EP1899434A1 - Polymeres fluorescents solubles en solution aqueuse et procede de preparation de polymeres fluorescents solubles en solution aqueuse - Google Patents

Polymeres fluorescents solubles en solution aqueuse et procede de preparation de polymeres fluorescents solubles en solution aqueuse

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Publication number
EP1899434A1
EP1899434A1 EP06778734A EP06778734A EP1899434A1 EP 1899434 A1 EP1899434 A1 EP 1899434A1 EP 06778734 A EP06778734 A EP 06778734A EP 06778734 A EP06778734 A EP 06778734A EP 1899434 A1 EP1899434 A1 EP 1899434A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
polymer
fluorophores
mol
monomer
fluorophore
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP06778734A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Marie-Thérèse CHARREYRE
Bernard Mandrand
José Manuel Gaspar MARTINHO
Paula Relogio
José Paulo SEQUEIRA FARINHA
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux SA
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Instituto Superior Tecnico
Original Assignee
Biomerieux SA
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Instituto Superior Tecnico
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomerieux SA, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Instituto Superior Tecnico filed Critical Biomerieux SA
Publication of EP1899434A1 publication Critical patent/EP1899434A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • C08F8/30—Introducing nitrogen atoms or nitrogen-containing groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F2/00—Processes of polymerisation
    • C08F2/38—Polymerisation using regulators, e.g. chain terminating agents, e.g. telomerisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • C08F8/34—Introducing sulfur atoms or sulfur-containing groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B69/00—Dyes not provided for by a single group of this subclass
    • C09B69/10—Polymeric dyes; Reaction products of dyes with monomers or with macromolecular compounds
    • C09B69/103—Polymeric dyes; Reaction products of dyes with monomers or with macromolecular compounds containing a diaryl- or triarylmethane dye
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B69/00—Dyes not provided for by a single group of this subclass
    • C09B69/10—Polymeric dyes; Reaction products of dyes with monomers or with macromolecular compounds
    • C09B69/109—Polymeric dyes; Reaction products of dyes with monomers or with macromolecular compounds containing other specific dyes

Definitions

  • the present invention relates to the field of fluorescent polymers. More particularly, the present invention relates to novel polymers
  • the invention also relates to the process for preparing soluble fluorescent polymers in aqueous solution.
  • Synthetic polymers have been used for a long time both in the therapeutic field for vectorizing active molecules or genes, and in the field of diagnosis. In the latter case, biological ligands are attached to the polymers by complexation, covalence or specific recognition, and the conjugates thus formed are used in molecular detection tests.
  • Fluorescent polymers can also find applications in different methods of labeling, detection, imaging, including fluorescence microscopy and confocal microscopy. For applications in the
  • polystyrene sulfonate derivative for water solubility
  • fluorescent coumarin styrene derivative and a methacrylate-PEG-COOH derivative for covalent coupling of proteins.
  • the polymers obtained have a broad polymolecularity (Ip).
  • Ip polymolecularity
  • the relative quantum yield of these immobilized fluorophores on the polymer is 0.67 (in relative relation to the coumarin alone), which corresponds to a fluorescence amplification factor of 9 for the 38 000 g / mol polymer. , that is, an amplification factor of the fluorescence based on the molar mass of the polymer of 0.24 per Kg / mol of polymer, and a fluorescence enhancement factor of 40 for the polymer of 150000 g / mol, that is to say at a factor of amplification of the fluorescence based on the molar mass of the polymer of 0.27 per Kg / mol of polymer.
  • the polymer obtained carries 22 lateral fluorophores per chain and a coumarin at one end of the chain.
  • This polymer has a certain number of drawbacks: it is soluble in water only when it is ionized, in the example given at pH 11, which greatly limits its use in biological media which have a pH close to 7 ; the lateral fluorophores are grouped on the hydrophobic block, which is not favorable to good fluorescence of these lateral fluorophores; the 22 fluorophores are all hydrophobic, which leads to a tendency of the polymer to aggregate into a micelle type structure: it is therefore not really soluble in water but dispersible in water; this polymer is not very fluorescent: only the coumarin located at the end of the chain emits fluorescence, the lateral fluorophores serving as a light storage antenna.
  • the amplification of the fluorescence obtained, and in particular, the amplification of the fluorescence relative to the mass of the polymer is low.
  • some of these polymers are labeled with fluorescein and are therefore very sensitive to pH and poorly photostable. In all these prior art techniques, the polymers exhibit a limited fluorescence amplification factor.
  • the polymers are most often obtained by a polymerization process leading to a broad chain size distribution, which requires purification by fractionation, to achieve a narrow size distribution. Polydispersity in size is, for example, a problem for the analysis of intercellular communication and size exclusion phenomena such as the permeability of membranes.
  • the Applicant proposes to provide new polymers, soluble in aqueous solution, which have a high fluorescence.
  • the subject of the present invention is a soluble fluorescent polymer in aqueous solution which carries at least 5 fluorophores distributed over the polymer, said fluorophores having the following properties:
  • the fluorophores are water-soluble, the fluorophores do not form a self-association in water, up to a concentration of 10 -4 mol / l, preferably up to a concentration of 10 3 mol / l,
  • the free fluorophores in aqueous solution have a molar extinction coefficient greater than 1000 M -1 cm -1 , preferably greater than 5000 m -1 cm -1 , the free fluorophores in aqueous solution have a higher quantum yield at 0.3, preferably greater than 0.6,
  • the polymer according to the invention has a fluorescence amplification factor greater than or equal to 0.35 per Kg / mol of polymer, preferably greater than 0.45.
  • the polymers according to the invention have a characteristic below or a combination of the characteristics below, where they do not exclude each other: the fluorophores comprise or are linked via a spacer arm, comprising at least one sequence -CH 2 -CH 2 - located between the fluorescent portion of the fluorophore and the polymer;
  • the polymer is obtained by using a process of controlled radical polymerization or living ionic polymerization;
  • the polymer is obtained by using a controlled radical polymerization process based on reversible addition / fragmentation chain transfer (RAFT);
  • RAFT reversible addition / fragmentation chain transfer
  • the polymer has a polymolecularity index of less than 1.5, preferably less than 1.3;
  • the fluorophores comprise at least one polar or ionizable group in aqueous solution
  • the polymer has less than 2.4 kg / mol, preferably less than 2 kg / mol of polymer per fluorophore; said fluorophores having a relative fluorescence quantum yield of at least 0.7, preferably at least 0.75;
  • the fluorophores are chosen from: N- (5-aminopentyl) -4-amino-3,6-disulfo-1,8-naphthalimide, 3,6-diamino-9- (2-methoxycarbonyl) phenyl, 9 - (2,4-disulfophenyl) -2 5 3,6,7,12,13,16,17-octahydro-lH, 5H, llH, 15h- xanthéno [2,3,4-ij: 5,6,7 1-diquinolizin-18-ium, 9- (2,4-disulfophenyl) -3,6-bis (ethylamino) -2,7-dimethyl-xanthylium, 3,6-bis (diethylamino) - 9- (2,4-disulfophenyl) -xanthylium and their derivatives;
  • the fluorophores are identical and are N- (5-aminopentyl) -4-amino-3,6-disulpho-1,8-naphthalimide;
  • the fluorophores are insensitive to variations in pH
  • the fluorophores are photostable
  • the polymer is in the form of a random copolymer, comprising at least two distinct repeating entities, one carrying the fluorophore and at least one other hydrophilic entity;
  • the polymer comprises, at one of its ends, a compound of interest such as a covalently bound biological ligand; preferably, the compound of interest is either bound to the polymer by a thioether function at its end ⁇ , is bound to the polymer by an amide function at its end ⁇ .
  • the invention proposes to provide processes for the preparation of new fluorescent polymers, soluble in aqueous solution, which have a high fluorescence. The subject of the invention is therefore the processes as defined in the claims
  • the subject of the invention is therefore also a first process for the preparation of soluble fluorescent polymers in aqueous solution and which exhibit a fluorescence amplification factor greater than or equal to 0.35 per Kg / mol of polymer, preferably greater than 0 45 per Kg / mol of polymer comprising the following steps:
  • the fluorophores do not form a self-association in water, up to a concentration of 10 -4 mol / l, preferably up to a concentration of 10 3 mol / l,
  • the free fluorophores in aqueous solution have a molar extinction coefficient greater than 1000 M -1 cm -1 , preferably greater than 5000 Iv T 1 X m -1 ,
  • the free fluorophores in aqueous solution have a quantum yield greater than 0.3, preferably greater than 0.6.
  • the subject of the invention is also a second process for the preparation of soluble fluorescent polymers in aqueous solution and which has a fluorescence amplification factor greater than or equal to 0.35 per Kg / mol of polymer, preferably greater than 0, 45 per Kg / mol of polymer implementing a polymerization step by copolymerization of a functionalized monomer carrying a fluorophore, with a hydrophilic monomer, or with a monomer, which after treatment can lead to a hydrophilic entity, said fluorophores having the following characteristics:
  • the fluorophores are water-soluble, the fluorophores do not form a self-association in water, up to a concentration of 10 -4 mol / l, preferably up to a concentration of 10 mol / l,
  • the free fluorophores in aqueous solution have a molar extinction coefficient greater than 1000 M -1 . cm "1, preferably greater than 5000 M -1 Xm '1,
  • the free fluorophores in aqueous solution have a quantum yield greater than 0.3, preferably greater than 0.6.
  • the functionalized monomer carrying a fluorophore may be obtained by coupling a fluorophore, optionally via a spacer arm, to a functionalized monomer bearing a reactive function X1.
  • the monomer bearing a reactive functional group X1 is chosen from the following functional monomers: N-acryloxysuccinimide, N-methacryloxysuccinimide, 2-hydroxyethyl methacrylate, 2-aminoethyl methacrylate, 2-hydroxyethyl acrylate, 2-aminoethyl acrylate, maleic anhydride and, preferably, N-acryloxysuccinimide, N-methacryloxysuccinimide, maleic anhydride, and more particularly N-acryloxysuccinimide ( ⁇ AS).
  • N-acryloxysuccinimide N-methacryloxysuccinimide
  • maleic anhydride and more particularly N-acryloxysuccinimide ( ⁇ AS).
  • the monomer carrying a reactive function X1 is chosen from derivatives of a sugar, preferably 6-O- (2-vinyloxyethyl) - ⁇ -D-galactopyranose, 6-O-acryloyl- ⁇ - D-galactopyranose, 6-Oacryloylamino-6-deoxy- ⁇ -D-galactopyranose and 6-O- (8-acryloylamino-3,6-dioxaoctyl) - ⁇ -D-galactopyranose.
  • a sugar preferably 6-O- (2-vinyloxyethyl) - ⁇ -D-galactopyranose, 6-O-acryloyl- ⁇ - D-galactopyranose, 6-Oacryloylamino-6-deoxy- ⁇ -D-galactopyranose and 6-O- (8-acryloylamino-3,6-dioxaoctyl) - ⁇ -D-galactopyranose.
  • the fluorophores used in these processes have the additional characteristics as defined above for the polymers.
  • the coupling step is carried out in such a way that the fluorescent part of the fluorophores is removed from the polymer by a spacer arm comprising at least minus one concatenation -CH 2 -CH 2 -; for example, the fluorophores comprise a spacer arm, comprising at least one sequence --CH 2 --CH 2 -, located between the fluorescent portion of the fluorophore and the polymer;
  • the polymerization step is carried out by controlled radical polymerization or living ionic polymerization, preferably by a controlled radical polymerization process based on reversible addition / fragmentation chain transfer (RAFT);
  • RAFT reversible addition / fragmentation chain transfer
  • the number of fluorophores attached to the polymer is adjusted, so as to obtain less than 2.4 kg / mol, preferably less than 2 kg / mol of polymer per fluorophore;
  • the polymerization step is carried out by copolymerization, preferably a statisitic one, between a functionalized monomer, optionally carrying a fluorophore, and a hydrophilic monomer;
  • the hydrophilic monomer is chosen from hydrophilic derivatives of acrylate, methacrylate, acrylamide, methacrylamide, N-vinylpyrrolidone, hydrophilic derivatives of saccharide monomers and, preferably, from: N-vinylpyrrolidone, N N-dimethylacrylamide and N-acryloylmorpholine;
  • the polymerization step is carried out by random copolymerization between a monomer carrying a reactive function X1, optionally in protected form, and a hydrophilic monomer with the exception of unprotected hydrophilic saccharide monomers, or a monomer which, after treatment can lead to a hydrophilic entity; preferably, a monomer bearing a reactive functional group Xl, advantageously chosen from the following functional monomers: N-acryloxysuccinimide, ⁇ -methacryloxysuccinimide, 2-hydroxyethyl methacrylate, 2-aminoethyl methacrylate, acrylate 2-hydroxyethyl, 2-aminoethyl acrylate, maleic anhydride and, preferably, N-acryloxysuccinimide, N-methacryloxysuccinimide, maleic anhydride, etc.
  • N-acryloxysuccinimide after the coupling step, a treatment of the remaining Xl functions on the polymer is advantageously carried out, either by deactivation or by coupling with non-fluorescent water-soluble molecules; the polymerization step is carried out by random copolymerization between a monomer carrying a reactive function X1, optionally in protected form, and a hydrophilic monomer; a hydrophilic monomer chosen from hydrophilic acrylate, methacrylate, acrylamide, methacrylamide and N-vinylpyrrolidone derivatives is preferably used, and preferably from: N-vinylpyrrolidone, N, N-dimethylacrylamide and N-acryloylmorpholine;
  • the polymerization step is carried out by homopolymerization of a monomer carrying a reactive function X1 in protected form, said function being deprotected before coupling of the fluorophores; preferably, the monomer bearing a reactive function X1 in protected form is chosen from derivatives of a sugar, preferably 1,2,2,4-di-O-isopropylidene-6-O- (2- vinyloxyethyl) - ⁇ -D-galactopyranose, 6-O-acryloyl-1,2,2,4-di-O-isopropylidene- ⁇ -D-galactopyranose, 6-O-acryloylamino-6-deoxy-1,2 3,4-di- (3-isopropylidene- ⁇ -D-galactopyranose and 6-O- (8-acryloylamino-3,6-dioxaoctyl) -1,2,3,4-di-O-isopropylidene- ⁇ ; -D-galact
  • the polymerization step is carried out by homopolymerization of a monomer bearing a reactive functional group X1, advantageously chosen from the following functional monomers: N-acryloxysuccinimide, ⁇ -methacryloxysuccinimide, 2-hydroxyethyl methacrylate, methacrylate, 2-aminoethyl, 2-hydroxyethyl acrylate, 2-aminoethyl acrylate, maleic anhydride and, preferably, N-acryloxysuccinimide, N-methacryloxysuccinimide, maleic anhydride and, more particularly, N-acryloxysuccinimide ( ⁇ AS); after the fluorophore coupling step, a treatment of the remaining Xl functions on the polymer is advantageously carried out, either by deactivation or by coupling with non-fluorescent water-soluble molecules;
  • the reactive functional group X1 is chosen from hydroxyl, amine, aldehyde, anhydride and activated carboxylic acid functions in the form of an activated ester, for example N-hydroxysuccinirnide; the activated carboxylic acid function in the form of N-hydroxysuccinimide ester being preferred;
  • a compound of interest such as a biological ligand
  • a compound of interest is coupled in a covalent to an E reactive function, present at the end of the chain of the fluorescent polymer obtained; in the case where the polymer is obtained by RAFT method 5 the compound of interest is coupled, at the end ⁇ of the polymer, to form a thioether function;
  • the biological ligands are chosen in particular from polynucleotides, antigens, antibodies, polypeptides, proteins, haptens, and biotin.
  • the present invention also relates to soluble fluorescent polymers in aqueous solution, obtainable by such methods.
  • the term "molar mass” means the number-average molar mass, Mn, of the polymer chains formed. In the present case, it is obtained after analysis of the samples by size exclusion chromatography, by using a refractometer type detector coupled to a light scattering apparatus, which makes it possible to have access to absolute molar mass values.
  • the light scattering apparatus is a miniDawn (Wyatt Technology) and the absolute molar masses are determined with ASTRA software (Wyatt Technology).
  • the polymolecularity index is the molar mass distribution index well known to those skilled in the art.
  • the polymolecularity index is Ip, with
  • Ip MwZMn, Mn being as defined above and Mw being the mass average molecular weight of the polymer chains. In this case, it has also been determined with ASTRA software.
  • copolymer is to be understood as a polymer formed by at least two different repeating entities and, in particular, block copolymers and random copolymers.
  • random copolymer refers to polymers formed by at least two different repeating entities, in which either the entities are statistically distributed along the macromolecular chain, or the entities successively succeed one another in a general structure (Bn'Cm ') p' in where n ', m' and p 'are identical or different integers.
  • random copolymer therefore encompasses alternating copolymers.
  • monomer is meant a polymerizable entity.
  • functionalized monomer is meant a monomer carrying a reactive function Xl (reactive monomer), optionally in protected form, or a fluorophore (fluorescent monomer).
  • soluble polymer in aqueous solution a polymer which, introduced into an aqueous solution at 25 0 C 5 at a concentration by weight equal to 1%, allows to obtain a solution having a maximum transmittance value of the light at a wavelength at which the polymer does not absorb, through a sample 1 cm thick, at least 70%, preferably at least 80%.
  • water-soluble fluorophore is meant a fluorophore which, introduced at 25 ° C. in an aqueous solution to a concentration of at least 10 -3 mol / L, gives a homogeneous and transparent solution.
  • the polymer or fluorophores can be tested is, for example, pure water or a buffer solution of pH between 5 and 10.
  • the fluorescence quantum yield of a fluorophore is the ratio between the number of photons emitted by this fluorophore and the number of photons absorbed by this fluorophore. It is always less than or equal to 1. The closer it is to 1, the more the fluorophore considered has a high quantum yield.
  • the relative fluorescence quantum yield of a fluorophore immobilized on a polymer is the fluorescence quantum yield of the immobilized fluorophore divided by the fluorescence quantum yield of the free fluorophore in solution.
  • This fluorescence amplification factor is related to the molar mass of the polymer by dividing it by the molar mass of the polymer expressed in Kg / mol.
  • the quantum yield of a free fluorophore in solution or immobilized on a polymer is determined by a method using as standard a dilute solution of rhodamine 101 in ethanol having a quantum yield equal to 0.92 at 25 ° C.
  • the fluorescence spectra of the free fluorophore in solution and of the fluorophore immobilized on the polymer are obtained under the same experimental conditions (excitation wavelength, bandwidth of the excitation and emission monochromators, optical geometry) using SPEX Fluorolog F112A spectrofluorometer.
  • the number of fluorophores immobilized on a polymer chain is determined by dividing the molar extinction coefficient of the fluorescent polymer by the molar extinction coefficient of the free fluorophore in solution.
  • the molar extinction coefficient ⁇ of a free fluorophore in solution is determined from the slope of the curve representing the absorbance (optical density or OD) of the fluorophore (or the polymer respectively) depending on the concentration (C) of the fluorophore (or polymer) according to the well-known law of Beer-Lambert:
  • the absorbance is determined at the maximum absorbance wavelength with a JASCO V-650 UV / Vis spectrophotometer.
  • the phenomenon of self-association of a free fluorophore in aqueous solution is determined from the UV absorption spectra of solutions of increasing concentration.
  • concentration at which the self-association phenomenon occurs is determined to be the concentration where the Beer-Lambert curve deviates from linearity, and this for an absorbance value of less than 1.0 using path cells appropriate optics (from 0.1 cm to 1 cm depending on the fluorophore concentration).
  • the molar extinction coefficient and the fluorescence quantum yield are measured in an aqueous solution, under conditions, in particular pH and ionic strength, where these parameters take maximum values. Most often, the aqueous solution used is a solution pH buffer between 5 and 10.
  • compound of interest is meant any type of molecular or macromolecular compound, or solid support, which it is advantageous to couple to the end of a polymer, for this or that application, in particular for an application in biology, therapeutic or diagnostic.
  • compounds of interest mention may be made of biological ligands, mono- or disaccharides, lipids, fluorescent molecules, dyes, polymer chains and solid supports.
  • the only necessary condition for the compound of interest is that it carries a reactive function capable of reacting with a function E present at one of the ends of the polymer or, in the case of the RAFT process, at one of the ends. reversible chain transfer agent or at one end of the polymer.
  • this function E is a thiol or activated ester function, as detailed later in the description.
  • the reactive function is respectively chosen as an example from the functions maleimide and iodoacetamide and among the functions amine, hydrazine, hydrazide, azide, alkoxyamine, hydroxy, thiol.
  • the compound of interest can be bonded to the polymer according to the invention by means of a spacer arm which then carries the reactive function.
  • biological ligand is meant a compound which has at least one recognition site allowing it to react with a target molecule of biological interest.
  • biological ligands of polynucleotides, antigens, antibodies, polypeptides, proteins, haptens, labiotin, etc.
  • polynucleotide means a sequence of at least 2 deoxyribonucleotides or ribonucleotides optionally comprising at least one modified nucleotide, for example at least one nucleotide comprising a modified base such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino- 5-deoxyuridine, deoxyuridine, diamino-2,6-purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base for hybridization.
  • a modified base such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino- 5-deoxyuridine, deoxyuridine, diamino-2,6-purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base for hybridization.
  • This polynucleotide may also be modified at the level of the internucleotide linkage, for example phosphorothioates, H-phosphonates or alkylphosphonates, at the level of the backbone such as, for example, alpha-oligonucleotides (FR 2 607 507), or NAPs ( Egholm M. et al., J. Am. Chem., Soc., 1992, 114, 1895-1897), or 2-O-alkyl ribose, or LNA (Loked Nucleic Acids), described in particular in US Pat. published patent application WO 00/66604). Each of these changes can be taken in combination.
  • the polynucleotide may be an oligonucleotide, a natural nucleic acid or its fragment such as a DNA, a ribosomal RNA, a messenger RNA, a transfer RNA, a nucleic acid obtained by an enzymatic amplification technique.
  • polypeptide is meant a sequence of at least two amino acids.
  • amino acids we mean the primary amino acids that code for proteins, the amino acids derived after enzymatic action such as trans-4-hydroxyproline and natural amino acids but not present in proteins such as norvaline, N-methyl- L-Leucine, Stalin (Hunt S. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Barett GC, Ed., Chapman and Hall, London, 1985), amino acids protected by chemical functions for use in solid support synthesis or liquid phase and unnatural amino acids.
  • hapten refers to non-immunogenic compounds, i.e. incapable by themselves of promoting an immune reaction by production of antibodies, but capable of being recognized by antibodies obtained by immunization of animals in animals. known conditions, in particular by immunization with a hapten-protein conjugate. These compounds generally have a molecular mass of less than 3000 Da, and most often less than 2000 Da and can be for example glycosylated peptides, metabolites, vitamins, hormones, prostaglandins, toxins or various drugs, nucleosides and nucleotides.
  • antibodies includes polyclonal or monoclonal antibodies, antibodies obtained by genetic recombination and antibody fragments.
  • antigen refers to a compound capable of being recognized by an antibody for which it has induced synthesis by an immune response.
  • protein includes holoproteins and heteroproteins such as nucleoproteins, lipoproteins, phosphoproteins, metalloproteins and both fibrous and globular glycoproteins.
  • monosaccharide there may be mentioned, for example, glucose, galactose, mannose, fructose, and as “disaccharide”, for example, sucrose, cellobiose, lactose, maltose.
  • lipid there may be mentioned, for example, dipalmitoylphosphatidylcholine.
  • die mention may be made of methylene blue, bromocresol green, methyl red, safranine O.
  • fluorescent molecules there may be mentioned for example fluorescein, rhodamine, pyrene, phenanthrene, anthracene, coumarin.
  • polymer chain is meant a natural or synthetic polymer having been modified to bring at least one reactive function vis-à-vis the activated ester function.
  • a natural polymer mention may be made, for example, of polysaccharides such as cellulose, dextran, chitosan and alginates.
  • Synthetic polymers that may be mentioned include, for example, polyethylene oxide, polypropylene oxide, polyvinyl chloride, polyethylenes, polypropylenes, polystyrenes, polyacrylates, polyacrylamides, polyamides, polymethacrylates, polymethacrylamides, polyesters, or copolymers with vinyl aromatic monomers, alpha-beta unsaturated acid alkyl esters, unsaturated carboxylic acid esters, vinylidene chloride, dienes or compounds having nitrile functions (acrylonitrile), copolymers of vinyl chloride and propylene, vinyl chloride and vinyl acetate, copolymers based on styrenes or substituted derivatives of styrene
  • solid support includes all materials for use in diagnostic tests or in therapeutics, affinity chromatography and separation processes. Natural materials, synthetic, modified or not chemically, can be used as a solid support, including polymers such as polyvinyl chloride, polyethylene, polystyrenes, polyacrylates, polyamides, polymethacrylates, polyesters, or copolymers based on vinyl aromatic monomers, alkyl esters unsaturated alpha-beta acids, unsaturated carboxylic acid esters, vinylidene chloride, dienes or compounds having nitrile functions (acrylonitrile); copolymers of vinyl chloride and propylene, vinyl chloride and vinyl acetate; copolymers based on styrenes or substituted styrene derivatives; synthetic fibers such as nylon; inorganic materials such as silica, glass, ceramic, quartz; latexes; magnetic particles; metal derivatives.
  • polymers such as polyvinyl chloride, polyethylene, polystyrenes, polyacrylates, poly
  • the solid support according to the invention may be, without limitation, in the form of a microtiter plate, a sheet, a cone, a tube, a well, beads, particles or the like, of a plane support like a silica wafer or silicon.
  • the material is either hydrophilic or intrinsically hydrophobic or as a result of a chemical modification such as a hydrophilic support made hydrophobic.
  • Solid supports capable of reacting by covalent bond formation with a thiol function carried by the polymer advantageously have maleimide functions on the surface.
  • maleimide functions for example, it is possible to chemically introduce maleimide functions, at the surface of a silica wafer by silanization, using an aminoalkylsilane and then a heterobifunctional spacer arm carrying an N-hydroxysuccinimide function at one end (which reacts on the amine function ) and a maleimide function at its other end.
  • Solid supports capable of reacting by covalent bond formation with an activated ester function for example, carried the polymer obtained by implementing the RAFT process, advantageously have amine functions on the surface.
  • amine functions for example, it is possible to chemically introduce amine functions at the surface of a silica wafer by silanization using an aminoalkylsilane such as aminopropyldimethylchlorosilane, aminopropylmethyldichlorosilane or aminopropyltrichlorosilane.
  • an aminoalkylsilane such as aminopropyldimethylchlorosilane, aminopropylmethyldichlorosilane or aminopropyltrichlorosilane.
  • functionalisation by amine functions can be obtained by copolymerization of styrene with aminomethylstyrene or with aminoethyl methacrylate.
  • alkyl is meant, when not more precise, a saturated hydrocarbon group, linear or branched having from 1 to 18, preferably from 1 to 6, carbon atoms.
  • alkyl group there may be mentioned methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, tert-butyl, n-pentyl, n-hexyl and the like.
  • Alkoxy means an O-alkyl group, alkyl being as defined above.
  • halogen is meant a chlorine, bromine, iodine or fluorine atom.
  • alkenyl and alkynyl correspond to a hydrocarbon group of 2 to 18, and preferably 2 to 6 carbon atoms, comprising respectively at least one double or one triple bond.
  • alkenyl or alkynyl are, for example, vinyl, allyl, isopropenyl, 1-, 2- or 3-butenyl, pentenyl, hexenyl, ethynyl, 2-propynyl, butynyl.
  • cycloalkyl denotes an alkyl, alkenyl or alkynyl group, monocyclic or polycyclic, for example bicyclic, comprising from 3 to 10 carbon atoms, for example cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, bridged cycloalkyl groups such as adamantyl, bicyclo [3.2.1] octyl.
  • heterocycloalkyl means cycloalkyl as defined above, comprising one or more heteroatoms selected from nitrogen, oxygen and sulfur.
  • Aryl groups denote mono-, bi- or polycyclic carbocycles comprising at least one aromatic group.
  • heteroaryl refers to an aryl group as defined above comprising at least one atom selected from nitrogen, oxygen or sulfur.
  • Aryl or heteroaryl include phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, indanyl, indenyl, biphenyl, benzocycloalkyl, i.e. 5-triene, benzodioxolyl, such as pyrrolyl, furanyl, thienyl, imidazolyl, pyrazolyl, thiazolyl, oxazolyl, isoxazolyl, pyridyl, pirazinyl, pyrimidyl, tetrazolyl, thiadiazolyl, oxadiazolyl, triazolyl, pyridazinyl, indolyl, pyrimidyl.
  • cycloalkylalkyl group means that the group consists of an alkyl group itself substituted with a cycloalkyl group.
  • alkylcycloalkyl group means that the group consists of a cycloalkyl group itself substituted by an alkyl group.
  • substituted group is meant a group bearing one or more substituents.
  • substituents is meant a group chosen from: halogens, cyano, alkyl, trifluoroalkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, heterocycloalkyl, amino, alkylamino, dialkylamino, hydroxy, alkoxy, aryloxy, an optionally substituted phenyl group, an aromatic group.
  • alkoxycarbonyl or aryloxycarbonyl (-COOR 0 ), carboxy (-COOH), acyloxy (-O 2 CR 0 ), carbamoyl (-CONR ° 2 ), isocyanatoalkylcarbonyl, alkylarylcarbonyl, arylcarbonyl, arylalkylcarbonyl, phthalimido, maleimido , succinimido, amidino, guanidino, allyl, epoxy-SR °, groups having a hydrophilic or ionic character such as the alkaline salts of carboxylic acids, alkaline salts of sulphonic acid, polyalkylene oxide chains (PEO, PPO) 5 cationic substituents (quaternary ammonium salts) where R 0 represents an alkyl or aryl group.
  • PEO polyalkylene oxide chains
  • the invention relates to soluble polymers in aqueous solution and having a high fluorescence.
  • the polymers according to the invention have a fluorescence enhancement factor relative to the polymer weight greater than or equal to 0.35 per Kg / mol of polymer, preferably greater than 0.45 per Kg / mol of polymer. Therefore, even for relatively small polymers, it is possible within the scope of the invention to obtain a rather high fluorescence amplification factor.
  • the polymers according to the invention have a large number of fluorophores, namely at least 5, preferably at least 10 fluorophores, distributed over the polymer chain. The distribution of fluorophores along the chain is achieved through statistical functionalization of the polymer and / or random copolymerization as explained below. Given this distribution, the fluorescence quenching of the fluorophores is low.
  • the fluorophores used in the context of the invention have a certain number of characteristics making it possible to obtain the desired properties.
  • the fluorophores used are water-soluble and exhibit, when they are free in aqueous solution, a molar extinction coefficient greater than 1000 M -1 cm -1 , preferably greater than 5000 m 4 ⁇ 1 m -1 , and a higher quantum yield. at 0.3, preferably greater than 0.6,
  • the fluorophores selected form few self-associations in aqueous solution, so as to further reduce the quenching of fluorescence.Freferentially, the selected fluorophores will not form self-associated in water to a concentration of 10 "4 mol / 1, preferably to a concentration of 10" 3 mol / 1.
  • the aqueous phase solubility of the polymer according to the invention results, on the one hand, from the hydrosoluble nature of the fluorophores and, on the other hand, from the presence in the polymer chain of hydrophilic monomeric entities.
  • the solubility of the polymer may of course be related to the pH or the ionic strength of the aqueous solution in which it is dissolved.
  • the polymers according to the invention will be soluble in an aqueous solution having a pH of between 5 and 10.
  • the fluorophores used carry polar or ionizable groups, which make them water-soluble. Ionizable fluorophores in aqueous solution will preferably be used.
  • Nonionic polymers the solubility of which does not depend on pH, are a preferred variant for certain applications.
  • the fluorescent portion of the fluorophores is removed from the polymer by a spacer arm having at least one sequence -CH 2 -CH 2 -. That is, the fluorescence emitting entity is separated from the polymer chain by at least two successive atoms.
  • the polymer has less than 2.4 Kg / mol, preferably less than 2 Kg / mol of polymer per fluorophore.
  • the subject of the invention is a polymer soluble in the aqueous phase, carrying at least 5 fluorophores, as previously defined, said fluorophores having a significant relative fluorescence quantum yield, that is to say say greater than or equal to 0.7, preferably at least 0.75.
  • the fluorophores used will be insensitive to variations in pH, and / or thermostable and / or photostable. Nevertheless, it is possible to envisage using environmentally sensitive fluorophores such as pH or temperature, or capable of transferring fluorescence energy.
  • fluorophores used are all identical.
  • fluorophores that may be used in the context of the invention, mention may be made of the following fluorophores:
  • N- (5-aminopentyl) -4-amino-3,6-disulpho-1,8-naphthalimide including the dipotassium salt of formula:
  • Rhodamine 123 is marketed under the name Rhodamine 123;
  • N- (5-aminopentyl) -4-amino-3,6-disulfo-1,8-naphthalimide is a particularly preferred fluorophore.
  • This fluorophore is particularly advantageous because, in addition to being water-soluble, non-sensitive to pH, it does not form a self-association up to a concentration of 10 -3 mol / L in aqueous solution, to exhibit a function -NH Since it has a covalent bond with the polymer, it has on the one hand a spacer arm - (CH 2 ) 5 - which makes it possible to move the fluorescent part away from the polymer backbone and on the other hand to obtain an emission wavelength. It will be close to the emission wavelength of fluorescein, which implies that the filters usually used for fluorescein will be directly usable.
  • the fluorophores are all identical and are N- (5-aminopentyl) -4-amino-3,6-disulfo-1,8-naphthalimide.
  • the polymer can then be used, for example, to establish an identification code of the polymer chain.
  • the covalent immobilization of 2 or 3 different fluorophores as defined above, on the same polymer chain and in defined proportions may be used to establish an identification code of the polymer chain insofar as the fluorophores chosen have a maximum emission wavelength sufficiently distinct.
  • n 1 to 5
  • the polymers according to the invention are obtained using a controlled radical polymerization technique (K. Matyjazewski, Controlled
  • polymerization techniques make it possible to control the architecture of the polymers obtained and thus to synthesize polymers with well defined macromolecular characteristics (molecular weight, polymolecularity index and chain architecture).
  • these techniques make it possible to control the molar mass of the polymers obtained, a molar mass that is quite predictable, and to obtain polymers that are very homogeneous in size and, in particular, that have a polymolecularity index of less than 1.5. and preferably less than 1.3.
  • the number of fluorophores per chain is also very homogeneous.
  • these various controlled polymerization techniques make it possible to obtain at the ends of the polymer at least one reactive function, which will serve as an attachment entity for a compound of interest, and in particular a biological ligand.
  • the polymers according to the invention are biological tools, particularly interesting.
  • controlled radical polymerization techniques are preferred.
  • Radical polymerization has three stages: initiation (creation of free radicals and reaction with the first monomer unit), propagation (successive additions of monomer units on the growing ((macro) radical chain) and termination ( stopping the chain) by coupling or disproportionation between two growing chains or by transfer of a proton on a growing chain.
  • the termination and transfer reactions affecting the (macro) radicals are responsible for the loss of control of the polymerization (polymer chains of unpredictable mass, high polymolecularity). To obtain a polymerization controlled radical, it is therefore necessary to strongly reduce these termination and irreversible transfer reactions.
  • the general principle consists in reversibly deactivating the active centers by forming dormant (non-reactive) species, in order to have a very low concentration of (macro) radicals in the medium throughout the polymerization (K. Matyjazewski, Controlled Radical Polymerization, American Chemical Society Symposium Series, 768, Washington DC, USA, 2000).
  • RAFT Reversible Addition Fragmentation Chain Transfer
  • the patent application WO99 / 31144 describes the RAFT polymerization process in which the transfer agent is chosen from xanthates and dithiocarbamates. Since then, other organosulfur transfer agents have been described: either xanthates, as described in particular in patent applications WO00 / 75207, WO01 / 42312 and FR 2 809 829, or dithiocarbamates, as described in particular in patent applications.
  • WO99 / 35177, FR 2 809 829, or trithiocarbonates as described in particular in patent applications WO98 / 58974, WO01 / 60792, WO02 / 070571, WO 03/066685, or thioetherthiones, as described in particular in the patent application FR 2 794 464, or dithiocarbazates, as described in particular in US Pat. No. 6,380,335 and US Pat. No. 6,395,850, or dithiophosphoroesters as described in particular in patent application FR 2 812 293, or tetrathiophosphates as described in US Pat. in particular in the patent application FR 2 816 311.
  • the RAFT technique will preferably be used, since it is particularly applicable to any family of monomers, unlike the SFRP method, which is not applicable to the family of methacrylates, and the ATRP hardly applicable to acrylamide derivatives.
  • the RAFT technique does not involve metals, unlike the ATRP process for which metal residues, even in very small quantities, may be a contraindication for biomedical applications.
  • the RAFT technique makes it possible to introduce a compound of interest, in particular, via a binding entity, either at the beginning (end ⁇ ) or at the end of the chain (end ⁇ ) of the polymer, unlike the ATRP process which does not allow an easy introduction at the beginning of the chain via the polymerization initiator molecule.
  • the RAFT polymerization process with a reversible chain transfer agent is carried out, according to standard techniques well known to those skilled in the art, from identical or different monomers, in the presence of a source of initiator radicals.
  • Controlled radical polymerization reactions are generally carried out from one or more ethylenically unsaturated monomers. It will be possible to refer for the polymerization conditions to the documents of the prior art previously mentioned and to WO 2004/055060 in particular.
  • the polymerization leads to polymers of the homopolymer type. In the opposite case, it leads to polymers of the copolymer type, so as to obtain, in the end, in the context of the invention, either random copolymers, for example alternating, or block copolymers, at least one of the blocks. being a random copolymer.
  • random copolymers for example alternating, or block copolymers, at least one of the blocks. being a random copolymer.
  • biocompatible polymers that is to say that do not disturb the biological properties of the biological ligand attached to the polymer, in terms of molecular recognition.
  • the polymerization can be carried out in different ways.
  • the first route consists of using a functionalized monomer B1 bearing a reactive function X1, optionally in protected form. This is followed by either a homopolymerization reaction of this monomer B1 or a reaction of copolymerization of Bl with a hydrophilic monomer B2 with the exception of unprotected hydrophilic saccharide monomers, or with a monomer B2 'which, after treatment, can lead to a hydrophilic entity.
  • hydrophilic monomer is meant a monomer whose polymer has an expanded structure in the aqueous phase, corresponding to a Mark-Houwink Sakurada coefficient greater than or equal to 0.5.
  • the hydrophilic monomer is, for example, chosen from hydrophilic derivatives of acrylate, methacrylate, acrylamide, methacrylamide and N-vinylpyrrolidone, unprotected saccharide monomers and their derivatives.
  • N-vinylpyrrolidone ( ⁇ VP), N, N-dimethylacrylamide and N-acryloylmorpholine ( ⁇ AM) are preferred in the context of the invention.
  • hydrophobic monomer is meant a non-hydrophilic monomer.
  • hydrophobic monomer mention may be made of hydrophobic derivatives of methacrylate, acrylate, acrylamide, methacrylamide and styrene, advantageously n-butyl acrylate, t-butyl acrylate and t-butylacrylamide. styrene.
  • a monomer in protected form can be chosen, such as protected saccharide monomers, for example 1,2,2,4-di- ⁇ -isopropylidene.
  • a hydrophobic monomer carrying a reactive function can also, after deactivation of the reactive functional group or after coupling of the latter with a water-soluble molecule, lead to a hydrophilic entity.
  • examples of such monomers include N-acryloxysuccinimide, ⁇ -methacryloxysuccinimide, maleic anhydride and more particularly, N-acryloxysuccinimide ( ⁇ AS).
  • the monomer B1, which carries a reactive function X1, optionally in protected form, can be a hydrophilic or hydrophobic monomer. Of course, this monomer must be polymerizable with the selected polymerization technique.
  • the reactive function X1 must be capable of reacting with a reactive function X2 carried by the fluorophore or the spacer arm that is to be grafted.
  • the reactive function X1 is chosen, for example, from amine, hydrazine, hydrazone, azide, isocyanate, isothiocyanate, alkoxyamine, aldehyde (optionally a masked aldehyde, as in the case of saccharide monomers), epoxy, nitrile, maleimide, haloalkyl, hydroxy, thiol, anhydride, carboxylic acid activated in the form of N-hydroxysuccinimide ester, pentachlorophenyl, trichlorophenyl, p-nitrophenyl, carboxyphenyl.
  • the reactive function X1 is chosen from amino, aldehyde, anhydride or activated carboxylic acid functions in the form of N-hydroxysuccinimide ester.
  • the Xl function will advantageously be of the activated ester, aldehyde or anhydride type.
  • hydrophilic monomer B1 having a reactive function X1 there may be mentioned 2-hydroxyethyl methacrylate, 2-aminoethyl methacrylate, 2-hydroxyethyl acrylate, 2-aminoethyl acrylate and saccharide monomers, such as 6-0- (2-vinyloxyethyl) - ⁇ -D-galactopyranose polymerizable by living cationic polymerization, 6-Oacryloyl- ⁇ -D-galactopyranose, 6-O-acryloylamino-6-deoxy- ⁇ -D-galactopyranose, the 6-O (8-acryloylamino-3,6-dioxaoctyl) - ⁇ -D-galactopyranose, these three monomers being polymerizable by controlled radical polymerization, in particular by the RAFT method.
  • 2-hydroxyethyl methacrylate 2-aminoethyl methacrylate
  • 2-hydroxyethyl acrylate
  • hydrophobic monomer B1 carrying a reactive functional group X1 there may be mentioned N-acryloxysuccinimide, ⁇ -methacryloxysuccinimide, maleic anhydride and, preferably, N-acryloxysuccinimide ( ⁇ AS).
  • the monomer B1 carries a function reactive XI in protected form. This is, for example, the case of protected saccharide monomers as defined above.
  • the monomers B1, B2, B2 ' are chosen according to the selected polymerization technique.
  • a coupling reaction of the fluorophore on the reactive functions X1 is carried out, so as to immobilize the number of desired fluorophores on the polymer.
  • the coupling reaction will be preceded by an appropriate deprotection reaction.
  • the coupling of the fluorophores is carried out in such a way that the fluorescent portion of the fluorophores is removed from the polymer by a spacer arm comprising at least one -CH 2 -CH 2 - chain.
  • either the fluorophore comprises a spacer arm and carries an X2 function and is therefore directly coupled with the reactive function X1, ie the fluorophore used does not have a spacer arm or is not a carrier.
  • X2 reactive function in this case, the fluorophore will be modified to include the spacer arm, if necessary, and the reactive function X2. It may also be provided to perform the coupling in two steps, a first consisting of coupling a spacer arm on the reactive function X1, the second of coupling the fluorophore on the spacer arm.
  • the reactive function X 2 situated at the end of the fluorophore or of the spacer arm, capable of reacting with the function X1, is preferably a primary or secondary amine function.
  • a particularly stable amide function is obtained, so that the fluorescent polymers obtained will be chemically stable.
  • the monomer B2 ' is preferably carrying a reactive function Xl' in protected form to avoid, after polymerization, competitive coupling reactions of the fluorophore on the monomers B1 and B2 '.
  • the distribution of the fluorophores along the polymer chain is obtained on the one hand, by the fact that the coupling is done statistically on the reactive functions Xl present on the polymer and secondly, in the case where a copolymerization is carried out, by obtaining a random copolymer.
  • a masking reaction of the residual reactive functions is then carried out, either by deactivation (for example a hydrolysis) or by coupling with a non-fluorescent water-soluble compound, which makes it possible to on the one hand, to eliminate residual reactive functions along the polymer chain and, on the other hand, to provide additional hydrophilicity to the polymer.
  • the reactive functional group is an anhydride or an activated carboxylic acid in the form of N-hydroxysuccinimide ester
  • an excess of a water-soluble amine such as aminoethylmorpholine, may be used.
  • the polymerization will preferably be carried out between a monomer carrying a reactive function X1, optionally in protected form, and a hydrophilic monomer.
  • a hydrophobic monomer B having a reactive function such as N-acryloxysuccinimide, ⁇ -methacryloxysuccinimide, maleic anhydride and preferably N-acryloxysuccinimide ( ⁇ AS)
  • ⁇ AS N-acryloxysuccinimide
  • hydrophilic monomer such as the hydrophilic derivatives of acrylate, methacrylate, acrylamide, methacrylamide and ⁇ -vinylpyrrolidone, and preferably N-vinylpyrrolidone ( ⁇ VP), N, N-dimethylacrylamide and the
  • N-acryloylmorpholine ( ⁇ AM). which does not require any deprotection reaction of the reactive functional groups Xl and makes it possible to obtain a polymer having a satisfactory hydrophilicity, after treatment of any remaining reactive functions X1 after coupling of the fluorophores.
  • Another preferred variant consists in carrying out a homopolymerization reaction of a protected sugar, for example 1,2,2,4-di-O-isopropylidene-6-O- (2-vinyloxyethyl) - ⁇ -D-galactopyranose.
  • a protected sugar for example 1,2,2,4-di-O-isopropylidene-6-O- (2-vinyloxyethyl) - ⁇ -D-galactopyranose.
  • a second route which can also be envisaged, although it is not preferred, is to carry out the coupling of the fluorophore (or of the spacer arm) with the monomer B1 bearing the function X1 and to carry out the polymerization with this new monomer.
  • This route therefore consists in using a monomer B3 already carrying a fluorophore.
  • a copolymerization reaction of this monomer B3 is then carried out with another hydrophilic monomer B4, or a monomer B4 'which, after treatment, can lead to a hydrophilic entity.
  • the monomer B3 is either commercially available or obtained from a monomer B1 described above, by coupling, as previously described, of a function X2 carried by the fluorophore or the spacer arm, on the reactive function X1 of the monomer.
  • the monomer B1 carries a protected reactive function, it will of course be deprotected beforehand.
  • the monomers B4 and B4 ' correspond, respectively, to the hydrophilic monomers (B2), and to the monomers which, after treatment, can lead to a hydrophilic entity (B2'), mentioned above.
  • a hydrophilic monomer B4 will preferably be used.
  • the polymer has at its end ⁇ , the function -SC (S) -Z " terminal and at its end ⁇ the group R ".
  • transfer agents already carrying a compound of interest such as RAFT reversible chain transfer agents (II), belonging to the family of dithioesters, xanthates or trithiocarbonates, which comprise a group of formula:
  • R ' comprises at least one -amide-L function, with L selected from biological ligands, mono- or disaccharides, lipids, dyes, fluorescent molecules, polymer chains and solid supports.
  • L selected from biological ligands, mono- or disaccharides, lipids, dyes, fluorescent molecules, polymer chains and solid supports.
  • the -amide-L function corresponds to a function:
  • X which represents a hydrogen atom, an optionally substituted group chosen from the following: alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aralkyl, alkylaryl, or a covalent bond, so as to forming an amine ring with the compound L, and L which is as defined above.
  • the group -R 'of the transfer agents (II) is chosen from the following groups: alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aralkyl, alkylaryl, heteroaralkyl, alkylheteroaryl, cycloalkylalkyl, heterocycloalkylalkyl, alkylcycloalkyl , alkylheterocycloalkyl, or a polymer chain, and said group being, on the one hand, carrying at least one function:
  • organosulfur reversible chain transfer agents described in the prior art have the following pattern: Z C-S -...
  • the group Z of the transfer agents (II) is advantageously chosen so that the transfer agent belongs to the family of dithioesters (Z containing an H, C atom,
  • Z represents a hydrogen atom, a chlorine atom, -COOH, -CN, or a group chosen from the following optionally substituted groups: alkyl, cycloalkyl, aryl, heterocycloalkyl, heteroaryl, -ORa, -SRa, -COORa , -O 2 CRa, -CONRaRb, -CONHRa, -P (O) ORaRb, -P (O) RaRb, -O-CRcRd-P (O) (ORa) (ORb), -S-CReRf-COOH, - 0-CReRf-COOH or a polymer chain,
  • Z ' is a derivative of an optionally substituted alkyl, an optionally substituted aryl or a polymeric chain, its bond with the carbonylthio groups, occurring via an aliphatic carbon, an aromatic carbon or a sulfur atom, or oxygen,
  • R ' is selected from the following groups: alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aralkyl, alkylaryl, heteroaralkyl, alkylheteroaryl, cycloalkylalkyl, heterocycloalkylalkyl, alkylcycloalkyl, alkylheterocycloalkyl, or a polymer chain, and said group being on the one hand, carrying at least one function:
  • X represents a hydrogen atom, an optionally substituted group chosen from the following: alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aralkyl, alkylaryl, or a covalent bond, so as to form an amine ring with the compound L,
  • p is an integer greater than 1
  • Ra and Rb represent, each independently of one another, an optionally substituted group chosen from the following: alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aralkyl, alkylaryl,
  • Rc and Rd represent, each independently of one another, a hydrogen or halogen atom, a group -NO 2 , -SO 3 H, -SO 3 Rg, -NCO, -CN, -Rg , -OH, -ORg, -SH, -SRg, -NH 2 , -NHRg, -NRgRh, -COOH, -COORg, -O 2 CRg, -CONH 2 , -CONHRg, -CONRgRh, -NHCORg, -NRgCORh, C m F 2m + 1 with m between 1 and 20, preferably equal to 1,
  • Rf represent, each independently of one another, an optionally substituted alkyl or aryl group
  • Rg and Rh represent, each independently of one another, an optionally substituted group chosen from the following: alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aralkyl, alkylaryl,
  • R ' represents a group
  • - A represents an optionally substituted group chosen from the following: alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aralkyl, alkylaryl, heteroaralkyl, alkylheteroaryl, cycloalkylalkyl, heterocycloalkylalkyl, alkylcycloalkyl, alkylheterocycloalkyl, or a polymer chain,
  • L and X are as defined above, and
  • n is an integer greater than or equal to 1, preferably equal to 1.
  • the group A of the group R ' is a branched aliphatic chain, optionally substituted, having a carbon atom secondary or tertiary, alpha of the sulfur atom.
  • Z represents a group chosen from: alkyl, cycloalkyl, aryl, -ORa, and -SRa, said groups being optionally substituted and Ra being as defined above for (IIa), (IIb) and (IIc).
  • transfer agents (II), (IIa), (IIb) and (IIc) are obtained by coupling of corresponding transfer agents (I) carrying at least one activated ester function with an amine compound of interest.
  • activated ester is well known to those skilled in the art.
  • An activated ester function can be defined as an ester whose "alcohol" part is a good leaving group with respect to nucleophilic substitution reactions, that is to say a leaving group which makes it possible to carry out a reaction of nucleophilic substitution between 0 and 100 ° C, preferably between 0 and 60 ° C, more preferably between 0 and 40 ° C.
  • Such activated esters have, for example, been described by W. Anderson et al, in American Society, 1964, 46, 1839-1842 and by R. Arshady in Advances in Polymer Science, 1994, 111, 1-41.
  • the functionalization can therefore be carried out by reacting a compound of interest comprising a nucleophilic function, and in particular a primary or secondary amine function, or an ammonium function which will make it possible to generate a reactive amine function in situ on the ester function. activated.
  • This coupling reaction is easy, fast, quantitative and in a single step, which makes it possible to obtain a bond with the compound of interest, with a very high yield (close to 100%).
  • the activated amine / ester function coupling leads to an amide bond, which in turn makes a very stable compound with respect to, for example, a more fragile and hydrolysable ester type function obtained in the prior art (Stenzel et al., in J. Mater Chem 2003, 13, 2090 and Chen et al., in Chem. Comm., 2002, 2276-2277).
  • Such transfer agents (I) belong to the family of dithioesters, xanthates, or trithiocarbonates and comprise a group of formula:
  • R is a group which comprises an activated ester function.
  • this group R comprises at least one activated ester function -C (O) OY, -OY being a leaving group, Y being, for example, chosen from the following groups: N-succinimidyl, 1-benzotriazole, pentachlophenyl, 2 , 4,5-trichlorophenyl, 4-nitrophenyl, 3-pyridyl, 2-methoxycarbonylphenyl, N-phthalimidyl, and 2-carboxyphenyl.
  • Y is the N-succinimidyl group:
  • any type of group R described in the prior art can be used; it will be chosen according to the group R 'that one wishes to obtain.
  • chain transfer agents (I) comprise a group R which is chosen from the following groups: alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aralkyl, alkylaryl, heteroaralkyl, alkylheteroaryl, cycloalkylalkyl, heterocycloalkylalkyl, alkylcycloalkyl, alkylheterocycloalkyl, or a polymer chain, and said group carrying at least one activated ester function as defined above and being optionally substituted by one or more other substituents.
  • R is -A - (- C (O) -OY) n wherein: - A represents a group optionally substituted selected from alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aralkyl, alkylaryl, heteroaralkyl, alkylheteroaryl, cycloalkylalkyl, heterocycloalkylalkyl, alkylcycloalkyl, alkylheterocycloalkyl, or a polymer chain, - Y is as defined above and,
  • n is an integer greater than or equal to 1, preferably equal to 1.
  • transfer agents of formula (Ia), (Ib) or (Ic) will be used.
  • Z represents a hydrogen atom, a chlorine atom, -COOH, -CN, or a group chosen from the following optionally substituted groups: alkyl, cycloalkyl, aryl, heterocycloalkyl, heteroaryl, -ORa, -SRa, -COORa , -O 2 CRa, -CONRaRb, -CONHRa, -P (O) ORaRb, -P (O) RaRb, -O-CRcRd-P (O) (ORa) (ORb), -O-CReRf-COOH, - S-CReRf-COOH or a polymer chain,
  • Z ' is a derivative of an optionally substituted alkyl, an optionally substituted aryl or a polymeric chain, its bond with the carbonylthio groups, occurring via an aliphatic carbon, an aromatic carbon or a sulfur atom, or oxygen
  • R is selected from the following groups: alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aralkyl, alkylaryl, heteroaralkyl, alkylheteroaryl, cycloalkylalkyl, heterocycloalkylalkyl, alkylcycloalkyl, alkylheterocycloalkyl, or a polymer chain, and said group bearing at least one activated ester function as defined above and being optionally substituted by one or more other substituents,
  • p is an integer greater than 1
  • Ra and Rb represent, each independently of one another, an optionally substituted group chosen from the following: alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aralkyl, alkylaryl, - Rc and Rd represent, each independently of one another, a hydrogen or halogen atom, a group -NO 2 , -SO 3 H, -SO 3 R 8, -NCO, -CN, -Rg, -OH, -ORg, -SH, -SRg, -NH 2 , -NHRg, -NRgRh, -COOH, -COORg, -O 2 CRg, -CONH 2 , -CONHRg, -CONRgRh, -NHCORg, -NRgCORh, C m F 2m + 1 with m between 1 and 20, preferably equal to 1,
  • - Re and Rf represent, each independently of one another, an optionally substituted alkyl or aryl group
  • - Rg and Rh represent, each independently of one another, an optionally substituted group chosen from the following: alkyl , alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aralkyl, alkylaryl.
  • the transfer agents of formula (Ia) are preferred, and in particular those in which R is substituted by a single activated ester function.
  • the group R of the transfer agents (I), (Ia), (Ib) and (Ic) as defined above have a secondary or tertiary carbon atom, located in alpha of the sulfur atom.
  • the group A of the R group is a branched aliphatic chain having a secondary or tertiary carbon atom, alpha to the sulfur atom.
  • Z is chosen from the groups: alkyl, cycloalkyl, aryl, -ORa, and -SRa, said groups being optionally substituted and Ra being as defined above for (Ia), (Ib) and (Ic).
  • succinimido-6-phenyl-6-thioxo-5-thia-4-cyano-4-methylhexanoate succinimido-4-phenyl-4-thioxo-3- thia-2-methylbutanoate.
  • the transfer agents of formula (I), (Ia), (Ib) and (Ic) are prepared according to techniques well known to those skilled in the art.
  • a transfer agent carrying an acid function is obtained for example according to the reference Dupont WO98 / 01478 if it is a dithioester or a trithiocarbonate, or for example according to Rhodia reference WO98 / 58974 if is a dithiocarbonate also called xanthate.
  • the acid function of this transfer agent is converted into function "activated ester" for example by addition of NHS (N-hydroxysuccinimide) in the presence of DCC (dicyclohexylcarbodiimide).
  • the coupling between the activated ester function and a compound carrying a nucleophilic function is carried out directly on the transfer agent, which is then used in the RAFT polymerization and thus allows the synthesis of functionalized polymers at their ⁇ -ends.
  • the coupling on the activated ester with a compound of interest (carrying a nucleophilic function) is thus preferably carried out before the RAFT polymerization.
  • the RAFT polymerization of B1 (homo or copolymerization) is carried out in the presence of the transfer agent (I); a homopolymer (or a copolymer) carrying at least one activated ester function at its ⁇ -end is thus obtained,
  • the compound of interest that is attached to the ⁇ or ⁇ end of the polymer will preferably be a biological ligand.
  • the biological ligands that can be attached to the polymer of the present invention are, for example, those used in the field of diagnosis in detection tests for target molecules, for example, or in the therapeutic field, in particular for vectorizing active molecules or of genes.
  • the biological ligand is capable of forming a ligand / anti-ligand capture complex.
  • said anti-ligand may constitute the target molecule.
  • those skilled in the art will choose the nature of the biological ligand to bind to the polymer.
  • the biological ligand may be a biotin.
  • the anti-ligand will be a streptavidin immobilized on the target via a nucleic acid labeled with a biotin and sufficiently complementary to the target for to hybridize specifically according to the reaction conditions and in particular the temperature or the salinity of the reaction medium.
  • the fluorescent polymer then directly allows the detection of the target molecule.
  • a polynucleotide is synthesized by a solid support chemical method having a reactive function at any point in the chain, such as, for example, 5 'end or 3' end or on an internucleotide phosphate base or on the 2 'position of sugar (see Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties edited by S.
  • a biotin, a sugar, an oligonucleotide, or a lipid that promotes membrane insertion may be coupled to the end of the polymer.
  • the fluorescent polymer may then be fixed by one of its ends and specifically, on any support having, on the surface, the entity recognized by the selected compound of interest (polymer, latex, silica, lipid vesicle, protein , DNA or RNA target ).
  • the fluorescent polymer may be immobilized on a given surface coated with streptavidin.
  • the polymers according to the invention are very resistant to photodegradation, hence an interest in following kinetics by fluorescence microscopy, or by confocal microscopy with laser scanning to analyze different levels.
  • the highly fluorescent polymers according to the invention may be used in diagnostic tests to enhance the detection of the capture of a biological target, such as a nucleic acid per molecule.
  • a biological target such as a nucleic acid per molecule.
  • the polymers according to the invention may also be used for marking materials (polymers, hybrid compounds, other) in optical microscopy applications (confocal, multiphoton, SNOM).
  • FIG. 1 shows, in a comparative manner, the evolution over time of the fluorescence intensity between a polymer according to FIG. the invention (poly (N AM-LY)) and an R-Phycoerythrin-Streptavidin (RPE) conjugate.
  • N-acryloylmorpholine ( ⁇ AM, sold by ALDRICH, reference 44.827-3) is distilled prior to use in polymerization.
  • the N-acryloxysuccinimide ( ⁇ AS, sold by ACROS, reference 40030) is purified by chromatography on a silica column before use in polymerization.
  • the dioxane (polymerization solvent) (sold by SDS, reference 27,053-9) is distilled on LiAlH 4 before use.
  • 2,2'-Azobis-isobutyronitrile AIB ⁇ (polymerization initiator) (Fluka, reference 11630) is recrystallized from ethanol.
  • the tert-butyl dithiobenzoate (chain transfer agent (ATC) of the RAFT polymerization) is synthesized according to the method described by A. Favier et al. in Macromolecule, 2002, 35, 8271-8280 Trioxane (internal reference for 1 H NMR monitoring) (JANSSEN-CHIMICA, reference 14.029.61) is used as it is.
  • a copolymerization is carried out between the NAM and the NAS, in the dioxane, in the presence of AIBN and of fert-butyl dithiobenzoate.
  • the various reagents are introduced into a Schlenk type reactor at room temperature, and the mixture is degassed by a succession of freeze / vacuum / thawing cycles, and then put under nitrogen.
  • the reaction mixture is brought to 90 ° C. and left stirring for 2 hours.
  • the polymer obtained, named poly (NAM-st-NAS) is precipitated in ether, several times if necessary, that is to say until the residual monomers are completely removed, then is recovered by centrifugation and dried under empty of the vane pump.
  • Nuclear Magnetic Resonance (NMR) analysis conditions 1 H The kinetic monitoring of the monomer consumption is carried out by 1 H NMR (Nuclear Magnetic Resonance) with a Bruker AC 200 MHz spectrometer.
  • the samples to be analyzed are prepared by mixing 300 ⁇ L of each sample with 300 ⁇ L of deuterated solvent: CDCl 3 .
  • the fluorophore Lucifer Yellow Cadaverine, (N- (5-aminopentyl) -4-amino-3,6-disulfo-1,8-naphthalimide, dipotassium salt) (LY, sold by Molecular Probes, reference A-1340) is used as what.
  • 4- (2-Aminoethyl) morpholine (sold by ALDRICH, reference A5,500-4) is used as it is.
  • Dimethylformamide (solvent) (sold by Merck, reference 822275) is dried over CaH 2 and distilled before use.
  • the poly (NAM-st-NAS) polymer obtained in paragraph a) and the fluorophore LY are introduced with the solvent into a glass flask.
  • the reaction mixture placed under argon is heated to 45 ° C. and left stirring in the dark for 96 hours.
  • the temperature is lowered to 30 ° C. and 4- (2-aminoethyl) morpholine is introduced into the reaction medium.
  • the reaction mixture is left for 4 days under argon, protected from light.
  • the resulting polymer, named poly (NAM-LY) is precipitated in ether from a dichloromethane solution (several times), recovered by centrifugation and dried under vacuum from the vane pump. Operational conditions of the fluorophore coupling reaction and masking of the
  • Characteristics of the fluorescent poly (NAM-LY) polymer in aqueous solution The absorption and emission maxima of the LY fluorophore are not modified by the coupling of LY molecules on the poly (NAM-st-NAS) polymer.
  • the exact amount of LY bound to the polymer is determined by NMR and confirmed by comparing the absorption and fluorescence emission spectra of the fluorescent polymer and free LY: 36 fluorophore molecules are attached per chain, which corresponds to a coupling efficiency of 58% and 1.56 Kg / mol of polymer per fluorophore.
  • the quantum yield of free LY is 0.61 (free ⁇ FLY) and the coupled quantum yield of LY on the polymer is 0.48 (immobilized ⁇ FLY).
  • the relative quantum yield of LY fluorophores immobilized on the polymer is therefore 0.79.
  • the fluorescence amplification factor of the poly [NAM-LY] fluorescent polymer is determined by the following formula:
  • Fluorescence amplification factor number of LY / chain x (immobilized ⁇ FLY) / (free ⁇ FLY)
  • the fluorescent polymer obtained has a fluorescence amplification of 28 compared with a free fluorophore in aqueous solution. If this value is reported to the molar mass of the polymer which is 56.2 Kg / mol, a fluorescence amplification factor of 0.5 per Kg / mol of polymer is obtained.
  • poly (NAM-LY) polymer synthesized as described in paragraph a) and b) and the biological ligand (PEO-Maleimide Activated Biotin) are introduced with the solvent into a flask.
  • the reaction mixture placed under argon is stirred, at a temperature of 30 ° C. and protected from light for 5 days.
  • the resulting polymer, named poly (NAM-LY-B) is purified by dialysis.
  • the purified poly (NAM-LY-B) is mixed with an Avidin-polystyrene latex (sold by ESTAPOR, reference 1080-06) in a PBS-Tween 1% o buffer containing albumin 0.1 gL "1. the reaction mixture is left for 4 h at 37 0 C. After centrifugation (4000 rpm) and six washes with buffer, the latex was analyzed by fluorescence.
  • the fluorescence emission at 530nm is compared with the fluorescence of a solution of the poly (NAM-LY) fluorescent polymer (under the same operating conditions) This comparison makes it possible to determine the proportion of polymer chains carrying a biotin at their end, namely 15%.
  • the fluorescence emission of the polymer does not vary, contrary to what is observed for the RPE which sees its emission decrease by 30%.
  • the emission of poly (NAM-LY) decreased by 14% while that of the RPE decreased by 56%.
  • Biotin-Fluoresceine conjugate (BF, sold by SIGMA, reference: B 8889 or MOLECULAR PROBES, reference: B-1370) is used as it is.
  • Biotin-Lucifer Yellow conjugate (B-LY) is synthesized by reaction of EZ-link NHS-PEO 4 -Biotin (sold by PIERCE, reference 21330) and Lucifer Yellow Cadaverine (NHS lmol: 1.1 mol LY), in the same operating conditions as those of the coupling reaction of the fluorophore on the poly (NAM-st-NAS) described previously in paragraph b).

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Abstract

L'invention a pour objet des polymères fluorescents solubles en solution aqueuse, porteurs d'au moins 5 fluorophores répartis sur le polymère, qui présentent les propriétés suivantes : les fluorophores sont hydrosolubles ; les fluorophores ne forment pas d'auto-association dans l'eau, jusqu'à une concentration de 10<SUP>-4</SUP> mol/l, de préférence jusqu'à une concentration de 10<SUP>-3</SUP> mol/l ; les fluorophores libres en solution aqueuse présentent un coefficient d'extinction molaire supérieur à 1000 M<SUP>-1</SUP>. cm<SUP>-1</SUP>, de préférence supérieur à 5000 M<SUP>-1</SUP>.cm<SUP>-1</SUP> ; les fluorophores libres en solution aqueuse présentent un rendement quantique supérieur à 0,3, de préférence supérieur à 0,6 ; lesdits polymère présentant un facteur d'amplification de fluorescence supérieur ou égal à 0,35 par Kg/mol de polymère, de préférence supérieur à 0,45 par Kg/mol de polymère.

Description

POLYMERES FLUORESCENTS SOLUBLES EN SOLUTION AQUEUSE ET PROCEDE DE PREPARATION DE POLYMERES FLUORESCENTS SOLUBLES EN SOLUTION AQUEUSE
La présente invention concerne le domaine des polymères fluorescents. Plus particulièrement, la présente invention a pour objet de nouveaux polymères
5 fluorescents solubles en solution aqueuse et obtenus, de préférence, par polymérisation radicalaire ou ionique vivante. L'invention est également relative au procédé de préparation de polymères fluorescents solubles en solution aqueuse.
Le développement de polymères répondant aux besoins de nouvelles applications est l'un des enjeux de la recherche.
10 Les polymères de synthèse ont été utilisés depuis longtemps aussi bien dans le domaine thérapeutique pour vectoriser des molécules actives ou des gènes, que dans le domaine du diagnostic. Dans ce dernier cas, des ligands biologiques sont fixés sur les polymères par complexation, par covalence ou par reconnaissance spécifique, et les conjugués ainsi formés sont utilisés dans des tests de détection de molécules
15 cibles, essentiellement pour augmenter la sensibilité. L'immobilisation des ligands biologiques sur des polymères fluorescents permet d'améliorer la détection.
Les polymères fluorescents peuvent également trouver des applications dans différentes méthodes de marquage, de détection, dans l'imagerie, notamment, par microscopie de fluorescence et microscopie confocale. Pour les applications dans le
20 domaine diagnostique ou thérapeutique, il est particulièrement avantageux d'utiliser des polymères fluorescents solubles en solution aqueuse.
De nombreux travaux se sont intéressés à la synthèse de polymères fluorescents. M. Pitschke et al, par exemple, dans Colloid Polym. ScL, 1995, 273, 740-752 décrit la synthèse d'un polymère hydrosoluble fluorescent obtenu par
25 polymérisation de trois types de monomères : un dérivé styrène sulfonate pour la solubilité dans l'eau, un dérivé styrène coumarine fluorescent et un dérivé méthacrylate-PEG-COOH pour le couplage covalent de protéines. Les polymères obtenus présentent une large polymolécularité (Ip). Un polymère de 38 000 g.mol"1 porteur de 13 coumarines par chaîne et un polymère de 150 000 g-mol"1 porteur de 60
30 coumarines par chaîne sont décrits. Le rendement quantique relatif de ces fluorophores immobilisés sur le polymère est de 0,67 (en relatif par rapport à la coumarine seule), ce qui correspond à un facteur d'amplification de la fluorescence de 9 pour le polymère de 38 000 g/mol, c'est-à-dire à un facteur d'amplification de la fluorescence rapporté à la masse molaire du polymère de 0,24 par Kg/mol de polymère, et à un facteur d'amplification de la fluorescence de 40 pour le polymère de 150000 g/mol, c'est-à-dire à un facteur d'amplification de la fluorescence rapporté à la masse molaire du polymère de 0,27 par Kg/mol de polymère. Il apparaît donc, dans cette publication, qu'une amplification de la fluorescence, entraînant une meilleure sensibilité dans les applications visées, est directement liée à la longueur du polymère. De plus, des problèmes d'interactions hydrophobes sont rencontrés lors de l'utilisation en phase aqueuse de ces polymères, à cause de la présence des coumarines hydrophobes. M. Chen et al. dans Macromolecules, 2004, 37, 5479-5481, ont décrit la synthèse d'un polymère fluorescent amphiphile, comportant un bloc hydrosoluble et un bloc hydrophobe, par le procédé de polymérisation radicalaire contrôlée dit RAFT. La polymérisation met en œuvre un agent de transfert fluorescent porteur d'une coumarine et un monomère acénaphtylène fluorescent. Le polymère obtenu porte 22 fluorophores latéraux par chaîne et une coumarine à l'une des extrémités de la chaîne. Ce polymère présente un certain nombre d'inconvénients : il est soluble dans l'eau uniquement lorsqu'il est ionisé, dans l'exemple donné à pH 11, ce qui limite fortement son utilisation dans les milieux biologiques qui présentent un pH proche de 7 ; les fluorophores latéraux sont groupés sur le bloc hydrophobe, ce qui n'est pas favorable à une bonne fluorescence de ces fluorophores latéraux ; les 22 fluorophores sont tous hydrophobes, ce qui entraîne une tendance du polymère à s'agréger en structure de type micelle : il n'est donc pas vraiment soluble dans l'eau mais dispersable dans l'eau ; ce polymère n'est pas très fluorescent : seule la coumarine située en extrémité de chaîne émet de la fluorescence, les fluorophores latéraux servant d'antenne de stockage de la lumière.
Différents polymères fluorescents hydrosolubles sont également proposés dans le Handbook of Fluorescent Probes, 9th Edition, 2002, 581-590 de Molecular Probes : différents dextrans fluorescents, par exemple de 3000 g/mol avec de 0,3 à 0,7 fluorophores par chaîne, de 10000 g/mol avec de 0,5 à 2 fluorophores par chaîne, de 40000 g/mol avec de 2 à 4 fluorophores par chaîne, de 70000 g/mol avec de 3 à 6 fluorophores par chaîne, tous polydisperses en taille et en nombre de fluorophores par chaîne. Les rendements quantiques relatifs des fluorophores portés par de tels polymères ne sont pas indiqués. Cependant, même si l'on suppose que les rendements quantiques relatifs sont très élevés, l' amplification de la fluorescence obtenue, et en particulier, l'amplification de la fluorescence rapportée à la masse du polymère est faible. De plus, certains de ces polymères sont marqués à la fluorescéine et sont donc très sensibles au pH et peu photostables. Dans toutes ces techniques de l'art antérieur, les polymères présentent un facteur d'amplification de la fluorescence limité. De plus, les polymères sont, le plus souvent, obtenus par un procédé de polymérisation conduisant à une large distribution de taille des chaînes, ce qui nécessite de procéder à une purification par fractionnement, pour aboutir à une distribution de tailles étroite. La polydispersité en taille est, par exemple, un problème pour l'analyse de la communication intercellulaire et des phénomènes d'exclusion de taille comme la perméabilité de membranes.
Or, pour répondre aux besoins sus mentionnés, la Demanderesse se propose de fournir de nouveaux polymères, solubles en solution aqueuse, qui présentent une fluorescence élevée.
Dans ce contexte, la présente invention a pour objet un polymère fluorescent soluble en solution aqueuse qui est porteur d'au moins 5 fluorophores répartis sur le polymère, lesdits fluorophores présentant les propriétés suivantes :
- les fluorophores sont hydrosolubles, - les fluorophores ne forment pas d'auto-association dans l'eau, jusqu'à une concentration de 10"4 mol/1, de préférence jusqu'àme concentration de 10'3 mol/1,
- les fluorophores libres en solution aqueuse présentent un coefficient d'extinction molaire supérieur à 1000 M"1.cm'1, de préférence supérieur à 5000 M"1.cm"1, - les fluorophores libres en solution aqueuse présentent un rendement quantique supérieur à 0,3, de préférence supérieur à 0,6. Le polymère selon l'invention présente un facteur d'amplification de la fluorescence supérieur ou égal à 0,35 par Kg/mol de polymère, de préférence supérieur à 0,45. L'obtention d'un tel facteur d'amplification est due aux propriétés particulières des fluorophores utilisés et enparticulier à celle de non auto-association. De façon avantageuse, les polymères selon l'invention présentent une caractéristique ci-dessous ou une combinaison des caractéristiques ci-dessous, lorsqu'elles ne s'excluent pas l'une l'autre : - les fluorophores comportent ou sont liés par l'intermédiaire d'un bras espaceur, comportant au moins un enchaînement -CH2-CH2- situé entre la partie fluorescente du fluorophore et le polymère ;
- le polymère est obtenu en utilisant un procédé de polymérisation radicalaire contrôlée ou de polymérisation ionique vivante ;
- le polymère est obtenu en utilisant un procédé de polymérisation radicalaire contrôlée basé sur un transfert réversible de chaînes par addition/fragmentation (RAFT) ;
- le polymère présente un indice de polymolécularité inférieur à 1,5, de préférence inférieur à 1,3 ;
- les fluorophores comprennent au moins un groupe polaire ou ionisable en solution aqueuse ;
- le polymère présente moins de 2,4 Kg/mol, de préférence moins de 2 Kg/mol de polymère par fluorophore ; - les dits fluorophores présentant un rendement quantique relatif de fluorescence au moins égal à 0,7, de préférence au moins égal à 0,75 ;
- les fluorophores sont tous identiques ;
- les fluorophores sont choisis parmi : le N-(5-aminopentyl)-4-amino-3,6- disulfo-l,8-naphthalimide, le 3,6-diamino-9-(2-méthoxycarbonyl)phényle, le 9-(2,4-disulfophényl)-253,6,7,12,13,16,17-octahydro-lH,5H,llH,15H- xanthéno[2,3,4-ij :5,6,7-i'j']diquinolizin-18-ium, le 9-(2,4-disulfophényl)- 3,6-bis(éthylamino)-2,7-diméthyl-xanthylium, le 3,6-bis(diéthylamino)-9- (2,4-disulfophényl)-xanthylium et leur dérivés ;
- les fluorophores sont identiques et sont le N-(5-aminopentyl)-4-amino-3,6- disulfo-l,8-naphthalimide ;
- les fluorophores sont insensibles aux variations de pH ;
- les fluorophores sont photostables ;
- le polymère se présente sous la forme d'un copolymère statistique, comportant au moins deux entités distinctes répétées, l'une porteuse du fluorophore et au moins une autre entité hydrophile ;
- le polymère comprend, à l'une de ses extrémités, un composé d'intérêt tel qu'un ligand biologique lié de façon covalente ; de préférence, le composé d'intérêt est soit lié au polymère par une fonction thioether à son extrémité ω, soit lié au polymère par une fonction amide à son extrémité α. Selon un autre de ses aspects, l'invention se propose de fournir des procédés de préparation de nouveaux polymères fluorescents, solubles en solution aqueuse, qui présentent une fluorescence élevée. L'invention a donc pour objet les procédés tels que définis aux revendications
20 à 52.
L'invention a donc également pour objet un premier procédé de préparation de polymères fluorescents solubles en solution aqueuse et qui présentent un facteur d'amplification de la fluorescence supérieur ou égal à 0,35 par Kg/mol de polymère, de préférence supérieur à 0,45 par Kg/mol de polymère comportant les étapes suivantes :
• une étape de polymérisation par homopolymérisation ou copolymérisation réalisée avec un monomère fonctionnalisé porteur d'une fonction réactive Xl, éventuellement sous forme protégée, de façon à obtenir un polymère porteur d'au moins 5 fonctions réactives Xl, éventuellement sous forme protégée, réparties sur ledit polymère,
• une étape de couplage d'au moins 5 fluorophores sur au moins une partie des fonctions réactives Xl, après déprotection desdites fonctions réactives si nécessaire, lesdits fluorophores présentant les caractéristiques suivantes : - les fluorophores sont hydrosolubles,
- les fluorophores ne forment pas d'auto-association dans l'eau, jusqu'à une concentration de 10"4 mol/1, de préférence jusqu'à une concentration de 10'3 mol/1,
- les fluorophores libres en solution aqueuse présentent un coefficient d'extinction molaire supérieur à 1000 M'1.cm"1, de préférence supérieur à 5000 IvT1Xm"1,
- les fluorophores libres en solution aqueuse présentent un rendement quantique supérieur à 0,3, de préférence supérieur à 0,6.
L'invention a également pour objet un deuxième procédé de préparation de polymères fluorescents solubles en solution aqueuse et qui présentent un facteur d'amplification de la fluorescence supérieur ou égal à 0,35 par Kg/mol de polymère, de préférence supérieur à 0,45 par Kg/mol de polymère mettant en oeuvre une étape de polymérisation par copolymérisation d'un monomère fonctionnalisé porteur d'un fluorophore, avec un monomère hydrophile, ou bien avec un monomère, qui après traitement, peut conduire à une entité hydrophile, lesdits fluorophores présentant les caractéristiques suivantes :
- les fluorophores sont hydrosolubles, - les fluorophores ne forment pas d'auto-association dans l'eau, jusqu'à une concentration de 10"4 mol/1, de préférence jusqu'à une concentration de 10 mol/1,
- les fluorophores libres en solution aqueuse présentent un coefficient d'extinction molaire supérieur à 1000 M'1. cm"1, de préférence supérieur à 5000 M-1Xm'1,
- les fluorophores libres en solution aqueuse présentent un rendement quantique supérieur à 0,3, de préférence supérieur à 0,6.
Dans ce cas, le monomère fonctionnalisé porteur d'un fluorophore pourra être obtenu par couplage d'un fluorophore, éventuellement, par l'intermédiaire d'un bras espaceur, sur un monomère fonctionnalisé porteur d'une fonction réactive Xl .
De préférence, le monomère porteur d'une fonction réactive Xl est choisi parmi les monomères fonctionnels suivants : le N-acryloxysuccinimide, le N- méthacryloxysuccinimide, le méthacrylate de 2-hydroxyéthyle, le méthacrylate de 2- aminoéthyle, Pacrylate de 2-hydroxyéthyle, Pacrylate de 2-aminoéthyle, l'anhydride maléïque et, de préférence, parmi le N-acryloxysuccinimide, le N- méthacryloxysuccinimide, l'anhydride maléïque, et plus particulièrement le N- acryloxysuccinimide (ΝAS). Ou bien le monomère porteur d'une fonction réactive Xl est choisi parmi les dérivés d'un sucre, de préférence, le 6-0-(2-vinyloxyethyl)- α-D-galactopyranose, le 6-O-acryloyl-α-D-galactopyranose, le 6-Oacryloylamino- 6-désoxy -α-D-galactopyranose et le 6-O-(8-acryloylamino-3,6-dioxaoctyl)- α-D- galactopyranose.
De façon avantageuse, les fluorophores utilisés dans ces procédés présentent les caractéristiques supplémentaires telles que définies ci-dessus pour les polymères.
De plus, les variantes ci-dessous, éventuellement prises en combinaison lorsqu'elles ne s'excluent pas l'une l'autre, constituent des aspects préférés de l'un et/ou l'autre des procédés selon l'invention :
- l'étape de couplage est réalisée de façon à ce que la partie fluorescente des fluorophores soit éloignée du polymère par un bras espaceur comportant au moins un enchaînement -CH2-CH2- ; par exemple, les fluorophores comportent un bras espaceur, comportant au moins un enchaînement -CH2- CH2-, situé entre la partie fluorescente du fluorophore et le polymère ;
- l'étape de polymérisation est réalisée par polymérisation radicalaire contrôlée ou polymérisation ionique vivante, préférentiellement, par un procédé de polymérisation radicalaire contrôlée basé sur un transfert réversible de chaînes par addition/fragmentation (RAFT) ;
- le nombre de fluorophores fixés au polymère est ajusté, de façon à obtenir, moins de 2,4 Kg/mol, de préférence moins de 2 Kg/mol de polymère par fluorophore ;
- l'étape de polymérisation est réalisée par copolymérisation, de préférence statisitique, entre un monomère fonctionnalisé, éventuellement porteur d'un fluorophore, et un monomère hydrophile ; préférentiellement, le monomère hydrophile est choisi parmi les dérivés hydrophiles d'acrylate, de méthacrylate, d'acrylamide, de méthacrylamide, de N-vinylpyrrolidone, les dérivés hydrophiles de monomères saccharidiques et, de préférence, parmi : la N-vinylpyrrolidone, le N,N-diméthylacrylamide et la N- acryloylmorpholine ;
- l'étape de polymérisation est réalisée par copolymérisation statistique entre un monomère porteur d'une fonction réactive Xl, éventuellement sous forme protégée, et un monomère hydrophile à l'exception des monomères saccharidiques hydrophiles non protégés, ou bien un monomère qui, après traitement, peut conduire à une entité hydrophile ; de préférence, on utilise un monomère porteur d'une fonction réactive Xl, avantageusement choisi parmi les monomères fonctionnels suivants : le N-acryloxysuccinimide, le Ν- méthacryloxysuccinimide, le méthacrylate de 2-hydroxyéthyle, le méthacrylate de 2-aminoéthyle, l'acrylate de 2-hydroxyéthyle, Pacrylate de 2- aminoéthyle, l'anhydride maléïque et, de préférence, parmi le N- acryloxysuccinimide, le N-méthacryloxysuccinimide, l'anhydride maléïque, etc .. et, plus particulièrement, le N-acryloxysuccinimide (ΝAS) ; après l'étape de couplage, on réalise, de façon avantageuse, un traitement des fonctions Xl restantes sur le polymère, soit par désactivation, soit par couplage avec des molécules hydrosolubles non fluorescentes ; - l'étape de polymérisation est réalisée par copolymérisation statistique entre un monomère porteur d'une fonction réactive Xl, éventuellement sous forme protégée, et un monomère hydrophile ; de préférence on utilise un monomère hydrophile choisi parmi les dérivés hydrophiles d'acrylate, de méthacrylate, d'acrylamide, de méthacrylamide, de N-vinylpyrrolidone et, de préférence, parmi : la N-vinylpyrrolidone, le N,N-diméthylacrylamide et la N- acryloylrnorpholine ;
- l'étape de polymérisation est réalisée par homopolymérisation d'un monomère porteur d'une fonction réactive Xl sous forme protégée, ladite fonction étant déprotégée avant couplage des fluorophores ; de préférence, le monomère porteur d'une fonction réactive Xl sous forme protégée est choisi parmi les dérivés d'un sucre, de préférence, le l,2:3,4-di-0-isopropylidène-6- 0-(2-vinyloxyethyl)-α-D-galactopyranose, le 6-O-acryloyl-l,2:3,4-di-O- isopropylidène-α-D-galactopyranose, le 6-0-acryloylamino-6-désoxy- l,2:3,4-di-(3-isopropylidène-α-D-galactopyranose et le 6-0-(8- acryloylamino-3 ,6-dioxaoctyl)- 1,2:3 ,4-di-O-isopropylidène-α-D- galactopyranose;
- l'étape de polymérisation est réalisée par homopolymérisation d'un monomère porteur d'une fonction réactive Xl, avantageusement choisi parmi les monomères fonctionnels suivants : le N-acryloxysuccinimide, le Ν- méthacryloxysuccinimide, le méthacrylate de 2-hydroxyéthyle, le méthacrylate de 2-aminoéthyle, l'acrylate de 2-hydroxyéthyle, l'acrylate de 2- aminoéthyle, l'anhydride maléïque et, de préférence, parmi le N- acryloxysuccinimide, le N-méthacryloxysuccinimide, l'anhydride maléïque et, plus particulièrement, le N-acryloxysuccinimide (ΝAS) ; après l'étape de couplage des fluorophores, on réalise, de façon avantageuse, un traitement des fonctions Xl restantes sur le polymère, soit par désactivation, soit par couplage avec des molécules hydrosolubles non fluorescentes ;
- la fonction réactive Xl est choisie parmi les fonctions hydroxy, aminé, aldéhyde, anhydride, acide carboxylique activé sous forme d'ester activé, par exemple de N-hydroxysuccinirnide ; la fonction acide carboxylique activé sous forme d'ester de N-hydroxysuccinimide étant préférée ;
- un composé d'intérêt, tel qu'un ligand biologique, est couplé de façon covalente à une fonction E réactive, présente en bout de chaîne du polymère fluorescent obtenu ; dans le cas où le polymère est obtenu par procédé RAFT5 le composé d'intérêt est couplé, à l'extrémité ω du polymère, pour former une fonction thioether ; les ligands biologiques sont choisis notamment parmi les polynucléotides, les antigènes, les anticorps, les polypeptides, les protéines, les haptènes, la biotine.
La présente invention a également pour objet les polymères fluorescents solubles en solution aqueuse, susceptibles d'être obtenus par de tels procédés.
Avant de décrire plus en détails l'invention, certains termes employés dans la description et les revendications, outre ceux indiqués précédemment, sont définis ci- après.
On entend par masse molaire au sens de l'invention la masse molaire moyenne en nombre, Mn, des chaînes polymères formées. Dans le cas présent, elle est obtenue après analyse des échantillons par chromatographie d'exclusion stérique, en utilisant un détecteur de type réfractomètre couplé à un appareil de diffusion de lumière, ce qui permet d'avoir accès à des valeurs de masse molaire absolues. L'appareil de diffusion de lumière est un miniDawn (Wyatt Technology) et les masses molaires absolues sont déterminées avec le logiciel ASTRA (Wyatt Technology).
L'indice de polymolécularité est l'indice de distribution des masses molaires bien connu de l'homme du métier. Ainsi l'indice de polymolécularité est Ip, avec
Ip=MwZMn, Mn étant telle que définie ci-dessus et Mw étant la masse molaire moyenne en masse des chaînes polymères. Dans le cas présent, il a également été déterminé avec le logiciel ASTRA.
Le terme copolymère doit être compris comme un polymère formé par au moins deux entités différentes répétées et, notamment, les copolymères à blocs et les copolymères statistiques. Le terme copolymère statistique désigne les polymères formés par au moins deux entités différentes répétées, dans lesquels soit les entités sont réparties statistiquement le long de la chaîne macromoléculaire, soit les entités se succèdent régulièrement selon une structure générale (Bn'Cm')p' dans laquelle n', m' et p' sont des nombres entiers identiques ou différents. Le terme copolymère statistique englobe donc les copolymères alternés.
Par monomère, on entend une entité polymérisable. Par monomère fonctionnalisé, on entend un monomère porteur d'une fonction réactive Xl (monomère réactif), éventuellement sous forme protégée, ou d'un fluorophore (monomère fluorescent).
Par polymère soluble en solution aqueuse, on entend un polymère qui, introduit dans une solution aqueuse à 25 0C5 à une concentration en poids égale à 1%, permet l'obtention d'une solution qui présente une valeur de transmittance maximale de la lumière, à une longueur d'onde à laquelle le polymère n'absorbe pas, à travers un échantillon de 1 cm d'épaisseur, d'au moins 70%, de préférence d'au moins 80%.
Par fluorophore hydrosoluble, on entend un fluorophore qui, introduit à 250C, dans une solution aqueuse jusqu'à une concentration de 10"3 mol/L au moins, conduit à une solution homogène et transparente. La solution aqueuse dans laquelle la solubilité du polymère ou des fluorophores peut être testée est, par exemple, de l'eau pure ou une solution tampon de pH compris entre 5 et 10.
Le rendement quantique de fluorescence d'un fluorophore est le rapport entre le nombre de photons émis par ce fluorophore et le nombre de photons absorbés par ce fluorophore. Il est toujours inférieur ou égal à 1. Plus il est proche de 1, plus le fluorophore considéré a un rendement quantique élevé.
Le rendement quantique de fluorescence relatif d'un fluorophore immobilisé sur un polymère est le rendement quantique de fluorescence du fluorophore immobilisé divisé par le rendement quantique de fluorescence du fluorophore libre en solution.
On entend par facteur d'amplification de la fluorescence d'un polymère fluorescent, le produit du nombre de fluorophores immobilisés sur le polymère par leur rendement quantique relatif. Il est déterminé par la formule suivante : Facteur d'amplification de la fluorescence = nombre de LY/chaîne x (ΦFLY immobilisé)/(ΦFLY libre) dans laquelle : LY = fluorophore
ΦFLY immobilisé ≈ rendement quantique de fluorescence du fluorophore LY immobilisé sur le polymère ΦFLY libre = rendement quantique de fluorescence du fluorophore LY libre en solution.
Ce facteur d'amplification de la fluorescence est rapporté à la masse molaire du polymère en le divisant par la masse molaire du polymère exprimée en Kg/mol. Le rendement quantique d'un fluorophore libre en solution ou immobilisé sur un polymère est déterminé par une méthode utilisant comme standard une solution diluée de rhodamine 101 dans Péthanol ayant un rendement quantique égal à 0,92 à 25°C. Les spectres de fluorescence du fluorophore libre en solution et du fluorophore immobilisé sur le polymère sont obtenus dans les mêmes conditions expérimentales (longueur d'onde d'excitation, largeur de bande des monochromateurs d'excitation et d'émission, géométrie optique) en utilisant un spectrofluorimètre SPEX Fluorolog F112A.
Le nombre de fluorophores immobilisés sur une chaîne polymère, est déterminé en divisant le coefficient d'extinction molaire du polymère fluorescent par le coefficient d'extinction molaire du fluorophore libre en solution.
Le coefficient d'extinction molaire ε d'un fluorophore libre en solution (ou d'un polymère fluorescent) est déterminé à partir de la pente de la courbe représentant l'absorbance (densité optique ou DO) du fluorophore (ou du polymère respectivement) en fonction de la concentration (C) du fluorophore (ou du polymère) selon la loi bien connue de Beer-Lambert :
DO = ε x 1 x C avec 1 = largeur de la cuve (ou chemin optique) en cm C = concentration en mol/L ou M ε en M-1Xm'1
L'absorbance est déterminée à la longueur d'onde d'absorbance maximale avec un spectrophotomètre UV/Vis JASCO V-650.
Le phénomène d'auto-association d'un fluorophore libre en solution aqueuse est déterminé à partir des spectres d'absorption UV de solutions de concentration croissante. La concentration à laquelle le phénomère d'auto-association se produit est déterminée comme étant la concentration où la courbe de Beer-Lambert dévie de la linéarité, et ceci pour une valeur d'absorbance inférieure à 1,0 en utilisant des cellules de chemin optique approprié (de 0,1 cm à lcm selon la concentration en fluorophore). Dans le cadre de l'invention, le coefficient d'extinction molaire et le rendement quantique de fluorescence sont mesurés dans une solution aqueuse, dans des conditions, notamment de pH et force ionique, où ces paramètres prennent des valeurs maximales. Le plus souvent, la solution aqueuse utilisée est une solution tampon de pH compris entre 5 et 10.
Par composé d'intérêt, on entend tout type de composé moléculaire ou macromoléculaire, ou support solide, qu'il est intéressant de coupler à l'extrémité d'un polymère, pour telle ou telle application, en particulier pour une application en biologie, thérapeutique ou diagnostic. A titre d'exemple de composés d'intérêt, on peut citer les ligands biologiques, les mono- ou disaccharides, les lipides, les molécules fluorescentes, les colorants, les chaînes polymères et les supports solides. La seule condition nécessaire pour le composé d'intérêt est qu'il porte une fonction réactive susceptible de réagir avec une fonction E présente, à l'une des extrémités du polymère ou, dans le cas du procédé RAFT, à l'une des extrémités de l'agent de transfert réversible de chaîne ou à l'une des extrémités du polymère. Dans le cas où le polymère est préparé par procédé RAFT, cette fonction E est une fonction thiol ou ester activé, comme détaillé plus loin dans la description. Dans ce cas, la fonction réactive est respectivement choisie à titre d'exemple parmi les fonctions maléïmide et iodoacétamide et parmi les fonctions aminé, hydrazine, hydrazide, azide, alcoxyamine, hydroxy, thiol. Le composé d'intérêt peut être lié au polymère selon l'invention par l'intermédiaire d'un bras espaceur qui porte alors la fonction réactive.
Par ligand biologique, on entend un composé qui possède au moins un site de reconnaissance lui permettant de réagir avec une molécule cible d'intérêt biologique. A titre d'exemple, on peut citer, comme ligands biologiques, les polynucléotides, les antigènes, les anticorps, les polypeptides, les protéines, les haptènes, labiotine ...
Le terme "polynucléotide" signifie un enchaînement d'au moins 2 désoxyribonucléotides ou ribonucléotides comprenant éventuellement au moins un nucléotide modifié, par exemple au moins un nucléotide comportant une base modifiée tel que l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylamino-5- désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant l'hybridation. Ce polynucléotide peut aussi être modifié au niveau de la liaison internucléotidique comme par exemple les phosphorothioates, les H-phosphonates, les alkyl-phosphonates, au niveau du squelette comme par exemple les alpha-oligonucléotides (FR 2 607 507), ou les PNA (Egholm M. et al, J. Am. Chem, Soc, 1992, 114, 1895-1897), ou les 2-O-alkyl ribose, ou les LNA (de l'anglais « Loked Nucleic Acids », décrits notamment dans la demande de brevet publiée sous le numéro WO 00/66 604). Chacune de ces modifications peut être prise en combinaison. Le polynucléotide peut être un oligonucléotide, un acide nucléique naturel ou son fragment comme un ADN, un ARN ribosomique, un ARN messager, un ARN de transfert, un acide nucléique obtenu par une technique d'amplification enzymatique. Par "polypeptide", on entend un enchaînement d'au moins deux acides aminés.
Par acides aminés, on entend les acides aminés primaires qui codent pour les protéines, les acides aminés dérivés après action enzymatique comme la trans-4- hydroxyproline et les acides aminés naturels mais non présents dans les protéines comme la norvaline, la N-méthyl-L-leucine, la Staline (Hunt S. dans Chemistry and Biochemistry of the amino acides, Barett G.C., éd., Chapman and Hall, London, 1985), les acides aminés protégés par des fonctions chimiques utilisables en synthèse sur support solide ou en phase liquide et les acides aminés non naturels.
Le terme "haptène" désigne des composés non immunogènes, c'est-à-dire incapables par eux-mêmes de promouvoir une réaction immunitaire par production d'anticorps, mais capables d'être reconnus par des anticorps obtenus par immunisation d'animaux dans des conditions connues, en particulier par immunisation avec un conjugué haptène-protéine. Ces composés ont généralement une masse moléculaire inférieure à 3000 Da, et le plus souvent inférieure à 2000 Da et peuvent être par exemple des peptides glycosylés, des métabolites, des vitamines, des hormones, des prostaglandines, des toxines ou divers médicaments, les nucléosides et les nucléotides.
Le terme "anticorps" inclut les anticorps polyclonaux ou monoclonaux, les anticorps obtenus par recombinaison génétique et des fragments d'anticorps. Le terme "antigène" désigne un composé susceptible d'être reconnu par un anticorps dont il a induit la synthèse par une réponse immune. Le terme "protéine" inclut les holoprotéines et les hétéroprotéines comme les nucléoprotéines, les lipoprotéines, les phosphoprotéines, les métalloprotéines et les glycoprotéines aussi bien fibreuses que globulaires.
En tant que "monosaccharide", on peut citer, par exemple, le glucose, le galactose, le mannose, le fructose, et en tant que "disaccharide", par exemple, le saccharose, le cellobiose, le lactose, le maltose.
En tant que "lipide", on peut citer, par exemple, le dipalmitoylphosphatidylcholine. En tant que "colorant", on peut citer le bleu de méthylène, le vert de bromocrésol, le rouge methyl, la safranine O.
En tant que "molécules fluorescentes", on peut par exemple citer la fluorescéine, la rhodamine, le pyrène, le phénanthrène, l'anthracène, la coumarine. En tant que "chaîne polymère", on entend un polymère naturel ou de synthèse ayant été modifié afin de porter au moins une fonction réactive vis-à-vis de la fonction ester activé. Comme polymère naturel, on peut par exemple citer les polysaccharides comme la cellulose, le dextrane, le chitosane, les alginates. Comme polymère de synthèse, on peut, par exemple, citer le polyoxyde d'éthylène, le polyoxyde de propylène, le polychlorure de vinyle, les polyéthylènes, polypropylènes, polystyrènes, polyacrylates, polyacrylamides, polyamides, polyméthacrylates, polyméthacrylamides, polyesters, ou copolymères à base de monomères vinyle aromatique, alkylesters d'acides alpha-beta insaturés, esters d'acides carboxyliques insaturés, le chlorure de vinylidène, les diènes ou composés présentant des fonctions nitrile (acrylonitrile), les copolymères de chlorure de vinyle et de propylène, de chlorure de vinyle et acétate de vinyle, les copolymères à base de styrènes ou dérivés substitués du styrène
Le terme "support solide" tel qu'utilisé ici inclut tous les matériaux permettant une utilisation dans des tests diagnostiques ou en thérapeutique, en chromatographie d'affinité et dans des processus de séparation. Des matériaux naturels, de synthèse, modifiés ou non chimiquement, peuvent être utilisés comme support solide, notamment des polymères tels que polychlorure de vinyle, polyéthylène, polystyrènes, polyacrylates, polyamides, polyméthacrylates, polyesters, ou copolymères à base de monomères vinyle aromatique, alkylesters d'acides alpha-beta insaturés, esters d'acides carboxyliques insaturés, chlorure de vinylidène, diènes ou composés présentant des fonctions nitrile (acrylonitrile) ; des copolymères de chlorure de vinyle et de propylène, de chlorure de vinyle et acétate de vinyle ; copolymères à base de styrènes ou dérivés substitués du styrène ; des fibres synthétiques telles que le nylon ; des matériaux inorganiques tels que la silice, le verre, la céramique, le quartz ; des latex ; des particules magnétiques ; des dérivés métalliques. Le support solide selon l'invention peut être, sans limitation, sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une feuille, d'un cône, d'un tube, d'un puits, de billes, particules ou analogues, d'un support plan comme un wafer de silice ou silicium. Le matériau est soit hydrophile, soit hydrophobe intrinsèquement ou par suite d'une modification chimique comme par exemple un support hydrophile rendu hydrophobe.
Les supports solides susceptibles de réagir par formation de liaison covalente avec une fonction thiol portée par le polymère, présentent avantageusement des fonctions maléimïde en surface. Par exemple, il est possible d'introduire chimiquement des fonctions maléïmide, en surface d'un wafer de silice par silanisation, en utilisant un aminoalkylsilane puis un bras espaceur hétérobifonctionnel portant une fonction N-hydroxysuccinimide à une extrémité (qui réagit sur la fonction aminé) et une fonction maléïmide à son autre extrémité.
Les supports solides susceptibles de réagir par formation de liaison covalente avec une fonction ester activé, par exemple, portée le polymère obtenu par mise en œuvre du procédé RAFT, présentent avantageusement des fonctions aminé en surface. Par exemple, il est possible d'introduire, chimiquement, des fonctions aminé, en surface d'un wafer de silice par silanisation, en utilisant un aminoalkylsilane comme l'aminopropyldiméthylchlorosilane, Paminopropylméthyl- dichlorosilane ou raminopropyltrichlorosilane. Dans le cas où le support solide est sous la forme de particules de latex de polystyrène, la fonctionnalisation par des fonctions aminé peut être obtenue par copolymérisation de styrène avec de 1 ' aminométhylstyrène ou avec du méthacrylate d' aminoéthyle.
Par alkyle, on entend, lorsqu'il n'est pas donné plus de précision, un groupe hydrocarboné saturé, linéaire ou ramifié comportant de 1 à 18, avantageusement de 1 à 6, atomes de carbone. A titre d'exemples de groupe alkyle, on pourra citer les groupes méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, n-butyle, isobutyle, tert-butyle, n- pentyle, n-hexyle et analogues.
Par alcoxy, on entend un groupe O-alkyle, alkyle étant tel que défini ci-dessus. Par halogène, on entend un atome de chlore, brome, iode ou fluor. Les termes alcényle et alcynyle correspondent à un groupe hydrocarboné de 2 à 18, et de préférence de 2 à 6 atomes de carbone, comprenant respectivement au moins une double ou une triple liaison. Les exemples de groupe alcényle ou alcynyle sont, par exemple, des groupes vinyle, allyle, isopropényle, 1-, 2- ou 3-butényle, pentényle, hexényle, éthynyle, 2-propynyle, butynyle.
Le terme cycloalkyle, désigne un groupe alkyle, alcényle ou alcynyle, monocyclique ou polycyclique, par exemple bicyclique, comprenant de 3 à 10 atomes de carbone, par exemple cyclopropyle, cyclobutyle, cyclopentyle, cyclohexyle, des groupes cycloalkyle pontés tels que les groupes adamantyle, bicyclo[3.2.1 Joptanyle. Le terme hétérocycloalkyle désigne un cycloalkyle tel que ci-dessus défini, comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, sélectionnés parmi les atomes d'azote, oxygène et soufre.
Les groupes aryle désignent des carbocycles mono-, bi- ou polycycliques comprenant au moins un groupe aromatique. Le terme hétéroaryle désigne un groupe aryle tel que défini ci-dessus comprenant au moins un atome choisi parmi les atomes d'azote, oxygène ou soufre.
En tant qu' aryle ou hétéroaryle, on peut citer les groupes phényle, 1-naphtyle, 2-naphtyle, indanyle, indényle, biphényle, benzocycloalkyle, c'est-à-dire bicyclo[4.2.0]octa-l,3,5-triène, benzodioxolyle, tels que les groupes pyrrolyle, furanyle, thiényle, imidazolyle, pyrazolyle, thiazolyle, oxazolyle, isoxazolyle, pyridyle, pirazinyle, pyrimidyle, tétrazolyle, thiadiazolyle, oxadiazolyle, triazolyle, pyridazinyle, indolyle, pyrimidyle.
Les termes utilisés pour la définition des groupements chimiques sont ceux usuellement reconnus par l'homme du métier. Par exemple, un groupe du type cycloalkylalkyle signifie que le groupe est constitué d'un groupe alkyle lui-même substitué par un groupe cycloalkyle. Inversement, un groupe du type alkylcycloalkyle signifie que le groupe est constitué d'un groupe cycloalkyle lui- même substitué par un groupe alkyle.
Par groupe substitué, on entend un groupe porteur de un ou plusieurs substituants. Par substituants, on entend un groupe choisi parmi : les halogènes, cyano, alkyle, trifluoroalkyle, alcényle, alcynyle, cycloalkyle, aryle, hétérocycloalkyle, amino, alkylamino, dialkylamino, hydroxy, alcoxy, aryloxy, un groupe phényle éventuellement substitué, un groupe aromatique éventuellement substitué ou des groupes : alkoxycarbonyle ou aryloxycarbonyle (-COOR0), carboxy (-COOH), acyloxy (-O2CR0), carbamoyle (-CONR°2), isocyanato alkylcarbonyle, alkylarylcarbonyle, arylcarbonyle, arylalkylcarbonyle, phtalimido, maleïmido, succinimido, amidino, guanidino, allyle, époxy-SR°, les groupes présentant un caractère hydrophile ou ionique tels que les sels alcalins d'acides carboxyliques, les sels alcalins d'acide sulfonique, les chaînes polyoxyde d'alkylène (POE, POP)5 les substituants cationiques (sels d'ammonium quaternaires) avec R0 qui représente un groupe alkyle ou aryle.
L'objet de l'invention va maintenant être décrit en détail. L'invention a pour objet des polymères solubles en solution aqueuse et présentant une fluorescence élevée. Les polymères selon l'invention présentent un facteur d'amplification de la fluorescence rapporté à la masse du polymère supérieur ou égal à 0,35 par Kg/mol de polymère, de préférence supérieur à 0,45 par Kg/mol de polymère. Par conséquent, même pour des polymères assez petits, il est possible dans le cadre de l'invention d'obtenir un facteur d'amplification de la fluorescence assez élevé. Les polymères selon l'invention présentent un grand nombre de fluorophores, à savoir au moins 5, de préférence au moins 10 fluorophores, répartis sur la chaîne polymère. La répartition des fluorophores le long de la chaîne est réalisée grâce à une fonctionnalisation statistique du polymère et/ou à une copolymérisation statistique comme expliqué plus loin. Compte tenu de cette répartition, l'extinction de fluorescence des fluorophores est faible.
Les fluorophores utilisés dans le cadre de l'invention présentent un certain nombre de caractéristiques permettant d'obtenir les propriétés souhaitées. Les fluorophores utilisés sont hydrosolubles, présentent, lorsqu'ils sont libres en solution aqueuse, un coefficient d'extinction molaire supérieur à 1000 M"1. cm"1, de préférence supérieur à 5000 M4Xm"1, et un rendement quantique supérieur à 0,3, de préférence supérieur à 0,6. De plus, les fluorophores sélectionnés forment peu d'auto- associations en solution aqueuse, de façon à encore diminuer l'extinction de fluorescence. Préférentiellement, les fluorophores sélectionnés ne formeront pas d'auto-association dans l'eau, jusqu'à une concentration de 10"4 mol/1, de préférence jusqu'à une concentration de 10"3 mol/1.
La solubilité en phase aqueuse du polymère selon l'invention résulte, d'une part, du caractère hydrosoluble des fluorophores et, d'autre part, de la présence dans la chaîne polymère d'entités monomères hydrophiles. La solubilité du polymère pourra bien entendu être liée au pH ou à la force ionique de la solution aqueuse dans laquelle il est dissous. En particulier, les polymères selon l'invention seront solubles dans une solution aqueuse présentant un pH compris entre 5 et 10. En particulier, les fluorophores utilisés sont porteurs de groupes polaires ou ionisables, qui les rendent hydrosolubles. Des fluorophores ionisables en solution aqueuse seront de préférence utilisés.
Les polymères non-ioniques, dont la solubilité ne dépend pas du pH, constituent une variante préférée, pour certaines applications. Par ailleurs, de façon avantageuse, la partie fluorescente des fluorophores est éloignée du polymère par un bras espaceur comportant au moins un enchaînement -CH2-CH2-. C'est-à-dire que l'entité émettrice de fluorescence est séparée de la chaîne polymère par au moins deux atomes successifs.
De façon préférée, le polymère présente moins de 2,4 Kg/mol, de préférence moins de 2 Kg/mol de polymère par fluorophore.
Selon un de ses aspects préférés, l'invention a pour objet un polymère soluble en phase aqueuse, porteur d'au moins 5 fluorophores, tels que précédemment définis, lesdits fluorophores présentant un rendement quantique de fluorescence relatif important, c'est-à-dire supérieur ou égal à 0,7, de préférence au moins égal à 0,75. De façon avantageuse, les fluorophores utilisés seront insensibles aux variations de pH, et/ou thermostables et/ou photostables. On peut néanmoins envisager d'utiliser des fluorophores sensibles à l'environnement tel que le pH ou la température, ou capables de faire du transfert d'énergie de fluorescence.
De façon préférée, les fluorophores utilisés sont tous identiques. A titre d'exemples de fluorophores pouvant être utilisés dans le cadre de l'invention, on peut citer les fluorophores suivants:
- le N-(5-aminopentyl)-4-amino-3,6-disulfo-l,8-naphthalimide, dont le sel de dipotassium de formule :
est commercialisé sous le nom de Lucifer Yellow par Molecular Probes ; le 3,6-diamino-9~(2-méthoxycarbonyl)phényle, dont le chlorhydrate de formule :
est commercialisé sous le nom de Rhodamine 123 ;
- le 9-(2,4-disulfophényl)-2,3,6,7,12,13,16,17-octahydro-lH,5H,l 1H.15H- xanthéno[2,3,4-ij :5,6,7-i'j']diquinolizin-l 8-ium,
commercialisé sous le nom de Sulforhodamine B ;
- le 9-(2,4-disulfophényl)-3,6-bis(éthylamino)-2,7-diméthyl-xanthylium, dont le sel de sodium de formule :
est commercialisé sous le nom de Sulforhodamine G ;
- le 3,6-bis(diéthylamino)-9-(2,4-disulfophényl)-xanthylium de formule
commercialisé sous le nom de Sulforhodamine 101, ainsi que leurs dérivés.
En particulier, le N-(5-aminopentyl)-4-amino-3,6-disulfo-l,8-naphthalimide est un fluorophore particulièrement préféré. Ce fluorophore est particulièrement avantageux, car en plus d'être hydrosoluble, non sensible au pH, de ne pas former d'auto-association jusqu'à une concentration de 10"3 mol/L en solution aqueuse, de présenter une fonction -NH2 aliphatique assurant sa liaison covalente avec le polymère, il présente d'une part un bras espaceur -(CH2)5- qui permet d'éloigner la partie fluorescente du squelette polymère et d'autre part une longueur d'onde d'émission de 531 irai, proche de la longueur d'onde d'émission de la fluorescéine, ce qui implique que les filtres habituellement utilisés pour la fluorescéine vont être directement utilisables.
De préférence, les fluorophores sont tous identiques et sont le N-(5- aminopentyl)-4-amino-3,6-disulfo-l ,8-naphthalimide.
En utilisant de tels fluorophores, l'introduction d'un nombre croissant de ces fluorophores le long de la chaîne polymère, conduit à une augmentation quasi- linéaire de l'intensité de fluorescence.
Il est également possible d'introduire différents fluorophores, en proportions définies, le polymère pouvant alors servir, par exemple, à établir un code d'identification de la chaîne polymère. Par exemple, l'immobilisation covalente de 2 ou 3 fluorophores différents tels que définis précédemment, sur la même chaîne polymère et en proportions définies, pourra servir à établir un code d'identification de la chaîne polymère dans la mesure où les fluorophores choisis ont une longueur d'onde maximale d'émission suffisamment distincte. Afin de limiter les phénomènes d'auto-associations et d'inter-associations, on veillera à choisir des fluorophores porteur de groupes ionisés du même signe (cationiques ou anioniques). Ainsi, par exemple, en couplant 3 fluorophores différents sur le polymère et en faisant varier la proportion de chacun de n" = 1 à 5 (n" entier), il existera 125 combinaisons possibles de marquage des chaînes polymères.
De façon avantageuse, les polymères selon l'invention sont obtenus en utilisant une technique de polymérisation radicalaire contrôlée (K. Matyjazewski, Controlled
Radical Polymerization, American Chemical Society Symposium Séries, 768,
Washington DC, USA, 2000) ou ionique vivante (G. Odian, Principles of Polymerization, Third édition, Wiley-Interscience Publication, 1991).
Ces techniques de polymérisation permettent de contrôler l' architecture des polymères obtenus et donc de synthétiser des polymères aux caractéristiques macromoléculaires (masse molaire, indice de polymolécularité et architecture des chaînes) bien définies. En particulier, ces techniques permettent de contrôler la masse molaire des polymères obtenus, masse molaire qui est tout à fait prédictible, et d'obtenir des polymères très homogènes en taille et, en particulier, qui présentent un indice de polymolécularité inférieur à 1,5, et de préférence inférieur à 1,3. De plus, le nombre de fluorophores par chaîne est également très homogène.
Par ailleurs, ces différentes techniques de polymérisation contrôlée permettent d'obtenir aux extrémités du polymère au moins une fonction réactive, qui va pouvoir servir d'entité de fixation pour un composé d'intérêt, et notamment, un ligand biologique. Dans ce cas, les polymères selon l'invention constituent des outils biologiques, particulièrement intéressants.
Dans le cadre de l'invention, les techniques de polymérisation radicalaire contrôlée, plus faciles à mettre en œuvre, sont préférées.
La polymérisation radicalaire comporte trois étapes : l'amorçage (création de radicaux libres et réaction avec la première unité de monomère), la propagation (additions successives d'unités monomères sur la chaîne en croissance ((macro)radical)) et la terminaison (arrêt de la chaîne) par couplage ou dismutation entre deux chaînes en croissance ou par transfert d'un proton sur une chaîne en croissance. Les réactions de terminaison et de transfert affectant les (macro)radicaux sont responsables de la perte de contrôle de la polymérisation (chaînes polymères de masse non prévisible, polymolécularité élevée). Pour obtenir une polymérisation radicalaire contrôlée, il convient donc de réduire fortement ces réactions de terminaison et de transfert irréversible. Le principe général consiste à désactiver de façon réversible les centres actifs en formant des espèces dormantes (non réactives), afin d'avoir une très faible concentration en (macro)radicaux dans le milieu tout au long de la polymérisation (K. Matyjazewski, Controlled Radical Polymerization, American Chemical Society Symposium Séries, 768, Washington DC, USA, 2000).
Deux types de désactivation des (macro)radicaux permettant d'obtenir une polymérisation radicalaire contrôlée ont été mis au point récemment :
- par terminaison réversible, soit par couplage avec un nitroxyde (radical stable) généralement appelé procédé SFRP (Stable Free Radical Polymérisation)
(Solomon D. et al, 1985, Chem. Abstr., 1985,102, 221-335), soit par couplage avec un atome d'halogène généralement appelé procédé ATRP (Atom Transfer Radical Polymérisation) (Wang J. S. et al, 1995, Macromol., 28,7901) et
- par transfert réversible de chaîne, procédé utilisant un agent de transfert incluant, le plus souvent, le motif suivant :
... -C-S-... s
Un exemple d'un tel procédé de polymérisation radicalaire contrôlée utilisant un agent de transfert réversible de chaîne organosoufré est le procédé RAFT (Réversible Addition Fragmentation chain Transfer) tel que notamment décrit dans la demande de brevet WO98/01478 où l'agent de transfert de chaîne est un dithioester. La demande de brevet WO99/31144, quant à elle, décrit le procédé de polymérisation RAFT dans lequel l'agent de transfert est choisi parmi les xanthates et les dithiocarbamates. Depuis, d'autres agents de transfert organosoufrés ont été décrits : soit des xanthates, comme décrit notamment dans les demandes de brevet WO00/75207, WO01/42312 et FR 2 809 829, soit des dithiocarbamates, comme décrit notamment dans les demandes de brevet WO99/35177, FR 2 809 829, soit des trithiocarbonates, comme décrit notamment dans les demandes de brevet W098/58974, WO01/60792, WO02/070571, WO 03/066685, soit des thioétherthiones, comme décrit notamment dans la demande de brevet FR 2 794 464, soit des dithiocarbazates, comme décrit notamment dans les brevets US 6,380,335 et US 6,395,850, soit des dithiophosphoroesters comme décrit notamment dans la demande de brevet FR 2 812 293, soit des tétrathiophosphates comme décrit notamment dans la demande de brevet FR 2 816 311.
Dans le cadre de l'invention, la technique RAFT sera, de préférence, utilisée, car elle est notamment applicable à n'importe quelle famille de monomères, contrairement au procédé SFRP, non applicable à ce jour à la famille des méthacrylates, et à l'ATRP difficilement applicable aux dérivés d'acrylamide. De plus, la technique RAFT ne fait pas intervenir de métaux, contrairement au procédé ATRP pour lequel les résidus métalliques, même en quantité très faible, peuvent être une contre-indication pour les applications biomédicales.
Enfin, la technique RAFT permet d'introduire un composé d'intérêt, notamment, via une entité de fixation, soit en début (extrémité α), soit en fin de chaîne (extrémité ω) du polymère, contrairement au procédé ATRP qui ne permet une introduction aisée qu'en début de chaîne via la molécule amorceur de polymérisation.
Le procédé de polymérisation RAFT avec un agent de transfert réversible de chaîne est réalisé, selon des techniques classiques bien connues de l'homme de l'art, à partir de monomères identiques ou différents, en présence d'une source de radicaux amorceurs. Les réactions de polymérisation radicalaire contrôlée sont, généralement, réalisées à partir de un ou plusieurs monomères éthyléniquement insaturés. On pourra se référer pour les conditions de polymérisation aux documents de l'art antérieur précédemment cités et à WO 2004/055060 notamment.
Dans la mesure où les monomères utilisés sont identiques, la polymérisation conduit à des polymères de type homopolymère. Dans le cas contraire, elle conduit à des polymères de type copolymère, de façon à obtenir, au final, dans le cadre de l'invention, soit des copolymères statistiques, par exemple alternés, soit des copolymères à blocs, au moins un des blocs étant un copolymère statistique. On utilisera, avantageusement, pour les applications en biochimie, thérapeutique et diagnostic notamment, des polymères biocompatibles, c'est-à-dire qui ne perturbent pas les propriétés biologiques du ligand biologique fixé sur le polymère, en terme de reconnaissance moléculaire. La polymérisation peut être réalisée selon différentes voies.
La première voie consiste à utiliser un monomère Bl fonctionnalisé porteur d'une fonction réactive Xl, éventuellement sous forme protégée. On effectue alors, soit une réaction d'homopolymérisation de ce monomère Bl, soit une réaction de copolymérisation de Bl avec un monomère B2 hydrophile à l'exception des monomères saccharidiques hydrophiles non protégés, ou bien avec un monomère B2' qui, après traitement, peut conduire à une entité hydrophile.
Par monomère hydrophile, on entend un monomère dont le polymère présente en phase aqueuse une structure déployée, correspondant à un coefficient de Mark- Houwink Sakurada supérieur ou égal à 0,5. Dans le cas du procédé RAFT, le monomère hydrophile est, par exemple, choisi parmi les dérivés hydrophiles d'acrylate, de méthacrylate, d'acrylamide, de méthacrylamide et de N- vinylpyrrolidone, les monomères saccharidiques non protégés et leurs dérivés. La N- vinylpyrrolidone (ΝVP), le N,N-diméthylacrylamide et la N-acryloylmorpholine (ΝAM) sont préférés dans le cadre de l'invention.
Par monomère hydrophobe, on entend un monomère non hydrophile. A titre d'exemple de monomère hydrophobe, on peut citer les dérivés hydrophobes de méthacrylate, d'acrylate, d'acrylamide, de méthacrylamide, du styrène, avantageusement Pacrylate de n-butyle, Pacrylate de t-butyle, le t-butylacrylamide et le styrène.
En tant que monomère qui, après traitement, peut conduire à une entité hydrophile, on peut choisir un monomère sous forme protégée, tel que les monomères saccharidiques protégés, par exemple le l,2:3,4-di-<9-isopropylidène-6- O-(2-vinyloxyethyl)-α-D-galactopyranose polymérisable par polymérisation cationique vivante, le 6-0-acryloyl-l,2:3,4-di-O-isopropylidène-α-D- galactopyranose, le 6-O-acryloylamino-6-désoxy-l,2:3,4-di-O-isopropylidène-α-D- galactopyranose, le 6-O-(8-acryloylamino-3,6-dioxaoctyl)-l ,2:3,4-di-O- isopropylidène-α-D-galactopyranose, ces trois monomères étant polymérisables par polymérisation radicalaire contrôlée, notamment par le procédé RAFT. Après polymérisation, un traitement approprié permettra de déprotéger les entités saccharidiques, de manière à obtenir des entités hydrophiles.
Un monomère hydrophobe porteur d'une fonction réactive, peut, également, après désactivation de la fonction réactive ou après couplage de cette dernière avec une molécule hydrosoluble, conduire à une entité hydrophile. A titre d'exemple de tels monomères, on peut citer le N-acryloxysuccinimide, le Ν-méthacryloxysuccinimide, l'anhydride maléïque et plus particulièrement, le N-acryloxysuccinimide (ΝAS). Le monomère Bl, qui est porteur d'une fonction réactive Xl, éventuellement sous forme protégée, peut être un monomère hydrophile ou hydrophobe. Bien entendu, ce monomère doit être polymérisable avec la technique de polymérisation sélectionnée. La fonction réactive Xl doit être susceptible de réagir avec une fonction réactive X2 portée par le fluorophore ou le bras espaceur que l'on souhaite greffer. La fonction réactive Xl est choisie, à titre d'exemple, parmi les groupements aminé, hydrazine, hydrazone, azide, isocyanate, isothiocyanate, alcoxyamine, aldéhyde (éventuellement un aldéhyde masqué, comme dans le cas des monomères saccharidiques), époxy, nitrile, maléïmide, halogénoalkyle, hydroxy, thiol, anhydride, acide carboxylique activé sous forme d'ester de N-hydroxysuccinimide, de pentachlorophényle, de trichlorophényle, de p-nitrophényle, de carboxyphényle. De préférence, la fonction réactive Xl est choisie parmi les fonctions aminé, aldéhyde, anhydride, ou acide carboxylique activé sous forme d'ester de N-hydroxysuccinimide. Lorsque le fluorophore est porteur d'une fonction aminé primaire, la fonction Xl sera avantageusement de type ester activé, aldéhyde, ou anhydride. L'utilisation d'un monomère porteur d'une fonction réactive Xl, vis-à-vis d'une fonction X2 portée par le fluorophore (ou le bras espaceur) que l'on souhaite fixer, permet d'effectuer un couplage direct du fluorophore (ou du bras espaceur) sur les fonctions réactives du polymère, en obtenant une liaison covalente stable.
En tant que monomère Bl hydrophile porteur d'une fonction réactive Xl, on peut citer le méthacrylate de 2-hydroxyéthyle, le méthacrylate de 2-aminoéthyle, Pacrylate de 2-hydroxyéthyle, Pacrylate de 2-aminoéthyle et les monomères saccharidiques, tels que le 6-0-(2-vinyloxyéthyl)-α-D-galactopyranose polymérisable par polymérisation cationique vivante, le 6-Oacryloyl-α-D- galactopyranose, le 6-O-acryloylamino-6-désoxy-α-D-galactopyranose, le 6-O(8- acryloylamino-3,6-dioxaoctyl)-α-D-galactopyranose, ces trois monomères étant polymérisables par polymérisation radicalaire contrôlée, notamment par le procédé RAFT. En tant que monomère Bl hydrophobe porteur d'une fonction réactive Xl, on peut citer le N-acryloxysuccinimide, le Ν-méthacryloxysuccinimide, l'anhydride maléïque et, de préférence, le N-acryloxysuccinimide (ΝAS).
Il est également possible que le monomère Bl soit porteur d'une fonction réactive XI sous forme protégée. C'est, par exemple, le cas des monomères saccharidiques protégés tels que définis ci-dessus.
Bien entendu, les monomères Bl, B2, B2' sont choisis en fonction de la technique de polymérisation sélectionnée. Après polymérisation, une réaction de couplage du fluorophore sur les fonctions réactives Xl est réalisée, de façon à immobiliser le nombre de fluorophores désirés sur le polymère. Dans le cas où les fonctions réactives Xl se trouvent sous forme protégée, la réaction de couplage sera précédée d'une réaction de déprotection appropriée. De façon avantageuse, le couplage des fluorophores est réalisé de façon à ce que la partie fluorescente des fluorophores soit éloignée du polymère par un bras espaceur comportant au moins un enchaînement -CH2-CH2-. Aussi, dans ce cas, soit le fluorophore comprend un bras espaceur et est porteur d'une fonction X2 et est donc directement couplé avec la fonction réactive Xl, soit le fluorophore utilisé ne comporte pas de bras espaceur ou n'est pas porteur de la fonction réactive X2, dans ce cas, le fluorophore sera modifié pour inclure le bras espaceur, si nécessaire, et la fonction réactive X2. Il peut également être prévu d'effectuer le couplage en deux étapes, une première consistant à coupler un bras espaceur sur la fonction réactive Xl, la deuxième consistant à coupler le fluorophore sur le bras espaceur. La fonction réactive X2, située à l'extrémité du fluorophore ou du bras espaceur, susceptible de réagir avec la fonction Xl est, de préférence, une fonction aminé primaire ou secondaire. Dans ce cas, par réaction sur une fonction Xl de type ester activé, on obtient une fonction amide particulièrement stable, de sorte que les polymères fluorescents obtenus seront chimiquement stables. Bien entendu, le monomère B2' est, de préférence, porteur d'une fonction réactives Xl ' sous forme protégée pour éviter, après polymérisation, des réactions compétitives de couplage du fluorophore sur les monomères Bl et B2'. Dans le cas où B2' est porteur de fonctions réactives Xl' sous forme protégée, la réaction de déprotection de ces fonctions est réalisée seulement après couplage des fonctions X2 portées par le fluorophore ou le bras espaceur, sur les fonctions Xl présentes sur le polymère (provenant du monomère Bl) et masquage des fonctions Xl résiduelles.
La répartition des fluorophores le long de la chaîne polymère est obtenue d'une part, par le fait que le couplage se fait de façon statistique sur les fonctions réactives Xl présentes sur le polymère et d'autre part, dans la cas où une copolymérisation est mise en oeuvre, par l'obtention d'un copolymère statistique.
Après couplage du nombre de fluorophores désiré sur le polymère, qui viennent donc, dans tous les cas, se répartir le long du polymère, il reste le plus souvent des fonctions réactives sur le polymère. Dans certains cas, il est nécessaire d'effectuer un traitement supplémentaire pour rendre hydrophiles les entités non porteuses du fluorophore. C'est, en particulier, le cas quand une homopolymérisation avec un monomère Bl hydrophobe a été réalisée. Selon une variante préférée du procédé de l'invention, on réalise alors une réaction de masquage des fonctions réactives résiduelles, soit par désactivation (par exemple une hydrolyse), soit par couplage avec un composé hydrosoluble non-fluorescent, ce qui permet, d'une part, d'éliminer les fonctions réactives résiduelles le long de la chaîne polymère et, d'autre part, d'apporter une hydrophilie supplémentaire au polymère. Dans le cas où la fonction réactive est un anhydride ou un acide carboxylique activé sous forme d'ester de N-hydroxysuccinimide, par exemple, on pourra utiliser un excès d'une aminé hydrosoluble, telle que l'aminoéthylmorpholine.
La polymérisation sera, de préférence, réalisée entre un monomère porteur d'une fonction réactive Xl, éventuellement sous forme protégée, et un monomère hydrophile. En particulier, entre : - un monomère Bl hydrophobe porteur d'une fonction réactive, tel que le N- acryloxysuccinimide, le Ν-méthacryloxysuccinimide, l'anhydride maléïque et de préférence, le N-acryloxysuccinimide (ΝAS),
- et un monomère hydrophile, tel que les dérivés hydrophiles d'acrylate, de méthacrylate, d'acrylamide, de méthacrylamide et de Ν-vinylpyrrolidone, et de préférence la N-vinylpyrrolidone (ΝVP), le N,N-diméthylacrylamide et la
N-acryloylmorpholine (ΝAM). ce qui ne nécessite aucune réaction de déprotection des fonctions réactives Xl et permet d'obtenir un polymère présentant une hydrophilie satisfaisante, après traitement des éventuelles fonctions réactives Xl restantes après couplage des fluorophores.
Une autre variante préférée consiste à réaliser une réaction d'homopolymérisation d'un sucre protégé, par exemple le l,2:3,4-di-0- isopropylidène-6-O-(2-vinyloxyethyl)-α-D-galactopyranose polymérisable par polymérisation cationique vivante, le 6-0-acryloyl-l,2:3,4-di-0-isopropylidène-α-D- galactopyranose, le 6-O-acryloylamino-6-désoxy-l ,2:3,4-di-O-isopropylidène-α-D- galactopyranose, le 6-<9-(8-acryloylamino-3,6-dioxaoctyl)-l ,2:3,4-di-0- isopropylidène-α-D-galactopyranose, ces trois monomères étant polymérisables par polymérisation radicalaire contrôlée, notamment par le procédé RAFT. Après polymérisation, les entités saccharidiques seront déprotégées pour permettre le couplage des fluorophores.
Une seconde voie qui peut également être envisagée, bien qu'elle ne soit pas préférée, est d'effectuer le couplage du fluorophore (ou du bras espaceur) sur le monomère Bl porteur de la fonction Xl et de réaliser la polymérisation avec ce nouveau monomère porteur du fluorophore. Cette voie consiste donc à utiliser un monomère B3 déjà porteur d'un fluorophore. On effectue alors une réaction de copolymérisation de ce monomère B3 avec un autre monomère B4 hydrophile, ou bien un monomère B4' qui, après traitement, peut conduire à une entité hydrophile. Le monomère B3 est, soit commercial, soit obtenu à partir d'un monomère Bl décrit ci-dessus, par couplage, comme décrit précédemment, d'une fonction X2 portée par le fluorophore ou le bras espaceur, sur la fonction réactive Xl du monomère Bl. Dans le cas où le monomère Bl est porteur d'une fonction réactive protégée, celle-ci sera bien entendu préalablement déprotégée. De préférence, les monomères B4 et B4' correspondent, respectivement, aux monomères hydrophiles (B2), et aux monomères qui, après traitement, peuvent conduire à une entité hydrophile (B2'), précédemment cités. On utilisera de préférence un monomère B4 hydrophile.
Dans le cas où un monomère B4' est utilisé, un traitement visant à rendre hydrophile l'entité résultante, comme décrit précédemment, sera mis en œuvre après polymérisation.
Dans tous les cas, il faudra ajuster la quantité de monomère fonctionnalisé Bl (réactif) ou B3 (fluorescent) pour disposer, au final, de suffisamment de fluorophores sur le polymère (au moins 5, de préférence au moins 10). Dans le cas où une réaction de copolymérisation est mise en œuvre, l'homme du métier choisira le type de fonctions polymérisables des deux monomères mis en jeu, de telle sorte que la copolymérisation s'effectue de façon statistique, et qu'ainsi les fluorophores ou les fonctions réactives Xl soient réparties sur le polymère. Dans le cas où la polymérisation a été réalisée par le procédé RAFT, avec un agent de transfert du type R"-S-C(S)-Z", le polymère présente à son extrémité ω, la fonction -S-C(S)-Z" terminale et à son extrémité α le groupe R". L'étape de couplage d'un fluorophore aminé, comportant éventuellement un bras espaceur, ou ultérieurement l'étape de masquage avec un dérivé aminé, va entraîner la transformation de la fonction -S-C(S)-Z" en une fonction thiol (-SH), qui va éventuellement permettre le greffage ultérieur d'un composé d'intérêt porteur d'une fonction apte à réagir avec cette fonction thiol, par exemple une fonction maléïmide ou iodoacétamide. Selon une autre variante du procédé de l'invention, il est également possible de réaliser une polymérisation RAFT avec un agent de transfert réversible de chaîne, déjà porteur d'un composé d'intérêt. En effet, lorsque l'agent de transfert répond à la formule R"-S-C(S)-Z", le procédé RAFT permet la synthèse de chaînes polymères de longueur contrôlée, et possédant à chacune de leurs extrémités, les groupements -R" et -S-C(S)-Z" provenant de l'agent de transfert de chaîne utilisé. On peut donc envisager de se servir de cet agent de transfert pour introduire sélectivement et quantitativement des composés d'intérêt à l'extrémité α de chaque chaîne polymère. En particulier, on pourra utiliser des agents de transfert déjà porteurs d'un composé d'intérêt, tels que des agents de transfert réversible de chaîne (II) pour polymérisation RAFT, appartenant à la famille des dithioesters, des xanthates ou des trithiocarbonates, qui comprennent un groupement de formule :
S dans lequel R' comprend au moins une fonction -amide-L, avec L choisi parmi les ligands biologiques, les mono- ou disaccharides, les lipides, les colorants, les molécules fluorescentes, les chaînes polymères et les supports solides. En particulier, la fonction -amide-L correspond à une fonction :
Λ
II ^X O avec X qui représente un atome d'hydrogène, un groupe éventuellement substitué choisi parmi les suivants : alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, ou bien une liaison covalente, de façon à former un cycle aminé avec le composé L, et L qui est tel que défini ci-dessus.
De façon avantageuse, le groupe -R' des agents de transfert (II) est choisi parmi les groupes suivants : alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, hétéroaralkyle, alkylhétéroaryle, cycloalkylalkyle, hétérocycloalkylalkyle, alkylcycloalkyle, alkylhétérocycloalkyle, ou une chaîne polymère, et ledit groupe étant, d'une part, porteur d'au moins une fonction :
avec X et L tels que précédemment définis et, d'autre part, éventuellement substitué par un ou plusieurs autres substituants.
Les agents de transfert de chaîne réversible organosoufré décrits dans l'art antérieur possèdent le motif suivant : Z C-S-... s
Le groupe Z des agents de transfert (II) est avantageusement choisi pour que l'agent de transfert appartienne à la famille des dithioesters (Z comportant un atome de H, C,
P, ou halogène lié au thiocarbonyle du groupe )} comme décrit dans la demande de brevet WO98/01478, des xanthates, également nommés dithiocarbonates
(Z comportant un atome d'oxygène lié au thiocarbonyle du groupe ), comme décrit notamment dans les demandes de brevet WO98/58974, WO99/31144, WO00/75207 (dans lesquels le groupe Z est substitué par au moins un atome de chlore, brome ou fluor), WO01/42312 et FR 2 809 829, ou des trithiocarbonates (Z
— C-S-
II comportant un atome de soufre lié au thiocarbonyle du groupe ), également nommés trithioesters, comme décrit notamment dans les demandes de brevet WO98/58974, WO01/60792, WO02/07057, WO 03/066685. De façon avantageuse, on utilisera les composés de formule (lia), (Ilb) ou
(Ile) : Z-C-S-R1 (lia)
S
dans laquelle :
- Z représente un atome d'hydrogène, un atome de chlore, -COOH, -CN, ou un groupe choisi parmi les groupes suivants, éventuellement substitués : alkyle, cycloalkyle, aryle, hétérocycloalkyle, hétéroaryle, -ORa, -SRa, -COORa, -O2CRa, -CONRaRb, -CONHRa, -P(O)ORaRb, -P(O)RaRb, -0-CRcRd-P(O)(ORa)(ORb), -S-CReRf-COOH, -0-CReRf-COOH ou une chaîne polymère,
- Z' est un dérivé d'un alkyle éventuellement substitué, d'un aryle éventuellement substitué ou d'une chaîne polymère, sa liaison avec les groupes carbonylthio, se faisant par un carbone aliphatique, un carbone aromatique ou un atome de soufre, ou d'oxygène,
- R' est choisi parmi les groupes suivants : alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, hétéroaralkyle, alkylhétéroaryle, cycloalkylalkyle, hétérocycloalkylalkyle, alkylcycloalkyle, alkylhétérocycloalkyle, ou une chaîne polymère, et ledit groupe étant, d'une part, porteur d'au moins une fonction :
et, d'autre part, éventuellement substitué par un ou plusieurs autres substituants,
- X représente un atome d'hydrogène, un groupe éventuellement substitué choisi parmi les suivants : alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, ou bien une liaison covalente, de façon à former un cycle aminé avec le composé L,
- p est un entier supérieur à 1,
- Ra et Rb représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un groupe éventuellement substitué choisi parmi les suivants : alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle,
- Rc et Rd représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou d'halogène, un groupe -NO2, -SO3H, -SO3Rg, -NCO, -CN, -Rg, -OH, -ORg, -SH, -SRg, -NH2, -NHRg, -NRgRh, -COOH, -COORg, -O2CRg, -CONH2, -CONHRg, -CONRgRh, -NHCORg, -NRgCORh, CmF2m+1 avec m compris entre 1 et 20, de préférence égal à 1,
- Re et Rf représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un groupe alkyle ou aryle éventuellement substitué,
- Rg et Rh représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un groupe éventuellement substitué choisi parmi les suivants : alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle,
- L est tel que défini pour (II).
En fait, R' représente un groupe
dans lequel
- A réprésente un groupe, éventuellement substitué, choisi parmi les suivants : alkyle , alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, hétéroaralkyle, alkylhétéroaryle, cycloalkylalkyle, hétérocycloalkylalkyle, alkylcycloalkyle, alkylhétérocycloalkyle, ou une chaîne polymère,
- L et X sont tels que définis précédemment, et
- n est un entier supérieur ou égal à 1, de préférence égal à 1.
Les composés de formule (lia) et, en particulier, ceux dans lesquels R' est porteur d'une seule fonction:
sont préférés.
Par ailleurs, R' présente avantageusement, dans les composés de formule (II),
(lia), (Ilb) et (Ile), un atome de carbone secondaire ou tertiaire, situé en alpha de l'atome de soufre. De façon avantageuse, le groupe A du groupe R' est une chaîne aliphatique, ramifiée, éventuellement substituée, présentant un atome de carbone secondaire ou tertiaire, en alpha de l'atome de soufre.
De façon avantageuse, Z représente un groupe choisi parmi : alkyle, cycloalkyle , aryle, -ORa, et -SRa, lesdits groupes étant éventuellement substitués et Ra étant tel que défini précédemment pour (lia), (Ilb) et (Ile). Ces agents de transfert (II), (lia), (Ilb) et (Ile) sont obtenus par couplage d'agents de transfert (I) correspondants porteurs d'au moins une fonction ester activé, avec un composé aminé d'intérêt. Les agents de transfert réversible de chaîne (I), sont de type dithioester, xanthate, ou trithiocarbonate, pour polymérisation RAFT, modifiés pour comporter au moins une fonction ester activé qui est beaucoup plus réactive que la fonction -C(=S)S-, vis-à-vis d'un composé d'intérêt porteur d'une fonction nucléophile, par exemple une fonction aminé. Un tel agent de transfert (I) est porteur d'une fonction ester activé, -C(O)OY, dans laquelle Y est avantageusement choisi, de façon à ce que, lorsque l'agent de transfert est mis en présence d'une fonction nucléophile de type aminé, la fonction ester activé réagisse avec cette dernière, préférentiellement à la fonction -C(=S)S-.
La notion d'ester activé est bien connue de l'homme de l'art. Une fonction ester activé peut être définie comme un ester dont la partie « alcool » est un bon groupe partant vis-à-vis de réactions de substitutions nucléophiles, c'est-à-dire un groupe partant qui permet d'effectuer une réaction de substitution nucléophile entre 0 et 100° C, préférentiellement entre 0 et 60° C, plus préférentiellement entre 0 et 4O0C. De tels esters activés ont, par exemple, été décrits par W. Anderson et al, dans American Society, 1964, 46, 1839-1842 et par R. Arshady dans Advances in Polymer Science, 1994, 111, 1-41.
Par conséquent, l'utilisation d'un tel agent de transfert autorise le couplage en une seule étape de composés d'intérêt porteurs d'une fonction réactive vis-à-vis de cet ester activé, sans que la fonction -C(=S)S- ne soit affectée. La fonctionnalisation peut donc être effectuée, en faisant réagir un composé d'intérêt comportant une fonction nucléophile, et en particulier une fonction aminé primaire, secondaire, ou encore une fonction ammonium qui permettra de générer in situ une fonction aminé réactive, sur la fonction ester activé. Cette réaction de couplage est facile, rapide, quantitative et en une seule étape, ce qui permet d'obtenir une liaison avec le composé d'intérêt, avec un rendement très élevé (proche de 100%). De plus, le couplage fonction amine/ester activé conduit à une liaison de type amide, ce qui en fait un composé très stable par rapport, notamment à une fonction de type ester plus fragile et hydrolysable, obtenue dans l'art antérieur (Stenzel et al, dans J. Mater. Chem. 2003, 13, 2090 et Chen étal, dans Chem. Comm. 2002 , 2276-2277).
De tels agents de transfert (I) appartiennent à la famille des dithioesters, des xanthates, ou des trithiocarbonates et comprennent un groupe de formule :
dans lequel R est un groupe qui comprend une fonction ester activé. En particulier, ce groupe R comporte au moins une fonction ester activé -C(O)OY, -OY étant un groupe partant, Y étant, par exemple, choisi parmi les groupes suivants : N-succinimidyle, 1-benzotriazole, pentachlophényle, 2,4,5-trichlorophényle, 4-nitrophényle, 3-pyridyle, 2-méthoxycarbonylphényle, N-phtalimidyle, et 2-carboxyphényle. De façon préférée, Y est le groupe N-succinimidyle :
A part cette particularité, tout type de groupement R décrit dans l'art antérieur peut être utilisé ; il sera choisi en fonction du groupe R' que l'on souhaite obtenir.
En particulier, ces agents de transfert de chaîne (I) comprennent un groupe R qui est choisi parmi les groupes suivants : alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, hétéroaralkyle, alkylhétéroaryle, cycloalkylalkyle, hétérocycloalkylalkyle, alkylcycloalkyle, alkylhétérocycloalkyle, ou une chaîne polymère, et ledit groupe étant porteur d'au moins une fonction ester activé telle que précédemment définie et étant éventuellement substitué par un ou plusieurs autres substituants.
Quand l'ester activé est -C(O)-OY5 R représente un groupe -A-(-C(O)-OY)n dans lequel : - A représente un groupe, éventuellement substitué, choisi parmi les suivants : alkyle , alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, hétéroaralkyle, alkylhétéroaryle, cycloalkylalkyle, hétérocycloalkylalkyle, alkylcycloalkyle, alkylhétérocycloalkyle, ou une chaîne polymère, - Y est tel que défini ci-dessus et ,
- n est un entier supérieur ou égal à 1, de préférence égal à 1.
En particulier, on utilisera des agents de transfert de formule (Ia), (Ib) ou (Ic)
Z-C-S-R (Ia)
S
(Z-C-S-)-R (Ic)
S dans laquelle :
- Z représente un atome d'hydrogène, un atome de chlore, -COOH, -CN, ou un groupe choisi parmi les groupes suivants, éventuellement substitués : alkyle, cycloalkyle , aryle, hétérocycloalkyle, hétéroaryle, -ORa, -SRa, -COORa, -O2CRa, -CONRaRb, -CONHRa, -P(O)ORaRb, -P(O)RaRb, -0-CRcRd-P(O)(ORa)(ORb), -0-CReRf-COOH, -S-CReRf-COOH ou une chaîne polymère,
- Z' est un dérivé d'un alkyle éventuellement substitué, d'un aryle éventuellement substitué ou d'une chaîne polymère, sa liaison avec les groupes carbonylthio, se faisant par un carbone aliphatique, un carbone aromatique ou un atome de soufre, ou d'oxygène, - R est choisi parmi les groupes suivants : alkyle , alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, hétéroaralkyle, alkylhétéroaryle, cycloalkylalkyle, hétérocycloalkylalkyle, alkylcycloalkyle, alkylhétérocycloalkyle, ou une chaîne polymère, et ledit groupe étant porteur d'au moins une fonction ester activé telle que précédemment définie et étant éventuellement substitué par un ou plusieurs autres substituants,
- p est un entier supérieur à 1 ,
- Ra et Rb représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un groupe éventuellement substitué choisi parmi les suivants : alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle, - Rc et Rd représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou d'halogène, un groupe -NO2, -SO3H, -SO3Rg, -NCO, -CN, -Rg, -OH, -ORg, -SH, -SRg, -NH2, -NHRg, -NRgRh, -COOH, -COORg, -O2CRg, -CONH2, -CONHRg, -CONRgRh, -NHCORg, -NRgCORh, CmF2m+1 avec m compris entre 1 et 20, de préférence égal à 1,
- Re et Rf représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un groupe alkyle ou aryle éventuellement substitué, - Rg et Rh représentent, chacun indépendamment l'un de l'autre, un groupe éventuellement substitué choisi parmi les suivants : alkyle, alcényle, alcynyle, aryle, hétéroaryle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, aralkyle, alkylaryle.
Les agents de transfert de formule (Ia) sont préférés, et en particulier ceux dans lesquels R est substitué par une seule fonction ester activé. De façon avantageuse, le groupe R des agents de transfert (I), (Ia), (Ib) et (Ic) tels que définis ci-dessus présentent un atome de carbone secondaire ou tertiaire, situé en alpha de l'atome de soufre. En particulier, le groupe A du groupe R est une chaîne aliphatique, ramifiée, présentant un atome de carbone secondaire ou tertiaire, en alpha de l'atome de soufre. De façon avantageuse, Z est choisi parmi les groupes : alkyle, cycloalkyle , aryle, -ORa, et -SRa , lesdits groupes étant éventuellement substitués et Ra étant tel que défini précédemment pour (Ia), (Ib) et (Ic).
A titre d'exemple de composé (Ia), on peut citer le succinimido-6-phényl-6- thioxo-5-thia-4-cyano-4-méthylhexanoate et le succinimido-4-phényl-4-thioxo-3- thia-2-méthylbutanoate.
Les agents de transfert de formule (I), (Ia), (Ib) et (Ic) sont préparés selon des techniques bien connues de l'homme de l'art. Un agent de transfert porteur d'une fonction acide est obtenu par exemple selon la référence Dupont WO98/01478 s'il s'agit d'un dithioester ou d'un trithiocarbonate, ou par exemple selon la référence Rhodia WO98/58974 s'il s'agit d'un dithiocarbonate encore appelé xanthate. Puis, la fonction acide de cet agent de transfert est transformée en fonction « ester activé » par exemple par addition de NHS (N-hydroxysuccinimide) en présence de DCC (dicyclohexylcarbodiimide) .
Le couplage entre la fonction ester activé et un composé porteur d'une fonction nucléophile est effectuée directement sur l'agent de transfert, qui est ensuite utilisé dans la polymérisation RAFT et permet donc la synthèse de polymères fonctionnalisés à leur extrémité α. Le couplage sur l'ester activé, avec un composé d'intérêt (porteur d'une fonction nucléophile) s'effectue donc, de préférence, avant la polymérisation RAFT.
Lorsque Bl est un monomère saccharidique protégé, soit homopolymérisé, soit copolymérisé avec un monomère hydrophile B2 ne portant pas de fonction réactive, il est également possible d'effectuer la polymérisation avec un agent de transfert (I). On procède alors dans l'ordre suivant :
- on effectue la polymérisation RAFT de Bl (homo ou copolymérisation) en présence de l'agent de transfert (I) ; on obtient donc un homopolymère (ou un copolymère) porteur d'au moins une fonction ester activé à son extrémité α,
- on réalise le couplage d'un composé d'intérêt sur la fonction ester activé située à l'extrémité α du polymère (ou du copolymère),
- on déprotège les entités saccharidiques portées par le (co)polymère,
- et on réalise le couplage covalent d'un fluorophore aminé sur les fonctions réactives (aldéhyde) des entités saccharidiques.
Dans le cas où l'agent de transfert porteur de la ou des fonctions ester activé est couplé avec un support solide, on obtient un agent de transfert supporté et la polymérisation RAFT est alors réalisée à partir de cet agent supporté, ce qui est appelé « grafting from polymerization ». Cette fixation permet, ultérieurement, d'obtenir des « brosses » de polymère en surface.
Le composé d'intérêt qu'il soit fixé à l'extrémité ω ou α du polymère sera, de préférence, un ligand biologique. Les ligands biologiques pouvant être fixés sur le polymère de la présente invention sont, par exemple, ceux utilisés dans le domaine du diagnostic dans des tests de détection de molécules cibles, par exemple, ou dans le domaine thérapeutique, notamment pour vectoriser des molécules actives ou des gènes. Dans le cas du diagnostic, pour permettre la détection et/ou la quantification et/ou la purification de la molécule cible, le ligand biologique est capable de former un complexe de capture ligand/anti-ligand. En particulier, ledit anti-ligand pourra constituer la molécule cible. En fonction de la nature de la cible à détecter, l'homme du métier choisira la nature du ligand biologique à fixer sur le polymère. A titre d'exemple, pour la mise en évidence d'une molécule cible de type acide nucléique préalablement capturée sur un support, le ligand biologique peut être une biotine. Dans ce cas, l' anti-ligand sera une streptavidine immobilisée sur la cible via un acide nucléique marqué par une biotine et suffisamment complémentaire de la cible pour s'hybrider spécifiquement en fonction des conditions de réaction et notamment la température ou la salinité du milieu réactionnel. Le polymère fluorescent permet alors directement la détection de la molécule cible.
De nombreuses méthodes pour introduire des fonctions réactives sur un ligand biologique sont disponibles : pour les protéines, antigènes, anticorps ou polypeptides, voir par exemple "Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking", Wong S. S., CRC press, Boca Raton, 1991 ou "Bioconjugate Techniques", Hermanson G. T., Académie Press, San Diego, 1996. Pour les acides nucléiques, on synthétise par exemple un polynucléotide par méthode chimique sur support solide ayant une fonction réactive à un endroit quelconque de la chaîne comme par exemple, l'extrémité 5' ou l'extrémité 3' ou sur une base ou sur un phosphate internucléotidique ou sur la position 2' du sucre (voir Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties édité par S. Agrawal, Humana Press, Totowa, New Jersey). Des méthodes d'introduction de fonctions réactives sur des haptènes sont données notamment dans "Préparation of Antigenic Steroid-Protein Conjugate", F Kohen et al, dans Steroidimmunoassay, Proceedings of the fifth tenovusworkshop, Cardiff, Avril 1974, éd. EHD Cameron, SH.Hillier,K. Griffiths. Par exemple, dans le cas d'un ligand biologique de type protéine possédant une composition en lysine suffisante, les aminés portées par la chaîne latérale de la lysine pourront être utilisées pour le couplage avec la fonction ester activé.
En particulier, il est possible de fixer en tant que composés d'intérêt, toutes molécules qui portent un site de reconnaissance et qui permettront d'induire une réaction de reconnaissance biologique spécifique, et donc d'utiliser les polymères selon l'invention en biologie, notamment dans des tests de diagnostic, notamment des test ELOSA de détection d'une cible d'ADN. Par exemple, une biotine, un sucre, un oligonucléotide, ou encore un lipide qui favorise l'insertion membranaire, pourra être couplé à l'extrémité du polymère. Le polymère fluorescent pourra alors être fixé par une de ses extrémités et de manière spécifique, sur n'importe quel support présentant, en surface, l'entité reconnue par le composé d'intérêt sélectionné (polymère, latex, silice, vésicule lipidique, protéine, cible ADN ou ARN ...). Dans le cas où la molécule d'intérêt est une biotine, le polymère fluorescent pourra être immobilisé sur une surface donnée recouverte de streptavidine.
Les polymères très fluorescents selon l'invention, éventuellement porteurs à leur extrémité d'un composé d'intérêt et, en particulier d'un ligand biologique trouvent également de nombreuses applications, dans l'imagerie par microscopie de fluorescence, par exemple, l'analyse de la communication intercellulaire et des phénomènes d'exclusion de taille comme la perméabilité de membranes. Grâce à l'utilisation d'un fluorophore insensible au pH et d'un polymère également insensible au pH, il sera possible d'étudier des phénomènes à l'intérieur des endosomes (pH = 5,5) où la fluorescéine est inutilisable. De plus, les polymères selon l'invention sont très résistants à la photodégradation, d'où un intérêt pour suivre une cinétique par microscopie de fluorescence, ou bien par microscopie confocale avec balayage laser pour analyser différents niveaux.
Par ailleurs, les polymères très fluorescents selon l'invention, porteurs à leur extrémité d'un composé d'intérêt, pourront être utilisés dans des tests de diagnostic pour amplifier la détection de la capture d'une cible biologique, comme un acide nucléique par exemple. Les polymères selon l'invention pourront également être utilisés pour le marquage de matériaux (polymères, composés hybrides, autres) dans des applications de microscopie optique (confocale, multiphoton, SNOM).
L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples suivants donnés à titre illustratif et non limitatif, en référence à la Figure unique qui montre, de façon comparative, l'évolution dans le temps de l'intensité de fluorescence entre un polymère selon l'invention (poly(N AM-LY)) et un conjugué R-Phycoérythrine- Streptavidine (RPE).
Les réactifs suivants sont utilisés :
Le N-acryloylmorpholine (ΝAM, vendu par ALDRICH, référence 44.827-3) est distillé avant utilisation en polymérisation. Le N-acryloxysuccinimide (ΝAS, vendu par ACROS, référence 40030) est purifié par chromatographie sur colonne de silice avant utilisation en polymérisation. Le dioxane (solvant de polymérisation) (vendu par SDS, référence 27,053-9) est distillé sur LiAlH4 avant utilisation. Le 2,2'-azobis-isobutyronitrile AIBΝ (amorceur de polymérisation) (Fluka, référence 11630) est recristallisé dans l'éthanol.
Le dithiobenzoate de tert-butyle (agent de transfert de chaîne (ATC) de la polymérisation RAFT) est synthétisé selon le procédé décrit par A. Favier et al. dans Macromolecule, 2002, 35, 8271-8280 Le trioxane (référence interne pour le suivi R.M.N. 1H) (JANSSEN-CHIMICA, référence 14.029.61) est utilisé tel quel.
a) Polymérisation RAFT : On réalise une copolymérisation entre le NAM et le NAS, dans le dioxane, en présence d'AIBN et de dithiobenzoate de fert-butyle.
Les différents réactifs sont introduits dans un réacteur de type Schlenk à température ambiante, et le mélange est dégazé par une succession de cycles de congélation/vide/décongélation, puis mis sous azote. Le mélange réactionnel est porté à 90°C et laissé sous agitation pendant 2h. Le polymère obtenu, nommé poly(NAM-st-NAS) est précipité dans l'éther, plusieurs fois si nécessaire, c'est-à-dire jusqu'à élimination totale des monomères résiduels, puis, est récupéré par centrifugation et séché sous vide de la pompe à palettes. Conditions opératoires de la copolymérisation du NAM et du NAS par le procédé RAFT:
- [Monomères]= 1,55 mol.L"1 ([NAM] = 1,24 mol.L"1 et [NAS] = 0,31 mol.L"1)
- [Monomères]/[ATC] = 1022 => Mn visée à 100% de conversion =
- [ATC]/[ AIBN] = 10 - Température = 90°C, polymérisation dans le dioxane sous azote (en présence de trioxane). [a] signifie concentration en réactif a.
Conditions d'analyses par Résonance Magnétique Nucléaire (R.M.N.) 1H : Le suivi cinétique de la consommation des monomères est réalisé par R.M.N. 1H (Résonance Magnétique Nucléaire) avec un spectromètre Bruker AC 200 MHz. Les échantillons à analyser sont préparés en mélangeant 300 μL de chaque prélèvement à 300 μL de solvant deutéré : le CDCl3.
Conditions d'analyses par Chromatoeraphie d'Exclusion Stériaue (C.E.S.) couplée à un détecteur de diffusion dynamique de la lumière (DDL) :
Colonnes : Ultra Hydrogel 500 et 2000 (Waters) ; pompe : Waters 510 ;; détecteur réfractométrique différentiel : Waters 410 ; détecteur Diffusion Dynamique de la Lumière : Trois angles, miniDawn, Wyatt Technology ; éluant : tampon borate 0,05 M5 pH = 9,3 ; débit : 0,5 mL.min K
Caractéristiques du copolymère polv(NAM-st-NAS) obtenu : Les analyses par C.E.S. couplée à un détecteur D.D.L. permettent de déterminer : la masse molaire moyenne en nombre des chaînes polymères formées (Mn) et l'indice de polymolécularité reflétant l'homogénéité des masses des chaînes polymères (Ip). En ce qui concerne la composition molaire en monomères du polymère synthétisé, elle est obtenue par R.M.N. 1H. - Ip = 1,22
- 78,4 % d'unités NAM et 21,6 % d'unités NAS
- soit 383 unités par chaîne polymère, parmi lesquelles 84 sont réactives (NAS)
b) Réaction de couplage du fluorophore sur le copolvmère obtenu par le procédé
RAFT, suivi d'une étape de masquage
Le fluorophore Lucifer Yellow Cadaverine, (N-(5-aminopenthyl)-4-amino-3,6- disulfo-l,8-naphtalimide, sel dipotassique) (LY, vendu par Molecular Probes, référence A- 1340) est utilisé tel quel. La 4-(2-aminoethyl)morpholine (vendu par ALDRICH, référence A5,500-4) est utilisée telle quelle.
Le dimethylformamide (solvant) (vendu par MERCK, référence 822275) est séché sur CaH2 et distillé avant utilisation.
Mode opératoire :
Le polymère poly(NAM-st-NAS) obtenu au paragraphe a) et le fluorophore LY, sont introduits avec le solvant, dans un ballon en verre. Le mélange réactionnel mis sous argon, est porté à 45°C et laissé sous agitation à l'abri de la lumière pendant 96h. La température est diminuée jusqu'à 3O0C et la 4-(2- aminoéthyl)morpholine est introduite dans le milieu réactionnel. Pour s'assurer d'un masquage complet, le mélange réactionnel est laissé pendant 4 jours sous argon, à l'abri de la lumière. Le polymère obtenu, nommé poly(NAM-LY) est précipité dans l'éther à partir d'une solution de dichlorométhane (plusieurs fois), récupéré par centrifugation et séché sous vide de la pompe à palettes. Conditions opératoires de la réaction de couplase du fluorophore et masquage du
- masse de polymère = 0,03 g - masse de LY = 0,0174 g
- volume de 4-(2-aminoéthyl)morpholine = 22 μL (excès : 20 eq/NAS)
- volume de solvant = 4 mL
- Température: couplage = 450C et masquage = 3O0C, réaction sous argon et à l'abri de la lumière.
Conditions d'analyses par Spectroscopie d'Absorption et de Fluorescence La caractérisation du polymère obtenu est réalisée par absorption UV- Vis avec un spectromètre JASCO V-560, et par fluorescence à l'état stationnaire avec un fluorimètre SPEX Fluorolog F112A (largeur de bande de 4,5 nm pour le monochromateur d'excitation et de 2,5 nm pour le monochromateur d'émission)). Les durées de vie sont obtenues par fluorescence résolue en temps par la technique du comptage mono-photonique avec excitation laser. Cuvettes en Quartz (1 = lcm ou 1 = 0,1cm, selon la concentration, de façon à obtenir une densité optique inférieure à 1). Les solutions sont analysées en tampon phosphate (50 mM ; pH = 7,5).
Caractéristiques du fluorophore LY en solution aqueuse (tampon phosphate pH =
7.5. 5OmM)
Maximum d'absorption = 430 nm et maximum d'émission = 531 nm ε(43onm) = 11580 M^cm"1 Durée de vie de fluorescence : 6,05 ns (λex = 290 nm; λem = 525 nm) LY ne forme pas d'auto-association en solution diluée jusqu'à 10"3 mol/L Rendement quantique de LY = 0,61
Caractéristiques du polymère poly(NAM-LY) fluorescent en solution aqueuse Les maxima d'absorption et d'émission du fluorophore LY ne sont pas modifiés par le couplage de molécules LY sur le polymère poly(NAM-st-NAS). La quantité exacte de LY fixés au polymère est déterminée par RMN et confirmée par comparaison des spectres d'absorption et d'émission de fluorescence du polymère fluorescent et du LY libre : 36 molécules de fluorophore sont fixées par chaîne, ce qui correspond à un rendement de couplage de 58% et à 1,56 Kg/mol de polymère par fluorophore.
Le rendement quantique de fluorescence de LY (ΦF libre) est déterminé en utilisant une solution de Rhodamine 101 dans l'éthanol (φp rhodamine libre = 0,92) comme étalon. Le rendement quantique de LY libre est 0,61 (ΦFLY libre) et le rendement quantique de LY couplé sur le polymère est 0,48 (ΦFLY immobilisé). Le rendement quantique relatif des fluorophores LY immobilisés sur le polymère est donc de 0,79. Le facteur d'amplification de fluorescence du polymère fluorescent poly[NAM- LY] est déterminé par la formule suivante:
Facteur d'amplification de fluorescence = nombre de LY/chaîne x (ΦFLY immobilisé)/ (ΦFLY libre)
II résulte que le polymère fluorescent obtenu présente une amplification de fluorescence de 28 par comparaison avec un fluorophore libre en solution aqueuse. Si l'on rapporte cette valeur à la masse molaire du polymère qui est de 56,2 Kg/mol, on obtient un facteur d'amplification de la fluorescence de 0,5 par Kg/mol de polymère.
c) Réaction du coporymère fluorescent avec un ligand biologique Un dérivé de biotine portant un bras espaceur terminé par une fonction maléïmide :
EZ-Link PEO-Maleimide Activated Biotin (vendu par Pierce; référence 21901), est utilisé tel quel.
Mode opératoire:
Le polymère poly(NAM-LY) synthétisé comme décrit au paragraphe a) et b) et le ligand biologique (PEO-Maleimide Activated Biotin), sont introduits avec le solvant, dans un ballon. Le mélange réactionnel mis sous argon est laissé sous agitation, à une température de 3O0C et à l'abri de la lumière pendant 5 jours. Le polymère obtenu, nommé poly(NAM-LY-B), est purifié par dialyse.
Conditions opératoires de la réaction du ligand biologique avec le polv (NAM-LY) :
- [polymère] ≈ 1,786 x 10"4 mol.L"1
- [PEO-Maleimide Activated Biotin] = 8.953 x 10"3 mol.L"1 (en excès, 50eq)
- solvant : Tampon phosphate, 1OmM, pH = 7 - volume de solvant = 1,7 mL
- Température: 3O0C, réaction sous argon et à l'abri de la lumière.
Confirmation du couplage du lisand biologique au polymère : Le poly(NAM-LY-B) purifié est mélangé avec un Latex Avidine-polystyrène (vendu par ESTAPOR, référence 1080-06) dans un tampon PBS-Tween 1 %o contenant de l'albumine à 0,1 g.L"1. Le mélange réactionnel est laissé pendant 4 h à 370C. Après centrifugation (4 000 rpm) et six lavages avec le tampon, le latex est analysé par fluorescence. L'émission de fluorescence à 530nm est comparée avec la fluorescence d'une solution du polymère fluorescent poly(NAM-LY) (dans les mêmes conditions opératoires). Cette comparaison permet de déterminer la proportion de chaînes polymères portant une biotine à leur extrémité, à savoir 15%.
d) Essai de résistance du polv(NAM-LY") à la photodégradation Le conjugué R-Phycoérythrine-Streptavidine (RPE, vendu par JACKSON ImmunoResearch Laboratories, INC, référence: 016-110-084) - maximum d'absorption : 490nm - maximum d'émission : 578nm - est utilisé.
Mode opératoire La variation de l'émission de fluorescence (λex = 430 nm; λem = 525 nm) en fonction de la durée d'irradiation du poly(NAM-LY) (3, Ix 10"8 moles de chaînes.L'1) en tampon phosphate (5OmM, pH = 7,5) est comparée avec l'émission de fluorescence (λex = 490 nm; λem = 578 nm) du RPE (3,1 x 10"8 mol/L) dans le même solvant. Les solutions de RPE et de poly(NAM-LY) sont préparées dans les mêmes conditions.
Pendant les 2 premières heures, l'émission de fluorescence du polymère ne varie pas, au contraire de ce qui est observé pour le RPE qui voit son émission diminuer de 30 %. Après 24h d'irradiation, l'émission du poly(NAM-LY) a diminué de 14 % pendant que celle du RPE a diminué de 56 %.
En conclusion, comme le montre la Figure unique, le polymère fluorescent obtenu (poly(NAM-LY) sur la Figure unique) est beaucoup plus résistant à la photodégradation que le R-phycoerythrine-streptavidine (RPE). e) Essai de sensibilité du fluorophore LY au pH
Le conjugué Biotine-Fluoresceine (B-F, vendu par SIGMA, référence: B 8889 ou MOLECULAR PROBES, référence: B-1370) est utilisé tel quel. Le conjugué Biotine-Lucifer Yellow (B-LY) est synthétisé par réaction du EZ-link NHS-PEO4-Biotine (vendu par PIERCE, référence 21330) et du Lucifer Yellow Cadaverine (lmol NHS: 1,1 mol LY), dans les mêmes conditions opératoires que celles de la réaction de couplage du fluorophore sur le poly(NAM-st-NAS) décrites précédemment au paragraphe b). Mode opératoire
Les solutions de B-F et B-LY en tampon phosphate (5OmM à différents pH) sont préparées (pH = 4 àlO) et à la même densité optique (0,15). Les spectres d'émission et excitation de fluorescence de B-LY (λex = 430 nm; λem = 530 nm) sont comparés avec les spectres de B-F (λex = 494 nm; λem = 518 nm), en fonction du pH de la solution analysée.
La Biotine-Fluorescéïne est très sensible au pH. Le maximum de fluorescence se déplace un peu vers le bleu et l'intensité de fluorescence du fluorophore diminue beaucoup pour pH < 7. Un changement du maximum de fluorescence de la fluorescéïne est aussi observé. Au contraire, le spectre de fluorescence et l'intensité de la Biotine-Lucifer Yellow ne change pas entre pH=4 et 10.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Polymère fluorescent soluble en solution aqueuse porteur d'au moins 5 fluorophores répartis sur le polymère, qui présentent les propriétés suivantes :
- les fluorophores sont hydrosolubles, - les fluorophores ne forment pas d'auto-association dans l'eau, jusqu'à une concentration de 10"4 mol/1, de préférence jusqu'à une concentration de 10'3 mol/1,
- les fluorophores libres en solution aqueuse présentent un coefficient d'extinction molaire supérieur à lOOO M^.cm"1, de préférence supérieur à 5000 M"1. cm"1,
- les fluorophores libres en solution aqueuse présentent un rendement quantique supérieur à 0,3, de préférence supérieur à 0,6, ledit polymère présentant un facteur d'amplification de fluorescence supérieur ou égal à 0,35 par Kg/mol de polymère, de préférence supérieur à 0,45 par Kg/mol de polymère.
2 - Polymère selon la revendication précédente, caractérisé en ce que les fluorophores comportent ou sont liés par l'intermédiaire d'un bras espaceur, comportant au moins un enchaînement -CH2-CH2- situé entre la partie fluorescente du fluorophore et le polymère. 3 - Polymère selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les fluorophores comprennent au moins un groupe polaire ou ionisable en solution aqueuse.
4 - Polymère selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est obtenu en utilisant un procédé de polymérisation radicalaire contrôlée ou de polymérisation ionique vivante.
5 - Polymère selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il est obtenu en utilisant un procédé de polymérisation radicalaire contrôlée basé sur un transfert réversible de chaînes par addition/fragmentation (RAFT).
6 - Polymère selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il présente un indice de polymolécularité inférieur à 1,5, de préférence inférieur à 1,3.
7 - Polymère selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il présente moins de 2,4 Kg/mol, de préférence moins de 2 Kg/mol de polymère par fluorophore. 8 - Polymère selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les fluorophores répartis sur le polymère présentent un rendement quantique relatif de fluorescence au moins égal à 0,7, de préférence au moins égal à 0,75.
9 - Polymère selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que les fluorophores sont tous identiques.
10 - Polymère selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les fluorophores sont choisis parmi : le N-(5-aminopentyl)-4-amino-3,6-disulfo- 1,8-naphthalimide, le 3,6-diamino-9-(2-méthoxycarbonyl)phényle, le 9-(2,4- disulfophényl)-2,3,6,7,12,13,16,17-octahydro-lH,5H,HH,15H-xanthéno[2,3,4- ij :5,6,7-i'j']diquinolizin-18-ium, le 9-(2,4-disulfophényl)-3,6-bis(éthylamino)-
2,7-diméthyl-xanthylium, le 3 ,6-bis(diéthylamino)-9-(2,4-disulfophényl)- xanthylium et leur dérivés.
11 - Polymère selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que les fluorophores sont la JV-(5-aminopentyl)-4-amino-3,6-disulfo-l,8- naphthalimide.
12 - Polymère selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les fluorophores sont insensibles aux variations de pH.
13 - Polymère selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les fluorophores sont photostables. 14 - Polymère selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un copolymère statistique, comportant au moins deux entités distinctes répétées, une entité porteuse du fluorophore et au moins une autre entité hydrophile.
15 - Polymère selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte, à l'une de ses extrémités, un composé d'intérêt lié de façon covalente.
16 - Polymère selon la revendication 15, caractérisé en ce le composé d'intérêt est lié au polymère à l'extrémité ω, par une fonction thioéther.
17 - Polymère selon la revendication 15, caractérisé en ce que le composé d'intérêt est lié au polymère à son extrémité α, par une fonction amide.
18 - Polymère selon l'une des revendications 15 à 17, caractérisé en ce que le composé d'intérêt est choisi parmi les ligands biologiques, les mono- ou disaccharides, les lipides, les colorants, les molécules fluorescentes, les chaînes polymères, les supports solides.
19 - Polymère selon la revendication 18, caractérisé en ce que le composé d'intérêt est un ligand biologique choisi parmi les polynucléotides, les antigènes, les anticorps, les polypeptides, les protéines, les haptènes, la biotine. 20 - Procédé de préparation de polymères fluorescents solubles en solution aqueuse et qui présentent un facteur d'amplification de la fluorescence supérieur ou égal à 0,35 par Kg/mol de polymère, de préférence supérieur à 0,45 par Kg/mol de polymère comportant les étapes suivantes :
• une étape de polymérisation par homopolymérisation ou copolymérisation réalisée avec un monomère fonctionnalisé porteur d'une fonction réactive
Xl, éventuellement sous forme protégée, de façon à obtenir un polymère porteur d'au moins 5 fonctions réactives Xl, éventuellement sous forme protégée, réparties sur ledit polymère,
• une étape de couplage d'au moins 5 fluorophores sur au moins une partie des fonctions réactives Xl, après déprotection desdites fonctions réactives si nécessaire, lesdits fluorophores présentant les caractéristiques suivantes :
- les fluorophores sont hydrosolubles,
- les fluorophores ne forment pas d'auto-association dans l'eau, jusqu'à une concentration de 10"4 mol/1, de préférence jusqu'à une concentration de 10"3 mol/1,
- les fluorophores libres en solution aqueuse présentent un coefficient d'extinction molaire supérieur à 1000 M"1. cm"1, de préférence supérieur à 5000 M"1. cm"1,
- les fluorophores libres en solution aqueuse présentent un rendement quantique supérieur à 0,3, de préférence supérieur à 0,6.
21 - Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que l'étape de polymérisation est réalisée par copolymérisation statistique entre un monomère porteur d'une fonction réactive Xl, éventuellement sous forme protégée, et un monomère hydrophile, à l'exception des monomères saccharidiques hydrophiles non protégés, ou bien avec un monomère qui, après traitement, peut conduire à une entité hydrophile.
22 - Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que l'on utilise un monomère porteur d'une fonction réactive Xl, avantageusement choisi parmi les monomères fonctionnels suivants : le N-acryloxysuccinimide, le N-méthacryloxy- succinimide, le méthacrylate de 2-hydroxyéthyle, le méthacrylate de 2- aminoéthyle, l'acrylate de 2-hydroxyéthyle, l'acrylate de 2-aminoéthyle, l'anhydride maléïque et, de préférence, parmi le N-acryloxysuccinimide, le N- méthacryloxysuccinimide, l'anhydride maléïque, et plus particulièrement le N- acryloxysuccinimide (ΝAS).
23 - Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que l'étape de polymérisation est réalisée par homopolymérisation d'un monomère porteur d'une fonction réactive Xl . 24 - Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que le monomère est choisi parmi le N-acryloxysuccinimide, le Ν-méthacryloxysuccinimide, le méthacrylate de 2-hydroxyéthyle, le méthacrylate de 2-aminoéthyle, l'acrylate de 2-hydroxyéthyle, l'acrylate de 2-aminoéthyle, l'anhydride maléïque et, de préférence, parmi le N-acryloxysuccinimide, le N-méthacryloxysuccinimide, l'anhydride maléïque, et plus particulièrement le N-acryloxysuccinimide (ΝAS).
25 - Procédé selon l'une des revendications 20 à 24, caractérisé en ce qu'après l'étape de couplage des fluorophores, on réalise, de façon avantageuse, un traitement des fonctions Xl restantes sur le polymère, soit par désactivation, soit par couplage avec des molécules hydrosolubles non fluorescentes. 26 - Procédé selon l'une des revendications 20 à 22 ou 25 caractérisé en ce que l'étape de polymérisation est réalisée par copolymérisation statistique entre un monomère porteur d'une fonction réactive Xl, éventuellement sous forme protégée, et un monomère hydrophile.
27 - Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce que le monomère hydrophile est choisi parmi les dérivés hydrophiles d'acrylate, de méthacrylate, d'acrylamide, de méthacrylamide, de N-vinylpyrrolidone et, de préférence, parmi : la N-vinylpyrrolidone, le NN-diméthylacrylamide et la N-acryloylmorpholine.
28 - Procédé selon la revendications 20, caractérisé en ce que l'étape de polymérisation est réalisée par homopolymérisation d'un monomère porteur d'une fonction réactive Xl sous forme protégée, ladite fonction étant déprotégée avant couplage des fluorophores.
29 - Procédé selon la revendications 28, caractérisé en ce que le monomère porteur d'une fonction réactive Xl sous forme protégée est choisi parmi les dérivés d'un sucre, de préférence, le l,2:3,4-di-0-isopropylidène-6-0-(2- vinyloxyethyl)-α-D-galactopyranose, le 6-0-acryloyl-l,2:3,4-di-O- isopropylidène-α-D-galactopyranose, le 6-<9-acryloylamino-6-désoxy-l ,2:3,4-di- O-isopropylidène-α-D-galactopyranose et le 6-O-(8-acryloylamino-3,6- dioxaoctyl)- 1,2:3 ,4-di-O-isopropylidène-α-D-galactopyranose.
30 - Procédé de préparation de polymères fluorescents solubles en solution aqueuse et qui présentent un facteur d'amplification de la fluorescence supérieur ou égal à 0,35 par Kg/mol de polymère, de préférence supérieur à 0,45 par Kg/mol de polymère mettant en oeuvre une étape de polymérisation par copolymérisation d'un monomère fonctionnalisé porteur d'un fluorophore, avec un monomère hydrophile, ou bien un monomère, qui après traitement, peut conduire à une entité hydrophile, lesdits fluorophores présentant les caractéristiques suivantes :
- les fluorophores sont hydrosolubles, - les fluorophores ne forment pas d'auto-association dans l'eau, jusqu'à une concentration de 10"4 mol/1, de préférence jusqu'à une concentration de 10'3 mol/1,
- les fluorophores libres en solution aqueuse présentent un coefficient d'extinction molaire supérieur à 1000 M-1Xm"1, de préférence supérieur à 5000 M'1. cm"1,
- les fluorophores libres en solution aqueuse présentent un rendement quantique supérieur à 0,3, de préférence supérieur à 0,6.
31 - Procédé selon la revendication 30, caractérisé en ce que le monomère fonctionnalisé porteur d'un fluorophore est obtenu par couplage d'un fluorophore, éventuellement par l'intermédiaire d'un bras espaceur, sur un monomère fonctionnalisé porteur d'une fonction réactive Xl .
32 - Procédé selon la revendications 31, caractérisé en ce que le monomère porteur d'une fonction réactive Xl est choisi parmi les monomères fonctionnels suivants : le N-acryloxysuccinimide, le Ν-méthacryloxysuccinimide, le méthacrylate de 2-hydroxyéthyle, le méthacrylate de 2-aminoéthyle, l'acrylate de 2-hydroxyéthyle, l'acrylate de 2-aminoéthyle, l'anhydride maléïque et, de préférence, parmi le N-acryloxysuccinimide, le N-méthacryloxysuccinimide, l'anhydride maléïque, et plus particulièrement le N-acryloxysuccinimide (ΝAS). 33 - Procédé selon la revendications 31, caractérisé en ce que le monomère porteur d'une fonction réactive Xl est choisi parmi les dérivés d'un sucre, de préférence, le 6-O-(2-vinyloxyethyl)-α-D-galactopyranose, le 6-0-acryloyl-α-D- galactopyranose, le 6-O-acryloylamino-6-désoxy -α-D-galactopyranose et le 6-0- (8-acryloylamino-3,6-dioxaoctyl)- α-D-galactopyranose.
34 - Procédé selon l'une des revendications 30 à 33, caractérisé en ce que l'étape de polymérisation est réalisée par copolymérisation statistique entre un monomère porteur d'un fluorophore et un monomère hydrophile
35 - Procédé selon la revendication 34, caractérisé en ce que le monomère hydrophile est choisi parmi les dérivés hydrophiles d'acrylate, de méthacrylate, d'acrylamide, de méthacrylamide, de N-vinylpyrrolidone, les dérivés hydrophiles de monomères saccharidiques et, de préférence, parmi : la iV-vinylpyrrolidone, le N,N-diméthylacrylamide et la iV-acryloylmorpholine.
36 - Procédé selon l'une des revendications 20 à 29 ou 31 à 35, caractérisé en ce que la fonction réactive Xl est choisie parmi les fonctions hydroxy, aminé, aldéhyde, anhydride, acide carboxylique activé sous forme d'ester activé.
37 - Procédé selon la revendication 36, caractérisé en ce que la fonction réactive Xl est une fonction acide carboxylique activé sous forme d'ester de N- hydroxysuccinimide. 38 - Procédé selon l'une des revendications 20 à 37, caractérisé en ce que le couplage des fluorophores est réalisé de façon à ce que la partie fluorescente des fiuorophores soit éloignée du polymère par un bras espaceur comportant au moins un enchaînement -CH2-CH2-.
39 - Procédé selon la revendication 38, caractérisé en que les fluorophores comportent un bras espaceur, comportant au moins un enchaînement -CH2-CH2- situé entre la partie fluorescente du fluorophore et le polymère.
40 - Procédé selon l'une des revendications 20 à 39, caractérisé en que les fluorophores comprennent au moins un groupe polaire ou ionisable en solution aqueuse. 41 - Procédé selon l'une des revendications 20 à 40, caractérisé en que l'étape de polymérisation est réalisée par polymérisation radicalaire contrôlée ou polymérisation ionique vivante.
42 - Procédé selon la revendication 41, caractérisé en que l'étape de polymérisation est réalisée par un procédé de polymérisation radicalaire contrôlée basé sur un transfert réversible de chaînes par addition/fragmentation (RAFT).
43 - Procédé selon l'une des revendications 20 à 42, caractérisé en ce que la quantité de fluorophore est ajustée, de façon à obtenir, moins de 2,4 Kg/mol, de préférence moins de 2 Kg/mol de polymère par fluorophore.
44 - Procédé selon l'une des revendications 20 à 43, caractérisé en ce que les fluorophores répartis sur le polymère présentent un rendement quantique relatif de fluorescence au moins égal à 0,7, de préférence au moins égal à 0,75.
45 - Procédé selon l'une des revendications 20 à 44, caractérisé en ce que les fluorophores sont tous identiques.
46 - Procédé selon l'une des revendications 20 à 45, caractérisé en ce que les fluorophores sont choisis parmi : le iV-(5-aminopentyl)-4-amino-3,6-disulfo-l,8- naphthalimide, le 3,6-diamino-9-(2-méthoxycarbonyl)phényle, le 9-(2,4- disulfophényl)-2s3,6,7,12,13,16,17-octahydro-lH,5H,HH,15H-xanthéno[2,3,4- ij :5,6,7-i'j']diquinolizin-18-ium, le 9-(2,4-disulfophényl)-3,6-bis(éthylamino)-
2,7-diméthyl-xanthylium, le 3 ,6-bis(diéthylamino)-9-(2,4-disulfophényl)- xanthylium et leur dérivés.
47 - Procédé selon la revendication 46, caractérisé en ce que les fluorophores sont tous identiques et sont le N-(5-aminopentyl)-4-amino-3,6-disulfo-l,8- naphthalimide.
48 - Procédé selon l'une des revendications 20 à 47, caractérisé en ce qu'un composé d'intérêt, tel qu'un ligand biologique, est couplé de façon covalente à une fonction réactive E, présente en bout de chaîne du polymère fluorescent obtenu. 49 - Procédé selon la revendication 48, caractérisé en ce que l'étape de polymérisation est réalisée par polymérisation RAFT et en ce que le composé d'intérêt est couplé, à l'extrémité ω du polymère, pour former une fonction thioether.
50 - Procédé selon l'une des revendications 48 ou 49, caractérisé en ce que le composé d'intérêt est un ligand biologique choisi parmi les polynucléotides, les antigènes, les anticorps, les polypeptides, les protéines, les haptènes, la biotine.
51 - Procédé selon l'une des revendications 20 à 50, caractérisé en ce que les fluorophores sont insensibles aux variations de pH. 52 - Procédé selon l'une des revendications 20 à 51, caractérisé en ce que les fluorophores sont photostables.
53 - Polymères susceptibles d'être obtenus selon un procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications 20 à 52.
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