CONTENEUR POUR FECONDATION DES OVOCYTES HUMAINS EN ABSENCE D'AIR ENRICHI EN C02
Cette invention concerne un procédé totalement nouveau de féconda¬ tion des ovocytes humains faisant appel à un dispositif que nous dé¬ crirons.
La fécondation in vitro des ovocytes humains est une technique très complexe qui a permis de solutionner des cas de stérilité du couple jusqu'alors irréversibles. Depuis la première naissance, en 1978, de Louise Bro n, réalisée par l'équipe d'Edwards en Angleterre, des milliers d'enfants sont nés par cette technique à travers le monde
Le souci majeur de l'ensemble des équipes de fécondation in vitro a toujours été d'obtenir une simplification de la technique tout en conservant ou en améliorant les résultats. C'est ainsi que sur le plan clinique sont apparus :
- la stimulation, afin d'obtenir plusieurs ovocytes et d'augmenter ainsi les chances de succès,
- d'autres modes de ponction que celui sous contrôle coelioscopique, notamment ceux effectués sous contrôle échographique transvésical puis transvaginal et enfin transurétral, qui permettent de se passer de l'anesthésie générale et d'éviter la toxicité éventuelle du C02. Sur le plan biologique la congélation des embryons surnuméraires a permis une amélioration des résultats. Seule l'étape biologique de la fécondation proprement dite n'a subi que de très minimes modi¬ fications.
Cette étape biologique demeurait jusqu'à ce jour très complexe. Classiquement elle correspondait à une culture des embryons aérobie et stérile en boite ou en tube à 37° et sous b% de C02. Ce qui néces¬ site des boites et tubes non hermétiques, avec un risque de contamina¬ tion par le milieu ambiant. D'où la nécessité de disposer d'une étuve à C02 ou d'une couveuse (mise au point par "Testart"), parfaitement équilibrée à 37° et en C02. Celles-ci sont des matériels lourds et chers.
De même initialement après la ponction, on procédait à une phase de maturation de 1 à 4 heures des ovocytes dans le milieu de culture complémenté le plus souvent en sérum humain et après ce délai à la fécondation des ovocytes après changement de milieu; 18 à 24 heures après une dénudation des oeufs était effectuée. (Cette dénudation correspond à retirer de façon mécanique les cellules du cumulus entou¬ rant l'oeuf afin d'apprécier son stade de développement). L'oeuf était
alors transféré dans un nouveau milieu, qui, 20 à 24 heures après était à nouveau changé avant la replacement dans la cavité utérine, ce qui correspondait à l'utilisation de plus de 3ml de milieu de cul¬ ture par oeuf et à de nombreuses manipulations échelonnées sur 48 heures, pouvant créer une toxicité pour ces oeufs.
Le procédé que nous avons mis au point et dont nous vous résume¬ rons la démarche scientifique qui nous y a conduit est caractérisé par sa simplicité et son économie aussi bien en temps que financière¬ ment.
Ce procédé consiste en une fécondation en absence d'air enrichi en C02 des ovocytes humains à l'aide d'un tube étanche entièrement rempli de milieu de culture et placé dans la cavité vaginale qui joue alors rôle d'étuve. Dès la ponction des ovocytes, dont l'heure a été retardée (afin de se passer de la phase de maturation ovocytaire), ceux-ci sont placés dans le conteneur ainsi que les spermatozoïdes nécessaires à la fécondation et qui ont été préalablement préparés. Puis le dispositif, avec son mode de contention sont placés dans la cavité vaginale où ils ne seront retirés qu'après 44 à 48 heures afin de replacer immédiatement les oeufs dans la cavité utérine à l'aide d'un cathéter de "Frydman".
Nous allons vous décrire un modèle du conteneur qui constitue le dispositif (fig. I).
- C'est un tube cylindrique de faibles dimensions, aux parois externes lisses et arrondies (1) afin d'éviter tout traumatisme de la muqueuse vaginale. Ses dimensions sont d'environ 4cm de long pour un. iamètre externe de 1,5cm; l'épaisseur des parois est de 2mm sur le corps du cylindre (2) sauf au niveau du col où elle n'est plus que de 1mm (3), ce qui donne une cavité interne de 1,1cm de diamètre sur 3,8cm de long avec un volume utile d'environ 3,2cm3. Ce volume convient à la culture de 4 à 5 embryons. Pour un nombre d'embryons supérieur à 5. le volume de milieu utilisé peut être augmenté à 5cm3, les dimen¬ sions externes sont alors de 4,5cm de long sur 1,7cm de diamètre ex¬ terne, l'épaisseur des parois restant inchangée. De même d'autres formes, autre que la forme cylindrique, peuvent être envisagées: piriforme, ronde ou arciforme en fonction de la plastique du vagin.
- Sur la paroi externe du corps du tube, une surface d'inscription pour le nom de la patiente doit être prévue. Sur la paroi externe du bouchon ce qui limite les fautes d'aseptie.
- En raison de la diminution d'épaisseur de la paroi du col, le bord externe du bouchon, une fois vissé, ne déborde pas de la paroi du tube.
- L'extrémité borgne du tube est arrondie (5).
- L'extrémité supérieure en rapport avec le col est plate (6) et pré¬ sente en son centre un orifice rond de 4mm de diamètre environ (7). C'est par cet orifice que seront déposés les ovocytes et les sperma¬ tozoïdes nécessaires à la fécondation. Les dimensions de l'orifice sont volontairement réduites par rapport au diamètre du tube afin de limiter les échanges du milieu de culture avec l'air ambiant et donc d'en minimiser les perturbations.
- Pour diminuer encore les risques septiques, les perturbations du milieu et réduire les temps de manipulations, il nous est apparu bon de concevoir des conteneurs dans lesquels le milieu de culture est placé dans le tube dès sa fabrication (8).
- Pour éviter que des perturbations biochimiques du milieu ou qu'une contamination ne surviennent durant le délai séparant sa fabrication et son utilisation, une fermeture hermétique du tube sera réalisée par une fine membrane (9) venant couvrir l'orifice. Cette membrane sera réalisée de telle sorte qu'elle puisse se rompre très facilement lors de la dépose des ovocytes et spermatozoïdes dans le tube à l'aide d'une "pipette Pasteur" en verre ou d'un embout de pipette en plasti¬ que à usage unique. D'autres modes de fermeture étanche peuvent être utilisés tel un système muni d'une valve.
- Le milieu de culture peut être un de ceux classiquement utilisé et commercialisé. Celui que nous utilisons est le milieu "I.N.R.A. de ^enezo" commercialisé sous le nom de "B2" par "A.P.I. Système". Il ne persistera qu'un faible volume gazeux d'environ 200ul (10) entre la surface du milieu et la membrane, correspondant au volume des ovo¬ cytes et spermatozoïdes transférés.
- Les parois internes du tube doivent être parfaitement lisses et arrondies (11) afin d'éviter qu'un des oeufs ne reste accroché lors¬ qu'on les prélèvera pour les replacer dans la cavité utérine.
- Le bouchon (12) d'environ 1cm de haut sur 1,5cm de diamètre viendra se visser sur le col du tube pour en fermer l'orifice. Après rupture de la membrane une parfaite étancheité du tube est cependant nécessai¬ re afin d'éviter les perturbations du milieu et les éventuelles conta¬ minations résultant de sa mise en place dans la cavité vaginale. Cette étanchéité sera assurée par 2 joints, l'un en couronne enserrant le
col du tube (13) d'une épaisseur d'environ 1mm; l'autre plat et rond (14) venant tapisser le fond du bouchon et d'une épaisseur identique. Pour en parfaire l'étanchéité le fond du bouchon présente en son mi- lieu un relief (15) dont le diamètre est sensiblement celui de l'ori¬ fice et qui permet, lors du vissage du bouchon, de bien appliquer le joint dans la lumière de l'orifice du tube.
- La paroi externe du bouchon présente des bords arrondis (16).
- Le matériau utilisé pour la réalisation sera un plastique rigide présentant une grande résistance mécanique (en cas de traumatisme) de type polypropylène non toxique pour les cultures cellulaires.
- Le tube et le milieu stériles seront emballés de façon individuelle sous emballage stérile, style papier cellophane; lors de L'emballage le bouchon ne sera pas totalement vissé afin d'éviter une rupture de la membrane. Un dispositif de contention permettant de maintenir le tube dans la cavité vaginale est représenté par la figure II. Ce dispositif se compose d'un anneau flexible, lui-même constitué d'une lame métallique (17) gainée de caoutchouc (18) à laquelle se trouve attachée une petite poche de caoutchouc (19) de la taille du tube et qui permet de l'y glisser. Le diamètre de cet anneau sera détermi¬ né, comme pour un diaphragme, pour chaque patiente en fonction de la taille de sa cavité utérine et de son col utérin lors d'une consul¬ tation avant fécondation in vitro. Ce dispositif permet de maintenir le tube dans le cul de sac vaginal postérieur sans risque pour la patiente de le perdre ou de créer des refroidissements du milieu de culture en rapport avec une position trop proche de l'orifice vuivai- re.
La démarche qui nous a permis d'aboutir à ce procédé technique et à son dispositif est basée sur des constatations et travaux de recherche. La première de ces constatations observée pendant 6 mois est qu'une fraction du milieu conservée dans un tube stérile herméti¬ quement fermé, sans interposition d'air dans la limite du possible, permet de la conserver plus de 10 jours sans perturbation et sans que son utilisation ne modifie les résultats classiquement obtenus. La deuxième constatation repose sur des études de fécondation de 3 ovocytes placés dans le même plot de boite, soit dans 1ml de milieu; elle montre l'obtention d'un pourcentage de clivage identique à celui obtenu classiquement lorsqu'un seul ovocyte est cultivé par plot. Le fait aussi que si un oeuf est laissé dans le même plot durant les
48 heures nécessaires à sa fécondation, ceci n'interférerait en ri', a sur son stade de développement.
Enfin des études multiples dont celles effectuées par "Nenezo" "V. ont montré des modifications très minimes du milieu de culture avant et après fécondation. m L'ensemble de ces constatations nous ont conduit à pratiquer des études préliminaires qui, bien que le nombre de patientes, le nombre des ovocytes et des oeufs concernés soient faibles nous ont incité à progresser, les résultats initiaux étant très encourageants.
Une première étude portant sur 8 patientes qui présentaient un nombre d'ovocytes supérieur à 4 par ponction a été réalisée. Environ la moitié des oeufs obtenus ont été cultivés de façon classique, l'au¬ tre moitié cultivée en tube hermétiquement fermé durant -48 heures à l'étuve. Aucune différence dans le taux de clivage n'a été observée. Deux patientes ont débuté une grossesse, ce qui correspond au pour¬ centage de succès classiquement obtenu.
Une deuxième série de 8 patientes présentant toujours plus de 4 ovocytes à la ponction, dont environ la moitié ont été cultivé de façon classique, l'autre moitié par la mise en pLace intra-utérin d'un tube contenant les oeufs. Là encore, les pourcentages de clivage étaient sensiblement équivalents et même légèrement supérieurs pour la technique de culture en intra-vaginale. 5 de ces patientes ont débuté une grossesse.
Bien que ces groupes soient trop petits pour pouvoir les comparer statistiquement et donc qu'il soit trop tôt pour en tirer des conclu¬ sions, ces résultats se montrent très encourageants et tout en conti¬ nuant une étude comparative du mode de culture classique et de celui s'effectuant dans la cavité vaginale, nous avons débuté des cultures intra-vaginales pures avec deux premières tentatives, l'une d'entre elle s'est soldée par une grossesse débutante.
Les intérêts de cette technique sont multiples et considérables: * > économie de temps et de manipulations diminuant ainsi les risques septiques et la toxicité vis à vis des oeufs. Economie financière ^ importante en rapport avec l'utilisation d'une moins grande quantité de milieu et de petit matériel de laboratoire. Et surtout ne nécessi¬ tant plus une étuve à C02 ou une couveuse, matériels lourds et chers. Simplicité d'utilisation permettant la formation très rapide d'une laborantine expérimentée et permettant ainsi une plus grande diffusion
de la technique. Apport psychologique fondamental, la patiente se sentant plus directement concernée par la fécondation de ses oeufs. Il est peut-être trop tôt pour l'envisager, mais les bons résultats d'emblée obtenus sont peut-être en rapport avec une culture s'effec¬ tuant à une température qui varie dans le nycthémère et qu'aucune étuve ne peut reproduire actuellement. Cette variation thermique pou¬ vant jouer de façon tout à fait hypothétique un rôle important dans le développement de l'oeuf. Ce procédé permet aussi le transport des ovocytes et des embryons par la patiente elle-même ou dans un récep¬ tacle spécialement conçu pour une température stabilisée à 37e.