DE69933549T2

DE69933549T2 - Pharmakophore rekombination zur identifizierung von "lead"-verbindungen von kleinmolekül-medikamenten

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Publication number: DE69933549T2
Application number: DE69933549T
Authority: DE
Inventors: A. Jonathan Oakland ELLMAN; Ingrid Berkeley CHOONG
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1998-03-27
Filing date: 1999-03-26
Publication date: 2007-06-21
Anticipated expiration: 2019-03-27
Also published as: US20040063157A1; AU759327B2; US7001727B2; WO1999049314A9; CA2326341A1; EP1066522A1; US20040132100A1; DE69933549D1; WO1999049314A1; EP1066522B1; US6344334B1; JP2002507748A; IL138717A0; US20020115107A1; AU3211399A; ATE342507T1; EP1066522A4; CA2326341C; US6344330B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verfahren zum Identifizieren von Kleinmolekül-Arzneimittel-Leitverbindungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
In Reaktion auf die ständig steigende Nachfrage nach neuen Verbindungen, die für die wirkungsvolle Behandlung verschiedener Erkrankungen geeignet sind, hat die medizinische Forschergemeinschaft eine Anzahl verschiedener Strategien zum Entdecken und Optimieren neuer therapeutischer Arzneimittel entwickelt. Zum größten Teil sind diese Strategien von molekularen Techniken abhängig, die die Identifikation von fest bindenden Liganden für ein gegebenes biologisches Zielmolekül ermöglichen. Sobald sie identifiziert wurden, können diese Liganden dann ihre therapeutischen Funktionen ausüben, indem sie die Aktivität des Zielmoleküls, an das sie binden, aktivieren, hemmen oder in anderer Weise verändern.
In einer solchen Strategie werden neue therapeutische Arzneimittel identifiziert, indem man kombinatorische Bibliotheken synthetischer Kleinmolekül-Verbindungen screent, indem man bestimmt, bei welcher Verbindung (welchen Verbindungen) es am wahrscheinlichsten ist, daß sie ein wirkungsvolles Therapeutikum liefert (liefern), und dann die therapeutischen Eigenschaften der identifizierten Kleinmolekül-Verbindung(en) optimiert, indem man strukturell verwandte Analoge synthetisiert und sie hinsichtlich Bindung an das Zielmolekül analysiert (Gallop et al., J. Med. Chem. 37:1233-1251 (1994), Gordon et al., J. Med. Chem. 37:1385-1401 (1994), Czarnik und Ellman, Acc. Chem. Res. 29:112-170 (1996), Thompson und Ellman, Chem. Rev. 96:555-600 (1996) und Balkenhohl et al., Angew. Chem. Int. Ed. 35:2288-2337 (1996)). Dieses Verfahren ist jedoch nicht nur zeitaufwendig und kostenintensiv, sondern es liefert häufig auch keine erfolgreiche Identifikation einer Kleinmolekül-Verbindung mit ausreichender therapeutischer Wirksamkeit für die gewünschte Anwendung. Während die Herstellung und Beurteilung kombinatorischer Bibliotheken von Kleinmolekülen sich als recht geeignet für die Entdeckung neuer Arzneimittel erwiesen hat, war die Identifizierung von Kleinmolekülen für verschiedene Zielmoleküle (z.B. diejenigen, die zum Blockieren von Protein-Protein-Wechselwirkungen oder einer anderen Teilnahme daran geeignet sind) beispielsweise nicht besonders effektiv (Brown, Molecular Diversity 2:217-222 (1996)).
Ein Problem, welches den Erfolg von Ansätzen mit kombinatorischen Bibliotheken beschränkt, besteht darin, daß es nur möglich ist, einen sehr kleinen Bruchteil der möglichen Zahl von Kleinmolekülen zu synthetisieren. Beispielsweise können mehr als 10⁶⁰ verschiedene Kleinmoleküle mit gültigen chemischen Strukturen und Molekulargewichten von weniger als 600 Dalton in Betracht gezogen werden. Selbst die ehrgeizigsten Ansätze von kombinatorischen Kleinmolekül-Bibliotheken konnten jedoch Bibliotheken mit einer Anzahl an verschiedenen Verbindungen zum Testen nur im zwei- bis dreistelligen Millionenbereich erzeugen. Daher ermöglicht die kombinatorische Technik nur das Testen eines sehr kleinen Anteils der möglichen Kleinmoleküle, was zu einer hohen Wahrscheinlichkeit führt, daß die potentesten Kleinmolekül-Verbindungen verpaßt werden. Somit sind geeignete Kleinmolekül-Verbindungen mit der erforderlichen Verfügbarkeit, Aktivität oder mit den erforderlichen chemischen und/oder strukturellen Eigenschaften oft nicht auffindbar. Darüber hinaus erfordert, selbst wenn solche Kleinmolekül-Verbindungen verfügbar sind, die Optimierung dieser Verbindungen, so daß sie ein effektives Therapeutikum identifizieren, oft die Synthese einer extrem großen Anzahl struktureller Analoge und/oder bereits bekanntes Wissen über die Struktur des Zielmoleküls für diese Verbindung. Weiterhin kann das Screenen großer kombinatorischer Bibliotheken potentiell bindender Verbindungen, um eine Leitverbindung für die Optimierung zu identifizieren, schwierig und zeitaufwendig sein, da sämtliche Mitglieder der Bibliothek getestet werden müssen. Es ist daher offensichtlich, daß neue Verfahren zum raschen und effizienten Identifizieren neuer Kleinmolekül-Arzneimittel-Leitverbindungen erforderlich sind.
Lebende Organismen entwickeln sich durch einen Prozeß, der sowohl (1) die genetische Rekombination, wobei die geschlechtliche Fortpflanzung dazu dient, die Attribute der Elternorganismen zu mischen und zu rekombinieren, um Nachkommen zu erzeugen, die die Attribute beider Elternteile aufweisen, als auch (2) die natürliche Selektion, wobei nur diejenigen Nachkommen, die ausreichend "qualifiziert" sind, ihre Attribute an die nächste Generation weiterzugeben, umfaßt. Es wurde zuvor von Ansätzen berichtet, die den Prozeß, durch den sich Organismen entwickeln, genau nachahmen, um Kleinmoleküle zu identifizieren, die an Rezeptoren und Enzyme binden (Weber et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34:2280-22$2 (1995) und Singh et al., J. Am. Chem. Soc. 118:1669-1676 (1996)). Diese Ansätze basieren auf dem als "genetische Algorithmen" bezeichneten mathematischen Verfahren (Holland, Sci. Am. 66-72 (1992)). Unter Verwendung genetischer Algorithmen wird eine Population verschiedener Verbindungen gescreent, um die Verbindungen zu identifizieren, die an den Rezeptor oder das Enzym binden (d.h. die "qualifiziertesten" Verbindungen). Eine Population von Verbindungsnachkommen wird dann hergestellt, indem man die Bausteine, die zur Herstellung der "qualifiziertesten" Verbindungen verwendet wurden, rekombiniert. Dann wird ein Screening durchgeführt, um die Verbindungen zu identifizieren, die mit der höchsten Affinität an das Ziel binden und die aus den optimalen Kombinationen von Bausteinen bestehen.
Da die in dem Ansatz des genetischen Algorithmus verwendeten Bausteine jedoch nicht vorausgewählt werden, wird eine von zwei Techniken verwendet, um fest bindende Liganden zu identifizieren: (1) extrem große Populationen von Verbindungen müssen gescreent und rekombiniert werden, oder (2) mehrere Runden von Screening und Rekombination werden mit relativ kleinen Populationen durchgeführt, wobei allmählich zusätzliche Bausteine durch ein Verfahren, welches zu genetischer Mutation analog ist, eingebracht werden. In diesem zweiten Ansatz sind viele Runden der Selektion, Rekombination und Einbringung von Bausteinen erforderlich, um die optimalen Kombinationen von Bausteinen zu identifizieren, was zu den vielen Runden der Selektion, Fortpflanzung und Mutation, die in der Entwicklung lebender Organismen erforderlich sind, analog ist. Somit ist die Verwendung genetischer Algorithmen derzeit aufgrund der langen Zeitdauer, die zur Herstellung und zum Screenen von Verbindungen erforderlich ist, beschränkt, wobei das Ziel bei der Entdeckung neuer Arzneimittel darin besteht, so schnell wie möglich eine wirksame Verbindung zu identifizieren.
Ein weiterer Ansatz zum Identifizieren von Liganden mit hoher Affinität für interessierende Zielmoleküle, über den kürzlich berichtet wurde, besteht darin, daß Struktur-Aktivitäts-Verhältnisse aus der kernmagnetischen Resonanzanalyse bestimmt werden, d.h. "SAR durch NMR" (Shuker et al., Science 274:1531-1534 (1996) und US-Patent Nr. 5,698,401 von Fesik et al.). Bei diesem Ansatz wird die physikalische Struktur eines Zielproteins mittels NMR bestimmt, und dann werden Kleinmolekül-Bausteine identifiziert, die an nahegelegenen Punkten auf der Proteinoberfläche an das Protein binden. Nebeneinander liegende bindende Kleinmoleküle werden dann mit einem Linker miteinander gekoppelt, um Verbindungen zu erhalten, die mit höherer Affinität an das Zielprotein binden als die unverknüpften Verbindungen alleine. Dadurch, daß die NMR-Struktur des Zielproteins zur Verfügung steht, können somit die Längen der Linker zum Koppeln zweier benachbarter bindender Kleinmoleküle bestimmt werden, und Kleinmolekül-Liganden können rationell ausgestaltet werden. Dieser Ansatz ist geeignet zum Identifizieren von Verbindungen, die an FK506-Bindungsprotein mit einem K_d = 20 nM (Shuker et al., a.a.O.) und an Stromelysin mit einem K_d = 15 nM (Hajduk et al., J. Am. Chem. Soc., 119:5818-5827 (1997) und Hajduk et al., J. Am. Chem. Soc. 119:5828-5832 (1997)) binden.
Obwohl das Verfahren SAR durch NMR sehr leistungsfähig ist, unterliegt es auch schwerwiegenden Beschränkungen. Beispielsweise erfordert der Ansatz große Mengen an Zielprotein (> 200 mg), und dieses Protein muß typischerweise mit ¹⁵N markiert sein, damit es für NMR-Studien geeignet ist. Darüber hinaus erfordert der Ansatz SAR durch NMR für gewöhnlich, daß das Zielprotein auf > 0,3 mM löslich ist und ein Molekulargewicht von weniger als etwa 25-30 kDa hat. Zusätzlich wird die Struktur des Zielproteins erst durch NMR aufgelöst, ein Vorgang, welcher oft eine Zeitdauer von 6 bis 12 Monaten erfordern kann.
Aus dem Obigen wird offensichtlich, daß ein Bedarf nach neuen Techniken besteht, die für die rasche und effiziente Identifizierung von Kleinmolekül-Arzneimittel-Leitverbindungen, die mit hoher Affinität an ein interessierendes Zielmolekül binden können, geeignet sind. Wir beschreiben hier zum ersten Mal ein Verfahren, welches auf der Rekombination von Pharmakophoren basiert, wobei eine Population von Kleinmolekül-Pharmakophoren hinsichtlich ihrer Fähigkeit, an ein Zielmolekül zu binden, "vorselektiert" wird und wobei die Kleinmolekül-Pharmakophoren, die mit der höchsten Affinität binden, dann in verschiedenen Kombinationen chemisch verknüpft werden, um eine Bibliothek potentieller Bindungsliganden mit hoher Affinität zu liefern. Die Bibliothek potentieller Bindungungsliganden wird dann unter Verwendung eines einfachen funktionellen Tests hinsichtlich des Vorhandenseins einer oder mehrerer Verbindungen, die mit sehr hoher Affinität an das Zielmolekül binden, gescreent.
Hioki, H. und Still, W.C. (1998), LJ. Org. Chem. Band 63(4):904-905 offenbaren Verbindungen, die an ein Tripeptid binden, welche durch eine Disulfidgruppe verknüpfte Gruppen enthalten.
Huc, I. und Lehn, J.-M. (1997), Procs. Natl. Acad. Sci. USA Band 94:2100-2110 beschreiben die Verwendung einer Bibliothek von Verbindungen für die Identifikation von Inhibitoren von Kohlenstoffanhydrase.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Bibliothek von Zielbindungsfragmentkandidaten (CTBFs) bereitgestellt, wobei jedes Fragment ein kleines organisches Molekül ist und jedes Mitglied der Bibliothek durch die folgende Formel repräsentiert wird: CTBF-S-S-R⁸ wobei R⁸
ein geradkettiges Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, welches mit einer Aminogruppe substituiert ist, und wobei die Bibliothek wenigstens zwei CTBFs umfaßt, die miteinander kombiniert sind.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Screenen einer Bibliothek von kleinen organischen Molekülen hinsichtlich eines oder mehrerer Zielbindungsfragmentkandidaten (CTBFs), die an ein biologisches Zielmolekül (TBM) binden, bereitgestellt, wobei jedes CTBF eine verknüpfbare funktionelle Gruppe (LFG) oder eine blockierte Form davon (BLFG) hat, wobei die LFG oder die BLFG eine Disulfid-Linker-Gruppe (LG) enthält, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:

(a) Inkontaktbringen des TBM mit einzelnen Mitgliedern der CTBF-Bibliothek nach Anspruch 1,
(b) Detektieren oder Bestimmen, welche CTBFs an das TBM binden, und
(c) Selektieren von CTBFs, die an das TBM binden.

Die Anmelder beschreiben hier einen molekularen Ansatz für das rasche und effiziente Identifizieren von Kleinmolekül-Liganden, die mit hoher Affinität an ein biologisches Zielmolekül binden können, wobei die durch das Verfahren identifizierten Ligandenverbindungen als neue Kleinmolekül-Arzneimittel-Leitverbindungen geeignet sind. In den hier beschriebenen Verfahren können die Zielbindungsfragmente zusammengesetzt und einem ersten Screening oder einem "Vorscreening" unterzogen werden, um einen Teilsatz der Bibliothek zu identifizieren, der mit einer oder unterhalb einer bestimmten Dissoziationskonstante an das biologische Zielmolekül bindet. Diejenigen Zielbindungsfragmentkandidaten, von denen während dieser Stufe des "Vorscreenings" gemäß einer Ausführungsform herausgefunden wurde, daß sie an das biologische Zielmolekül binden können, werden dann unter Verwendung eines oder mehrerer Linkerelemente in einer Vielzahl von Kombinationen gemäß der Erfindung gekoppelt oder verknüpft, um eine Bibliothek potentieller Bindungsliganden mit hoher Affinität oder verknüpfte Zielbindungsfragmentkandidaten bereitzustellen, deren Bausteine die Kleinmolekül-Zielbindungsfragmentkandidaten mit der höchsten Affinität für das biologische Zielmolekül repräsentieren, wie sie in der "Vorscreening"-Stufe identifiziert wurden. Die Bibliothek potentieller Liganden oder verknüpfter Zielbindungsfragmentkandidaten zum Binden an das biologische Zielmolekül wird dann ein zweites Mal gemäß der Erfindung gescreent, um diejenigen Mitglieder zu identifizieren, die die niedrigste Dissoziationskonstante für die Bindung an das biologische Zielmolekül zeigen. Weil in einer Ausführungsform die Bibliothek der Bausteine von Zielbindungsfragmentkandidaten anfangs "vorgescreent" wird, um einen viel kleineren Satz der vorteilhaftesten Bausteine zu selektieren, können die produktivsten Kombinationen von Bausteinen und Cross-Linkern identifiziert werden, ohne daß mit großem Arbeitsaufwand alle möglichen Kombinationen aller Bausteine, die durch einen Satz von Linkem miteinander gekoppelt sind, gescreent werden müssen. Der Prozeß der Identifizierung von Arzneimittel-Leitverbindungen mit hoher Affinität wird dadurch stark beschleunigt.
In Anbetracht des Obigen betrifft eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren von Arzneimittel-Leitverbindungen, die an ein interessierendes biologisches Zielmolekül binden, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:

(a) Zusammensetzen einer Bibliothek aus Zielbindungsfragmentkandidaten (CTBF), die durch ein Verknüpfungselement chemisch verknüpft werden können, wodurch verknüpfte Zielbindungsfragmentkandidaten zur Bindung an das biologische Zielmolekül bereitgestellt werden,
(b) Screenen der Bibliothek von Zielbindungsfragmentkandidaten, um wenigstens erste und zweite Zielbindungsfragmentkandidaten, die an das biologische Zielmolekül binden, zu identifizieren,
(c) chemisches Verknüpfen der wenigstens ersten und zweiten Zielbindungsfragmentkandidaten oder strukturell verwandter Analoger davon mit einem Verknüpfungselement, um eine Bibliothek von verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten für die Bindung an das biologische Zielmolekül gemäß der Erfindung bereitzustellen, und
(d) Screenen der in (c) erhaltenen Bibliothek, um eine Arzneimittel-Leitverbindung zu identifizieren, die an das biologische Zielmolekül bindet.

In verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen kann die Bibliothek von Zielbindungsfragmentkandidaten Verbindungen mit einem Molekulargewicht von weniger als 500 Dalton umfassen, sie kann einfache Aldehyde, Amine, Amide, Carbamate, Ureidos, Sulfonamide, Alkohole, Carbonsäuren, Thiole, Arylhalogenide, Alkene, Alkine, Ketone, Ether und/oder Oxime umfassen und/oder sie kann mit einem K_d von 10 mM oder darunter an das biologische Zielmolekül binden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann die Bibliothek von Zielbindungsfragmentkandidaten Oximverbindungen umfassen, wobei die strukturell verwandten Aldehydanalogen dieser Oximverbindungen über einen O,O'-Diaminoalkandiol-Verknüpfer chemisch verknüpft werden könen. Biologische Zielmoleküle, die in den beschriebenen Verfahren Verwendung finden, umfassen beispielsweise Proteine, Nukleinsäuren und Saccharide, bevorzugt Proteine. Bevorzugte TBMs umfassen menschliche oder menschliche pathogene Proteine, insbesondere Enzyme, menschliche Hormone, menschliche Rezeptoren und Fragmente davon. Diese TBMs können alle Atome mit natürlich vorkommender Isotopenhäufigkeit enthalten.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen umfaßt die Bibliothek von verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten verknüpfte Zielbindungsfragmente mit einem Molekulargewicht von weni ger als etwa 1000 Dalton, die Homo- oder Heterodimere sein können und einen K_d für das TBM von etwa 500 μM bis etwa 500 nM oder darunter haben können.
Wir beschreiben auch ein Verfahren zum Hemmen der Wechselwirkung zwischen ersten und zweiten biologischen Molekülen, wobei das Verfahren die Stufe umfaßt, bei der man ein System, welches sowohl das erste als auch das zweite biologische Molekül umfaßt, mit einer die Bindung hemmenden Menge eines verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten, der durch das oben beschriebene Verfahren identifiziert wurde, in Kontakt bringt, wobei der verknüpfte Zielbindungsfragmentkandidat entweder an das erste oder an das zweite biologische Molekül bindet und deren Fähigkeit zur Wechselwirkung miteinander hemmt.
Wir beschreiben weiterhin eine Arzneimittel-Leitverbindung, hergestellt durch das hier beschriebene Verfahren, wobei die Verbindung durch die nachstehende Formel repräsentiert wird:
wobei
TBF_m ein erstes TBF repräsentiert, ausgewählt aus Stufe (d),
TBF ein zweites TBF repräsentiert, ausgewählt aus Stufe (d),
TBF_m-Teil A und B TBF_m aus Stufe (d) repräsentieren, wobei jedes Fragment an ein einzelnes Atom in LG₃ gebunden ist,
TBF Teil C und D TBF aus Stufe (d) repräsentieren, wobei jedes Fragment an ein einzelnes Atom in LG₄ gebunden ist,
XL einen Cross-Linker der Formel -(C₀-C₂-Alkyl-L¹-L²-L³-L⁴-L⁵-C₀-C₂-Alkyl)- repräsentiert,
LG₁ und LG₂ Cross-Linker-Gruppen sind, die unabhängig voneinander aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind: C(R_a)=N-O-, -O-N=C(R_a)-, -CH₂-N(R_a)-, -N(R_a)-CH₂-, -C(=O)-N(R_a)-, -N(R_a)-C(=O)-, -N(R_a)-C(=O)-O-, -O-C(=O)-N(R_a)-, -N(R_a)-C(=O)-N(R_b)-, -N(R_a)-C(=O)-N(R_b)-, SO₂-N(R_a)- und -N(R_a)-SO₂-,
LG₃ und LG₄ Linker-Gruppen sind, die unabhängig voneinander aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind: >C=N-O-, -O-N=C<, -CH₂-N<, >N-CH₂-, -C(=O)-N<, <N-C(=O)-, >N-C(=O)-O-, -O-C(=O)-N<, >N-C(=O)-N(R_b)-, -N(R_a)-C(=O)-N<, -SO₂-N< und >N-SO₂-, wobei < und > zwei Bindun gen repräsentieren, die CTBF-Teil A, B, C oder D mit dem einzelnen N- oder C-Atom in LG₃ oder LG₄ verknüpfen,
R_a und R_b unabhängig voneinander aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind: Wasserstoff, C₁-C₁₀-Alkyl, C₀-C₁₀-Alkyl-C₆-C₁₀-Aryl, C₆-C₁₀-Aryl-C₀-C₁₀-Alkyl, C₀-C₁₀-Alkyl-Heterozyklus-C₀-C₁₀-Alkyl, C₁-C₆-Alkyl-NH-C₁-C₆-Alkyl, C₀-C₁₀-Alkyl-O-C₀-C₁₀-Alkyl, C₀-C₁₀-Alkyl-C(=O)-C₀-C₁₀-Alkyl, C₀-C₁₀-Alkyl-NH-C(=O)-C₀-C₁₀-Alkyl, C₀-C₁₀-Alkyl-O-C(=O)-C₀-C₁₀-Alkyl, wobei jedes Alkyl, jedes Aryl oder jeder Heterozyklus optional mit C₁-C₁₀-Alkyl, C₁-C₁₀-Alkoxy, C₆-C₁₀-Aryl, C₆-C₁₀-Aryloxy, Halogen (F, Cl, Br, I), Hydroxy, Carboxy, Amino, Nitro und S(O)_0-3 substituiert ist,
TBF_m, TBF_n, TBF_m-Teil A, TBF_m-Teil B, TBF_n-Teil C und TBF_n-Teil D jeweils unabhängig voneinander durch Formel I repräsentiert werden -A-(Zyklus 1)-B-(Zyklus 2)-E (I)wobei
Zyklus 1 und Zyklus 2 unabhängig voneinander vorhanden oder nicht vorhanden sind und unter einem mono-, bi- oder trizyklischen gesättigten, ungesättigten oder aromatischen Ring ausgewählt sind, wobei jeder Ring 5, 6 oder 7 Ringatome enthält, wobei die Ringatome Kohlenstoff oder 1-4 Heteroatome sind, ausgewählt unter Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel, und wobei jedes Schwefelringatom optional oxidiert sein kann und jedes Kohlenstoffringatom eine Doppelbindung mit O, NRⁿ und CR¹R¹ bilden kann, wobei jeder Stickstoff in dem Ring mit Rⁿ substituiert sein kann und jeder Kohlenstoff in dem Ring mit R^d substituiert sein kann,
A und B unabhängig voneinander ausgewählt sind unter
wobei:
L¹ nicht vorhanden ist oder unter Oxo (O), S(O)_S, C(=O), C(=N-Rⁿ), C(=CR¹R^1'), C(R¹R^1'), C(R¹), C, Het, N(Rⁿ) oder N ausgewählt sein kann,
L² nicht vorhanden ist oder unter Oxo (O), S(O)_S, C(=O), C(=N-Rⁿ), C(=CR²R^2'), C(R²R^2'), C(R²), C, Het, N(Rⁿ) oder N ausgewählt sein kann,
L³ nicht vorhanden ist oder unter Oxo (O), S(O)_S, C(=O), C(=N-Rⁿ), C(=CR³R^3'), C(R³R^3'), C(R³), C, Het, N(Rⁿ) oder N ausgewählt sein kann,
L⁴ nicht vorhanden ist oder unter Oxo (O), S(O)_S, C(=O), C(=N-Rⁿ), C(=CR⁴R^4'), C(R⁴R^4'), C(R⁴), C, NRⁿ oder N ausgewählt sein kann,
L⁵ nicht vorhanden ist oder unter Oxo (O), S(O)_S, C(=O), C(=N-Rⁿ), C(R⁵R^5'), C(=CR⁵R^5'), C(R⁵), C, NRⁿ oder N ausgewählt sein kann,
R¹, R^1', R², R^2', R³, R^3', R⁴, R^4', R⁵ und R^5' jeweils unabhängig voneinander unter R^a, R^a', R^c und U-Q-V-W ausgewählt sind, wobei s 0-2 ist.
Optional kann jeder R¹-R⁵ oder NRⁿ zusammen mit jedem anderen R¹-R⁵ oder NRⁿ einen mono-, bi- oder trizyklischen gesättigten, ungesättigten oder aromatischen Ring bilden, wobei jeder Ring ein Homo- oder Heterozyklus mit 5, 6 oder 7 Ringatomen ist, jeder Ring optional 1-4 Heteroatome, ausgewählt unter N, O und S, enthält, wobei jeder Kohlenstoff in dem Ring oder jedes Schwefelatom optional oxidiert, jeder Stickstoff in dem Ring optional mit Rⁿ substituiert und jeder Kohlenstoff in dem Ring optional mit R^d substituiert sein kann,
E -L¹-L²-L³-R^a ist,
R^a aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Wasserstoff, Halogen (F, Cl, Br, I), Halogen (F-Cl-Br-I)-C₁-C₁₁-Alkyl, Halogen (F, Cl, Br, I)-C₁-C₁₁-Alkoxy, Hydroxy-C₁-C₁₁-Alkyl, Cyano, Isocyanat, Carboxy-C₀-C₁₁-Alkyl, Amino, C₀-C₁₁-Alkylamino-(C₁-C₈-Alkyl), C₀-C₁₁-Alkylaminodi-(C₁-C₈-Alkyl), Aminocarbonyl, C₁-C₁₁-Alkylcarbonylamino, Carboxamido, Carbamoyl, Carbamoyloxy, Formyl, Formyloxy, Azido, Nitro, Hydrazid, Hydroxamsäure, Imidazoyl, Ureido, Thioureido, Thiocyanato, Hydroxy, C₁-C₆-Alkoxy, Mercapto, Sulfonamido, Het, Phenoxy, Phenyl, Benzyl, Benzyloxy, Benzamido, Tosyl, Morpholino, Morpholinyl, Piperazinyl, Piperidinyl, Pyrrolinyl, Imidazolyl und Indolyl,
R^a' aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: C₀-C₁₀-Alkyl-Q-C₀-C₆-Alkyl, C₀-C₁₀-Alkenyl-Q-C₀-C₆-Alkyl, C₀-C₁₁-Alkinyl-Q-C₀-C₁₁-Alkyl, C₃-C₁₁-Cycloalkyl-Q-C₀-C₆-Alkyl, C₃-C₁₀-Cycloalkenyl-Q-C₀-C₆-Het-Q-C₀-C₆-Alkyl, C₀-C₆-Alkyl-Q-Het-C₀-C₆-Alkyl, Het-C₀-C₆-Alkyl-Q-C₀-C₆-Alkyl, C₀-C₆-Alkyl-Q-C₆-C₁₂-Aryl und Q-C₁-C₆-Alkyl, wobei jedes Aryl oder jeder Het optional mit 1-3 R^d substituiert ist und jedes Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl optional mit 1-3 R^a substituiert ist,
R^a und R^a' sich unter Bildung eines 3- bis 7-gliedrigen homozyklischen Rings, der mit 1-3 R^a substituiert ist, verbinden können,
R^c ausgewählt ist unter Wasserstoff und substituiertem oder unsubstituiertem Amino, O-C₁-C₈-Alkyl, Amino-(C₁-C₈-Alkyl), Aminodi-(C₁-C₈-Alkyl), C₁-C₁₀-Alkyl, C₂-C₁₀-Alkenyl, C₂-C₁₀-Alkinyl, C₃-C₁₁-Cycloalkyl, C₃-C₁₀-Cycloalkenyl, C₁-C₆-Alkyl-C₆-C₁₂-Aryl, C₆-C₁₀-Aryl-C₁-C₆-Alkyl, C₁-C₆-Alkyl-Het, Het-C₁-C₆-Alkyl, C₆-C₁₂-Aryl und Het, wobei die Substituenten an jedem Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl 1-3 R^a sind und die Substituenten an jedem Aryl oder jeder Het 1-3 R^d sind,
R^d unter R^h und R^p ausgewählt ist,
R^h aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: OH, OCF₃, OR^c, SR^m, Halogen (F, Cl, Br, I), CN, Isocyanat, NO₂, CF₃, C₀-C₆-Alkyl-NRⁿR^n', C₀-C₆-Alkyl-C(=O)-NRⁿR^n', C₀-C₆-Alkyl-(C=O)-R^a, C₁-C₈-Alkyl, C₁-C₈-Alkoxy, C₂-C₈-Alkenyl, C₂-C₈-Alkinyl, C₃-C₆-Cycloalkyl, C₃-C₆-Cycloalkenyl, C₁-C₆-Alkylphenyl, Phenyl-C₁-C₆-Alkyl, C₁-C₆-Alkyloxycarbonylamino, C₁-C₆-Alkyloxycarbonyl-C₀-C₆-Alkyl, Phenyl-C₀-C₆-Alkyloxy, C₁-C₆-Alkyl-Het, Het-C₁-C₆-Alkyl, SO₂-Het, O-C₆-C₁₂-Aryl, SO₂-C₆-C₁₂-Aryl, SO₂-C₁-C₆-Alkyl und Het, wobei jedes Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl optional mit 1-3 Gruppen, ausgewählt unter OH, Halogen (F, Cl, Br, I), Nitro, Amino und Aminocarbonyl, substituiert sein kann, wobei die Substituenten an jedem Aryl oder jedem Het 1-2-Hydroxy, Halogen (F, Cl, Br, I), CF₃, C₁-C₆-Alkyl, C₁-C₆-Alkoxy, Nitro und Amino sind,
R^m ausgewählt ist unter Wasserstoff, S-C₁-C₆-Alkyl, C(=O)-C₁-C₆-Alkyl, C(=O)-NRⁿR^n', C₁-C₆-Alkyl, Halogen (F, Cl, Br, I)-C₁-C₆-Alkyl, Benzyl und Phenyl,
Rⁿ aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: R^c, OH, OCF₃, OR^o, CN, Isocyanat, NH-C(=O)-O-R^c, NH-C(=O)-R^c, NH-C(=O)-NHR^c, NH-SO₂-R^s, NH-SO₂-NH-C(=O)-R^c, NH-C(=O)-NH-SO₂-R^s, C(=O)-O-R^o, C(=O)-R^c, C(=O)-NHR^c, C(=O)-NH-C(=O)-O-R^o, C(=O)-NH-C(=O)-R^c, C(=O)-NH-SO₂-R^s, C(=O)-NH-SO₂-NHR^c, SO₂-R^s, SO₂-O-R^o, SO₂-N(R^c)₂, SO₂-NH-C(=O)-O-R^o, SO₂-NH-C(=O)-O-R^o und SO₂-NH-C(=O)-R^c,
R^o ausgewählt ist unter Wasserstoff und substituiertem oder unsubstituiertem C₁-C₆-Alkyl, C₀-C₆-Alkyl-C₆-C₁₀-Aryl, C₁-C₆-Alkylcarbonyl, C₂-C₆-Alkenyl, C₂-C₆-Alkinyl, C₃-C₈-Cycloalkyl und Benzoyl, wobei die Substituenten an jedem Alkyl 1-3 R^a sind und die Substituenten an jedem Aryl 1-3 R^p sind,
R^p aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: OH, COOH, COH, NH₂, C₀-C₆-Alkyl, Halogen (F, Cl, Br, I), CN, Isocyanat, OR^o, SR^m, SOR^o, NO₂, CF₃, R^c, NRⁿR^n', N(Rⁿ)-C(=O)-O-R^o, N(Rⁿ)-C(-O)-R^c, SO₂-R^s, C₀-C₆-Alkyl-SO₂-R^s, C₀-C₆-Alkyl-SO₂-NRⁿR^n', C(=O)-R^c, O-C(=O)-R^c, C(=O)-O-R^o und C(=O)-NRⁿR^n', wobei die Substituenten an jedem Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl 1-3 R^a sind und die Substituenten an jedem Aryl oder jeder Het 1-3 R^d sind,
R^s eine substituierte oder unsubstituierte Gruppe ist, ausgewählt unter: C₁-C₈-Alkyl, C₂-C₈-Alkenyl, C₂-C₈-Alkinyl, C₃-C₈-Cycloalkyl, C₃-C₆-Cycloalkenyl, C₀-C₆-Alkyl-C₆-C₁₀-Aryl, C₆-C₁₀-Aryl-C₀-C₆-Alkyl, C₀-C₆-Alkyl-Het und Het-C₀-C₆-Alkyl, wobei die Substituenten an jedem Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl 1-3 R^a sind und die Substituenten an jedem Aryl oder jedem Het 1-3 R^d sind,
Het irgendein mono-, bi- oder trizyklischer gesättigter, ungesättigter oder aromatischer Ring ist, wobei wenigstens ein Ring ein 5-, 6- oder 7-gliedriger Ring ist, der ein bis vier Heteroatome enthält, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel, wobei der 5-gliedrige Ring 0 bis 2 Doppelbindungen enthält und der 6- oder 7-gliedrige Ring 0 bis 3 Doppelbindungen enthält und wobei alle Kohlenstoff- oder Schwefelatome in dem Ring optional oxidiert sein können, und wobei jedes Stickstoffheteroatom optional quaternisiert sein kann und jeder Ring von 0-3 R^d enthalten kann,
U eine optional substituierte zweiwertige Gruppe ist, ausgewählt aus der Gruppe: C₁-C₆-Alkyl, C₀-C₆-Alkyl-Q, C₂-C₆-Alkenyl-Q und C₂-C₆-Alkinyl-Q, wobei die Substituenten an jedem Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl 1-3 R^a sind,
Q nicht vorhanden ist oder aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: -O-, -S(O)_s-, -SO₂-N(Rⁿ)-, -N(Rⁿ)-, -N(Rⁿ)-C(=O)-, -N(Rⁿ)-C(=O)-O-, -N(Rⁿ)-SO₂-, -C(=O)-, -C(=O)-O-, -Het-, -C(=O)-N(Rⁿ)-, -PO(OR^c)O- und -P(O)O-, wobei s 0-2 ist und der heterozyklische Ring mit 0-3 R^h substituiert ist,
V nicht vorhanden ist oder eine optional substituierte zweiwertige Gruppe ist, ausgewählt unter C₁-C₆-Alkyl, C₃-C₈-Cycloalkyl, C₀-C₆-Alkyl-C₆-C₁₀-Aryl und C₀-C₆-Alkyl-Het, wobei die Substituenten an jedem Alkyl 1-3 R^a sind und die Substituenten an jedem Aryl oder Het 1-3 R^d sind,
W aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Wasserstoff, -OR^o, -SR^m, -NRⁿR^n', -NH-C(=O)-O-R^o, -NH-C(=O)-NRⁿR^n', -NH-C(=O)-R^o, -NH-SO₂-R^s, -NH-SO₂-NRⁿR^n', -NH-SO₂-NH-C(=O)-R^c, -NH-C(=O)-NH-SO₂-R^s, -C(=O)-NH-C(=O)-O-R^o, -C(=O)-NH-C(=O)-R^c, -C(=O)-NH-C(=O)-NRⁿR^n', -C(=O)-NH-SO₂-R^s, -C(=O)-NH-SO₂-NRⁿR^n', -C(=S)-NRⁿR^n', -SO₂-R^s, -SO₂-O-R^o, -SO₂-NRⁿR^n', -SO₂-NH-C(=O)-O-R^o, -SO₂-NH-C(=O)-NRⁿR^n', -SO₂-NH-C(=O)-R^c, -O-C(=O)-NRⁿR^n', -O-C(=O)-R^c, -O-C(=O)-NH-C(=O)-R^c, -O-C(=O)-NH-SO₂-R^s und -O-SO₂-R^s.
Optional können TBF_m-Teil A zusammen mit TBF_m-Teil B und TBF_n-Teil C zusammen mit TBF_n-Teil D unabhängig voneinander Zyklus 1 bilden, der mit -B-(Zyklus 2)-E substituiert ist.
Ein Arzneimittel-Leitsubstanz-Vorläufer oder -Zwischenprodukt dieser Erfindung wird durch C₀-C₂-Alkyl-L¹-L²-L³-L⁴-L⁵-C₀-C₂-Alkyl repräsentiert, wobei L¹ bis L⁵ wie oben definiert sind. Zusätzliche Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ergeben sich für einen Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet beim Studium der vorliegenden Beschreibung.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine Vergleichs-Synthesereaktion, bei der ein Aldehyd unter Bildung einer O-Methyloximverbindung mit O-Methylhydroxylamin umgesetzt wird.
2 zeigt eine Mehrzahl von organischen Aldehydpharmakophor-Vergleichsmolekülen, bei denen nach Umwandlung in)-Methyloxime herausgefunden wurde, daß sie die Wechselwirkung zwischen CD4 und gp120 hemmen können.
3 zeigt eine Vergleichschemie, die für das chemische Koppeln zweier Aldehyde über einen O,O'-Diaminoalkandiol-Linker unter Bildung sowohl heterodimerer als auch homodimerer Oximverbindungen geeignet ist.
4 zeigt eine Mehrzahl von Aldehyd-Vergleichspharmakophoren, von denen herausgefunden wurde, daß sie in dimerer Form beim Hemmen der Wechselwirkung zwischen CD4 und gp120 überaus effizient sind.
5 zeigt eine O-Methyl-Oximvergleichsverbindung, von der herausgefunden wurde, daß sie in dimerer Form beim Hemmen der Wechselwirkung zwischen CD4 und gp120 überaus effizient ist.
6 zeigt einen spezifischen Vergleichsliganden mit besonders hoher Aktivität zum Hemmen der Wechselwirkung zwischen CD4 und gp120.
7 zeigt eine Vergleichs-Synthesereaktion, bei der ein Aldehyd mit einem Dimethylamin in der Gegenwart von trägergebundenem Triacetoxyborhydrid umgesetzt wird, wodurch eine organische N,N-Dimethylaminverbindung entsteht.
8 zeigt eine Vergleichsabfolge der chemischen Synthese, die zur Erzeugung eines Uganden der vorliegenden Erfindung führt.
9 zeigt ein Flußdiagramm für die Abfolge der Zusammensetzung der Fragmente, die zur Erzeugung einer Arzneimittel-Leitverbindung der vorliegenden Erfindung führt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
I. Allgemeine Beschreibung
Die vorliegende Erfindung liefert ein schnelles und effizientes Verfahren zum Identifizieren von Kleinmolekül-Zielbindungsfragmentkandidaten oder -ligandenkandidaten, die mit hoher Affinität an interessierende biologische Zielmoleküle (TBM) binden können. Die durch das vorliegende Verfahren identifizierten Verbindungen finden beispielsweise als Arzneimittel-Leitverbindungen für die Entwicklung neuer therapeutischer Arzneimittel Anwendung. Das vorliegende Verfahren umfaßt den Aufbau einer Bibliothek aus kleinen organischen Zielbindungsfragmentkandidaten, die über ein Linkerelement chemisch verknüpft werden können. Die Bibliothek aus organischen Zielbindungsfragmentkandidaten kann "vorgescreent" werden, um Mitglieder der Bibliothek zu identifizieren, die an ein biologisches Zielmolekül binden können. Wenigstens ein Teil der kleinen organischen Zielbindungsfragmentkandidaten, von denen während des "Vorscreenings" herausgefunden wurde, daß sie an das Ziel binden können, wird dann in verschiedenen Kombinationen unter Bereitstellung einer Bibliothek potentieller verknüpfter Zielbindungsfragmente oder verknüpfter Zielbindungsfragmentkandidaten für die Bindung an das biologische Zielmolekül chemisch miteinander verknüpft. Die Bibliothek von verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten, die potentiell Antagonisten (oder Agonisten) mit hoher Affinität sein können, werden dann gescreent, um Arzneimittel-Leitverbindungen zu identifizieren, die mit hoher Affinität an das biologische Zielmolekül binden. Die Stufe des "Vorscreenens" der Bibliothek kleiner organischer Zielbindungsfragmentkandidaten, um diejenigen zu identifizieren, die an das Ziel binden können, ermöglicht es, die Bibliothek potentieller Bindungsliganden auf nur diejenigen zu beschränken, die aus den günstigsten Bausteinen von organischen Zielbindungsfragmentkandidaten bestehen, wodurch die erforderliche Komplexität der Bibliothek potentieller Liganden reduziert wird, während gleichzeitig die Wahrscheinlichkeit, daß ein Molekül mit hoher Bindungsaffinität für das biologische Zielmolekül identifiziert wird, erhöht wird.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Identifizieren einer Arzneimittel-Leitverbindung, die an ein interessierendes biologisches Zielmolekül bindet. Das vorliegende Verfahren umfaßt den Aufbau einer Bibliothek eines bzw. von organischen Zielbindungsfragmentkandidaten, der bzw. die über einen chemisch kompatiblen Cross-Linker chemisch verknüpft werden können, um (einen) verknüpfte(n) Zielbindungsfragmentkandidaten für die Bindung an das biologische Zielmolekül bereitzustellen. In dieser Hinsicht ist der Ausdruck "Aufbau einer Bibliothek organischer Zielbindungsfragmentkandidaten" breit zu interpretieren und soll alle Mittel umfassen, mit denen man eine Bibliothek, die zwei oder mehr organische Verbindungen umfaßt, erhalten kann und die beispielsweise das Erhalten solcher Verbindungen von einer kommerziellen oder nicht-kommerziellen Quelle, das Synthetisieren solcher Verbindungen unter Verwendung standardmäßiger chemischer Synthesetechniken oder einer kombinatorischen Synthesetechnik (siehe Gallop et al. (1994), a.a.O., Gordon et al., (1994), a.a.O., Czarnik und Ellman (1996), a.a.O., Thompson und Ellman (1996), a.a.O. und Balkenhohl et al. (1996), a.a.O.) und das Erhalten solcher Verbindungen als Abbauprodukte aus größeren Vorläuferverbindungen, z.B. bekannten therapeutischen Arzneimitteln, großen chemischen Molekülen und dergleichen, umfaßt.
Die Zielbindungsfragmentkandidaten (CTBF) sind größtenteils kleine wasserlösliche organische Moleküle, die eine oder mehrere chemisch reaktive Funktionalitäten aufweisen, die als verknüpfbare funktionelle (oder funktionelle Verknüpfungs-) Gruppen (LFG) bezeichnet werden (oder Stellen, die unter Verwendung von Standardtechniken leicht in eine chemisch reaktive Funktionalität umgewandelt werden können (BLFG)), die eine Stelle für die Kopplung einer anderen Verbindung oder eines anderen Zielbindungsfragmentkandidaten über einen chemisch kompatiblen Cross-Linker liefern und wobei die LFG oder die BLFG eine Disulfid-Linker-Gruppe (LG) enthält. Somit können die Zielbindungsfragmentkandidaten der vorliegenden Erfindung über einen Cross-Linker chemisch miteinander gekoppelt werden, um verknüpfte Zielbindungsfragmentkandidaten für die Bindung an das biologische Zielmolekül bereitzustellen, was bedeutet, daß die Zielbindungsfragment-Kandidatenverbindungen eine reaktive Funktionalität oder eine Stelle, die leicht chemisch in eine reaktive Funktionalität umgewandelt werden kann, aufweisen, wobei ein chemisch kompatibler Cross-Linker kovalent daran binden kann, wodurch eine Multimerisierung der Zielbindungsfragmentkandidaten durch den Cross-Linker ermöglicht wird. "Liganden"; "Kandidatenliganden" oder "verknüpfte Zielbindungsfragmentkandidaten" für die Bindung an ein "biologisches Zielmolekül" für die vorliegenden Zwecke sind Verbindungen, die durch Umsetzen zweier oder mehrerer organischer Verbindungen, die die gleichen oder verschieden sein können und vorzugsweise verschieden sind, mit einem oder mehreren Cross-Linkern erhalten werden, wodurch ein Molekül erzeugt wird, welches zwei oder mehrere Zielbindungsfragmente und einen oder mehrere Cross-Linker umfaßt. Solche Liganden werden hier als verknüpfte Zielbindungsfragmentkandidaten (CXL-TBF) bezeichnet.
Zielbindungsfragmentkandidaten, bei denen die funktionelle Linker-Gruppe modifiziert oder blockiert ist, so daß sie im wesentlichen die gleiche Linker-Gruppe enthalten, wie sie in den verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten zu finden ist, werden manchmal als Monomere bezeichnet. Monomere oder monomere Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung Verwendung finden, umfassen beispielsweise Aldehyde, Ketone, Oxime, wie O-Alkyloxime, vorzugsweise O-Methyloxime, Hydrazone, Semicarbazone, Carbazide, primäre Amine, sekundäre Amine, wie N-Methylamine, tertiäre Amine, wie N,N-Dimethylamine, N-substituierte Hydrazine, Hydrazide, Alkohole, Ether, Thiole, Thioether, Thioester, Disulfide, Carbonsäuren, Ester, Amide, Harnstoffe, Carbamate, Carbonate, Ketale, Thioketale, Acetale, Thioacetale, Arylhalogenide, Arylsulfonate, Alkylhalogenide, Alkylsulfonate, aromatische Verbindungen, heterozyklische Verbindungen, Aniline, Alkene, Alkine, Diole, Aminoalkohole, Oxazolidine, Oxazoline, Thiazolidine, Thiazoline, Enamine, Sulfonamide, Epoxide und Aziridine und dergleichen, die alle chemisch reaktive Funktionalitäten aufweisen (oder direkt aus Vorläuferverbindungen hergestellt sind, die chemisch reaktive Funktionalitäten aufweisen) und entweder direkt oder indirekt an einen Cross-Linker binden können. Tatsächlich kann nahezu jedes kleine organische Molekül, welches chemisch an ein anderes kleines organisches Molekül gekoppelt werden kann, in der vorliegenden Erfindung Verwendung finden, mit der Maßga be, daß es in wäßrigen Lösungen ausreichend löslich ist, um auf seine Fähigkeit zur Bindung an ein biologisches Zielmolekül getestet zu werden.
Die oben beschriebenen Monomere oder Zielbindungsfragmentkandidaten dienen als die einzelnen Bausteine für daraus hergestellte verknüpfte Zielbindungsfragmentkandidaten. Zielbindungsfragmentkandidaten, die hier Verwendung finden, haben im allgemeinen eine Größe von weniger als etwa 2000 Dalton, für gewöhnlich von weniger als etwa 1500 Dalton, üblicher von weniger als etwa 750 Dalton, bevorzugt von weniger als etwa 500 Dalton, oft von weniger als etwa 250 Dalton und häufiger von weniger als etwa 200 Dalton, obwohl hier auch organische Moleküle mit einer Größe von mehr als 2000 Dalton Anwendung finden. Zielbindungsfragmentkandidaten, die in dem hier beschriebenen Verfahren Verwendung finden, können entweder ursprünglich aus einer kommerziellen oder nicht-kommerziellen Quelle erhalten worden sein (beispielsweise ist eine große Anzahl kleiner organischer chemischer Verbindungen, die als Zielbindungsfragmentkandidaten dienen, leicht von kommerziellen Lieferanten, wie Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, und Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, erhältlich), oder sie können mittels chemischer Synthese erhalten werden. Beispiele für letztere umfassen die Herstellung einer Bibliothek organischer Oximverbindungen aus einer einstufigen Kondensation kommerziell erhältlicher Aldehyde mit O-Alkylhydroxylamin, wie es in Beispiel I unten beschrieben ist, und die Herstellung einer Bibliothek von verknüpften N,N-Dimethylamin-Zielbindungsfragmentkandidaten aus der reduktiven Aminierung von kommerziell erhältlichen Aldehyden und Dimethylamin unter Verwendung von trägergebundenem Triacetoxyborhyrid, wie es in Beispiel II unten und von Kaldor et al., Tetrahedron Lett. 37:7193-7196 (1996) beschrieben ist.
Bibliotheken von Zielbindungsfragmentkandidaten oder verknüpften Zielbindungsfragment kandidaten, die hierin Verwendung finden, umfassen im allgemeinen wenigstens 2 organische Verbindungen, oft wenigstens etwa 25 verschiedene organische Verbindungen, häufiger wenigstens etwa 100 verschiedene organische Verbindungen, üblicherweise wenigstens etwa 500 verschiedene organische Verbindungen, üblicher wenigstens etwa 1000 verschiedene organische Verbindungen, bevorzugt wenigstens etwa 2500 verschiedene organische Verbindungen, bevorzugter wenigstens etwa 5000 verschiedene organische Verbindungen und am meisten bevorzugt wenigstens etwa 10.000 oder mehr verschiedene organische Verbindungen. Die Bibliotheken können so ausgewählt, oder konstruiert sein, daß jedes einzelne Molekül in der Bibliothek räumlich von den anderen Molekülen der Bibliothek getrennt sein kann (z.B. liegt jedes Mitglied der Bibliothek in einem separaten Mikrotiterwell vor) oder zwei oder mehr Mitglieder der Bibliothek vereinigt werden können, wenn Verfahren zu deren Dekonvolution leicht verfügbar sind. Die Verfahren, mit denen die Bibliothek der organischen Verbindungen hergestellt wird, sind für die Erfindung nicht kritisch.
Sobald sie aufgebaut wurde, wird eine Bibliothek organischer Zielbindungsfragmentkandidaten unter Verwendung eines Tests aus irgendeiner Anzahl verschiedener bekannter Tests gescreent, um verknüpfte Zielbindungsfragmentkandidaten zu identifizieren, die an ein interessierendes biologisches Zielmolekül binden können. "Biologische Zielmoleküle", "biologische angezielte Moleküle", "Ziel-Biomoleküle", "Zielmoleküle", "biologische Ziele" und andere grammatikalische Äquivalente bezeichnen biologische Zielmoleküle (TBM), die in ausreichenden Mengen zur Verwendung in Bindungstests in vitro erhältlich sind (entweder kommerziell, durch Rekombination, Synthese oder in anderer Weise) und bei denen einiges Interesse daran besteht, einen Bindungspartner mit hoher Affinität zu identifizieren. Zum größten Teil sind biologische Zielmoleküle Proteine, einschließlich menschlicher Proteine oder menschlicher pathogener Proteine, die mit einem Erkrankungszustand in Menschen assoziiert sein können, wie Zelloberflächen- und lösliche Rezeptorproteine, wie Lymphozyten-Zelloberflächenrezeptoren, Enzyme, wie Proteasen, Gerinnungsfaktoren, Serin/Threonin-Kinasen und -dephosphorylasen, Tyrosinkinasen und -dephosphorylasen, bakterielle Enzyme, Pilzenzyme und virale Enzyme, Signalübertragungsmoleküle, Transkriptionsfaktoren, Proteine, die mit DNA- und/oder RNA-Synthese oder -Abbau assoziiert sind, Immunglobuline, Hormone, Rezeptoren für verschiedene Zytokine, einschließlich beispielsweise Erythropoietin/EPO, Granulozytenkoloniestimulierendem Rezeptor, Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierendem Rezeptor, Thrombopoietin (TPO), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-11, IL-12, Wachstumshormon, Prolactin, menschlichem Plazenta-Lactogen (LPL), CNTF, Octostatin, verschiedene Chemokine und deren Rezeptoren, wie RANTES, MIP1-α, IL-8, verschiedene Liganden und Rezeptoren für Tyrosinkinasen, wie Insulin, Insulin-artiger Wachstumsfaktor 1 (IGF-1), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Heregulin-α und Heregulin-β, vaskulärer Endothelwachstumsfaktor (VEGF), Plazentawachstumsfaktor (PLGF), Gewebewachstumsfaktoren (TGF-α und TGF-β), anderer Hormone und Rezeptoren, wie Knochen-morphogenenetische Faktoren, follikelstimulierendem Hormon (FSH) und Leutenisierungshormon (LH), Gewebenekrosefaktor (TNF), Apoptosefaktor-1 und -2 (AP-1 und AP-2) und Proteine und Rezeptoren, die 20% oder mehr Sequenzidentität zu diesen aufweisen, und dergleichen, Nukleinsäuren, einschließlich sowohl DNA als auch RNA, Saccharidkomplexen und dergleichen.
Für die Stufe(n) des Screenens von Bibliotheken von Zielbindungsfragmentkandidaten oder verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten für Mitglieder, die an ein interessierendes biologisches Zielmolekül binden können, kann ein einfacher ELISA-Test verwendet werden, um (a) (ein) Mitglieder) der Bibliothek zu identifizieren, das in der Lage ist bzw. die in der Lage sind, an das Ziel zu binden, und (b) den ungefähren K_d zu bestimmen, mit dem das Mitglied (die Mitglieder) der Bibliotheken an das Zielmolekül bindet (binden). Während ELISA-Tests zum Screenen von Bibliotheken organischer Verbindungen bevorzugt sind, kann praktisch jeder in vitro-Test, der das Detektieren von Bindungen des biologischen Zielmoleküls durch eine organische Verbindung ermöglicht, zum Screenen der Bibliothek verwendet werden, wobei solche Tests ELISA, andere Sandwich-Bindungstests, Bindungstests, die markierte Moleküle, wie radioaktiv oder fluoreszierend markierte Moleküle verwenden, Fluoreszenzdepolarisierung, Kalorimetrie, Proteindenaturierung, Resistenz gegen Proteolyse, Gelfiltration, Gleichgewichtsdialyse, Oberflächenplasmonresonanz, Röntgenkristallographie und dergleichen umfassen. Solche Tests messen entweder die Fähigkeit von Mitgliedern der Bibliothek, direkt an das biologische Zielmolekül zu binden, oder es handelt sich um kompetitive Bindungstests, die dafür ausgestaltet sind, die Fähigkeit der Mitglieder der Bibliothek, die Wechselwirkung zwischen dem biologischen Zielmolekül und einem anderen Molekül, welches an das biologische Zielmolekül bindet, zu hemmen. Jeder der obigen Tests kann verwendet werden, um Bibliotheken von Kandidatenverbindungen zu screenen, um diejenigen zu identifizieren, die an ein biologisches Zielmolekül binden.
Für die Stufe des Screenens einer Bibliothek von Kandidatenverbindungen, um diejenigen zu identifizieren, die an ein biologisches Zielmolekül binden, liegt es für einen Fachmann auf dem Gebiet auf der Hand, die Konzentration der Mitglieder der Bibliothek, die in dem Bindungstest verwendet werden sollen, zu bestimmen. Größtenteils verwenden die Screeningtests Konzentrationen von Kandidatenverbindungen im Bereich von etwa 0,01 bis 10 mM, bevorzugt von etwa 0,05 bis 5 mM.
Die Stufe des Vorscreenens einer Bibliothek von Zielbindungsfragmentkandidaten, um diejenigen zu identifizieren, die an ein biologisches Zielmolekül binden, ermöglicht es, nur diejenigen Mitglieder der Bibliothek zu identifizieren und zu isolieren, die eine gewisse Bindungsaffinität für das Ziel besitzen. Hier werden die kleinen organischen Bausteine im Gegensatz zu standardmäßigen Ansätzen mit kombinatonschen Bibliotheken "vorgescreent", um einen kleineren Satz von Verbindungen zu selektieren, die eine gewisse Bindungsaffinität für das Ziel besitzen. So können die produktivsten Bausteine von organischen Verbindungen für die Aufnahme in die daraus hergestellten potentiellen verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten mit hoher Affinität identifiziert werden, ohne daß alle möglichen Kombinationen aller anfänglichen Bausteine von Zielbindungsfragmentkandidaten gescreent werden müssen. Im allgemeinen sind die Mitglieder der Bibliotheken von Zielbindungsfragmentkandidaten, die als Bausteine für die nachfolgend hergestellten verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten selektiert werden, diejenigen mit der höchsten Affinität für eine Bindung an das biologische Zielmolekül. Größenteils sind Zielbindungsfragmentkandidaten, die als Bausteine für die Aufnahme in die nachfolgend hergestellten verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten selektiert werden, diejenigen, die mit einem K_d von etwa 10 mM oder weniger, für gewöhnlich etwa 5 mM oder weniger, üblicher etwa 1 mM oder weniger, bevorzugt etwa 500 μM oder weniger, bevorzugter etwa 100 μM oder weniger und am meisten bevorzugt etwa 50 μM oder weniger, an das biologische Zielmolekül binden. Für einige Anwendungsfälle kann jedoch eines oder können mehrere der Zielbindungsfragmentkandidaten, die für die Aufnahme in die nachfolgend hergestellten verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten ausgewählt wurden, einen individuellen K_d für das biologische Zielmolekül haben, der größer als 10 mM ist.
Sobald Zielbindungsfragmentkandidaten identifiziert wurden, die mit einem gewünschten Grad an Affinität an ein biologisches Zielmolekül binden, wird wenigstens ein Teil dieser Verbindungen (oder strukturell verwandter Analoger davon) über einen Cross-Linker chemisch gekoppelt, um eine Bibliothek von verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten für die Bindung an das biologische Zielmolekül bereitzustellen, wobei diese verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten wenigstens einen Zielbindungsfragmentkandidaten umfassen, der mit einem Cross-Linker umgesetzt oder verknüpft wurde. Für gewöhnlich werden zwei oder mehrere Zielbindungsfragmentkandidaten (oder strukturell verwandte Analoge davon), die durch einen Cross-Linker verknüpft sind, kombiniert, und in manchen Fällen sind diese beiden Fragmente die gleichen. Die zwei (oder mehreren) Zielbindungsfragmentkandidaten (oder strukturell verwandten Analogen davon), die in einen verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten aufgenommen sind, können die gleichen (d.h. um ein Homodimer oder Homomultimer bereitzustellen) oder verschieden (d.h. um ein Heterodimer oder ein Heteromultimer bereitzustellen) sein. Meistens sind die beiden Zielbindungsfragmentkandidaten in dem verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten verschieden.
"Strukturell verwandtes Analoges", "Analogon" und dergleichen bedeutet ein Verbindungsfragment, welches die gleiche chemische Struktur hat wie ein Fragment, von dem herausgefunden wurde, daß es an das biologische Zielmolekül binden kann, mit der Ausnahme, daß das Analoge eine andere chemisch reaktive Funktionalität oder eine andere funktionelle Linker-Gruppe (LFG) für die Bindung an den Cross-Linker hat als das Fragment, von dem im ersten Screening oder Vorscreening herausgefunden wurde, daß es an das biologische Zielmolekül binden kann. Das Analoge kann optional auch einen oder mehrere Substituenten aufweisen oder nicht aufweisen, die an den im Vorscreening identifizierten Fragmenten vorliegen bzw. fehlen, vorausgesetzt, daß das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein dieser Substituenten die Fähigkeit der Verbindungen zur Bindung an das Ziel nicht wesentlich verändert. Während es möglich ist, eine Bibliothek beispielsweise von Kandidaten-Oximverbindungen vorzuscreenen, um Kandidaten-Oximfragmente zu identifizieren, die an das biologische Zielmolekül binden, kann man somit nicht die tatsächlichen Oximverbindungen, die im 'Vorscreening" identifiziert wurden, chemisch koppeln, sondern vielmehr Aldehyde, die die gleichen chemischen Strukturen haben wie die im Screening identifizierten Oxime (die jedoch anstelle einer reaktiven Oximfunktionalität eine reaktive Aldehydfunktionalität aufweisen). Die vorliegende Erfindung umfaßt daher nicht nur das chemische Koppeln der tatsächlichen Verbindungen, die in der anfänglichen "Vorscreening"-Stufe identifiziert wurden (z.B. werden Aldehyde vorgescreent und anschließend auch verknüpft), sondern auch das chemische Koppeln strukturell verwandter Analoger dieser Verbindungen (z.B. werden Oxime vorgescreent, die analogen Aldehyde jedoch werden verknüpft).
Wie es oben beschrieben wurde, umfaßt ein Zielbindungsfragmentkandidat eine chemisch reaktive Funktionalität oder eine funktionelle Linker-Gruppe (LFG) (oder eine Stelle, die in eine chemisch reaktive Funktionalität (BLFG)), an die ein Cross-Linker kovalent gebunden werden kann, umgewandelt werden kann, wodurch ein Mittel zum Verknüpfen zweier oder mehrerer Zielbindungsfragmentkandidaten mit einer LFG (oder einer analogen oder blockierten Form davon) bereitgestellt wird, um einen Zielbindungsfragmentkandidaten zu liefern. Daher sind Cross-Linker, die hier Verwendung finden, multifunktionale, vorzugsweise bifunktionale Verknüpfungsmoleküle, die so funktionieren können, daß sie wenigstens zwei Fragmentverbindungen über deren reaktive Funktionalitäten oder LFGs kovalent aneinander binden. Linker oder Cross-Linker (XL) haben wenigstens eine, zwei oder mehr und vorzugsweise nur zwei chemisch kreuzreaktive funktionelle Gruppen (CFG) auf dem Cross-Linker (XL). Die chemisch kreuzreaktiven funktionellen Gruppen, die für die Bindung zweier oder mehrerer Zielbindungsfragmentkandidaten zur Verfügung stehen, wobei diese funktionellen Gruppen überall auf dem Cross-Linker, vorzugsweise an jedem Ende des Cross-Linkers, erscheinen können, und wobei diese chemisch kreuzreaktiven Gruppen in Abhängigkeit davon, ob der Zielbindungsfragmentkandidat verknüpft werden soll, gleich oder verschieden sein können, weisen die gleichen oder verschiedene chemisch kreuzreaktive funktionelle Gruppen auf. Cross-Linker, die hier Verwendung finden, können substituiertes oder unsubstituiertes geradekettiges oder verzweigtes Alkyl, Aryl, Alkaryl, Heteroaryl, Heterozyklen und dergleichen sein. Vorzugsweise ist geradkettiges Alkyl im allgemeinen wenigstens ein Methylen, allgemeiner 2 bis 8 Methylene lang, und optional kann es sogar etwa 12 oder mehr Methylene oder deren Äquivalent lang sein. Cross-Linker können Atome oder Gruppen beinhalten, um die Löslichkeit der Mitglieder der Bibliothek zu steigern oder zu verbessern, wie beispielsweise Sauerstoffatome, die zwischen Methylengruppen angeordnet sind, wodurch Ether- oder Polyetherlinker erzeugt werden. Cross-Linker umfassen im allgemeinen entweder gesättigte oder ungesättigte Alkylgruppen und können daher Alkane, Alkene oder Alkine umfassen. Heteroatome, einschließlich Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff und dergleichen, können unter Bildung von Gruppen, wie Alkoxyl-, Hydroxyalkyl- oder Hydroxygruppen, ebenfalls an das Alkyl angehängt sein. Andere Linker-Gruppen, wie Aryl-, insbesondere Phenylen- oder substituierte Phenylenlinker werden in geeigneter Weise eingesetzt. Für gewöhnlich haben Cross-Linker-Elemente variierende Längen, wodurch ein Mittel zum Optimieren der Bindungseigenschaften eines daraus hergestellten verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten bereitgestellt wird.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen können Cross-Linker O,O'-Diaminoalkandiolverbindungen, vorzugsweise O,O'-Diamino-C₁-C₆-Alkandiol, sein, die für das chemische Koppeln on organischen Aldehydverbindungen geeignet sind, oder irgendeine aus einer Vielzahl verschiedener Diaminverbindungen, die für das chemische Koppeln von Aldehyd enthaltenden Verbindungen geeignet sind.
Es können verschiedene chemische Prinzipien angewendet werden, um Zielbindungsfragmentkandidaten über einen Cross-Linker unter Bereitstellung von verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten für die Bindung an ein biologisches Zielmolekül chemisch zu koppeln. Beispielsweise umfassen viele gut bekannte Chemien, die für das chemische Koppeln von (eines) Zielbindungsfragmentkandidaten über einen Linker unter Bildung von verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten verwendet werden können, z.B. reduktive Aminierungen zwischen Aldehyden und Ketonen und Aminen (March, Advanced Organic Chemistry, John Wiley & Sons, New York, 4. Aufl., 1992, S. 898-900), alternative Verfahren zur Herstellung von Aminen (March et al., a.a.O., S. 1276), Reaktionen zwischen Aldehyden und Ketonen und Hydrazinderivaten unter Erhalt von Hydrazonen und Hydrazonderivaten, wie Semicarbazonen (March et al., a.a.O., S. 904-906), die Bildung von Amidbindungen (March et al., a.a.O., S. 1275), die Bildung von Harnstoffen (March et al., a.a.O., S. 1299), die Bildung von Thiocarbamaten (March et al., a.a.O., S. 892), die Bildung von Carbamaten (March et al., a.a.O., S. 1280), die Bildung von Sulfonamiden (March et al., a.a.O., S. 1296), die Bildung von Thioethern (March et al., a.a.O., S. 1297), die Bildung von Disulfiden (March et al., a.a.O., S. 1284), die Bildung von Ethern (March et al., a.a.O., S, 1285), die Bildung von Estern (March et al., a.a.O., S. 1281), Additionen zu Epoxiden (March et al., a.a.O., S. 368), Additionen zu Aziridinen (March et al., a.a.O., S. 368), die Bildung von Acetaten und Ketalen (March et al., a.a.O., S. 1269), die Bildung von Carbonaten (March et al., a.a.O., S. 392), die Bildung von Enaminen (March et al., a.a.O., S. 1284), die Metathese von Alkenen (March et al., a.a.O., S. 1146-1148, und Grubbs et al., Acc. Chem. Res. 28:446-452 (1995)), durch Übergangsmetalle katalysierte Kopplungen von Arylhalogeniden und Sulfonaten mit Alkenen und Acetylenen (z.B. Heck-Reaktionen) (March et al., a.a.O., S. 717-178), die Umsetzung von Arylhalogeniden und Sulfonaten mit organometallischen Reagenzien (March et al., a.a.O., S. 662), wie Organobor- (Miyaura et al., Chem. Rev., 95:2457 (1995)), Organozinn- und Organozinkreagenzien, die Bildung von Oxazolidinen (Ede et al., Tetrahedron Letts. 38:7119-7122 (1997)), die Bildung von Thiazolidinen (Patek et al., Tetrahedron Letts. 36:2227-2230 (1995)), Amine, die über Amidingruppen verknüpft sind durch Koppeln von Aminen über Imidoester (Davies et al., Canadian J. Biochem., 50:416-422 (1972)) und dergleichen.
Die Stufe des chemischen Verknüpfens wenigstens eines Teils der Zielbindungsfragmentkandidaten, von denen wie oben beschrieben herausgefunden wurde, daß sie an das biologische Zielmolekül oder strukturell verwandte Analoge davon binden können, über einen Cross-Linker liefert eine Bibliothek von verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten für die Bindung an das Zielmolekül, die wenigstens zwei der Zielbindungsfragmentkandidaten oder Analoge davon und den Cross-Linker umfaßt. Wie es zuvor erwähnt wurde, können die Zielbindungsfragmentkandidaten, die in verknüpfte Zielbindungsfragmentkandidaten aufgenommen sind, gleich sein, wodurch ein Homomultimer bereitgestellt wird, oder sie können verschieden sein, wodurch ein Heteromultimer bereitgestellt wird, und Bibliotheken von verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten umfassen im allgemeinen sowohl Homo- als auch Heteromultimere. Verknüpfte Zielbindungsfragmentkandidaten für die Bindung an das Zielmolekül sind vorzugsweise dimer, Zielbindungsfragmentkandidaten, die hier Verwendung finden, können jedoch auch trimer, tetramer und dergleichen sein, wobei diese Verbindungen durch die Verwendung von Cross-Linkern, die mehr als zwei chemisch kreuzreaktive funktionelle Gruppen aufweisen, für Verknüpfungszwecke erhalten werden. Verknüpfte Zielbindungsfragmentkandidaten für die Bindung an ein biologisches Zielmolekül, die hier Verwendung finden, haben im allgemeinen eine Größe von weniger als etwa 1000 Dalton und oft eine Größe von weniger als etwa 750 Dalton.
Bibliotheken von verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten für die Bindung an das biologische Zielmolekül umfassen im allgemeinen wenigstens einen verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten, für gewöhnlich wenigstens etwa 20 verschiedene Kandidaten, üblicher wenigstens etwa 100 verschiedene Kandidaten, bevorzugt wenigstens etwa 200 verschiedene Kandidaten, bevorzugter wenigstens etwa 500 verschiedene Kandidaten, am meisten bevorzugt wenigstens etwa 1.000 verschiedene Kandidaten und häufig 10.000 oder mehr verschiedene Kandidaten. Bibliotheken von verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten können so aufgebaut sein, daß jedes einzelne Molekül in der Bibliothek von den anderen Molekülen in der Bibliothek räumlich getrennt ist (z.B. liegt jedes Mitglied der Bibliothek in einem separaten Mikrotiterwell vor), oder zwei oder mehrere Mitglieder ^der Bibliothek können physikalisch vereinigt werden, wenn Verfahren zur Dekonvolution leicht verfügbar sind.
Sobald sie erhalten wurden, werden Bibliotheken von verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten für die Bindung an das biologische Zielmolekül gescreent, um ein Mitglied (Mitglieder) der Bibliothek zu identifizieren, welches) mit hoher Affinität an das biologische Zielmolekül binden kann (können). Für solche Zwecke kann jeder der oben beschriebenen Screeningtests verwendet werden, wobei bevorzugt ein biologischer Test, wie ein ELISA-Test, verwendet wird.
Für die Stufe des Screenens einer Bibliothek von verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten, um einen oder mehrere zu identifizieren, die an ein biologisches Zielmolekül binden, ist es für einen Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich, die Konzentration der Verbindungen, die in dem Bindungstest verwendet werden sollen, zu bestimmen. Wir haben hier herausgefunden, daß verknüpfte Zielbindungsfragmentkandidaten, die durch chemisches Koppeln organischer Verbindungen, die an ein biologisches Zielmolekül binden, erzeugt wurden, oft überraschend hohe Bindungsaffinitäten für das Ziel aufweisen. Zum großen Teil können verknüpfte Zielbindungsfragmentkandidaten, die als potentielle Arzneimittel-Leitverbindungen dienen oder die selbst therapeutische Wirksamkeit besitzen, mit einem K_d von etwa 500 nM oder weniger, für gewöhnlich etwa 100 nM oder weniger, üblicher etwa 50 nM oder weniger an die biologischen Zielmoleküle binden. Für verschiedene Anwendungsformen kann jedoch auch eine oder können mehrere Arzneimittel-Leitverbindungen) mit einem individuellen K_d für das biologische Zielmolekül von mehr als 500 nM Verwendung finden.
Wir beschreiben auch ein Verfahren zum Hemmen der Wechselwirkung zwischen ersten und zweiten biologischen Molekülen, die aneinander binden, wobei das Verfahren umfaßt, daß man ein System, welches diese Moleküle umfaßt, mit einer die Bindung hemmenden Menge eines verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten oder einer Arzneimittel-Leitverbindung, die durch das oben beschriebene Verfahren identifiziert wurden, in Kontakt bringt, wobei die Arzneimittel-Leitverbindung oder der verknüpfte Zielbindungsfragmentkandidat an das erste biologische Molekül bindet und dessen Fähigkeit zur Bindung an das zweite biologische Molekül hemmt. Größtenteils sind das erste und das zweite biologische Molekül Proteine, Nukleinsäuren, Saccharidkomplexe und dergleichen, wobei vorzugsweise wenigstens eines ein Protein ist und bevorzugter beide Proteine sind. In besonders bevorzugten Ausführungsformen kann das erste oder das zweite biologische Molekül CD4 oder gp120 sein. In anderen bevorzugten Ausführungsformen kann das erste biologische Molekül ein Protein sein, wobei das zweite biologische Molekül ein Rezeptor für dieses Protein ist, eine Nukleinsäure, entweder DNA oder RNA, die an dieses Protein oder ein Polysaccharid bindet, oder wobei das erste biologische Molekül ein Enzym ist, wobei das zweite biologische Molekül ein Substrat für dieses Enzym ist.
Systeme, die sowohl das erste als auch das zweite biologische Molekül umfassen, können entweder in vitro- oder in vivo-Systeme sein, wobei das erste und das zweite biologische Molekül so angeordnet sind, daß sie aneinander binden können. Für Anwendungen in vivo kann das interessierende Leitmolekül alleine oder in einem pharmazeutisch verträglichen Medium, beispielsweise normaler Salzlösung, PBS usw., verabreicht werden. Die Zusatzstoffe können bakterizide Mittel, Stabilisatoren, Puffer oder dergleichen umfassen. Um die Halbwertszeit der Arzneimittel-Leitverbindungen in vivo zu verbessern, können die Verbindungen eingekapselt, in das Lumen von Liposomen eingebracht oder als Kolloide hergestellt werden, oder es kann irgendeine andere konventionelle Technik verwendet werden, die eine Verlängerung von deren Lebensdauer bewirkt.
Die Arzneimittel-Leitverbindungen können als eine Kombinationstherapie zusammen mit anderen pharmakologisch aktiven Mitteln verabreicht werden oder sie können mit solchen Mitteln oder mit anderen Trägern physikalisch verknüpft sein. Es können verschiedene Verabreichungsverfahren verwendet werden. Die Arzneimittel-Leitverbindungen können oral verabreicht werden, oder sie können intravaskulär, subkutan, peritoneal usw. injiziert werden. Eine "die Bindung hemmende Menge" der Arzneimittel-Leitverbindungen variiert in hohem Maße in Abhängigkeit von der Beschaffenheit des ersten und des zweiten biologischen Moleküls, der Häufigkeit der Verabreichung, der Art der Verabreichung, der Clearance der Verbindung aus dem Wirt und dergleichen. Geeignete die Bindung hemmende Mengen können von Fachleuten auf dem Gebiet routinemäßig empirisch bestimmt werden.
II. Definitionen und bevorzugte Ausführungsformen
In der breitesten Ausführungsform umfaßt das Verfahren dieser Erfindung folgendes: das Zusammensetzen einer Bibliothek von Zielbindungsfragmentkandidaten, das Screenen der Bibliothek von Zielbindungsfragmentkandidaten hinsichtlich derjenigen, die an ein Zielmolekül binden, das Verknüpfen von Zielbindungsfragmenten unter Erzeugung einer Bibliothek von verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten und das Screenen der Bibliothek von verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten hinsichtlich derjenigen, die an das Zielmolekül binden. Das Produkt dieses Verfahrens wird als Leit-Pharmazeutikum oder Arzneimittelkandidat bezeichnet.
Spezieller (siehe 9) wird das Verfahren dieser Erfindung verwendet, um pharmazeutische Leit-Arzneimittelkandidaten zu identifizieren, und umfaßt optional die folgenden einfachen Stufen (a-h). (a) Zusammenstellen einer Bibliothek von Zielbindungsfragmentkandidaten, wobei jedes Fragment eine verknüpfbare funktionelle (oder funktionelle Verknüpfungs-) Gruppe (LFG) oder die blockierte Form davon (BLFG) aufweist, wobei die blockierte Form die folgende Linker-Gruppe (LG) umfaßt:
Das Zusammenstellen einer Bibliothek, wie es hier verwendet wird, bedeutet irgendein Verfahren zum Selektieren zweier oder mehrerer Moleküle zur Bildung einer Bibliothek für die Verwendung in dem Verfahren dieser Erfindung. Vorzugsweise ist die Bibliothek groß, sie umfaßt mehr als 50 Mitglieder und enthält eine vielfältige Anzahl miteinander wechselwirkender Zielgruppen, die nicht-kovalente Bindungen, z.B. Wasserstoff-, Van-der-Waals-, elektrostatische, hydrophobe Bindungen und dergleichen, mit dem Zielmolekül bilden können. Solche miteinander wechselwirkenden Gruppen können funktionelle Gruppen umfassen, wie sie auf natürlich vorkommenden Aminosäure-Seitenketten, Kohlehydraten, Lipiden, Nukleinsäuren und deren Metaboliten und Derivaten davon zu finden sind, oder Gruppen, die in bekannten Pharmazeutika zu finden sind. Optional kann eine Bi bliothek so ausgestaltet werden, daß sie miteinander wechselwirkende Gruppen enthält, von denen bekannt ist oder vermutet wird, daß sie mit Bindungsstellen auf dem biologischen Zielmolekül oder dessen biologischem Liganden wechselwirken.
Zielbindungsfragmentkandidaten (CTBF) sind kleine wasserlösliche organische Moleküle mit einem Molekulargewicht von etwa 2000 Da (einschließlich der LFG), die mit einem biologischen Zielmolekül (TBM) einen nicht-kovalenten Komplex bilden können. Dieser Komplex kann eine geringe Affinität und einen K_d von nur etwa 5 mM haben. Die CTBFs sind kommerziell erhältlich oder sie können mit bekannten Verfahren synthetisiert werden.
Verknüpfbare funktionelle (oder funktionelle Verknüpfungs-) Gruppen (LFG) umfassen alle funktionellen Gruppen, die mit einer chemisch kreuzreaktiven funktionellen Gruppe (CFG) auf einem Cross-Linker (XL) reagieren können, wodurch eine stabile kovalente Bindung mit dem Cross-Linker gebildet wird. Diese kovalente Bindung wird einfach als eine Linker-Gruppe (LG) bezeichnet. Wenn das verknüpfte Molekül mehr als eine Linker-Gruppe enthält, wird eine ganze Zahl, die LG folgt, verwendet, um die Zahl der LG in dem Molekül anzuzeigen. Die LFG umfaßt blockierte, geschützte oder in anderer Weise transformierte Gruppen, die direkt mit der CFG auf dem Cross-Linker reagieren können oder nicht. Diese blockierte Form der verknüpfbaren funktionellen Gruppe (BLFG) ist oft die bevorzugte Form der CTBF, da es möglicherweise weniger wahrscheinlich ist, daß sie in der Stufe des Inkontaktbringens unten kovalente Verknüpfungen mit dem biologischen Zielmolekül bildet.
Wenn die BLFG in der Stufe des Inkontaktbringens verwendet werden soll, ist die entschützte oder zurück umgewandelte Form des CTBF, die mit der CFG auf dem Cross-Linker reagieren kann, die Form, die in der Verknüpfungsstufe unten verwendet wird. Lediglich zur Veranschaulichung kann ein CTBF ein Aldehyd als eine LFG enthalten oder dieses Aldehyd kann geschützt oder umgewandelt werden, indem es unter Bildung eines Oxims (BLFG), wie unten gezeigt, mit einem O-Aminoalkoholumgesetzt wird.
In diesem Fall wird das Oxim als die BLFG betrachtet. Es versteht sich, daß mehr als eine Umsetzung oder Umwandlung mit einer LFG durchgeführt werden kann. Zur weiteren Veranschaulichung kann ein Aldehyd unter Bildung einer Schift-Base, die wiederum zu einem sekundären Amin reduziert werden kann, mit einem Amin umgesetzt werden. Dieses kann unter Bildung eines Amids, Sulfonamids, Harnstoffs, Carbamats usw. noch weiter umgesetzt werden. All diese Transformationen des anfänglichen Aldehyds werden ebenfalls als BLFGs betrachtet.
Wenn der CTBF (einschließlich der LFG) zuerst umgewandelt oder geschützt wird, wird der anfängliche CTBF manchmal als "Vorläufer" bezeichnet, während die transformierte oder geschützte Form, die mit dem TBM in Kontakt gebracht wird, als "Monomer" bezeichnet wird. In der oben veranschaulichten Reaktion kann das Aldehyd somit als Vorläufer bezeichnet werden, während das Oxim als Monomer bezeichnet wird. In diesem Fall wird die kovalente Oximbindung (=N-O-) als die Linker-Gruppe (LG) bezeichnet. Es ist oft bevorzugt, daß das Monomer die gleiche Linker-Gruppe (LG) enthält, die auch in der verknüpften Form vorliegt, wie unten beschrieben, da ein Teil der Bindungsenergie mit dem Ziel von der LG kommen kann.
Beispiele von verknüpfbaren funktionellen Gruppen oder funktionellen Linker-Gruppen umfassen Aldehyd, Keton, primäres Amin, sekundäres Amin, Epoxid, Carbonsäure, Sulfonsäure, Alkohol (Hydroxyl), Isocyanat, Isothiocyanat, Halogenid und Sulfonat. Diese funktionellen Gruppen könen als Vorläufer der blockierten verknüpfbaren funktionellen Gruppen dienen.
Beispiele von CTBFs mit blockierten verknüpfbaren funktionellen Gruppen oder blockierten funktionellen Linker-Gruppen sind Moleküle, die Linker-Gruppen enthalten, die unter den folgenden ausgewählt sind: Oxim, Hydrazon, N-Acylhydrazon, sekundärem Amin, tertiärem Amin, Acetal, Ketal, 1,2-Aminoalkoholen, Amid, N,N-disubstituierten Amiden, Thioamid, Ureido, Thioureido, Carbamat, Thiocarbamat, Thiothiocarbamat, Sulfonamid, Carbamat, Guanidino, Amidino, Thioester, Ester, Ether, 2-Hydroxyether, 2-Hydroxythioether, Thioether, Disulfid, Alkan (Alkylen), Alken (Alkenylen) und Alkin (Alkinylen). Bevorzugte Monomere enthalten die obigen funktionellen Gruppen als LGs.
Die Stufen b-d unten können zu einer einzigen Screeningstufe kombiniert werden, die als eine erste Screeningstufe, eine Vorselektionsstufe oder eine Vorscreeningstufe bezeichnet werden kann.
(b) Inkontaktbringen der Zielbindungsfragmentkandidaten mit einem biologischen Zielmolekül (TBM).
Das Inkontaktbringen des TBM mit einem oder mehreren Mitgliedern der Bibliothek kann entweder einzeln oder mit mehreren durchgeführt werden. Vorzugsweise wird jeder Zielbindungsfragmentkandidat einzeln mit dem TBM in Kontakt gebracht. Dies kann beispielsweise in geeigneter Weise in einer Platte im 96-Well-Format durchgeführt werden, so daß die Bildung eines Komplexes mit jedem Mitglied der Bibliothek in geeigneter Weise beurteilt werden kann, ohne daß irgendeine Stufe der Dekonvolution erforderlich ist. Die Stufe des Inkontaktbringens wird oft bei relativ hohen Konzentrationen des CTBF durchgeführt, so daß K_ds von nur 5 mM gemessen werden können (siehe unten).
Das biologische Zielmolekül (TBM) kann jedes biologische Molekül, bevorzugt mit Säugerursprung und am meisten bevorzugt menschlichem Ursprung, sein. Optional bevorzugte TBMs können menschliche pathogene Proteine, wie virale Proteine von Viren, die menschliche Zellen infizieren, sein. Bevorzugte TBMs sind Proteine, am meisten bevorzugt sekretierte Proteine. Bevorzugte sekre tierte Proteine umfassen Enzyme, Zytokine, Hormone, Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren. Die TBMs können aus natürlichen Quellen isoliert sein oder in einer Wirtszelle rekombinant hergestellt werden. Normalerweise enthalten die Atome des TBM die natürlich vorkommenden Isotope, in einigen Fällen können diese jedoch angereichert sein. Wenn das Ziel ein Rezeptor oder ein an die Zelloberfläche gebundenes Molekül ist, kann das TBM in geeigneter Weise die extrazelluläre Domäne oder ein Derivat davon sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist das biologische Zielmolekül kein einzelnes biologisches Molekül; es handelt sich vielmehr um zwei oder mehrere Moleküle. Bevorzugte TBMs können beispielsweise Protein-Protein-, Protein-DNA/RNA- oder Protein/Substrat-Paare sein. Zur Veranschaulichung kann ein Ligand-Rezeptor-Paar das tatsächliche Ziel sein, wenn ein ELISA oder ein anderer biologischer Test, der zwei oder mehrere biologische Moleküle erfordert, verwendet wird, um eine physikalische Verknüpfung (siehe unten), wie Bindung, oder Aktivität zu messen. Die Bindungskonstante, IC50, oder ein anderer Meßwert kann aus der Bindung von CTBF mit entweder dem Liganden, dem Rezeptor oder beiden resultieren. In ähnlicher Weise können, wenn ausgewählte Fragmente verknüpft (siehe unten) und hinsichtlich des Ligand-Rezeptor-Paares erneut gescreent werden, die rekombinierten Fragmente an den Liganden, den Rezeptor oder beide binden.
(c) Messung einer Veränderung einer ersten physikalischen Verknüpfung (PA-1) des biologischen Zielmoleküls.
Die Messung einer Veränderung, wie sie hier verwendet wird, bedeutet irgendein Verfahren, mit dem eine physikalische Verknüpfung, einschließlich Bindung, des CTBF mit dem TBM quantifiziert werden kann.
Eine physikalische Verknüpfung (PA-1) des Zielmoleküls beinhaltet eine biologische Eigenschaft, wie Bindung mit einem anderen biologischen Molekül, Signalumwandlung oder Katalyse einer Reaktion. Sie kann auch jede meßbare physikalisch-chemische Eigenschaft, wie eine spektroskopische oder magnetische Eigenschaft, umfassen. Vorzugsweise ist die physikalische Verknüpfung geeignet für schnelles Screening mit hohem Durchsatz. Die am meisten bevorzugte Messung der physikalischen Verknüpfung ist eine biologische Messung, wie die Messung von Bindung oder die Katalyse. Ein Beispiel der Bindungsmessung ist ein ELISA-Test, bei dem der Protein-Protein-Antagonismus gemessen wird.
(d) Selektieren von Zielbindungsfragmenten (TBF) basierend auf (c).
Das Selektieren von Zielbindungsfragmenten (TBF) basiert auf der Stufe der Messung der physikalischen Verknüpfung. Ausgewählte TBFs umfassen diejenigen, die relativ schwach an das TBM binden. So können beispielsweise in einem Bindungstest, wie einem ELISA, Fragmente selektiert werden, die mit nicht mehr als 5 nM an Affinität binden. Am häufigsten binden die zuerst selektierten CTBFs mit einer Affinität von 2 mM bis 100 μM an das Ziel. TBFs oder Monomere, die mit einer höheren Affinität, z.B. mit Kd < 50 μM, binden, sind bevorzugt, jedoch sind solche relativ hohen Bindungsaffinitäten für die Selektion für die Verknüpfungsstufe nicht notwendig.
(e) Umsetzen von Zielbindungsfragmenten mit einem Cross-Linker, der (eine) mit der LFG chemisch kompatible kreuzreaktive Gruppe(n) aufweist, unter Bedingungen, die zur Bildung einer Bibliothek von verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten (CXL-TBF) geeignet sind.
Die ausgewählten Zielbindungsfragmente, die normalerweise jeweils mit relativ geringer Affinität an das Ziel binden, werden dann normalerweise in allen Kombinationen und Permutationen verknüpft, wodurch eine Bibliothek von verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten (CXL-TBF) gebildet wird. Zur Veranschaulichung werden, wenn TBF_m und TBF_n aus dem ersten Screening selektiert werden, diese Moleküle dann unter Bildung von verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten (CXL-TBF) für die zweite Screening-Stufe gemäß der nachstehenden allgemeinen Gleichung mit einem geeigneten Cross-Linker, wie einem bifunktionalen Linker (BFL) umgesetzt:
Der BFL oben weist normalerweise zwei kreuzreaktive Gruppen auf, die mit beiden LFGs kompatibel sind, d.h. sie bilden mit den LFGs unter ausgewählten Reaktionsbedingungen (eine) stabile kovalente Bindung(en) (LG).
Jedes TBF kann aus zwei (oder drei) Teilen oder Resten bestehen, wenn LFG ein Atom enthält, welches zwei (oder drei) Bindungen bilden kann, die andere sind als die Bindung der Linker-Gruppe (LG) mit dem Linker. Wenn beispielsweise LFG das Carbonyl eines Ketons ist, kann der Carbonylkohlenstoff an zwei Alkyl-, Aryl- usw. Teile oder Reste (Teil A und Teil B oder Teil C und Teil D) gebunden sein. Dieser Fall kann allgemein durch das untenstehende Diagramm dargestellt werden, wobei beispielsweise zwei Ketone unter Bildung eines Dioxims mit einem O,O'-Diaminoalkandiol-Cross-Linker verknüpft sind:
Hier ist jeder der beiden Alkyl-, Aryl- usw. Teile oder Reste aus dem Keton an ein Stickstoffatom in der Linker-Gruppe (LG, =N-O-) gebunden.
Die CXL-TBFs werden manchmal als "Dimere" bezeichnet, jedoch sind sie in Wirklichkeit nur dann Dimere, wenn der Verknüpfungsrest (XL) nur eine chemische Bindung ist. Im allgemeinsten Fall enthalten diese "Dimere" einen Verknüpfungsrest, wie Alkan, Alken, Arylen, Alkylether und dergleichen, die durch eine oder mehrere Linker-Gruppen (LG) an die entsprechenden TMFs gebunden sind.
Umsetzen bedeutet chemisches Umsetzen, so daß eine stabile kovalente Bindung oder eine Linker-Gruppe LG als das Produkt der Umsetzung zwischen der verknüpfbaren funktionellen Gruppe an dem Zielbindungsfragment (den Zielbindungsfragmenten) und einer chemisch kreuzreaktiven funktionellen Gruppe (CFG) auf dem Cross-Linker gebildet wird. Diese Stufe kann als eine Verknüpfungsstufe oder manchmal als "Kombinations"- oder "Rekombinations"-Stufe bezeichnet werden.
Kompatible funktionelle Gruppe bedeutet hier die Fähigkeit zur Umsetzung hiervon unter Bildung einer stabilen LG.
Der Cross-Linker ist ein kleines organisches Molekül mit wenigstens einer kreuzreaktiven funktionellen Gruppe, die mit der verknüpfbaren funktionellen Gruppe wenigstens eines der Zielbindungsfragmente reagieren kann. Für gewöhnlich weist der Cross-Linker 2-4 solcher kreuzreaktiver funktioneller Gruppen und am üblichsten 2 solcher Gruppen auf. In diesem Fall wird der Cross-Linker als ein bifunktionaler Linker (BFL) bezeichnet, der in Abhängigkeit davon, ob die kompatiblen funktionellen Gruppen die gleichen oder verschieden sind, entweder homo-bifunktional oder hetero-bifunktional ist.
Wenn der Cross-Linker eine einzige kreuzreaktive funktionelle Gruppe aufweist, ist der verknüpfte Zielbindungsfragmentkandidat, CXL-TBF, einfach das Produkt der Umsetzung dieser beiden Moleküle:
Ein einfaches Vergleichsbeispiel einer solchen Reaktion ist das Produkt aus einem Aldehyd und einem Amin. In diesem beispielhaften Fall ist R1 ein TBF und R2 ist XL, wobei LFG-1 ein Aldehyd ist und CFG-1 ein primäres Amin ist:
In diesem Fall ist LG das resultierende sekundäre Amin, -(NH)-.
Wenn der Cross-Linker ein bifunktionaler Linker, BFL, ist, weist der Linker zwei kreuzreaktive Linker-Gruppen auf und kann allgemein wie folgt dargestellt werden:
In diesem Fall kann das Umsetzen zweier Zielbindungsfragmente aus dem ersten Screening oben, von denen jedes seine eigene funktionelle Linker-Gruppe aufweist, mit dem obigen BFL wie folgt dargestellt werden:
Im allgemeinsten Fall der obigen Reaktion weisen die beiden Zielbindungsfragmente verschiedene verknüpfbare funktionelle Gruppen auf und werden durch einen hetero-bifunktionalen Linker (Het-BFL) verknüpft. Im üblichsten Fall haben beide TBFs die gleiche CFG und sind durch einen homo-bifunktionalen Linker (Homo-BFL) verknüpft. In manchen Fällen können Zielbindungsfragmente mit verschiedenen verknüpfbaren funktionellen Gruppen mit einem homo-BFL verknüpft werden, und Zielbindungsfragmente mit den gleichen verknüpfbaren funktionellen Gruppen können mit einem het-BFL verknüpft werden.
Linker-Gruppen höherer Ordnung, wie tri- und tetrafunktionale Linker, können in dem Verfahren dieser Erfindung ebenfalls verwendet werden. Zur vergleichenden Veranschaulichung kann ein trifunktionaler Linker verwendet werden, wie er unten gezeigt ist:
In jedem der obigen Fälle erzeugt das Produkt der Verknüpfungsreaktion (einen) verknüpfte(n) Zielbindungsfragmentkandidaten (CXL-TBF). Diese Kandidatenmoleküle, die typischerweise ein Molekulargewicht von 400-600 Dalton haben, werden dann ein zweites Mal hinsichtlich des biologischen Zielmoleküls gescreent.
Die Stufen f-h unten können zu einer einzigen Screeningstufe kombiniert werden, die als eine zweite Screeningstufe, eine Selektionsstufe oder eine abschließende Screeningstufe bezeichnet werden kann.
(f) Inkontaktbringen der verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten mit dem biologischen Zielmolekül.
Das Inkontaktbringen des TBM und eines oder mehrerer Mitglieder der Bibliothek von verknüpften Zielbindungsfragmentkandidaten (CXL-TBF) kann wie zuvor entweder einzeln oder mit mehreren durchgeführt werden. Vorzugsweise wird jeder verknüpfte Zielbindungsfragmentkandidat einzeln mit dem TBM in Kontakt gebracht. Die Stufe des Inkontaktbringens wird üblicherweise bei im Vergleich zu den CTBFs in der ersten Screeningstufe geringeren Konzentrationen von CXL-TBF durchgeführt, so daß Kds im mikromolaren oder nanomolaren Bereich gemessen werden können. Die Art und Weise des Inkontaktbringens kann gleich sein wie in der ersten oder Vorscreeningstufe, oder es kann anders sein. So können beispielsweise die beiden Stufen des Inkontaktbringens beide Teil eines Bindungstests (z.B. ELISA) sein oder die zweite Stufe des Inkontaktbringens kann beispielsweise ein Test der funktionellen Aktivität oder ein zellbasierter Bindungstest sein.
(g) Messung einer Veränderung einer zweiten physikalischen Verknüpfung (PA-2) des biologischen Zielmoleküls.
Die Messung der zweiten physikalischen Verknüpfung (PA-2) für die CXL-TBFs kann die gleiche sein wie die für die CTBFs verwendete, oder es kann sich um eine andere physikalische Messung handeln. Vorzugsweise ist die Messung der zweiten physikalischen Verknüpfung eine biologische Messung anstelle einer physikalisch-chemischen Messung, wie einer spektroskopischen Messung oder dergleichen.
(h) Selektieren von verknüpften Zielbindungsfragmenten (XL-TBF) auf Basis von (g).
Die selektierten verknüpften Zielbindungsfragmente (XL-TBF) haben typischerweise einen Kd, IC-50 oder das Äquivalent von 500 nM oder besser. Diese XL-TBFs sind als pharmazeutische Leit-Kandidatenmoleküle für Arzneimittel geeignet.
III. Spezifische Chemie
Es können viele chemische Prinzipien angewendet werden, um verknüpfbare funktionelle Gruppen zu erzeugen oder um sie zu blockieren oder zu derivatisieren. In ähnlicher Weise ist eine große Vielzahl von chemischen Verknüpfungsprinzipien möglich. Unten wird eine Anzahl von chemischen Prinzipien beschrieben, die für schnelles Screening mit hohem Durchsatz geeignet sind. Diese Beschreibung soll veranschaulichend und nicht beschränkend sein. In der untenstehenden Beschreibung ist der Begriff "CTBF" äquivalent zu "CTBF-Teil A" plus "CTBF-Teil B", wie es oben definiert wurde. In ähnlicher Weise wird der Begriff verknüpfbare funktionelle Gruppe austauschbar mit dem Begriff funktionelle Linker-Gruppe verwendet.
Der Begriff "Alkyl" bezeichnet eine zyklische, verzweigte oder unverzweigte gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffgruppe mit einer spezifizierten Anzahl an Kohlenstoffen oder, wenn keine Anzahl spezifiziert ist, mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen.
Der Begriff "Aryl" bezeichnet eine homozyklische aromatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 6-14 Kohlenstoffatomen. Beispiele umfassen Phenyl, Naphthyl, Biphenyl, Phenanthrenyl, Naphthacenyl und dergleichen.
Der Begriff "Heteroaryl" bezeichnet eine heterozyklische aromatische Gruppe mit 4-13 Kohlenstoffatomen und 1-6 Heteroatomen, ausgewählt unter N, O, S und P.
Der Begriff "Heterozyklus" bezeichnet eine gesättigte oder teilweise ungesättigte zyklische Gruppe mit 3-13 Kohlenstoffatomen und 1-6 Heteroatomen, ausgewählt unter O, S, N und P.
Der Begriff "Alkoxy" bezeichnet eine Alkylgruppe, wie oben definiert, die mit einer Oxogruppe (-O-) substituiert ist.
Der Begriff "Acyl" bezeichnet Alkanoyl oder Alkylcarbonyl mit 1-12 Kohlenstoffatomen.
Der Begriff "Carboxyester" bezeichnet Acyloxy oder Alkanoyloxy mit 1-12 Kohlenstoffatomen.
Der Begriff "Carboxamid" bezeichnet Alkylcarbonylamino mit 1-12 Kohlenstoffatomen.
ALLGEMEINE ANMERKUNG: Wenn CTBFs mit BLFGs verwendet werden, können sie wie unten beschrieben aus CTBFs hergestellt werden, die die korrespondierenden LFGs enthalten. Alternativ kann es praktikabel sein, die CTBFs mit BLFGs zu kaufen, anderweitig zu erwerben oder mit anderen Verfahren unter Anwendung alternativer chemischer Prinzipien herzustellen.
Zielbindungsfragmentkandidaten oder Zielbindungsmolekülkandidaten (CTBFs)
Die Thiolgruppe als die funktionelle Linker-Gruppe und die korrespondierenden blockierten funktionellen Linker-Gruppen

(a). Die funktionelle Linker-Gruppe ist die Thiolgruppe. Diese CTBFs können kommerziell erhältlich sein, oder sie können mit einer Vielzahl von Verfahren hergestellt werden, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind.

Thiol-CTBFs werden wie folgt dargestellt.

(b). Alternativ kann die Bibliothek aus Thioether-BLFGs zusammensetzt sein.
(i). Der Thioether kann durch Umsetzen einer Thiol-LFG mit einer Aryl-, Heteroaryl- oder Alkylgruppe hergestellt werden, die mit einer Abgangsgruppe X substituiert sind, wobei X eine Halogenid- oder eine Sulfonatgruppe sein kann (OSO₂R, wobei R substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl oder Aryl ist, z.B. CH₃, CF₃, Phenyl-CH₃ und Phenyl-NO₂). Das Halogenid könnte an eine aromatische oder heteroaromatische Funktionalität an R⁸ angehängt sein, oder es könnte an eine aliphatische Gruppe an R⁸ angehängt sein. Wenn X an einer aromatischen und an einer heteroaromatischen Funktionalität substituiert ist, wird eine S_NAr-Reaktion oder eine Palladium-vermittelte, eine Kupfer-vermittelte oder eine durch ein verwandtes Übergangsmetall vermittelte Kopplungsreaktion durchgeführt. Wenn X an einer Alkylfunktionalität substituiert ist, wird eine S_N2- oder S_N1-Reaktion durchgeführt. Diese Verfahren sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt [(March et al., a.a.O., S. 407-409) und (Peach in Patai The Chemistry of the Thiol Group, Teil 1, John Wiley & Sons, New York, 1974, S. 721-735)]. R⁸ kann H oder eine gerade- oder verzweigtkettige Alkylgruppe mit einer Länge von 1 bis 10 sein, wobei 1 bis 10 Heteroatome (N, O, P, S) in der Kette aufgenommen sein können. An R⁸ können auch bis zu fünf R⁹-Gruppen (R⁹ ist Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Carboxyester, Carboxamid, Amino, N-Acylamino, Alkoxy, Hydroxy, Mercapto, Phosphono, Sulfono) angehängt sein. R⁸ kann auch eine Aryl- oder Heteroarylgruppe sein, die optional substituiert ist (Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Carboxyester, Carboxamid, Amino, N-Acylamino, Alkoxy, Hydroxy, Mercapto, Phosphono). Die Thioether-BLFGs können auch zu besser in Wasser löslichen Sulfoxid- und Sulfon-BLFGs oxidiert sein (March et al., a.a.O., S. 1201-1203).
(ii). Der Thioether kann auch durch die Mitsunobu-Reaktion zwischen Alkohol-LFGs und einem Thiol hergestellt werden (z.B. (Hughes et al. (Paquette, Chefredakteur der Reihe), Organic Reactions, John Wiley & Sons, New York, 1992, Band 42, S. 335-636). R⁸ kann H oder eine gerade- oder verzweigtkettige Alkylgruppe mit einer Länge von 1 bis 10 sein, wobei 1 bis 10 Heteroatome (N, O, P, S) in die Kette aufgenommen sein können. An R⁸ können auch bis zu fünf R⁹-Gruppen (R⁹ ist Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Carboxyester, Carboxamid, Amino, N-Acylamino, Alkoxy, Mercapto, Phosphono, Sulfono) angehängt sein. Die Thioether-BLFGs können auch zu besser in Wasser löslichen Sulfoxid- und Sulfon-BLFGs oxidiert sein (March et al., a.a.O., S. 1201-1203).
(c). Alternativ kann die Bibliothek aus BLFGs zusammengesetzt werden, wobei die ThiolLFGs acyliert sind (March et al., a.a.O., S. 409). Thiol-LFGs können mit Carbonsäuren (Z = O, X = H), Carbonsäurederivaten (Z = O, X = OR, SR, Halogenid) oder den korrespondierenden thiosubstituierten Derivaten (Z = S, X = H, OR, SR, Halogenid) gekoppelt werden. Carbonsäuren und Carbonsäurederivate können unter Verwendung von Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, mit Thiolen gekoppelt werden. R⁸ kann H oder eine gerade- oder verzweigtkettige Alkylgruppe mit einer Länge von 1 bis 10 sein, wobei 1 bis 10 Heteroatome (N, O, P, S) in die Kette aufgenommen sein können. An R⁸ können auch bis zu fünf R⁹-Gruppen (R⁹ ist Halogenid, Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Carboxyester, Carboxamid, Amino, N-Acylamino, Alkoxy, Hydroxy, Mercapto, Phosphono, Sulfono) angehängt sein. R⁸ kann auch eine Aryl- oder Heteroarylgruppe sein, die optional substituiert ist (Halogenid, Alkyl, Aryl, Halogenid, Heteroaryl, Carboxyester, Carboxamid, Amino, N-Acylamino, Alkoxy, Hydroxy, Mercapto, Phosphono).
(d). Alternativ kann die Bibliothek aus Thiocarbamat- (Z=O) oder Dithiocarbamat- (Z=S) BLFGs zusammengesetzt sein.
(i). Diese CTBFs können durch Kondensation von Thiol-LFGs und Isocyanaten oder Isothiocyanaten hergestellt werden. Die direkte Kopplung von Isocyanaten und Isothiocyanaten mit Thiolen ist einfach und liegt für Fachleute auf dem Gebiet auf der Hand (Greene et al., a.a.O., S. 301). R⁸ kann H oder eine gerade- oder verzweigtkettige Alkylgruppe mit einer Länge von 1 bis 10 sein, wobei 1 bis 10 Heteroatome (N, O, P, S) in die Kette aufgenommen sein können. An R⁸ können auch bis zu fünf R⁹-Gruppen (R⁹ ist Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Carboxyester, Carboxamid, Amino, N-Acylamino, Alkoxy, Hydroxy, Mercapto, Phosphono, Sulfono) angehängt sein. R⁸ kann auch eine Aryl- oder Heteroarylgruppe sein, die optional substituiert ist (Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Carboxyester, Carboxamid, Amino, N-Acylamino, Alkoxy, Hydroxy, Mercapto, Phosphono).
(ii). Diese CTBFs können durch Kondensation von Thiol-LFGs und Carbamaten, Thiocarbamaten oder verwandten Derivaten hergestellt werden, wobei X eine Alkoxygruppe, eine Mercaptylgruppe oder ein Halogenid ist. R⁸ kann H oder eine gerade- oder verzweigtkettige Alkylgruppe mit einer Länge von 1 bis 10 sein, wobei 1 bis 10 Heteroatome (N, O, P, S) in die Kette aufgenommen sein können. An R⁸ können auch bis zu fünf R⁹-Gruppen (R⁹ ist Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Carboxyester, Carboxamid, Amino, N-Acylamino, Alkoxy, Hydroxy, Mercapto, Phosphono, Sulfono) angehängt sein. R⁸ kann auch eine Aryl- oder Heteroarylgruppe sein, die optional substituiert ist (Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Carboxyester, Carboxamid, Amino, N-Acylamino, Alkoxy, Hydroxy, Mercapto, Phosphono).
(iii). Diese CTBFs können in einem zweistufigen Verfahren hergestellt werden. In der ersten Stufe werden die Thiol-LFGs in Carbonat (Z = O) oder Thiocarbamat (Z = S) oder verwandte Derivate umgewandelt, wobei X und Y Alkoxygruppen, Mercaptylgruppen, Halogenide oder andere geeignete Abgangsgruppen sind (Greene et al., a.a.O., S. 299-301). In der zweiten Stufe wird ein Amin hinzugefügt, um die Abgangsgruppe Y zu verlagern. R⁸ und R⁹ können H oder gerade- oder verzweigtkettige Alkylgruppen mit einer Länge von 1 bis 10 sein, wobei 1 bis 10 Heteroatome (N, O, P, S) in die Kette aufgenommen sein können. An R⁸ und R⁹ können auch bis zu fünf R¹⁰-Gruppen (R¹⁰ ist Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Carboxyester, Carboxamid, Amino, N-Acylamino, Alkoxy, Hydroxy, Mercapto, Phosphono, Sulfono) angehängt sein. R⁸ und R⁹ können auch eine Aryl- oder Heteroarylgruppe sein, die optional substituiert ist (Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Carboxyester, Carboxamid, Amino, N-Acylamino, Alkoxy, Hydroxy, Mercapto, Phosphono).
(e). Alternativ kann die Bibliothek aus Disulfid-BLFGs zusammengesetzt sein. Die Disulfide können durch Umsetzen der Thiol-LFGs mit Thiolen (X = H) oder aktivierten Thiolen (X = Mercaptyl, Halogenid, Sulfonyl) unter Verwendung von Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, hergestellt werden (z.B. Greene et al., a.a.O., S. 302-303). R⁸ kann H oder eine gerade- oder verzweigtkettige Alkylgruppe mit einer Länge von 1 bis 10 sein, wobei 1 bis 10 Heteroatome (N, O, P, S) in die Kette aufgenommen sein können. An R⁸ können auch bis zu fünf R⁹-Gruppen (R⁹ ist Halogenid, Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Carboxyester, Carboxamid, Amino, N-Acylamino, Alkoxy, Hydroxy, Mercapto, Phosphono, Sulfono) angehängt sein. R⁸ kann auch eine Aryl- oder Neteroarylgruppe sein, die optional substituiert ist (Halogenid, Alkyl, Aryl, Halogenid, Heteroaryl, Carboxyester, Carboxamid, Amino, N-Acylamino, Alkoxy, Hydroxy, Mercapto, Phosphono).

11. Verfahren zum kovalenten Binden von TBFs unter Verwendung der LFG mit einem bifunktionalen Linker (BFL) unter Erzeugung von verknüpften Zielbindungsmolekülkandidaten (CXL-TBFs).
Nach Identifikation der TBFs wird eine Verknüpfung unter Verwendung eines BFL bewerkstelligt. Die gesamte Chemie, die zur Herstellung der BLFGs beschrieben wurde, könnte in der Verknüpfungsstufe verwendet werden. Ein Verfahren besteht darin, TBFs zu verknüpfen, die die gleichen LFGs beinhalten und die gleiche Verknüpfungschemie verwenden. Ein zweites Verfahren besteht darin, TBFs zu verknüpfen, die die gleichen LFGs beinhalten, jedoch eine andere Verknüpfungschemie verwenden. Ein drittes Verfahren besteht darin, TBFs zu verknüpfen, die verschiedene LFGs beinhalten, was in den meisten, jedoch nicht in allen Fällen eine unterschiedliche Verknüpfungschemie erfordert. Jede dieser Strategien verwendet Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind. Vergleichsbeispiele zu den drei Verfahren sind unten angegeben.
Vergleichsverfahren 1. Beispielsweise könnten zwei TBFs mit Aldehyd-LFGs unter Verwendung eines BFL, der zwei O-substituierte Hydroxylamine enthält, verknüpft werden.
Vergleichsverfahren 2. Beispielsweise könnten zwei TBFs mit Aldehyd-LFGs unter Verwendung eines BFL, der ein O-substituiertes Hydroxylamin und ein Acylhydrazid enthält, verknüpft werden.
Vergleichsverfahren 3. Beispielsweise könnten ein TBF mit einer Aldehyd-LFG und ein TBF mit einer Amin-LFG unter Verwendung eines BFL, der ein O-substituiertes Hydroxylamin und eine Carbonsäure enthält, verknüpft werden.
Ein hypothetisches Beispiel für die Herstellung von Heterolinkern besteht darin, Aminosäuren als Heterolinker zu verwenden. Wie es unten gezeigt ist, dient der Aminosäure-Heterolinker dazu, TBFs mit Carbonsäure-LFGs an TBFs mit Amin-LFGs zu binden. Die Amin-LFG könnte ein primäres Amin oder ein sekundäres Amin (nicht gezeigt) sein. Viele Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, könnten verwendet werden, um die CXL-TBFs unter Verwendung von Aminosäure-Heterolinkern herzustellen. Eines der Verfahren ist unten beschrieben.
Für dieses Probeverfahren wird der Aminosäure-BFL als das N-tert-Butoxycarbonyl- (Boc-) Derivat geschützt. Viele N-Boc-Aminosäuren sind kommerziell erhältlich, z.B. von Novabiochem (San Diego, CA) und Neosystems (Straßburg, Frankreich). Mit N-Boc geschützte Aminosäuren können auch durch Verfahren hergestellt werden, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind (Bodansky et al., The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin, 1984, 18-20).
Das Probeverfahren ist in Schema 1 veranschaulicht. Experimentelle Probeverfahren werden unten bereitgestellt.
Stufe 1 (Desai et al., Tetrahedron Letters, 34. 7685-7688, (1993))
Zu einer Suspension von Polymer-gebundenem Carbodiimid (1,5 mmol) in Chloroform (10 ml) werden die mit N-Boc geschützte Aminosäure 2 (0,55 mmol) und das Amin-substituierte TBF 1 (0,50 mmol) zugegeben. Nachdem das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt wurde, wird das Gemisch filtriert. Das Harz wird mit Chloroform (3 × 7,5 ml) gewaschen, und das vereinigte Filtrat wird unter Erhalt von 3 unter Vakuum verdampft.
Stufe 2
Zu Verbindung 3 (0,5 mmol) werden 5 ml einer Lösung von 4,0 M Salzsäure in Dioxan (Aldrich, Milwaukee, WI) zugegeben. Die Lösung wird für eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt und dann verdampft, um das Lösungsmittel und überschüssige Salzsäure zu entfernen. Das Produkt wird mit 5 ml Methanol verdünnt, und die Konzentration wird wiederholt, um 4 zu liefern.
Stufe 3 (Desai et al., Tetrahedron Letters, 34, 7685-7688, (1993))
Zu einer Suspension von Polymer-gebundenem Carbodiimid (1,5 mmol) in Chloroform (10 ml) werden das Zwischenprodukt 4 (0,50 mmol) und das mit Carbonsäure substituierte TBF 5 (0,55 mmol) zugegeben. Nachdem das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt wurde, wird das Gemisch filtriert. Das Harz wird mit Chloroform (3 × 7,5 ml) gewaschen, und das verenigte Filtrat wird unter Vakuum verdampft unter Erhalt von Produkt 6, welches der gewünschte CXL-TBF ist. Schema 1 Stufe 1:
Stufe 2:
Stufe 3:
EXPERIMENTELLES
Wenn es nicht anders angegeben ist, wurden Materialien von kommerziellen Lieferanten erhalten und ohne weitere Reinigung verwendet. Aldehyde wurden von Aldrich Chemical Company, Inc. (Milwaukee, WI) erworben. Wasserfreies Dimethylsulfoxid (DMSO) und Essigsäure wurden von Fischer (Pittsburgh, PA) erworben. Löslicher CD4 (sCD4) wurde von Intracel Corporation (Issaquah, WA), erworben, gp120 und Anti-gp120-Antikörper wurden von DuPont (Wilmington, DE) erworben, und Sätze von Tabletten aus o-Phenylendiaminperoxidasesubstrat wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erworben. Die Reaktionen wurden in kommerziell erhältlichen Mikrotiterplatten von Beckman mit tiefen Wells mit 2 ml durchgeführt.
VERGLEICHSBEISPIEL 1
Pharmakophor-Rekombination für die Identifikation von Verbindungen, die die Wechselwirkung zwischen gp120 und CD4 hemmen können
Um das Prinzip der Pharmakophor-Rekombination zu demonstrieren, etablierten wir ein biochemisches Screening für die Inhibition der gp120-CD4-Bindung. Dieser Test mißt die Fähigkeit kleiner Moleküle, die Bindung von gp120 an sCD4, welcher auf einer Mikrotiterplatte immobilisiert ist, zu hemmen. Die Bindung von sCD4 wurde mit einem an Meerrettichperoxidase konjugierten Anti-gp120-Antikörper mengenmäßig bestimmt.
Allgemeines Verfahren für die Synthese einer Bibliothek von Oximverbindungen
Aus verschiedenen Gründen entschieden wir uns dafür, anfangs O-Methyloxime anstelle von Aldehyden für die erste Bibliothek aus Verbindungsbausteinen zu verwenden. Erstens sind O-Methyloxime das beste Modell für die Pharmakophoren-Einheiten in den abschließenden oximgekoppelten Dimeren. Zweitens sind O-Methyloxime in wäßriger Lösung besser löslich als ihre hydrophoberen Aldehydvorläufer. Auch ist die Oximfunktionalität eindeutig nicht inhärent toxisch und beeinflußt nicht gute Pharmakokinetiken oder die Zellpermeabilität, da Oxime in vielen Arzneimitteln vorliegen. Schließlich lassen sich die O-Methyloxime in einer einstufigen Kondensation von Aldehyden mit O-Methylhydroxylamin leicht herstellen, ohne daß die Reinigung des resultierenden Produkts erforderlich ist. Die chemische Kondensation eines Aldehyds mit O-Methylhydroxylamin unter Bereitstellung einer Oximverbindung ist in 1 gezeigt.
In der ersten Stufe des Verfahrens wurde die anfängliche Oximbibliothek durch separates Kondensieren von O-Methylhydroxylamin mit 252 verschiedenen Aldehyden in einer DMSO-Lösung Synthetisiert. Die Oximbibliothek wurde in einer räumlich getrennten Form in einer Platte im Mikrotiterformat durchgeführt, so daß jeder Well eine einzige Oximverbindung enthielt. Spezieller wurde zu jedem Well einer Mikrotiterplatte eine DMSO-Lösung eines einzigartigen Aldehyds (0,188 ml, 0,15 M, 0,028 mmol) zugegeben. Zu dieser Lösung wurde dann eine DMSO-Lösung von O-Methylhydroxylamin (0,083 ml, 0,5 M, 0,042 mmol) zugegeben, gefolgt von der Zugabe einer DMSO-Lösung von Essigsäure (0,023 ml, 0,5 M, 0,011 mmol). Man ließ die Platten über Nacht bei Raumtemperatur stehen; während dieser Zeit fand die Kondensation statt, wodurch die Bibliothek aus Oximverbindungen mit 252 Mitgliedern bereitgestellt wurde.
Test zur Bestimmung, welche Oximverbindungen die Wechselwirkung zwischen gp120 und CD4 hemmen können
Die 252 Mitglieder umfassende Bibliothek von Oximverbindungen, die wie oben beschrieben hergestellt wurde, wurde dann in einem standardmäßigen ELISA-Test auf das Vorliegen von Verbindungen, die die Wechselwirkung zwischen gp120 und CD4 hemmen können, gescreent. Für den gp120-CD4-ELISA-Test wurde eine Immulon-2-Mikrotiterplatte über Nacht bei 4°C mit 70 ng sCD4 in 100 μl Carbonatpuffer inkubiert. Die Lösung wurde aus der Platte entfernt und dreimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bei einem pH-Wert von 7,4 gewaschen. Die Platte wurde mit 150 μl PBS-Tween-BSA (0,5% BSA, 0,05% Tween-20) für 1 h bei Raumtemperatur blockiert und dann erneut gewaschen. gp120 (1 ng) in 50 μl PBS und 50 μl organische Oxim-Testverbindung (3 mM), 40 μl PBS, 10 μl wurden zugegeben und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde dann gewaschen, und 100 μl mit Meerrettichperoxidase konjugierter Anti-gp120 wurden zugegeben und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Der gebundene gp120 wurde dann mit o-Phenylendiamin als Substrat mengenmäßig bestimmt.
Die Ergebnisse dieser Tests zeigten, daß 30 der 252 Oximverbindungen die Wechselwirkung zwischen gp120 und CD4 hemmen konnten, wobei die ungefähren EC₅₀-Werte im Bereich von etwa 20 μM bis 500 μM lagen. Die strukturell verwandten Aldehydanalogen von 30 dieser Oxime zeigten diverse strukturelle Motive, einschließlich Chromonen, Phenolen und Furanen (siehe 2).
Verknüpfung der oberen 30 strukturell verwandten Aldehydanalogen unter Erzeugung einer Bibliothek von Kandidatenverbindungen und Screenen dieser Kandidatenverbindungen auf die Fähigkeit zur Hemmung der Wechselwirkung zwischen gp120 und CD4
Jedes der 30 strukturell verwandten Aldehydanalogen, die zu den 30 Oximverbindungen korrespondieren, von denen oben herausgefunden wurde, daß sie die Wechselwirkung zwischen gp120 und CD4 hemmen, wurde durch eine Vielzahl von Linkern einzeln mit jedem der anderen 29 Aldehyde gekoppelt, wodurch eine Bibliothek von Kandidatenverbindungen für die Bindung an das Zielmolekül erzeugt wurde. Jedes der 30 einzelnen Aldehyde wurde durch einen O,O'-Diaminoalkandiol-Linker mit einem anderen Aldehyd verknüpft, wodurch die Bibliothek von verknüpften Kandidatenverbindungen erhalten wurde. Jede Aldehydkombination wurde räumlich separat gehalten, doch wurde in jeder Kopplungsreaktion ein äquimolares Gemisch aus fünf verschiedenen O,O'-Diaminoalkandiol-Linkern verwendet, um eine 450 Mitglieder umfassende Bibliothek von verknüpften Kandidatenverbindungen bereitzustellen. Die zur Herstellung der Verbindungen verwendete Chemie ist in 3 gezeigt, welche die Synthese sowohl von Homodimeren als auch von Heterodimeren darstellt.
Die verwendeten fünf Linker bestanden jeweils aus zwei Hydroxylamingruppen, die an eine aliphatische Kette mit entweder zwei, drei, vier, fünf oder sechs Methyleneinheiten angeordnet sind. Dies ermöglichte es uns, jegliche Abstandsabhängigkeit zu beurteilen, die die beiden Pharmakophoren an der Bindungsstelle aufweisen können. Die Linker wurden wie folgt hergestellt. In einen Rundkolben wurden Alkyldibromid (20,2 mmol), N-Hydroxyphthalimid (36,8 mmol, ~ 1,8 Äquiv.) und Dimethylformamid (90 ml) gegeben. Der Kolben wurde auf 0°C gekühlt, und 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (40,5 mmol) wurde tropfenweise unter Rühren zugegeben. Man ließ das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur erwärmen, und dann wurde es über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann in 1 M HCl (500 ml) gegossen. Der resultierende präzipitierte weiße Feststoff wurde mit Wasser (3 × 50 ml) und Methanol (3 × 50 ml) gewaschen und ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe verwendet.
13,9 mmol rohes bis-N-Alkoxyphthalimid wurden dann in Kombination mit Dimethoxyethylenglycol (150 ml) in einen Rundkolben gegeben. Hydrazinmonohydrat (41,8 mmol, 3 Äquiv.) und Dimethoxyethylenglycol (100 ml) wurden in einen weiteren Rundkolben gegeben. Die Suspension von bis-N-Alkoxyphthalimid wurde langsam unter Rühren zu der Hydrazinlösung zugegeben. Der Kolben wurde für 3 h rückflußerhitzt, man ließ ihn auf Raumtemperatur abkühlen, und das resultierende Präzipitat wurde abfiltriert. Die verbleibende Überstandslösung wurde konzentriert, und das Resultierende gelbliche Öl wurde mittels Kugelrohr-Destillation (0,01 mm Hg, 60-70°C) und Säulenchromatographie (89:9:2 CHCl₃/MeOH/NH₄OH) gereinigt.
Für O,O'-Diamino-1,4-butandiol wurde das oben beschriebene allgemeine Syntheseverfahren befolgt. IR (Film aus CH₂Cl₂): 3412,8, 3310,0, 2942,7, 2866,3 cm¹. ¹N-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5,31 (br s, 4H), 3,65 (m, 4H), 1,57 (m, 4H). ¹³C-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 75,5, 24,8. Anal. ber. für C₄H₁₂O₂N₂: C, 39,99, H, 10,07, N, 23,32. Gefunden: C, 40,17, H, 9,90, N, 23,12.
Sobald die fünf Linker erhalten worden waren, wurden die 450 verknüpften Aldehydkombinationen wie folgt hergestellt. In jeden Well wurde eine DMSO-Lösung aus jedem der zwei verschiedenen Aldehyde (jeweils 0,045 ml, 0,15 M, 0,007 mmol) zugegeben. Zu dieser Lösung wurde eine DMSO-Lösung aus einem äquimolaren Gemisch der fünf Linker (0,025 ml, 0,3 M von jedem Linker, 0,007 mmol) zugegeben, gefolgt von der Zugabe einer DMSO-Lösung aus Essigsäure (0,005 ml, 0,5 M, 0,003 mmol). Die Platten wurden über Nacht stehen gelassen, um eine potentielle Ligandenbildung zu ermöglichen.
Jedes der 450 Mitglieder der Bibliothek potentieller Liganden wurde dann bei einer Konzentration von jeweils 100 μM (d.h. einer Konzentration, die um das 10-fache stärker verdünnt ist als die Konzentration, die bei dem anfänglichen Screening der Oximmonomere verwendet wurde) unter verwendung des oben beschriebenen ELISA-Tests auf die Fähigkeit zur Hemmung der Wechselwirkung zwischen gp120 und CD4 getestet. Die Ergebnisse dieser Tests demonstrierten, daß bei der verwendeten Konzentration mehr als 300 der 450 Mitglieder der Bibliothek potentieller Liganden mehr als 50% Inhibitionsaktivität zeigten. Wenn die 450 Mitglieder der Bibliothek potentieller Liganden bei einer Konzentration von jeweils 1 μM auf die Fähigkeit zur Hemmung der Wechselwirkung zwischen gp120 und CD4 getestet wurden, zeigten 17 der Liganden bei dieser Konzentration mehr als 50% inhibitorische Aktivität. Die chemischen Strukturen von 12 der 17 aktivsten Aldehydvorläufer sind in 4 gezeigt.
Beurteilung der Abhängigkeit zwischen der Länge des Linkers und der Aktivität
Die 17 verknüpften Aldehydkombinationen mit der größten Aktivität wurden dann wie oben beschrieben mit einem einzigen Linker pro Well (85 separate Wells) neu synthetisiert, um die Abhängigkeiten zwischen der Länge des Linkers und der Bindung zu beurteilen. Das Screenen jeder der 85 Ligandenverbindungen mit einer Konzentration von jeweils 1 μM zeigte, daß Liganden, die Pharmakophore 1 beinhalteten (siehe 5), potenter waren als die anderen Liganden und daß tatsächlich eine Abhängigkeit von der Länge des Linkers gegeben war. Speziell waren Liganden mit Linkern mit entweder 4 oder 5 Methyleneinheiten viel aktiver als Liganden mit Linkern mit 6 Methyleneinheiten, wohingegen Liganden mit Linkern mit entweder 2 oder 3 Methyleneinheiten nur etwas aktiver waren als Liganden mit Linkern mit entweder 4 oder 5 Methyleneinheiten.
Biologische und analytische Charakterisierung repräsentativer Liganden
Einer der Liganden, die eine starke Aktivität beim Hemmen der Wechselwirkung zwischen gp120 und CD4 zeigten (siehe 6), wurde erneut synthetisiert, wobei jeder der fünf verschiedenen Linker in großem Umfang vorlag, und dann mittels Säulenchromatographie gereinigt. Die Reinigung mittels Säulenchromatographie ermöglichte die Isolation des Heterodimers von dem Homodimer.
Die Synthese organischer Oximverbindungen in großem Maßstab wurde wie folgt durchgeführt. In einen flammengetrockneten Rundkolben wurden Aldehyd (0,82 mmol) und DMSO (8 ml) gegeben. Dann wurden 0,9 M O-Methylhydroxylamin (1,4 ml) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in Methylenchlorid (50 ml) gegossen, mit H₂O (3 × 20 ml) gewaschen, getrocknet und konzentriert. Silicagelchromatographie lieferte die reinen organischen Oximverbindungen.
Die durch dieses Verfahren hergestellten Oximverbindungen wurden wie folgt charakterisiert.
(1) O-Methyloxdim aus 6-Nitropigeronal
Die Umsetzung von 6-Nitropiperonal mit O-Methylhydroxylamin lieferte vorherrschend ein Oximisomer, welches mittels Silicagelchromatographie gereinigt wurde (10:90 EtOAc/Hexane). ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8,61 (s, 1H), 7,53 (s, 1H), 7,37 (s, 1H), 6,15 (s, 2H), 4,00 (s, 3H). Anal. ber. für C₉H₈O₅N₂: C, 48,22, H, 3,60, N, 12,50. Gefunden: C, 48,40, H, 3,75, N, 12,56.
(2) O-Methyloxim aus 6,8-Dichlor-3-formylchromon
Die Umsetzung von 6,8-Dichlor-3-formylchromon lieferte 1:1-cis/trans-Isomere, die mittels Silicagelchromatographie isoliert wurden (20:80, CH₂Cl₂/Hexane).
Isomer 1: ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8,48 (s, 1H), 8,24 (s, 1H), 8,12 (d, 1H, J = 2,5), 7,75 (d, 1H, J = 2,5), 3,97 (s, 3H). Anal. ber. für C₁₁H₇O₃NCl₂: C, 48,56, H, 2,59, N, 5,15. Gefunden: C, 48,44, H, 2,47, N, 5,03.
Isomer 2: ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9,45 (s, 1H), 8,12 (d, 1H, J = 2,5), 7,75 (d, 2H, J = 2,5), 4,07 (3H). Anal. ber. für C₁₁H₇O₃NCl₂: C, 48,56, H, 2,59, N, 5,15. Gefunden: C, 48,45, H, 2,49, N, 5,11.
Die Synthese von Oximliganden in großem Maßstab wurde wie folgt durchgeführt. In einen flammengetrockneten Rundkolben wurden 10 ml DMSO und 1,03 mmol von jedem der zwei Aldehyde, die in den Liganden aufgenommen werden sollten, gegeben. Nachdem alle Feststoffe gelöst waren, wurde eine Lösung des geeigneten Linkers (1,24 mmol) in 1 ml DMSO tropfenweise zugegeben, gefolgt von der Zugabe von Essigsäure (0,72 mmol). Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann in Methylenchlorid (50 ml) gegossen, mit H₂O (3 × 20 ml) gewaschen, getrocknet und konzentriert. Silicagelchromatographie lieferte die isolierten Homo-/Heterodimere. Cis/trans-Isomere, wenn vorhanden, wurden nicht getrennt und als Gemische von Isomeren gereinigt. Die durch dieses Verfahren hergestellten Oximdimere wurden unten charakterisiert.
(1) Oximheterodimer aus 6 8 Dichlor-3-formylchromon und 6-Nitropigeronal Linker enthält 4 Methyleneinheiten
Das Heterodimer wurde mittels Silicagelchromatographie (20:80, EtOAc/Hexane) von den Homodimeren getrennt. Das Heterodimer wurde isoliert und als ein 1:1-Gemisch aus cis/trans-Isomeren charakterisiert. Anal. ber. für C₂₂H₁₇O₈N₃Cl₂: C, 50,59, H, 3,28, N, 8,05. Gefunden: C, 50,70, H, 3,40, N, 7,89.
Isomer 1: ¹N-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9,42 (s, 1H), 8,55 (s, 1H), 8,00 (s, 1H), 7,67 (m, 2H), 7,39 (s, 1H), 7,27 (s, 1H), 6,09 (s, 2H), 4,22 (m, 4H), 1,84 (m, 4H).
Isomer 2: ¹N-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8,54 (s, 1H), 8,41 (s, 1H), 8,16 (s, 1H), 7,99 (s, 1 H), 7,67 (s, 1H), 7,40 (s, 1H), 7,24 (s, 1H), 6,08 (s, 2H), 4,22 (m, 4H), 1,83 (m, 4H).
(2) Oximheterodimer aus 6,8-Dichlor-3-formylchromon und 6-Nitropigeronal, Linker enthält 5 Methyleneinheiten
Das Heterodimer wurde mittels Silicagelchromatographie (20:80, EtOAc/Hexane) von den Homodimeren getrennt. Das Heterodimer wurde isoliert und als ein 1,5:1-Gemisch aus cis/trans-Isomeeren charakterisiert. Anal. ber. für C₂₃H₁₉O₈N₃Cl₂: C, 51,51, H, 3,57, N, 7,83. Gefunden: C, 51,68, H, 3,70, N, 7,66.
Isomer 1: ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8,62 (s, 1H), 8,47 (s, 1H), 8,24 (s, 1H), 8,10 (s, 1H), 7,74 (s, 1H), 7,73 (s, 1H), 7,37 (s, 1H), 6,14 (s, 2H), 4,20 (m, 4H), 1,8 (m, 4H), 1,53 (m, 2H).
Isomer 2: ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 9,47 (s, 1H), 8,61 (s, 1H), 8,11 (s, 1H), 7,75 (s, 2H), 7,48 (s, 1H), 7,33 (s, 1H), 6,14 (s, 2H), 4,30 (t, 2H, J = 6,6), 4,20 (m, 2H), 1,80 (m, 4H), 1,53 (m, 2H).
Diese gereinigten Heterodimere und Homodimere wurden dann wie oben beschrieben auf die Fähigkeit zur Hemmung der Wechselwirkung zwischen gp120 und CD4 getestet. Die Ergebnisse dieser Tests demonstrierten, daß die in 6 gezeigten Heterodimere, die einen Linker aufweisen, der 2 bis 5 Methyleneinheiten enthält, EC₅₀-Werte im Bereich von 0,6 bis 1,5 μM zeigten und eine 10- bis 20-fache Verstärkung der inhibitorischen Aktivität gegenüber der in 5 gezeigten Verbindung (EC₅₀ im Bereich von etwa 10-15 μM) aufwiesen. Die andere Verbindung, die in das Heterodimer aufgenommen wurde, hatte einen EC₅₀-Wert von mehr als 50 μM.
Die in 6 gezeigten Heterodimere, die Linker aufweisen, die 2 bis 5 Methyleneinheiten enthalten, sind von vergleichbarer Wirksamkeit wie die potentesten Verbindungen, von denen bislang herausgefunden wurde, daß sie die Wechselwirkung von CD4/gp120 blockieren (Tanaka et al., J. Antibiotics 50:58 (1997), Sun et al., J. Antibiotics 49:689 (1997), Jarvest et al., Bio. Med. Chem. Lett. 3:2851 (1993) und Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5872 (1992)). Zusätzlich sind diese Heterodimerliganden beträchtlich weniger komplex als zuvor identifizierte Verbindungen mit vergleichbarer Aktivität. Eine weitere Optimierung der optimalen Baustein- und Linkerkombinationen könnte möglicherweise durch Beurteilen eines größeren Bereichs von Linkern mit größerer Festigkeit oder durch Aufnahme von Analogen der optimalen Aldehydvorläufer bewerkstelligt werden.
VERGLEICHSBEISPIEL 2
Pharmakophor-Rekombination unter Verwendung von N,N-Dimethylaminen und anderen Diamin-Linkern
Zusätzlich zur Verwendung von Aldehyden und Oximen für die Pharmakophor-Rekombination, wie oben beschrieben, finden auch zusätzliche Chemien Verwendung. In diesem Beispiel sind die organischen Verbindungsbausteine N,N-Dimethylaminverbindungen, die durch reduktive Aminierung von Ausgangs-Aldehyden und Dimethylamin unter Verwendung von trägergebundenem Triacetoxyborhydrid hergestellt werden (Kaldor et al., Tetrahedron Lett. 37:7193-7196 (1996)). Die Chemie dieser Reaktionen ist in 7 gezeigt. Die Entfernung des trägergebundenen Reduktionsmittels durch Filtration, gefolgt von Konzentration zur Entfernung des flüchtigen überschüssigen Dimethylamins liefert dann die reinen N,N-Dimethylaminmonomerbausteine. Alternativ können die N,N-Dimethylaminbausteine durch Reduktion unter Verwendung eines Reduktionsmittels auf Basis von Natriumborhydrid in Lösung erhalten werden. Das resultierende Aminprodukt wird dann aus dem überschüssigen Reduktionsmittel oder Aldehyd isoliert, indem man es eine saure Ionenaustauschsäule durchlaufen läßt. Das Aminprodukt wird dann durch Elution aus der Ionenaustauschsäule mit einem flüchtigen Amin, wie Ammoniak, gefolgt von Konzentration, erhalten.
Die Verknüpfung der N,N-Dimethylaminbausteine kann unter Verwendung der Diamin-Linker bewerkstelligt werden, von denen viele kommerziell erhältlich sind und viele weitere unter Verwendung gut bekannter Verfahren leicht hergestellt werden können. Die kommerzielle Verfügbarkeit der Diaminverknüpfer ermöglicht eine rasche Optimierung der Linkerlänge, -festigkeit, und -Orientierung. Ein beispielhafter Syntheseablauf ist in 8 gezeigt. Speziell wird trägergebundenes Chlorid (3) (oder ein anderes trägergebundenes Halogenid) mit einem Überschuß an Diamin behandelt, um einen von Amin abgeleiteten Träger (4) zu liefern. Die Acylierung der Aminfunktionalität liefert dann trägergebundenes Formamid oder Carbamat (5). Die Reduktion liefert dann trägergebundenes sekundäres Amin (6). Die reduktive Aminierung bringt dann eines der Pharmakophoren-Elemente (7) ein. Die Säurebehandlung setzt dann ein sekundäres Amin aus dem Träger frei, welches dann unter Bereitstellung des gewünschten Pharmakophoren-Heterodimers (es können entweder trägergebundene Reagenzien oder alternative Einfangverfahren verwendet werden) mit dem zweiten Pharmakophoren-Monomer und Natriumtriacetoxyborhydrid umgesetzt werden kann. Die anfängliche Anheffung des Diamins an den Träger kann unter Verwendung anderer trägergebundener Alkylhalogenide bewerkstelligt werden oder sie könnte durch reduktive Aminierung eines trägergebundenen Aldehyds oder Ketons bewerkstelligt werden. Es sind weniger Linker erhältlich, die zwei sekundäre Amingruppen enthalten, diese können jedoch auch aufgenommen werden. In diesem Fall würden die Stufe der Acylierung (4 bis 5 in 8) und die nachfolgende Stufe der Reduktion (5 bis 6 in 8) entfallen.

Claims

Bibliothek von Zielbindungsfragmentkandidaten (CTBFs), wobei jedes Fragment ein kleines organisches Molekül ist und jedes Mitglied der Bibliothek durch die folgende Formel repräsentiert wird CTBF-S-S-R⁸ wobei R⁸ ein geradkettiges Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, welches mit einer Aminogruppe substituiert ist, und wobei die Bibliothek wenigstens zwei CTBFs umfaßt.
CTBF nach Anspruch 1, wobei jedes CTBF aus der Bibliothek weiterhin wenigstens eine zweite Bindungsgruppe (LG) enthält, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Amid, sekundärem Amid, Disulfid, Sulfonamid, Ureido, Thioharnstoff, Carbamat und Sulfonamid.
CTBF nach Anspruch 2, wobei die zweite LG ein Amid ist.
CTBF nach Anspruch 2, wobei die zweite CTBF ein Sulfonamid ist.
CTBF-Bibliothek nach Anspruch 1, wobei jedes CTBF aus der Bibliothek weiterhin wenigstens eine zweite LG enthält, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Amid, sekundärem Amid, Disulfid, Sulfonamid, Ureido, Thioharnstoff, Carbamat und Sulfonamid.
CTBFs nach Anspruch 5, wobei die zweite LG ein Amid ist.
CTBFs nach Anspruch 5, wobei die zweite LG ein Sulfonamid ist.
Verfahren zum Screenen einer Bibliothek von kleinen organischen Molekülen hinsichtlich eines oder mehrerer Zielbindungsfragmentkandidaten (CTBFs), die an ein biologisches Zielmolekül (IBM) binden, wobei jedes CTBF eine verknüpfbare funktionelle Gruppe (LFG) oder eine blockierte Form davon (BLFG) hat, wobei die LFG oder die BLFG eine Disulfid-Linker-Gruppe (LG) enthält, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: (a) Inkontaktbringen des TBM mit einzelnen Mitgliedern der CTBF-Bibliothek nach Anspruch 1, (b) Detektieren oder Bestimmen, welche CTBFs an das TBM binden, und (c) Auswählen von CTBFs, die an das TBM binden.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei in (b) ein funktioneller Test, ausgewählt unter einem ELI-SA-Test oder einem enzymatischen Test, verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei jedes CTBF weiterhin eine zweite LG enthält, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Amid, sekundärem Amid, Disulfid, Sulfonamid, Ureido, Thioharnstoff, Carbamat und Sulfonamid.
Verfahren nach Anspruch 8, welches weiterhin das Verbinden wenigstens zweier der ausgewählten CTBFs oder von Analogen davon umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 8, welches weiterhin das Umwandeln der ausgewählten CTBFs in strukturell verwandte Analoge davon umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 8, welches weiterhin das Verbinden der ausgewählten CTBFs mit einer pharmazeutisch wirksamen Verbindung oder einem anderen Träger umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das TBM ein Protein ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Protein ein Hormon, ein Zytokin, ein Chemokin oder ein Rezeptor ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das TBM ein Enzym ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Enzym eine Protease, eine Phosphatase (Dephosphorylase) oder eine Kinase ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Bibliothek von CTBFs kleine organische Moleküle mit Molekulargewichten von weniger als etwa 1000 Dalton umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Bibliothek von CTBFs kleine organische Moleküle mit Molekulargewichten von weniger als etwa 500 Dalton umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei (b) durch einen biologischen Test in vitro durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei (b) einen ELISA-Test umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Bibliothek von CTBFs zum Binden an ein TBM wenigstens etwa 100 verschiedene CTBFs umfaßt.