WO1991013977A1 - Process for the artificial stimulation of cells and ovocyte culture device - Google Patents

Process for the artificial stimulation of cells and ovocyte culture device Download PDF

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WO1991013977A1
WO1991013977A1 PCT/FR1991/000200 FR9100200W WO9113977A1 WO 1991013977 A1 WO1991013977 A1 WO 1991013977A1 FR 9100200 W FR9100200 W FR 9100200W WO 9113977 A1 WO9113977 A1 WO 9113977A1
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WO
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oocytes
pulse
cells
medium
duration
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Application number
PCT/FR1991/000200
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French (fr)
Inventor
Jean-Pierre Ozil
Original Assignee
Institut National De La Recherche Agronomique (Inra)
Societe Nationale Elf Aquitaine
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12MAPPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/02Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves

Definitions

  • the present invention relates to a method of artificial stimulation of cells, in particular of oocytes, said stimulation being modular over time, and to a cell culture device allowing the implementation of the method.
  • the present invention relates to the stimulation of cells, in particular of oocytes or fertilized eggs, by a bio-chemical mechanism regulated under physiological conditions by an internal oscillator.
  • This is in particular a procedure for cloning animal embryos and, in particular for obtaining competent recipient oocytes for transplanting a cell nucleus in a homogeneous state.
  • the cloning of domestic animal embryos is the way to remedy the genetic variability induced by fertilization and to standardize the genetic improvements of a breed.
  • the cloning of an embryo is a method which aims to obtain the most living animals following the transfer of the cell nuclei of this embryo (which contains several cells) into enucleated and activated oocytes.
  • the two functions of fertilization are dissociated.
  • mammalian eggs can be artificially activated by various physical or chemical stimuli, whether they are electric, thermal or osmotic shocks, enzymes or anesthetic agents (Kaufman MH 1983 - Early mammalian development - parthenogenetic studies - Cambridge University Press).
  • activation is always identified with a unique stimulus, limited in time, supposed to mimic the penetration of the sperm into the egg. None of these treatments replicate the series of physiological changes that occur in the egg after penetration of the sperm.
  • the procedures described in the publications are similar.
  • the process is triggered by the sperm within seconds of fertilization.
  • the chain of reactions that leads to the production of InsP3 appears to depend on an influx of calcium ions.
  • InsP3 binds to a specific receptor that controls the activity of a calcium channel located on the intracellular membrane of an intracellular calcium reservoir.
  • the calcium thus released activates specific proteins, which themselves activate specific processes, for example calcium-calmodulin complexation, kinase activation, etc.
  • Calcium is considered to be the main activator of metabolism.
  • This cycle of reactions is repeated at a frequency of the order of a minute lasting several hours (McCulloh et al. 1983; Igusa & Miyazaki, 1983-1986; Miyazaki et al. 1986; Miyazaki, 1988).
  • GTP [S] guanosine -5'-0- (3-thiotriphosphate)
  • mice The respective genetic contributions of the oocyte and the spermatozoon are well documented in mice. These studies show that the normal term development of an embryo depends on the permanent presence throughout the first cell cycle of the two parental pronuclei (PN) (Surani ⁇ 3c Barton 1983; McGrath & Solter, 1984; Surani et al. 1986; Mann ⁇ Jc Lovell - Badge, 1986, 1988).
  • PN pronuclei
  • Controlling activation understood as a rhythmic phenomenon extending over the entire first cell cycle is essential, not only to routinely produce activated and synchronous oocytes, but also to allow eggs "clones" to benefit from this type of imposed activation. to develop normally.
  • the present invention therefore relates to a method of artificial stimulation, in particular in the long term, of a set of cells reproducing the effect of a biochemical regulatory mechanism, controlled under natural physiological conditions by an internal oscillator, characterized in that that it includes the following stages: a) the cells are placed in culture in vitro, for a determined time, b) the cells are placed in the pulse medium, after elimination of the culture medium, c) the cells are subjected to a pulse generated by an electric field , d) the cells are again placed in the culture medium, e) the preceding steps are repeated a certain number of times, and f) the cells are obtained in a homogeneous activated state.
  • the elimination of the culture medium will preferably be completed by washing the cells with the pulse medium.
  • This stimulation method although it can be used in a large number of methods, has been developed in the context of the activation of oocytes for the cloning of embryos. Recent studies have in fact shown that in mammalian eggs, fertilization is accompanied by a transient increase in the intracellular concentration of free calcium ([Ca] -], followed by a series of oscillations of this concentration , which lasts at least 4 hours.
  • the process developed in the present invention will therefore make it possible to periodically stimulate the oocytes by influxes of calcium at the plasma membrane.
  • a blastomer is then introduced under the pellucid zone and the cell fusion is carried out by the action of an electric field.
  • the process can then be applied to cloned embryos thus obtained, in order to improve their development, that is to say to regularize cell divisions and obtain compaction.
  • Stimulation by this process can be applied to freshly ovulated oocytes placed in the presence of an inhibitor, the expulsion of the second polar body, such as cytochalasin B, which maintains a diploid state.
  • an inhibitor such as cytochalasin B
  • the process was designed based on the effects of electric fields on plasma membranes.
  • the process involves the combination of an in vitro culture method of a batch of oocytes (or embryos) by perfusion between two electrodes and a washing method with a non-conductive solution, containing calcium 0 to 30 ⁇ M , in which the pulses are delivered.
  • a very weakly conductive solution for example an isotomic solution of glucose containing the Ca ions
  • the concentration of Ca + ions is between 8 and 20 ⁇ M. Good results are obtained for example for a concentration of Ca ions equal to 10 ⁇ M or else 16 ⁇ M.
  • the alternation of a culture period and a washing period makes it possible to frequently subject the oocytes to stimulation in a very well defined ionic medium.
  • This process can extend to the stimulation of cells by a whole range of simple or complex ionic or molecular signals at variable concentrations which will be determined by the composition of the pulse medium. This process makes it possible to modulate the frequency of the signal by the duration between two washes, and its amplitude by the duration of the electrical pulse.
  • One of the aspects of the present invention is the simultaneous treatment of a set of oocytes, which will thus be obtained, activated in the same physiological state.
  • the core transplants can thus be performed on physiologically identical oocytes.
  • the present invention therefore relates to a dynamic system, operating continuously and which can be automated, produced by a device allowing the automatic succession of the washing and stimulation stages and the acquisition of the stimulation parameters.
  • This device is characterized by the fact that it immobilizes the cells during the different phases of the treatment.
  • It consists of an enclosure comprising at least one fluid inlet (10, 11) and a fluid outlet (6) and, is characterized in that at the bottom of the enclosure there are one or more orifices ( 4) whose geometry is such that it opposes the passage of the cells and in that the liquid entering the enclosure is withdrawn, at least in part, through the orifices, creating a depression as it ensures substantially blocking the cells on the orifice (s), part of the fluid being evacuated by overflow.
  • This device makes it possible to retain the cells without damaging them or introducing parasitic mechanical stress. In addition, it allows everything when to replace, remove or move cells. This device therefore makes it possible to successively place the cells in media of chemical composition of different natures, for periods and according to a variable frequency.
  • the enclosure has on its internal walls two electrodes, preferably parallel, and the orifice (s) are aligned at equal distance from the electrodes, immersed in the medium corresponding to the phase of the treatment in progress.
  • this device it is possible to cultivate the cells at will or else into the impulse medium to penetrate into the treated cell, an ion, a molecule, a complex chemical or biological substance.
  • the device allows in particular the treatment in a single enclosure of a large number of oocytes, without the need to place them in separate compartments.
  • the device comprises at least two fluid inlets, which can be superimposed.
  • the evacuation of fluids can also be done laterally.
  • Each medium arriving successively in the chamber corresponds to a separate injection tube.
  • a suitable suction system on the culture medium inlet device allows the suction of a small quantity of the pulse medium which enters the inlet pipe of the culture medium. culture centre ; this prevents ions from the culture medium from entering the chamber during the washings.
  • the circulation of the medium flows is represented by arrows in FIG. 3.
  • the compositions of the culture media are known and depend on the cells in culture.
  • the pulse medium is usually consisting of a non-ionic medium to ensure a field effect. It will be an isotonic solution for example of glucose.
  • This device can be designed as an activation chamber, the capacity of which can be adapted to the number of cells which it is desired to treat simultaneously.
  • the characteristics of the process using the device can vary widely and are generally only limited by conditions such as washing times. Thus, the frequency of the pulses is limited by the minimum washing time by the pulse medium.
  • the parameters of the process and of the device, that is to say the inflows and outflows of fluid, as well as the frequency, the duration and the intensity of the electrical pulses arriving in the electrodes are managed by an electronic system.
  • the characteristics of the electrical pulses in themselves can vary and depend on the cells and the objectives sought.
  • the electric fields vary from 1 to 3 v. cm " and the dawn electric pulse duration from 10 ⁇ s to 2000 ⁇ s.
  • the frequency and duration of the pulses can vary during different stages of the same stimulation process.
  • the organization of the tubes which open into the chamber allows media to be injected without the oocytes being taken down by the gas bubbles which eventually form in the pipes.
  • the distribution structure of the media makes it possible to considerably limit the ionic contamination of the stimulation medium by the ions of the culture medium.
  • the media injection pumps can be controlled by a microcomputer which will determine the repeatable washing sequences while keeping the cells between the electrodes.
  • This device can be applied to the treatment of cells with any substance that one wishes to penetrate into the intracellular space.
  • the composition of the pulse medium will determine the penetration of this substance according to a concentration gradient.
  • the culture medium will be replaced by the pulse medium and the electric field pulse will be triggered, the duration of the pulse determining the quantity of substance which penetrates.
  • This pulse medium can then be removed and the cells returned to culture in an appropriate medium.
  • the advantage of this system is that it allows simultaneous processing of a set of cells which are thus synchronized. It works continuously and avoids any manipulation of the cells, thus ensuring better reproducibility and greater speed of execution. This allows standardization of conditions and facilitates technology transfer. It is conceivable to make an ion or a simple molecule enter cells. This device can also be applied to the stimulation of cells by a more complex molecule, or to the penetration of DNA fragments, or episomes.
  • This device will be used to carry out a cyclic stimulation of the cells, several basic sequences being carried out successively, the intensity, the duration and the frequency of the pulses controlled by means of a microcomputer.
  • This device makes it possible to carry out the activation and synchronization process of oocytes, by repeated stimulations with Ca + , for the cloning of domestic animal embryos.
  • An embodiment of the chamber is represented in figure
  • the oocytes 1 are placed on a rectilinear slit 4, produced by the juxtaposition of two glass plates 3 and 5, the spacing of which is less than the diameter of the oocytes.
  • the media, culture medium and pulse medium arrive in the upper part of the chamber each through a separate tube, respectively 10 and 11, avoiding reciprocal contamination.
  • the medium 9 corresponding to the current treatment phase arrives continuously and is discharged through a tube 6 located at a lower level than that of the oocytes. This current of liquid keeps the oocytes pressed against the bottom of the chamber by suction.
  • Enclosure 8 is thermostatically controlled at 38 ° C. Each medium arrives in the chamber after passing through a system retaining the large gas bubbles.
  • This system consists of a glass balloon into which the liquid arrives. From this balloon leaves a gold rod perforated with small diameter holes; after passing through this rod, the gas bubbles of large size are retained and the liquid arrives in the chamber through a short tube.
  • Oocytes can be immediately subjected to activation treatment, no aging period is necessary. They are subjected for 90 minutes to a series of pulses of electric field, at a rate of one pulse every 4 minutes, that is to say 22 pulses of decreasing duration dissipating a total energy 1250 ⁇ joules, of a total duration of 14 868 ⁇ s , the electric field has a value of 1.8 Kv. cm " .
  • the culture medium is replaced by a pulse medium consisting of an isotonic glucose solution containing Cad-, l O ⁇ M.
  • oocytes At the end of the activation treatment, all oocytes have two well-formed polar cells. A homogeneous population of activated oocytes in the same physiological state is therefore obtained at the same time, within a few minutes.
  • the cell fusion is then carried out.
  • the cell fusion method derives from Zimmerman's work on electric fields. The procedure has been refined. (Ozil and Modlinski 1986, J. Embryol.
  • the oocytes were recovered from the oviducts 12-15 h after the projection by washing with a buffered phosphate saline solution (PBS). They were incubated for 5 minutes in hyaluronidase (300 i.u.ml-1 in PBS) to eliminate the follicular cells. After the treatment, the oocytes were cultured at 38 ° in B2 medium (Ménézo 1976) in an atmosphere containing 5% CO 2.
  • PBS buffered phosphate saline solution
  • the membrane permeability of freshly ovipressed rabbit oocytes was transiently increased by opening the pores by a pulse induced by an electric field in the presence of Ca “ " " 10 ⁇ M contained in a 0.3 M - 18 MOhm H20 glucose solution. (pulse medium) It is recognized that, while the pores are open, an ion flow circulates according to the concentration gradients through the cell membrane towards the interior of the cytosol as has already been shown in oocytes sea urchin (Rossignol et al, 1983), so the ion influx can be adjusted under these conditions either by the difference in ion concentration between the inside and outside of the cell or by the duration of the pulses.
  • the amplitude of the ion signal was modulated over the duration of the pulse.
  • the entire process was controlled by an IBM PC-AT 286 microcomputer via a Tektronix MI 5010 interface with a program written in MS-BASIC.
  • the actual voltage and current between the electrodes were measured by a Tektronix 7704 1 oscilloscope mounted with a programmable digital converter 7D20 and an amplifier 7A22.
  • the rhythm of the electrical pulses and the total duration of the treatment were the same for all the treatments, that is to say applying one pulse every four minutes for 90 minutes. These values were chosen because they agree well with the frequency and the average duration of the hyperpolarization of the membrane potential of rabbit oocytes during fertilization (22 biphasic oscillations of the membrane potential during the first 90 minutes after fusion sperm-egg, one pulse every 4 minutes -McCulloh et al., 1983).
  • We know that the variation of the membrane potential reflects the passage of K based on calcium activated channels and that they therefore constitute a reliable indicator of [Ca + ]. (Miyazaki and Igusa 1982).
  • the amplitude of electric fields (1.8 kVcm-1) was constant for all the experimental groups.
  • the effect of the pulse duration was studied in the pulse medium containing 10 ⁇ M CaC12.
  • the treatment for which the oocytes are not activated was considered to be the minimum duration and that resulting in the lysis of the oocytes was considered to be the maximum duration.
  • a set of six treatments with 22 constant double pulses was chosen arbitrarily. These treatments have a pulse duration equal to 200, 300, 600, 900, 1200 and 1500 ⁇ s respectively-
  • Processing with 22 double pulses of constant duration reveals the value of the pulse duration for which the maximum and minimum effects are recorded.
  • These constant treatments do not produce a high activation rate with a uniform type of parthenogenetic egg.
  • the oocytes were subjected to treatments in which the duration of the impulses gradually decreased according to a negative exponential relationship. Four treatments were tested in accordance with the maximum duration of the first pulse.
  • FIG. 2 gives the curve of the pulse durations for these treatments.
  • the coefficient b determines the duration of the first pulse.
  • the coefficient c determines the duration of the last pulse.
  • the eggs are treated in the presence of 8 ⁇ gml-1 of cytochaasin B in the culture medium to block the expulsion of the second polar globule and to obtain a uniform population of diploid parthenogenic eggs.
  • Two treatments were applied to group C, treatment I which is the weak treatment with a total pulse duration equal to 11288 ⁇ s and treatment III which is the strong treatment with a duration of 14 868 ⁇ s.
  • Parthenogenetic eggs were cultured in vitro up to the blastocyst stage and the influence of the two treatments was evaluated by the rate of blastocyst formation. Viability beyond the implantation of parthenogenetic embryos
  • 4-cell stage embryos were transplanted into recipient oviducts.
  • the fertilized eggs were also transplanted into the opposite horn of a few recipients in order to compare parthenogenetic development with normal development.
  • the recipients were autopsied between day 8.5 and day 13 of gestation and the number of implantation sites for living fetuses was noted.
  • the pulse medium does not contain electrolytes
  • none of the oocytes (105) are activated.
  • the experimental environment and the culture conditions that is to say the replacement of the culture medium before each pulse with a pulse medium containing no electrolytes and the treatment with relatively strong electrical pulses (2 x 1.8 kVcm-lx900 ⁇ s x 22 times, i.e. a total pulse duration of 30,600 ⁇ s) has no visible effect on freshly ovulated oocytes but the conditions do not allow development to be triggered.
  • Table I summarizes the results of the experiment in which the activation rate was tested in relation to the pulse duration in the presence of 10 ⁇ M CaCl 2 .
  • the appearance of pronuclei after 3 or 4 hours of culture serves as a marker for parthenogenetic activation.
  • the activation rate is directly related to the duration of the pulse which indirectly controls stimulation by calcium.
  • the duration of ionic stimuli influences not only the activation rate but also the nuclear configuration of parthenogenetically activated oocytes of similar postovulatory age.
  • Freshly collected oocytes (13 h after the projection with a vasectomized male) are subjected to a standard treatment comprising 22 pulses (one every 4 minutes) and whose total duration is equal to 22,475 ⁇ s (working reference: lex 1370).
  • the only variable is the calcium concentration in the pulse solution.
  • Five values were chosen: 10, 12, 14, 16, 18, 20 ⁇ M of calcium.
  • the table below summarizes the results.
  • the washing parameters must therefore make it possible to limit the presence of residual culture medium at the time of the pulses.
  • the presence of residual medium increases the number of ionic species capable of entering the oocyte at the time of electropermeabilization of the membrane.
  • Freshly ovulated mouse oocytes (12 h post HCG) are subjected to treatments comprising 33 impulses, one every 4 minutes for 2 hours 12 minutes.
  • the treatments are carried out for calcium concentrations in the pulse solution successively worth 4 ⁇ M, 8 ⁇ M, 12 ⁇ M, and 16 ⁇ M and for variable pulse durations.
  • the dynamics of pronuclei formation can be controlled as a function of the calcium concentration in the pulse solution and the total duration of the electrical pulses (Vitullo, Ozil, 1991).
  • Phorbol ester and sperm activate mouse oocytes by inducing sustained oscillations in cell Ca2 " , Nature 316, 541-542.

Abstract

The present invention concerns a process for artificially stimulating a group of cells reproducing the effect of the biochemical regulation mechanism, controlled in natural physiological conditions by an internal oscillator, comprising the steps below: a) the cells are placed in in vitro culture for a given time; b) the ells are placed in the pulsing medium after the culture medium has been removed; c) the cells are subjected to pulses generated by an electric field; d) the cells are once more placed in the culture medium; e) the previous stages are repeated a certain number of times; f) cells in a uniform active state are obtained. It also concerns a device for the culture of ovocytes facilitating the operation of the process.

Description

PROCEDE DE STIMULATION ARTIFICIELLE DE CELLULES ET DISPOSITIFDE CULTURE D'OVOCYTES METHOD FOR ARTIFICIAL STIMULATION OF CELLS AND DEVICE FOR CULTURE OF OVOCYTES
La présente invention concerne un procédé de stimulation artificielle des cellules en particulier d'ovocytes, ladite stimulation étant modulable dans le temps, et un dispositif de culture de cellules permettant la mise en oeuvre du procédé.The present invention relates to a method of artificial stimulation of cells, in particular of oocytes, said stimulation being modular over time, and to a cell culture device allowing the implementation of the method.
La présente invention se rapporte à la stimulation de cellules, en particulier d'ovocytes ou d'oeufs fécondés, par un mécanisme bio¬ chimique régulé dans les conditions physiologiques par un oscillateur interne.The present invention relates to the stimulation of cells, in particular of oocytes or fertilized eggs, by a bio-chemical mechanism regulated under physiological conditions by an internal oscillator.
Il s'agit notamment d'une procédure de clonage des embryons d'animaux et, en particulier d'obtention d'ovocytes receveurs compétents pour la greffe d'un noyau cellulaire dans un état homogène.This is in particular a procedure for cloning animal embryos and, in particular for obtaining competent recipient oocytes for transplanting a cell nucleus in a homogeneous state.
Le clonage d'embryons d'animaux domestiques est la voie permettant de remédier à la variabilité génétique induite par la fécondation et de standardiser les améliorations génétiques d'une race.The cloning of domestic animal embryos is the way to remedy the genetic variability induced by fertilization and to standardize the genetic improvements of a breed.
Lors de la fécondation, l'entrée du spermatozoïde va avoir deux grandes fonctions :During fertilization, the entry of the sperm will have two main functions:
- apport du génome haploïde mâle,- contribution of the male haploid genome,
- activation du développement qui restructure le noyau mâle par le cytoplasme de l'ovocyte et favorise les interactions noyau-cytoplasme.- activation of development which restructures the male nucleus by the cytoplasm of the oocyte and promotes nucleus-cytoplasm interactions.
Il s'écoule en moyenne 12 à 20 heures entre la fécondation et la première division cellulaire, pendant lesquelles un ensemble de phénomènes ont lieu, les deux génomes paternel et maternel ayant des rôles complémentaires pour un développement ultérieur de l'embryonIt takes an average of 12 to 20 hours between fertilization and the first cell division, during which a series of phenomena take place, the two paternal and maternal genomes having complementary roles for further development of the embryo.
(5urani et al. 1984, Nature 308, 548-550), mais on n'en connait pas le mécanisme exact. Le clonage d'un embryon est une méthode qui vise à obtenir le plus d'animaux vivants à la suite du transfert des noyaux cellulaires de cet embryon (qui contient plusieurs cellules) dans des ovocytes enuclées et activés. Les deux fonctions de la fécondation sont dissociées. AJin d'obtenir un développement ultérieur de l'oeuf, il faut procéder à une activation de l'ovocyte receveur avant la greffe nucléaire. L'activation peut aussi s'appliquer aux premières heures du développement de l'oeuf fécondé.(5urani et al. 1984, Nature 308, 548-550), but the exact mechanism is unknown. The cloning of an embryo is a method which aims to obtain the most living animals following the transfer of the cell nuclei of this embryo (which contains several cells) into enucleated and activated oocytes. The two functions of fertilization are dissociated. In order to obtain a further development of the egg, it is necessary to activate the recipient oocyte before the nuclear transplant. Activation can also apply during the first hours of development of the fertilized egg.
On sait que les oeufs de mammifères peuvent être activés artificiellement par différents stimulis physiques ou chimiques, qu'il s'agisse de chocs électriques, thermiques ou osmotiques, d'enzymes ou d'agents anesthésiques (Kaufman MH 1983 - Early mammalian development - parthenogenetic studies - Cambridge University Press). Cependant, l'activation est toujours identifiée à un stimulus unique, limité dans le temps, supposé mimer la pénétration du spermatozoïde dans l'oeuf. Aucun de ces traitements ne reproduit la série de changements physiologiques se produisant dans l'oeuf après la pénétration du spermatozoïde.It is known that mammalian eggs can be artificially activated by various physical or chemical stimuli, whether they are electric, thermal or osmotic shocks, enzymes or anesthetic agents (Kaufman MH 1983 - Early mammalian development - parthenogenetic studies - Cambridge University Press). However, activation is always identified with a unique stimulus, limited in time, supposed to mimic the penetration of the sperm into the egg. None of these treatments replicate the series of physiological changes that occur in the egg after penetration of the sperm.
On ne connait que quelques cas d'activation parthénogénétique de l'ovocyte de vache (Menezo et al. 1976 - Commission of the European Coimmuniτies, Agricultural research seminar, Egg transfer in Cattle. EurOnly a few cases of parthenogenetic activation of the cow oocyte are known (Menezo et al. 1976 - Commission of the European Coimmuniτies, Agricultural research seminar, Egg transfer in Cattle. Eur
5491) ; aucune méthode vraiment fiable et précise d'activation des ovocytes de bovins n'est disponible. L'activation expérimentale par Téthanol présente de nombreux inconvénients : grande variabilité des résultats en fonction de l'âge des ovocytes (Cuthbertson, 1983 ; J. Exp. Zool. 226, 31 1-314).5491); no truly reliable and precise method of activating bovine oocytes is available. Experimental activation with tethanol has many drawbacks: great variability of the results as a function of the age of the oocytes (Cuthbertson, 1983; J. Exp. Zool. 226, 31 1-314).
En ce qui concerne le clonage d'embryons, les premiers résultats incontestés ont été obtenus par S. illadsen en 1986 chez la brebis. Ils ont été suivis par ceux de Prather et al en 1987 chez la vache, et en 1989 chez la truie. Chez la lapine, les premiers individus issus de clonage ont été obtenus par Stice et Robl en 1988. Les taux de succès de ces expériences rapportés dans les publications ne dépassent généralement pas 4 %. Toutefois, des sociétés américaines (Granada Genetics, Houston, Texas) ou Canadienne (Alta Genetics, Callgary, Alberta), semblent maîtriser la procédure de clonage chez les bovins. Il est dit qu'une centaine de veaux aurait déjà été obtenue sur le continent nord-américain. Cette prise en main industrielle reflète l'intérêt que suscite le clonage d'embryon chez les bovins. Mais les techniques ont-elles vraiment progressé ?With regard to the cloning of embryos, the first undisputed results were obtained by S. illadsen in 1986 in sheep. They were followed by those of Prather et al in 1987 in cows, and in 1989 in sows. In rabbits, the first individuals from cloning were obtained by Stice and Robl in 1988. The success rates of these experiments reported in the publications do not generally exceed 4%. However, American (Granada Genetics, Houston, Texas) and Canadian (Alta Genetics, Callgary, Alberta) companies seem to have mastered the cloning procedure in cattle. It is said that a hundred calves have already been obtained on the North American continent. This industrial handling reflects the interest aroused by embryo cloning in cattle. But have the techniques really progressed?
Les procédures décrites dans les publications se ressemblent. Les ovocytes utilisés ont subi une période de vieillissement de 6 à 10 heures. Ce veillissement est rendu nécessaire pour favoriser l'activationThe procedures described in the publications are similar. The oocytes used underwent an aging period of 6 to 10 hours. This aging is necessary to promote activation
(aucune technique classique d'activation ne permet d'activer des ovocytes fraîchement ovules même chez les bovins (Ware et al. 1989). Les chromosomes organisés sur la metaphase II sont prélevés en "aveugle" dans la région du premier globule polaire, mais des techniques de visualisation des chromosomes par fluorescence sont mises en oeuvre. Une cellule embryonnaire provenant d'une morula est introduite sous la zone pellucide et la fusion est obtenue par des impulsions de champs électriques. L'activation de l'ovocyte est généralement provoquée par la procédure de fusion cellulaire ; dans certains cas, elle n'est pas décrite. Deux chercheurs ont pu obtenir un agneau à la suite du transfert dans un ovocyte d'un noyau provenant d'une cellule du bouton embryonnaire (Smith & Wilmut, 1989). Toutefois, le niveau des résultats et la complexité des mécanismes en jeu tels que le stade de différenciation du noyau, la phase du cycle cellulaire, l'état de l'ovocyte receveur, son âge, la procédure d'activation ne permettent pas de comprendre pourquoi certains embryons se développent et d'autres non. De nombreuses théories pour expliquer les échecs comme celle fondée sur l'activité de transcription du noyau transplanté ont été contredites par quelques résultats expérimentaux.(no conventional activation technique allows activation of freshly ovulated oocytes even in cattle (Ware et al. 1989). The chromosomes organized on metaphase II are taken "blind" in the region of the first polar body, but techniques for visualizing the chromosomes by fluorescence are used. An embryonic cell from a morula is introduced under the pellucid zone and fusion is obtained by pulses of electric fields. The activation of the oocyte is usually caused by the cell fusion procedure; in some cases, it is not described. Two researchers were able to obtain a lamb following the transfer into an oocyte of a nucleus originating from an embryonic button cell (Smith & Wilmut, 1989). However, the level of results and the complexity of the mechanisms involved such as the nucleus differentiation stage, the phase of the cell cycle, the state of the recipient oocyte, its age, the activation procedure do not allow us to understand why some embryos develop and others do not. Many theories for explaining failure such as that based on the transcription activity of the transplanted nucleus have been contradicted by some experimental results.
Des données nouvelles sont apparues sur les mécanismes physiologiques déclenchés par la fécondation et notamment en ce qui concerne les rythmes des variations de niveau du calcium libre et des seconds messagers comme l'Inositol ( l,6,5)-tri-phosphate (InsP3) (Cuthbertson et al. 1981 ; Cuthbertson & Cobbold, 1985 ; Miyaza i et al.New data have appeared on the physiological mechanisms triggered by fertilization and in particular with regard to the rhythms of variations in the level of free calcium and second messengers like Inositol (l, 6,5) -tri-phosphate (InsP3) (Cuthbertson et al. 1981; Cuthbertson & Cobbold, 1985; Miyaza i et al.
1986 ; Miyazaki, 1988). L'activité périodique de ces seconds messagers pourrait réguler les synthèses des acides nucléiques (ADN et ARNs) et des protéines (Basset et al. 1968 ; Rodan et al. 1978).1986; Miyazaki, 1988). The periodic activity of these second messengers could regulate the synthesis of nucleic acids (DNA and RNAs) and proteins (Basset et al. 1968; Rodan et al. 1978).
Le processus est déclenché par le spermatozoïde dans les secondes qui suivent la fécondation. La chaîne de réactions qui aboutit à la production d'InsP3 semble dépendre d'un influx d'ions calcium. L'InsP3 se lie à un récepteur spécifique qui contrôle l'activité d'un canal calcique situé sur la membrane intracellulaire d'un réservoir intracellulaire de calcium. Le calcium ainsi libéré active des protéines spécifiques, qui elles-mêmes activent des processus spécifiques, par exemple la complexation calcium- calmoduline, l'activation de kinase etc. Le calcium est considéré comme l'activateur principal du métabolisme. Ce cycle de réactions se reproduit à une fréquence de l'ordre de la minute durant plusieurs heures (McCulloh et al. 1983 ; Igusa & Miyazaki, 1983-1986 ; Miyazaki et al. 1986 ; Miyazaki, 1988).The process is triggered by the sperm within seconds of fertilization. The chain of reactions that leads to the production of InsP3 appears to depend on an influx of calcium ions. InsP3 binds to a specific receptor that controls the activity of a calcium channel located on the intracellular membrane of an intracellular calcium reservoir. The calcium thus released activates specific proteins, which themselves activate specific processes, for example calcium-calmodulin complexation, kinase activation, etc. Calcium is considered to be the main activator of metabolism. This cycle of reactions is repeated at a frequency of the order of a minute lasting several hours (McCulloh et al. 1983; Igusa & Miyazaki, 1983-1986; Miyazaki et al. 1986; Miyazaki, 1988).
Cette activité rythmique, due à un système de signaux intracellulaires émis à une fréquence propre, semble dépendre de la présence de pronuclei mâle et femelle car elle n'a pu être observée sur des oeufs parthénogénétiques activés par des méthodes classiques (Cuthberston et al. 1981 ; Cuthbertson & cobbold, 1985 ; Miyazaki, 1988).This rhythmic activity, due to a system of intracellular signals emitted at a natural frequency, seems to depend on the presence of male and female pronuclei because it could not be observed on parthenogenetic eggs activated by conventional methods (Cuthberston et al. 1981 ; Cuthbertson & cobbold, 1985; Miyazaki, 1988).
L'injection dans des ovocytes d'une protéine G (guanosine -5'-0-(3-thiotriphosphate) (GTP [S]) induit plusieurs cycles de libération de calcium, mais ne permet pas de maintenir cette activité au-delà du quatrième (Swann, Igusa <5 Miyazaki, 1989).Injection into oocytes of a G protein (guanosine -5'-0- (3-thiotriphosphate) (GTP [S]) induces several cycles of calcium release, but does not allow this activity to be maintained beyond the fourth (Swann, Igusa <5 Miyazaki, 1989).
Les contributions génétiques respectives de l'ovocyte et du spermatozoïde sont très documentées chez la souris. Ces études montrent que le développement normal à terme d'un embryon dépend de la présence permanente durant tout le premier cycle cellulaire des deux pronuclei parentaux (PN) (Surani <3c Barton 1983 ; McGrath & Solter, 1984 ; Surani et al. 1986 ; Mann <Jc Lovell - Badge, 1986, 1988).The respective genetic contributions of the oocyte and the spermatozoon are well documented in mice. These studies show that the normal term development of an embryo depends on the permanent presence throughout the first cell cycle of the two parental pronuclei (PN) (Surani <3c Barton 1983; McGrath & Solter, 1984; Surani et al. 1986; Mann <Jc Lovell - Badge, 1986, 1988).
La production de jeunes par clonage ne peut être réalisée dans la pratique que si l'on dispose de procédés fiables et reproductibles. La qualité de l'activation de l'oeuf joue dans le développement un rôle important jusque là ignoré.The production of young people by cloning can only be carried out in practice if reliable and reproducible processes are available. The quality of egg activation plays an important role hitherto ignored in development.
La maîtrise de l'activation comprise comme phénomène rythmique s'étendant sur tout le premier cycle cellulaire est essentielle, non seulement pour produire en routine des ovocytes activés et synchrones mais aussi pour faire bénéficier des oeufs "clones" de ce type d'activation imposée pour se développer normalement.Controlling activation understood as a rhythmic phenomenon extending over the entire first cell cycle is essential, not only to routinely produce activated and synchronous oocytes, but also to allow eggs "clones" to benefit from this type of imposed activation. to develop normally.
La présente invention concerne donc un procédé de stimula¬ tion artificiel, notamment à long terme, d'un ensemble de cellules reproduisant l'effet d'un mécanisme de régulation biochimique, contrôlé dans les conditions physiologiques naturelles par un oscillateur interne, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) les cellules sont placées en culture in vitro, pendant un temps déterminé, b) les cellules sont placées dans le milieu d'impulsion, après élimination du milieu de culture, c) on soumet les cellules à une impulsion générée par un champ électrique, d) les cellules sont à nouveau placées dans le milieu de culture, e) on répète les étapes précédentes un certain nombre de fois, et f) on obtient les cellules dans un état activé homogène.The present invention therefore relates to a method of artificial stimulation, in particular in the long term, of a set of cells reproducing the effect of a biochemical regulatory mechanism, controlled under natural physiological conditions by an internal oscillator, characterized in that that it includes the following stages: a) the cells are placed in culture in vitro, for a determined time, b) the cells are placed in the pulse medium, after elimination of the culture medium, c) the cells are subjected to a pulse generated by an electric field , d) the cells are again placed in the culture medium, e) the preceding steps are repeated a certain number of times, and f) the cells are obtained in a homogeneous activated state.
L'élimination du milieu de culture sera de préférence complétée par un lavage des cellules par le milieu d'impulsion.The elimination of the culture medium will preferably be completed by washing the cells with the pulse medium.
Ce procédé de stimulation bien qu'il puisse être utilisé dans un grand nombre de procédés, a été mis au point dans le cadre de l'activation des ovocytes en vue du clonage d'embryons. Des études récentes ont en effet montré que dans les oeufs de mammifères, la fécondation est accompagnée d'une augmentation transitoire de la concentration intracel- lulaire de calcium libre ([Ca ]-], suivie d'une série d'oscillations de cette concentration, qui dure au moins 4 heures.This stimulation method, although it can be used in a large number of methods, has been developed in the context of the activation of oocytes for the cloning of embryos. Recent studies have in fact shown that in mammalian eggs, fertilization is accompanied by a transient increase in the intracellular concentration of free calcium ([Ca] -], followed by a series of oscillations of this concentration , which lasts at least 4 hours.
On ignore encore par quel moyen le spermatozoïde déclenche ces variations de [Ca ]., ainsi que les fonctions biologiques exactes de ces oscillations de Ca de longue durée. Cependant, elles semblent caracté¬ ristiques des oeufs fécondés et n'ont jamais été observées quand les ovocytes sont artificiellement activés (Miyazaki 1988 - 3. Cell. Biol. 106, 345-353).It is not yet known how the sperm triggers these [Ca] variations, as well as the exact biological functions of these long-lasting Ca oscillations. However, they seem characteristic of the fertilized eggs and have never been observed when the oocytes are artificially activated (Miyazaki 1988 - 3. Cell. Biol. 106, 345-353).
Le procédé développé dans la présente invention va donc permettre de stimuler périodiquement les ovocytes par des influx de calcium au niveau de la membrane plasmique.The process developed in the present invention will therefore make it possible to periodically stimulate the oocytes by influxes of calcium at the plasma membrane.
En effet, en introduisant dans le milieu d'impulsion des ions Ca +, ceux-ci vont pouvoir pénétrer dans la cellule par l'électroporation, c'est-à-dire la création de "pores" générées par l'impulsion électrique. Au-delà des phénomènes immédiats provoqués dans l'ovocyte comme l'expulsion du globule polaire, les effets de cette stimulation se manifesteront sur les stades ultérieurs du développement de l'embryon, alors même que le traitement a cessé. C'est ainsi que les phénomènes de compaction et de cavitation pourront être affectés. Ce procédé peut s'appliquer aux ovocytes fraichement ovules, obtenus par stimulation hormonale de la femelle. L'activation des ovocytes dans les conditions définies de fréquence, d'intensité et de durée provoque l'expulsion du deuxième globule polaire. On peut alors prélever les chromosomes qui se trouvent en fin de télophase juste sous le deuxième globule polaire. On dispose d'ovocytes dans le même état physiologique possédant un pronucleus.In fact, by introducing Ca + ions into the pulse medium, they will be able to penetrate the cell by electroporation, that is to say the creation of "pores" generated by the electric pulse. Beyond the immediate phenomena caused in the oocyte such as the expulsion of the polar body, the effects of this stimulation will manifest themselves in the later stages of the development of the embryo, even when the treatment has stopped. This is how the phenomena of compaction and cavitation can be affected. This process can be applied to freshly produced oocytes, obtained by hormonal stimulation of the female. The activation of oocytes under the defined conditions of frequency, intensity and duration causes the expulsion of the second polar body. We can then take the chromosomes which are at the end of telophase just below the second polar body. There are oocytes in the same physiological state with a pronucleus.
On introduit alors un blastomère sous la zone pellucide et on procède à la fusion cellulaire par action d'un champ électrique. Le procédé peut alors s'appliquer aux embryons clones ainsi obtenus, afin d'améliorer leur développement, c'est-à-dire de régulariser les divisions cellulaires et d'obtenir la compaction.A blastomer is then introduced under the pellucid zone and the cell fusion is carried out by the action of an electric field. The process can then be applied to cloned embryos thus obtained, in order to improve their development, that is to say to regularize cell divisions and obtain compaction.
La stimulation par ce procédé peut s'appliquer à des ovocytes fraichement ovules placés en présence d'un inhibiteur, de l'expulsion du deuxième globule polaire, comme la cytochalasine B, qui maintient un état diploîde. On obtient ainsi une population d'embryons parthenogénétiques, qui pourront être implantés dans des femelles receveuses et présenteront un développement synchrone du foetus et des annexes embryonnaires.Stimulation by this process can be applied to freshly ovulated oocytes placed in the presence of an inhibitor, the expulsion of the second polar body, such as cytochalasin B, which maintains a diploid state. We thus obtain a population of parthenogenetic embryos, which can be implanted in recipient females and will present a synchronous development of the fetus and embryonic appendages.
Ces expériences d'abord menées sur des ovocytes de lapine ont été confirmées sur des ovocytes de souris, réputés réfractaires à l'activation juste après l'ovulation. Les performances du procédé sont donc reproduc¬ tibles d'une espèce à l'autre. La méthode d'activation pourra certainement s'appliquer à des ovocytes fraichement ovules de bovin ou d'ovin.These experiments, which were first carried out on rabbit oocytes, were confirmed on mouse oocytes, said to be refractory to activation just after ovulation. The performance of the process is therefore reproducible from one species to another. The activation method can certainly be applied to freshly bovine or ovine oocytes.
Si l'on soustrait les ovocytes en cours de traitement, ils régressent et on obtient certains artefacts, comme des ovocytes en metaphase III reproductibles à volonté, et qui offrent de nouvelles possibilités d'études, notamment sur la dynamique du cytosquelette et l'activation du génome.If we subtract the oocytes during treatment, they regress and we obtain certain artefacts, such as metaphase III oocytes reproducible at will, and which offer new possibilities for study, in particular on the dynamics of the cytoskeleton and activation. of the genome.
Le procédé a été conçu sur la base des effets des champs électriques sur les membranes plasmiques.The process was designed based on the effects of electric fields on plasma membranes.
Il a été montré (Zimmermann, 1982) que des impulsions de champs électriques de l'ordre de 1 à 3 kVcm-1 et d'une durée de quelques μs peuvent créer des micropores dans la membrane plasmique et établir une communication directe entre les milieux intra et extra cellulaire. Il a été ainsi possible par exemple de faire pénétrer du calcium dans des ovocytes d'oursin en les exposant à des impulsions de champs électriques en présence d'ions calcium (Rossignol et al 1983). L'amplitude de ces influx peut être modulée par la durée de l'impulsion de champ électrique.It has been shown (Zimmermann, 1982) that pulses of electric fields of the order of 1 to 3 kVcm-1 and lasting a few μs can create micropores in the plasma membrane and establish a direct communication between the intra and extra cellular environments. It was thus possible, for example, to bring calcium into sea urchin oocytes by exposing them to pulses of electric fields in the presence of calcium ions (Rossignol et al 1983). The amplitude of these influxes can be modulated by the duration of the electric field pulse.
Le procédé implique la conjugaison d'une méthode de culture in vitro d'un lot d'ovocytes (ou embryons) par perfusion entre deux- électrodes et d'une méthode de lavage avec une solution non conductrice, contenant du calcium 0 à 30 μM, dans laquelle sont délivrées les impulsions. La présence d'une solution très faiblement conductrice, par exemple une solution isotomique de glucose contenant les ions Ca , au moment d'une impulsion permet de faire apparaître un champ électrique entre les électrodes. Une présence excessive d'ions diminue l'effet "champ élec¬ trique". De manière préférée, la concentration en ions Ca + est comprise entre 8 et 20 μM. De bons résultats sont obtenus par exemple pour une concentration en ions Ca valant 10 μM ou bien 16 μM. L'alternance d'une période de culture et d'une période de lavage permet de soumettre fréquemment les ovocytes à des stimulations dans un milieu ionique très bien défini.The process involves the combination of an in vitro culture method of a batch of oocytes (or embryos) by perfusion between two electrodes and a washing method with a non-conductive solution, containing calcium 0 to 30 μM , in which the pulses are delivered. The presence of a very weakly conductive solution, for example an isotomic solution of glucose containing the Ca ions, at the time of a pulse makes it possible to reveal an electric field between the electrodes. An excessive presence of ions decreases the "electric field" effect. Preferably, the concentration of Ca + ions is between 8 and 20 μM. Good results are obtained for example for a concentration of Ca ions equal to 10 μM or else 16 μM. The alternation of a culture period and a washing period makes it possible to frequently subject the oocytes to stimulation in a very well defined ionic medium.
Ce procédé peut s'étendre à la stimulation des cellules par toute une gamme de signaux simples ou complexes ioniques ou molécu¬ laires à des concentrations variables qui seront déterminés par la composition du milieu d'impulsion. Ce procédé permet de moduler la fréquence du signal par la durée entre deux lavages, et son amplitude par la durée de l'impulsion électrique.This process can extend to the stimulation of cells by a whole range of simple or complex ionic or molecular signals at variable concentrations which will be determined by the composition of the pulse medium. This process makes it possible to modulate the frequency of the signal by the duration between two washes, and its amplitude by the duration of the electrical pulse.
Il est impératif de remplacer totalement le milieu de culture par la solution d'impulsion, car l'intensité du courant due à des excès d'ions provenant du milieu de culture détruirait les ovocytes. Juste après l'impulsion, la solution d'impulsion est remplacée par le milieu de culture, les ovocytes ne pouvant pas survivre dans la solution d'impulsion. Ce procédé peut être piloté par l'intermédiaire d'un logiciel qui permettra de créer des traitement de stimulation selon des équations spécifiques, exporentielles, sinusoïdales, suites de Fourier ou autres.It is imperative to completely replace the culture medium with the pulse solution, because the intensity of the current due to excess ions from the culture medium would destroy the oocytes. Immediately after the pulse, the pulse solution is replaced by the culture medium, as the oocytes cannot survive in the pulse solution. This process can be controlled by means of software which will make it possible to create stimulation treatments according to specific, exporential, sinusoidal equations, Fourier sequences or others.
L'un des aspects de la présente invention est le traitement simultané d'un ensemble d'ovocytes, qui seront ainsi obtenus, activés dans le même état physiologique. Les greffes de noyau pourront ainsi être réalisées sur des ovocytes physiologiquement identiques.One of the aspects of the present invention is the simultaneous treatment of a set of oocytes, which will thus be obtained, activated in the same physiological state. The core transplants can thus be performed on physiologically identical oocytes.
Lors du clonage, la séquence et les phases du cycle cellulaire durant lesquelles sont enchaînées les opérations ont des conséquences très importantes sur le remodelage des noyaux et sur le développement ultérieur.During cloning, the sequence and the phases of the cell cycle during which the operations are linked have very important consequences on the remodeling of the nuclei and on the subsequent development.
Il est extrêmement intéressant de pouvoir standardiser les différentes phases du traitement des ovocytes, afin d'obtenir une bonne reproductibilité du procédé. La présente invention concerne donc un système dynamique, fonctionnant en continu et pouvant être automatisé, réalisé par un dispositif permettant la succession automatique des étapes de lavage, de stimulation et l'acquisition des paramètres de stimulation.It is extremely interesting to be able to standardize the different phases of oocyte processing, in order to obtain good reproducibility of the process. The present invention therefore relates to a dynamic system, operating continuously and which can be automated, produced by a device allowing the automatic succession of the washing and stimulation stages and the acquisition of the stimulation parameters.
Ce dispositif est caractérisé par le fait qu'il assure l'immobi- lisation des cellules pendant les différentes phases du traitement.This device is characterized by the fact that it immobilizes the cells during the different phases of the treatment.
Différents modes de réalisation de ce dispositif apparaissent sur les figures I et 3.Different embodiments of this device appear in Figures I and 3.
Il est constitué d'une enceinte comportant au moins une arrivée de fluide (10, 11) et une sortie de fluide (6) et, est caractérisé en ce qu'à la partie inférieure de l'enceinte se trouvent un ou plusieurs orifices (4) dont la géométrie est telle qu'elle s'oppose au passage des cellules et en ce que le liquide entrant dans l'enceinte est prélevé, au moins en partie, à travers les orifices, en créant une dépression telle qu'elle assure sensiblement le blocage des cellules sur le ou les orifices, une partie du fluide étant évacuée par débordement.It consists of an enclosure comprising at least one fluid inlet (10, 11) and a fluid outlet (6) and, is characterized in that at the bottom of the enclosure there are one or more orifices ( 4) whose geometry is such that it opposes the passage of the cells and in that the liquid entering the enclosure is withdrawn, at least in part, through the orifices, creating a depression as it ensures substantially blocking the cells on the orifice (s), part of the fluid being evacuated by overflow.
Ce dispositif permet de retenir les cellules sans les abimer ni introduire une contrainte mécanique parasite. En outre, il permet à tout moment de replacer, prélever ou déplacer des cellules. Ce dispositif permet donc de placer successivement les cellules dans des milieux de composition chimique de différentes natures, durant des périodes et selon une fréquence variables. L'enceinte comporte sur ses parois internes deux électrodes, de préférence parallèles, et le ou les orifices sont alignés à égaie distance des électrodes, baignant dans le milieu correspondant à la phase du traitement en cours.This device makes it possible to retain the cells without damaging them or introducing parasitic mechanical stress. In addition, it allows everything when to replace, remove or move cells. This device therefore makes it possible to successively place the cells in media of chemical composition of different natures, for periods and according to a variable frequency. The enclosure has on its internal walls two electrodes, preferably parallel, and the orifice (s) are aligned at equal distance from the electrodes, immersed in the medium corresponding to the phase of the treatment in progress.
Grâce à ce dispositif, on peut à volonté cultiver ies cellules ou bien dans le milieu d'impulsion faire pénétrer dans la cellule traitée, un ion, une molécule, une substance chimique ou biologique complexe.Thanks to this device, it is possible to cultivate the cells at will or else into the impulse medium to penetrate into the treated cell, an ion, a molecule, a complex chemical or biological substance.
Ce dispositif permet en particulier le traitement dans une même enceinte d'un ensemble d'ovocytes, en grand nombre, sans qu'il soit nécessaire de les placer dans des compartiments séparés. En particulier, le dispositif comporte au moins deux arrivées de fluide, qui peuvent être superposées.This device allows in particular the treatment in a single enclosure of a large number of oocytes, without the need to place them in separate compartments. In particular, the device comprises at least two fluid inlets, which can be superimposed.
L'évacuation des fluides pourra également se faire latéra¬ lement.The evacuation of fluids can also be done laterally.
A chaque milieu arrivant successivement dans la chambre, correspond une tubulure d'injection distincte.Each medium arriving successively in the chamber corresponds to a separate injection tube.
Au moment de l'injection du milieu d'impulsion, un système d'aspiration adapté sur le dispositif d'arrivée du milieu de culture permet la succion d'une petite quantité du milieu d'impulsion qui pénètre dans la canalisation d'arrivée du milieu de culture ; on évite ainsi que les ions du milieu de culture pénètrent dans la chambre durant les lavages. La circulation des flux de milieu est représentée par des flèches sur la figure 3.When the pulse medium is injected, a suitable suction system on the culture medium inlet device allows the suction of a small quantity of the pulse medium which enters the inlet pipe of the culture medium. culture centre ; this prevents ions from the culture medium from entering the chamber during the washings. The circulation of the medium flows is represented by arrows in FIG. 3.
Ces milieux, aussi bien le milieu de culture que le milieu d'impulsion, sont en circulation continue, et c'est ce flux de liquide qui par effet de succion assure le maintien des ovocytes entre les électrodes pendant les renouvellements du milieu.These media, both the culture medium and the pulse medium, are in continuous circulation, and it is this flow of liquid which by suction effect ensures the maintenance of the oocytes between the electrodes during the renewal of the medium.
Les compositions des milieux de culture sont connues et dépendent des cellules en culture. Le milieu d'impulsion est généralement constitué d'un milieu non ionique pour assurer un effet de champ. Il s'agira d'une solution isotonique par exemple de glucose.The compositions of the culture media are known and depend on the cells in culture. The pulse medium is usually consisting of a non-ionic medium to ensure a field effect. It will be an isotonic solution for example of glucose.
La présence d'une grande quantité d'ions peut gravement nuire aux cellules lors de l'impulsion. Il est donc nécessaire de laver les cellules avec le milieu d'impulsion pour éliminer les ions contenus dans le milieu de cult ure.The presence of a large amount of ions can seriously damage cells during the pulse. It is therefore necessary to wash the cells with the pulse medium to remove the ions contained in the culture medium.
Ce dispositif peut être conçu comme une chambre d'activation, dont la capacité peut être adaptée au nombre de cellules que l'on souhaite traiter simultanément. Les caractéristiques du procédé mettant en oeuvre le dispositif, peuvent varier largement et ne sont en général limitées que par des conditions telles que ies durées de lavage. Ainsi, la fréquence des impulsions est limitée par la durée de lavage minimum par le milieu d'impulsion. Les paramètres du procédé et du dispositif c'est-à-dire les arrivées et les sorties de fluide, de même que la fréquence, la durée et l'intensité des impulsions électriques arrivant dans les électrodes sont gérées par un système électronique.This device can be designed as an activation chamber, the capacity of which can be adapted to the number of cells which it is desired to treat simultaneously. The characteristics of the process using the device can vary widely and are generally only limited by conditions such as washing times. Thus, the frequency of the pulses is limited by the minimum washing time by the pulse medium. The parameters of the process and of the device, that is to say the inflows and outflows of fluid, as well as the frequency, the duration and the intensity of the electrical pulses arriving in the electrodes are managed by an electronic system.
Les caractéristiques des impulsions électriques en elles-mêmes peuvent varier et dépendre des cellules et des buts recherchés.The characteristics of the electrical pulses in themselves can vary and depend on the cells and the objectives sought.
En général, les champs électriques varient de 1 à 3 v. cm" et l'impulsion électrique aube durée de 10 μs à 2 000 μs.In general, the electric fields vary from 1 to 3 v. cm " and the dawn electric pulse duration from 10 μs to 2000 μs.
La fréquence et la durée des impulsions peuvent varier au cours des différentes étapes d'un même processus de stimulation. L'organisation des tubulures qui débouchent dans la chambre permet d'injecter des milieux sans que les ovocytes soient décrochés par les bulles de gaz qui finissent par se former dans les canalisations. De plus, la structure de distribution des milieux permet de limiter considérablement la contamination ionique du milieu de stimulation par les ions du milieu de culture. Les pompes d'injection des milieux peuvent être commandées par un microordinateur qui déterminera les séquences de lavage répétables tout en maintenant les cellules entre les électrodes.The frequency and duration of the pulses can vary during different stages of the same stimulation process. The organization of the tubes which open into the chamber allows media to be injected without the oocytes being taken down by the gas bubbles which eventually form in the pipes. In addition, the distribution structure of the media makes it possible to considerably limit the ionic contamination of the stimulation medium by the ions of the culture medium. The media injection pumps can be controlled by a microcomputer which will determine the repeatable washing sequences while keeping the cells between the electrodes.
Ce dispositif pourra s'appliquer au traitement des cellules par toute substance que l'on souhaite faire pénétrer dans l'espace intracellu¬ laire. La composition du milieu d'impulsion déterminera la pénétration de cette substance selon un gradient de concentration.This device can be applied to the treatment of cells with any substance that one wishes to penetrate into the intracellular space. The composition of the pulse medium will determine the penetration of this substance according to a concentration gradient.
Lors d'une culture cellulaire, on pourra provoquer, à un moment déterminé, qui peut être unique, l'entrée dans l'ensemble des cellules de la substance souhaitée. Pour cela on remplacera le milieu de culture par le milieu d'impulsion et on déclenchera l'impulsion de champ électrique, la durée de l'impulsion déterminant la quantité de substance qui pénètre. Ce milieu d'impulsion pourra alors être évacué et les cellules remises en culture dans un milieu approprié. L'avantage- de ce système est qu'il permet de traiter simultanément un ensemble de cellules qui sont ainsi synchronisées. Il fonctionne en continu et évite toute manipulation des cellules, assurant ainsi une meilleure reproductibilité et une plus grande rapidité d'exécution. Ceci permet une standardisation des conditions et facilite le transfert de technologies. On peut envisager de faire pénétrer dans les cellules un ion ou une molécule simple. Ce dispositif peut aussi s'appliquer à la stimulation des cellules par une molécule plus complexe, ou à la pénétration de fragments d'ADN, ou d'épisome.During a cell culture, it will be possible to cause, at a determined time, which may be unique, the entry into all of the cells of the desired substance. For this, the culture medium will be replaced by the pulse medium and the electric field pulse will be triggered, the duration of the pulse determining the quantity of substance which penetrates. This pulse medium can then be removed and the cells returned to culture in an appropriate medium. The advantage of this system is that it allows simultaneous processing of a set of cells which are thus synchronized. It works continuously and avoids any manipulation of the cells, thus ensuring better reproducibility and greater speed of execution. This allows standardization of conditions and facilitates technology transfer. It is conceivable to make an ion or a simple molecule enter cells. This device can also be applied to the stimulation of cells by a more complex molecule, or to the penetration of DNA fragments, or episomes.
Ce dispositif sera utilisé pour réaliser une stimulation cyclique des cellules, plusieurs séquences de base étant réalisées successivement, l'intensité, la durée et la fréquence des impulsions pilotées par l'intermédiaire d'un microordinateur. Ce dispositif permet la réalisation du procédé d'activation et de synchronisation d'ovocytes, par des stimulations répétées par Ca +, en vue du clonage d'embryons d'animaux domestiques. Un mode de réalisation de la chambre est représenté en figureThis device will be used to carry out a cyclic stimulation of the cells, several basic sequences being carried out successively, the intensity, the duration and the frequency of the pulses controlled by means of a microcomputer. This device makes it possible to carry out the activation and synchronization process of oocytes, by repeated stimulations with Ca + , for the cloning of domestic animal embryos. An embodiment of the chamber is represented in figure
1.1.
Les ovocytes 1 sont placés sur une fente rectiligne 4, réalisée par la juxtaposition de deux plaques de verre 3 et 5, dont l'écartement est inférieur au diamètre des ovocytes. Les milieux, milieu de culture et milieu d'impulsion, arrivent dans la partie supérieure de la chambre chacun par une tubulure distincte, respectivement 10 et 1 1, évitant une contamination réciproque.The oocytes 1 are placed on a rectilinear slit 4, produced by the juxtaposition of two glass plates 3 and 5, the spacing of which is less than the diameter of the oocytes. The media, culture medium and pulse medium, arrive in the upper part of the chamber each through a separate tube, respectively 10 and 11, avoiding reciprocal contamination.
Le milieu 9 correspondant à la phase de traitement en cours arrive en continu et est évacué par une tubulure 6 située à un niveau plus bas que celui des ovocytes. Ce courant de liquide maintient par succion les ovocytes plaqués sur le fond de la chambre.The medium 9 corresponding to the current treatment phase arrives continuously and is discharged through a tube 6 located at a lower level than that of the oocytes. This current of liquid keeps the oocytes pressed against the bottom of the chamber by suction.
Sur les parois internes de la chambre se trouvent deux électrodes de platine 2 et 7, parallèles, de 1 cm de long. L'enceinte 8 est thermostatée à 38°C. Chaque milieu arrive dans la chambre après passage par un système retenant les bulles de gaz de taille importante.On the inner walls of the chamber are two platinum electrodes 2 and 7, parallel, 1 cm long. Enclosure 8 is thermostatically controlled at 38 ° C. Each medium arrives in the chamber after passing through a system retaining the large gas bubbles.
Ce système est constitué d'un ballon de verre dans lequel le liquide arrive. De ce ballon part une tige d'or perforée de trous de petit diamètre ; après passage à travers cette tige, les bulles de gaz de taille importante sont retenues et le liquide arrive dans la chambre par une tubulure courte.This system consists of a glass balloon into which the liquid arrives. From this balloon leaves a gold rod perforated with small diameter holes; after passing through this rod, the gas bubbles of large size are retained and the liquid arrives in the chamber through a short tube.
Des lapines ont été superovulées par injection de FSH et deRabbits were superovulated by injection of FSH and
LH, et les ovocytes prélevés dans les oviductes. Après traitement 5 mn par la hyaluronidase, les ovocytes sont placés dans la chambre d'activation, dans le milieu B2 (Menezo, 1976 - C. Hebd. Seanc. Acad. Sci. Paris 282,LH, and oocytes taken from the oviducts. After 5 min treatment with hyaluronidase, the oocytes are placed in the activation chamber, in medium B2 (Menezo, 1976 - C. Hebd. Seanc. Acad. Sci. Paris 282,
1967-1970) à 38°C, dans une atmosphère à 5 % de C02.1967-1970) at 38 ° C, in an atmosphere containing 5% C0 2 .
Les ovocytes peuvent immédiatement être soumis au traitement d'activation, aucune période de viell ssement n'est nécessaire. Ils sont soumis pendant 90 minutes à une série d'impulsions de champ électrique, à un rythme d'une impulsion toutes les 4 minutes, soit 22 impulsions de durée décroissante dissipant une énergie totale 1250 μjoules, d'une durée totale de 14 868 μs, le champ électrique a une valeur de 1,8 Kv. cm" .Oocytes can be immediately subjected to activation treatment, no aging period is necessary. They are subjected for 90 minutes to a series of pulses of electric field, at a rate of one pulse every 4 minutes, that is to say 22 pulses of decreasing duration dissipating a total energy 1250 μjoules, of a total duration of 14 868 μs , the electric field has a value of 1.8 Kv. cm " .
Avant chaque impulsion, le milieu de culture est remplacé par un milieu d'impulsion constitué d'une solution isotonique de glucose contenant Cad-, l OμM.Before each pulse, the culture medium is replaced by a pulse medium consisting of an isotonic glucose solution containing Cad-, l OμM.
A la fin du traitement d'activation, tous les ovocytes ont deux globules polaires bien formés. On obtient donc au même moment, à quelques minutes près, une population homogène d'ovocytes activés dans le même état physiologique. Cela présente deux atouts : le premier est de pouvoir toujours réaliser les greffes de noyau dans des oeufs physiologi- quement identiques, le second, plus pratique, est de pouvoir opérer au moment où les chromosomes (haploïdes) se trouvent tous en fin de télophase juste sous le deuxième globule polaire. Ce repérage naturel de l'endroit où se trouvent les chromosomes facilite leur retrait en "aveugle" et permet, sans avoir recours à des techniques de marquage fluorescent, d'enchaîner rapidement les étapes de manipulations. On peut alors effectuer le prélèvement des chromosomes. On remarque que les deux globules polaires ne sont pas toujours accolés (certains sont à l'opposé l'un de l'autre, c'est pourquoi le premier globule polaire n'est pas un bon marqueur de l'endroit où se trouvent les chromo¬ somes maternels). L'efficacité de cette opération, vérifiée par la présence ultérieure d'un pronucleus, est supérieure à 80 %. Un blastomère est ensuite introduit sous la zone pellucide. Quinze à 20 ovocytes peuvent être manipulés en 1 heure.At the end of the activation treatment, all oocytes have two well-formed polar cells. A homogeneous population of activated oocytes in the same physiological state is therefore obtained at the same time, within a few minutes. This has two advantages: the first is to always be able to perform nucleus transplants in physiologically identical eggs, the second, more practical, is to be able to operate when the chromosomes (haploids) are all at the end of just telophase. under the second polar body. This natural location of the place where the chromosomes are located facilitates their "blind" removal and allows, without resorting to fluorescent labeling techniques, to quickly chain the manipulation steps. The chromosomes can then be removed. We notice that the two polar globules are not always joined (some are opposite one another, this is why the first polar globule is not a good marker of the place where the maternal chromosomes). The effectiveness of this operation, verified by the subsequent presence of a pronucleus, is greater than 80%. A blastomer is then introduced under the skin area. Fifteen to 20 oocytes can be handled in 1 hour.
On procède ensuite à la fusion cellulaire. La méthode de fusion cellulaire dérive des travaux de Zimmerman sur les champs électriques. La procédure a été affinée. (Ozil et Modlinski 1986, J. Embryol.The cell fusion is then carried out. The cell fusion method derives from Zimmerman's work on electric fields. The procedure has been refined. (Ozil and Modlinski 1986, J. Embryol.
Exp. Morph. 96, 211-228).Exp. Morph. 96, 211-228).
On obtient 100 % de fusion. Il sera possible de réaliser automatiquement, sous le contrôle d'un logiciel, l'alignement et la fusion cellulaire dans la chambre de stimulation. Cette procédure permettra de limiter la durée des manipulations et de standardiser les conditions expérimentales. EXEMPLE I100% fusion is obtained. It will be possible to automatically perform, under software control, cell alignment and fusion in the stimulation chamber. This procedure will limit the duration of the manipulations and standardize the experimental conditions. EXAMPLE I
MATERIELS ET METHODESMATERIALS AND METHODS
On a induit une superovulation chez les femelles de lapin sexuellement matures d'espèces variées par injection sous-cutanée d'hormone stimulant le follicule (FSH) et d'hormone lutéinisante (LH) en accord avec la technique décrite par ennely et Foote (1965) et modifée par Thibault (communication personnelle). Les femelles ont reçu 2 mg de FSH en cinq injections à 12 heures d'intervalle : 0,250, 0,250, 0,650, 0,650 et 0,250 mg. 12 heures plus tard, avant la saillie par un mâle vasectomisé, on leur a injecté 0,33 mg de LH.Superovulation was induced in sexually mature female rabbits of various species by subcutaneous injection of follicle stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH) in accordance with the technique described by ennely and Foote (1965 ) and modified by Thibault (personal communication). Females received 2 mg of FSH in five injections 12 hours apart: 0.250, 0.250, 0.650, 0.650 and 0.250 mg. 12 hours later, before a vasectomized male protruded, they were injected with 0.33 mg of LH.
Les ovocytes ont été récupérés à partir des oviductes 12-15 h après la saillie par lavage par une solution saline de phosphate tamponné (PBS). Ils ont été incubés pendant 5 minutes dans l'hyaluronidase (300 i.u.ml-1 dans du PBS) pour éliminer les cellules folliculaires. Après le traitement, les ovocytes ont été cultivés à 38° dans du milieu B2 (Ménézo 1976) dans une atmosphère à 5 % de C02.The oocytes were recovered from the oviducts 12-15 h after the projection by washing with a buffered phosphate saline solution (PBS). They were incubated for 5 minutes in hyaluronidase (300 i.u.ml-1 in PBS) to eliminate the follicular cells. After the treatment, the oocytes were cultured at 38 ° in B2 medium (Ménézo 1976) in an atmosphere containing 5% CO 2.
Méthode et procédure expérimentaleExperimental method and procedure
La perméabilité membranaire des ovocytes de lapin fraiche¬ ment ovuiées a été transitoirement augmentée par ouverture des pores par une impulsion induite par un champ électrique en présence de Ca """ 10 μM contenu dans une solution de glucose 0,3 M - 18 MOhm H20 (milieu d'impulsion). Il est admis que, pendant que les pores sont ouverts, un flux d'ions circule selon les gradients de concentration à travers la membrane cellulaire vers l'intérieur du cytosol comme cela a déjà été montré dans des ovocytes d'oursin (Rossignol et al, 1983). Ainsi, l'influx ionique peut être ajusté dans ces conditions soit par la différence de concentration ionique entre l'intérieur et l'extérieur de la cellule soit par la durée des impulsions.The membrane permeability of freshly ovipressed rabbit oocytes was transiently increased by opening the pores by a pulse induced by an electric field in the presence of Ca " "" 10 μM contained in a 0.3 M - 18 MOhm H20 glucose solution. (pulse medium) It is recognized that, while the pores are open, an ion flow circulates according to the concentration gradients through the cell membrane towards the interior of the cytosol as has already been shown in oocytes sea urchin (Rossignol et al, 1983), so the ion influx can be adjusted under these conditions either by the difference in ion concentration between the inside and outside of the cell or by the duration of the pulses.
La procédure expérimentale pour un flux ionique induit électriquement était similaire à celle précédemment décrite pour la fusion par champ électrique d'embryons de lapin à deux cellules (Ozil et Modlinski 1986). Les ovocytes sont cultivés avec du milieu Ml (Whittingham, 1 71 ) à 38°C dans une chambre spécialement conçue. Avant chaque impulsion, le milieu de culture est automatiquement remplacé par le milieu d'impulsion. Les détails de la chambre sont décrits dans la figure 1. Chaque impulsion était composée de deux impulsions alternatives afin d'éviter " une éiectrophorèse latérale " (Jaffe 1977) des protéines de membrane qui pourrait intervenir après plusieurs impulsions de la même polarité (Poo,The experimental procedure for an electrically induced ion flux was similar to that previously described for the electric field fusion of two-cell rabbit embryos (Ozil and Modlinski 1986). The oocytes are cultured with Ml medium (Whittingham, 1 71) at 38 ° C in a specially designed chamber. Before each pulse, the culture medium is automatically replaced by the pulse medium. The details of the chamber are described in Figure 1. Each pulse was composed of two alternative pulses in order to avoid "lateral electrophoresis" (Jaffe 1977) of the membrane proteins which could occur after several pulses of the same polarity (Poo,
1981 ). L'amplitude du signal ionique était modulé à travers la durée de l'impulsion. Le processus en entier était contrôlé par un micro-ordinateur IBM PC-AT 286 par l'intermédiaire d'une interface Tektronix MI 5010 avec un programme écrit en MS-BASIC. Le voltage réel et le courant entre les électrodes étaient mesurés par un oscilloscope Tektronix 7704 1 monté avec un convertisseur numérique programmable 7D20 et un amplificateur 7A22.nineteen eighty one ). The amplitude of the ion signal was modulated over the duration of the pulse. The entire process was controlled by an IBM PC-AT 286 microcomputer via a Tektronix MI 5010 interface with a program written in MS-BASIC. The actual voltage and current between the electrodes were measured by a Tektronix 7704 1 oscilloscope mounted with a programmable digital converter 7D20 and an amplifier 7A22.
Le rythme des impulsions électriques et la durée totale du traitement étaient les mêmes pour tous ies traitements, c'est-à-dire appliquer une impulsion toutes les quatres minutes pendant 90 minutes. Ces valeurs ont été choisies parce qu'elles s'accordent bien avec la fréquence et la durée moyenne de l'hyperpolarisation du potentiel de membrane des ovocytes de lapin pendant la fécondation (22 oscillations biphasiques du potentiel membranaire pendant les premières 90 minutes suivant la fusion sperme-oeuf, une impulsion toute les 4 minutes -McCulloh et al., 1983). On sait que la variation du potentiel de membrane reflète le passage de K basé sur des canaux activés par le calcium et qu'elles constituent donc un indicateur fiable de [Ca +]. (Miyazaki et Igusa 1982). L'amplitude de champs électriques ( 1.8 kVcm-1) était constante pour tout les groupes expérimentaux.The rhythm of the electrical pulses and the total duration of the treatment were the same for all the treatments, that is to say applying one pulse every four minutes for 90 minutes. These values were chosen because they agree well with the frequency and the average duration of the hyperpolarization of the membrane potential of rabbit oocytes during fertilization (22 biphasic oscillations of the membrane potential during the first 90 minutes after fusion sperm-egg, one pulse every 4 minutes -McCulloh et al., 1983). We know that the variation of the membrane potential reflects the passage of K based on calcium activated channels and that they therefore constitute a reliable indicator of [Ca + ]. (Miyazaki and Igusa 1982). The amplitude of electric fields (1.8 kVcm-1) was constant for all the experimental groups.
Traitement des ovocytesOocyte treatment
Les effets des différents paramètres du traitement sur l'activation des ovocytes ont été étudiés dans quatre groupes expérimen- taux. Groupe A - Environnement expérimentalThe effects of the different treatment parameters on the activation of oocytes were studied in four experimental groups. Group A - Experimental environment
Afin de tester l'effet des conditions expérimentales (perfusion continue, remplacement du milieu de culture et impulsions électriques), des ovocytes fraichement ovules et des oeufs fécondés soumis à 22 doubles impuisions de 900 μs dans le milieu d'impulsion dépourvu de Ca + (la première impulsion est donnée 13 à 15 heures après la saillie). Après le traitement, les oeufs fécondés ont été transférés dans des receveuses pour déterminer la survie à terme. Les ovocytes non fécondés ont été cultivés in vitro et le taux d'activation parthénogénétique a été noté.In order to test the effect of the experimental conditions (continuous perfusion, replacement of the culture medium and electrical impulses), freshly ovulated oocytes and fertilized eggs subjected to 22 double impulses of 900 μs in the impulse medium devoid of Ca + ( the first impulse is given 13 to 15 hours after the projection). After treatment, the fertilized eggs were transferred to recipients to determine long-term survival. Unfertilized oocytes were cultured in vitro and the rate of parthenogenetic activation was noted.
Groupe B - ions calcium et durée des impuisionsGroup B - calcium ions and duration of impulses
L'effet de la durée des impulsions a été étudié dans le milieu d'impulsion contenant du CaC12 10 μM. Le traitement pour lequel ies ovocytes ne sont pas activés a été considéré comme étant la durée minimum et celui résulta nt dans la lyse des ovocytes a été considéré comme étant la durée maximum. Un jeu de six traitements avec 22 doubles impulsions constantes a été choisi arbitrairement. Ces traitements ont une durée d'impulsions égale à 200, 300, 600, 900, 1200 et 1500 μs respective-The effect of the pulse duration was studied in the pulse medium containing 10 μM CaC12. The treatment for which the oocytes are not activated was considered to be the minimum duration and that resulting in the lysis of the oocytes was considered to be the maximum duration. A set of six treatments with 22 constant double pulses was chosen arbitrarily. These treatments have a pulse duration equal to 200, 300, 600, 900, 1200 and 1500 μs respectively-
" ment. L'effet de la présence d'ions Na+ et Mg à une concentration de 10 μM dans le milieu d'impulsion a été testé avec 22 doubles impulsions constantes d'une durée de 900 μs."The effect of the presence of Na + and Mg ions at a concentration of 10 μM in the pulse medium was tested with 22 constant double pulses with a duration of 900 μs.
Groupe C - modulation des impulsions et type d'activation parthéno¬Group C - pulse modulation and type of partheno activation
génétiquegenetic
Le traitement avec 22 doubles impulsions de durée constante révèle la valeur de la durée de l'impulsion pour laquelle les effets maximum et minimum sont enregistrés. Ces traitements constants ne produisent pas un taux élevé d'activation avec un type uniforme d'oeufs parthénogénétiques. Afin de vérifier si une réduction progressive des stimuli calcium dans un traitement donné a un effet sur le type de réaction parthénogénétique, les ovocytes ont été soumis à des traitements dans lesquels la durée des impulsions décroissait peu à peu selon une relation exponentielle négative. Quatre traitements ont été testés en accord avec la durée maximum de la première impulsion. La figure 2 donne la courbe des durées d'impulsions pour ces traitements.Processing with 22 double pulses of constant duration reveals the value of the pulse duration for which the maximum and minimum effects are recorded. These constant treatments do not produce a high activation rate with a uniform type of parthenogenetic egg. In order to verify whether a gradual reduction in calcium stimuli in a given treatment has an effect on the type of parthenogenetic reaction, the oocytes were subjected to treatments in which the duration of the impulses gradually decreased according to a negative exponential relationship. Four treatments were tested in accordance with the maximum duration of the first pulse. FIG. 2 gives the curve of the pulse durations for these treatments.
Une relation exponentielle négative (D(u)=e (axutb)+c) entre l'indice de l'impulsion ( 1 à 22) et la durée d'impulsion (1500 μs à 200 μs) a été choisie arbitrairement pour trouver la valeur de chaque impulsion au cours du traitement.A negative exponential relationship (D (u) = e (axutb) + c) between the pulse index (1 to 22) and the pulse duration (1500 μs to 200 μs) was chosen arbitrarily to find the value of each pulse during processing.
Avec D(u) : durée d'impulsion du cycle (u). Le coefficient a détermine la pente de décroissance de cette relation.With D (u): cycle pulse duration (u). The coefficient a determines the slope of decrease of this relation.
Le coefficient b détermine la durée de la première impulsion. Le coefficient c détermine la durée de la dernière impulsion.The coefficient b determines the duration of the first pulse. The coefficient c determines the duration of the last pulse.
Les coefficients a et c sont constants et égaux respectivement à -0,4 et 200. b = 5,9920 pour le traitement I = 6,5510 pour le traitement II = 6,9080 pour le traitement IIIThe coefficients a and c are constant and equal to -0.4 and 200 respectively. B = 5.9920 for treatment I = 6.5510 for treatment II = 6.9080 for treatment III
= 7,1700 pour le traitement IV. Groupe D - Modulation du champ électrique et développement in vitro= 7.1700 for IV treatment. Group D - Modulation of the electric field and in vitro development
Les oeufs sont traités en présence de 8 μgml-1 de cytocha- lasine B dans le milieu de culture pour bloquer l'expulsion du second globule polaire et obtenir une population uniforme d'oeufs partheno¬ genetiques diploides. Deux traitements ont été appliqués au groupe C, le traitement I qui est le tra itement faible avec une durée totale d'impulsion égaie à 1 1 228 μs et le traitement III qui est le traitement fort avec une durée de 14 868μs. Les oeufs parthenogenetiques ont été cultivés in vitro jusqu'au stade blastocyste et l'influence des deux traitements a été évalué par le taux de formation de blastocyste. Viabilité au delà de l'implantation des embryons parthenogenetiquesThe eggs are treated in the presence of 8 μgml-1 of cytochaasin B in the culture medium to block the expulsion of the second polar globule and to obtain a uniform population of diploid parthenogenic eggs. Two treatments were applied to group C, treatment I which is the weak treatment with a total pulse duration equal to 11288 μs and treatment III which is the strong treatment with a duration of 14 868 μs. Parthenogenetic eggs were cultured in vitro up to the blastocyst stage and the influence of the two treatments was evaluated by the rate of blastocyst formation. Viability beyond the implantation of parthenogenetic embryos
diploidesdiploids
Les embryons au stade 4-cellules ont été transplantés dans ies oviductes de receveuses. Les oeufs fécondés ont également été transplantés dans la corne opposée de quelques receveuses afin de comparer le développement parthénogénétique au développement normal. Les receveu¬ ses ont été autopsiées entre le jour 8.5 et le jour 13 de la gestation et le nombre de sites d'implantation de foetus vivants a été noté.4-cell stage embryos were transplanted into recipient oviducts. The fertilized eggs were also transplanted into the opposite horn of a few recipients in order to compare parthenogenetic development with normal development. The recipients were autopsied between day 8.5 and day 13 of gestation and the number of implantation sites for living fetuses was noted.
RESULTATSRESULTS
Groupe A - Effet de l'environnement expérimental (contrôles)Group A - Effect of the experimental environment (controls)
Quant le milieu d'impulsion ne contient pas d'électrolytes, aucun des ovocytes (105) n'est activé. L'environnement expérimental et les conditions de culture c'est-à-dire le remplacement du milieu de culture avant chaque impulsion par un milieu d'impulsion ne contenant pas d'électrolytes et le traitement par des impulsions électriques relativement fortes (2 x 1.8 kVcm-lx900μs x 22 fois, c'est-à-dire une durée totale d'impulsions de 30 600 μs) n'a pas d'effet visible sur les ovocytes fraîchement ovules mais les conditions ne permettent pas de déclencher le développement. Par contre 41 % (9/22) des oeufs fécondés traités de la même manière se sont développés à terme démontrant ainsi que le traitement par des impulsions électriques de haut voltage n'a pas d'effet contraire sur la capacité de développement des ovocytes fécondés. Il n'était pas possible de remplacer totalement le milieu de culture par le milieu d'impulsion avant chaque impulsion. Le courant mesuré pendant l'impulsion révèle que la conductivité du milieu d'impulsion est au moins de 15 % supérieure à celle du milieu d'impulsions mesurée entre les électrodes avant expérience et avant la première injection de milieu de culture. Pendant l'expérimentation, des ions provenant du milieu de culture sont encore présents pendant les impulsions et ceci modifie le signal ionique. Ces variations du micro-environnement n'apparaissent pas comme ayant un quelconque effet significatif sur l'activation ou le développement embryonnaire. Dans cette série d'expérimentations, les oeufs sont lavés par le milieu d'impulsion pendant 45 secondes toutes les quatre minutes. Cette période pendant laquelle les oeufs ne sont pas dans le milieu de culture n'a pas d'effet significatif sur l'activation ou sur la survie à terme.When the pulse medium does not contain electrolytes, none of the oocytes (105) are activated. The experimental environment and the culture conditions, that is to say the replacement of the culture medium before each pulse with a pulse medium containing no electrolytes and the treatment with relatively strong electrical pulses (2 x 1.8 kVcm-lx900μs x 22 times, i.e. a total pulse duration of 30,600 μs) has no visible effect on freshly ovulated oocytes but the conditions do not allow development to be triggered. On the other hand 41% (9/22) of the fertilized eggs treated in the same way developed in the long term demonstrating thus that the treatment by high voltage electric impulses does not have a contrary effect on the development capacity of the fertilized oocytes . It was not possible to completely replace the culture medium with the pulse medium before each pulse. The current measured during the pulse reveals that the conductivity of the pulse medium is at least 15% higher than that of the pulse medium measured between the electrodes before the experiment and before the first injection of culture medium. During the experiment, ions from the culture medium are still present during the pulses and this modifies the ion signal. These variations in the microenvironment do not appear to have any significant effect on activation or embryonic development. In this series of experiments, the eggs are washed by the pulse medium for 45 seconds every four minutes. This period during which the eggs are not in the culture medium has no significant effect on activation or on long-term survival.
Groupe B - ions calcium et durée de l'impulsionGroup B - calcium ions and pulse duration
Le tableau I résume les résultats de l'expérimentation dans lequel le taux d'activation a été testé en relation avec la durée d'impulsion en présence de CaCl2 10 μM. L'apparition de pronuclei après 3 ou 4 heures de culture sert de marqueur pour l'activation parthénogénétique. Ces résultats montrent clairement que l'activation parthénogénétique est déclenchée quand le milieu d'impulsion contient Ca 10 μM.Table I summarizes the results of the experiment in which the activation rate was tested in relation to the pulse duration in the presence of 10 μM CaCl 2 . The appearance of pronuclei after 3 or 4 hours of culture serves as a marker for parthenogenetic activation. These results clearly show that parthenogenetic activation is triggered when the pulse medium contains Ca 10 μM.
De plus, le taux d'activation est directement relié à la durée de l'impulsion qui contrôle indirectement la stimulation par le calcium. La durée des stimuli ioniques n'influence pas seulement le taux d'activation mais aussi la configuration nucléaire des ovocytes parthénogénétiquement activés d'âge postovuiatoire semblables.In addition, the activation rate is directly related to the duration of the pulse which indirectly controls stimulation by calcium. The duration of ionic stimuli influences not only the activation rate but also the nuclear configuration of parthenogenetically activated oocytes of similar postovulatory age.
Plus la durée d'impulsion est longue, plus la proportion d'oeufs activés est élevée mais plus la proportion d'ovocytes contenant des micronuciei est importante.The longer the pulse duration, the higher the proportion of activated eggs but the greater the proportion of oocytes containing micronucia.
Groupe C - modulation des impulsions et type d'activation parthéno-Group C - pulse modulation and type of partheno activation
génétique.genetic.
Les résultats sont résumés dans le tableau II. La relation entre le type d'activation parthénogénétique et chaque traitement est également montrée dans le tableau III. Quand la durée de l'impulsion est réduite, tous les ovocytes sont activés et la majorité (91 %) d'entre . eux ont un pronucieus unique et deux globules polaires quand la méiose est terminée.The results are summarized in Table II. The relationship between the type of parthenogenetic activation and each treatment is also shown in Table III. When the pulse duration is reduced, all oocytes are activated and the majority (91%) of them. they have a single pronouncement and two polar cells when the meiosis is over.
Ainsi, la modulation des stimuli de calcium à travers la durée de l'impulsion semble être effective et influence les premières étapes du développement.Thus, the modulation of calcium stimuli over the duration of the pulse seems to be effective and influences the first stages of development.
Dans cette étude, l'âge des ovocytes était similaire et ne peut donc pas affecter les résultats. Groupe D - Effet de la modulation de champ électrique sur leIn this study, the age of the oocytes was similar and therefore cannot affect the results. Group D - Effect of electric field modulation on the
développement in vitro d'ovocytes activés par parthénogenèse.in vitro development of oocytes activated by parthenogenesis.
Les résultats sont résumés dans le tableau III. Aucune différence visible dans le développement de chaque groupe n'a pu être notée jusqu'à la troisième division. Dans les embryons parthenogenetiques produits par le traitement I, une proportion plus faible d'embryons présente une compaction et ceux qui se compactent sont irréguliers. Par contre, la majorité des embryons produits par le traitement III se compacte et se développe jusqu'au stade de blastocyste. Ces résultats montrent que la forme du stimulus d'activation a un effet profond sur la capacité des embryons parthenogenetiques à se développer jusqu'au stade de blastocyste in vitro.The results are summarized in Table III. No visible difference in the development of each group could be noted until the third division. In the parthenogenetic embryos produced by treatment I, a smaller proportion of embryos show compaction and those that compact are irregular. On the other hand, the majority of embryos produced by treatment III compacts and develops until the blastocyst stage. These results show that the shape of the activation stimulus has a profound effect on the ability of parthenogenetic embryos to develop up to the blastocyst stage in vitro.
Viabilité post-implantation des oeufs parthenogenetiques diploïdes.Post-implantation viability of diploid parthenogenetic eggs.
13 receveuses sont devenues gravides et ont été autopsiées entre le jour 8.5 et le jour 13. Les résultats sont résumés dans le tableau IV. Bien que les embryons parthenogenetiques soient plus petits que les embryons de contrôle, ils apparaissent morphologiquement normaux selon les critères définis pour le lapin. Le rapport entre la taille des annexes embryonnaires et celle du foetus est grossièrement équivalent pour les embryons obtenus par fécondation ou par parthénogenèse.13 recipients became pregnant and were autopsied between day 8.5 and day 13. The results are summarized in Table IV. Although the parthenogenic embryos are smaller than the control embryos, they appear morphologically normal according to the criteria defined for the rabbit. The ratio between the size of the embryonic appendages and that of the fetus is roughly equivalent for embryos obtained by fertilization or parthenogenesis.
Ainsi, il semble que le développement général des embryons parthenogenetiques, le foetus et ses tissus trophobiastiques soit ralenti. Les foetus morts ont plusieurs anomalies et il n'était pas possible de les classifier. Tableau 1 -Thus, it seems that the general development of parthenogenetic embryos, the fetus and its trophobiastic tissues is slowed down. Dead fetuses have several anomalies and it was not possible to classify them. Table 1 -
Effet de la présence d'ions calcium et durée de l'impulsion électrique sur l'activation des ovocytes de lapinEffect of the presence of calcium ions and duration of the electrical pulse on the activation of rabbit oocytes
Durée Nombre Nombre % % d'ovocytes activés avec d'impulsion d'ovocytes lysés (96) activés l PN+PB1 2PN 2PN#Duration Number Number%% of oocytes activated with pulse of lysed oocytes (96) activated l PN + PB1 2PN 2PN #
(μs) <5 PB2 +PB 1 *PB 1(μs) <5 PB2 + PB 1 * PB 1
200 μs 47 0 (0) 13 83 17 0 300 μs 99 0 (0) 62 68 25 7 600μs 85 0 (0) 98 71 19- 10 900 μs 63 0 (0) 100 62 14 24 1 200 μs 97 5 (5) 100 57. 29 14 1 500 μs 50 3 (6) 100 30 17 53200 μs 47 0 (0) 13 83 17 0 300 μs 99 0 (0) 62 68 25 7 600 μs 85 0 (0) 98 71 19- 10 900 μs 63 0 (0) 100 62 14 24 1 200 μs 97 5 ( 5) 100 57. 29 14 1,500 μs 50 3 (6) 100 30 17 53
Tableau 2 - Effet de la modulation du champ électrique sur l'activationTable 2 - Effect of modulation of the electric field on activation
Traitement Nombre % % ovocytes actives avec d'ovocytes activation 1 PN+PB1 2PN 2PN#Treatment Number%% active oocytes with activation oocytes 1 PN + PB1 2PN 2PN #
&PB2 -PB1 -PB1& PB2 -PB1 -PB1
I 86 88 83 9 8I 86 88 83 9 8
II 151 99 89 9 1 III 118 100 91 9 0 IV 96 100 70 25 5II 151 99 89 9 1 III 118 100 91 9 0 IV 96 100 70 25 5
# Pronuclei anormaux, petits micronuclei Tableau 3 -# Abnormal pronuclei, small micronuclei Table 3 -
Effet de la modulation de champ électrique sur le développement d'oeufs parthenogenetiques in vitroEffect of electric field modulation on the development of parthenogenetic eggs in vitro
Traitement Nombre Nombre Nombre Nombre d'ovocytes activation cultivés morulae blastocystes compact (%) (%)Treatment Number Number Number Number of activation oocytes cultivated blastocyst compact morulae (%) (%)
98 91 69 25(36) 23 (33)98 91 69 25 (36) 23 (33)
III 352 100 244 244( 100) 216 (88)III 352 100 244 244 (100) 216 (88)
Tableau 4 - Développement post-implantation d'oeufs parthenogenetiques soumis au traitement III.Table 4 - Post-implantation development of parthenogenetic eggs subjected to treatment III.
Jour de l'autopsie J 8-9 J 9-10 J 10-11 J 12-13 TotalDay of autopsy D 8-9 D 9-10 D 10-11 D 12-13 Total
Nombre d'oeufs transférés 21 26 50 68 165Number of eggs transferred 21 26 50 68 165
Nombre d'implan¬ tations 9 3 15 23 50Number of sites 9 3 15 23 50
% cumulé (42,8) (21,2) (27,8) (30,3)cumulative% (42.8) (21.2) (27.8) (30.3)
Nombre de foetus vivants 8 3 7 0 18Number of live fetuses 8 3 7 0 18
% cumulé (88,8) (91,6) (66,6) (36) EXEMPLE IIcumulative% (88.8) (91.6) (66.6) (36) EXAMPLE II
DEVELOPPEMENT PARTHENOGETIQUEPARTHENOGETIC DEVELOPMENT
Des ovocytes fraîchement collectés ( 13 h après la saillie avec un mâle vasectomisé) sont soumis à un traitement standard comprenant 22 impulsions (une toutes les 4 minutes) et dont leur durée totale est égale à 22 475μs (référence de travail : lex 1370).Freshly collected oocytes (13 h after the projection with a vasectomized male) are subjected to a standard treatment comprising 22 pulses (one every 4 minutes) and whose total duration is equal to 22,475 μs (working reference: lex 1370).
La concentration en calcium dans la solution d'impulsion est l'unique variable. Cinq valeurs ont été choisies : 10, 12, 14, 16, 18, 20μM de calcium. Le tableau ci-dessous récapitule les résultats.The only variable is the calcium concentration in the pulse solution. Five values were chosen: 10, 12, 14, 16, 18, 20 μM of calcium. The table below summarizes the results.
Figure imgf000025_0001
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Sur un total de 23 transplantation, le taux de gestation global, tous traitements confondus, est de 74 %. Parmi les receveuses qui sont devenues gravides, le taux d'implantation enregistré au 1,5e jour de gestation (la durée de gestation chez la lapine est de 29 jours) est de 28 %. La présence de foetus a pu être observée dans 64 % des cas et 28 % d'entre eux étaient encore vivants au moment de l'autopsie. Ces résultats globaux sont nettement au-dessus des résultats obtenus par les méthodes classiques : chez les souris, l'obtention de foetus à J 11 est très rare. Toutefois, le résultat le plus important réside dans l'effet de la concentration en calcium au moment des impulsions sur le dévelop¬ pement post-implantatoire. La figure 2 montre clairement que les taux d'implantation et de survie à 311 dépendent directement de ce paramètre. Le développement optimum a été obtenu avec une concentration de 16μM. Dans ce cas, nous avons obtenu un taux d'implantation record de 38 % (31 implantations sur 81 oeufs transplantés), dont 26 % de foetus. La comparaison morphologique des différents foetus obtenus révèle q_e c'est avec 16μM de calcium que les foetus ont la taille la plus grande.Out of a total of 23 transplants, the overall gestation rate, all treatments combined, is 74%. Among recipients who have become pregnant, the implantation rate recorded on the 1.5th day of gestation (the duration of gestation in rabbits is 29 days) is 28%. The presence of fetuses was observed in 64% of the cases and 28% of them were still alive at the time of the autopsy. These overall results are clearly above the results obtained by conventional methods: in mice, obtaining fetuses on D 11 is very rare. However, the most important result lies in the effect of the calcium concentration at the time of the pulses on post-implantation development. Figure 2 clearly shows that the implantation and survival rates at 311 depend directly on this parameter. Optimal development was obtained with a concentration of 16μM. In this case, we obtained a record implantation rate of 38% (31 implantations out of 81 transplanted eggs), including 26% of the fetus. The morphological comparison of the different fetuses obtained reveals that it is with 16 μM of calcium that the fetuses have the largest size.
Par ailleurs, nous avons observé que la présence de milieu de culture résiduel dans la proportion de 1/10000 en plus des 16μM de calcium est capable de modifier considérablement le développement car les annexes embryonnaires se développent mais les foetus sont pratiquement inexis¬ tants.Furthermore, we observed that the presence of residual culture medium in the proportion of 1/10000 in addition to the 16 μM of calcium is capable of modifying development considerably because the embryonic appendages develop but the fetuses are practically nonexistent.
Les paramètres de lavage doivent donc permettre de limiter la présence de milieu de culture résiduel au moment des impulsions. La présence de milieu résiduel augmente le nombre d'espèces ioniques susceptibles de pénétrer dans l'ovocyte au moment de l'électroperméabi- lisation de la membrane.The washing parameters must therefore make it possible to limit the presence of residual culture medium at the time of the pulses. The presence of residual medium increases the number of ionic species capable of entering the oocyte at the time of electropermeabilization of the membrane.
EXEMPLE IIIEXAMPLE III
ACTIVATION DE L'OVOCYTE DE SOURIS FRAICHEMENT OVULEACTIVATION OF THE FRESHLY OVULATED MOUSE OVOCYTE
Des ovocytes de souris fraîchement ovules (12 h post HCG) sont soumis à des traitements comprenant 33 impuisions, une toutes les 4 minutes durant 2 heures 12 minutes. Les traitements sont menés pour des concentrations en calcium dans la solution d'impulsion valant successivement 4μM, 8μM, 12μM, et 16μM et pour des durées d'impulsions variables.Freshly ovulated mouse oocytes (12 h post HCG) are subjected to treatments comprising 33 impulses, one every 4 minutes for 2 hours 12 minutes. The treatments are carried out for calcium concentrations in the pulse solution successively worth 4 μM, 8 μM, 12 μM, and 16 μM and for variable pulse durations.
Les dynamiques de formation du pronucléus peuvent être contrôlées en fonction de la concentration en calcium dans la solution d'impulsion et la durée totale des impulsions électriques (Vitullo, Ozil, 1991 ).The dynamics of pronuclei formation can be controlled as a function of the calcium concentration in the pulse solution and the total duration of the electrical pulses (Vitullo, Ozil, 1991).
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REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de stimulation artificielle d'un ensemble de cellules reproduisant l'effet d'un mécanisme de régulation biochimique, contrôlé dans les conditions physiologiques naturelles par un oscillateur interne, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) les cellules sont placées en culture in vitro pendant un temps déterminé, b) les cellules sont placées dans le milieu d'impulsion, après élimination du milieu de culture, c) on soumet les cellules à une impulsion générée par un champ électrique, d) les cellules sont à nouveau placées dans le milieu de culture, e) on répète les étapes précédentes un certain nombre de fois, f) on obtient des cellules dans un état activé homogène.1. Method of artificial stimulation of a set of cells reproducing the effect of a biochemical regulatory mechanism, controlled under natural physiological conditions by an internal oscillator, characterized in that it comprises the following stages: a) cells are placed in culture in vitro for a determined time, b) the cells are placed in the pulse medium, after elimination of the culture medium, c) the cells are subjected to an impulse generated by an electric field, d) the cells are again placed in the culture medium, e) the preceding steps are repeated a number of times, f) cells are obtained in a homogeneous activated state.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on l'applique à des ovocytes animaux fraîchement ovules.2. Method according to claim 1, characterized in that it is applied to freshly ovulated animal oocytes.
3. Procédé selon l'une des revendications l et 2, caractérisé en ce que l'impulsion provient d'un champ de 1 à 3 kV.cm" .3. Method according to one of claims l and 2, characterized in that the pulse comes from a field of 1 to 3 kV.cm " .
4. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'impulsion de champ électrique a une durée de 10 μs à 2000 μs. 4. Method according to one of claims 1 and 2, characterized in that the electric field pulse has a duration of 10 μs to 2000 μs.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la fréquence des impulsions est modulée par la durée entre deux lavages.5. Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that the frequency of the pulses is modulated by the duration between two washes.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la fréquence et la durée des impulsions peuvent varier au cours des différentes étapes d'un même processus de stimulation.6. Method according to one of claims 1 to 5, characterized in that the frequency and duration of the pulses can vary during the different stages of the same stimulation process.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le milieu d'impulsion est constitué d'un milieu sensiblement non ionique.7. Method according to one of claims 1 to 6, characterized in that the pulse medium consists of a substantially nonionic medium.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le milieu d'impulsion contient un ion ou un mélange d'ions, une molécule, une substance chimique ou biologique complexe, qui va pénétrer dans la cellule traitée. 8. Method according to one of claims 1 to 7, characterized in that the pulse medium contains an ion or a mixture of ions, a molecule, a complex chemical or biological substance, which will penetrate the treated cell.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le composé pénétrant dans la cellule a un rôle de messager.9. Method according to claim 8, characterized in that the compound entering the cell has a messaging role.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le milieu d'impulsion est constitué d'une solution isotonique de glucose et contient des ions Ca .10. Method according to one of claims 1 to 9, characterized in that the pulse medium consists of an isotonic solution of glucose and contains Ca ions.
11. Procédé selon l'une des revendication 1 à 10, caractérisé11. Method according to one of claims 1 to 10, characterized
_> en ce que la concentration en ions Ca est comprise entre 8 et 30 μM._> in that the concentration of Ca ions is between 8 and 30 μM.
12. Procédé selon l'une des revendications 6 à 1 1 , caractérisé en ce que les ovocytes sont traités par un inhibiteur de l'expulsion du globule polaire et constitueront une population d'oeufs parthenogenetiques diploïdes.12. Method according to one of claims 6 to 1 1, characterized in that the oocytes are treated with an inhibitor of the expulsion of the polar corpuscle and will constitute a population of diploid parthenogenetic eggs.
13. Procédé selon les revendications 1 et 3 à 1 1, caractérisé en ce qu'après l'étape f) on prélève les chromosomes de l'ovocyte, sous le deuxième globule polaire, ces ovocytes servant ensuite ,de récepteur pour une greffe de noyau provenant d'embryons à cloner.13. Method according to claims 1 and 3 to 1 1, characterized in that after step f) the chromosomes of the oocyte are removed, under the second polar globule, these oocytes then serving as receptors for a transplant of nucleus from embryos to be cloned.
14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les cellules traitées sont des oeufs greffés.14. Method according to one of claims 1 to 10, characterized in that the treated cells are grafted eggs.
15. Dispositif destiné notamment à la culture des ovocytes, permettant la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à i ^, du type comportant au moins une enceinte destinée à recevoir les ovocytes, ladite enceinte comportant au moins une arrivée de fluide et une sortie de fluide, caractérisé en ce que à la partie inférieure de l'enceinte se trouvent un ou plusieurs orifices dont la géométrie est telle qu'elle s'oppose au passage des ovocytes et en ce que le fluide entrant dans l'enceinte est prélevé, au moins en partie, à travers les orifices, en créant une dépression telle qu'elle assure sensiblement le blocage des ovocytes sur le ou les orifices, une partie du fluide étant évacuée par débordement, et en ce que l'enceinte comporte deux parois latérales sur lesquelles sont placées des électrodes.15. Device intended in particular for the culture of oocytes, allowing the implementation of the method according to one of claims 1 to i ^, of the type comprising at least one enclosure intended to receive oocytes, said enclosure comprising at least one inlet for fluid and a fluid outlet, characterized in that at the bottom of the enclosure there are one or more orifices whose geometry is such that it opposes the passage of oocytes and in that the fluid entering the enclosure is removed, at least in part, through the orifices, creating a depression such that it substantially ensures the blocking of the oocytes on the orifice (s), part of the fluid being evacuated by overflow, and in that the enclosure has two side walls on which electrodes are placed.
16. Dispositif selon la revendication 15, caractérisé en ce que les électrodessont parallèles, et en ce que le ou les orifices sont alignés à égale distance des électrodes. 16. Device according to claim 15, characterized in that the electrodes are parallel, and in that the orifice or orifices are aligned at equal distance from the electrodes.
17. Dispositif selon l'une des revendications 15 et 16, caractérisé en ce qu'il comporte au moins deux arrivées de fluide.17. Device according to one of claims 15 and 16, characterized in that it comprises at least two fluid inlets.
18. Dispositif selon l'une des revendications 15 à 17, caractérisé en ce que les deux arrivées de fluide sont superposées. 18. Device according to one of claims 15 to 17, characterized in that the two fluid inlets are superimposed.
19. Dispositif selon l'une des revendications 15 à 18, caractérisé en ce que l'orifice est un orifice unique constitué par une fente rectiligne dont la largeur est inférieure au diamètre des ovocytes et dont la longueur permet de traiter dans la même enceinte un grand nombre d'ovocytes. 19. Device according to one of claims 15 to 18, characterized in that the orifice is a single orifice constituted by a rectilinear slit whose width is less than the diameter of the oocytes and whose length makes it possible to treat in the same enclosure a large number of oocytes.
20. Dispositif selon l'une des revendications 15 à 19, caractérisé en ce que l'enceinte peut être isolée et placée dans une atmosphère de composition définie et/ou stérile.20. Device according to one of claims 15 to 19, characterized in that the enclosure can be isolated and placed in an atmosphere of defined and / or sterile composition.
21. Dispositif selon l'une des revendication 15 à 20, caractérisé en ce que le fluide arrive dans l'enceinte par une tubulure courte, après passage par un système évitant l'arrivée de bulles de gaz de taille importante.21. Device according to one of claims 15 to 20, characterized in that the fluid arrives in the enclosure by a short tube, after passage through a system preventing the arrival of gas bubbles of large size.
22. Dispositif selon la revendication 21, caractérisé en ce que le système est constitué d'un ballon de verre dans lequel arrive le fluide et d'une tuyauterie d'évacuation qui comprend un tube perforé de trous de très petit diamètre qui débouchent au voisinage du centre du ballon, ladite tuyauterie se raccordant sur la tubulure.22. Device according to claim 21, characterized in that the system consists of a glass balloon into which the fluid arrives and of an evacuation pipe which comprises a tube perforated with very small diameter holes which open in the vicinity from the center of the balloon, said piping connecting to the tubing.
23. Dispositif selon l'une des revendications 15 à 22, caractérisé en ce que l'arrivée supérieure permet l'injection de milieu d'impulsion et en ce que l'arrivée inférieure est munie d'un système d'aspiration permettant la succion d'une petite quantité du milieu d'impulsion, lors de l'injection dudit milieu d'impulsion.23. Device according to one of claims 15 to 22, characterized in that the upper inlet allows the injection of pulse medium and in that the lower inlet is provided with a suction system allowing the suction a small amount of the pulse medium, upon injection of said pulse medium.
24. Dispositif selon l'une des revendications 16 à 23, caractérisé en ce que la fréquence, la durée et l'intensité des impulsions arrivant dans les électrodes sont variables et gérées par un système électronique.24. Device according to one of claims 16 to 23, characterized in that the frequency, duration and intensity of the pulses arriving in the electrodes are variable and managed by an electronic system.
25. Dispositif selon l'une des revendications 15 à 24, caractérisé en ce qu'il permet de réaliser l'alignement des ovocytes et la fusion cellulaire par action d'une impulsion calibrée, générée par un champ électrique. 25. Device according to one of claims 15 to 24, characterized in that it makes it possible to carry out the alignment of the oocytes and the cell fusion by the action of a calibrated pulse, generated by an electric field.
26. Dispositif selon la revendication 25, caractérisé en ce que le traitement de fusion cellulaire est automatiquement géré par un système électronique.26. Device according to claim 25, characterized in that the cell fusion processing is automatically managed by an electronic system.
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