WO1986007632A1 - Biosensor and method of manufacturing same - Google Patents
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Description
. 明 細 書
穽明の名称
パイォセンサおよびその製造法
技術分野
5 本発明は、 種々の生体試料液中の特定成分を高精度で、 迅速 かつ容易に定量することのできるバイ オセンサおよびその製造 法に関する ものである。
背景技術
近牟、 酵素の有する特異的触媒作用を利用した種々のバイ オ i o セ ンサが開発され、 特に臨床検査分野への応用が試みられて る。 検査項目及び検体数が増加している現在、 迅速に精度よ く 測定でき るバイ オセ ンサが望まれている。 - グルコ ースセンサに例をとると、 糖尿病の増加が激しい今日、' 血液中の血糖値を測定し管理するには、 以前のよ うに血液を遠
1 5 心分離し血漿にして測定するのでは非常に時間がかかるため、 全血で測定できるセ ンサが要求されている。 簡易型と しては、 尿検査の時に使用されて る検査紙と同様に、 スティ ッ ク状の 支持体に糖 ( グル コ ース ) にのみ反応する酵素および酵素反応 時又は酵素反応の生成物によ 変化する色素を含有する担体を
20 設置したものがある。 この担体に血液を添加し、 一定時間後の 色素の変化を目視又は光学的に測定する方式であるが、 血液中 の着色物による妨害が大き く精度は'低い。
そこで、 第 1 図のよ うな多層式の分析担体が提案されている (実開昭 5 4 — 1 T 8 4 9 5号公報 ) 。 これは透明る支持体 1
25 の上に試薬層 2、 展開層 3、 防水層 4、 ^過層 5が順に積層 し
た構造と つている。 血液サンブルを上部から ·滴下する と、 ま ず^過層 5によ 血液中の赤血球 ,血小板る どの固形成分が まされ、 防水層 4にある小.孔 6から展開層 3へ均一に浸透し、 試薬層 2において反応が進行する。 反応終了後、 透明な支持体 1 を通して矢印の方向から光をあて、 分光分析によ D基質饞度 を測定する方式である。 従来の簡易なスティ ッ ク状の担体にく らべ、 複雑る構造であるが、 血球除去るどによ ]9精度は向上し た。 しかし、 血液の浸透および反応に時間がかかるため、 サン ブルの乾燥を防ぐ防水層 4が必要と ¾ つた ]?、 反応を速めるた めに高温でィ ンキ ュ ベ— トする必要があ 3、 装置および担体が 複雑化する と う問題がある。
一方、 血液な どの生体試料中の特定成分につ て、 試料液の -希釈や攪拌な どの操作を行う ことな く高精度に定量する方式と しては、 第 2図に示す様なバィ 才センサが提案されている (例 えば、 特開昭 5 9 — 1 6 6 8 5 2号公報) 。 このバイ オセンサ は、 絶縁基板ァに リ ー ド 1 O , 1 1 をそれぞれ有する白金るど から る測定極 8および対極 9を埋設し、 これらの電極系の露 出部分を酸化還元酵素および電子受容体を担持した多孔体 1 2 で覆つたものである。 試料液を多孔体上へ滴下すると、 試料液 に多孔体中の酸化還元酵素と電子受容体が溶解し、 試料液中の 基質との間で酵素反応が進行し、 電子受容体が還元される。 酵 素反応終了後、 この還元された電子受容体を電気化学的に酸化 し、 このと き得られる酸化電流値から試料液中の基質濃度を求 める。 - しかし、 この様 ¾構成では、 多孔体については、 測定毎に取
替えることによ i?簡単に測定に供することができ るが、 電極 系については洗浄等の操作が必要である。 一方電極系をも含め て測定毎の使い棄てが可能となれば、 測定操作上、 極めて簡易 に ¾るものの、 白金等の電極材料や構成等の面から、 非常に高 価 ¾ものに ¾らざるを得ない。 また白金電極の構成方法として、 スパッ ク法や蒸着法を用いること もでき る力 製造上高価 ¾も のとなる。
そこで、 血液 どの生体試料中の特定成分を簡易かつ迅速 , 高精度に測定するためのセ ンサ と しては、 試料液を希釈あるい は定量することな く単にセ ンサに添加するだけで測定値が得ら れるものが望まれる。 さ らには、 洗浄 , 拭き取 操作 ¾どの操 作を伴 ¾わ ¾い、 ディスポ一ザブルタイ プのものが望まれる。 発明の開示
本発明のパイ才セ ンサは、 絶縁性の基板に少 く と も測定極 と対極からなる電極系を設け、 酸化還元酵素と電子受容体と試 料液を反応させ、 前記反応に際しての物質濃度変化を電気化学的 に前記電極系で検知し、 試料液中の基質濃度を測定するバイ才セ ンサにおいて、 電極系が力一ボンを主体とする材料から ¾ 、 酸化還元酵素および電子受容体を担持した多孔体で前記電極系 を覆い、 前記電極系および前記基板と と もに一体化したもので ある。 さ らに、 電極の表面を予め蛋白質で被覆することによ 、 血液な どの試料中に含まれる蛋白質の電極への吸着の影響を低 減している。 また、 カーボン電極を予め所定の温度範囲で熱処 理することによ 、 電極露出部分の活性度が一定 し、 保存に伴 う安定性を向上するこ とができた。 さ らに又酸化還先酵素およ
• び電子受容体を担持した多孔体に加えて試料添加層 , 庐過層 , 保液層を組み合わせた形で電極系および基板と一体化すること によ 、 試料液中の基質との酵素反応および電子受容体の電極 反応を円滑に進行させることができる。
5 本発明によれば、 電極系をも含めたディ ス ポ一ザブルタイ プ のバイォセンサを構成する ことができ、 試料液中の基質濃度、 たとえば血液中のグル コースるどについて、 試料の希釈や定量 をすることる く 、 試料液を添加するだけの簡易 ¾操作で迅速か つ高精度に測定でき る。
i o 図面の簡単る説明
第 1 図は従来のグルコースセンサの一例を示す模式図、 第 2 図は従来の酵素電極を用いたグルコ ースセンサの模式図、 第3 図は本発明の一実施例であるバイ オセ ン の模式図、 第 4図は '第 3図に示すパイ ォセンサの縦断面図、 第 5図 , 第 6図および
1 5 第 7図は第 3図に示すバイ オセンサの応答特性図、 第 8図は本 発明の他の実施例におけるバイオセ ンサの模式図、 第 9図は第 8図に示すバイ ォセンサの縦断面図である。
発明を実施するための最良の形態
実施例 1
0 パイォセンサの一伊[|と して、 グルコ ースセンサにつ て説明 する。 第 3図は、 グル コースセンサの一実施例について示した もので、 構成部分の分解図である。 ポ リ エチレンテレフ タ レ一 トから る絶縁性の基板 1 2に、 ス ク リ ーン印刷によ 樹脂バ ィ ン -を含む導電性カーボンペース ト を平行な帯状に印刷し、 3 加熱乾燥することにより、 対極1 3 , 測定極 1 4 , 参照極 1 5
からなる電極系を形成する。: 次に、 電極系を部分的に覆 、 各 々の電極の電気化学的に作用する部分と ¾る 1 7 , 1 57 (各 1 2 ) を残す様に、 ポ リ エス テル主体の絶緣性ペー ス トを 前記と同様に印刷し、 加熱処理して絶緣層 1 6を形成する。 次 に、 露出した Ι Β , Ι ^ , Ι 5/の各部分を研摩後、 空気中で 1 O O 'Cにて 4時間熱処理を施した。
この後、 穴を開けたポリ エ ステル等の合成樹脂製の保持枠 1了 を絶緣層 1 6に接着し、 前記電極系 1 3 1
1 5 を覆う様 に酵素および電子受容体を担持した多孔体 8を穴の中に保持 する。 さ らにこの多孔体 1 8の外径よ 小さ 径の開孔部を有 する樹脂製カバー 1 9を接着し、 全体を一体化する。 この一体 化されたバイオセンサについて、 測定極 1 4に沿った断面図を 第 4図に示す。 上記で用いた多孔体は、 ナ イ ロ ン不織布を基材 と し、 酸化還元酵素と してのグル コ ー スォキ シダ一ゼ 200 ng と、 電子受容体と してのフ ヱ リ シア ン化力 リ ゥ ム 4 0 0 を、 濃度 0。25 w t の界面活性剤 ( ポ リ エチレングリ コー ル アル キルフ ニ ルエ ーテル ) を含む pH 5。 6のリ ン酸缓衝液 1 m に 溶解した液を前記基材に含浸後、 濃度 0。25 w t の界面活性 剤を含むエ タ ノ ー ル中に浸漬して結晶化し、 次に滅王乾燥して 作製したものである。
上記の様に構成 したグル コ ース センサの多孔体へ試料液と し てグル コー ス標準液を滴下し、 滴下 2分後に参照極を基準にし て 7 O O mV のパル ス電圧を印加することによ ] 、 測定極をァ ノ 一 ド方向へ分極した。
この場合、 添加されたグル コ ー スは多孔体 1 8に担持された
グルコー ス才キシダーゼの作用でフ ヱ リ シア ン化力 リ ゥ ム と反 応してフ エ ロ シア ン化カ リ ウムを生成する。 そこで、 上記のァ ノー ド方向へのパ ルス電圧の印加によ 、 生成したフ ヱ ロヅァ ン化カ リ ウム濃度に比例した酸化電流が得られ、 この電流値は 基質であるグル コ ー ス濃度に対応する。
第 5図は、 上記構成のセンサの応答特性の一例と して、 電圧 印加 1 O秒後の電流値と、 グルコ ー ス濃度との関係を示すもの であ!?、 極めて良好 ¾直線性を示した。
実施例 2
実施例 1 に示したグルコー スセンサの作製方法において、 力
— ボン電極の研摩後の熱処理工程の温度を 1 o o , τ o : ,
6 O TC , 5 O 。C及び熱処理る しと した以外は、 前記と全く 同様 に構成したセ サを各々複数個作 し、 3 0 1Cにて保存し、 前 記ダル コ ース標準液に対する応答変化を検討した。 各々の熱処 理温度の電極を用いたセンサについて、 初変の応答電流を 1 00 と したときの変化を第 6図に示す。 図よ 明らかなごと く、 処理温度 6 0 °C以上では保存に伴う応答変化は少るいが、 5 O 'Cある は熱処理る しの場合には変動が大である。 これは、 研 摩された力一ボン印刷電極の露出表面部分の活性が安定してい るいことによるものと推定される。 なお、 電極面を研摩し い 場合には、 研摩した場合の約 の応答電流しか得られ ¾かった が、 この様な研摩の有無による応答電流の違いは、 ペー ス ト中 にバイ ンダーと して含まれる樹脂成分な どがカーボン表面を部 分的に被覆していることによるものと考えられる。 研摩によ j?、 力一ボン電極表面の樹脂バィ ンダ一の削除 ¾ らびに電極表面の
均一 平滑化が達成でき ると と もに、 これを 6 O TC以上の温度、 好ま しくは 6 0〜 1 7 01Cで 1 〜8時間熱処理するこ とによ ^ 電極露出部の活性度を一定化でき る。
本発明者らの検討によれば、 7 0〜 1 50 Όの温度で 4時間 熱処理することで、 保存後における応答電流の変化が極めて少 い、 好結果が得られた。
熱処理に際し、 5 O TC以下では前述した通!)好ま しい結果は 得られる く 、 又逆に 1 7 0 TC よ も高温での熱処理は、 センサ の基板であるポ リ エチ レンテレフ タ レ一 卜の熱劣化やカーボン ペース ト 中の樹脂バイ ンダーの変質を招くので避けるべきであ る。
実施例 3 . ,
実施例 1 に示した方法と同様に、 絶緣基板上に電極を形成し て、 これを研摩後、 1 Ο Ο で4時間熱処理した。 この後、 第 3図に示す電極系 1 3 1 4', 1 5 の表面を被覆するよ うにァ ルブ ミ ン ( 5 o Mg Z m£ ) の水溶液を滴下し、 5〜 1 o分放置し、 次に水洗し、 余分 ¾アルブミ ンを除去した後、 乾燥する。 この 操作によ ]?、 各電極表面にアルブ ミ ンが吸着される。
上記の様に、 アルブミ ンで被覆した電極系を形成した後、 実 施例 1 と同様に してグルコ ースセンサを構成した。
上記構成による 1 o個のグルコー スセ ンサに約 s o ^/ d のグルコ ースを含む血清サン ブルを各々滴下し、 2分後に 700 - mV のパルス電圧を印加し、 実施例 1 と同様に測定したところ、 第 7図中 Aに示す様に良好 ¾再現性を示した。 一方、 アルブミ ンの吸着処理を施さな 電極系を用いて前記同様にグルコ ース
セン サを構成し、 前記と同様に測定した場合には第ァ図中 Bに 示す様に、 Aに比較して応答電流の変動が大であった。 A , B はいずれも各々同様に作製した 1 O個のグルコ ースセ ンサにつ いての応答を示したものであるが、 この様 ¾吸着処理による再 現性の差異は、 血清サン プル中の蛋白質等の吸着物質の電極へ の吸着度の差異に起因するものと考えられる。 Aに示すごと く 予め、 電極へのアルブミ ンの十分 ¾吸着処理を施すことによ]?、 応答電流のバラッキ影響を防止することが出来るものと考えら れる。
アルブ ミ ン以外に、 グルコ ースォキ シダ一 ゼ ( 1 ocy g^ ) の水溶液を用いて、 前記同様の処理を施した場合も、 再現性の 良好 応答特性が得られた。 - -吸着させる蛋白質と しては.、 上記実施'列に示したアルブ ミ ン やグルコ ース才 キ シダ一ゼに限定されることは ¾い。 また、 電 極系の中で、 少く とも測定極に対して吸着処理が施されておれ ば、 上記同様の効果を有する。
実施例 4
実施例 3と同様に絶縁性基板上にアルブ ミ ンで被覆した電極 系を形成した。 第 8図にセ ンサ構成前の分解図を示す。 まず電 極系を覆う様に多孔性のレ ー ヨ ン不織布から ¾る保液層 2 3を スぺ一サを ¾す 2枚の樹脂プ レー ト 2 2で高さを調節して設置 し、 次に 1 m の孔径を有するポ リ 力一ボネ一 ト膜から ¾る^ 過層 2 1 を、 保持枠 1 7でその上に固定する。 さらに酵素と電 子受容体とを担持した多孔体 1 8とセル ロ ー ス不織布 2 Oから ¾る試料添加層 2 0をともに円盤状と して保持枠 1 7の穴の中
一? —
へ設置する。 さ らに多孔体 1 8 セル口一ス不織布から る試 料添加層 2 Oの外径よ 小さい径の開孔部を有する樹脂製カパ 一を接着し、 全体を一体化する。 この一体化されたバイ オセン サについて、 測定極 1 4に沿 った断面図を第 9図に示す。
次に実施例 1 と同様に多孔体 1 8にグルコ ースォキ シダ一ゼ, フ リ シア ン化力 リ ゥ ムを担持させ、 これを組み込んだ上'記構 成によるグルコ ースセンサを製作した。 このセンサに血液(全 血 ) を添加すると、 血液は試料添加層 2 Oですみやかにその全 面に拡が ]9、 多孔体 1 8に担持された酵素 , フ ェ リ シア ン化力 リ ゥ ムの溶解と反応が進行しつつ、 ^過層 2 1 で赤血球るどが 庐過され、 ^液のみが保液層 2 3に吸収され、 電極系 1 S ^ l , 1 5 /の上には電極反応を行るわせる 十分 反応液が集められ る。 この様にして、 血液中のグルコ ースが実施例 1 と同様に反 応し、 電極系においてグルコ ース濃度が検知できた。
本発明のバイ 才センサにおける一体化の方法と しては、 実施 例に示した枠体 , カバ一る どの形や組み合わせに限定されるも のではない。
また、 保液層 , 試料添加層 , ^過廇の材質についても実施例 に示したものに限定されることは ¾ く 、 本発明の主旨に合致す る ものであれば用いる ことができる。
—方、 前記実施例においては、 電極系と して 3電極方式の場 合について述べたが、 対極と測定極から ¾る 2電極方式でも測 定は可能である。
多孔体 1 8に担持させる電子受容体と しては、 前記実施例で 用いたフ エ リ シア ン化カ リ ゥムが安定に反応するので適 してい
• るが、 P —べン ゾキノ ンを使えば、 反応速度が早いので高速化 に適して る。 又、 2 , 6—ジク ロ ロ フ ヱ ノ ールイ ン ドフ エ ノ —ノレ、 メ チレンブソレー、 フ ヱ ナジンメ ト サノレフ ヱ ー ト 、 β —ナ フ ト キノ ン 4 ー スルホン酸カ リ ゥ ムな ども使用できる。
なお、 上記実施例におけるセ ンサはグルコ ースに限らず、 ァ ルコールセンサやコ レステ ロ ールセンサ ¾ ど、 酸ィヒ還元酵素の 関与する系に用いることができる。 酸化還元酵素と してはグル コ ー スォキシダ一ゼを用いたが、 他の酵素、 たとえばア ル コ 一 ノレ才キシダ一ゼ , キサンチ ン才キシダーゼ , コレ ステ ロ一ノレ才 キシダ一ゼ等も用いることができる。
産業上の利用可能性
本発明のバイオセンサは、 種々の生体試料液中の特定成分を、 迅速に精度よ くかつ簡易に測定できるため、 臨床検査にお て その利用価値は非常に大きい。 '
Claims
. 請 求 の 範 囲
. 少な く と も測定極と対極から ¾る電極系を設けた絶緣性の 基板を備え、 酸化還元酵素と電子受容体と試料液の反応に際し ての物質濃度変化を電気化学的に前記電極系で検知し、 前記試
5 料液の基質濃度を測定するパイ才センサにお て、 前記電極系 がカー ボンを主体とする材料からる 、 前記酵素および電子受 容体を担持した多孔体で前記電極系を覆う と と もに、 前記多孔 体を前記電極系および前記基板と と もに一体化したことを特徵 とするバイ オ センサ。 i o 2 . 請求の範囲第 1 項において、 電極系が測定極 , 対極および 参照極から構成されているバイオセンサ。
3 . 請求の範囲第 1 項において、 電極系がカー ボンペー ス 卜の 塗布あるいは印刷によ J?形成されてい'るバイ オセ ンサ。 4。 請求の範囲第 1 項において、 少な く と も測定極の表面が蛋
1 5 白質で被覆されて るバイ 才 セン サ。
5 . 請求の範囲第 4項において、 蛋白質がアルブ ミ ンかダルコ 一ス才キシタ,ーゼであるノ ィ 才センサ。
6。 少¾ く と も測定極と対極からるる電極系を設けた絶縁性の 基板を備え、 酸化還元酵素と電子受容体と試料液の反応に際し 0 ての物質濃度変化を電気化学的に前記電極系で検知し、 前記試 料液の基質濃度を測定するバイォセンサにおいて、 前記電極系 がカー ボンを主体とする材料から ¾ ]9、 前記酵素および電子受 容体を担持した多孔体と試料添加層と保液層とを重ねて前記電 極系を覆い, これらを基板と 一体化したこと を特徴とするバイ 5 ォセ ンサ。 ·
T . 請求 範囲第 6項において、:電極系を覆う保液層の上側に 庐過層を配置したバイォセ ンサ。
8。 請求の範囲第 6項において、 カーボンペース トから ¾る電 極系の表面が蛋白質で被覆されて るバイ才セ ンサ。
9 . 請求の範囲第 6項において、 絶籙性基板上に設けたカーボ ンを主体とする電極系を、 2枚の樹脂プレー ト で高さ調節した 保液層で覆い、 この保液層の上側に樹脂製の保持枠で保持され た炉' 過餍 , 多孔体及び試料添加層を配置すると と もに、 前記保 持枠を基板に固定し、 かつ保持枠上面に前記多孔体及び試料添 加層の外径よ 小さ 径の開孔部を有した樹脂製カバ一を接着 したバ イ オセンサ。
ια 絶録性の基板上に カー ボ ンペー ス トを印刷または塗布に よ 少な く とも卿定極と対極から る電極系を設け、 ついでこ の電極の表面を研摩後 6 0〜 1 ァ Ο の温度で1 〜 8時間熱処 理し、 その後酸化還元酵素および電子受容体を担持した多孔体 で前記電極系を覆い、 この多孔体を前記電極系および絶緣性の 基板と一体化することを特徵とするバイ 才センサの製造法。 11 . 請求の範囲第 1 Ο項において、 熱処理がァ 0〜 1 5 Ο X:の 温度における 4時間の加熱であるパイ 才セ ンサの製造法。
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