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TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in
einer Probe und einem Kit zur Verwendung in dem Verfahren.
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Ausgehend
vom Stand der Technik umfasst das Verfahren der Erfindung die folgenden
Schritte:
- i. Die Probe wird in der Probenapplikationszone
(ASZ) auf einer Flussmatrix, in der ein Transport von in der Probe
vorhandenen Bestandteilen stattfinden kann (Transportfluss) appliziert.
Die Flussmatrix umfasst des weiteren:
a) optional eine Applikationszone
(AR*Z) für
einen Bindungsreaktanten (Reaktant* = R*), welcher analytisch detektierbar
ist,
b) eine Detektionszone (DZ), welche in Bezug auf ASZ flussabwärts gelegen
ist und einen weiteren bindenden Recktanten aufweist (Fänger ("capturer")), der fest mit
der Matrix verbunden ist, und in welcher ein den Analyten und/oder
den Recktanten* enthaltender Komplex (Signalkomplex) während des
Verfahrens gebildet wird.
- ii. Es wird dem Fluss ermöglicht,
den Transport der Probenbestandteile zu bewirken.
- iii. Der Signalkomplex wird in der Detektionszone detektiert
und das gemessene Signal wird verwendet zur Bestimmung des Analyten.
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Die
Erfindung richtet sich primär
auf die Flussmatrix, welche von derselben Art sein kann, wie die
bisher, z.B. in der Immunchromatographie, verwendeten, siehe unten.
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Geeignete
Bindungsreaktanten sind solche, welche in sogenannten Affinitätsreaktionen
teilnehmen, insbesondere biospezifische Affinitätsreaktionen, sowie kovalente
Bindungsreaktionen, insbesondere Austauschreaktionen zwischen freiem
Thiol und reaktiven Disulfiden und anderen Reaktionen zwischen weichen Elektrophilen
und weichen Nukleophilen. Häufige
biospezifische Affinitätsreaktionen
sind immunochemisch, d.h., zwischen Antikörper und Antigen oder Hapten.
Andere Arten von bioaffinen Reaktionen sind Hybridisierungen zwischen
komplementären
Nukleinsäuren
(umfassend Oligonukleotide), Reaktionen zwischen Lektin und Kohlenwasserstoffstrukturen,
zwischen der Ig(Fc)-Struktur und Ig(Fc)-bindenden Proteinen, wie
Protein A oder Protein G, etc. Die bioaffinen Reaktionen umfassen
die Reaktion zwischen einem Biomolekül und einem synthetisch hergestellten
Liganden/Fänger.
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Bezüglich der
Verfahrensart, die in Frage kommt, spricht man von nicht kompetitiven
Verfahren, z.B. die Sandwichtechnik und kompetitive Verfahren. Die
Sandwichtechnik bedeutet üblicherweise,
dass ein analytisch detektierbarer Komplex gebildet wird, in welchem
Analyt an zwei bioaffine Gegenstücke
bindet, von welchen der eine analytisch detektierbar ist und der
andere der Fänger
ist. In üblichen
kompetitiven Varianten kompetitieren der Analyt und ein analytisch
detektierbares Analytanalog in bezug auf eine limitierende Menge eines
bioaffinen Gegenstücks.
Als Beispiele zweier kompetitiver Varianten können jene erwähnt werden,
welche verwenden: a) Kompetition zwischen Analyt und Analytanalog,
welches markiert ist, in Bezug auf eine limitierende Menge des Liganden
in der Form eines fest verankerten Fängers, und b) Kompetition zwischen Analyt
und Analytanalog in Form eines fest verankerten Fängers für eine limitierende
Menge von löslichem
und analytisch detektierbaren bioaffinen Gegenstück.
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Für weitere
Information zur bisher verwendeten Methodologie in dem technischen
Bereich der Erfindung wird auf
US-A-4,861,711 (Behringwerke),
WO 88/08534 (Unilever),
US-A-5,120,643 und
4,740,468 (Abbott),
EP-A-284,232 und
US-A-4,855,240 (Becton
Dickinson) und
WO 96/22532 (Pharmacia
AB) verwiesen.
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HETEROFORMEN
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Verbindungen,
welche in Bezug auf die Bindung an ein Gegenstück über eine der oben erwähnten Bindungsreaktionen
kompetitieren können.
Heteroformen können
Isoformen von Proteinen sein, z.B. Isoenzyme, etc. In dem Begriff
Heteroformen sind u.a. unterschiedliche Formen von bioaffinen Komplexen
umfasst, welche einander "ähneln", indem sie die obige
Definition erfüllen.
Beispiele sind Immunkomplexe, wo das Antigen dasselbe, jedoch der
Antikörper
von einer anderen Klasse/Subklasse ist. Siehe Weiteres unter der Überschrift "Analyt", unten.
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Die
Bestimmung, ob zwei Verbindungen Heteroformen zueinander sind, kann
in sogenannten Inhibitionstests durchgeführt werden.
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PROBLEME, DIE DURCH DIE ERFINDUNG ZU LÖSEN SIND
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Die
Bestandteile einer Probe, die das Signal, das in der DZ zu bestimmen
ist, beeinträchtigen
oder beeinflussen können,
können
in zwei Hauptgruppen unterteilt werden: a) den Analyt und b) Bestandteile,
welche direkt oder indirekt die Detektion stören. Direkt störende Komponenten
sind solche, welche mit dem Signal als solchem interferieren, z.B.
fluoreszierende Bestandteile in Serum in dem Fall, dass der Komplex
durch Fluoreszenz nachzuweisen ist. Beispiele von indirekt störenden Komponenten
sind Heteroformen in Bezug auf den Fänger und/oder ein hinzugefügter bioaffiner
Reaktant R (z.B. R*). Andere indirekt störende Komponenten, wie z.B.
heterophile Antikörper,
können
in der ursprünglichen
Probe vorhanden sein und mit der Bildung des Signalkomplexes in
DZ interferieren. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung
können
Liganden, die aus der Separationszone der Erfindung freigesetzt
werden, störend
wirken (siehe Beispiel 1).
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Probleme
mit störenden
Bestandteilen in Proben hatten vielfach zu Folge, dass für Analyten,
die in geringen Konzentrationen vorhanden sind, die Auftrennung
von störenden
Bestandteilen und die Detektion in verschiedenen Systemen durchgeführt wurden.
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Ein
Beispiel, in dem nach einer Ionenaustauschauftrennung die Analyse
durchgeführt
worden war, entweder durch ein immunologisches System oder durch
eine Online-Messung einer absorbierenden Gruppe (460 nm), ist die
Messung von Kohlenwasserstoff-Defizienten-Transferrinen (CDT = CD-Transferrin = Asialo-, Monosialo-
und Disialo-Transferrin). Wenn CDT in einer relativ hohen Konzentration
(10-9 M) vorhanden ist, waren beide Detektionalternativen
möglich,
jedoch bei einer geringeren Konzentration des Analyten war eine immunologische
Messung nötig.
Die chromatographische Ionenaustauschauftrennung wird kontrolliert
von hoch entwickelter und teurer Ausrüstung, welche speziell ausgebildetes
Personal benötigt.
Die traditionellen immunologischen Tests sind ebenfalls teuer und
benötigen
gut ausgebildetes Personal.
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Die
Technik für
eine immunologische Online-Messung nach einem chromatographischen
Auftrennungsschritt ist beschrieben worden von Afeyan et al (Nature
358 (1992) 603-604) und Irth et al. (Anal. Chem. 14 (1995) 355-361).
Seine Schwierigkeiten wurden zusammengefasst von Krull et al. (LC-GC
15(7) (1997) 620-629).
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Der
Transport von ganzen Zellen in die DZ kann mit dem Signal von dem
Detektionskomplex interferieren. Es ist vorbekannt, Flussmatrizen
zu verwenden, worin Zellen mechanisch (durch Filtration) in einer
dichteren Präzone
gefangen werden (Oudheusden et al., Ann. Clin. Biochem. 28 (1991)
55-59).
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EP-A-696,735 offenbart
ein chromatographisches immunanalytisches System, worin eine vorherbestimmte
Menge eines Analyt-bindenden Antikörpers in der Probenapplikationszone
immobilisiert worden ist, so dass eine bestimmte Menge für den Analyten
darin zurückgehalten
wird, um den Messbereich des Analyten auszuweiten.
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EP-A-702,233 offenbart
ein chromatographisches immunanalytisches System, worin in einer ähnlichen
Weise, wie jener die in
EP-A-696,735 beschrieben
ist, ein Verdünnungseffekt
der Probe erreicht wird durch Fangen einer bestimmten Menge des
Analyten bevor er mit markiertem Recktanten reagiert, welcher dann
in der Detektionszone detektiert wird.
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WO 97/35205 offenbart eine
chromatographische Membran für
Immunanalyse mit (i) einer Zone zur Detektion von markiertem Analyten-bindenden
Recktanten, welcher nicht an den Analyten gebunden hat, und (ii)
eine Zone zur Detektion des Komplexes zwischen Analyt-bindenden
Recktanten und dem Analyten. Die relativen Mengen des ungebundenen
Analyt-bindenden Recktanten und des Analyten: Reaktantenkomplexes geben
ein Maß für die Menge
des Analyten in der Probe.
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Wo 94/06012 offenbart einen
analytischen Testapparat mit einer negativen Kontrollzone, die vor
der Analytdetektionszone angeordnet ist. Die negative Kontrollzone
hat die Funktion das Vorhandensein von Bestandteilen in der Probe
anzuzeigen, die die Analytendetektion beeinträchtigen, so dass sie unverlässlich wird.
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ZIELE DER ERFINDUNG
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Ein
erstes Hauptziel der Erfindung ist es, ein einfaches und schnelles
Verfahren zu kreieren, das die Bestimmung von Analyten in der Gegenwart
von störenden
Bestandteilen erleichtert. Ein besonderes Ziel ist es, Probleme
mit störenden
Bestandteilen zu vermeiden, die löslich oder suspendierbar sind
in einem flüssigen Medium.
von Interesse.
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Ein
zweites Hauptziel der Erfindung sind raschere und einfachere Bestimmungen
von individuellen Heteroformen oder Kombinationen davon, insbesondere
Heteroformen, die Peptid, Kohlenwasserstoff oder Fettstrukturen
aufweisen, umfassend verschiedene Arten von biologisch aktiven Verbindungen.
Unter Fetten sind Steroide und andere fettlösliche Substanzen umfasst.
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Ein
drittes Hauptobjekt der Erfindung ist es, die Messung von Analyten
im Konzentrationsbereich < 10-7 M, insbesondere < 10-9 M zu
erleichtern, insbesondere für
Proben die störende
Heteroformen des Analyten enthalten.
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Ein
viertes Hauptziel der Erfindung ist es, die Bestimmung von individuellen
Heteroformen oder Kombinationen davon in Proben, die aus biologischem
Material stammen, zu vereinfachen.
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Ein
fünftes
Hauptziel der Erfindung ist es, schnellere und einfachere Evaluierungen
von Substanzbibliotheken zur Verfügung zu stellen, z.B. chemischen
Bibliotheken, wie kombinatorischen Bibliotheken.
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Ein
untergeordnetes Ziel in Bezug auf die oben genannten vier Hauptziele
ist es, die Möglichkeiten
Bestimmungen durchzuführen
zu verbessern, sowohl im Feld (üblicherweise
semiquantitativ) als auch in fortgeschrittenen Laboratorien (mit
der Möglichkeit
einer genauen Quantifizierung).
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DIE ERFINDUNG
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Die
oben genannten Ziele können
erreicht werden durch das Verfahren, das im einleitenden Teil erwähnt wird,
wenn die Flussmatrix eine oder mehrere Separationszonen (SZ) zwischen
ASZ und DZ enthält, welche
es ermöglichen
sollten, dass zumindest ein Probenbestandteil, der nicht der Analyt
ist, der in der Lage ist das Signal von dem Signalkomplex in DZ
zu beeinflussen, zu retardieren oder zu trennen. Dies sollte in
der SZ stattfinden, mittels der Ligandeninteraktionen, die nachstehend
erwähnt
werden, welche reversibel oder irreversibel sein können. Wenn
der Bestandteil kein Analyt ist, bedeutet Retardation, dass der
Bestandteil (oder die Bestandteile) langsamer als der Analyt durch
SZ wandern oder irreversibel an SZ gebunden werden und dadurch daran
gehindert werden DZ zu erreichen, so dass die Detektion des Analyten
in DZ im wesentlichen ungestört
sein wird durch den fraglichen Bestandteil (oder die Bestandteile). Üblicherweise
bedeutet dies, dass eine ausreichende Menge von Ligand vorhanden
sein sollte, um im wesentlichen die gesamte störende Komponente oder die Komponenten
in der Probe zu beeinflussen. "Im
wesentlichen die gesamten" hängt von
der relativen Konzentration der Komponenten ab, bedeutet jedoch üblicherweise,
dass zumindest 90%, vorzugsweise zumindest 95% und noch bevorzugter
zumindest 99% der störenden
Komponenten retardiert oder gefangen werden in der Separationszone.
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Die
Wahl der retardierenden Struktur/des Liganden in der Separationszone
wird bestimmt durch die zu retardierenden Bestandteile. Die Retardation
kann auf verschiedenen mehr oder weniger spezifischen Interaktionen
zwischen der Ligandenstruktur und den Bestandteilen, die es zu retardieren
gilt, basieren; siehe nachstehend unter der Überschrift "Separationszone". Nach dem Passieren der SZ wird der
Analyt in dem Transportfluss zu der Detektionszone (DZ) wandern,
in welcher ein Komplex, enthaltend den Fänger und den Analyten und/oder
R* gebildet wird.
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In
den Fällen
wo es beabsichtigt ist, eine oder mehrere störende Komponenten zu retardieren,
wird die Bildung des Signalkomplexes in deren Abwesenheit stattfinden.
Die Detektion des Signalkomplexes in DZ kann als qualitative oder
quantitative Messung des Analyten angesehen werden.
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1 bis 3 illustrieren
verschiedene Varianten der Flussmatrizen gemäß der Erfindung.
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1 ist
eine einfache Variante mit einer ASZ, einer ARZ, einer SZ und einer
DZ. ARZ und ASZ sind getrennt.
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2A unterscheidet
sich von der Variante in 1 primär dadurch, dass sie fünf Separationszonen mit
dem gleichen Liganden aufweist. ARZ und ASZ sind getrennt.
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2B ist
dieselbe Variante wie in 2A, außer dass
ARZ und ASZ zusammenfallen.
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3 illustriert
die Variante der Flussmatrix der Erfindung, die in Beispiel 1 verwendet
wird mit drei Separationszonen, wovon zwei Zonen (SZ1) einen bestimmten
Liganden und eine Zone (SZ2) einem anderen Liganden aufweisen. ASZ
und ARZ (= AR*Z) sind getrennt.
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Eine
genauere Beschreibung von 1 wird unten
dem Titel "Matrix
und Transportfluss" zu
finden sein, und 2 bis 3 in
der Einleitung zu Beispiel 1. Die Flussmatrizen, die in 1 bis 3 dargestellt werden,
können
im Prinzip eine beliebige der unten stehenden geometrischen Ausführungsformen
aufweisen.
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MATRIX UND TRANSPORTFLUSS
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Die
Matrix von derselben Art, wie die zuvor in sogenannten immunchromatographischen
Bestimmungsverfahren (Flussmatrix) verwendeten und definiert den
Raum, in welchem Recktanten und Probenbestandteile transportiert
werden. Die Matrix kann somit die innere Oberfläche eines einzelnen Flusskanals
sein (z.B. eine Kapillare), die innere Oberfläche einer porösen Matrix
mit einem penetrierenden System von Flusskanälen (poröse Matrix), etc. Die Matrix
kann in der Form eines Monolithen, Blattes, Säule, einer Membran, separater
Flusskanäle,
z.B. in kapillären
Dimensionen, oder aggregierter Systeme solcher Flusskanäle sein, etc.
Sie kann auch in der Form von Teilchen sein, die in Säulenhülsen gepackt
sind, oder in eingeschnittene Vertiefungen, komprimierte Fasern,
etc. Eine weitere Alternative sind sogenannte Nanosäulen für Flüssigchromatographie,
d.h., Silikon- oder Quarzplatten mit Kanälen von etwa 2 μm oder weniger,
die durch Mikrolithographie hergestellt werden (siehe z.B. He, B.,
et al., Anal. Chem. 1998, 70, 3790-3797). Die innere Oberfläche der
Matrix, d.h., die Oberfläche
der Flusskanäle,
sollte ausreichend hydrophil sein, um es zu ermöglichen, dass wässrige Medien
(vor allem Wasser) durch die Matrix transportiert werden, entweder
durch kapilläre
Kräfte oder
durch angelegten Druck oder Saugen. Die geringsten inneren Ausmaße des Flusskanals
(für runde
Kanäle
als Durchmesser gemessen) sollte ausreichend groß sein, um den Transport des
Analyten, der hinzugefügten
Recktanten, und Bestandteile, die in der Detektionszone interferieren
und die in der SZ retardiert werden sollen, zu ermöglichen.
Die Daumenregel ist, dass geeignete Matrizen ausgewählt werden
können
unter solchen mit Flusskanälen
mit einer kleinsten inneren Dimension im Bereich von 0,1 bis 1.000 μm, vorzugsweise
0,4 bis 100 μm,
wenn die Matrix ein System von kommunizierenden Flusskanälen hat.
Flusskanäle
deren geringste Ausmaße
im oberen Teil des breiten Bereichs (bis zu 1.000 μm) sind,
sind primär
von Interesse für Flüsse, die
durch extern applizierten Druck oder Saugen betrieben werden.
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Geeignete
Matrizen sind oft aus einem Polymer gebildet, z.B. Nitrocellulose,
Polyester, Polyethylsulfon, Nylon, Cellulosenitrat/Acetat, Cellulose,
regenerierte Cellulose. Vorzugsweise können dieses Membranen ausgestattet
sein mit einer dichten Rückseite
aus z.B. Polyester.
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Das
Material der Matrize sowie das physikalische und geometrische Design
der Flusskanäle
kann entlang des Flusses unterschiedlich sein in Abhängigkeit
von der vorgesehenen Nutzung eines bestimmten Teils der Matrix [
WO 96/22532 (Pharmacia AB);
Wo 94/15215 (Medix)]. Ein
und dieselbe Matrix kann verschiedenen Transportflüsse umfassen,
die parallel sind oder radiär
von einem gemeinsamen Zentrum ausgerichtet sind, z.B. in der Form
separater Kanäle.
In manchen der wichtigsten Ausführungsformen
sollte zumindest die Detektionszone und die am nächsten daran anliegenden Teile
der Matrix in einer solchen Form sein, dass der Transportfluss in
die DZ hinein, in der DZ und daraus hinaus lateral in der Matrix
stattfinden können,
d.h., zumindest dieser Teil der Matrix ist in der Form eines Membranstreifens
oder einer Platte mit eingeschnittenen Vertiefungen oder dgl.
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Verschiedene
Flussmatrizen, die in dieser Art von Test verwendet werden können, sind
in früheren
Patentveröffentlichungen
beschrieben. Siehe z.B.
US-A-4,861,711 (Behringwerke),
WO 88/08534 (Unilever),
US-A-5,120,643 und
US-A-4,740,468 (Abbott),
EP-A-284,232 und
US-A-4,855,240 (Becton
Dickinson);
WO 96/22532 (Pharmacia
AB).
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Die
wichtigste Ausführungsform
der Erfindung zum Prioritätszeitpunkt
basiert auf dem Flüssigkeitstransport
in einer Flussmatrix, welche in der Form von z.B. einem Membranstreifen
ist (siehe
1). Der Streifen wird gebildet
durch eine Matrix, die einen Transportfluss (
1) definiert
und aufgetragen ist auf eine flüssigkeitsdichte
Rückseite
(
2), geeigneterweise aus Plastik. Auf der Matrix ist eine
Applikationszone für
die Probe (
3, ASZ) und eine Detektionszone (
4,
DZ), die stromabwärts
davon positioniert ist. Der Transportfluss ist in der Richtung von
ASZ nach DZ. Zwischen der Probenapplikationszone (ASZ) und der Detektionszone
ist eine Separationszone (
5, SZ). Im Transportfluss kann,
falls dies durch bestimmte Ausführungsformen
benötigt
wird, auch die Applikationszonen (
6) für zusätzliche Recktanten (R, z.B.
R*, mit der Applikationszone ARZ, z.B. AR*Z) sein. Zwischen besagten
Zonen können
Zonen (
7) sein, deren einzige Funktion es ist, Recktanten
zu transportieren. Die Position einer Applikationszone ARZ (AR*Z)
wird bestimmt durch das zu verwendende Testprotokoll, und kann stromauf
oder stromab der ASZ sein oder damit zusammenfallen. Für den Fall,
dass ARZ (z.B. AR*Z) stromaufwärts
von ASZ liegt, kann es vorteilhaft sein, wenn das Hinzufügen der
Flüssigkeit in
ASZ im wesentlichen gleichzeitig stattfindet zu dem Hinzufügen der
Flüssigkeit
in der Zone ARZ (AR*Z), die stromaufwärts davon gelegen ist. Siehe
auch unsere früher
eingereichte internationale Patentanmeldung
PCT/SE98/02463 (durch Bezugnahme inkorporiert).
Für bestimmte
Arten von Testprotokollen kann ARZ (AR*Z) mit DZ zusammenfallen.
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In
manchen Ausführungsformen
ist es vorteilhaft, wenn ein Reaktant R, z.B. R*, vorher aufgetragen worden
war. Dies ist insbesondere der Fall, wenn ARZ stromab von ASZ gelegen
ist und die Testprotokollvariante, die verwendet wird, simultan
ist, d.h., der Reaktant R und der Analyt sollen im wesentlichen
gleichzeitig nach DZ hineinwandern.
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In
dem Fall, in dem es erwünscht
ist, Varianten zu verwenden, die sequentiell sind in dem Sinn, dass der
Analyt vor dem Recktanten (R) in die DZ hineintransportiert werden
soll, sollte R hinzugefügt
werden, nachdem die Probe an ARZ vorbeigekommen ist, wenn die Applikationszone
für den
Recktanten (ARZ) stromab von ASZ ist. Sequentielle Verfahren können auch
erreicht werden, wenn ARZ stromauf von ASZ ist, in welchem Fall
R optional in ARZ zuvor schon aufgebracht sein kann.
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In
alternativen Ausführungsformen
können
Recktanten (R), z.B. R*, in DZ hineinwandern in verschiedenen Transportflüssen von
einer anderen Richtung als jener des Flusses, der den Analyt nach
DZ hineintransportiert. Siehe z.B.
US-A-4,855,240 (Becton & Dickinson).
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In
ein und demselben Transportfluss können verschiedene Detektionszonen
für verschiedene
Analyten oder verschiedene Konzentrationsbereiche des gleichen Analyts
vorgesehen sein. In dem Fall, dass die Analyten unterschiedlich
sind, darf natürlich
der Fänger
in dem jeweiligen DZ keine wesentliche Kreuzreaktivität gegenüber einem
der Analyten aufweisen.
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Der
Transportfluss von ASZ durch die Separationszone (SZ) und weiter
zur Detektionszone (DZ) kann ein Flüssigkeitsfluss sein, der durch
kapilläre
Kräfte
getrieben wird. Falls nötig,
kann die Flussmatrix ein Flüssigkeitsreservoir
(8) in Form einer porösen
Matrix aufweisen, welche getränkt
ist mit Transportflüssigkeit
und stromaufwärts
von ASZ aufgebracht wird und/oder einer saugenden, porösen Matrix
(9), die stromab von DZ platziert ist. Das Flüssigkeitsreservoir
und die saugende Matrix unterstützen
die Aufrechterhaltung des Flusses. Der Fluss der Flüssigkeit
kann auch erreicht werden durch Druck oder Saugen durch die Matrix.
So kann der Druck hydrostatisch erzeugt werden, z.B. durch einen
Teil der Matrix, der entworfen ist als eine Minisäule, die
vertikal platziert ist und deren Auslaß in direkter Flüssigkeitskommunikation
mit einer horizontal platzierten Flussmatrix ist. In der letzteren
Form kann der horizontal angeordnete Teil der Matrix in der Form
eines Streifens oder einer Membran sein. Eine Alternative für den Transport
des Analyten, des Recktanten und störender Komponenten kann das
Anbringen eines elektrischen Feldes über die Matrix sein.
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Ähnliche
Abfolgen von Zonen, wie jene in 1, können auch
konstruiert werden für
andere Arten von Flussmatrizen, z.B. kapilläre Röhren und Matrizen, in welchen
der Transportfluss in der Tiefe sein kann.
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Eine
oder mehrere Matrizen/Transportflüsse gemäß dem Obenstehenden, können zusammen
positioniert werden, z.B. auf einer gemeinsamen Rückwand,
optional mit einer Flüssigkeitsbarriere
zwischen ihnen. Optional können
die Flüsse
eine gemeinsame ASZ, eine gemeinsame ARZ (AR*Z), etc. haben. In
der Regel ist DZ separat für
jeden Transportfluss.
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In
den oben erwähnten
Varianten können
Matrizen mit einer Separationszone verwendet werden, um eine Heteroform
(Analyt) zu bestimmen. Eine Matrix ohne Separationszone kann verwendet
werden, um alle Heteroformen des Analyten zu bestimmen, die in der
Probe vorhanden sein können
in einer analogen Art und Weise zu jener für den Analyten selbst. Durch
Kombinieren dieser zwei Arten von Zonenabfolgen können sowohl
relative als auch absolute Mengen eines Analyten in der Probe einfach
gemessen werden.
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SEPARATIONSZONE (SZ)
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Die
Separationszone weist einen Liganden/eine Struktur mit Bindungsfähigkeit
für eine
oder mehrere Bestandteile der Probe, die die Detektion in DZ gestört haben
würden,
auf. Ein charakteristisches Merkmal ist, dass die Trennung erreicht
wird durch Mittel einer Art von spezifischer/selektiver Bindungsreaktion
und nicht da die Matrix in SZ ein mechanisches Hindernis für störende Komponenten
bildet (Filtration). Leitende Prinzipien für die Auswahl von trennenden/verzögernden
Liganden/Struktur, insbesondere in Bezug auf Spezifität, Bindungsstärke (Affinität) und Kinetik
sind dieselben wie in der Affinitätschromatographie, umfassend
Ionenaustauschchromatographie, kovalente Chromatographie, und biospezifische
analytische Verfahren, in welchen Festphasentechnologie zum Fangen
("capture") verwendet wird.
In Bezug auf Bindungsstärke
(Affinität, Avidität) und Kinetik
ist das Hauptziel der gegenwärtig
bevorzugten Varianten der Erfindung störende Bestandteile im Verhältnis zum
Analyten zu retardieren, so dass die Detektion in DZ stattfinden
kann, ohne das Vorhandensein dieser Komponenten. Im allgemeinen
bedeutet dies, dass die störenden
Komponenten so effektiv wie möglich
retardiert werden sollten oder so stark und schnell wie möglich in
der Separationszone gebunden werden sollten.
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Die
Liganden, die die Separation in SZ möglich machen, können so
a) geladene (anionische, kationische, amphotere = Ionenaustauschliganden),
amphoterische/amphiphile, bioaffine, Chelat-bildende, Schwefel-enthaltende
(Primär-Thioether
für die
sogenannte thiophile Affinität),
solche die kovalente Chromatographie ermöglichen (reaktive Disulfide,
wie Pyridyldisulfid) oder π-π-Interaktion, hydrophobisch,
etc., sein.
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Die
Daumenregel ist, dass die Bindungsfähigkeit des Liganden gegenüber einem
oder mehreren störenden
Bestandteilen, die verzögert
werden sollen, stärker
sei sollte als gegenüber
dem Analyten. Dies betrifft die für die Auftrennung in SZ verwendeten
Bedingungen. Faktoren die bestimmen wie die Auftrennung gelingen
wird, sind die Länge
der Separationszone, die Ligandendichte, die Verfügbarkeit
des Liganden, die Temperatur, die Flussgeschwindigkeit, der Puffer,
die Ionenstärke,
der pH, etc.
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Unter
biospezifischen Affinitätsliganden,
werden primär
sogenannte Immunoliganden erwähnt,
d.h., Antikörper
und Antigen-bindende Fragmente davon, sowie Antigen und Hapten.
Andere Beispiele von Affinitätsliganden
sind Lektin (z.B. Siazylsäure-bindende
Lektine); Ig(Fc)-bindende Proteine (wie Protein A und G); Nukleinsäuren, wie
Oligo- oder Polynukleotide in einzel- oder doppelsträngiger Form,
Analoge von Substraten für
Enzyme, Enzyminhibitoren, etc. Für
biospezifische Affinitätsliganden
kann die Spezifität
gegen eine oder mehrere Bindungsstellen auf den zu verzögernden
Bestandteil(en) gerichtet sein. Die korrespondierenden Bindungsstellen
sollten auf dem Analyten nicht in demselben Ausmaß verfügbar sein
(worunter auch der Fall zu verstehen ist, dass sie nicht einmal
in einer nicht-exponierten Form existieren).
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Die
Liganden/Strukturen um die es geht, können verankert sein in der
Separationszone, entweder durch kovalente Bindung an die Matrix, über physikalische
oder biospezifische Adsorption. Beispiele des Letzteren sind die
Interaktion zwischen Biotin und Streptavidin, zwischen hoch affinem
Antikörper
und Hapten, etc. Die Verankerung an die Matrix kann stattfinden über ein
Polymer oder einen anderen Substituenten, welcher wiederum kovalent
gebundene, physikalisch adsorbtierte, oder biospezifisch gebundene
Liganden trägt,
die in der Separation verwendet werden. Eine weitere Möglichkeit
ist die Ablagerung von polymeren Teilchen, die den gewünschten
Typ Ligand aufweisen. Die Teilchen können hydrophile oder hydrophobe
Eigenschaften haben, und es kann an sie eine Verbindung, die die
Ligandenstruktur aufweist, adsorbiert oder kovalent gebunden sein.
Die Techniken für
die Bindung eines Separierungsliganden an die Matrix SZ können grundsätzlich in derselben
Weise ausgewählt
werden, wie zuvor bekannt für
den Fänger
(Capturer) in DZ. Siehe z.B. unsere früher eingereichten internationalen
Patentanmeldungen
PCT/SE98/02462 ,
PCT/SE98/02463 und
PCT/SE98/02464 , welche hiermit
durch Bezugnahme inkorporiert werden in Bezug auf das Einführen des
Fängers
in die Detektionszone. In diesem Zusammenhang kann erwähnt werden,
dass es kommerziell verfügbare Membranen
gibt, welche kovalent gebundenen Liganden aufweisen, z.B. DEAE-Cellulosepapier
(Diethylaminoethyl) (DE81, Whatman International Ltd., England)
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DETEKTIONSZONE
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Der
Fänger
in der Detektionszone kann ausgewählt werden gemäß denselben
Regeln wie jene, die auf dem Liganden in der Separationszone zutreffen,
mit der Bedingung, dass die Bindungsfähigkeit des Fängers auf
den Analyten gerichtet sein sollte und/oder auf einen Analyt-bezogenen
Recktanten. Es ist vorteilhaft, hoch affine Fänger mit schnellen Kinetiken
zum Fangen des Liganden auszuwählen.
Es ist primär
von Interesse, Antikörper
oder Antigen/Hapten zu verwenden, für welche es oft einfach ist,
hoch affine Antikörper
zu finden.
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Unter
Analyt-bezogenen Recktanten ist ein Reaktant (R) zu verstehen, der
hinzugefügt
wird und wenn er durch DZ wandert an den Fänger binden kann in einer Menge,
die in Bezug steht zu der Gegenwart des Analyten in der Probe. Beispiele
von Analyt-bezogenen Recktanten sind R* in der Form von a) markiertem Analytanalog
in kompetitiven Verfahren, die Kompetition für eine limitierende Menge von
Festphasen-gebundenen
Anti-Analyt-Antikörper
verwenden, und b) markierte oder nicht-markierte lösliche Anti-Analyt-Antikörper in
Verfahren, die Kompetition/Inhibition zwischen Festphasen-gebundenen Analytanalog
und Analyt für
eine limitierende Menge für
Anti-Analyt-Antikörper
in gelöster
Form verwenden.
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Der
Fänger
kann mit der Detektionszone verankert sein durch ein Verfahren das
analog ist zu dem das verwendet wird den Liganden an die Separationszone
zu binden.
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Es
kann geeignet sein, ein Separationsprinzip in der Separationszone
mit einem anderen Fangprinzip in der Detektionszone zu kombinieren,
z.B. Ionenaustauschchromatographie für die Separtion und immunchemische
Adsorption zum Fangen in DZ. In manchen Situationen kann es praktisch
sein, das gleiche Prinzip für die
Retardation und das Fangen in den zwei Zonen zu verwenden (z.B.
zwei monoklonale Antikörper
mit unterschiedlichen Spezifitäten,
siehe die Beispiele).
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ANALYT
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Unter
Analyt ist die Verbindung oder die Verbindungen zu verstehen, die
quantitativ oder qualitativ bestimmt werden. Quantitative Bestimmung
bezieht sich auf die Messung von Mengen in absoluter sowie relativer
Hinsicht. Qualitative Bestimmung eines Analyten bezieht sich auf
das Detektieren des Vorhandenseins oder Nicht-Vorhandenseins von
etwas (ja/nein-Test) oder qualitative Eigenschaften einer Verbindung,
wie die Fähigkeit
der Affinitätsbindung
an einen bestimmten Liganden.
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Unter
relativer Messung ist zu verstehen, dass der erhaltene Messwert
ein Verhältnis
der Summe von einem oder mehreren ausgewählten Heteroformen und der
Summe von einer anderen Kombination von Heteroformen ist. Ein Beispiel
ist das Verhältnis
von der Menge des Analyten und der Gesamtmenge von allen Heteroformen
in Bezug auf ein bestimmtes Gegenstück (die Gesamtmenge umfass
die Menge des Analyten).
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Die
Erfindung ist anwendbar auf Analyten, die als Bindungsreaktant funktionieren
können.
Dies bedeutet, dass der Analyt grundsätzlich eine beliebige Substanz
sein kann, für
welche es möglich
ist, einen wie oben beschriebenen Fänger zur Verfügung zu
stellen. Als spezifische Beispiele können Antigen/Hapten, Enzyme oder
Antikörper
oder Nukleinsäuren,
welche komplett oder zum Teil in einsträngiger Form vorliegen, erwähnt werden.
Der Analyt kann eine Aminosäure-/Peptid-,
Kohlenwasserstoff- oder Fettstruktur aufweisen.
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Besonders
große
Vorteile werden erhalten für
Analyten, die zusammen mit Heteroformen in Bezug auf Bindungsfähigkeiten
an den Fänger
und/oder einen hinzugefügten
Recktanten R, z.B. R*, vorliegen. Dies betrifft insbesondere die
Fälle,
wo der Analyt in der Probe in Konzentrationen vorliegt, welche < 10-7 M,
insbesondere < 10-9 M sind. Als Beispiele dieser Art von Heteroformen
können
erwähnt
werden: a) Verbindungen, welche sich in Bezug aufeinander in der
Ladung entscheiden, wie Isotransferrine, mit, z.B., CDT als Analyt,
Isohämoglobine
mit, z.B., HbA1c als Analyt; b) Verbindungen, die sich voneinander
unterscheiden in bestimmten Teilen ihrer Grundstruktur, wie zusätzlich eingefügte oder
gespaltene (z.B. durch Degradation) Aminosäuren, oder teilweise Unterschiede
in den Peptidketten; c) Verbindungen, die sich dadurch unterscheiden,
dass unterschiedliche Substanzen/Strukturen zu einer Grundstruktur
hinzugefügt
worden sind, z.B. kovalent gebundenen Kohlenwasserstoffstrukturen;
d) Makromoleküle,
die aus zwei oder mehr Untereinheiten bestehen, welche in dem Makromolekül über nicht-kovalente
Bindungen aneinander binden, wie bioaffine Bindungen zwischen Rezeptor
und Ligand in Rezeptor-Ligand-Komplexen
und zwischen Antigen und Antikörper
in Immunkomplexen, oder über
Cysteinbrücken,
z.B. zwischen den Ketten eines Antikörpers.
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Beispiele
von potentiellen Verwendungen/Analyten sind:
- a)
Der Analyt ist eine Heteroform, welche sich von einer anderen Heteroform
in Bezug auf den Kohlenwasserstoffgehalt (Glycosylierung) unterscheidet,
z.B. Glycoproteine mit derselben oder einem ähnlichen Proteinteil. Variationen
in dieser Art der Heteroformen sind bekannt in einer Anzahl von
Krankheitszuständen, wie
Krebs, Entzündung
und Leberkrankheiten (Turner G A, "N-glycosylation of serum Proteins in
disease and ist investigation using lectins", Clin. Chim. Acta 208 (1992) 149-171;
und Varki A, "Biological
roles of oligosaccarides: all of the theories correct", Glycobiology 3(2)
(1993) 97-130). Insbesondere kann erwähnt werden die Messung von
i) Kombinationen von Asialo-, Monosialo- und Disialo-Transferrin
für welche
die Auftrennung durchgeführt
werden kann durch Ionenaustauschligand und ebenfalls durch einen
Lektinliganden in SZ, und ii) HbA1c, welches aufgetrennt werden
kann durch Ionenaustausch oder Boronatligand. Variationen im Kohlenwasserstoffgehalt
von Proteinen sind auch bekannt in normalen biologischen Veränderungen,
z.B. während
des Menstruationszyklus und für
ein unterschiedliches Alter und Geschlecht.
- b) Der Grad der Glycosylierung von rekombinanten Proteinen kann
bestimmt werden durch Ionenaustausch, Lektin oder Boronatliganden
in SZ. Der Analyt wird in diesem Fall die Fraktion eines rekombinanten Proteins
sein, welche keine Kohlenwasserstoffstruktur aufweist, die an den
Liganden in SZ bindet und daher am schnellsten durch SZ wandert.
- c) Rekombinante Proteine, in welchen ein Teil zur Auftrennung
eingefügt
worden ist, z.B. eine Histidinsequenz oder eine IgG-bindende Sequenz,
und in welchen die komplette Spaltung dieses Teils wichtig ist, können nach
der Auftrennung in SZ geprüft
werden durch einen Metallchelatliganden bzw. einem IgG(Fc)-Liganden.
Der Analyt wird in diesem Fall die Fraktion des rekombinanten Proteins
sein, für
welche die Histidinsequenz oder die Ig(Fc)-bindende Sequenz abgespalten
worden ist.
- d) Enzyme können
auftrennt werden in eine aktive und eine inaktive Form durch einen
Liganden in SZ, welcher ein Substratanalog oder ein Inhibitor des
fraglichen Enzyms ist. Der Analyt wird das inaktive Enzym sein.
- e) Proteine, Peptide oder andere Biomoleküle, welche ihre biologische
Funktion durch Bindung an einen spezifischen Rezeptor ausüben, können aufgetrennt
werden durch einen Liganden in SZ, welcher ein Rezeptor für das Biomolekül ist. Der
Analyt wird die Fraktion des Moleküls sein, dem die Fähigkeit
an den Rezeptor zu binden fehlt oder diese reduziert ist.
- f) Proteine (z.B. IgE) können
in vivo daran gebundene Autoantikörper (IgG, IgA, IgM) aufweisen.
Diese Autoantikörper
ergeben auf der einen Seite eine unterschiedliche Antwort in der
immunchemischen Bestimmung des Proteins, und auf der anderen Seite
eine veränderte
Turn-over-Rate/Funktion. Unter Verwendung von Antikörpern gegen
die fraglichen Autoantikörpern
als Ligand in der Separationszone können Autoantikörper in
freier und Immunkomplex-gebundener Form aufgetrennt werden und die
Menge der freien Form des Proteins (= Analyt, z.B. IgE) kann berechnet
werden.
- g) Durch einen monoklonalen Antikörper, der gegen eine bestimmte
Bindungsstelle eines Proteins gerichtet ist und in SZ immobilisiert
ist, kann das Vorhandensein von Heteroformen des Proteins, welche
keine Bindungsstelle aufweisen (= Analyt), detektiert werden durch
Quantifikation in DZ.
- h) das Vorhandensein von unterschiedlichen Substanzen, die an
Transportproteine gebunden sind, z.B. einen Wirkstoff, der an Albumin
gebunden ist, kann gemessen werden unter Verwendung von geeigneten
Liganden in SZ. Durch die Wahl eines geeigneten Liganden in SZ können Transportproteine
mit oder ohne gebundenem Wirkstoff in DZ gemessen werden.
- i) IgG und IgA in Serum können
in bestimmten rheumatischen oder Autoimmun-Erkrankungen eine erhöhte Adsorption
an verschiedenen Oberflächen
aufweisen. Durch Verankern von Liganden in der Separationszone,
die in der Lage sind an IgG und IgA mit veränderten Eigenschaften zu binden,
wird es möglich,
den Anteil von IgG und IgA mit unveränderten Adsorptionseigenschaften
(= Analyt) in DZ zu messen. Indem man das korrespondierende Autoantigen/Hapten
als Fänger
in DZ hat, können
spezifische Autoantikörper der
IgG- oder IgA-Klasse mit einer besseren Sensitivität gemessen
werden.
- j) Viele biologisch aktive Verbindungen (z.B. Peptide oder Steroide)
werden in Serum in der Form von Komplexen mit Bindungsproteinen
transportiert. Unter Verwendung von Antikörpern gegen das Bindungsprotein als
Ligand in SZ kann die nicht-komplex bebundene (freie) Form dieser
Verbindungen (= Analyt) immunchemisch bestimmt werden in der folgenden
Detektionszone. Beispiele sind Trijodthyronin und Thyroxin, welche
gebunden an Thyroxin-bindendes Globulin (TBG) oder Thyroxin-bindendes Prealbumin
(TBPA) transportiert werden. Analog können freie Formen von Estradiol
und Testosteron, welche in gebundener Form mit Sexualhormon-bindenden
Globulinen transportiert werden, gemessen werden.
- k) Die Bindungsfähigkeit
einer ersten Verbindung (= Analyt) für eine zweite Verbindung kann
bestimmt werden mit der Erfindung. In dieser Ausführungsform
kann man die zweite Verbindung als Ligand in SZ haben, und ein Fänger mit
einer bekannten Bindungsfähigkeit
für den
Analyten in DZ. Das Einfangen/Retardieren in SZ wird ein Maß der Bindungsfähigkeit
des Analyten sein und kann in DZ gemessen werden. Diese Ausführungsform
der Erfindung kann besonders vorteilhaft sein im Screening von unterschiedlichen
Bibliotheken von Verbindungen, wobei die Mitglieder der Bibliothek
Liganden in SZ sind (z.B. chemische Bibliotheken).
- l) Degradionsisoformen von Proteinen, in denen Aminosäuren abgespalten
worden sind, können
durch die Erfindung bestimmt werden. Z.B. sind Degradationsisoformen
von Kreatinkinase (CK) von Interesse als kardiale Marker.
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DETEKTION IN DZ UND MARKIERTER REAKTANT
(R*)
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Detektion
und Quantifikation von Signalkomplexen kann durchgeführt werden
durch einen analytisch detektierbaren Recktanten (Reaktant* = R*).
In jenen Fällen,
in denen der Analyt per se detektierbar ist und Teil eines Signalkomplexes
ist, kann die Detektion und Quantifikation ohne die Verwendung von
R* stattfinden.
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R*
ist üblicherweise
ein biospezifischer Affinitätsreaktant,
welcher markiert ist mit einer analytisch detektierbaren Gruppe,
wie einer enzymatisch aktiven Gruppe, radioaktiven Gruppe, fluoreszierenden
Gruppe, chromogenen Gruppe, Hapten, Biotin, Teilchen, etc. Analytisch
detektierbare Recktanten (R*) umfassen ebenfalls Recktanten, welche
per se Bindungsstellen oder Eigenschaften haben, die analytisch
detektiert werden können,
wenn der Reaktant Teil des Signalkomplexes ist. Beispiele solcher
Bindungsstellen sind Ig-Klassen- und Ig-Subklasse-spezifische Determinanten,
wenn der Reaktant ein Antikörper
ist und der Antigenbindungsteil davon verwendet wird, um den Komplex
in der Detektionszone zu bilden.
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Übliche Arten
von analytisch markierten Recktanten sind markierte Antikörper und
markiertes Antigen/Hapten. Markierte Antikörper haben ihre primäre Verwendung
in
- A) nicht-kompetitiven Techniken, wie einer
Sandwich-Technik,
in welcher der Fänger
a)
ein Antikörper,
der gegen dasselbe Antigen (= Analyt), wie der markierte Antikörper gerichtet
ist, oder
b) ein Antigen/Hapten, oder
- B) kompetitive Techniken, in welchen Kompetition stattfindet
zwischen einem Analyt und einem Festphase-gebundenen Analytanalog für eine limitierte
Menge eines Anti-Analyt-Antikörpers
und die Detektion von freien oder besetzten Stellen auf der Festphase
durchgeführt
werden kann, durch markierte Anti-Analyt-Antikörper bzw. Anti-Anti-Analyt-Antikörper.
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Markiertes
Antigen/Hapten hat seine primäre
Verwendung in
- A) kompetitiven Techniken, in
welchen ein markiertes Antigen/Hapten kompetitieren gelassen wird
mit einem nicht-markierten Antigen/Hapten für eine limitierte Menge eines
Antikörpers
(Fänger),
oder
- B) Sandwich-Techniken, in welchen Antigen/Hapten-spezifische Antikörper bestimmt
werden mit Anti-Antikörpern als
Fänger.
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Beispiele
von Varianten der Erfindung, in welchen ein analytisch detektierbarer
Reaktant (R*) nicht verwendet wird, sind solche, in welchen der
Analyt per se detektierbar ist, wenn er Teil des Komplexes in DZ
ist. Dies wird illustriert mit einem Enzym als Analyt in Kombination
mit einem Substrat, welches ein analytisch detektierbares Produkt
ergibt, z.B. ein Substrat, welches ein gefärbtes oder fluoreszierendes
Produkt ergibt, das unlöslich
sein sollte.
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R*
kann Bindungsfähigkeit
an die störenden
Bestandteile, die in SZ abgetrennt werden, aufweisen, muss aber
nicht. In dem Ausmaß in
dem R* Bindungsfähigkeit
aufweist, sollte die Auftragungszone davon stromab der Separationszone
(SZ) positioniert sein, es sei denn, es ist erwünscht, das Niveau von störenden Heteroformen
durch die Menge an R*, die an SZ bindet, zu messen.
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Eine
besonders nützliche
Markierungsgruppe sind Teilchen, welche optional eine der oben erwähnten detektierbaren
Gruppen, wie eine fluorophore Gruppe oder eine chromogene Gruppe
(fluoreszierende bzw. gefärbte
Teilchen) enthalten. Nützliche
Teilchen haben vielfach eine Größe im Bereich
von 0,001 bis 5 μm,
vorzugsweise im Bereich von 0,05 bis 5 μm. Die Teilchen können kolloidale
Dimensionen aufweisen, sogenanntes Sol (d.h., üblicherweise sphärisch und
monodispers mit einer Größe im Bereich
von 0,001 bis 1 μm).
Insbesondere können
Metallteilchen erwähnte
werden (z.B. Goldsol), Nicht-Metallteilchen (z.B. SiO
2,
Carbon, Latex und getötete
Erythrocyten und Bakterien). Es sind auch Teilchen mit nicht-kolloidalen
Dimensionen verwendet worden. Diese Teilchen sind mehr oder weniger
unregelmäßig gewesen
und mehr oder weniger polydispers (z.B. Carbonteilchen < 1 μm; Pharmacia
AB,
WO 96/22532 ).
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Wenn
Teilchen die Markierungsgruppe der Erfindung sind, kann der Komplex
in DZ oft visuell detektiert werden oder durch optische Messausrüstung (z.B.
eine CCD-Kamera, verbunden mit einem Computer mit spezieller Software
für Imageanalyse
oder ein Laserscanner).
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Für Teilchen
als Markierungsgruppe wird Bezug genommen auf
Wo 88/08534 (Unilever);
US-A-5,120,643 (Abbott);
EP-A-284,232 (Becton
Dickinson) und andere.
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PROBEN
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Die
Erfindung ist primär
für biologische
Proben gedacht, z.B. Blut (Serum, Plasma, Vollblut), Speichel, Tränenflüssigkeit,
Urin, Cerebrospinalflüssigkeit,
Schweiß,
etc. Die Erfindung ist auch anwendbar auf andere Proben, wie Fermentationslösungen,
Reaktionsmischungen, Lösungen,
die ein bestimmtes Protein enthalten, für welches die Bindungsfähigkeit
an einen Liganden in SZ untersucht werden soll, etc. Siehe oben
unter dem Titel "Analyten". Es kann insbesondere
interessant sein die Erfindung zur Analyse von Umweltproben zu verwenden.
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Zusätzlich zu
dem Verfahren betrifft die Erfindung auch eine Vorrichtung bzw.
einen Kit, enthaltend die oben definierte Flussmatrix.
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Die
Erfindungen, die in den oben erwähnten
internationalen Anmeldungen
WO
99/3780 ,
WO 99/36776 und
WO 99/36777 offenbart sind,
können
in relevanten Teilen bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung darstellen.
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PATENTBEISPIELE
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BEISPIEL 1: Teststreifen zur Messung des
Anteils von freiem IgE, IgE gebunden an IgG und Antikörper gegen IgE
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2A, 2B und 3 ist
die Richtung des Transportflusses durch einen Pfeil (10)
angezeigt. In jeder Variante kann am Anfang des Transportflusses
eine Zone ASZ (11) für
die Probe sein, stromab davon eine Zone DZ (12), am Ende
des Transportflusses ein Saugteil (13), und zwischen jeder
Art von Zone Teile, welche nur als Transportzonen (14)
dienen.
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2A:
Die Variante gemäß dieser
Abbildung hat fünf
Separationszonen (SZ), in welchen der Ligand derselbe oder ein unterschiedlicher
sein kann oder in verschiedenen Mengen vorhanden sein kann (15 bis 19) und
eine AR*Z (20) für
Reagenzien.
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2B:
Es liegt dieselbe Folge von Zonen vor wie in 2A, außer dass
ASZ (11) und AR*Z (20) zusammenfallen (21).
Diese Abfolge von Zonen kann auch verwendet werden in Fällen in
denen der Analyt per se detektierbar ist, wenn er Teil eines Signalkomplexes
in DZ ist. Ein AR*Z ist dann nicht notwendig.
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3:
Die Abfolge von Zonen gemäß dieser
Abbildung zeigt zwei Arten von Auftrennungszonen SZ1 (22, 23)
bzw. SZ2 (24), und separat AR*Z (25) stromab von
SZ1 (23) und SZ2 (24).
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HINTERGRUND:
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Freies
IgE und IgE-Komplex-gebunden an Autoantikörper (IgA, IgG und IgM) können für die Messung interessant
sein. Vor allem sollte jedoch freies IgE korrekt quantifiziert werden.
In den gegenwärtigen
Tests zur Messung von IgE können
die Autoantikörper
an dasselbe Epitop an IgE binden, wie die Reagenz-Antikörper (Anti-IgE-Antikörper) und
dies kann dann zu fälschlicher
Weise zu niedrigen Gesamt-IgE-Niveaus führen, die vom Design des Tests
abhängig
sind. Durch Auftrennen von IgG, IgM und IgA vor der Messung von
IgE, kann freies IgE gemessen werden. Die Menge von Autoantikörpern sollte
auch quantifiziert werden, sowohl als Komplexe sowie als freie IgG-Antikörper, die
gegen IgE gerichtet sind.
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Die
gebräuchlichsten
Tests messen freie Antikörper
durch Verfahren, die IgE gebunden an eine Festphase (korrespondierende
zu DZ) verwenden, mit der eine stark verdünnte Serumprobe interagieren
gelassen wird. Wenn die Serumprobe Anti-IgE-Antikörper enthält, wird
der Letztere an die Festphase gebunden unter Bildung eines Immunkomplexes.
Nachdem nicht-gebundene Serumbestandteile weggewaschen wurden, wird Anti-IgG-Antikörper, der
markiert ist (R*), z.B. mit einem Enzym, hinzugefügt. Ein Überschuss
an markiertem Antikörper
(R*) wird entfernt und die Menge von Enzym-markiertem Anti-IgG-Antikörper (R*),
gebunden an die immobilisierten Immunkomplexe wird bestimmt durch
das Hinzufügen
eines geeigneten Substrats. Die Sensitivität dieser Tests ist limitiert
durch die unspezifische Bindung von IgG an die Festphase. Der IgE-spezifische Teil
der IgG-Population
ist im allgemeinen sehr klein und es mag schwierig sein, diesen
zu unterscheiden von der Menge von unspezifisch gebundenem IgG.
Durch Einfangen von IgG an die Festphase und Messen der Bindung
von IgE kann diese Limitierung vermieden werden.
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Wenn
IgG-Komplex-gebundenes IgE gemessen wird, wird IgG an eine Festphase
s (korrespondierend zu DZ) eingefangen, welche einen kovalent gebundenen
Anti-IgG-Antikörper
(Fänger)
trägt.
Durch Hinzufügen von
markiertem Anti-IgE-Antikörper
(R*), kann die Menge an Komplex-gebundenem IgE gemessen werden.
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Die
Verwendung einer Immunassaytechnik, basierend auf lateralem Flüssigkeitstransport
in Membranen, wie oben beschrieben, worin der Fluss zunächst durch
eine oder mehrere Separationszonen (SZ) und dann eine Detektionszone
(DZ) hindurchtritt, öffnet
viele Möglichkeiten
für die
einfache Messung von IgE-IgG-bezogenen Parametern. Wenn z.B. eine
Probe, die eine Mischung von freiem IgE und IgE gebunden an menschliche
Anti-IgE-Antikörper
der IgG-Klasse zunächst
durch eine Zone hindurchtritt, die Festphasen-gebundene anti-menschliche IgG-Antikörper (Ligand
in SZ) enthält,
und dann eine Zone, enthaltend Festphasen-gebundene Anti-IgE-Antikörper (Fänger in
DZ), wird der Probengehalt von Komplexen zwischen IgE und Anti-IgE-Antikörpern der
IgG-Klasse in der
Separationszone gebunden werden, während freies IgE hindurchtritt
zur Detektionszone, wo es bestimmt wird durch Hinzufügen von
markiertem Anti-IgE-Antikörper
(R*), stromaufwärts
der Detektionszone (12), jedoch stromabwärts der
Separationszone (15 bis 19) zur Passage nur durch
die Detektionszone (Hinzufügen
in Zone 20 in 2A). Dadurch, dass der Anti-IgE-Antikörper (R*)
auch durch die Separationszone hindurchtritt, kann die Menge von
IgE-IgG-Komplex,
gefangen in der Separationszone durch Bindung an anti-humanes IgG
(Ligand), auch bestimmt werden (ASZ und AR*Z fallen zusammen) (Hinzufügen in Zone 21 in 2B,
ASZ gemeinsam mit AR*Z). In der Separationszone sind zusätzlich zu
Komplexen zwischen IgE und Anti-IgE-Antikörper der IgG-Klasse auch freie
Antikörper
gegen IgE. Die Menge der Letzteren kann bestimmt werden durch das
Hindurchtreten von markiertem IgE (R*1)
durch die Separationszone. Markiertes IgE (R*1)
wird dann in einem separaten Test auf einem Membranstreifen stromaufwärts von
SZ hinzugefügt.
Siehe 2B.
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Wenn
die Menge von IgG im Serum sehr hoch ist, müssen verschiedene Banden mit
hohen Konzentrationen von Anti-IgG als SZ verwendet werden. Sowohl
Komplex-gebundene als auch freie Anti-IgE-Antikörper werden dann verteilt sein über verschiedene
Banden in Folge der Gesamtmenge von IgG, und die Summe der Signalintensitäten dieser
Banden ergibt die Menge von Antikörpern gegen IgE.
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In
dem nachfolgenden Beispiel wird das Testprinzip von artifiziell
hergestellten Komplexen von IgE und IgG demonstriert. Die Komplexe
sind hergestellt worden mit monoklonalen Antikörpern gegen IgE, und Antikörper gegen
Maus-IgG sind daher gebunden worden an die Auftrennungsmembran.
In dem Detektionssystem sind Antikörper gegen IgE, die gegen andere
Epitope als die Komplex-bindenden Antikörper gerichtet sind, verwendet
worden. Dies ermöglicht es,
den Komplex genauso gut wie freies IgE in dem Detektionssystem zu messen.
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SEPARATIONSMEMBRAN 1 (SZ1):
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Schaf-Anti-Maus-IgG(Fc)
(Ligand 1) wurde gekoppelt an Polystyrolaldehydteilchen (0,29 μm Durchmesser,
IDC, Portland, Oregon, USA) durch Mischung von 1,0 mg/ml Antikörper und
20 mg/ml Polysytrolaldehydpartikel in 25 mM Phosphatpuffer, pH 6,6,
bei 4°C
für 20
Stunden. Die Teilchen wurden in 20 mM Boratpuffer, pH 8,6, gewaschen
und wurden reagiert mit 15 mg NaCNBH3 (Sigma-Aldrich
Chemie, Steinheim, Deutschland) pro 50 mg der Teilchen für 20 Stunden.
Die Teilchen wurden dann in 20 mM Boratpuffer, pH 8,6, gewaschen,
durch wiederholte Suspension, Zentrifugation und Abgießen. Die
Teilchensuspension wurde verdünnt in
3% Trehalose, 20 mM Boratpuffer auf 25 mg Teilchen/ml. Die verdünnte Suspension
wurde auf Streifen gesprüht
(20 cm × 3
cm)) von Nitrocellulosemembranen (Nitrocellulose auf Polyester,
5 μm Porengröße, Whatman
International Ltd., England) in zwei 0,3 cm breiten Linien, die
parallel waren zu den langen Seiten der Streifen. Die Sprühausrüstung (IVEK
linear striper, IVEK Corporation, Vermont, USA) lieferte etwa 50 μg Polystyrolteilchen/cm
für jede
Linie. Die Membranen wurden bei Raumtemperatur getrocknet und dann
in kleinere Stücke
(0,5 cm × 3
cm) geschnitten.
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SEPARATIONSMEMBRAN 2 (SZ2):
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Maus-IgG
(Ligand 2) wurde in 20 mM Boratpuffer auf 3,4 mg Protein/ml verdünnt. Der
verdünnte
Antikörper
wurde auf Streifen (20 cm × 4
cm) von Nitrocellulosemembranen (derselbe Typ wie oben) in einer
0,3 cm breiten Linie gesprüht
(Sprühausrüstung wie
oben) mit etwa 6,8 μg
Antikörper/cm.
Die Membranen wurden bei Raumtemperatur getrocknet und dann in kleinere
Stücke
(0,5 cm × 1
cm) geschnitten.
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DETEKTIONSMEMBRAN (DZ):
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Maus-Anti-IgE-monoklonale
Antikörper
(gerichtet gegen Domäne
4 auf IgE, Fänger)
wurde verdünnt in
20 mM Boratpuffer auf 1,0 mg Protein/ml. Der verdünnte Antikörper wurde
auf Streifen (20 cm × 4
cm) von Nitrocellulosemembranen (derselbe Typ wie oben) in einer
0,15 breiten Linie (Sprühausrüstung wie
oben) mit etwa 1 μg
Antikörper/cm
gesprüht.
Die Membranen wurden bei Raumtemperatur getrocknet und in kleinere Stücke geschnitten
(0,5 cm × 4
cm), so dass die Linie mit Antikörper
parallel zu einer kurzen Seite war.
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KOMBINATIONSMEMBRAN: Siehe 3.
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Ein
Teil der Separationsmembran 1 (0,5 cm × 3 cm, SZ1, 22 bzw. 23,
in 3) wurde an ein Stück Separationsmembran 2 (0,5
cm × 1
cm, SZ2, 24 in 3) befestigt und die so erhaltene
kombinierte Separationsmembran wurde wiederum verbunden mit einem
Streifen der Detektionsmembran (0,5 cm × 4 cm, die Linie = DZ = 12 in 3)
(kurze Seite an kurze Seite mit einem Spalt zwischen ihnen). Die
Stücke
wurden an der Unterseite mit Klebeband zusammengehalten. Auf der
Oberseite wurden Stücke
von Nitrocellulose platziert (0,5 cm × 0,3 cm) (A100, 12 μm, Schleicher
und Schuell, Dassel, Deutschland) mit etwas überlappenden zwei benachbarten
kurzen Seiten. Die letzteren Stücke
wurden durch mehr Klebeband an Ort und Stelle gehalten. Ein Cellulosefilter
(13 in 3) (0,5 cm × 2 cm; GB 004, Schleicher
und Schuell, Dassel, Deutschland), überlappend mit der freien kurzen
Seite der Detektionsmembran, wurde als Saugmembran aufgebracht.
Die Abfolge der Zonen war ASZ, SZ1, SZ2, DZ.
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HERSTELLUNG VON CARBONTEILCHENKONJUGAT
(R*):
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CARBONSUSPENSION
(STOCKLÖSUNG):
2 g Carbonteilchen (sp 100, Degussa, Deutschland) wurden suspendiert
in 200 ml 5 mM Boratpuffer, pH 8,4, und mit Ultraschall beschallt
(VibraCell 600 W, 1,5 cm Spitze, Soniced Materials, Danebury, Connecticut,
USA) in einem Eisbad für
3 × 5
Minuten bei 100% Amplitude und mit 9,9 + 2 Sekunden Puls.
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CARBONTEILCHENKONJUGAT
(R*): 35 μg/ml
Fab'2 von Anti-IgE-monoklonalen Antikörpern (gerichtet
gegen Domäne
3 in IgE) und eine Suspension der Carbonteilchen (250 μg/ml) wurden
für 3 Stunden
gemischt. Rinderserumalbumin (BSA) wurde zu 1% hinzugefügt und die
Teilchen wurden für
weitere 30 Minuten gemischt und dann gewaschen durch Zentrifugation
in 1% BSA (0,1 M Boratpuffer, pH 8,5, 0,05% NaN3)
und verdünnt
auf 0,8 mg Carbon/ml in dem Waschpuffer. Das fertige Carbonteilchenkonjugat
wurde bei 4°C
im Waschpuffer gelagert.
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PROBENMATERIAL:
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HERSTELLUNG
EINES KOMPLEXES ZWISCHEN IgE UND IgG: 1 mg IgE (ND)/ml und 5 mg/ml Maus-Anti-IgE-monoklonaler
Antikörper
(der IgG-Klasse und gerichtet gegen Domäne 2) wurden in 50 mM Phosphatpuffer,
pH 7,5, für
2,75 Stunden bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Die Probenmischung
(0,35 ml) wurde auf SuperdexTM 200 prep
grade, 16/60 (Amersham Pharmacia Biotech AB, Schweden) aufgetrennt. Die
Auftrennung gab zwei unterscheidbare Komplexpeaks, wobei ein Peak
zu IgE-IgG korrespondierte und ein Peak zu IgG-IgE-IgG.
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KONTROLLE MIT 125I-MARKIERTEN
PROTEINEN (MARKIERTE ANTI-IgE-ANTIKÖRPER UND
MARKIERTES IgE):
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SEPARATIONSMEMBRAN
1 (LIGAND = ANTI-MAUS-IgG): Maus-Anti-IgE-Antikörper (gegen Domäne 2 von
IgE) und IgE wurden markiert mit 125I (Chloramin
T) mit einem Markierungsgrad von 0,03 für Anti-IgE-Antikörper und
1,5 für
IgE. Die markierten Proteine wurden verdünnt in 6% BSA (50 mM Phosphatpuffer, pH
7,5): Anti-IgE-Antikörper
auf etwa 2,4 μg/ml
und IgE auf 0,06 μm/ml. 125I-Anti-IgE-Antikörper (Domäne 2) wurde mit unmarkiertem
Anti-IgE-Antikörper
(gegen Domäne
2) gemischt zur Messung von höheren
Niveaus von Anti-IgE-Antikörpern.
Eine Saugmembran (0,5 cm × 2
cm, GB004, Schleicher und Schuell, Dassel, Deutschland) wurde mit
Klebeband befestigt auf ein Ende eines Stücks der Separationsmembran
1 (0,5 cm × 4
cm) mit adsorbierten Schaf-Anti-Maus-IgG(Fc). 10 μl 0,1 M Boratpuffer,
pH 8,5 (6% BSA, 0,05% NaN3), gefolgt durch
10 μl einer
Lösung
von 125I-Protein wurden aufgetragen auf
das freie Ende der Separationsmembran. Der laterale Fluss wurde
dann initiiert durch das Hinzufügen
von 4 × 10 μl 0,1 M Boratpuffer,
pH 8,5 (1% BSA, 0,05% NaN3) auf das freie
Ende. Nachdem die gesamte Flüssigkeit
in die Membran gewandert war, wurde sie in Stücke geschnitten zur Messung
der Radioaktivität
in den verschiedenen Zonen des Blatts (Separations- und Transportzonen).
Die Messung wurde in einem Gamma-Zähler durchgeführt und
der Anteil von 125I-Protein (markierte Anti-IgE-Antikörper bzw.
markiertes IgE), die in den verschiedenen Zonen eingefangen worden
waren, wurden berechnet nach der Korrektur für die Menge von freiem radioaktiven
Jod. IgE band nicht stärker
an die Separationszonen, in welchen Anti-IgG-Antikörper der
Ligand war als an die dazwischenliegenden Transportzonen. Mehr als
85% IgE trat durch die Membran hindurch. Auf der anderen Seite wurde
der gesamte Anti-IgE-Antikörper
gebunden in den zwei Separationszonen, wenn bis zu 120 ng Anti-IgE-Antikörper hinzugefügt wurde.
Wenn 1.000 ng Anti-IgE-Antikörper
hinzugefügt
wurden, wurden 200 ng in jeder Anti-Maus-IgG-Zone (Separationszone)
gebunden und 500 ng traten hindurch. Für IgG in menschlichem Serum mag
diese Kapazität
ausreichend sein, wenn das Serum 1/100 verdünnt wird (etwa 1.000 ng IgG)
und mehr Anti-IgG-Antikörper
(gegen menschliches IgG) als fest verankerter Ligand verwendet wird.
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SEPARATIONSMEMBRAN
2 (LIGAND = MAUS-IgG): Diese Membran wurde eingeführt, um
Anti-Maus-IgG-Antikörper
zu binden, welche freigesetzt worden sein könnten aus der Separationsmembran
1, welche ansonsten an die Detektionszone gebunden werden würde, was
in einem erhöhen
Hintergrundsignal resultieren würde
(Anti-Maus-IgG-Antikörper
hat zwei Fab-Teile und kann daher gleichzeitig an R* und den Fänger binden,
welche beide Maus-IgGs
sind). Die Menge Schaf-Anti-IgG, die freigesetzt wurde, könnte vorteilhafterweise
gebunden werden mit einer Separationszone, enthaltend Maus-IgG,
vor der Detektionszone. Durch diese Fängerzone (SZ2) konnte die nicht-spezifische
Bindung in der Detektionszone mehr als 6-fach verringert werden.
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STANDARDPROTOKOLL ZUR KOMBINIERTEN AUFTRENNUNG
UND IMMUNCHEMISCHEN BESTIMMUNG:
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20 μl Waschpuffer
(1% BSA, 0,9% NaCl, 1% Tween 20, 0,1 M Boratpuffer, pH 8,4, 0,05%
NaN3) wurden aufgetragen auf die Kante des
freien Endes (ASZ = 11 in 3) der Separationsmembran
1 auf einem Kombinationsstreifen gemäß dem Obenstehenden (Abfolge
SZ1, SZ2, DZ). Dann wurden jeweils 10 μl IgE-Standard (IgE, 4 bis 500
kU/l, 0,01 bis 1,2 μg/ml)
und Probe (IgE-IgG-Komplex mit etwa 1 μg Komplex/ml und IgG-IgE-IgG-Komplex mit
etwa 1,3 μg
Komplex/ml) hinzugefügt.
Sowohl Probe als auch Standard waren verdünnt in 50 mM Phosphatpuffer,
pH 7,5, enthaltend 6% BSA und 0,05% NaN3.
Ein lateraler Fluss wurde initiiert durch Platzieren eines 0,6 cm × 0,6 cm × 0,3 cm
Celluloseschwamms, enthaltend Waschpuffer, 0,1 M Boratpuffer, pH
8,4 (1% BSA, 0,9% NaCl, 1% Tween 20, 0,05% NaN3)
auf dem freien Ende des Auftrennungsteils des Streifens. Die Testlösung wanderte
durch die Separationszonen (22, 23, 24 in 3)
und die Detektionszone (12 in 3) und in
den Saugcelluloseschwamm (13 in 3). Nach
7 Minuten Fluss, wurden 10 μl Konjugat
(R*) von Carbonteilchen und Anti-IgE-Antikörper (0,8 mg Carbon/ml in 0,1
M Boratpuffer, pH 8,4 (1% BSA, 0,05% NaN3)
hinzugefügt
in der Position zwischen der Detektionszone und dem Separationsteil
(25) des Streifens. Nach weiteren 5 Minuten Fluss war die
Detektionszone grau bis schwarz gefärbt. Die Schwärzung wurde
durch einen Laserscanner ausgelesen (Ultrascan, Amersham Pharmacia
Biotech AB, Uppsala, Schweden), die Peakintensität wurde berechnet und die Konzentration
bestimmt durch Lesen gegen die IgE-Standardkurve. Je höher die IgE-Konzentration,
desto schwärzer
das Signal.
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Als
Vergleich wurden Streifen, in denen die Separationszone 1 durch
Nitrocellulose ohne Ligand ausgetauscht worden war (sowohl Standard
als auch Probe), in derselben Weise ausgewertet.
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ERGEBNISSE:
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Die
Standards (IgE) gaben dieselbe Intensität auf der Schwärzungskurze
in beiden Messsystemen. Die Komplexe (IgE-IgG und IgG-IgE-IgG) wurden detektiert
durch ein starkes schwarzes Signal in DZ, wenn SZ1 ersetzt wurde
durch Nitrocellulose ohne Ligand. Wenn SZ1 Anti-Maus-IgG als Ligand
enthält,
konnte in DZ kein Signal detektiert werden für die Komplexe. TABELLE 1
| Probe | Separationszone
(SZ1) |
| Immunkomplex | Ohne
Ligand | Ligand
= Anti-Maus-IgG |
| IgE-IgG-Komplex | 131
kU/l | < 4 kU/l |
| IgG-IgE-IgG-Komplex | 141
kU/l | < 4 kU/l |
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Die
Separationszone mit Anti-Maus-IgG fing so mehr als 97% der Komplexe.
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BEISPIEL 2: BESTIMMUNGSVERFAHREN FÜR CD-TRANSFERRIN
IN PATIENTENPROBEN
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SEPARATIONSMEMBRAN MIT ANIONENAUSTAUSCHEIGENSCHAFTEN:
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Ein
Blatt Nitrocellulosemembran (5 μm,
Nitrocellulose auf Polyester, Whatman International Ltd., England)
wurde in einer Lösung
von 0,1% Polyethylenimin (PEI, Sigma, St. Louis, MO, USA) in ultrareinem
Wasser (Milli Q, Millipore Corp., Redford, MA, USA) platziert. Die
Lösung
wurde für
3 Stunden geschüttelt
und dann in 0,1% Tween 20 für
30 Minuten platziert, luftgetrocknet und dann in einem Plastikbeutel
bei 4°C
gelagert. Der Grad der Modifikation der Membran wurde mit Bromphenolblau
(pK = 4,1) überprüft.
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Die
Funktion der modifizierten Membran mit geladenen Proteinen zu interagieren
wurde bestätigt durch
Transportieren von 125I-markierten Proteinen
(Rinderserumalbumin, Tetrasialo- und Asialo-Transferrin, welches
mit der Chloramin T-Methode markiert worden war) in einem lateralen
Flüssigkeitsfluss
in Streifen des Blattes. Das Protein mit dem höchsten pI hatte die stärkste Tendenz
mit dem Flüssigkeitsfluss
zu wandern. Wenn die Flüssigkeit
in verschiedenen Tests eine ansteigende Konzentration von NaCl (0
bis 1.000 mM) enthielt, wurde die Wanderungsrate am meisten beeinflusst
für die
Proteine mit dem geringsten pI. Beide dieser Funktionskontrollen
unterstützen
die Tatsache, dass positiv geladene Gruppen bei der Behandlung mit
Polyethylenimin eingeführt
worden waren und dass diese Gruppen als Ionenaustauschergruppen
gegenüber
Protein und NaCl funktionieren können.
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DETEKTIONSMEMBRAN:
Anti-Transferrin-monoklonaler Antikörper wurde gekoppelt an Polystyrolaldehydteilchen
(0,29 μm
Durchmesser, IDC, Portland, Oregon, USA) durch Mischen von 1,3 mg/ml
Antikörper und
22 mg/ml Polystyrolaldehydteilchen in 25 mM Phosphatpuffer, pH 6,6,
bei 4°C
für 18
Stunden. Die Teilchen wurden in 20 mM Boratpuffer, pH 8,4 gewaschen
und wurden reagiert mit 5 mg NaCNBH3 (Sigma-Aldrich
Chemie GmbH, Steinheim Deutschland) pro 40 mg Teilchen pro ml für 18 Stunden.
Die Teilchen wurden in 20 mM Boratpuffer, pH 8,6, gewaschen und
verdünnt
in 20 mM Boratpuffer, enthaltend 6% Trehalose auf 14 mg Teilchen/ml.
Die verdünnte
Suspension wurde auf Streifen (20 cm × 4 cm) von Nitrocellulosemembranen
(5 μm, Nitrocellulose
auf Polyesterrücken,
Whatman International Ltd., England) in einer 1,4 mm breiten Linie
in der Mitte des Streifens und parallel zur langen Seite des Streifens
aufgesprüht.
Die Sprühausrüstung war
die gleiche wie in Beispiel 1 und lieferte nun 14 μg Polystyrolteilchen/cm.
Die Membranen wurden bei Raumtemperatur getrocknet und in einem
Plastikbeutel bei 4°C
gelagert.
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KOMBINATIONSMEMBRAN:
Siehe 1. Das Ende eines Streifens der Separationsmembran
(0,5 cm × 3
cm) (= SZ = 5 in 1) wurde
durch ein Klebeband montiert auf der Unterseite auf das Ende eines Streifens
der Detektionsmembran, welche um 0,5 cm verkürzt worden war (0,5 cm × 3,5 cm,
die Linie mit Antikörper
= DZ = 4 in 1). Der Spalt zwischen den Enden
wurde überbrückt mit
einer Überlappung
durch ein Stück
Nitrocellulosemembran (0,3 cm × 0,5
cm, A100, 12 μm,
Schleicher und Schuell, Dassel, Deutschland), welches durch ein
Klebeband niedergehalten wurde. Als Saugmembran (9 in 1)
wurde ein Cellulosefilter (0,5 cm × 2 cm, GB 004, Schleicher
und Schuell, Dassel, Deutschland) durch Klebeband montiert, so dass
er mit dem freien Ende des Streifens, abgeleitet von der Detektionsmembran überlappte.
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CARBONTEILCHENKONJUGAT (R*):
-
CARBONSUSPENSION
(STOCKLÖSUNG):
2 g Carbonteilchen (sp 4, Degussa, Deutschland) wurden in 100 ml
5 mM Boratpuffer, pH 8,4, suspendiert und mit Ultraschall beschallt
in demselben Apparat wie in Beispiel 1 in einem Eisbad für 5 Minuten
bei 100% Amplitude und 5 + 5 Sekunden Puls.
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CARBONTEILCHENKONJUGAT:
100 μg/ml
Anti-Transferrin-monoklonaler
Antikörper
und Carbonsuspension (250 μg/ml)
wurden für
2 Stunden gemischt. BSA wurde zu 1% hinzugefügt und die Teilchen wurden
für weitere
30 Minuten gemischt und dann gewaschen durch Zentrifugation in 0,1
M Boratpuffer, pH 8,5 (enthaltend 1% BSA und 0,05% NaN3)
und verdünnt
auf 1,9 mg Carbon/ml mit Waschpuffer. Das fertige Carbonteilchenkonjugat
wurde bei 4°C
im Waschpuffer gelagert.
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PROBENMATERIALIEN:
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TETRASIALO-TRANSFERRIN:
Tetrasialo-Transferrin wurde isoliert aus einer Eisen-gesättigten
Präparation
von menschlichem Transferrin (hauptsächlich Tetrasialo-Transferrin)
durch Ionenaustauschchromatographie auf Mono Q (Amersham Pharmacia
Biotech AB, Uppsala, Schweden).
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ASIALO-TRANSFERRIN:
Eine Eisen-gesättigte
Präparation
von Transferrin (Sigma, St. Louis, MO, USA) wurde behandelt mit
Neuramidase (Behringwerke, Marburg, Deutschland), wonach Asialo-Transferrin isoliert
wurde durch Ionenaustauschchromatographie auf Mono Q (Amersham Pharmacia
Biotech AB, Uppsala, Schweden).
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ISOELEKTRISCHE
PUNKTE (pI): Die Werte wurden bestimmt für die jeweiligen Isoformpräparationen und
für BSA
durch isoelektrische Fokussierung in Phast System (Amersham Pharmacia
Biotech AB, Uppsala, Schweden). Asialo-Form pI = 5,7, Tetrasialo-Form
pI = 5,3 und BSA pI = 4,7.
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TRANSFERRIN-STANDARD:
Asialo-Transferrin, hergestellt wie oben, wurde verdünnt in 20
mM BIS-TRIS pH 6,3, enthaltend 0,2% BSA, 0,1% Tween 20, 0,1 mM Fe3 +-Citrat und 1 mM
NaHCO3 und 0,05% NaN3 auf
die Konzentrationen 0,07 bis 16,6 μg Transferrin/ml und wurde als
Standard verwendet.
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SERUMPROBEN:
11 Serumproben und 6 Serumkontrollen wurden 1/50 verdünnt in 20
mM BIS-TRIS pH 6,3, enthaltend 0,1% Rinder-gamma-Globulin (Sigma, St. Louis, USA),
0,1% Tween 20, 0,1 mM Fe3 +-Citrat, 1
mM NaHCO3 und 0,05% NaN3.
Die Serumproben wurden zuvor analysiert in Bezug auf CDT durch CDTect (Pharmacia & Upjohn Diagnostics
AB, Uppsala, Schweden). CDTect misst CD-Transferrin.
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STANDARDPROTOKOLL ZUR KOMBINIERTEN SEPARATION
UND IMMUNCHEMISCHEN DETERMINATION:
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2 μl Probe (Verdünnungsserie
von Transferrin bzw. verdünnte
Serumproben) wurden aufgetragen bei 1 cm von der Kante (ASZ =
3 in
1)
des freien Endes des Membranteils mit der Separationszone auf einen Kombinationsstreifen
gemäß dem Obenstehenden.
Ein lateraler Flüssigkeitsfluss
wurde initiiert durch Platzieren eines 0,6 cm × 0,6 cm × 0,3 cm Celluloseschwammes
(
8 in
1), getränkt mit 20 mM BIS-TRIS-Puffer, pH 6,5,
enthaltend 15 mM NaCl und 0,1% Tween 20 auf dem freien Ende der
Separationszone. In der Separationszone (
5 in
1)
werden der Analyt (CD-Transferrin)
und seine Heteroformen (andere Transferrine), angezogen durch positive
Ladungen, die fest in der Zone verankert sind (Ligand eingeführt in der
PEI-Behandlung), so dass eine Heteroform mit einer größeren negativen
Ladung (andere Transferrine) stärker
angezogen werden als Heteroformen mit einer geringeren negativen
Ladung (CD-Transferrin),
d.h., CD-Transferrine wandern leichter mit dem Flüssigkeitsfluss
als Trisialo-, Tetrasialo-, Pentasialo-, etc. Transferrin. Während seiner Wanderung
durch den Kombinationsstreifen/Matrix wird ein gewisser Anteil der
Gesamtmenge Transferrin daher in der Lage sein, an Anti-Transferrin-Antikörper (Fänger) in
der Detektionszone (DZ =
4 in
1) zu binden.
Nach 4 Minuten Fluss wurden 5 μl
Konjugat (R*) zwischen Carbonteilchen und Anti-Transferrin-Antikörper (1,8
mg Carbon/ml in 0,1 M Boratpuffer, pH 8,4, enthaltend 30% Trehalose,
1% Tween 20, 1% BSA, 0,05% NaN
3) hinzugefügt zwischen
der Separationszone und der Detektionszone (in Zone (
6)
in
1 (= AR*Z)). Nach weiteren 5 Minuten wurde der
Fluss gestoppt und die Schwärung
in der Detektionszone wurde ausgelesen mit einem Laserscanner (Ultroscan,
Amersham Pharmacia Biotech AGB, Uppsala, Schweden) und die Konzentration
wurde berechnet durch Ablesen gegen Messwerte für die Verdünnungsserie von Asialo-Transferrin. Je höher das
Niveau von CD-Transferrin in der Probe, desto stärker das Schwärungssignal. TABELLE 2: ERGEBNISSE
| Probe | CDTect
U/l | Erfindung
Willkürliche
Einheiten/l | Probe | CDTect
U/l | Erfindung
willkürliche
Einheiten/l |
| 1 | 5 | 0,09 | 10 | 38 | 0,87 |
| 2 | 11 | 0,24 | 11 | 40 | 1,24 |
| 3 | 13 | 0,22 | 12 | 40 | 1,51 |
| 4 | 17 | 0,30 | 13 | 58 | 1,71 |
| 5 | 18 | 0,49 | 14 | 78 | 1,60 |
| 6 | 22 | 0,44 | 15 | 86 | 2,18 |
| 7 | 22 | 0,57 | 16 | 90 | 2,85 |
| 8 | 26 | 0,55 | 17 | 110 | 3,36 |
| 9 | 26 | 0,64 | | | |
-
Die
Messwerte, erhalten mit dem Verfahren der Erfindung, zeigten eine
sehr gute Konformität
mit jenen erhalten mit CDTect (Korrelationskoeffizient 0,971). Die
Erfindung ist erheblich schneller und einfacher durchzuführen als
CDTect.
-
BEISPIEL 3: TESTSTREIFEN MIT SAMBUCUS
NIGRA-LEKTIN IN DER SEPARATIONSZONE
-
SEPARATIONSMEMBRAN:
Ein Blatt (4 cm × 12
cm) Cellulose (Cellulosefilter 54, Whatman International Ltd., England)
wurde aktiviert mit Cyanodiethylaminpyridin (CDAP) (Kohn und Wilchek,
Appl. Biochem. Biotechnol. 9 (1984) 285-304). Das aktivierte Blatt
wurde platziert in einer Lösung
von 0,1 mg/ml Sambucos Nigra-Lektin (bindet Sialsäure, die
in der Endposition einer Kohlenstoffkette ist; Vetor Laboratories
Inc. Burlingame, CA, USA) in 0,1 M NaHCO3,
pH 8,4. Die Lösung
wurde für
2 Stunden geschüttelt
und das Blatt wurde dann platziert in a) 0,1 M NaHCO3,
b), 0,5 M NaCl, c) destilliertes Wasser, d) 0,1 M Acetatpuffer,
pH 4,5, e) 0,1 M NaHCO3, pH 8,4, f) 0,5
M NaCl, g) destilliertes Wasser, h) 0,1 M Acetatpuffer, pH 4,5,
i) 5 mM BIS-TRIS, pH 6,4, enthaltend 0,1% Tween 20. Zwischen den
unterschiedlichen Bädern
wurde überflüssige Flüssigkeit
mit Küchenrolle
abgesaugt. Nach der Waschprozedur wurde das Blatt luftgetrocknet
und in einem Plastikbeutel bei 4°C
gelagert.
-
Bevor
das Blatt verwendet wurde, wurde das Blatt auf selbstklebendes Plastik
aufgebracht (75 μm selbstklebender
Polyesterfilm; Gelman Science Inc., Ann Arbor, MI, USA).
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MEMBRANEN MIT DETEKTIONSZONE UND KOMBINATIONSSTREIFEN:
-
Die
Membranen können
analog zu Beispiel 2 produziert werden. Siehe auch 1.
Der Ligand in SZ ist nun Lektin.
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CARBONTEILCHENKONJUGAT (R*) UND 125I-MARKIERTE PROTEINE.
-
-
KONTROLLE DER SEPARATIONSMEMBRAN DURCH 125I-MARKIERTE PROTEINE:
-
Tetrasialo-
und Asialo-Transferrin und Rinderalbumin wurden markiert mit 125I (Chloramin T, Markierungsgrad 0,08 bis
0,13). Die markierten Proteine wurden verdünnt in 10 mM BIS-TRIS pH 6,4, enthaltend 0,1%
Tween 20, 0,04 mM Fe3+-Citrat und 0,05%
NaN3 auf etwa 0,3 μg/ml. Zusätzlich wurde 0,4 mg BSA/ml hinzugefügt.
-
Ein
Streifen (0,5 cm × 4
cm) der Separationsmembran und ein Teil einer Saugmembran aus Cellulose (0,5
cm × 2
cm, GB 004, Schleicher und Schuell, Dassel, Deutschland) wurden
durch Klebeband auf der Unterseite verbunden, so dass ihre Enden
etwas überlappten.
1 μl der
Lösungen
der
125I-markierten Proteine wurden aufgetragen
bei 1 cm von dem freien Ende einer jeweiligen Separationsmembran.
Der laterale Fluss wurde initiiert durch Platzieren eines Celluloseschwamms
(0,6 cm × 0,6
cm × 0,3
cm) auf dem freien Ende der Separationsmembran. Der Schwamm war
getränkt
mit 20 mM TRIS-HCl-Puffer,
pH 7,5, enthaltend 0,5 M NaCl, 1 mM CaCl
2 mit
0,1% Tween 20. Der Fluss wurde unterbrochen durch Entfernen des
Celluloseschwamms nach 2, 4, 6 bzw. 10 Minuten, und die Membranen
wurden 2 und 3 cm von dem freien Ende der Separationsmembran geschnitten.
Die radioaktiven Membranstücke
wurden in einem Gamma-Zähler
gemessen und der Anteil von hinzugefügtem
125I-Protein,
welcher 2 und 3 cm hinter sich gelassen hatte, wurde berechnet.
Die Werte für die
Migration von 1 cm oder mehr, werden in Tabelle 4 gezeigt. TABELLE 4 % des gesamten
125I-Proteins,
das mehr als 1 cm in der Separationsmembran gewandert war:
| | Asialo-Transferrin | Tetrasialo-Transferrin | BSA |
| PI | 5,7 | 5,3 | 4,7 |
| | %
vom Gesamten | %
vom Gesamten | %
vom Gesamten |
| Migrationszeit
Minuten | | | |
| 2
Minuten | 54 | 10 | 86 |
| 4
Minuten | 74 | 10 | 87 |
| 6
Minuten | 78 | 11 | 91 |
| 10
Minuten | 91 | 11 | 92 |
-
SCHLUSSFOLGERUNG:
Es erscheint anhand der Ergebnisse, dass Tetrasialo-Transferrin
durch das Sambucus Nigra-Lektin stark zurückgehalten wird in der Separationsmembran,
während
Asialo-Transferrin und BSA nicht in demselben Ausmaß zurückgehalten
werden. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Separationsmembran mit
Sambucus Nigra-Lektin kombiniert werden kann mit einer Detektionsmembran
in Analogie mit Beispiel 2 und verwendet werden kann, um CD-Transferrin
in Proben, enthaltend Transferrin mit einem größeren Anteil von Sialsäure als
CD-Transferrin zu quantifizieren.