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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft einen Biosensor für die rasche und vereinfachte
Mengenbestimmung eines Substrats in einer Probe mit hoher Genauigkeit.
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Herkömmlicherweise
sind Verfahren unter Verwendung der Polarimetrie, Colorimetrie,
Reduktometrie, einer Vielfalt von Chromatographie- und dergleichen
Verfahren entwickelt worden als Maß für eine quantitative Analyse
von Zuckern, wie etwa Sucrose, Glukose und dergleichen. Diese herkömmlichen
Verfahren sind jedoch sämtliche
unzureichend spezifisch für
Zucker und besitzen damit eine unzureichende Genauigkeit. Von den
Genannten ist die Polarimetrie einfach bezüglich der Manipulation, jedoch
stark beeinträchtigt
durch die Temperatur bei der Manipulation. Dieses Verfahren ist
deshalb nicht geeignet für
eine einfache Quantifizierung bzw. Mengenbestimmung des Zuckerpegels
im Heimeinsatz durch normale Leute.
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Andererseits
ist eine Vielzahl von Biosensoren vor kurzem entwickelt worden,
welche eine spezifische katalytische Wirkung von Enzymen vorteilhaft
nutzt.
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Im
Folgenden wird ein Verfahren für
eine quantitative Analyse von Glukose als Beispiel des Verfahrens
zur Mengenbestimmung eines Substrats in einer Probenlösung erläutert. Bei
einer herkömmlich
bekannten elektrochemischen Quantifizierung von Glukose handelt
es sich um ein Verfahren zur Verwendung einer Kombination aus Glukoseoxidase (EC
1.1.3.4; nachfolgend abge kürzt
als "GOD" bezeichnet) mit
einer Sauerstoffelektrode oder einer Wasserstoffperoxidelektrode
(siehe "Biosensor", herausgegeben durch
Shuichi Suzuki, Kodansha beispielsweise).
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GOD
oxidiert selektiv ein β-D-Glukose-Substrat
in D-Glucono-δ-Lacton unter Verwendung
von Sauerstoff als Elektronenmediator. Sauerstoff wird durch Wasserstoffperoxid
während
der Oxidationsreaktion durch GOD in Anwesenheit von Sauerstoff reduziert.
Ein verringertes Sauerstoffvolumen wird durch die Sauerstoffelektrode
gemessen oder ein erhöhtes
Wasserstoffperoxidvolumen wird durch die Wasserstoffperoxidelektrode
gemessen. Das verringerte Sauerstoffvolumen oder anderweitig das
erhöhte
Wasserstoffperoxidvolumen ist proportional zum Glukosegehalt in
der Probenlösung.
Die Glukosekonzentration in der Probenlösung kann deshalb mengenmäßig bestimmt
werden auf Grundlage des verringerten Sauerstoffvolumens bzw. des
erhöhten Wasserstoffperoxidvolumens.
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Wie
aus der Oxidationsreaktion durch GOD spekulativ angenommen, ist
dieses Verfahren gemäß dem Stand
der Technik jedoch mit dem Nachteil eines starken Einflusses auf
das Messergebnis der Sauerstoffkonzentration in der Probenlösung behaftet.
In dem Fall, dass Sauerstoff in der Probenlösung nicht vorliegt, erlaubt
dieses Verfahren selbst keine Messung.
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Unter
diesen Umständen
ist ein Glukosesensor neuen Typs entwickelt worden, der als Elektronenmediator
eine organische Verbindung bzw. einen Methankomplex nutzt, wie etwa
Kaliumferricyanid, Ferrocenderivat, Quinondericat etc. anstelle
von Sauerstoff in der Probenlösung.
Dieser Sensor reoxidiert eine reduzierte Form eines Elektronenmediators,
der aus der Enzymreaktion herrührt,
um die Glukoseskonzentration in der Probenlö sung auf Grundlage einer Oxidationsstroms
zu messen, welche durch die Reoxidationreaktion erzeugt wird. Die
Verwendung einer derartigen organischen Verbindung bzw. eines Metallkomplexes
als Elektronenmediator anstelle von Sauerstoff gewährleistet
eine präzise Platzierung
einer bekannten GOD-Menge zusammen mit dem Elektronenmediator in
ihrem stabilen Zustand auf dem Elektrodensystem bei der Bildung einer
Reagenzschicht auf dem Elektrodensystem. Zu diesem Zeitpunkt kann
die Reagenzschicht mit dem Elektrodensystem integriert werden, während die Erstgenannte
in nahezu trockenem Zustand gehalten wird. Ein wegwerfbarer Glukosesensor
auf Grundlage dieser Technologie ist deshalb kürzlich auf starkes Interesse
gestoßen.
Dieser wegwerfbare Glukosesensor erleichtert eine Messung der Glukosekonzentration
unter Verwendung eines Messgerätes
ausschließlich
an dem Sensor durch einfache Einführung einer Probelösung in
den Sensor, welcher mit dem Messgerät lösbar verbunden ist. Die Anwendung
dieser Technik ist nicht auf die Glukosequantifizierung bzw. -mengenermittlung
beschränkt,
sondern kann auf die Mengenermittlung eines beliebigen anderen Substrats
ausgedehnt werden, das in der Probenlösung vorliegt.
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Eine
Messung unter Verwendung des vorstehend genannten Sensors führt zu einer
Ermittlung der Substratkonzentration in einer Probe auf Grundlage
eines Oxidationsstroms, der bei einer Oxidation einer reduzierten
Form eines Elektronenmediators auf eine Arbeitselektrode fließt. Wenn
es sich bei der Probe um Blut, Fruchtsaft oder dergleichen handelt, wird
jede leicht oxidierbare Substanz, wie etwa Ascorbinsäure, Urinsäure und
dergleichen in der Probe auf der Arbeitselektrode zusammen mit der
reduzierten Form des Elektronenmediators oxidiert. Diese Oxidation
einer leicht oxidierbaren Substanz beeinträchtigt mitunter das Messergebnis.
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Die
Messung unter Verwendung des vorstehend genannten Sensors ist mit
dem weiteren Problem einer gleichzeitigen Entwicklung der Reduktion des
Elektronenmediators verbunden, der auf der Reagenzschicht getragen
ist, zusammen mit der Erzeugung von Wasserstoffperoxid unter Verwendung
von aufgelöstem
Sauerstoff in der Probe als Elektronenmediator. Das derart erzeugte
Wasserstoffperoxid wirkt dahingehend, die reduzierte Form des Elektronenmediators
zu reoxidieren. Dies führt
mitunter zur Erzeugung von Messverfälschungen in den Messergebnissen
durch den aufgelösten
Sauerstoff, wenn die Substratkonzentration auf Grundlage des Oxidationsstroms
der reduzierten Form des Elektronenmediators ermittelt werden muss.
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Ein
Biosensor der im Oberbegriff des Anspruchs 1 festgelegten Art ist
aus der EP-A-0 732 406 und aus der EP-A-0 537 761 bekannt.
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KURZE ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Um
das vorstehend genannte Problem der Biosensoren gemäß dem Stand
der Technik zu überwinden,
besteht der Gegenstand der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung
eines Biosensors, wie er im Anspruch 1 festgelegt ist.
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Die
normale Positionsbeziehung zwischen der Reagenzschicht und der dritten
Elektrode ist derart, dass die Reaktionsschicht stromabwärts von
der dritten Elektrode innerhalb des Probenlösungszufuhrpfads zu liegen
kommt.
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Die
Reaktionsschicht ist bevorzugt in Kontakt mit der dritten Elektrode,
der Arbeitselektrode und/oder der Gegenelektrode gegenüber liegenden Elektrode
gebildet. Es ist sogar stets erforderlich, eine Reagenzschicht stromabwärts von
der dritten Elektrode zu bilden, wenn die Probenlösung, welche in
den Sensor eingeführt
worden ist, die Reagenzschicht doch noch nicht aufgelöst hat,
mit anderen Worten, wenn sie frei von einer reduzierten Form des Elektronenmediators
ist, irgendetwas durch die dritte Elektrode Oxidierbares enthält, und
wobei ein Oxidationsstrom zum Oxidieren dieser oxidierbaren Substanz
gemessen werden kann, bevor die Probenlösung, welche die Reaktionsschicht
auflöst
und damit den reduzierten Elektronenmediator durch die Enzymreaktion
enthält,
an der dritten Elektrode anlangt.
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Es
ist bevorzugt, eine Schicht im Wesentlichen Lecithin enthaltend
in einer vorbestimmten Position an einer Stelle getrennte von der
dritten Elektrode, bevorzugt in einer Position im Kontakt mit der Reaktionsschicht
enthält.
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Bevorzugt
enthält
die Reagenzschicht ferner ein hydrophiles Polymer.
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Währen die
neuartigen Merkmale der Erfindung insbesondere in den anliegenden
Ansprüchen ausgeführt sind,
lässt sich
die Erfindung sowohl hinsichtlich ihres Aufbaus wie ihres Inhalts
besser verstehen und würdigen
zusammen mit weiteren Aufgaben und Merkmalen aus der nachfolgenden
detaillierten Beschreibung in Verbindung mit den Zeichnungen.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER MEHREREN ANSICHTEN DER ZEICHNUNG
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1 zeigt
eine perspektivische Explosionsansicht eines Glukosesensors gemäß einem
Beispiel in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung, von welchem die Reagenzschicht weggelassen
ist.
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2 zeigt
eine perspektivische Explosionsansicht eines Glukosesensors gemäß einem
weiteren Beispiel in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung, von welchem die Reagenzschicht weggelassen
ist.
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3 zeigt
eine perspektivische Explosionsansicht eines Glukosesensors vor
noch einem weiteren Beispiel gemäß der vorliegenden
Erfindung, von welchem die Reagenzschicht weggelassen ist.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Der
Biosensor in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Offenbarung stellt eine Modifikation eines
Biosensors gemäß dem Stand
der Technik dar, enthaltend ein Elektrodensystem mit einer Arbeitselektrode
und einer Gegenelektrode, eine Reagenzschicht, welche eine Oxidoreduktase
und einen Elektronenmediator enthält, und mit einer elektrisch
isolierenden Basisplatte zum Tragen des Elektrodensystems und der
Reagenzschicht, wobei eine Probenlösung der Reagenzschicht hinzugeführt wird,
um eine Enzymreaktion hervorzurufen, um den Elektronenmediator zu
reduzieren, wobei der resultierende Elektronenmediator reduzierter
Form auf der Arbeitselektrode reoxidiert wird, um eine Substratkonzentration
in der Probenlösung
aus dem Oxidationsstrom zu ermitteln, welche durch die Reoxidationsreaktion fließt. Die
vorliegende Offenbarung fügt
dem vorstehend genannten Biosensor eine zusätzliche dritte Elektrode zu,
welche die doppelte Funktion als interferierende Substanzermittlungselektrode
hat, welche in einer Position in Gegenüberlage zu mindest entweder
der Arbeitselektrode oder Gegenelektrode angeordnet ist und unter
Anordnung der Reagenzschicht in einer vorstehenden Position entfernt
von der dritten Elektrode.
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In
der vorliegenden Offenbarung umfasst der Biosensor eine elektrisch
isolierende Basisplatte, ein elektrisch isolierendes Abdeckelement
zum Bilden eines Probenlösungszufuhrpfads
zwischen dem Abdeckelement und der Basisplatte, und ein Elektrodensystem
sowie eine Reagenzschicht, die beide auf der Basisplatte bzw. dem
Abdeckelement derart gebildet sind, dass sie dem Probenlösungszufuhrpfad ausgesetzt
sind, wobei die dritte Elektrode in einer gegenüberliegenden Position, wie
nachfolgend festgelegt, zu zumindest entweder der Arbeitselektrode oder
der Gegenelektrode angeordnet ist, wobei die Reagenzschicht in einer
Position in einer bestimmten Position entfernt von der dritten Elektrode
innerhalb des Probenlösungszufuhrpfads
angeordnet ist.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Offenbarung besteht das Abdeckelement aus einer
elektrisch isolierten Basisplatte und einem Abstandhalter, der einen
Schlitz zur Bildung des Probenlösungszufuhrpfads
aufweist. Mehr im Einzelnen besteht der Biosensor aus zwei Schichten
bzw. Lagen mit einer elektrisch isolierten Basisplatte und einem
Abstandhalter. In dem Biosensor in Übereinstimmung mit der vorliegenden
Erfindung gilt folgendes:
- a) die Arbeits- und
Gegenelektroden 2, 4 sind entweder auf der Basisplatte 1 oder
dem Abdeckelement 11 gebildet, während die dritte Elektrode 7 auf
dem andere Teil, der Basisplatte bzw. dem Abdeckelement gebildet
ist;
- b) ausschließlich
die Arbeitselektrode 2 ist entweder auf der Basisplatte 1 oder
dem Abdeckelement 11 gebildet, während die Gegen- und dritten Elektroden 4, 7 auf
dem anderen Teil, der Basisplatte bzw. dem Abdeckelement gebildet
sind;
- c) die Arbeits- und dritten Elektroden 2, 7 sind
entweder auf der Basisplatte oder dem Abdeckelement 11 gebildet,
während
die Gegenelektrode 4 auf dem anderen Teil, der Basisplatte
oder dem Abdeckelement gebildet ist,
wobei in den Alternativen
a) und b) die Reagenzschicht auf der Arbeitsplatte 1 gebildet
ist, auf welcher die Arbeitselektrode vorgesehen ist, und wobei in
der Alternative c) diese Schicht auf der Basisplatte 1 gebildet
ist, auf welcher die Gegenelektrode 4 vorgesehen ist.
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Es
ist bevorzugt, die Reagenzschicht in einer Position in Kontakt mit
derjenigen Elektrode zu bilden, die sich in Gegenüberlage
zu der Elektrode befindet. Die vorliegende Offenbarung ist jedoch
nicht auf diese Anordnung beschränkt;
vielmehr kann die Reagenzschicht in einer alternativen Position
derart angeordnet sein, dass eine rohe Probenlösung an der dritten Elektrode
zu einer bestimmten Zeit vor Ankunft an der dritten Elektrode eines
Produkts der Enzymreaktion anlernen kann aufgrund der Auflösung der
Reagenzschicht in der Probenlösung,
welche auf dem Weg des Probenlösungszufuhrpfads
zugeführt wird.
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Wenn
die Probenlösung
eine leicht oxidierbare Substanz enthält, spiegelt der Oxidationsstrom in Übereinstimmung
mit der Struktur des Biosensors in Übereinstimmung mit der vorliegenden
Erfindung, welcher Oxidationsstrom über die dritten und Gegenelektroden
in einem anfänglichen
Zustand der Messung nach der Probenzufuhr fließt, mit anderen Worten, vor
Ankunft der reduzierten Form des Elektronenmediators als Produkt
der Enzymreaktion an der dritten Elektrode, ausschließlich die
Konzentration der leicht oxidierbaren Substanz. Die nachfolgende Messung
des Oxidationsstroms über
die Arbeits- und Gegenelektroden nach Ablauf von ausreichend Zeit, reflektiert
den Strom, der erzeugt wird durch die Oxidationsreaktion der leicht
oxidierbaren Substanz in der Probenlösung und der Oxidationsreaktion
der reduzierten Form des Elektronenmediators, der aus der Enzymreaktion
resultiert.
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Eine
Korrektur des Oxidationsstromwerts, der durch die nachfolgende Messung
erhalten wird, und zwar durch diejenige, die durch die anfängliche Messung
erhalten wird, ergibt deshalb eine präzise Konzentration des Substrats
in der Probe.
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Wenn
die zugeführte
Probe Sauerstoff enthält,
ermöglicht
die Anlegung eines geeigneten Potenzials an die dritte Elektrode
in einer anfänglichen Stufe
der Messung nach der Probenzufuhr, wie vorstehend angeführt, eine
Messung des Oxidationsstroms, der die Konzentration des aufgelösten Sauerstoffs
in der Probe reflektiert. Wenn die Substratkonzentration in der
Probe aus dem Oxidationsstrom ermittelt wird, der zur Reoxidation
der reduzierten Form des Elektronenmediators aufgrund der Enzymreaktion
erforderlich ist, versagt der aufgelöste Sauerstoff in der Probe
negative Fehler der gemessenen Werte. Eine ähnliche Korrektur bezüglich des
Messwerts durch den Oxidationsstrom, der den aufgelösten Sauerstoff
reflektiert, ergibt eine präzise
Substratkonzentration, aus welcher jeglicher Einfluss des aufgelösten Sauerstoffs
ausgeschlossen ist.
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In
der vorliegenden Erfindung wird die Oxidoreduktase, die in der Reagenzschicht
enthalten sein soll, so ausgewählt,
dass sie für
den Typ des Substrats in der Probenlösung passt. Beispielhafte Oxidoreduktasen
umfassen Fructosedehydrogenase, Glucoseoxidase, Alkoholoxidase,
Lactatoxidase, Cholesteroloxidase, Xanthinoxidase, Aminosäureoxidase
und dergleichen.
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Beispiele
des Elektronenmediators umfassen Kaliumferricyanid, p-benzoquinon,
Phenzinmethosulfat, Methylen blau, Ferrocenderivate. Diese Elektronenmediatoren
werden einzeln oder in Kombinationen aus zwei oder mehr genutzt.
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Das
vorstehend genannte Enzym und der vorstehend genannte Elektronenmediator
können
in der Probenlösung
aufgelöst
werden bzw. sein. Anderweitig kann verhindert werden, dass sie in
der Probenlösung
aufgelöst
werden, und zwar durch Fixieren der Reagenzschicht an der Basisplatte
oder anderen Teilen. Wenn die zuletzt genannte Basisplatte zum Einsatz
kommt, ist es bevorzugt, dass die Reagenzschicht außerdem eines
der nachfolgend genannten hydrophilen Polymere enthält.
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Eine
Vielzahl von hydrophilen Polymeren sind auf der Reagenzschicht anwendbar.
Beispielhafte hydrophile Polymere für diesen Zweck umfassen Carboxymethylzellulose,
Hydroxyethylzellulose, Hydroxypropylzellulose, Methylzellulose,
Ethylzellulose, Ethylhydroxyethylzellulose, Carboxymethylethylzellulose,
Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Polyaminosäuren, wie
etwa Polylysol, Polystyrolsulfonat, Gelatine und ihre Derivate,
ein Polymer der Acrylsäure
oder ein Acrylat, ein Polymer der Methacrylsäuren oder ein Methacrylat,
Stärke
und ihre Derivate, ein Polymer von Maleinanhydrid oder ein Maleat
und dergleichen. Von diesen sind Carboxymethylzellulose, Hydroxye thylzellulose,
Hydroxypropylzellulose, Methylzellulose, Ethylzellulose, Ethylhydroxyethylzellulose
und Carboxymethylethylzellulose bevorzugt.
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Obwohl
in den nachstehend genannten Beispielen ein Potenzial von 500 mV
oder von –1,300 mV
an die dritte Elektrode angelegt wird, um die Zufuhr der Probenlösung zu
erfassen, und um die existierende Askorbinsäure oder Sauerstoff in der
Probenlösung
zu ermitteln, wobei diese für
die vorstehend genannten Beispiele gilt, ist die vorliegende Erfindung
nicht auf diese Potenzialwerte beschränkt. Obwohl ein Potenzial von
500 mV an die Arbeitselektrode angelegt wird, um einen Reaktionsstrom
zu erhalten, ist die vorliegende Erfindung nicht auf diesen Wert
beschränkt;
vielmehr kann ein beliebiger Potenzialwert, mit welchem die reduzierte
Form des Elektronenmediators als Produkt einer Reaktionsreihe reoxidiert
werden kann, verwendet werden. Der Messzeitpunkt für den Stromwert
ist nicht auf die spezifische, in dem nachfolgend genannten Beispiel
genannten Werte, beschränkt.
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In
den nachstehend genannten Beispielen sind einige Beispiele des Elektrodensystems
gezeigt. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele
in Bezug auf die Elektrodenform, die Anordnung der Elektroden und
ihrer Leitungen beschränkt und
ebenso wenig auf einfache ??? zum Kombinieren mit anderen Sensorelementen.
Die vorliegende Erfindung ist in den anliegenden Ansprüchen festgelegt.
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Obwohl
Kohlenstoff als Material für
die dritte Elektrode in den nachfolgend genannten Beispielen verwendet,
ist die vorliegende Erfindung nicht auf Kohlenstoff beschränkt; vielmehr
kann ein anderes leitfähiges
Material in ähnlicher
Weise ver wendet werden, wie beispielsweise eine Silberelektrode
bzw. eine Silberchloridelektrode.
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Die
vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand konkreter Beispiele
näher erläutert.
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Beispiel 1
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Ein
Glukosesensor wird nunmehr als Beispiel eines Biosensors erläutert. 1 zeigt
eine perspektivische Explosionsansicht des Glukosesensors gemäß dem Beispiel
1 unter Weglassung der Reagenzschicht.
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Eine
Arbeitselektrode 2 und eine Gegenelektrode 4 sind
auf einer elektrisch isolierten Basisplatte 1 zusammen
mit Leitungsanschlüssen 3 und 5 gebildet,
welche elektrisch mit den Arbeits- und Gegenelektroden 2 und 4 verbunden
sind. Eine dritte Elektrode 7 ist auf einer weiteren elektrisch
isolierten Basisplatte 11 zusammen mit einem Leitungsanschluss 8 gebildet,
der elektrisch mit der dritten Elektrode 7 verbunden ist.
Eine (nicht gezeigte) kreisförmige
Reagenzschicht wird auf der Basisplatte 1 derart gebildet, dass
die Peripherie der Reagenzschicht entlang der Peripherie der Gegenelektrode 4 zu
liegen kommt, um sowohl die Arbeitselektrode 2 wie die
Gegenelektrode 4 abzudecken. Die Bezugsziffern 6 und 9 in
der Figur bezeichnen Isolationsschichten.
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Der
Glukosesensor gemäß dem Beispiel
1 wird zusammengebaut unter Verwendung von zwei Schichten aus einer
elektrisch isolierten Basisplatte 1 und einer solchen Platte 11,
die hergestellt sind aus Polyethylenterephtalat, und unter Verwendung
eines Abstandhalters 12, der sandwichartig zwischen den beiden Basisplatten 1 und 11 angeordnet
wird. Diese Elemente sind aneinander in eine Positionsbeziehung
geklebt, wie in 1 gestrichelt gezeigt, wodurch
ein Glukosesensor gewonnen wird.
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Der
Abstandhalter 12 ist mit einem Schlitz 13 zur
Bildung eines Probenlösungszufuhrpfads
versehen. Die elektrisch isolierende Basisplatte 11 ist
mit einem Belüftungsloch 10 versehen.
Die Basisplatten 1 und 11 sind aneinander laminiert
und geklebt, wobei der Abstandhalter 12 dazwischen angeordnet
ist. Hierdurch kann ein Raum (nicht gezeigt) durch die Basisplatten 1, 11 und
den Abstandhalter 12 gebildet werden, der als Probenlösungszufuhrpfad
dient. Ein offenes Ende 14 des Schlitzes, welches eine
Startseite des Raums festlegt, bildet eine Probenlösungszufuhröffnung bzw.
einen -anschluss und eine Abschlussseite des Raums steht mit der
Luftbohrung bzw. dem Luftloch 10 in Verbindung.
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Eine
Kombination aus Basisplatte 11 und Abstandhalter 12 entspricht
dem vorstehend genannten Abdeckelement. Das Abdeckelement dieses
Biosensors besteht aus zwei Elementen. Es kann jedoch aus ausschließlich einem
Element mit einer Nut entsprechend dem Schlitz 13 des Abstandhalters 12 gebildet
sein.
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Der
Glukosesensor des Beispiels 1 wird wie folgt hergestellt.
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Eine
Silberpaste wurde auf die elektrisch isolierende Platte 1 gedruckt,
die aus Polyethylenterephtalat besteht, und zwar unter Verwendung
eines bekannten Siebdruckverfahrens zur Bildung der Leitungsanschlüsse 3 und 5.
Eine identische Silberpaste wurde auf die andere elektrisch isolierende
Basisplatte 11 in derselben Weise gebildet, um den Leitungsanschluss 8 zu
bilden. Daraufhin wird eine leitfähige Kohlenstoffpaste, enthal tend
ein Harzbindemittel, auf die Basisplatte 1 gedruckt, um
darauf die Arbeitselektrode 2 zu bilden. Die dritte Elektrode 7 wurde
auf der Basisplatte 11 in derselben Weise gebildet. Die
Arbeitselektrode 2 und die dritte Elektrode 7 wurden
elektrisch mit den Leitungsanschlüssen 3 und 8 verbunden.
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Als
nächstes
wurde eine isolierende Paste auf die beiden Basisplatten 1 und 11 gedruckt,
um eine isolierende Schicht auf der Basisplatte 1 und eine
isolierende Schicht 9 auf der Basisplatte 11 zu bilden.
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Die
isolierende Schicht 6 deckt die Peripherie der Arbeitselektrode 2 ab
und die isolierende Schicht 9 deckt die Peripherie der
dritten Elektrode 7 ab, wodurch der freiliegende Bereich
bzw. die freiliegende Fläche
von sowohl der Arbeitselektrode wie der dritten Elektrode 7 konstant
gehalten werden könnten.
Die isolierenden Schichten 6 und 9 decken außerdem die
Leitungsanschlüsse 3 und 5 und
teilweise den Leitungsanschluss 8 ab.
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Daraufhin
wurde eine identische leitfähige Kohlenstoffpaste,
enthaltend ein Harzbindemittel auf die Basisplatte 1 gedruckt,
um darauf die Gegenelektrode 4 zu bilden. Die Gegenelektrode 4 wurde
elektrisch mit den Leitungsanschlüssen 5 verbunden.
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Ein
GOD als Oxidoreduktase enthaltende wässrige Lösung und Natriumferricyanid
als Elektronenmediator wurden auf die Arbeitselektrode 2 und die
Gegenelektrode 4 tropfenweise aufgetragen und getrocknet,
um die Reagenzschicht zu bilden.
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Um
eine gleichmäßige Zufuhr
der Probenlösung
zu der Reagenzschicht zu fördern,
wurde daraufhin eine Lecithinschicht auf der Reagenzschicht gebildet
durch Verteilen bzw. Auftragen eines organischen Lecithinlösungsmittels,
beispielsweise einer Toluollecithinlösung ausgehend von der Probenlösungszufuhröffnung 14 in
Richtung auf die Reagenzschicht, woraufhin sie getrocknet wurde.
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Zu
diesem Zeitpunkt vergrößert die
Einordnung der Lecithinschicht in einer Position in Kontakt mit
der Zwischenschicht 7 Schwankungen der Sensorreaktion.
Dies kann auf der Ausbildung einer Änderung auf der Oberfläche der
dritten Elektrode aufgrund der Lecithinschicht der Fall sein.
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Schließlich wurden
die Basisplatte 1 und 11 und der Abstandhalter 7 in
einer in 1 gestrichelt gezeigten Positionsbeziehung
aneinander geklebt, um den Glukosesensor des Beispiels 1 zu gewinnen.
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Wenn
bei der Herstellung die dritte Elektrode 7, die Arbeitselektrode 2 und
die Gegenelektrode 4 in derselben Ebene angeordnet werden,
deckt die Reaktionsschicht die dritte Elektrode 7 teilweise
ab, was zu einem Fehler im Messergebnis führt. In dem vorstehend beispielhaft
genannten Sensor ist die dritte Elektrode 7 in einer Position
in Gegenüberlage
zur Arbeitselektrode 2 und der Gegenelektrode angeordnet.
Diese Anordnung der dritten Elektrode verringert drastisch Fehler
der Messergebnisse, die durch die Lecithinschicht eingeführt werden,
wie vorstehend angeführt.
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Der
derart hergestellte Glucosesensor wurde in einem Messgerät angeordnet,
welches speziell für den
Sensor bestimmt ist. Daraufhin wurde ein Potenzial von 500 mV an
die dritte Elektrode 7 und Nutzung der Gegenelektrode 4 als
Referenz bzw. Bezugs punkt angelegt. Während das Potenzial angelegt wird,
wurden drei μl
der wässrigen
Glukoselösung, enthaltend
Ascorbinsäure
als interferierende Substanz, dem Sensor als Probe durch die Probenlösungszufuhröffnung 14 zugeführt. Die
Probenlösung bewegt
sich in Richtung auf die Luftbohrung 10 durch den Raum
und löst
die Reagenzschicht auf den Elektrodensystem auf.
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Bei
Zufuhr der Probenlösung
wurde das System zum Ermitteln der Zufuhr der Probe auf Grundlage
einer elektrischen Änderung
zwischen der dritten Elektrode 7 und der Gegenelektrode 4 betätigt, das heißt, auf
Grundlage der Flüssigkeitsverhinderung zwischen
den vorstehend genannten beiden Elektroden auf Grundlage der Probenlösung und
der Zeitgeber, der mit der Messeinrichtung versehen ist, wurde in
Betrieb gesetzt. Während
in diesem Zeitpunkt das Potenzial an der dritten Elektrode 7 und
der Gegenelektrode 4 angelegt gehalten wurde, wurde der über die
beiden Elektroden fließende
Strom nach Ablauf einer bestimmten Zeit ausgehend von der Ermittelung
der Zufuhr der Probenlösung
gemessen. Der gewonnene Stromwert, der aus der Oxidationsreaktion der
Ascorbinsäure
abgeleitet wurde, die in der Probenlösung enthalten ist, und zwar
als interferierende Substanz, war proportional zur Konzentration
der Ascorbinsäure.
Nach einer Messung des Stromwerts über die dritten und Gegenelekroden 7 und 4 wurde die
Potenzialanlegung an die beiden Elektroden unterbrochen bzw. beendet.
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Wie
vorstehend angesprochen, ist die dritte Elektrode 7 in
eine Position in Gegenüberlage
zu der Arbeitselektrode 2 und der Gegenelektrode 4 gebildet
und entfernt von der Reaktionsschicht angeordnet. Es dauert deshalb
eine bestimmte Zeit bis zur Ankunft des Ferrocyanidions an der dritten
Elektrode 7 als Produkt der Enzymreaktion der Reagenzschicht.
Mit anderen Wor ten vermag der Stromwert über den dritten und Gegenelektroden 7 und 4 bis
zu Ankunft des Ferrocyanidions an der dritten Elektrode die Konzentration
ausschließlich
von Ascorbinsäure zu
reflektieren.
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Ein
Potenzial von 500 mV wurde an die Arbeitselektrode 2 unter
Verwendung der Gegenelektrode 4 als Referenz 25 Sekunden
nach Ermittlung der Zufuhr der Probenlösung angelegt und der Stromwert über die
Arbeits- und Gegenelektroden 2 und 4 wurde nach
5 Sekunden gemessen.
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Wenn
die Reagenzschicht in der Probenlösung aufgelöst wird, entwickelt eine Reaktion
von Glukose, GOD und des Ferricyanidions eine resultierende Mischlösung, um
eine Oxidation von Glukose in Glukonolacton und eine Reaktion des
Ferricyanidions in ein Ferrocyanidion zu erzeugen. Die Konzentration
des Ferrocyanidions ist proportional zur Konzentration von Glukose.
Der Strom über
die Arbeits- und Gegenelektroden 2 und 4 30 Sekunden
nach Ermittlung der Zufuhr der Probenlösung beruht auf einer Oxidationsreaktion
zwischen dem Ferrocyanidion und der vorab vorliegenden Ascorbinsäure. Dies
bedeutet, dass die vorab vorliegende Ascorbinsäure einen positiven Fehler
des Messergebnisses hervorruft. Wie vorstehend angesprochen, reflektiert
jedoch der Strom über
die dritten und Gegenelektroden 7 und 4 die Konzentration
von ausschließlich
Ascorbinsäure.
Eine Korrektur des nachfolgenden Messwerts auf Grundlage des Oxidationsstroms
der Ascorbinsäure
ergibt deshalb eine präzise
Konzentration der Glukose, aus welcher jeglicher Einfluss der Ascorbinsäure ausgeschlossen
ist.
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Beispiel 2
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Ein
Glukosesensor wurde in derselben Weise wie im Beispiel 1 mit der
Ausnahme hergestellt, dass Carboxymethylcellulose (nachfolgend abgekürzt "CMC" genannt) in der
Reaktionsschicht angeschlossen bzw. enthalten ist. Daraufhin wurde
der Sensor in derselben Weise wie in Beispiel 1 getestet.
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Zunächst wurde
eine wässrige
CMC-Lösung auf
die Arbeitselektrode 2 und die Gegenelektrode 4 auf
der Basisplatte 1 tropfenweise aufgetragen und getrocknet,
um eine CMC-Schicht zu bilden. Daraufhin wurde eine gemischte wässrige Lösung aus
dem Enzym und dem Elektronenmediator tropfenweise auf der CMC-Schicht aufgetragen.
Dies ist Anlass für eine
vorübergehende
Auflösung
der CMC-Schicht und eine darauf folgende Trocknung führt zu einer Reagenzschicht,
in welchem das Enzym, der Elektronenmediator und CMC gemischt sind.
Wenn die CMC-Schicht aufgelöst
wird, würden
jedoch das Enzym, der Elektronenmediator und CMC nicht vollständig gemischt,
weil die gemischte wässrige
Lösung
zum Aufösen
der CMC-Schicht nicht gerührt worden
war. Hierdurch würde
die Oberfläche
des Elektrodensystems ausschließlich
mit CMC abgedeckt. Da die Oberfläche
des Elektrodensystems vor einem Kontakt mit dem Enzym und dem Elektronenmediator
geschützt
worden war, konnte eine Absorption von Protein auf der Oberfläche des
Elektrodensystems verhindert werden.
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Diese
Struktur verringert Schwankungen der Sensorreaktion.
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Beispiel 3
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2 zeigt
eine perspektivische Explosionsansicht des Glukosesensors von Beispiel
3 unter Weglassung der Reagenzschicht.
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Die
Arbeitselektrode 2 wurde auf der elektrisch isolierenden
Basisplatte 1 zusammen mit einer Kohlenstoffschicht 15 gebildet,
und die dritte Elektrode 7 sowie die Gegenelektrode 4 wurden
auf der anderen elektrisch isolierenden Platte 11 gemäß dem im
Beispiel 1 verwendeten Verfahren gebildet. Daraufhin wurden die
Reagenzschicht und die Lecithinschicht auf der Arbeitselektrode 2 gebildet
und die Kohlenstoffschicht 15 wurde gemäß dem in Beispiel 2 verwendeten
Verfahren gebildet. Obwohl in dieser Schicht die Kohlenstoffschicht 15 nicht
als Elektrode diente, erleichterte die Anordnung der Kohlenstoffschicht 15 und
die Arbeitselektrode 2 die Bildung der Reagenzschicht.
Ein Verkleben der Basisplatten 1 und 11 mit dem
Abstandhalter 12, der dazwischen angeordnet ist, erfolgte
wie im Beispiel 1 und ergab den Glukosesensor des Beispiels 2.
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Ähnlich dem
Beispiel 1 wurde eine wässrige Glukoselösung, gemischt
mit Ascorbinsäure
verwendet, um die Glukosekonzentration durch den Glukosesensor zu
messen. Das Ergebnis zeigt eine präzise Glukosekonzentration,
aus welcher der Einfluss der Ascorbinsäure ausgeschlossen war.
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Wenn
die Glukosekonzentration hoch ist (etwa 1000 mg/dl oder mehr beträgt), nimmt
der über die
Arbeits- und Gegenelektroden 2 und 4 fließende Strom
zu. Insbesondere erzeugt die hohe Glukosekonzentration eine starke
Erhöhung
der Nebenproduktmenge auf der Gegenelektrode 4. Eine Anordnung
der Gegenelektrode und der Arbeitselektrode kann mitunter dazu führen, dass
das Nebenprodukt ungünstigen
Einfluss auf die Sensorreaktion nimmt. Die Anordnung der Arbeits-
und Gegenelektroden gemäß dem vorliegenden
Beispiel verhindert optimal diese ungünstigen Einflüsse.
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Beispiel 4
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3 zeigt
eine perspektivische Explosionsansicht des Glukosesensors des Beispiels
4 unter Weglassung der Reagenzschicht.
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Die
Arbeitselektrode 2 und die dritte Elektrode 7 wurden
auf der elektrisch isolierenden Basisplatte 1 gebildet
und eine Gegenelektrode 4d wurde auf der anderen elektrisch
isolierenden Platte 11 gemäß dem Verfahren gebildet, das
im Beispiel 1 zum Einsatz kommt. Daraufhin wurden die Reaktionsschicht und
die Lecithinschicht auf der Gegenelektrode 4d gemäß dem in
Beispiel 2 verwendeten Verfahren gebildet. Ähnlich wie in Beispiel 1 wurden
schließlich
die Basisplatten 1 und 11 miteinander verklebt,
wobei ein Abstandhalter 12 dazwischen angeordnet war, um den
Glukosesensor des Beispiels 4 fertig zu stellen.
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Ähnlich wie
in Beispiel 1 wurde eine wässrige Glukoselösung, gemischt
mit Ascorbinsäure
verwendet, um die Glukosekonzentration durch den Glukosesensor zu
messen. Das Ergebnis zeigte eine präzise Glukosekonzentration,
aus welcher der Einfluss der Ascorbinsäure ausgeschlossen war.
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Die
mit diesem Beispiel erzielbaren Wirkungen sind folgende: eine größere Oberfläche kann
für die
Gegenelektrode 4d im Vergleich zu den Arbeits- und dritten
Elektroden 2 und 7 beibehalten werden, und das
ReferenzPotenzial, welches bei Anliegen eines Potenzials genutzt
wird, kann stärker
stabilisiert werden aufgrund einer Positionierung der Reagenzschicht
auf der Gegenelektrode 4d.
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Die
vorstehend genannten Effekte führen
zu einer Verringerung der Schwankungen der Sensorreaktion.
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Beispiel 5
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Ein
Glukosesensor wurde in derselben Weise wie im Beispiel 2 hergestellt.
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Der
derart hergestellte Glukosesensor wurde in einem Messgerät angeordnet,
das speziell für
den Sensor bereitgestellt war. Daraufhin wurde ein Potenzial von –1300 mV
an der dritten Elektrode 7 unter Nutzung der Gegenelektrode 4 als
Referenz angelegt. Während
das Potenzial angelegt wurde, wurden drei μl einer luftgesättigten
wässrigen
Glukoselösung dem
Sensor als Probe durch die Probenlösungszufuhröffnung 14 zugeführt. Die
Probenlösung
bewegte sich in Richtung auf die Luftbohrung 10 durch den Raum
und führte
zu einer Auflösung
der Reaktionsschicht auf dem Elektrodensystem.
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Bei
Zufuhr der Probenlösung
wurde das System zur Ermittlung der Zufuhr der Probenlösung auf Grundlage
einer elektrischen Änderung
zwischen der Gegenelektrode 4 und der dritten Elektrode 7 und
der Zeitgeber betätigt,
der in dem Messgerät
vorgesehen war, wurde ausgelöst.
Während
das Potenzial über der
Gegenelektrode 4 und der dritten Elektrode 7 angelegt
gehalten wurde, wurde zu diesem Zeitpunkt der über die beiden Elektroden fließende Strom
nach Ablauf einer bestimmten Zeit ausgehend von der Ermittlung der
Zufuhr der Probenlösung
ermittelt.
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Der
erhaltene Stromwert wird normalerweise abgeleitet aus der Reduktionsreaktion
des aufgelösten
Sauerstoffs in der Probenlösung;
die Zufuhr einer Glukoselösung,
die keine Luft enthielt, mit Argon führte jedoch zu einer drastischen
Verringe rung des Reduktionsstroms.
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Nachdem
der Strom über
die Gegenelektrode 4 und die dritten Elektrode 7 gemessen
worden war, wurde die Potenzialanlegung an den beiden Elektroden
gestoppt.
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Wie
vorstehend angesprochen, wurde die Reagenzschicht auf der dritten
Elektrode 7 weggelassen. Es dauert deshalb einige Zeit
bis zur Ankunft nahe an der dritten Elektrode des Ferrocyanidions, welches
in der Reagenzschicht enthalten ist. Mit anderen Worten vermag der
Stromwert über
den Gegen- und dritten Elektroden 4 und 7 vor
Ankunft des Ferrocyanidions nahe an der dritten Elektrode die Konzentration
von ausschließlich
dem aufgelösten Sauerstoff
zu reflektieren.
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Daraufhin
wurde ein Potenzial von 500 mV an die Arbeitselektrode 2 unter
Verwendung der dritten Elektrode 7 als Referenz 25 Sekunden
nach Ermittlung der Zufuhr der Probenlösung angelegt und der Stromwert über den
Gegen- und Arbeitselektroden 4 und 2 wurde nach
5 Sekunden gemessen.
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Wenn
die Reagenzschicht in der Probenlösung aufgelöst wird, entwickelt eine Reaktion
von Glukose, von GOD und des Ferricyanidions eine resultierende
gemischte Lösung,
um eine Glukoseoxidation zugunsten Glukonolaceton sowie eine Reduktion
des Ferricyanidions in einem Ferrocyanidion hervorzurufen. Zu diesem
Zeitpunkt schreitet die Enzymreaktion als Reaktion im Wettbewerb
zu der vorstehend genannten Oxidation und Reaktion fort, um Gluconolaceton
und Wasserstoffperoxid unter Verwendung des aufgelösten Sauerstoffs
als Elektronenmediator zu erzeugen. Das Wasserstoffperoxid, welches
durch die Enzymreaktion erzeugt wird, wirkt dahingehend, das Ferrocyanidion
in ein Ferricyanidion zu reoxidieren. Der aufgelöste Sauerstoff erzeugt deshalb
einen negativen Fehler im Messergebnis, wenn die Glukosekonzentration
aus dem Oxidationsstrom abgeleitet wird, der erforderlich ist, das
Ferrocyanidion zu oxidieren.
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Wie
vorstehend erläutert,
spiegelt jedoch der Strom über
der Gegenelektrode 4 und der dritten Elektrode 7 die
Konzentration ausschließlich
Sauerstoff. Eine Korrektur des Messergebnisses mit der Sauerstoffkonzentration
ergibt deshalb eine präzise Glukosekonzentration,
aus welcher der Einfluss des aufgelösten Sauerstoffs ausgeschlossen
ist.
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Beispiel 6
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Ein
Glukosesensor wurde in derselben Weise wie im Beispiel 2 hergestellt.
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Der
derart hergestellte Glukosesensor wurde in einem Messgerät angeordnet,
das speziell für
den Sensor ausgelegt war. Daraufhin wurde in Potenzial von 500 mV
an die dritte Elektrode 7 unter Verwendung der Gegenelektrode 4 als
Referenz angelegt. Während
das Potenzial angelegt wird, wurden 3 μl einer luftgesättigten
wässrigen
Glukoselösung,
enthaltend Ascorbinsäure,
dem Sensor als Probe durch die Probenlösungszufuhröffnung 14 zugeführt. Die
Probenlösung
bewegte sich in Richtung auf die Luftbohrung 10 durch den
Raum und führte
zu einer Auflösung
der Reaktionsschicht auf den Elektrodensystem.
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Bei
Zufuhr der Probenlösung
wurde das System zum Ermitteln der Zufuhr der Probenlösung auf Grundlage
einer elektrischen Änderung
zwischen der Gegenelektrode 4 und dritten Elektrode 7 des
Elektrodensystems betätigt
und der in dem Messgerät vorgesehen Zeitgeber
wurde betätigt
bzw. ausgelöst. Zu
diesem Zeitpunkt wurde das Potenzial über der Gegenelektrode 4 und
dritten Elektrode 7 angelegt gehalten.
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2
Sekunden nach Ermittelung der Zufuhr der Probenlösung wurde das an die dritte
Elektrode 7 anzulegende Potenzial auf –1300 mV geändert. Der Strom über den
Gegenelektroden und dritten Elektroden 4 und 7 wurde
in zwei Punkten unmittelbar vor sowie 3 Sekunden nach einer Änderung
des Potenzialwerts auf –1300
mV gelassen.
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Der
Strom unmittelbar vor der Potenzialänderung hängt hauptsächlich von der Ascorbinsäurekonzentration
ab. Andererseits hängt
der Strom 3 Sekunden nach der Potenzialänderung auf tatsächlich von
dem aufgelösten
Sauerstoff ab.
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Nach
einer Messung des Stroms über
den beiden Elektroden 2 Sekunden und 5 Sekunden nach Zufuhr
eben dieser Lösung
wurde die Potenzialanlegung gestoppt.
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25
Sekunden nach Ermittlung der Zufuhr der Probenlösung wurde daraufhin ein Potenzial
von 500 mV an die Arbeitselektrode 2 unter Nutzung der
dritten Elektrode 7 als Referenz angelegt und der zwischen
der Gegenelektrode 4 und der Arbeitselektrode 2 fließende Strom
wurde nach 5 Sekunden gemessen.
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Wie
vorstehend angeführt,
spiegelt der Strom über
den Gegenelektroden und dritten Elektroden 4 und 7 die
Konzentration der vorliegenden Ascorbinsäure und des Sauerstoffs. Eine
Korrektur des Messergebnisses durch die Konzentration der Ascorbinsäure und
des Sauerstoffs ergibt eine präzise
Glukosekonzentration, aus welcher der Einfluss dieser Substanzen
ausge schlossen ist.
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Wie
vorstehend angesprochen, ist die vorliegende Erfindung dazu geeignet,
einen hochgradig zuverlässigen
Biosensor bereitzustellen, bei der ungünstige Einflüsse einer
anderen Substanz als der Substanz in der Probe ausschließen kann.