WO1992013264A1 - Procede de mesure de la luminescence emise dans un dosage par luminescence - Google Patents

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WO1992013264A1
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luminescent
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medium
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Michel Mabile
Gérard Mathis
Etienne Jean-Pierre Jolu
Dominique Pouyat
Christophe Dumont
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Cis Bio International
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Definitions

  • the subject of the invention is a method for measuring the luminescence emitted in a luminescence assay making it possible to correct certain disturbances due to the measurement medium.
  • tracer is meant either a luminescent molecule emitting direct luminescence, or a luminescent molecule capable of inducing luminescence emission, said molecule being capable of being coupled to one of the reagents of the assay, and the emission luminescence, direct or induced, allowing the detection and / or determination of the desired analyte.
  • rare earth cryptates The use of particular complexes, the rare earth cryptates, is described for example in applications EP 0 321 353, 0 180 492, 0 232 348 or the international application W0 90/04791. These rare earth cryptates have the advantage of being very stable in protein and saline medium, this property being particularly important in the case of homogeneous immunoassays.
  • the spectroscopic properties of the medium due in particular to the parasitic emissions of the molecules present in the measurement medium and likely to be excited and to emit at wavelengths close to those of the fluorescent tracer and / or with high intensities; its absorption, which results in a loss of exciting light; its light scattering properties when the measurement medium is not clear,
  • quenching the fluorescence emitted
  • the time-resolved fluorescence measurement methods make it possible to partially remedy the parasitic emissions (background noise).
  • the principle of these methods resides in the fact that the measurement of the fluorescence emitted by a tracer molecule having a relatively long emission lifetime is carried out, the measurement being delayed in time beyond the lifetime of d emission of other molecules present.
  • fluorescent tracer molecules with a relatively long lifetime, such as chelates and rare earth cryptates.
  • the solution consisting in strongly diluting the sample is unfavorable to the sensitivity of the detection.
  • the implementation of a double excitation beam system entails the use of expensive equipment and special measuring cuvettes, which are difficult to standardize.
  • the systematic measurement of the absorption of the medium before the measurement of the fluorescence of the sample increases the assay process.
  • Application EP 355 849 describes a method and an automatic apparatus making it possible to verify the reliability of the fluorescence measurement of a sample and to correct this measurement with respect to an internal reference. This requires prior to the measurement of the test sample, to carry out a measurement with 2 reference samples, one "blank" containing only the measurement medium and the other containing the measurement medium and the fluorescent marker.
  • Application EP 91 126 relates to a fluorimeter making it possible to measure, in parallel with the fluorescence of the sample, the transmission of the latter and the fluctuations of the excitation energy, in order to correct the measured fluorescence.
  • This system requires a special measuring cell allowing the excitation beam to pass, because the transmission must be measured in alignment with the excitation beam.
  • the subject of the invention is therefore a method for measuring the luminescence emitted in a luminescence assay, characterized in that at least one luminescent tracer compound and one luminescent compound used as internal reference are used which, when they are subjected to the same excitation wavelength, are likely to emit either by direct luminescence, or by induction of an emission of luminescence, at different wavelengths, respectively ⁇ 2 and ⁇ 1 , the luminescence of the reference compound reflecting the optical quality of the medium, and in that which is corrected measuring the luminescence emitted by the tracer compound at the wavelength ⁇ 2 by measuring the luminescence emitted by the reference compound at the wavelength ⁇ 1 .
  • reference compound is meant either a luminescent molecule emitting direct luminescence, or a luminescent molecule capable of inducing luminescence emission, said luminescence emission, direct or indirect, not being disturbed by the reactive system of the assay .
  • the luminescent compounds which can be used in the measurement method according to the invention can either emit directly at their emission wavelength or at another wavelength, for example in the case of a spectrum shift linked to the reactive system dosage.
  • the luminescent compounds which can be used in the measurement method according to the invention can optionally emit indirectly by inducing an emission of luminescence, as in particular in the case of homogeneous methods by energy transfer.
  • the luminescence emissions at wavelengths ⁇ 2 and ⁇ 1 are detected simultaneously.
  • the method according to the invention which uses a single excitation beam, makes it possible to carry out easily and reliably the measurement of the luminescence emitted in a luminescence assay without requiring complex apparatus, by eliminating the disturbances due spectroscopic properties of the assay medium.
  • the emission wavelengths of the luminescent tracer compound and of the luminescent compound of reference ⁇ 1 and ⁇ 2 will be different but preferably close (by having a difference for example less than or equal to 100 nm) so as to that the disturbance of the luminescence emission due to the absorption of the medium occurs in the same way manner vis-à-vis the emission of the tracer compound and that of the reference compound.
  • the method according to the present invention does not require that the sample to be assayed be placed in a particular measuring tank.
  • the luminescence emission of the reference compound at wavelength ⁇ 1 makes it possible to correct the measurement carried out at wavelength ⁇ 2 .
  • the correction can be carried out for example, by dividing this last measurement by the measurement carried out at the wavelength ⁇ 1 .
  • Other correction means can be used, such as, for example, a correction method integrated into the apparatus in which a counting rate is fixed on the channel measuring the luminescence emission of the reference compound at the length of wave ⁇ 1 . When this rate is reached, the end of the measurement is triggered on the channel measuring the emission of luminescence at the wavelength ⁇ 2 . The value obtained on this channel is therefore directly corrected.
  • the subject of the invention is a method for measuring the fluorescence emitted in an assay by fluorometry, characterized in that at least one fluorescent tracer compound and a fluorescent compound used as internal reference are used, which when subjected to the same excitation wavelength are capable of emitting, either by direct fluorescence, or by induction of a fluorescence emission, at different wavelengths, ⁇ 2 and ⁇ 1 respectively , the fluorescence of the reference compound reflecting the optical quality of the medium, and the measurement of the fluorescence emitted by the tracer compound then being corrected by the measurement of the fluorescence emitted by the reference compound.
  • the method according to the invention makes it possible to achieve a measurement sensitivity of the order of a picomole / liter, while the phenomena mentioned above usually limit the sensitivity of the assay, especially during homogeneous assays in serum medium, at analyte concentrations of the order of a micromole / liter.
  • the luminescent tracer compound and the reference compound are one and the same compound.
  • This first variant of the method according to the invention preferably applies when using a homogeneous method of detection and / or determination by luminescence of an analyte in a medium capable of containing it in which the measurement of the emitted luminescence representative of the amount of analyte in the medium is carried out at an emission wavelength different from that of the tracer compound.
  • this case arises when the emitted luminescence representative of the analyte results from an energy transfer between a donor luminescent compound and an accepting luminescent compound, the latter emitting at a wavelength ⁇ 2 while the compound donor also serving as a reference compound emits at a wavelength ⁇ 1 .
  • this case also occurs when the tracer compound emits at different wavelengths ⁇ 1 and ⁇ 2 depending on whether it is, respectively, not engaged or engaged in the reactive assay system.
  • homogeneous process is meant a dosing process in which the measurement does not require the prior separation of the components of the dosage.
  • the intensity of the signal emitted by the luminescent compound of reference at the wavelength ⁇ 1 is practically constant.
  • the signal emitted therefore depends only on the optical properties of the medium in which the assay is carried out and not on the amount of analyte, and can serve as a reference.
  • this first variant of the method according to the invention will be used in a homogeneous method of detection and / or determination by luminescence of an analyte in a medium capable of containing it using an excess method consisting of:
  • the first reagent and the second reagent used in the methods of detection and / or determination by luminescence of an analyte indicated above are added simultaneously to the medium containing the analyte sought.
  • this variant of the method can be used in a homogeneous method of detection and / or determination by luminescence of an analyte in a medium capable of containing it using a competitive method. consisting of:
  • This variant of the process can also advantageously be used in a homogeneous process for the detection and / or determination by luminescence of an analyte in a medium capable of containing it using a competition method consisting of:
  • the luminescent tracer compound and the reference compound are 2 distinct compounds excitable at the same wavelength, the reference compound emitting at a wavelength different from that used to measure the amount of analyte .
  • This second variant of the process of the invention is preferred in particular in the use of a homogeneous process for the detection and / or determination by luminescence of an analyte in a medium capable of containing it in which a reagent coupled with a luminescent tracer compound and a reagent coupled with a heavy atom or motifs containing a heavy atom capable of modulating are used the signal from the luminescent tracer compound.
  • a dosing method of this type is described in application EP 232 348.
  • this second variant of the method according to the invention is used in a homogeneous method of detection and / or determination by luminescence of an analyte in a medium capable of containing it consisting of:
  • This second variant of the method in which the luminescent tracer compound and the reference compound are two distinct compounds is also advantageously usable in homogeneous methods for detecting and / or determining a analyte in a medium capable of containing it by methods by excess or by competition involving a donor / acceptor system, as described above for the first variant of the method of the invention.
  • the signal of the reference luminescent compound will then be measured at a wavelength ⁇ 1 and the signal resulting from the transfer of energy at a wavelength ⁇ 2 , this measurement then being able to be corrected by the measurement carried out at ⁇ 1 .
  • analyte any substance or group of analogous substances to be detected and / or determined;
  • receptor any substance capable of specifically binding to a site of said analyte
  • - "heavy atom” an atom with a high atomic number and whose presence near a fluorescent molecule is capable of inducing an increase in the spin-orbit coupling thereof.
  • suitable heavy atoms mention may in particular be made of halogen atoms, mercury, thallium, lead. money;
  • motif containing at least ur. heavy atom any chemical substance naturally containing at least one heavy atom or on which at least one heavy atom can be attached.
  • a fluorescent compound such as a chelate or a rare earth cryptate, in particular a chelate or a cryptate of terbium, europium, dysprosium, samarium or neodynium.
  • a terbium or europium cryptate will be used.
  • terbium cryptate Tb trisbipyridine or europium cryptate: Eu trisbipyridine, as described in application EP 180 492 or the cryptates Eu trisbipyridine diamine and Tb trisbipyridine diamine described in application EP 321 353, will be used.
  • the donor fluorescent compound is a europium cryptate and the fluorescent acceptor compound is chosen from allophycocyanin, allophycocyanin B, C phycocyanin or R phycocyanin.
  • a fluorescent acceptor compound chosen from chlorophylls such as those cited in applications EP 71 991 and EP 314 406, or porphyrins as cited in application EP 71 991 or phthalocyanines such as those of international application WO 88 04777.
  • the reading will be carried out either on a solid support, or by adding oxygen-sensing molecules to the measuring medium, these techniques being known to those skilled in the art .
  • Chlorophylls and phthalocyanines can also be used as fluorescent acceptor compounds using as donor compound a cryptate or a chelate of europium.
  • the luminescent tracer compound and / or the reference luminescent compound have a lifetime greater than one microsecond.
  • the measurement method of the invention finds in particular an important application in immunoassays by fluorescence, both in assay methods called by competition and by excess, described in the prior art (Landon, Ann. Clin. Biochem, 1981, 18, 253 and E. SOINI et al. Clin. Chem. 1979, 25, 353).
  • the measurement method of the invention can be advantageously used in immunoassays in serum medium.
  • a further aspect of the invention relates to a device for implementing the measurement method according to the invention.
  • This device is characterized in that it comprises an excitation light source, means for collecting the light beam emitted following said excitation and means for allowing the measurement of luminescence at two distinct wavelengths.
  • this device also comprises means for dividing the beam emitted following the excitation.
  • Such a device is illustrated, by way of example, in FIG. 1.
  • Figure 1 shows:
  • a lens focusing the exciting beam towards a filter 3 selecting the wavelength desired for the excitation
  • a dichroic filter 4 placed at 45 reflecting the ultraviolet rays and transmitting visible light, which reflects the exciting beam on a lens 5, the latter focusing it on the microplate 6 containing the samples;
  • a lens collects in combination with the lens 5 the luminescence emission resulting from the excitation and projects it on a dichroic filter 8 which divides the emitted light beam;
  • This example is carried out on the detection of a standard range of antigen and on the assay of 5 serum samples of unknown prolactin concentration.
  • the fluorescent donor compounds used are europium cryptate trisbipyridine diamine (Eu 3+ )
  • allophycocyanin (Cyanotech, USA) is used as the fluorescent acceptor compound.
  • Monoclonal anti-prolactin E 1 and 3D3 antibodies are used (CIS bio international, France) recognizing 2 distinct prolactin epitopes.
  • the preparation of the antibodies labeled with europiumtrisbipyridine diamine cryptate (Eu 3+ ) or with llophycocyanin is described below:
  • EuTBP europium cryptate trisbipyridine diamine (Eu 3+ )
  • HSA human albumin serum
  • IgG immunoglobulin G
  • Sulfo-SMCC sulfosuccinimidyl 4 (n-maleimidomethyl) cyclohexane
  • APC (3 mg) commercially available as precipitated in a 60% solution of ammonium sulfate, is centrifuged. After removal of the supernatant, the residue is taken up in 250 ⁇ l of 100 mM phosphate buffer, pH 7.0, then filtered at 0.8 ⁇ m in order to remove any particles in suspension.
  • the filtrate is purified by exclusion chromatography on a G25 superfine column (Pharmacia, Sweden) in the same buffer.
  • the concentration of APC eluted in the exclusion volume is determined at 650 nm, considering a ⁇ 650nm of 731000M -1 CM -1 .
  • Activation of the APC is carried out by adding a sulfo-SMCC solution prepared extemporaneously at a rate of 6.9 mM in a 100 mM phosphate buffer pH 7.0 and allowing the reaction to take place for one hour, at room temperature. , with gentle stirring (molar ratio of 15 to 75 sulfo-SMCC by APC).
  • the APC-maleimide is then purified on a G25 superfine column in 100 mM phosphate buffer, 5 mM EDTA, pH 6.5 and stored at 4 ° C. before coupling on 3D3 IgG.
  • IgG E 1 5 mg of IgG E 1 at a rate of 10 mg / ml in a 100 mM phosphate buffer, pH 7.0 are activated by the addition of a solution of SPDP (Pierce, USA) at a rate of 6.4 mM in dioxane in a molar ratio of 4 to 16 SPDP per IgG E 1 .
  • SPDP Pulierce, USA
  • the IgG pyridine-2 thione is purified on a G25 superfine column in a 100 mM phosphate buffer, 5 mM EDTA, pH 6.5.
  • the proteins are concentrated and the 2-pyridyl sulfide groups are reduced by a solution of DTT (Sigma, USA) having a final concentration of 19 mM for 15 min at room temperature.
  • DTT and pyridine-2-thione are eliminated by purification on a G25 superfine column in 100 mM phosphate buffer, 5 mM EDTA, pH 6.5.
  • the IgG-SH concentration is determined at 280 nm with an ⁇ 280nm of 210,000 M -1 cm -1 .
  • the fixing of the thiol groups on the maleimides is carried out by adding 2.51 mg of activated APC per mg of IgG E 1 -SH. After 18 hours of incubation at 4oC and in the dark under gentle stirring, the thiol functions which remain free are blocked by the addition of a 100 mM solution of N-methyl maleimide
  • the reaction medium is purified by gel filtration on a semi-preparative TSK G3000SW column (Beckmann, USA) in 100 mM phosphate buffer pH 7.0.
  • the APC and IgG E 1 concentrations of the purified conjugate, eluted in the first peak, are determined by the absorptions at 280 nm and at 650 nm, according to the following calculation:
  • a ' 280nm being the contribution to this wavelength of APC-maleimide.
  • HSA Human serum albumin
  • IgG 3D3-SH is carried out according to the protocol described above for IgG E 1 but with a molar ratio of 7.5 SPDP per IgG 3D3.
  • reaction medium After 45 min of activation at room temperature, the reaction medium is filtered at 0.8 ⁇ m in order to remove the precipitate which may have formed.
  • Undesirable reaction products sulfo-SMCC, N-hydroxysuccinimide, (N-maleimidomethyl) carboxylic acid
  • ion exchange chromatography on a Mono Q column (Pharmacia, Sweden) in 20 mM phosphate buffer dimethylformamide 10% (v / v ), pH 7.0 under NaCl shock.
  • the concentration of maleimide Eu TBP is determined at 307 nm with an ⁇ 307nm of 25000 M -1 cm -1 as well as the ratio A 307nm / A 280nm .
  • the uncoupled Eu TBP is removed by dialysis in 100 mM phosphate buffer pH 7.0 at 4 ° C until exhaustion (more fluorescence in the dialysis baths).
  • the characteristics of the conjugate are determined by its absorptions at 307 nm and at 280 nm using the following values taking into account the inherent absorption of the cryptate determined by the ratio A 307nm / A 280nm .
  • fluorescence at 665 nm is detected in resolved time, with a measurement delay of 50 ⁇ s and an integration time of 400 ⁇ s.
  • the duration of the measurement is 1 s.
  • the excitation is caused by a flash lamp, pulsed at 1000 Hz.
  • the excitation wavelength is centered by an interference filter at 307 nm, maximum absorption of trisbipyridine diamine
  • the measurement is carried out using an ARCUS fluorimeter
  • the measurement can also be carried out in a single step using the prototype fluorimeter described in Example 2.
  • a white 96-well microplate (Dynatech, USA) will be used for the measurement.
  • Ech5 699 In a second protocol, the fluorescence at 665nm is measured in the same way as described above. However, a second measurement of the same well is carried out at 545nm after a second excitation, under the same time reading parameters (delay, integration time and duration of the measurement).
  • the fluorescence emission thus measured in time resolved at 545 nm is characteristic of the emission of trisbipyridine diamine (Tb 3+ ) used as an internal reference and reflects the optical properties of the medium to be assayed.
  • the 5 samples are also assayed by the ELSA-PRL radioimmunometric assay kit (CIS bio international, France).
  • the fluorescence measurement is carried out using a prototype fluorimeter, which is described below:
  • An N2 VSL 337 laser (LSI, USA) is used as an excitation source (wavelength at 337 nm).
  • the pulse duration is specified at 3 nanoseconds and is repeated at a frequency of 10 Hertz.
  • the beam passes through a filter (CORNING) in order to eliminate any stray light at excitation other than 337 nm.
  • the beam After entering the measurement chamber, the beam is reflected by a dichroic filter, placed at 45 degrees, which has the property of reflecting ultraviolet light and of being able to transmit visible light.
  • the beam reflected by the dichroic filter is focused on the well to be measured of a microplate by a lens of fused silica.
  • the fluorescence emission is collected at a solid angle of 20 degrees, neck bounded by the same lens, and passes directly through the dichroic filter (fluorescence in visible light).
  • An interference filter with characteristics defined according to the fluorescence wavelength to be detected, makes it possible to get rid of the lights that can interfere with the signal, the intensity of which is then measured by a photomultiplier
  • the photon counter used is an SR-400 (STANFORD RESEARCH SYSTEMS), whose operations and synchronization with the laser are controlled by an IBM PC-AT type computer via an RS 232 output.
  • the pulses from the photomultiplier are recorded during a time window (t g ) and after a delay (t d ) determined provided that they are greater than a discriminating level selected by the photon counter in order to optimize the signal / noise of the photomultiplier.
  • An XY table controlled by the IBM PC-AT, allows the different positioning of the measurement microplate by stepping motors, including the loading, positioning under the exciting beam, automatic sequential reading of the 96 wells , and exit.
  • an anti-prolactin-europium cryptate antibody conjugate at a concentration of 0.5 ⁇ g / ml of antibody in 100 mM phosphate buffer pH 7.5, HSA 1 g / l, 150 mM NaF.
  • the europium cryptate used is trisbipyridine diamine (Eu 3+ ), the preparation of which is described in application EP 321 353 (examples 3 and 4).
  • the anti-prolactin antibody used is the 3D3 antibody (CIS bio international, France).
  • the 3D3 antibody-europium cryptate antibody conjugate is prepared as described in Example 1.
  • fluorescence is detected at 620nm, in resolved time, with a measurement delay of 50 ⁇ s and an integration time of 400 ⁇ s.
  • the measurement time is 1 s.
  • the optical density of the serum is measured at 310 nm using a Lambda 15 spectrophotometer PERKIN ELMER (UK). The results are reported in Table IV below.
  • This antibody conjugate E 1 (CIS bio international France) -allophycocyanin (Cyanotech, USA) is prepared as described in Example 1.
  • the measurement is carried out at 665nm and the measured value is corrected by dividing this value by the value of the fluorescence measured at 620nm which reflects the optical properties of the medium.
  • concentration values determined using a standard curve as indicated in Example 1, with or without correction, are compared with the values obtained using as reference the ELSA-PRL radioimmunometric assay kit (CIS bio international France).
  • the signal measured at 620nm (which corresponds to the conjugate not engaged in the complex) should be constant.
  • the prolactin concentration values determined from the measurement of the signal at 665nm do not correspond to the values obtained by the reference assay, while the values obtained by the corrected measurement (FIA 665 / 620 ) are in good correlation with these.

Abstract

La présente invention a pour objet un procédé de mesure de la luminescence émise dans un dosage par luminescence permettant de corriger certaines perturbations dues au milieu de mesure. Ledit procédé est caractérisé en ce qu'il met en ÷uvre au moins un composé luminescent traceur et un composé luminescent utilisé comme référence interne qui, lorsqu'ils sont soumis à une même longueur d'onde d'excitation, sont susceptibles d'émettre soit par luminescence directe, soit par induction d'une émission de luminescence, à des longueurs d'onde différentes, respectivement μ2 et μ1, et en ce qu'on corrige la mesure de la luminescence émise par le composé traceur à la longueur d'onde μ2 par la mesure de la luminescence émise par le composé de référence à la longueur d'onde μ1. L'invention concerne également l'utilisation dudit procédé dans un procédé homogène de détection et/ou de détermination d'un analyte ainsi qu'un dispositif pour sa mise en ÷uvre.

Description

Procédé de mesure de la luminescence émise dans un dosage par luminescence.
L'invention a pour objet un procédé de mesure de la luminescence émise dans un dosage par luminescence permettant de corriger certaines perturbations dues au milieu de mesure.
L'utilisation de dosages immunologiques pour l'analyse qualitative et quantitative de composés dans des fluides biologiques est à l'heure actuelle largement répandue.
Parmi les techniques existantes, les dosages par fluorimétrie ont pris une importance croissante.
En effet, ils présentent un certain nombre d'avantages parmi lesquels la sensibilité, la rapidité de la mesure, la stabilité et l'inocuité des réactifs marqués par des composés fluorescents et le coût relativement réduit.
Il est connu que les méthodes de détection utilisant la fluorescence sont intrinsèquement très sensibles et pourraient permettre des limites de détection inférieures à celles atteintes par des dosages immunologiques utilisant des réactifs radiomarqués, en particulier par l'utilisation de sources lumineuses modulables laser (I. Wieder, Immunofluorescence and related staining techniques, 1978, Elsevier).
De nombreuses molécules fluorescentes utilisables comme traceur dans ce type de dosages ont été précédemment décrites; parmi celles-ci, on peut citer notamment les complexes de terre rare qui possèdent des propriétés intéressantes.
Par "traceur", on entend soit une moiécule luminescente émettant une luminescence directe, soit une molécule luminescente capable d'induire une émission de luminescence, ladite molécule étant susceptible d'être couplée à l'un des réactifs du dosage, et l'émission de luminescence, directe ou induite, permettant la détection et/ou la détermination de l'analyte recherché.
L'utilisation de complexes particuliers, les cryptates de terre rare, est décrite par exemple dans les demandes EP 0 321 353, 0 180492, 0 232 348 ou la demande internat iona le W0 90/04791. Ces cryptates de terre rare présentent l'avantage d'être très stables en milieu protéique et salin, cette propriété étant particulièrement importante dans le cas des dosages immunologiques homogènes.
La sensibilité de la mesure est néanmoins limitée par différents paramètres interférents parmi lesquels on peut citer :
- les propriétés spectroscopiques du milieu, et en particulier sa fluorescence intrinsèque, due notamment aux émissions parasites des molécules présentes dans le milieu de mesure et susceptibles d'être excitées et d'émettre à des longueurs d'ondes proches de celles du traceur fluorescent et/ou avec de fortes intensités ; son absorption, qui entraîne une perte de lumière excitatrice ; ses propriétés de diffusion de la lumière lorsque le milieu de mesure n'est pas limpide,
- l'extinction de la fluorescence émise ("quenching") par des inhibiteurs présents dans le milieu,
- la composition de l'appareillage, et notamment les réflexions parasites causées par l'appareillage,
L'ensemble de ces interférences affecte considérablement la sensibilité et la reproductibilité de la mesure.
Certains de ces problèmes ont déjà été résolus par diverses techniques.
En particulier, les méthodes de mesure de fluorescence en temps résolu permettent de remédier partiellement aux émissions parasites (bruit de fond ). Le principe de ces méthodes réside dans le fait qu'on effectue la mesure de la fluorescence émise par une molécule traceur ayant une durée de vie d'émission relativement longue, la mesure étant retardée dans le temps au-delà de la durée de vie d'émission des autres molécules présentes.
II est dans ce cas nécessaire d'utiliser des molécules fluorescentes traceurs à durée de vie relativement longue telles que les chélates et les cryptates de terre rare.
Néanmoins, aucune solution satisfaisante n'a été apportée aux limitations dues aux propriétés spectroscopiques du milieu, et en particulier à son absorption.
En effet, parmi les techniques proposées pour éviter l'effet de filtre du milieu, aucune ne permet à la fois une mise en oeuvre aisée, peu coûteuse ainsi que l'obtention d'une grande sensibilité et d'une très bonne reproductibilité dans la mesure.
En particulier, la solution consistant à diluer fortement l'échantillon est défavorable à la sensibilité de la détection.
Par ailleurs, la mise en oeuvre d'un système à double faisceau d'excitation, entraîne l'utilisation d'appareillages coûteux et de cuvettes de mesure spéciales, difficiles à standardiser. De plus, la mesure systématique de l'absorption du milieu avant la mesure de la fluorescence de l'échantillon alourdit le procédé de dosage.
La demande EP 355 849 décrit une méthode et un appareillage automatique permettant de vérifier la fiabilité de la mesure de fluorescence d'un échantillon et de corriger cette mesure par rapport à une référence interne. Ceci nécessite préalablement à la mesure de l'échantillon à tester, d'effectuer une mesure avec 2 échantillons de référence, un "blanc" ne contenant que le milieu de mesure et l'autre contenant le milieu de mesure et le marqueur fluorescent.
La demande EP 91 126 concerne un fluorimètre permettant de mesurer, parallèlement à la fluorescence de l'échantillon, la transmission de celui-ci et les fluctuations de l'énergie d'excitation, afin de corriger la fluorescence mesurée. Ce système nécessite une cellule de mesure particulière laissant passer le faisceau d'excitation, car la mesure de la transmission doit s'effectuer dans l'alignement du faisceau d'excitation.
D'autres systèmes mettent en oeuvre un système de division du faisceau d'excitation, tel que décrit par exemple dans les demandes EP 174 722 et EP 241 268.
L'invention a donc pour objet un procédé de mesure de la luminescence émise dans un dosage par luminescence, caractérisé en ce qu'on met en oeuvre au moins un composé luminescent traceur et un composé luminescent utilisé comme référence interne qui , lorsqu' ils sont soumis à une même longueur d' onde d' excitation, sont susceptibles d' émettre soit par luminescence directe, soit par induction d'une émission de luminescence, à des longueurs d'onde différentes, respectivement λ2 et λ1, la luminescence du composé de référence reflétant la qualité optique du milieu, et en ce qu'on corrige la mesure de la luminescence émise par le composé traceur à la longueur d'onde λ2 par la mesure de la luminescence émise par le composé de référence à la longueur d'onde λ1.
Par "composé de référence" on entend soit une molécule luminescente émettant une luminescence directe, soit une molécule luminescente capable d'induire une émission de luminescence, ladite émission de luminescence, directe ou indirecte, n'étant pas perturbée par le système réactif du dosage.
Les composés luminescents utilisables dans le procédé de mesure selon l'invention peuvent soit émettre directement à leur longueur d'onde d'émission ou à une autre longueur d'onde comme par exemple dans le cas d'un déplacement de spectre lié au système réactif du dosage.
Les composés luminescents utilisables dans le procédé de mesure selon l'invention peuvent le cas échéant émettre indirectement en induisant une émission de luminescence, comme notamment dans le cas de méthodes homogènes par transfert d'énergie.
Avantageusement, les émissions de luminescence aux longueurs d'onde λ2 et λ1 sont détectées simultanément.
Le procédé selon l'invention , qui met en oeuvre un seul faisceau d'excitation, permet d'effectuer de manière aisée et fiable la mesure de la luminescence émise dans un dosage par luminescence sans nécessiter d'appareillage complexe, en éliminant les perturbations dues aux propriétés spectroscopiques du milieu de dosage.
De manière avantageuse, les longueurs d'onde d'émission du composé luminescent traceur et du composé luminescent de référence λ1 et λ2 seront différentes mais de préférence proches (en ayant une différence par exemple inférieure ou égale à 100 nm) de façon à ce que la perturbation de l'émission de luminescence due à l'absorption du milieu se produise de la même manière vis-à-vis de l'émission du composé traceur et de celle du composé de référence.
On notera que, avantageusement, le procédé selon la présente invention ne nécessite pas que l'échantillon à doser soit placé dans une cuve de mesure particulière.
L'émission de luminescence du composé de référence à longueur d'onde λ1 permet de corriger la mesure réalisée à la longueur d'onde λ2. On peut effectuer la correction par exemple, en divisant cette dernière mesure par la mesure réalisée à la longueur d'onde λ1. D'autres moyens de correction sont utilisables, tel que, par exemple, une méthode de correction intégrée à l'appareillage dans laquelle on fixe un taux de comptage sur le canal mesurant l'émission de luminescence du composé de référence à la longueur d'onde λ1. Lorsque ce taux est atteint, on déclenche la fin de la mesure sur le canal mesurant l'émission de luminescence à la longueur d'onde λ2. La valeur obtenue sur ce canal est de ce fait directement corrigée.
D'autres méthodes de correction connues de l'homme du métier sont également utilisables.
Dans un aspect préféré, l'invention a pour objet un procédé de mesure de la fluorescence émise dans un dosage par fluorométrie, caractérisé en ce qu'on met en oeuvre au moins un composé fluorescent traceur et un composé fluorescent utilisé comme référence interne qui, lorsqu'ils sont soumis à une même longueur d'onde d'excitation sont susceptibles d'émettre, soit par fluorescence directe, soit par induction d'une émission de fluorescence, à des longueurs d'onde différentes, respectivement λ2 et λ1, la fluorescence du composé de référence reflétant la qualité optique du milieu, et la mesure de la fluorescence émise par le composé traceur étant alors corrigée par la mesure de la fluorescence émise par le composé de référence.
Le procédé selon l'invention permet d'atteindre une sensibilité de mesure de l'ordre de la picomole/litre, alors que les phénomènes évoqués plus haut limitent habituellement la sensibilité du dosage , notamment lors de dosages homogènes en milieu sérique, à des concentrations en analyte de l'ordre de la micromole/litre.
Dans un aspect avantageux de l'invention, le composé luminescent traceur et le composé de référence sont un seul et même composé.
Cette première variante du procédé selon l'invention s'applique de préférence lors de l'utilisation d'un procédé homogène de détection et/ou de détermination par luminescence d'un analyte dans un milieu susceptible de le contenir dans lequel la mesure de la luminescence émise représentative de la quantité d'analyte dans le milieu est effectuée à une longueur d'onde d'émission différente de celle du composé traceur.
Par exemple, ce cas se présente lorsque la luminescence émise représentative de l'analyte résulte d'un transfert d'énergie entre un composé luminescent donneur et un composé luminescent accepteur, ce dernier émettant à une longueur d'onde λ 2 alors que le composé donneur servant également de composé de référence émet à une longueur d'onde λ 1.
Notamment ce cas se présente également lorsque le composé traceur émet à des longueurs d'onde différentes λ 1 et λ2selon qu'il est, respectivement, non engagé ou engagé dans le système réactif du dosage.
Par "procédé homogène", on entend un procédé de dosage dans lequel la mesure ne nécessite pas la séparation préalable des constituants du dosage.
De manière surprenante, on a en effet trouvé que l'intensité du signal émis par le composé luminescent de référence à la longueur d'onde λ 1 est pratiquement constant. Le signal émis est donc fonction uniquement des propriétés optiques du milieu dans lequel on effectue le dosage et non de la quantité d'analyte, et peut servir de référence.
Dans le cas d'une émission de luminescence résultant d'un transfert d'énergie, le signal reflétant à la fois la quantité d'analyte à doser et les propriétés optiques du milieu de mesure est détecté à une longueur d'onde λ2 et corrigé par la mesure réalisée à la longueur d'onde λ1. De préférence, on utilisera cette première variante du procédé selon l'invention dans un procédé homogène de détection et/ou de détermination par luminescence d' un analyte dans un milieu susceptible de le contenir à l'aide d'une méthode par excès consistant :
1) à ajouter, audit milieu contenant l'analyte recherché, un premier réactif constitué par au moins un récepteur dudit analyte, couplé avec un composé luminescent donneur,
2) à ajouter un second réactif constitué par un ou plusieurs autres récepteurs dudit analyte, ledit second réactif étant couplé avec un composé luminescent accepteur,
3) à faire incuber ledit milieu après chaque addition de réactifs ou après l'addition des deux réactifs,
4) à exciter le milieu résultant à la longueur d'onde d'excitation du composé luminescent donneur
5) à mesurer le signal du composé luminescent donneur à une longueur d'onde λ1, cette mesure servant de référence, et le signal résultant du transfert d'énergie à une longueur d'onde différente λ2.
Dans un aspect avantageux, le premier réactif et le second réactif utilisés dans les procédés de détection et/ou de détermination par luminescence d'un analyte indiqués ci-dessus sont ajoutés simultanément au milieu contenant l'analyte recherché.
Dans un autre aspect de l'invention, on peut utiliser cette variante du procédé dans un procédé homogène de détection et/ou de détermination par luminescence d'un analyte dans un milieu susceptible de le contenir à l'aide d'une méthode par compétition consistant :
1) à ajouter, audit milieu contenant l'analyte recherché, un premier réactif constitué par au moins un récepteur dudit analyte, couplé avec un composé luminescent donneur,
2) à ajouter un second réactif constitué de l'analyte couplé avec un composé luminescent accepteur,
3) à faire incuber ledit milieu après chaque addition de réactifs ou après l'addition des deux réactifs. 4) à exciter le milieu résultant à la longueur d'onde d'excitation du composé luminescent donneur,
5) à mesurer le signal du composé luminescent donneur à une longueur d'onde λ1, cette mesure servant de référence, et le signal résultant du transfert d'énergie à une longueur d'onde différente λ2.
On peut également avantageusement utiliser cette variante du procédé dans un procédé homogène de détection et/ou de détermination par luminescence d'un analyte dans un milieu susceptible de le contenir à l'aide d'une méthode par compétition consistant :
1) à ajouter, audit milieu contenant l'analyte recherché, un premier réactif constitué par au moins un récepteur dudit analyte, couplé avec un composé luminescent accepteur,
2) à ajouter un second réactif constitué de l'analyte couplé avec un composé luminescent donneur,
3) à faire incuber ledit milieu après chaque addition de réactifs ou après l'addition des deux réactifs,
4) à exciter le milieu résultant à la longueur d'onde d'excitation du composé luminescent donneur,
5) à mesurer le signal du composé luminescent donneur à une longueur d'onde λ1, cette mesure servant de référence, et le signal résultant du transfert d'énergie à une longueur d'onde différente λ2.
Dans une autre utilisation avantageuse du procédé de l'invention, l'un au moins des récepteurs de l'analyte est fixé à un support solide.
Dans un autre aspect avantageux, le composé luminescent traceur et le composé de référence sont 2 composés distincts excitables à la même longueur d'onde, le composé de référence émettant à une longueur d'onde différente de celle utilisée pour mesurer la quantité d'analyte.
Cette seconde variante du procédé de l'invention est préférée en particulier dans l'utilisation d'un procédé homogène de détection et/ou de détermination par luminescence d'un analyte dans un milieu susceptible de le contenir dans lequel on utilise un réactif couplé avec un composé luminescent traceur et un réactif couplé avec un atome lourd ou des motifs contenant un atome lourd susceptible de moduler le signal du composé luminescent traceur. Un procédé de dosage de ce type est décrit dans la demande EP 232 348.
Dans ce cas, on utilisera en plus du composé luminescent traceur couplé au récepteur de l'analyte et émettant à une longueur d'onde λ 2, un autre composé luminescent libre servant de référence émettant à une longueur λ 1 dont le signal n'est pas modulé par l'effet d'atome lourd et reflète les propriétés optiques du milieu de mesure, ces 2 composés étant excités à la même longueur d'onde.
Avantageusement, cette seconde variante du procédé selon l'invention est utilisée dans un procédé homogène de détection et/ou de détermination par luminescence d'un analyte dans un milieu susceptible de le contenir consistant :
1) à ajouter audit milieu un premier réactif constitué d'un récepteur dudit analyte,
2) à ajouter un second réactif choisi parmi l'analyte ou au moins l'un de ses récepteurs, l'un des deux réactifs étant couplé avec un composé luminescent traceur et l'autre réactif comportant un atome lourd ou des motifs contenant un atome lourd, ainsi qu'un composé luminescent servant de référence interne,
3) à faire incuber le milieu résultant soit après l'addition de chaque réactif, soit après l'addition des deux réactifs,
4) à exciter le milieu résultant, et
5) à mesurer d'une part le signal émis par le composé luminescent traceur, ledit signal étant modulé par l'effet d'atome lourd à une longueur d'onde λ2 , et d'autre part le signal émis par le composé de référence à une longueur λ1.
Cette seconde variante du procédé dans laquelle le composé luminescent traceur et le composé de référence sont deux composés distincts est également avantageusement utilisable dans des procédés homogènes de détection et/ou de détermination d'un analyte dans un milieu susceptible de le contenir par des méthodes par excès ou par compétition mettant en jeu un système donneur/ accepteur, telles que décrites plus haut pour la première variante du procédé de l'invention.
Néanmoins, dans le cas de la seconde variante, il y a lieu d'ajouter un composé luminescent servant de référence interne au cours de l'une des étapes d'addition des réactifs.
On mesurera alors le signal du composé luminescent de référence à une longueur d'onde λ1 et le signal résultant du transfert d'énergie à une longueur d'onde λ2, cette mesure pouvant alors être corrigée par la mesure effectuée à λ1.
Dans la présente description on définit par :
- "analyte" toute substance ou groupe de substances analogues à détecter et/ou déterminer ;
- "récepteur" toute substance capable de se fixer spécifiquement sur un site dudit analyte ;
- "atome lourd" un atome de nombre atomique élevé et dont la présence à proximité d'une molécule fluorescente est capable d'induire une augmentation du couplage spin-orbite de celle-ci. A titre d'exemples d'atomes lourds appropriés, on peut citer notamment les atomes d'halogènes, le mercure, le thallium, le plomb. l'argent ;
- "motif contenant au moins ur. atome lourd" toute substance chimique comportant naturellement au moins un atome lourd ou sur laquelle on peut fixer au moins un atome lourd.
Dans un aspect préféré, le milieu de mesure est un milieu biologique tel qu'un milieu sérique.
En tant que composés luminescents de référence et/ou utilisables comme composés traceurs, on utilisera avantageusement des composés fluorescents.
Notamment, on utilisera avantageusement un composé fluorescent tel qu'un chélate ou un cryptate de terre rare, en particulier un chélate ou un cryptate de terbium, europium, dysprosium, samarium ou néodynium. On utilisera de préférence un cryptate de terbium ou d'europium.
Dans les procédés de détection et/ou de détermination par fluorescence utilisant le procédé de mesure de l'invention, on choisira avantageusement un cryptate de terre rare décrit dans les demandes de brevets EP 180 492 et 321 353.
De préférence, on utilisera le cryptate de terbium : Tb trisbipyridine ou le cryptate d'europium : Eu trisbipyridine, tels que décrits dans la demande EP 180 492 ou les cryptates Eu trisbipyridine diamine et Tb trisbipyridine diamine décrits dans la demande EP 321 353.
Dans un aspect avantageux le composé fluorescent donneur est un cryptate d'europium et le composé fluorescent accepteur est choisi parmi l'allophycocyanine, l'allophycocyanine B, la C phycocyanine ou la R phycocyanine.
On peut également utiliser comme composé luminescent de référence ou comme composé traceur donneur, un composé phospho-rescent tel que l'éosine ou l'erythrosine. Dans ce cas, on utilisera avantageusement un composé fluorescent accepteur choisi parmi les chlorophylles telles que celles citées dans les demandes EP 71 991 et EP 314 406, ou les porphyrines telles que citées dans la demande EP 71 991 ou encore les phtalocyanines telles que celles de la demande internationale WO 88 04777.
Dans le cas d'un dosage en milieu liquide utilisant des composés donneurs phosphorescents, la lecture sera effectuée soit sur un support solide, soit en ajoutant au milieu de mesure des molécules capteurs d'oxygène, ces techniques étant connues de l'homme du métier.
Les chlorophylles et les phtalocyanines peuvent également être utilisées comme composés accepteurs fluorescents en utilisant comme composé donneur un cryptate ou un chélate d'europium.
Dans un aspect préféré, le composé luminescent traceur et/ou le composé luminescent de référence ont une durée de vie supérieure à une microseconde.
Comme source de lumière permettant l'excitation des composés luminescents traceurs et de référence, on utilisera avantageusement une source de lumière modulable telle que celles décrites dans Lakowicz, Principles of fluorescent spectroscopy,
Plénum Press, New-York, 1983, p. 96-100. Le procédé de mesure de l'invention trouve en particulier une application importante dans les dosages immunologiques par fluorescence, aussi bien dans les méthodes de dosage dites par compétition que par excès, décrits dans l'art antérieur (Landon, Ann. Clin. Biochem, 1981, 18, 253 et E. SOINI et al. Clin. Chem. 1979, 25, 353).
En particulier, le procédé de mesure de l'invention peut être avantageusement utilisé dans les dosages immunologiques en milieu sérique.
Un aspect ultérieur de l'invention concerne un dispositif pour la mise en oeuvre du procédé de mesure selon l'invention.
Ce dispositif est caractérisé en ce qu'il comprend une source lumineuse d'excitation, des moyens pour collecter le faisceau lumineux émis à la suite de ladite excitation et des moyens pour permettre la mesure de la luminescence à deux longueurs d'onde distinctes.
Avantageusement, ce dispositif comprend également des moyens pour diviser le faisceau émis à la suite de l'excitation.
Un tel dispositif est illustré, à titre d'exemple, sur la figure 1.
La figure 1 représente :
- en 1, une source lumineuse d'excitation ;
- en 2, une lentille focalisant le faisceau excitant vers un filtre 3 sélectionnant la longueur d'onde souhaitée pour l'excitation ;
- un filtre dichroîque 4 placé à 45 réfléchissant les rayons ultraviolets et transmettant la lumière visible, qui réfléchit le faisceau excitant sur une lentille 5, celle-ci le focalisant sur la microplaque 6 contenant les échantillons ;
- en 7, une lentille collecte en combinaison avec la lentille 5 l'émission de luminescence résultant de l'excitation et la projette sur un filtre dichroîque 8 qui divise le faisceau lumineux émis ;
- les filtres 9 et 10 permettent de sélectionner les signaux émis par le composé de référence et le composé traceur, avant leur arrivée sur des photomultiplicateurs 11 et 12. L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples ci-après qui ne présentent aucun caractère limitatif.
EXEMPLE 1 :
Correction de la fluorescence à 665 nm par détection d'un ajout de cryptate de terbium (trisbipyridine diamine (Tb3+)) dans un dosage immunof luorescent homogène de la prolactine.
Cet exemple est réalisé sur la détection d'une gamme standard en antigène et sur le dosage de 5 échantillons sériques de concentration en prolactine inconnue.
METHODOLOGIE :
Dans ce dosage, on utilise comme composés fluorescents donneur le cryptate d'europium trisbipyridine diamine (Eu3+)
(traceur) et composé de référence le cryptate de terbium trisbipyridine diamine (Tb3+) préparés comme décrit dans la demande EP 321 353 (exemples 3 et 4).
Comme composé fluorescent accepteur, on utilise l'allophycocyanine (Cyanotech, USA).
On utilise des anticorps monoclonaux anti-prolactine E1 et 3D3 (CIS bio international, France) reconnaissant 2 épitopes distincts de la prolactine. La préparation des anticorps marqués par le cryptate d'europiumtrisbipyridine diamine (Eu3+) ou par l 'a llophycocyanine est déc rite ci-dessous :
Or. utilise les abréviations suivantes :
APC = allophycocyanine
DTT = dithiothreitol
EuTBP = cryptate d'europium trisbipyridine diamine (Eu3+)
HSA = sérum albumine humaine
IgG = immunoglobuline G
SPDP = N-succinimidyl 3(2-pyridyldithio)propionate
Sulfo-SMCC = sulfosuccinimidyl 4(n-maléimidométhyl)cyclohexane
1-carboxylate.
1) PREPARATION DES IgG E1-APC
a) Activation de l'APC par le sulfo-SMCC
L'APC (3 mg) commercialement fournie sous forme précipitée dans une solution à 60 % de sulfate d'ammonium, est centrifugée. Après élimination du surnageant, le culot est repris par 250 μl de tampon phosphate 100 mM, pH 7,0, puis filtré à 0,8 μm afin d'éliminer les éventuelles particules en suspension.
Le filtrat est purifié par chromatographie d'exclusion sur colonne G25 superfine (Pharmacia, Suède) dans le même tampon.
La concentration d'APC éluée dans le volume d'exclusion est déterminée à 650 nm, en considérant un ε650nm de 731000M-1 CM-1.
L'activation de l'APC est réalisée en ajoutant une solution de sulfo-SMCC préparée extemporanément à raison de 6,9 mM dans un tampon phosphate 100 mM pH 7,0 et en laissant la réaction se produire pendant une heure, à température ambiante, sous agitation douce (rapport molaire de 15 à 75 sulfo-SMCC par APC). L'APC-maléimide est alors purifiée sur colonne G25 superfine en tampon phosphate 100 mM, EDTA 5 mM, pH 6,5 et conservée à 4ºC avant couplage sur IgG 3D3.
b) Activation des IgG E1 par le SPDP
Simultanément, 5 mg d'IgG E1 à raison de 10 mg/ml dans un tampon phosphate 100 mM, pH 7,0 sont activés par l'ajout d'une solution de SPDP (Pierce, USA) à raison de 6,4 mM dans du dioxane dans un rapport molaire de 4 à 16 SPDP par IgG E1.
Après 35 min d'activation à température ambiante, l'IgG pyridine-2 thione est purifiée sur colonne G25 superfine dans un tampon phosphate 100 mM, EDTA 5mM, pH 6,5.
Les protéines sont concentrées et les groupes 2-pyridyl dîsulfides sont réduits par une solution de DTT (Sigma, USA) ayant une concentration finale de 19 mM pendant 15 min à température ambiante. Le DTT et la pyridine-2-thione sont éliminés par purification sur colonne G25 superfine en tampon phosphate 100 mM, EDTA 5mM, pH 6,5. La concentration en IgG-SH est déterminée à 280 nm avec un ε280nm de 210000 M-1cm-1.
c) Conjugaison des IgG E1-SH avec APC-maléimide
La fixation des groupements thiols sur les maléimides est réalisée en ajoutant 2,51 mg d'APC activées par mg d'IgG E1-SH. Après 18 heures d'incubation à 4ºC et à l'obscurité sous agitation douce, les fonctions thiols restées libres sont bloquées par l'addition d'une solution à 100 mM de N-méthyl maléimide
(Sigma, USA) ayant une concentration finale de 20 mM pendant une heure à température ambiante.
Le milieu reactionnel est purifiée par gel filtration sur colonne TSK G3000SW semi-préparative (Beckmann, USA ) en tampon phosphate 100 mM pH 7,0.
Les concentrations en APC et en IgG E1 du conjugué purifié, élue dans le premier pic, sont déterminées par les absorptions à 280 nm et à 650 nm, selon le calcul suivant :
[APC] Mole/l = A650nM/710000
[IgG]Mole/l = (A280nm-A'280nm)/210000
avec A'280nm étant la contribution à cette longueur d'onde de l'APC-maléimide.
De l'albumine sérique humaine (HSA) est rajoutée à concurrence de 1 g/l au conjugué qui est ensuite réparti en aliquotes puis congelé à -20ºC.
2) PREPARATION DES CONJUGUES IgG 3D3 - Eu TBP
La préparation de IgG 3D3-SH est réalisée selon le protocole décrit plus haut pour les IgG E1 mais avec un rapport molaire de 7,5 SPDP par IgG 3D3.
A 5 mg (5 10 moles) de Eu TBP est ajoutée une solution à 25 mM de sulfo-SMCC, en tampon phosphate 20 mM, diméthylformamide 10 % (v/v pH 7,0 dans une proportion de 2,5 moles d'activateur par mole de EuTBP.
Après 45 min d'activation à température ambiante, le milieu reactionnel est filtré à 0,8 μm afin d'eliminer le précipité éventuellement formé. Les produits réactionnels indésirables (sulfo-SMCC, N-hydroxysuccinimide, acide (N-maléimidométhyl) carboxylique) sont éliminés par chromatographie échangeuse d'ions sur colonne Mono Q (Pharmacia, Suède) en tampon phosphate 20 mM diméthylformamide 10 % (v/v), pH 7,0 sous choc de NaCl. La concentration en Eu TBP maléimide est déterminée à 307 nm avec un ε307nm de 25000 M-1cm-1 ainsi que le rapport A 307nm/A 280nm.
De façon similaire à celle décrite plus haut on fait réagir les fonctions maléimides avec les fonctions thiols fixés sur l'anticorps, dans des proportions molaires variant de 10 à 30 Eu
TBP maléimide par IgG 3D3-SH.
Après 18 heures d'incubation à 4°C et blocage des groupements thiols (éventuellement restés libres) par
N-méthylmaléimide, le Eu TBP non couplé est éliminé par dialyse en tampon phosphate 100 mM pH 7,0 à 4°C jusqu'à épuisement (plus de fluorescence dans les bains de dialyse).
Les caractéristiques du conjugué sont déterminées par ses absorptions à 307 nm et à 280 nm en utilisant les valeurs suivantes en tenant compte de l'absorption propre du cryptate déterminée par le rapport A307nm/A280nm.
Eu TBP-maléimide :
ε307nm = 25000 M-1cm-1
A307nm/A280nm : déterminé expérimentalement.
IgG 3D3-SH :
ε280nm = 210000 M-1cm-1
ε307nm = 0 M-1cm-1
3) Dans des barrettes de 12 puits (Microstrip Labsystem 0y, Finlande) sont ajoutés successivement :
- 100 μl de standard (standards prolactine de la trousse ELSA-PRL, (CIS Bio international) en sérum de veau nouveau-né) ou 100 μl d'échantillon à doser (sérum humain),
- 100 μl d'anticorps monoclonal anti-prolactine 3D3, marqués au cryptate d'europium trisbipyridine diamine (Eu3+), à la concentration de 0,5 g/ml d'anticorps en tampon phosphate 100 mM, NaF 150 mM, BSA (séruma lbumine bovine) 1 g/ l, pH 7,0 ,
- 50 μl d'anticorps monoclonal anti-prolactine E1 marqués à l'allophycocyanine à la concentration de 7 μ g/ml d'anticorps en tampon phosphate 100 mM, NaF 150 mM, BSA 1g/l, PH 7,0 ,
- 50 μl de cryptate de terbium trisbipyridine diamine (Tb3+) 10-7M en tampon phosphate 100 mM, NaF 150 mM, BSA 1 g/l, pH 7,0. Après une heure d'incubation à 37ºC, la fluorescence de chaque puits est mesurée selon deux protocoles :
Dans un premier protocole, la fluorescence à 665 nm est détectée en temps résolu, avec un délai de mesure de 50 μs et un temps d'intégration de 400 μs. La durée de la mesure est de 1 s.
L'excitation est provoquée par une lampe flash, puisée à 1000 Hz.
La longueur d'onde d'excitation est centrée par un filtre interférentiel à 307 nm, maximum d'absorption du trisbipyridine diamine
(Eu3+) et trisbipyridine diamine (Tb3+). L'intensité de fluorescence relevée, reflet du transfert d'énergie, est proportionnelle à la concentration en antigène prolactine présent dans le milieu d'incubation.
La mesure est réalisée au moyen d'un fluorimètre ARCUS
(LKB, Suède) en utilisant un filtre interférentiel adapté à l'émission du composé fluorescent accepteur et du composé de référence.
On peut également réaliser la mesure en une seule étape en utilisant le fluorimètre prototype décrit dans l'exemple 2. Dans ce cas on utilisera pour la mesure une microplaque blanche de 96 puits (Dynatech, USA).
La courbe standard FLUO665nm = f ([Prolactine]) est tracée et la concentration des 5 échantillons est mesurée.
Les résultats sont rapportés dans le tableau I ci-après
TABLEAU I
Standard ELSA-PRL [Prolactine] μUI/ml
STD0 0
STD 1 165
STD 2 300
STD 3 920
STD 4 3100
STD5 6500
Sérum à doser [Prolactine] (FLUO665) μUI/ml Ech1 141
Ech2 951
Ech3 113
Ech4 287
Ech5 699 Dans un second protocole la fluorescence à 665nm est mesurée de la même façon que décrite précédemment. Mais une seconde mesure du même puits est réalisée à 545nm après une seconde excitation, sous les mêmes paramètres temporels de lecture (délai, temps d'intégration et durée de la mesure). L'émission de fluorescence ainsi mesurée en temps résolu à 545 nm est caractéristique de l'émission du trisbipyridine diamine (Tb3+) utilisé comme référence interne et reflète les propriétés optiques du milieu à doser.
La courbe standard FLUO 665nm/FLU0545nm = f([Prolactine]) est tracée et la concentration des 5 échantillons est mesurée. Les résultats sont rapportés dans le tableau II ci-après:
TABLEAU II
Standard ELSA-PRL [Prolactine] μUI/ml
STD0 0
STD1 165
STD2 300
STD3 920
STD4 3100
STD5 6500
Sérum à doser [Prolactine](FLUO665/FLUO545) μUI/ml
Ech1 580
Ech2 428
Ech3 417
Ech4 71
Ech5 2044
Enfin, en temps que référence, les 5 échantillons sont également dosés par le kit de dosage radio-immunométrique ELSA-PRL (CIS bio international, France).
Les comparaisons des résultats de dosages effectués sur les cinq échantillons sont rassemblés dans le tableau III ci-après:
TABLEAU III [prolactine] μUI/ml
ELSA-PRL FLUO665 FLUO665/ FLUO545
Ech1 612 141 580
Ech2 395 951 428
Ech3 425 113 417
Ech4 59 287 71
Ech5 1870 699 2044 Ces résultats montrent que les mesures des concentrations des échantillons de prolactine par la méthode comprenant une correction de l'intensité de fluorescence ( FLUO665/ FLUO545) sont en bonne corrélation avec les résultats obtenus à l'aide du dosage radio-immunométrique ELSA-PRL, alors que ce n'est pas le cas lorsque la concentration est mesurée uniquement par l'intensité de fluorescence à 665nm sans correction ( FLUO665).
EXEMPLE 2 :
Correction de la fluorescence à 665nm par détection de la fluorescence du conjugué anticorps-cryptate à 620nm dans un dosage immunofluorescent homogène de la prolactine.
La mesure de la fluorescence est réalisée à l'aide d'un fluorimètre prototype, qui est décrit ci-après :
Un Laser N2 VSL 337 (LSI, USA) est utilisé comme source d'excitation (longueur d'onde à 337 nm) . La durée des pulsations est spécifiée à 3 nanosecondes et est répétée sous une fréquence de 10 Hertz. Le faisceau passe à travers un filtre (CORNING) afin d'éliminer toute lumière parasite à l'excitation autre que 337 nm.
Après être rentré dans la chambre de mesure, le faisceau est réfléchi par un filtre dichroîque, placé à 45 degrés, qui a la propriété de réfléchir les ultraviolets et de pouvoir transmettre la lumière visible.
Le faisceau réfléchi par le filtre dichroîque est focalisé sur le puits à mesurer d'une microplaque par une lentille en silice fondue. L'émission de fluorescence est collectée selon un angle solide de 20 degrés,col limatée par la même lentille, et passe directement à travers le filtre dichroîque (fluorescence en lumière visible).
Un filtre interférentiel, de caractéristiques définies selon la longueur d'onde de fluorescence à détecter, permet de se débarrasser des lumières pouvant parasiter le signal, dont l'intensité est ensuite mesurée par un photomultiplicateur
(HAMAMATSU R2949).
Le compteur de photons utilisé est un SR-400 (STANFORD RESEARCH SYSTEMS), dont les opérations et la synchronisation avec le laser sont contrôlées par un ordinateur de type IBM PC-AT via une sortie RS 232 . Les pulsations provenant du photomultiplicateur sont enregistrées pendant une fenêtre de temps (tg) et après un délai (td) déterminés à condition qu'elles soient supérieures à un niveau discriminant sélectionné par le compteur de photons afin d'optimiser le rapport signal/bruit duphotomultiplicateur.
Une table X-Y, pilotée par l'IBM PC-AT, permet les différents positionnements de la microplaque de mesure par des moteurs pas à pas, incluant les manoeuvres de chargement, de positionnement sous le faisceau excitant, de lecture automatique en séquentiel des 96 puits, et de sortie.
I. Variation du signal d'un conjugué cryptate à 620nm en fonction du sérum.
Dans une microplaque blanche de 96 puits (Dynatech, USA) on introduit :
- 100 μl de sérum à tester
- 200 μl d'un conjugué anticorps anti-prolactine-cryptate d'europium à la concentration de 0,5 pg/ml d'anticorps en tampon phosphate 100 mM pH 7,5, HSA 1 g/l, NaF 150 mM.
Le cryptate d'europium utilisé est le trisbipyridine diamine (Eu3+) dont la préparation est décrite dans la demande EP 321 353 (exemples 3 et 4).
L'anticorps anti-prolactine utilisé est l'anticorps 3D3 (CIS bio international, France).
Le conjugué anticorps 3D3-cryptate d'europium est préparé comme décrit dans l'exemple 1.
Après 1 heure d'incubation à 37°C, la fluorescence est détectée à 620nm, en temps résolu, avec un délai de mesure de 50 μs et un temps d'intégration de 400 μs. La durée de mesure est de 1 s.
La densité optique du sérum est mesurée à 310nm à l'aide d'un spectrophotomètre Lambda 15 PERKIN ELMER (UK). Les résultats sont rapportés dans le tableau IV ci-après
TABLEAU IV
Sérum Do à 310 nm Signal à 620 nm 1 0,66 25 693
2 3,3 7 754
3 0,33 33 156
4 0,90 24959 Ces résultats montrent que le signal mesuré varie fortement en fonction de la densité optique du sérum.
Dans ces conditions, il est impossible de réaliser un dosage fiable car le résultat ne dépend pas seulement de la quantité d'analyte dans le sérum mais également de la qualité optique du sérum.
II. Correction du signal de l'accepteur.
On réalise ensuite un immunoessai en ajoutant successivement dans la microplaque :
- 100 μl de sérum
- 100 μl de conjugué anticorps monoclonal anti-prolactine
3D3-cryptate d'europium trisbipyridine diamine (Eu3+) à la concentration de 0,5 Ul/ml d'anticorps dans le tampon phosphate ci-dessus,
- 100 μl de conjugué anticorps monoclonal anti-prolactine E1-allophycocyanine à la concentration de 3,5 μg/ml d'anticorps dans le même tampon.
Ce conjugué anticorps E1 (CIS bio international France)-allophycocyanine (Cyanotech, USA) est préparé comme décrit dans l'exemple 1.
La mesure est réalisée à 665nm et la valeur mesurée est corrigée en divisant cette valeur par la valeur de la fluorescence mesurée à 620nm qui reflète les propriétés optiques du milieu.
Les valeurs de concentrations déterminées à l'aide d'une courbe étalon comme indiqué dans l'exemple 1, avec ou sans correction, sont comparées avec les valeurs obtenues en utilisant comme référence le kit de dosage radio-immunométrique ELSA-PRL (CIS bio international France).
Les résultats sont rapportés dans le tableau V ci-après dans lequel figurent les valeurs des concentrations en prolactine exprimées en pu/ml déterminées respectivement par le dosage ELSA-PRL (ELSA) et par la mesure de la fluorescence à 665nm non corrigée (FIA665) et corrigée (FIA665/620), ainsi que la valeur de la fluorescence mesurée pour les différents échantillons à 620nm ( FLUO620) exprimée en coups par seconde.
TABLEAU V
Echantillon nº ELSA FIA 665/620 FIA 665 FLUO 620 1 358 394 195 42148
2 530 592 91 28272
3 65 92 18 40495
4 153 178 94 43363
5 251 289 86,7 38007
6 161 146 86,4 44531
7 179 189 77 40873
8 285 297 161 41403
9 310 330 106 35214
10 2744 3427 1470 31670
11 196 153 15 36551
12 244 198 55 38134
13 447 477 300 40340
14 251 234 350 58615 Ces résultats confirment la variabilité du signal mesuré en fonction de l'échantillon de sérum dosé.
En effet, étant donné que le conjugué anticorps-cryptate se trouve en excès dans le dosage par rapport à l'analyte recherché, le signal mesuré à 620nm (qui correspond au conjugué non engagé dans le complexe) devrait être constant. De plus, on remarque que les valeurs de concentrations en prolactine déterminées à partir de la mesure du signal à 665nm (FIA665) ne correspondent pas aux valeurs obtenues par le dosage de référence, alors que les valeurs obtenues par la mesure corrigée (FIA665/620) sont en b°nne corrélation avec celles-ci.
Cette corrélation est illustrée par les courbes des figures 2 et 3, sur lesquelles sont représentées en abscisse la concentration en prolactine déterminée par le test ELSA-PRL en Ul/ml et en ordonnée, respectivement, la concentration déterminée par la mesure corrigée FIA665/620 (figure 2), ou par la mesure non corrigée FIA665 (figure 3), exprimée en UI/ml.
Les résultats obtenus sur 97 sera, montrent que la corrélation n'est obtenue qu'avec la correction du signal mesuré à 665nm.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de mesure de la luminescence émise dans un dosage par luminescence, caractérisé en ce qu'on met en oeuvre au moins un composé luminescent traceur et un composé luminescent utilisé comme référence interne qui, lorsqu'ils sont soumis à une même longueur d'onde d'excitation, sont susceptibles d'émettre soit par luminescence directe, soit par induction d'une émission de luminescence, à des longueurs d'onde différentes, respectivement λ2 et λ 1, et en ce qu'on corrige la mesure de la luminescence émise par le composé traceur à la longueur d'onde λ2 par la mesure de la luminescence émise par le composé de référence à la longueur d'onde λ1.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé luminescent traceur et le composé de référence sont un seul et même composé.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé luminescent traceur et le composé de référence sont distincts.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le composé luminescent traceur et/ou le composé de référence sont des composés fluorescents.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le composé luminescent traceur et/ou le composé de référence sont des chélates ou des cryptates de terre rare.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le composé luminescent traceur et/ou le composé de référence ont une durée de vie supérieure à une microseconde.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 , caractérisé en ce qu'on effectue simultanément la mesure de la luminescence émise par le composé de référence et par le composé traceur, respectivement, aux longueurs d'onde λ1 et λ 2.
8. Utilisation du procédé selon la revendication 1 dans un procédé homogène de détection et/ou de détermination d'un analyte dans un milieu susceptible de le contenir.
9. Utilisation selon la revendication 8, dans un procédé homogène de détection et/ou de détermination d'un analyte dans un milieu susceptible de le contenir à l'aide d'une méthode par excès consistant :
1) à ajouter, audit milieu contenant l'analyte recherché, un premier réactif constitué par au moins un récepteur dudit analyte, couplé avec un composé luminescent donneur,
2) à ajouter un second réactif constitué par un ou plusieurs autres récepteurs dudit analyte, ledit second réactif étant couplé avec un composé luminescent accepteur,
3) à faire incuber ledit milieu après chaque addition de réactifs ou après l'addition des deux réactifs,
4) à exciter le milieu résultant à la longueur d'onde d'excitation du composé luminescent donneur, 5) à mesurer le signal du composé luminescent donneur à une longueur d'onde λ1, cette mesure servant de référence, et le signal résultant du transfert d'énergie à une longueur d'onde λ2 .
10. Utilisation selon la revendication 8, dans un procédé homogène de détection et/ou de détermination d'un analyte dans un milieu susceptible de le contenir à l'aide d'une méthode par compétition consistant :
1) à ajouter, audit milieu contenant l'analyte recherché, un premier réactif constitué par un récepteur dudit analyte, couplé avec un composé luminescent donneur,
2) à ajouter un second réactif constitué de l'analyte couplé avec un composé luminescent accepteur,
3) à faire incuber ledit milieu après chaque addition de réactifs ou après l'addition des deux réactifs,
4) à exciter le milieu résultant à la longueur d'onde d'excitation du composé luminescent donneur,
5) à mesurer le signal du composé luminescent donneur à une longueur d'onde λ1, cette mesure servant de référence, et le signal résultant du transfert d'énergie à une longueur d'onde différente λ2.
11. Utilisation selon la revendication 8, dans un procédé homogène de détection et/ou de détermination d'un analyte dans un milieu susceptible de le contenir à l'aide d'une méthode par compétition consistant :
1) à ajouter, audit milieu contenant l'analyte recherché, un premier réactif constitué par un récepteur dudit analyte, ledit récepteur étant couplé avec un composé luminescent accepteur,
2) à ajouter un second réactif constitué de l'analyte couplé avec un composé luminescent donneur,
3) à faire incuber ledit milieu après chaque addition de réactifs ou après l'addition des deux réactifs,
4) à exciter le milieu résultant à la longueur d'onde d'excitation du composé luminescent donneur,
5) à mesurer le signal du composé luminescent donneur à une longueur d'onde λ1, cette mesure servant de référence, et le signal résultant du transfert d'énergie à une longueur d'onde différente λ2.
12. Utilisation selon la revendication 8, dans un procédé homogène de détection et/ou de détermination d'un analyte dans un milieu susceptible de le contenir à l'aide d'une méthode consistant:
1) à ajouter audit milieu un premier réactif constitué d'un récepteur dudit analyte,
2) à ajouter un second réactif choisi parmi l'analyte ou au moins l'un de ses récepteurs, l'un des deux réactifs étant couplé avec un composé luminescent traceur et l'autre réactif comportant un atome lourd ou des motifs contenant un atome lourd, ainsi qu'un composé luminescent servant de référence interne,
3) à faire incuber le milieu résultant soit après l'addition de chaque réactif soit après l'addition des deux réactifs,
4) à exciter le milieu résultant, et
5) à mesurer d'une part le signal émis par le composé luminescent traceur, ledit signal étant modulé par l'effet d'atome lourd à une longueur d'onde λ2 r et d'autre part le signal émis par le composé de référence à une longueur λ 1.
13. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisée en ce qu'on effectue simultanément la mesure de la luminescence émise par le composé de référence et par le composé traceur, respectivement, aux longueurs d'onde λ1 et λ2.
14. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisée en ce qu'au moins l'un des récepteurs de l'analyte est fixé à un support solide.
15. Dispositif pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une source d'excitation lumineuse, des moyens pour collecter le faisceau lumineux émis à la suite de ladite excitation, et des moyens pour permettre la mesure de la luminescence à deux longueurs d'ondes distinctes.
16. Dispositif selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comprend également des moyens pour diviser le faisceau émis à la suite de l'excitation.
17. Dispositif selon l'une des revendications 15 ou 16, caractérisé en ce qu'il comprend également une méthode de correction de la mesure réalisée à la longueur d'onde λ2 intégrée à l'appareillage, consistant à fixer un taux de comptage sur le canal mesurant l'émission de luminescence du composé de référence à la longueur d'onde λ1, puis, lorsque ce taux est atteint, à déclencher la fin de la mesure sur le canal mesurant l'émission de luminescence à la longueur d'onde λ2.
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