführt, und danach wurden 50 μl aus den Näpfen A3-H3 in A4-H4 übergeführt. Dieses Testschema führte also zu einer Serumkverdünnung von 0x, 2x, 4x und 8x für jedes Patientenserum. Die identische Behandlung der Näpfe A5-H5 bis A8-H8 und A9-H9 bis A12-H12 führt zu 12 getesteten Seren pro 96-Napf- Mikrotiterplatte. Von 75 insgesamt getesteten Patientenseren wurden 25, die keine erkennbare Toxizität auf humane 911-Zellen zeigten, anschließend auf die Anwesenheit von Antikörpern getestet, die eine Infektion durch chimärisches Adenovirus neutralisieren können. Zu diesem Zweck wurden 96-Napf-Mikrotiterplatten mit 50 μl DMEM gefüllt, das mit 5% fetalem Kälberserum versetzt war, außer die Näpfe A1-H1. In die Näpfe A1, A2, B1 und B2 wurden 50 μl Patientenserum 1 gegben. Ähnlich wurden in die Näpfe C1, C2, D1 und D2 50 μl Patientenserum 2 gegeben, usw. Anschließend wurden 50 μl aus den Näpfen A2-H2 in die Näpfe A3-H3 übergeführt, und danach wurden 50 μl aus A3-H3 in A4-H4 übergeführt, usw. bis A12-H12 (Verdünnungsbereich: 0 – 1/2048). Aus den Näpfen A12-H12 wurden 50 μl verworfen. Dann wurden 50 μl Virus hinzugefügt, und danach wurden die Mikrotiterplatten 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Nach Zugabe von 50 μl 911-Zellsuspension (3 × 10⁴ Zellen/Napf) wurden die Platten 7–9 Tage lang inkubiert, und danach wurde die Neutralisationsfähigkeit anhand der Abwesenheit, Anwesenheit oder Schwere der CPE bewertet. Als Kontrollen während dieser Experimente wurden Abwesenheit von Serum, Abwesenheit von Virus und Abwesenheit von Serum und Virus genommen. Auf der Grundlage dieser Experimente werden mehrere chimärische Viren identifiziert, gegen die vom Menschen nur wenig neutralisierende Antikörper erzeugt werden. Ähnliche Experimente, wie sie oben beschrieben sind, werden mit Wildtyp-Adenovirus-Serotypen sowohl vom Menschen als auch von Tieren durchgeführt, um nach Serotypen zu suchen, die weniger anfällig für eine Neutralisierung durch das Abwehrsystem des Wirts sind. Diese Experimente sind zwar ähnlich, werden jedoch in einer solchen Weise entwickelt, dass ein Hochdurchsatz-Screening von vielen Proben auf einmal möglich ist. Dieser Assay ist im Folgenden beschrieben.
Hochdurchsatz-Assay zum Nachweis einer neutralisierenden Wirkung in humanem Serum
Um ein Screening einer großen Menge an humanem Serum auf das Vorhandensein neutralisierender Antikörper gegen alle Adenovirus-Serotypen zu ermöglichen, wurde ein automatisierter Assay für 96 Näpfe entwickelt.
Humane Seren
Eine Gruppe von 100 Personen wurde ausgewählt. Freiwillige (50% männlich, 50% weiblich) waren gesunde Individuen mit einem Alter zwischen 20 und 60 und ohne Einschränkungen hinsichtlich der Rasse. Alle Freiwilligen unterschrieben ein Einverständnisformular. Personen, die berufsmäßig mit der Adenovirus-Forschung zu tun haben, wurden ausgeschlossen.
Etwa 60 ml Blut wurde in trockene Röhrchen abgezogen. Innerhalb von 2 h nach der Probennahme wurde das Blut 10 min lang mit 2500 U/min zentrifugiert. Etwa 30 ml Serum wurden in Polypropylenröhrchen übertragen und gefroren bei –20 °C bis zur Weiterverwendung aufbewahrt.
Serum wurde aufgetaut und 10 min lang bei 56 °C durch Wärme inaktiviert und dann aliquot aufgeteilt, um wiederholte Gefrier-/Tau-Zyklen zu vermeiden. Ein Teil wurde zur Herstellung von fünf Stufen von zweifachen Verdünnungen in einem Medium (DMEM, Gibco BRL) in einer Menge, die zum Füllen von etwa 70 Platten mit je 96 Näpfen ausreichend war, verwendet. Aliquote Teile von unverdünnten und verdünnten Seren wurden in Platten mit tiefen Näpfen (Format mit 96 Näpfen) pipettiert und unter Verwendung eines programmierten PlateMate als aliquote 100-μl-Teile Platten mit 96 Näpfen zudosiert. Auf diese Weise wurden die Platten nach dem unten aufgeführten Schema mit acht verschiedenen Seren in duplo (100 μl/Napf) beladen:
Während S1/2 bis S8/2 in den Spalten 1 und 6 ein Mal verdünnte Seren darstellen, stellen Sx/4, Sx/8, Sx/16 und Sx/32 die zweifachen seriellen Verdünnungen dar. Die letzten Platten enthielten auch vier Näpfe, die mit 100 μl fetalem Kalbsserum als Negativkontrolle befüllt waren. Die Platten wurden bis zur Weiterverwendung bei –20 °C gehalten.
Herstellung von humanem Adenovirus-Ausgangsmaterial
Prototypen aller bekannten humanen Adenoviren wurden in T25-Kolben, die mit PER.C6-Zellen (Fallaux et al., 1998) beimpft waren, inokuliert und nach vollständiger CPE geerntet. Nach einem Gefrieren/Auftauen wurden 1–2 ml der rohen Lysate zum Inokulieren eines T80-Kolbens mit PER.C6-Zellen verwendet, und das Virus wurde bei vollständiger CPE geerntet. Der Zeitrahmen zwischen der Inokulierung und dem Auftreten der CPE sowie die Virusmenge, die zum Reinfizieren einer neuen Kultur erforderlich war, variierte zwischen den Serotypen. Adenovirus-Ausgangsmaterialien wurden durch Gefrieren/Auftauen hergestellt und zum Inokulieren von 3–4 T175-cm²-Dreischichtkolben mit PER.C6-Zellen verwendet. Beim Auftreten der CPE wurden Zellen durch ein Rütteln des Kolbens geerntet, sedimentiert, und Virus wurde isoliert und mittels eines zweistufigen CsCl-Gradienten wie folgt gereinigt. Zellsedimente wurden in 50 ml eines Puffers aus 10 mM NaPO₄ (pH-Wert 7,2) gelöst und bei –20 °C eingefroren. Nach Auftauen bei 37 °C wurden 5,6 ml Natriumdeoxycholat (5% Gew./Vol.) zugegeben. Die Lösung wurde vorsichtig gemischt und 5–15 min lang bei 37 °C inkubiert, um die Zellen vollständig zu lysieren. Nach einem Homogenisieren der Lösung wurden 1875 μl 1 M MgCl₂ zugegeben. Nach der Zugabe von 375 μl DNase (10 mg/ml) wurde die Lösung 30 min lang bei 37 °C inkubiert. Zellrückstände wurden durch ein 30minütiges, bei RT ohne Bremse erfolgendes Zentrifugieren bei 1880 × g entfernt. Der Überstand wurde anschließend durch Extraktion mit Freon (3×) von Proteinen gereinigt. Der geklärte Überstand wurde auf einen mit 1 M Tris/HCl gepufferten Cäsiumchlorid-Blockgradienten (Bereich: 1,2/1,4 g/ml) aufgegeben und 2,5 h lang bei 10 °C mit 21 000 U/min zentrifugiert. Die Virusbande wird isoliert, wonach eine zweite Reinigung mittels eines mit 1M Tris/HCl gepufferten kontinuierlichen Gradienten von 1,33 g/ml Cäsiumchlorid durchgeführt wurde. Das Virus wurde dann 17 h lang bei 10 °C mit 55 000 U/min zentrifugiert. Die Virusbande wird isoliert, und Saccharose (50% Gew./Vol.) wird bis zu einer Endkonzentration von 1% zugegeben. Überschüssiges Cäsiumchlorid wird durch Dialyse (drei Mal 1 h bei Raumtemperatur) in Dialyse-Objektträgern (Slide-a-lizer, Ausschlussgrenze 10 000 kDa, Pierce, USA) gegen 1,5 l PBS, ergänzt mit CaCl₂ (0,9 mM), MgCl₂ (0,5 mM) und eine steigende Saccharosekonzentration (1, 2, 5%) entfernt. Nach der Dialyse wird das Virus aus dem Slide-a-lizer entfernt, wonach es in Portionen von 25 und 100 μl aliquot aufgeteilt wird, wonach das Virus bei –85 °C aufbewahrt wird.
Zur Bestimmung der Anzahl Viruspartikel pro Milliliter werden 50 μl der Viruscharge gemäß der Beschreibung von Shabram et al. (1997) in einen Hochdruck-Flüssigchromatographen (HPLC) aufgegeben. Viren wurden unter Verwendung eines von 0 bis 600 mM reichenden NaCl-Gradienten eluiert. Wie in Tabelle I gezeigt, variierte die NaCl-Konzentration, bei der die Viren eluiert wurden, signifikant zwischen den Serotypen.
Die meisten humanen Adenoviren vermehrten sich in PER.C6-Zellen mit einigen Ausnahmen gut. Die Adenovirustypen 8 und 40 wurden in 911-E4-Zellen (He et al., 1998) gezüchtet. Gereinigte Ausgangsmaterialien enthielten zwischen 5 × 10¹⁰ und 5 × 10¹² Viruspartikel/ml (VP/ml).
Titration von gereinigten humanen Adenovirus-Ausgangsmaterialien
Adenoviren wurden in PER.C6-Zellen titriert, um die Virusmenge zu bestimmen, die erforderlich ist, um einen vollen CPE innerhalb von 5 Tagen, der Zeitdauer des Neutralisationsassays, zu erhalten. Dazu wurden 100 μl Medium in jeden Napf von Platten mit 96 Näpfen dosiert. 25 μl Adenovirus-Ausgangsmaterialien, die um 10⁴, 10⁵, 10⁶ oder 10⁷ Mal vorverdünnt waren, wurden in die 2. Längsreihe einer Platte mit 96 Näpfen gegeben und durch ein 10maliges Herauf- und Herunterpipettieren vermischt. Dann wurden 25 μl von der 2. Längsreihe in die 3. Längsreihe übertragen und erneut vermischt. Dies wurde bis zur 11. Längsreihe wiederholt, wonach 25 μl aus der 11. Längsreihe verworfen wurden. Auf diese Weise wurden ausgehend von einem vorverdünnten Ausgangsmaterial serielle Verdünnungen in 5er-Schritten erhalten. Dann wurden 3 × 10⁴ PER.C6-Zellen in einem 100-μl-Volumen zugegeben, und die Platten wurden fünf oder sechs Tage lang bei 37 °C, 5% CO₂ inkubiert. Die CPE wurde mikroskopisch überwacht. Zur Berechnung der eine 50-%ige Hemmung der Zellkultur bewirkenden Dosis (CCID50) wurde das Verfahren von Reed und Muensch verwendet.
Parallel wurden identische Platten eingerichtet, die mittels des MTT-Assays (Promega) analysiert wurden. Bei diesem Assay werden lebende Zellen durch eine kolorimetrische Färbung quantifiziert. Dazu wurden 20 μl MTT (7,5 mg/ml in PBS) in die Näpfe gegeben und 2 h lang bei 37 °C, 5% CO₂, inkubiert. Der Überstand wurde entfernt, und 100 μl einer 20:1-Lösung von Isopropanol/Triton-X100 wurden in die Näpfe gegeben. Die Platten wurden 3–5 min lang auf einen Schüttler für 96 Näpfe gegeben, um ausgefallenes angefärbtes Material löslich zu machen. Die Extinktion wurde bei 540 nm und bei 690 nm (Hintergrund) gemessen. Mit diesem Assay können Näpfe mit fortschreitender CPE oder voller CPE unterschieden werden.
Neutralisationsassay
Platten mit 96 Näpfen mit verdünnten Proben von humanem Serum wurden bei 37 °C, 5% CO₂ aufgetaut. Adenovirus-Ausgangsmaterial, das auf 200 CCID50 pro 50 μl verdünnt war, wurde hergestellt, und 50-μl-Aliquote wurden zu den Längsreihen 1–11 der Platten mit Serum gegeben. Die Platten wurden 1 h lang bei 37 °C, 5% CO₂, inkubiert. Dann wurden allen Näpfen 50 μl PER.C6-Zellen mit 6 × 10⁵/ml zudosiert und 1 d lang bei 37 °C, 5% CO₂, inkubiert. Der Überstand wurde mit frischen Pipettenspitzen für jede Querreihe entfernt, und 200 μl frisches Medium wurde allen Näpfen zugegeben, um toxische Wirkungen des Serums zu vermeiden. Platten wurden weitere 4 Tage lang bei 37 °C, 5% CO₂, inkubiert. Darüber hinaus wurden parallele Kontrollplatten mit verdünnten positiven Kontrollseren, die in Kaninchen erzeugt wurden und für jeden zu testenden Serotyp spezifisch waren, in Duplikat in den Längsreihen A und B und mit dem negativen Kontrollserum (FCS) in den Längsreihen C und D eingerichtet. Auch in jeder der Längsreihen E-H wurde eine Titration wie oben beschrieben in Schritten von fünffachen Verdünnungen durchgeführt, wobei mit 200 CCID50 eines jeden zu testenden Virus begonnen wurde. Am 5. Tag wurde eine der Kontrollplatten mikroskopisch und mit dem MTT-Assay analysiert. Der experimentelle Titer wurde anhand der mikroskopisch betrachteten Kontroll-Titrationsplatte berechnet. Wenn gefunden wurde, dass dei CPE vollständig war, d.h. die erste Verdünnung in dem mittels MTT analysierten Kontroll-Titrationsexperiment zeigt einen klaren Zelltod, wurden alle Assayplatten verarbeitet. War dies nicht der Fall, wurde der Assay für einen bis mehrere Tage fortgesetzt, bis vollständige CPE erkennbar war, wonach alle Platten verarbeitet wurden. In den meisten Fällen wurde der Assay am 5. Tag beendet. Eine Serumprobe wird als nicht neutralisierend betrachtet, wenn bei der höchsten Serumkonzentration im Vergleich zu den Kontrollen ohne Serum ein maximaler Schutz von 40% zu sehen ist.
Beispiel 9: Erzeugung von auf Ad5 beruhenden Viren mit chimärischen Pentonproteinen
Das Verfahren zur Erzeugung von rekombinanten Adenoviren durch Cotransfektion von zwei oder mehr getrennten klonierten Adenovirussequenzen ist unten beschrieben. Diese klonierten adenoviralen Sequenzen wurden anschließend verwendet, um spezifische Adenovirus-Serotyp-5-Sequenzen zu entfernen und dadurch Matrizenklone zu erzeugen, die eine leichte Einführung von DNA-Sequenzen, die von anderen Adenovirus-Serotypen abgeleitet sind, ermöglichen. Als Beispiel für diese Matrizenklone ist die Konstruktion von Plasmiden angegeben, die einen Austausch von DNA, die für Pentonprotein codiert, ermöglichen.
Erzeugung von Adenovirus-Matrizenklonen, denen für Penton codierende DNA fehlt
Zuerst wurde ein Shuttle-Vektor für Pentonsequenzen durch Einsetzen des 7,2 kb großen NheI-EcoRV-Fragments aus dem Konstrukt pWE/Ad.AflII-EcoRI (in Beispiel 1 beschrieben) in mit denselben Enzymen verdautes pBr322 hergestellt. Der resultierende Vektopr wurde pBr/XN genannt. Aus diesem Plasmid wurden Ad5-Pentonsequenzen deletiert und durch einzigartige Restriktionsstellen ersetzt, die dann verwendet werden, um neue Pentonsequenzen von anderen Serotypen einzuführen. Hierzu wurden die linken flankierenden Sequenzen von Penton in pBr/XN mittels PCR amplifiziert, wobei die folgenden Primer verwendet wurden:
DP5-F: 5'- CTG TTG CTG CTG CTA ATA GC-3' und
DP5-R: 5'- CGC GGA TCC TGT ACA ACT AAG GGG AAT ACA AG-3'
DP5-R hat eine BamHI-Stelle (unterstrichen) für die Ligierung mit der rechten flankierenden Sequenz und führt auch eine einzigartige BsrGI-Stelle (halbfett) am 5'-Ende des früheren Ad5-Pentonbereichs ein.
Die rechte flankierende Sequenz wurde amplifiziert unter Verwendung von:
DP3-F: 5'-CGC GGA TCC CTT AAG GCA AGC ATG TCC ATC CTT-3' und
DP3-3R: 5'- AAA ACA CGT TTT ACG CGT CGA CCT TTC-3'
DP3-F hat eine BamHI-Stelle (unterstrichen) für die Ligierung mit der linken flankierenden Sequenz und führt auch eine einzigartige AflII-Stelle (halbfett) am 3'-Ende des früheren Ad5-Pentonbereichs ein. Die zwei resultierenden PCR-Fragmente wurden mit BamHI verdaut und miteinander ligiert. Dann wurde dieses Ligierungsgemisch mit AvrII und BglII abgebaut. pBr/XN wurde ebenfalls mit AvrII und BglII abgebaut, und das Vektorfragment wurde mit den abgebauten ligierten PCR-Fragmenten ligiert. Der resultierende Klon wurde pBr/Ad.Δpenton genannt. Pentoncodierende Sequenzen von anderen Serotypen als Ad5 wurden durch PCR amplifiziert, so dass die 5'- und 3'-Enden die BsrGI- bzw. AflII-Stelle enthielten. Bei der Einführung dieser heterologen Pentonsequenzen in pBr/Ad.Δpenton entstehen Konstrukte, die pBr/Ad.pentonXX genannt werden, wobei XX die Nummer des Serotyps darstellt, die dem Serotyp entspricht, der zum Amplifizieren der eingesetzten Pentonsequenzen verwendet wurde. Anschließend wurden die neuen Pentonsequenzen in das Konstrukt pWE/Ad.AflII-rITR eingeführt, indem man das gemeinsame FseI-Fragment austauschte.
Was wichtig ist: Es ist auch möglich, anstelle von pWE/Ad.AflII-rITR das FseI-Fragment von pBr/Ad.pentonXX in einen pWE/Ad.AflII-rITR/HexXX- oder einen pWE/Ad.AflII-rITR/FibXX-Vektor mit einer modifizierten Hexon- bzw. Fasersequenz einzusetzen. Auf diese Weise ermöglicht das auf Plasmiden beruhende System zur Erzeugung von Adenoviren eine flexible Gestaltung irgendeines Adenovirus mit irgendeinem gewünschten Merkmal bezüglich der Effizienz und Spezifität der Infektion der Zielzelle sowie bezüglich Immunogenität.
Amplifikation von Pentonsequenzen aus Adenovirus-Serotypen
Um die Amplifikation der DNAs, die von alternativen Serotypen abgeleitetes Pentonprotein codieren, zu ermöglichen, wurden degenerierte Oligonucleotide synthetisiert. Von jeder Adenovirus-Untergruppe ist bisher erst die Pentonsequenz von nur einem Vertreter bekannt. Daher wurden Oligonucleotide auf der Basis der bekannten Sequenzen entworfen. Für die Amplifikation von Pentonsequenzen der Untergruppe C wurden also die Oligonucleotide P5-for (5'-gctcgatgtacaatgcggcgcgcggcgatgtat-3') und P5-rev (5'-gctcgacttaagtcaaaaagtgcggctcgatag-3') verwendet. Für die Amplifikation von Pentonsequenzen der Untergruppe B wurden die Oligonucleotide P3-for (5'gctcgatgtacaatgaggagacgagccgtgcta-3') und P3-rev (5'-gctcgacttaagttagaaagtgcggcttgaaag-3') verwendet. Für die Amplifikation von Pentonsequenzen der Untergruppe D wurden die Oligonucleotide P17-for (5'gctcgatgtacaatgaggcgtgcggtggtgtcttc-3') und P17-rev (5'-gctcgacttaagttagaaggtgcgactggaaagc-3') verwendet. Für die Amplifikation von Pentonsequenzen der Untergruppe F wurden die Oligonucleotide PF-for (5'-gctcgatgtacaatgagacgtgcggtgggagtg-3') und PF-rev (5'-gctcgacttaagttaaaacgtgcggctagacag-3') verwendet. Alle oben beschriebenen Forward-Oligonucleotide enthalten eine BsrGI-Restriktionsstelle an ihrem 5'-Ende, und alle Reverse-Oligonucleotide enthalten eine AflII-Restriktionsstelle am 5'-Ende.
Die Amplifikationsreaktion (50 μl) enthielt 2 mM dNTPs, 25 pmol jedes Oligonucleotids, Standard-1x-PCR-Puffer, 1,5 mM MgCl₂ und 1 Einheit hitzestabile Pwo-Polymerase (Boehringer) pro Reaktion. Das Cycler-Programm enthielt 20 Zyklen, die jeweils aus 30 s bei 94 °C, 60 s bei 60–64 °C und 120 s bei 72 °C bestanden. Ein Zehntel des PCR-Produkts wurde auf einem Agarose-Gel laufen gelassen, was bewies, dass ein DNA-Fragment amplifiziert wurde. Von den verschiedenen Matrizen wurden jeweils zwei unabhängige PCR-Reaktionen durchgeführt, und danach wurden die erhaltenen unabhängigen PCR-Fragmente sequenziert, um die Nucleotidsequenz zu bestimmen. Von 51 humanen Serotypen wurden 20 Pentonsequenzen amplifiziert.
Erzeugung von pentonchimärischen adenoviralen DNA-Konstrukten
Alle amplifizierten Penton-DNAs sowie der Vektor (pBr/Ad.Δpenton) wurden mit BsrGI und AflII abgebaut. Die abgebauten DNAs wurden anschließend auf einem Agarose-Gel laufen gelassen, und danach wurden die Fragmente von dem Gel isoliert und unter Verwendung des Geneclean Kit (Bio101 Inc.) gereinigt. Dann wurden die PCR-Fragmente in die BsrGI- und AflII-Stellen von pBr/Ad.Δpenton kloniert, wodurch pBr/Ad.pentonXX entstand (wobei XX die Nummer des Serotyps ist, von dem die Penton-DNA isoliert wurde). Bisher wurde die Pentonsequenz der Serotypen 2, 3, 5, 6, 7, 11, 21, 26, 35, 39, 40, 41, 42, 47, 48, 49 und 51 in pBr/Ad.pentonXX kloniert. Aus pBr/Ad.pentonXX wurde ein 5,1-kb- FseI-Fragment, das die Pentonsequenz umfasste, durch Gel-Elektrophorese und Geneclean isoliert. Dieses FseI-Fragment wurde anschließend in das Cosmid pWE/Ad.AflII-rITR (siehe Beispiel 1) kloniert, das mit FseI bis zu Ende verdaut und dephosphoryliert wurde, wie es oben beschrieben ist. Diese Cosmidklonierung führte zur Bildung des Konstrukts pWE/Ad.AflII-rITR/PentonXX (wobei XX die Nummer des Serotyps ist, von dem die Penton-DNA isoliert wurde).
Erzeugung von rekombinantem, in Bezug auf Pentonprotein chimärischem Adenovirus
Zur Erzeugung von rekombinantem Ad5-Virus, das das Penton von alternativen Serotypen trägt, wurden Adenovirus erzeugende Zellen mit zwei Konstrukten, pCLIP.Luc und pWE/Ad.AflII-rITR/PenXX, transfiziert.
Für die Transfektion wurden 4 μg pCLIP.Luc und 4 μg pWE/Ad.AflII-rITR/PentonXX in serumfreiem DMEM auf 100 μl Gesamtvolumen verdünnt. Zu dieser DNA-Suspension wurden 100 μl 1× verdünntes Lipofectamin (Gibco) gegeben. Nach 30 min bei Raumtemperatur wurde die DNA-Lipofectamin-Komplexlösung zu 2,5 ml serumfreiem DMEM gegeben, das anschließend zu einem T25-cm²-Gewebekulturkolben gegeben wurde. Dieser Kolben enthielt 2 × 10⁶ PER.C6-Zellen, die 24 Stunden vor der Transfektion ausgesät wurden. Zwei Stunden später wurde das den DNA-Lipofectamin-Komplex enthaltende Medium einmal durch Zugabe von 2,5 ml DMEM verdünnt, das mit 20% fetalem Kälberserum ergänzt war. Wieder 24 Stunden später wurde das Medium durch frisches DMEM ersetzt, das mit 10% fetalem Kälberserum ergänzt war. Die Zellen wurden 6–8 Tage lang kultiviert, anschließend geerntet und dreimal einem Frier/Tau-Vorgang unterzogen. Zelltrümmer wurden durch 5 min Zentrifugation mit 3000 U/min bei Raumtemperatur entfernt. Vom Überstand (12,5 ml) wurden 3–5 ml verwendet, um wiederum PER.C6-Zellen (T80-cm²-Gewebekulturkolben) zu infizieren. Diese Neuinfektion führt nach 5–6 Tagen zu einer vollen cytopathogenen Wirkung (CPE), und danach wird das Adenovirus so geerntet, wie es oben beschrieben ist.
Die oben beschriebenen Beispiele 1–9 umfassen die Konstruktion von rekombinanten adenoviralen Vektoren, die chimärisch in Bezug auf Faserprotein oder Hexonprotein sind, was zu einem veränderten Infektionswirtsspektrum oder einer veränderten Immunantwort auf adenovirale Vektoren führt. Diese chimärischen adenoviralen Vektoren werden zur Genübertragung und für rekombinante DNA-Impfstoffe erzeugt. Es muss hervorgehoben werden, dass analog zur Beschreibung in Beispiel 1–9 chimärische adenovirale Vektoren für Penton konstruiert werden und für alle anderen Adenovirus-Proteine konstruiert werden können, einschließlich unter anderem DNA, die für kleine Proteine codiert, die für den Adenovirus-Zusammenbau erforderlich sind, und Sequenzen, die für die Adenovirus-Replikation erforderlich sind. Außerdem muss betont werden, dass mit dieser Technik doppelte, dreifache, vierfache usw. chimärische adenovirale Vektoren aufgebaut werden können, mit dem Ziel, Teile von vorhandenen Adenovirus-Serotypen miteinander zu kombinieren und dadurch Vektoren mit für jede gegebene Zielzelle oder Zielkrankheit bevorzugten Merkmalen zu erzeugen.
Legenden zu Figuren und Tabellen

Tabelle 1: Zusammenfassung der Klassifizierung von bekannten humanen Adenovirus-Serotypen nach dem Prinzip der Hämagglutination.
Tabelle 2: Assoziation von humanen Adenovirus-Serotypen mit menschlichen Krankheiten.
Tabelle 3: Oligonucleotide und degenerierte Oligonucleotid, die für die Amplifikation von DNA verwendet werden, die Faserprotein codiert, das von alternativen humanen Adenovirus-Serotypen abgeleitet ist. Halbfett gedruckte Buchstaben in den Oligonucleotiden A-E stellen eine NdeI-Restriktionsstelle dar. Halbfett gedruckte Buchstaben in den Oligonucleotiden 1-6 und 8 stellen eine NsiI-Restriktionsstelle dar. Halbfett gedruckte Buchstaben im Oligonucleotid 7 stellen eine PacI-Restriktionsstelle dar.
Tabelle 4: Produktionsergebnisse von faserchimärischen Adenoviren. Die Zahl der Viruspartikel pro ml wurde mit Hilfe von HPLC bestimmt. Die Zahl der infektiösen Einheiten (IU) pro Milliliter wurde durch Titration mit humanen 911-Zellen bestimmt. Für Infektionsexperimente wird die Zahl der Viruspartikel pro Milliliter von allen chimärischen Adenoviren genommen, da IE/ml einen rezeptorvermittelten Vorgang widerspiegelt.
Tabelle 5: Transduktionsergebnisse von humanen Zelllinien und primären Zellen. A549: humane Lungenkarzinom-Zelllinie (ATCC, CCL-1185). K562: Humane erythroide Leukämie (ATCC, CCL-243). SupT1: humane Lymphoblasten Hybrid B und T (ATCC, CRL-1991). GM09503: Humane primäre Fibroblasten. HEPG2: Humanes Leberkarzinom (ATCC, HB8065). CEM: humane Lymphoblastenzellen (ATCC, CRL-1992). HeLa: Humanes Zervixkarzinom (ATCC, CCL-2). Primäre Amniocyten und Chorionzottenzellen wurden vom Department of Anthropogenetics, Leiden, Niederlande, erhalten. Primäre Zellen der glatten Muskulatur und Synoviocyten wurden von der TNO-PG, Leiden, Niederlande, erhalten. Gezeigt ist die Luciferase-Aktivität (in relativen Lichteinheiten (RLU) pro μg Protein) bei Messungen an Zellen, die mit einer MOI von 5000 Viruspartikeln pro Zelle infiziert wurden.
Tabelle 6: Expression der Integrine α_vβ3 und α_vβ5, des Coxsackie-Adenovirus-Rezeptors (CAR) und MHC Klasse I auf den Membranen von Zielzellen. Außer den in Tabelle 5 beschriebenen Zellen: HUVEC: humane Nabelschnur-Endothelzellen wurden von der TNO-PG, Leiden, Niederlande, erhalten. Gezeigt ist der Prozentsatz an Zellen, die eines der Moleküle auf ihrer Membran exprimieren. Der auf Ad5 beruhende Vektor, der eine Faser von einem Vertreter jeder Untergruppe trägt, und die Effizienz der Infektion sind auf der rechten Seite der Tabelle gezeigt. ND: nicht bestimmt. 0% bedeutet nicht nachweisbare Expression des Moleküls auf der Membran der Zelle mit Hilfe von Durchflusscytometrie. 100% bedeutet eine hohe Expression des Moleküls auf der Zellmembran.

1: Schematische Darstellung des Adapterplasmids pMLPI.TK.
2: Schematische Darstellung des Adapterplasmids pAd/L420-HSA.
3: Schematische Darstellung des Adapterplasmids pAd5/CLIP.
4: Schematische Darstellung eines Zwei-Plasmiden-Systems für die Erzeugung von rekombinanten Adenoviren.
5: Schematische Darstellung eines Drei-Plasmiden-Systems für die Erzeugung von rekombinanten Adenoviren.
6: Schematische Darstellung der Erzeugung des Plasmids pBr/AdBamR-DeltaFib, bei dem ein Teil der Adenovirus-Typ-5-Faser-DNA durch ein kurzes DNA-Stück ersetzt ist, das eine einzigartige NsiI-Stelle enthält.
7: Faserproteinsequenzen der Adenovirus-Serotypen 8, 9, 13, 14,20, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 und 51. Halbfett gedruckte Buchstaben stellen einen Teil des Schwanzes von Adenovirus Serotyp 5 dar. Wenn keine halbfett gedruckten Buchstaben vorhanden sind, bedeutet dies, dass ein PCR-Fragment sequenziert wurde, das den Ad5-Schwanz nicht enthielt. Ein X, das in der Sequenz vorhanden ist, bedeutet eine unidentifizierte Aminosäure aufgrund eines unidentifizierten Nucleotids. Am Ende der Sequenz ist das Stopcodon der Faser durch einen Punkt dargestellt.
8: Vergleich der in-vivo-Bioverteilung von ¹²³I-markiertem Adenovirus Serotyp 5 und eines in Bezug auf Faserprotein chimärischen Adenovirus. Das radioaktiv markierte Adenovirus (10¹⁰ Viruspartikel, 0,1–2 MBq) wurde intravenös in die Schwanzvene verabreicht. Als Kontrolle wurde eine ähnliche Menge freier Marker in das Kontrolltier injiziert. Die Ratten wurden nach einer Stunde getötet, und die Organe wurden geeicht. Die Radioaktivität der in der Figur angegebenen Organe wurde mit einem Szintillationszähler gemessen und ist als Zählereignisse pro Minute pro Gramm Gewebe ausgedrückt.
9: Schematische Darstellung der Erzeugung des Plasmids pBr/Ad.Eco-PmeΔHexon. Ebenfalls gezeigt ist die Sequenz der Oligonucleotide delta hex 1-4, die verwendet wurden, um die DNA, die für das Hexon des Adenovirus-Serotyp-5-Proteins codiert, zu deletieren.
10: Hexonproteinsequenzen der Adenovirus-Serotypen 34, 35, 36 und 41. Ein in der Sequenz vorhandenes X bedeutet eine unidentifizierte Aminosäure aufgrund eines unidentifizierten Nucleotids. Am Ende der Sequenz ist das Stopcodon des Hexons durch einen Punkt dargestellt.
Literatur

Arnberg N., Mei Y. und Wadell G., 1997. Fiber genes of adenoviruses with tropism for the eye and the genital tract. Virology 227: 239-244.
Bout A., 1997. Gene therapy, S. 167-182. In: D.J.A. Crommelin und R.D. Sindelar (Hrsg.), Pharmaceutical biotechnology, Harwood Academic Publishers.
Bout, A. 1996. Prospects for human hene therapy. Eur. J. Drug Met. and Pharma. 2, 175-179.
Blaese et al., Cancer Gene Ther., 2 (1995): 291-297.
Brody und Crystal, Ann. N. Y. Acad. Sci. 716 (1994): 90-101.
Chroboczek J., Ruigrok R.W.H. und Cusack S., 1995. Adenovirus fiber, S. 163-200. In: W. Doerfler und P. Bohm (Hrsg.), The molecular repertoire of adenoviruses, I. Springer-Verlag, Berlin.
Defer C., Belin M., Caillet-Boudin M. und Boulanger P., 1990. Human adenovirus-host cell interactions; comparative study with members of subgroup B and C. Journal of Virology 64 (8): 3661-3673.
De Jong, J.C., Wermenbol, A.G., Verweij-Uijterwaal, M.W., Slaterus, K.W., Wertheim-van Dillen, P., van Doornum, G.J.J., Khoo, S.H. und Hierholzer, J.C. (1998) Adenoviruses from HIV-infected patients, including two new candidate serotypes Ad50 and Ad51 of Subgenus D and B1 respectively. In Vorbereitung.
Eisenlohr, L.C., Gerard, W. und Hackett, C.J. (1987). Role of receptor-binding activity of the viral hemagglutin molecule in the presentation of influenza virus antigens to helper T-cells. J. Virol 61, 1375-1383.
Eiz B und Pring-Åkerblom P., 1997. Molecular characterization of the typespecific g-determinant located on the adenovirus fiber. Journal of Virology 71: 6576-6581.
Francki, R.I.B., Fauquet, C.M., Knudson, D.L. und Brown, F. (1991) Classification and nomenclature of viruses. Fifth report of the international Committee on taxonomy of viruses. Arch. Virol. Suppl. 2, 140-144.
Gahery-Segard H., Farace F., Godfrin D., Gaston J., Lengagne R., Tursz T., Boulanger P. und Guillet J., 1998. Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity. Journal of Virology 72: 2388-2397.
Gall J., Kass-Eisler A., Leinwand L. und Falck-Pedersen E., 1996. Adenovirus type 5 and 7 capsid chimera: fiber replacement alters receptor tropism without affecting primary immune neutralization epitopes. Journal of Virology 70 (4): 2116-2123.
Greber, U.F., Willets, M., Webster, P. und Helenius, A. (1993). Stepwise dismanteling of adenovirus 2 during entry into cells. Cell 75, 477-486.
Hynes, R.O. (1992) Integrins: versatility, modulation and signalling in cell adhesion. Cell 69, 11-25.
Herz und Gerard, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96 (1993): 2812-2816. Hierholzer, J.C. (1992) Adenovirus in the immunocompromised host. Clin.
Microbial Rev. 5, 262-274.
Hierholzer, J.C., Wigand, R., Anderson, L.J., Adrian, T. und Gold, J.W.M. (1988) Adenoviruses from patients with AIDS: a plethora of serotypes and a description of five new serotypes of subgenus D (types 43-47). J. Infect. Dis. 158, 804-813.
Ishibashi, M. und Yasue (1983) in Adenoviruses of Animals, Kapitel 12, 5. 497-561.
Kay, R., Takei, F. und Humphries, R.K. (1990). Expression cloning of a cDNA encoding M1/69-J11d heat-stable antigens. J. Immunol. 145 (6), 1952-1959. Khoo, S.H., Bailey, A.S., De Jong, J.C. und Mandal, B.K. (1995). Adenovirus infections in human immunodeficiency virus-positive patients: Clinical features and molecular epidemiology. J. Infect. Dis 172, 629-637.
Kidd, A.H., Chrboczek, J., Cusack, 5. und Ruigrok, R.W.H. (1993) Adenovirus type 40 virions contain two distinct fibers. Virology 192, 73-84.
Krasnykh V.N., Mikheeva G.V., Douglas J.T. und Curiel D.T., 1996. Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism. Journal of Virology 70(10): 6839-6846.
Krasnykh V., Dmitriev I., Mikheeva G., Miller C. R., Belousova N. und Curiel D.T., 1998. Characterization of an adenovirus vector containing a heterologous peptide epitope in the HI loop of the fiber knob. Journal of Virology 72(3): 1844-1852.
Leopold, P.L., Ferris, B., Grinberg, I., Worgall, S., Hackett, N.R. und Crystal, R.G. (1998). Fluorescent virions: Dynamic tracking of the pathway of adenoviral vectors in living cells. Hum. Gene Ther. 9, 367-378.
Levrero, M., Barban, V., Manteca, S., Ballay, A., Balsamo, C., Avantaggiata, M.L., Natoli, G., Skellekens, H., Tiollais, P. und Perricaudet, M. (1991). Defective and non-defective adenovirus vectors for expression foreign genes in vitro and in vivo. Gene 101, 195-202.
Matlin, K.S., Reggio, H., Helenius, A. und Simons, K. (1981). Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J. Cell Biol. 91, 601-613. Morgan, C., Rozenkrantz, H.S. und Mednis, B. (1969) Structure and development of viruses as observed in the electron microscope. X. Entry and uncoating of adenovirus. J. Virol. 4, 777-796.
Roest, P.A.M., Bout, M., van der Tuijn, A.C., Ginjaar, I.B., Bakker, E., Hogervorst, F.B.L., van Ommen, G-J.B., den Dunnen, J.T. (1996). J. Med. Genet. 33, 935-939.
Roest P.A.M., van der Tuijn, A.C., Ginjaar, I.B., Hoeben, R.C., Hogervorst, F.B.L., Bakker, E, den Dunnen, J.T., van Ommen, G-J.B. (1996). Neuromusc. Disord. 6 (Nr. 3), 195-202.
Roest P.A.M., van der Tuijn, A.C., Ginjaar, I.B., Hoeben, R.C., Hogervorst, F.B.L., Bakker, E., den Dunnen, J.T., van Ommen, G-J.B. (1999). Lancet 353, 727-728.
Richman, D.D., Hostetler, K.Y., Yazaki, P.J. und Clark, S. (1986). Fate of influenza A virion proteins after entry into subcellular fractions of LLC cells and the effect of amantadine. Virology 151, 200-210.
Stevenson S.C., Rollence M., White B., Weaver L. und McClelland A., 1995. Human adenovirus serotypes 3 and 5 bind to two different cellular receptors via the fiber head domain. Journal of Virology 69(5): 2850-2857.
Stevenson S.C., Rollence M., Marshall-Neff J. und McClelland A., 1997. Selective targeting of human cells by a chimaeric adenovirus vector containing a modified fiber protein. Journal of Virology 71(6): 4782-4790.
Signas, G., Akusjarvi, G. und Petterson, U. (1985). Adenovirus 3 fiberpolypeptide gene: Complications for the structure of the fiber protein. J. Virol. 53, 672-678.
Stouten, P.W.F., Sander, C., Ruigrok, R.W.H. und Cusack, S. (1992) New triple helical model for the shaft of the adenovirus fiber. J. Mol. Biol. 226, 1073-1084.
Schulick, A.H., Vassalli, G., Dunn, P.F., Dong, G., Rade, J.J., Zamarron, C. und Dichek, D.A. (1997). Established immunity precludes adenovirus-mediated gene transfer inrat carotid arteries.
Schnurr, D. und Dondero, M.E. (1993) Two new candidate adenovirus serotypes Intervirol. 36, 79-83.
Svensson, V. und Persson, R. (1984). Entry of adenovirus 2 into Hela cells. J.
Virol. 51, 687-694.
Varga, M.J., Weibull, C. und Everitt, E. (1991). Infectious entry pathway of adenovirus type 2. J. Virol 65, 6061-6070.
Wickham T.J., Carrion M.E. und Kovesdi I., 1995. Targeting of adenovirus penton base to new receptors through replacement of its RGD motif with other receptor-specific peptide motifs. Gene Therapy 2: 750-756.
Wickham T.J., Segal, D.M., Roelvink, P.W., Carrion M.E., Lizonova, A., Lee, G-M. und Kovesdi, I. (1996). Targeted adenovirus gene transfer to endothelial and smooth muscle cells by using bispecific antibodies. J. Virol. 70 (10), 6831-6838. Wickham, T.J., Mathias, P., Cherish, D.A. und Nemerow, G.R. (1993) Integrins avb3 and avb5 promote adenovirus internalisation but not virus attachment. Cell 73, 309-319.

Tabelle 1
Tabelle 2
Tabelle 3
Tabelle 4
Sequenzprotokoll

Claims

Chimärisches Adenovirus mit einem geänderten Infektionswirtsbereich, wobei das chimärische Adenovirus ein chimärisches Faserprotein umfasst, das wenigstens die Knob-Domäne eines Faserproteins eines Adenovirus umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Adenovirus Serotyp 12, 16, 32, 40-S, 40-L, 49 und 51 besteht.
Chimärisches Adenovirus gemäß Anspruch 1, wobei der übrige Teil der chimärischen Faser von einem zweiten Adenovirus-Serotyp stammt.
Chimärisches Adenovirus gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei dem zweiten Adenovirus-Serotyp um Adenovirus Serotyp 5 handelt.
Chimärisches Adenovirus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das chimärische Adenovirus weiterhin wenigstens einen Teil eines Penton- oder Hexonproteins oder beide von einem dritten Adenovirus-Serotyp umfasst, wobei der zweite und der dritte Adenovirus-Serotyp gleich oder verschieden sein können.
Rekombinanter chimärischer adenoviraler Vektor, umfassend: – wenigstens ein ITR; – ein Verpackungssignal; – eine interessierende Nucleinsäuresequenz; – ein Gen, das ein chimärisches Faserprotein codiert, das eine Knob-Domäne eines Faserproteins eines Adenovirus-Serotyps umfasst, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Adenovirus Serotyp 12, 16, 32, 40-S, 40-L, 49 und 51 besteht.
Rekombinanter chimärischer adenoviraler Vektor gemäß Anspruch 5, bei dem es sich um ein Plasmid handelt.
Rekombinanter chimärischer adenoviraler Vektor gemäß Anspruch 5 oder 6, wobei das chimärische Faserprotein weiterhin einen Teil des Schwanzes des Faserproteins von Adenovirus Serotyp 5 umfasst.
Verpackungszelle zur Herstellung eines chimärischen Adenovirus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend einen rekombinanten chimärischen adenoviralen Vektor gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7 und in trans alle Elemente, die für die Adenovirusproduktion notwendig sind und auf dem rekombinanten chimärischen adenoviralen Vektor nicht vorhanden sind.
Kit, umfassend einen rekombinanten chimärischen adenoviralen Vektor gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7 und eine Verpackungszelle, die in trans alle Elemente zur Verfügung stellt, die für die Adenovirusproduktion notwendig sind und auf dem rekombinanten chimärischen adenoviralen Vektor nicht vorhanden sind, wobei es im Wesentlichen keine Überlappung zwischen der Zelle und dem Vektor gibt, die zur Rekombination führt, welche zur Produktion von replikationskompetentem Adenovirus führen würde.