WO1995018851A1 - Verfahren zum zerkleinern von hochmolekularen strukturen - Google Patents

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WO1995018851A1
WO1995018851A1 PCT/EP1995/000037 EP9500037W WO9518851A1 WO 1995018851 A1 WO1995018851 A1 WO 1995018851A1 EP 9500037 W EP9500037 W EP 9500037W WO 9518851 A1 WO9518851 A1 WO 9518851A1
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pore size
structures
porous layer
molecular
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PCT/EP1995/000037
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Helge Bastian
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Qiagen Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes

Definitions

  • the present invention relates to a method for comminuting high-molecular structures according to claim 1, a device according to claim 7 and uses of the device according to claims 12 to 15.
  • RNA or mRNA from cell or tissue lysates in most cases requires a homogenization step, since the rate of hybridization between the oligo-dT matrix necessary for mRNA isolation (e.g. Cellulose, paramagnetic particles or latex particles) in highly viscous solutions, in contrast to homogeneous solutions, is very low.
  • the corresponding matrices can, as it were, stick to the high molecular DNA that is also present in the sample and make cleaning so difficult that it is even impossible in some cases.
  • the high molecular weight DNA can be comminuted (sheared) by mechanical comminution of a sample frozen in liquid nitrogen using a pestle and mortar.
  • the DNA is also sheared by pulling the sample with high molecular DNA through a cannula into a syringe several times. In addition to their high workload, these methods are also not suitable for guaranteeing clean work.
  • the homogenization process for isolating biomolecules from potentially infectious starting material, such as human cell and / or tissue samples (biopsy material), has proven to be the most dangerous source for contamination of the person carrying out the experiment, since the homogenate can spray over a considerable distance during conventional homogenization .
  • nucleic acids and other biomolecules proves to be extremely difficult due to the high content of polysaccharides, polyols and / or other secondary metabolites, since after disintegration of the cells or tissues the substances mentioned are highly viscous lysates or Form gelatinous structures. Simply centrifuging off the gelatinous mass does not lead to success in most cases, since separation from the solution used cannot be achieved. The gelatinous structures and high viscosity prevent efficient isolation of nucleic acids or make them partially impossible.
  • Special homogenizers such as the commercially available UltraTurrax, Polytron, Omni, Tissuemizer and others can also be used to shear high-molecular DNA. Although this method enables simple and rapid homogenization of practically every sample, it is disadvantageous that very small cell, tissue or solution quantities which are intended in particular for analysis by means of PCR or RT-PCR, special mini generators have to be purchased. In order to avoid cross-contamination between different cell or tissue samples or other samples, miniaturized disposable generators can then also be used, although it must be assumed that a relatively complex device for homogenizing is already available. The miniaturized disposable generators themselves are also very cost-intensive.
  • Another method of homogenization that has proven itself for some applications is ultrasound treatment of the sample in question. This requires expensive equipment in the field mentioned, for example the PCR application. Another disadvantage is that disposable ultrasound heads are not available. There is also the danger that the nucleic acids will be too fragmented by the ultrasound treatment until they are completely unusable for the further analysis methods.
  • the apparatus for performing the described method consists of a hollow body with an inlet opening and an outlet opening, a powdery first material based on silica gel being arranged in the hollow body between two fixing devices and a second material being arranged between the first and the outlet opening, the first and second Materials have different adsorption characteristics for nucleic acids.
  • DE 4034 036 relates to a device and a method for isolating nucleic acids from cell suspensions.
  • the device for carrying out this method has a cell-receiving matrix in a hollow body between two porous devices.
  • the pore size of the facilities is larger than the cavity size of the material forming the matrix.
  • the problem on which the invention is based therefore consists in specifying a method which avoids the disadvantages of the prior art mentioned.
  • the aim is to provide a method which, in a simple and inexpensive manner, enables efficient and cross-contamination-free preparation of nucleic acids and generally homogenization of viscous systems.
  • Claims 7 to 11 relate to the device which is particularly suitable for the method according to the invention.
  • Claims 12 to 15 relate to the use of the device according to the invention.
  • the method according to the invention for comminuting high-molecular structures, in particular high-molecular nucleic acids assumes that the system containing the structures to be comminuted is arranged on a device. is arranged.
  • This device has at least one porous layer.
  • the porous layer has an asymmetrical distribution of its pore size.
  • the pore size decreases in the direction of passage of the structures to be comminuted, as seen through the porous layer.
  • the term pore size is to be understood as an average pore size.
  • the system containing the high-molecular structures to be comminuted passes through the device, the high-molecular structures being comminuted during the passage, presumably because of their sensitivity to mechanical influences.
  • the system containing the high-molecular structures to be comminuted can in particular be a relatively highly viscous system which consists of a cell and / or tissue lysate or a matrix used for the separation of nucleic acids, such as polyacrylamide gels, or soft tissue (breast tissue, brain, fat tissue and the like) . ⁇ .), or solutions that contain high molecular weight DNA.
  • a relatively highly viscous system which consists of a cell and / or tissue lysate or a matrix used for the separation of nucleic acids, such as polyacrylamide gels, or soft tissue (breast tissue, brain, fat tissue and the like) . ⁇ .), or solutions that contain high molecular weight DNA.
  • the method according to the invention can advantageously also be used for the homogenization of inhomogeneous viscous systems, in particular cell and tissue lysates, if the device described above has at least two porous layers.
  • the viscous system containing the high molecular weight structures to be comminuted or to be homogenized passes the device with at least two porous layers, the pore size of the porous layer decreasing as seen in the direction of passage of the system to be homogenized.
  • the pore size of the first layer seen in the direction of passage can be up to 6 times the pore size of the underlying second layer.
  • the second layer has a minimum pore size, which is essentially determined by the fact that the second layer is not blocked by the layer to be comminuted or homogenized.
  • the pore size of the second layer is typically> 10 ⁇ m.
  • a matrix used for the separation of nucleic acids or proteins, such as polyacrylamide gels, can thus also be comminuted or homogenized. The process can be repeated several times if it is shown that sufficient shear has not been achieved after a single passage. It goes without saying that the method according to the invention can also be modified in such a way that the passage distance for the structure to be comminuted is lengthened by varying the thickness of the porous layer or layers used.
  • Cells and / or tissues can optionally be taken up in buffer containing guanidine thiocyanate or in a buffer containing proteinase K or similar protease and / or if necessary incubated therein.
  • the pieces of cells or tissue may have been shredded beforehand by mechanical action.
  • the device according to the invention is problem-free for isolating nucleic acids. Highly viscous material is sheared in this device so that the lysate can then be easily used for further processing, while cell and tissue residues are removed from the lysate at the same time by the filtration effect of the device.
  • the passage of the viscous system through the pores surprisingly causes shear of substances sensitive to mechanical influences.
  • the passage shears high molecular nucleic acid, such as genomic DNA.
  • the method according to the invention makes it possible to homogenize genomic DNA or other solutions containing high-molecular compounds and to comminute high-molecular structures such as polyacrylamide gels. After homogenization, the corresponding samples have a lower viscosity than at the beginning of the treatment. Accordingly, the samples can be processed further more easily.
  • the method according to the invention enables sample preparation for the isolation of RNA and DNA. This makes RNA molecules accessible, particularly in a size range from 0.8 to 20 Kbp. DNA molecules with a size of 40,000 to 50,000 bp are obtained from samples that contain DNA as chromosomal DNA.
  • the system having the high-molecular structure to be comminuted or the system (sample) to be homogenized is arranged on the device with at least one porous layer and is pressed on the sample side by mechanical action through the at least one porous layer.
  • the passage can be effected, for example, on the sample side with mechanical action such as overpressure or gravity, as can be generated by centrifugation.
  • the device according to the invention advantageously allows sample preparation for the PCR reaction (PCR: Polymerase Chain Reaction).
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • This reaction is used for DNA amplification.
  • the DNA is predominantly obtained in lengths of 40 to 60 kb, regardless of whether the DNA comes directly from cell lysates or from pre-cleaned solutions.
  • the invention can thus advantageously be combined with the method described in P 43 21904.
  • a nucleic acid-binding matrix, such as glass fibers, is arranged on the porous layer.
  • the existing DNA is bound to the matrix under high ionic strengths and is then sheared (reduced) by elution with water, for example, by passing through the porous layer (s).
  • the same procedure must also be followed for the single-layer embodiment of the method.
  • FIG. 1 shows a device adapted to the method according to the invention, which is also the subject of the present invention.
  • the device has an inlet opening 10 and an outlet opening 15 with a device 1 arranged in the lumen of a hollow body 5.
  • the device 1 consists of a porous layer, the pore size of which decreases as seen through the porous layer in the direction of passage of the structures to be comminuted.
  • the porous layer preferably consists of inert materials, such as inorganic or organic substances, in particular glass frit-like materials or polymeric substances, as are also used for the construction of membrane filters.
  • Polyethylene, polypropylene, polystyrene and other polymeric hydrocarbon materials from which the porous layer can consist should be mentioned in particular.
  • FIG. 2 shows a device adapted to the method according to the invention, which is also the subject of the present invention. It has an inlet opening 10 and an outlet opening 15 with a device 1 arranged in the lumen of a hollow body 5.
  • the device 1 consists of at least two layers 2, 3 with the pore size of the layers 2 3 decreasing in the direction of the outlet opening 15. Passing the system to be homogenized through the layers 2, 3 is homogenized.
  • the layers are preferably fastened in the hollow body 5, which is in particular cylindrical. This attachment can take place by friction, for example by clamping the device 1 with the layers 2, 3 or by gluing to the, in particular, cylindrical cavity wall.
  • the layers have a pore size in the range from 1 mm to 10 ⁇ m, the pore size of the respective layers being graded.
  • the device according to the invention is matched to commercially available centrifuge tubes.
  • Figure 3 shows such an arrangement.
  • An essentially cylindrical hollow body with a funnel-shaped tapering at the outlet opening 15 is arranged at the upper end of the centrifuge tube so that the inlet opening 10 of the device to be used according to the invention is also arranged at the opening of the centrifuge tube 20.
  • the arrangement can be closed by means of a lid 25 which is arranged either on the device according to the invention or on the centrifuge tube itself. Inside the device according to the invention, five layers 2, 3, 4, 5, 6 are preferably arranged so that the layer with the smaller pore size directly adjoins the surface with the larger pore size. After passage of the viscous system through the device 1, the homogenized solution 30 collects at the bottom of the centrifuge tube 20.
  • the porous layers starting with layer 2, have pore sizes of approximately 200 ⁇ m, layer 3 approximately 75 ⁇ m, layer 4 approximately 35 ⁇ m, layer 5 approximately 20 ⁇ m and layer 6 approximately 10 ⁇ m on. It goes without saying that the device can also be used with only one porous layer, as described above.
  • the device 1 is arranged in a syringe (as a cylindrical hollow body 5).
  • the viscous system to be homogenized is drawn through the cannula into the syringe and passes through the device 1 located near the connection point between the cannula and the syringe. If the sample is drawn into the syringe, the device 1 can be pushed out again happen. If necessary, this process can be repeated several times in order to ensure adequate homogenization, in particular highly viscous solutions containing high molecular weight nucleic acids.
  • the layer with the largest pore size of the cannula can face the syringe.
  • the method according to the invention and / or the device according to the invention can nucleic acids, such as genomic DNA or total nucleic acids from the
  • CORRECTED SHEET (RULE 91) ISA / EP corresponding matrices are isolated, which are usually used for the separation of nucleic acids.
  • polyacrylamide gels which are used as a matrix for gel electrophoretic separations of DNA or RNA. After electrophoresis, only the bands in which the nucleic acids of a certain size have accumulated are separated from the other gel components, for example by punching or cutting, and then passed through the device to be used according to the invention using the method described according to the invention. It has surprisingly been found that the residual stocks of the gel present in the homogenized solution have no disruptive effects on the following molecular biological processing steps of the nucleic acids.
  • the invention thus describes a simple, safe and inexpensive method for comminuting and homogenizing viscous systems, in particular cell and tissue lysates or systems containing high molecular weight nucleic acids.
  • Sarcosin OW 150 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8.0, 10 mM Tris-HCl pH 7.5 TE: 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA pH 8.0 example 1
  • HeLa cells which were grown on a 10 cm cell culture dish until confluent growth (approx. I x 10 7 cells), were lysed in 600 ⁇ m OL directly on the cell culture dish.
  • the lysate was collected with a cell scraper on one side of the dish and pipetted onto a device according to the present patent application.
  • two layers of CELLPOR PE filter plates of 200 ⁇ m and 35 ⁇ m pore size were arranged in such a way that the layer with the smaller pore size was in the direction of the outlet opening.
  • the device was placed in a 2 ml microcentrifuge tube. The viscous lysate was then centrifuged through the device at full speed for 3 minutes in a conventional table centrifuge (approx.
  • the non-viscous lysate thus obtained was mixed with 1,200 ⁇ m DB and centrifuged for 3 min. The supernatant was transferred to a new centrifuge tube, mixed with 35 ⁇ l of an Oligotex suspension and incubated for 10 min.
  • the mRNA: Oligotex complexes were then pelleted and washed twice in 600 ⁇ l OW by resuspending and centrifuging. The mRNA was then eluted from the Oligotex particles in water and, after centrifugation and pelleting of the latex particles, transferred as a cleaned mRNA fraction into a new microcentrifuge tube.
  • Genomic DNA with an average size of 100 kb was extracted from HeLa cells according to the procedure in "Current Protocols in Molecular Biology "(Ausubel et al., Wiley and Sons, Boston, Vol. 1, pages 2.2.1 to 2.2.3).
  • the DNA was in Tris buffer using a device according to the present patent application with a layer of CELLPOR PE filter plates of 200 ⁇ m, 50 ⁇ m, 35 ⁇ m and 5 ⁇ m pore size was centrifuged for 2 minutes, then 1 ⁇ g of the differently sheared DNA and non-sheared DNA were used in the PCR approach to make a 140 bp fragment of the globin gene In the PCR reaction, with the same number of cycles, a higher yield of amplificate was achieved with sheared DNA than with unsheared DNA.
  • RNA was transcribed in vitro on a denaturing 5% polyacrylamide-urea gel in order to separate the "full-length" transcript from shorter transcripts.
  • the corresponding, 360-base band was cut out and transferred to a device according to the present patent application with a layer of CELLPOR PE filter plates of 200 ⁇ m.
  • 500 ul TE buffer was pipetted onto the device. The mixture was then centrifuged for 3 minutes at full speed in a conventional table centrifuge (approx. 14,000 to 18,000 g).
  • the piece of gel crushed in this way was again transferred to a device with a layer of a CELLPOR PE filter plate with a pore size of 1 ⁇ m in order to separate the small pieces of polyacrylamide-urea gel from the liquid.
  • the aqueous fraction in the receiver was then extracted phenol / chloroform.
  • the upper, aqueous phase was pipetted off, and the RNA dissolved therein was precipitated with LiCl (final concentration 3 M) for 3 hours at 20 ° C.
  • the RNA pellet was washed twice with 70% alcohol, centrifuged off and dried under vacuum. The RNA was then dissolved in TE.
  • R1 3.5 M guanidine isothiocyanate, 25 mM Na citrate pH 7.0,
  • 1% ⁇ -mercaptoethanol R2 900 mM GTC, 25 mM Tris-HCl pH 7.5, 10% ethanol TE: 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 80% ethanol
  • the non-viscous lysate thus obtained was mixed with 350 ul 70% ethanol and pipetted according to P 44 04 361 onto an RNeasy Spin column, which hangs in a 2 ml microcentrifuge tube. A centrifugation at 8,000 xg for 15 seconds is then carried out in a standard table centrifuge. The RNeasy Spin column is transferred to a new 2 ml tube and washed with 700 ⁇ l wash buffer R2 (15 seconds centrifugation at 8,000 xg). The column is then washed twice with 500 ⁇ l of washing buffer TE.
  • the column is placed in a new 1.5 ml reaction vessel, 50 ⁇ l of DEPC-treated water are applied directly to the membrane of the spin pipetted, and the RNA then collected by centrifugation at 8,000 xg for 1 min.
  • the non-viscous lysate thus obtained was mixed with 225 ⁇ l of 100% ethanol and pipetted according to P 44 04 361 onto an RNeasy Spin column, which hangs in a 2 ml microcentrifuge tube. This is followed by centrifugation at 8,000 x g for 15 seconds in a standard table centrifuge.
  • the RNeasy Spin column is transferred to a new 2 ml tube and washed with 700 ⁇ l wash buffer R2 (15 seconds centrifugation at 8000 x g). The column is then washed twice with 500 ⁇ l of washing buffer TE.
  • the column is placed in a new 1.5 ml reaction vessel, 50 ⁇ l of DEPC-treated water are pipetted directly onto the membrane of the spin column, and the RNA is then collected by centrifugation at 8,000 ⁇ g for 1 min.

Abstract

Verfahren zum Zerkleinern hochmolekularer Strukturen, insbesondere hochmolekularer Nucleinsäurestrukturen in Proben, wobei die zu zerkleinernden hochmolekularen Strukturen eine Einrichtung passieren, die mit mindestens einer porösen Schicht versehen ist, deren Porengröße in Passierrichtung der zu zerkleinernden Strukturen, durch die poröse Schicht gesehen, abnimmt.

Description

Verfahren zum Zerkleinern von hochmolekularen Strukturen
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Zerkleinerung von hochmolekularen Strukturen gemäß Anspruch 1, eine Vorrichtung gemäß Patentanspruch 7 sowie Verwendungen der Vorrichtung gemäß Ansprüchen 12 bis 15.
Ausgangspunkt vieler biologischer Isolationsverfahren sind beispielsweise Zeil- und Gewebelysate, die häufig sehr viskose Systeme darstellen. Aufgrund ihrer hohen Viskosität sind diese Systeme kaum weiterbearbeitbar und werden üblicherweise verschiedenen Verfahren zur Homogenisierung oder Verringerung der Viskosität unterzogen.
Insbesondere bei der Isolierung von mRNA ist es notwendig, die diese Substanzen enthaltenden Proben zu homogenisieren mit dem Ziel nicht-viskose Lysate oder Lösungen zu erhalten. Die Herstellung von homogenen Zell-Lysaten oder Lösungen mit geringerer Viskosität ist bei einer Reihe molekularbio¬ logischer Techniken notwendig. Beispielhaft seien im folgen¬ den einige dieser Techniken genannt.
Die direkte Isolierung von Gesamt-RNA oder mRNA aus Zell- oder Gewebelysaten erfordert in den meisten Fällen einen Homogenisierungsschritt, da die Hybridisierungsrate zwischen dem zur mRNA Isolierung notwendigen oligo-dT Matrix (z.B. Cellulose, paramagnetische Partikel oder Latexpartikel) in hochviskosen Lösungen, im Gegensatz zu homogenen Lösungen, sehr niedrig ist. Die entsprechenden Matrices können dabei mit der in der Probe ebenfalls vorhandenen hochmolekularen DNA quasi verkleben und eine Reinigung soweit erschweren, daß sie in manchen Fällen sogar unmöglich wird.
Schließlich ist bei der Präparation von Gesamt-RNA, wie z.B. in P 4321904 beschrieben, die zur chromatographischen Auf¬ reinigung notwendige und in eine Apparatur eingesetzte Membran durch hoch-viskose Lysate oder Lösungen schnell verstopft.
Die Protokolle für eine direkte mRNA Isolierung, wie sie im Stand der Technik bekannt sind unter Verwendung bekannter Produkte, gehen davon aus, daß eine Homogenisierung der Proben, die die genannten Substanzen enthalten, unbedingt erforderlich ist.
Es hat sich beispielsweise gezeigt, daß in der Polymerase- Chain-Reaction (PCR) mit genomischer DNA bessere Ergebnisse erzielt werden, wenn gescherte, niedermolekulare DNA eingesetzt wird. Dies könnte damit zusammenhängen, daß kleinere DNA Fragmente leichter denaturierbar sind und so die Hybridisierung des Primers (Primer-Annealing) effizienter ist. In diesem Zusammenhang ist bedeutsam, daß, bei Präparationen von Nucleinsäuren (mRNA, Gesamt-RNA und DNA) für die PCR-Reaktion, Cross-Kontaminationen mit Nucleinsäuren zwischen gleichzeitig oder nacheinander aufgearbeiteten Proben sowie Cross-Kontaminationen mit Nucleinsäuren aus anderen Quellen unbedingt vermieden werden müssen, da die PCR-Reaktion äußerst empfindlich ist, so daß auch Verun¬ reinigungen mit nicht gewünschter Nucleinsäure entsprechend amplifiziert werden würden.
Im Stand der Technik werden zur Homogenisierung bzw. Scherung von Geweben, Zellen und/oder hochmolekularen Stoffen ent- haltenden Lösungen im wesentlichen die folgenden Methoden angewandt.
Die Zerkleinerung (Scherung) der hochmolekularen DNA kann durch mechanisches Zerkleinern einer in flüssigen Stickstoff¬ tiefgefrorenen Probe mittels Pistill und Mörser erfolgen. Auch durch mehrmaliges Aufziehen der Probe mit hochmole¬ kularer DNA durch eine Kanüle in eine Spritze, wird die DNA geschert. Diese Methoden sind neben ihrem hohen Arbeits¬ aufwand auch nicht geeignet, ein sauberes Arbeiten zu garantieren. So erweist sich der Homogenisierungsprozeß zur Isolierung von Biomolekülen aus potentiell infektiösem Ausgangsmaterial, wie menschliche Zeil- und/oder Gewebeproben (Biopsiematerial) , als gefährlichste Quelle für eine Konta¬ mination des Versuchsdurchführenden, da das Homogenat bei der konventionellen Homogenisierung über eine beträchtliche Distanz spritzen kann.
Die Extraktion von Nucleinsäuren und anderen Biomolekülen aus pflanzlichen Materialien erweist sich aufgrund des hohen Gehalts an Polysacchariden, Polyolen und/oder anderen sekun¬ dären Metaboliten als äußerst schwierig, da die genannten Substanzen nach Aufschluß der Zellen oder Gewebe in den üblicherweise verwendeten Löschungen hochviskose Lysate oder gallertartige Strukturen ausbilden. Einfaches Abzentri- fugieren der gallertartigen Masse führt in den meisten Fällen nicht zum Erfolg, da eine Trennung von der verwendeten Lösung nicht erreicht werden kann. Die gallertartigen Strukturen und die hohe Viskosität verhindern eine effiziente Isolierung von Nucleinsäuren bzw. machen sie teilweise unmöglich.
Auch spezielle Homogenisatoren wie die handelsüblichen Ultra- turrax, Polytron, Omni, Tissuemizer u.a. können zur Scherung von hochmolekularer DNA eingesetzt werden. Diese Methode er¬ möglicht zwar ein einfaches und schnelles Homogenisieren praktisch jeder Probe, nachteilig ist allerdings, daß zur Homogenisierung sehr kleiner Zeil-, Gewebe- oder Lösungs- mengen, die insbesondere nachfolgend zur Analyse mittels PCR oder RT-PCR vorgesehen sind, spezielle Mini-Generatoren an¬ geschafft werden müssen. Um Cross-Kontaminationen zwischen verschiedenen Zeil- oder Gewebeproben oder anderen Proben zu vermeiden, können dann auch miniaturisierte Einmal- Generatoren verwendet werden, wobei jedoch vorausgesetzt werden muß, daß ein relativ aufwendiges Gerät zum Homo¬ genisieren bereits vorhanden ist. Die miniaturisierten Einmal-Generatoren selbst sind darüber hinaus sehr kosten¬ intensiv.
Eine weitere Methode zur Homogenisierung, die sich für einige Anwendungen bewährt hat, ist eine Ultraschallbehandlung der betreffenden Probe. Dabei ist auf dem angesprochenen Gebiet, beispielsweise der PCR-Anwendung, teures Gerät erforderlich. Nachteilig ist ebenfalls, daß Einmal-Ultraschallköpfe nicht erhältlich sind. Es besteht darüber hinaus die Gefahr, daß die Nucleinsäuren durch die Ultraschallbehandlung zu stark fragmentiert werden bis zur völligen Unbrauchbarkeit für die weiteren Analyse-Methoden.
Die DE 41 39 664 AI betrifft eine Vorrichtung und ein Ver¬ fahren zur Isolierung und Reinigung von Nucleinsäuren. Die Vorrichtung zur Durchführung des beschriebenen Verfahrens besteht aus einem Hohlkörper mit einer Einlaßöffnung und einer Auslaßöffnung, wobei im Hohlkörper zwischen zwei Fixiereinrichtungen ein pulverförmiges erstes Material auf Silicagelbasis angeordnet ist und ein zweites Material zwischen dem ersten und der Auslaßöffnung angeordnet ist, wobei die ersten und zweiten Materialien unterschiedliche Adsorptionscharakteristika für Nucleinsäuren aufweisen.
Die DE 4034 036 betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren aus Zellsuspensionen. Die Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens weist eine zellenaufnehmehde Matrix in einem Hohlkörper zwischen zwei porösen Einrichtungen auf. Die Porengröße der Einrichtungen ist größer als die Hohlraumgröße des die Matrix bildenden Materials.
CLONTECH Labs 1993, "Nucleic Acid Purification with CHROMA SPIN Columns", betrifft ein Verfahren zur Extraktion von Nucleinsäuren aus Agarosegelstücken.
In D. Blδcher und G. Iliakis, Int. J. Radiat. Biol., 1991, Vol. 59, 919 - 926, werden DNA-Fragmente von einem Filter entfernt während einer nicht denaturierenden Filterelution. Dabei scheinen DNA-Stücke an der Filtermembran abgebaut zu werden.
Das der Erfindung zugrundeliegende Problem besteht demnach darin, ein Verfahren anzugeben, das die genannten Nachteile des Standes der Technik vermeidet. Es soll ein Verfahren bereitgestellt werden, das es in einfacher und kosten¬ günstiger Weise ermöglicht, eine effiziente und cross- kontaminationsfreie Präparation von Nucleinsäuren und generell eine Homogenisierung von viskosen Systemen zu erreichen.
Das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem wird gelöst durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1. Die sich daran anschließenden Unteransprüche 2 bis 6 betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Die Patentansprüche 7 bis 11 betreffen die für das er¬ findungsgemäße Verfahren besonders geeignete Vorrichtung. Die Ansprüche 12 bis 15 betreffen die Verwendung der er¬ findungsgemäßen Vorrichtung.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Zerkleinerung von hoch¬ molekularen Strukturen insbesondere hochmolekularer Nuclein¬ säuren geht davon aus, daß das die zu zerkleinernden Strukturen enthaltende System auf einer Einrichtung ange- ordnet wird. Diese Einrichtung weist mindestens eine poröse Schicht auf. Die poröse Schicht weist dabei eine asymme¬ trische Verteilung ihrer Porengröße auf. Die Porengröße nimmt dabei in Passierrichtung der zu zerkleinernden Strukturen, durch die poröse Schicht gesehen, ab. Der Begriff Porengröße ist als mittlere Porengröße zu verstehen. Das die zu zer¬ kleinernden hochmolekularen Strukturen enthaltende System passiert die Einrichtung, wobei während der Passage die hoch¬ molekularen Strukturen, vermutlich aufgrund ihrer Empfind¬ lichkeit gegen mechanische Einwirkungen, zerkleinert werden. Das die zu zerkleinernden hochmolekularen Strukturen enthal¬ tende System kann insbesondere ein relativ hoch viskoses System sein, das aus einem Zeil- und/oder Gewebelysat besteht oder eine zur Trennung von Nucleinsäuren verwendete Matrix, wie Polyacrylamidgele, oder Weichgewebe (Brustgewebe, Hirn, Fettgewebe u. ä.), oder Lösungen, die hochmolekulare DNA enthalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in vorteilhafter Weise auch zur Homogenisierung von inhomogenen viskosen Systemen, insbesondere Zeil- und Gewebelysaten, verwendet werden, wenn die oben beschriebene Einrichtung mindestens zwei poröse Schichten aufweist. Das die zu zerkleinernden hochmolekularen Strukturen enthaltende oder zu homogenisierende viskose System passiert die Einrichtung mit mindestens zwei porösen Schichten, wobei die Porengröße der porösen Schicht in Passierrichtung des zu homogenisierenden Systems gesehen abnimmt. Die Porengröße der in Passierrichtung gesehenen ersten Schicht kann bis zum 6-fachen der Porengröße der darunterliegenden zweiten Schicht betragen. Die zweite Schicht besitzt eine Mindestporengröße, die im wesentlichen dadurch bestimmt ist, daß eine Verstopfung der zweiten Schicht durch die zu zerkleinernde oder homogenisierende Schicht unterbleibt. Typischerweise ist die Porengröße der zweiten Schicht > 10 μm. Damit kann auch eine zur Trennung von Nucleinsäuren oder Proteine verwendete Matrix, wie Polyacrylamidgele, zerkleinert bzw. homogenisiert werden. Der Vorgang kann mehrfach wiederholt werden, wenn sich zeigt, daß keine hinreichende Scherung nach einmaliger Passage erreicht wurde. Es versteht sich, daß das erfindungsgemäße Verfahren ebenso dahingehend abgewandelt werden kann, daß die Passierstrecke für die zu zerkleinernde Struktur ver¬ längert wird, indem die Dicke der verwendeten porösen Schicht oder Schichten variiert wird.
Zellen- und/oder Gewebe können gegebenenfalls in Guanidin- thiocyanat-haltigem Puffer oder in einem Proteinase K oder ähnliche Protease enthaltenden Puffer aufgenommen und/oder gegebenenfalls darin inkubiert werden. Die Zellen- oder Gewebestücke können vorher durch mechanische Einwirkung zerkleinert worden sein.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist zur Isolierung von Nucleinsäuren problemlos. Hochviskoses Material wird in dieser Vorrichtung geschert, so daß das Lysat anschließend einfach für die weitere Verarbeitung benutzt werden kann, während Zeil- und Gewebereste gleichzeitig aus dem Lysat durch den Filtrationseffekt der Vorrichtung entfernt werden.
Die Passage des viskosen Systems durch die Poren bewirkt überraschenderweise eine Scherung von gegen mechanische Einflüsse empfindlichen Substanzen. Insbesondere wird durch die Passage hochmolekulare Nucleinsäure, wie genomische DNA geschert. Gleichzeitig können durch das erfindungsgemäße Verfahren genomische DNA oder andere hochmolekulare Ver¬ bindungen enthaltende Lösungen homogenisiert und hoch¬ molekulare Strukturen wie Polyacrylamidgele zerkleinert werden. Nach der Homogenisierung weisen die entsprechenden Proben eine geringere Viskosität als zu Anfang der Behandlung auf. Die Proben können dementsprechend leichter weiterver¬ arbeitet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Probenauf¬ bereitung zur Isolierung von RNA und DNA. Dabei werden RNA- Moleküle, insbesondere in einem Größenbereich von 0,8 bis 20 Kbp zugänglich. DNA-Moleküle in einer Größe von 40.000 bis 50.0000 bp werden aus Proben erhalten, die DNA als chromosomale DNA enthalten.
In einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Ver¬ fahrens wird das die zu zerkleinernde hochmolekulare Struktur aufweisende System oder das zu homogenisierende System (Probe) auf der Einrichtung mit mindestens einer porösen Schicht angeordnet und auf der Probenseite unter mechanischer Einwirkung durch die mindestens eine poröse Schicht gedrückt. Die Passage kann beispielsweise auf der Probenseite mit mechanischer Einwirkung wie Überdruck oder Schwerkraft, wie sie durch Zentrifugation generiert werden kann, bewirkt werden. Es ist jedoch ebenfalls möglich, auf der der Probe abgewandten Seite einen Unterdruck zu erzeugen, wodurch dann z.B. das zu homogenisierende viskose System die porösen Schichten der Einrichtung passiert.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung erlaubt in vorteilhafter Weise eine Probenvorbereitung für die PCR-Reaktion (PCR: Polymerase Chain Reaction) . Diese Reaktion dient der DNA- Amplifikation. Insbesondere bei Verwendung einer Schicht mit einer Porengröße im Bereich von 20 μm bis 70 μm fällt die DNA überwiegend in Längen von 40 bis 60 kb an, unabhängig davon, ob die DNA direkt aus Zell-Lysaten stammt oder aus vorgereinigten Lösungen. Somit läßt sich die Erfindung in vorteilhafter Weise mit dem in P 43 21904 beschriebenen Ver¬ fahren kombinieren. Auf der porösen Schicht wird eine Nucleinsäure bindende Matrix wie z.B. Glasfasern, angeordnet. Die vorhandene DNA wird dabei unter hohen Ionenstärken auf der Matrix gebunden und bei Elution, mit z.B. Wasser, danach durch Passieren der poröse(n) Schicht (en) geschert (zer¬ kleinert) . Analog ist auch bei der einschichtigen Ausführungsform des Verfahrens vorzugehen.
Die Figur 1 zeigt eine an das erfindungsgemäße Verfahren angepaßte Vorrichtung, die ebenfalls gemäß Anspruch 7 Gegen¬ stand der vorliegenden Erfindung ist. Die Vorrichtung weist eine Einlaß- 10 und Auslaßöffnung 15, mit einer im Lumen eines Hohlkörpers 5 angeordneten Einrichtung 1 auf. Die Einrichtung 1 besteht aus einer porösen Schicht, deren Porengröße, in Passierrichtung der zu zerkleinernden Strukturen durch die poröse Schicht gesehen, abnimmt. Die poröse Schicht besteht vorzugsweise aus inerten Materialien, wie anorganischen oder organischen Substanzen, insbesondere Glasfritten-ähnliche Materialien oder polymere Substanzen, wie sie auch zum Aufbau von Membranfiltern verwendet werden. Es sind insbesondere Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol und andere polymere Kohlenwasserstoffmaterialien zu nennen, aus denen die poröse Schicht bestehen kann.
Die Figur 2 zeigt eine an das erfindungsgemäße Verfahren angepaßte Vorrichtung, die ebenfalls gemäß Anspruch 8 Gegen¬ stand der vorliegenden Erfindung ist. Die weist eine Einlaß- 10 und Auslaßöffnung 15, mit einer im Lumen eines Hohlkörpers 5 angeordneten Einrichtung 1 auf. Die Einrichtung 1 besteht aus mindestens zwei Schichten 2,3 mit in Richtung der Aus¬ laßöffnung 15 abnehmender Porengröße der Schichten 2,3. Durch die Passage des zu homogenisierenden Systems durch die Schichten 2,3 wird diese homogenisiert. Die Schichten sind vorzugsweise in dem insbesondere zylindrisch ausgestalteten Hohlkörper 5 befestigt. Diese Befestigung kann durch Reibung, wie beispielsweise durch Einspannen der Einrichtung 1 mit den Schichten 2,3 oder durch Verkleben mit der insbesondere zylindrischen Hohlraumwandung erfolgen. Die Schichten weisen Porengröße im Bereich von 1 mm bis 10 μm auf, wobei die Porengröße der jeweiligen Schichten abgestuft ist.
BERICHTIGTESBUTT(REGEL91) ISA/EP Die Abstufung der Porengrδße der Schichten erfolgt dadurch, daß die erste Schicht 2, in Fließrichtung der Probe gesehen, eine bis zum 6-fachen der Porengröße der zweiten Schicht 3 aufweist, wobei deren Porengröße > 10 μm ist. In einer besonderen Anordnung ist die erfindungsgemäße Vorrichtung auf handelsübliche Zentrifugenröhrchen abgestimmt. Die Figur 3 zeigt eine solche Anordnung. Dabei ist ein im wesentlichen zylindrischer Hohlkörper mit an der Auslaßöffnung 15 trichterförmig verjüngend am oberen Ende des Zentrifugen- röhrchens so angeordnet, daß die Einlaßöffnung 10 der erfin¬ dungsgemäß zu verwendenden Vorrichtung ebenfalls an der Öff¬ nung des Zentrifugenröhrchens 20 angeordnet ist. Die An¬ ordnung kann mittels eines Deckels 25, der entweder an der erfindungsgemäßen Vorrichtung oder an dem Zentrifugenröhrchen selbst angeordnet ist, verschlossen werden. Im Innern der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind fünf Schichten 2,3,4,5,6 vorzugsweise so angeordnet, daß die Schicht mit der jeweils geringeren Porengröße direkt an diejenige mit der größeren Porengröße mit ihren Oberflächen aneinandergrenzt. Nach Passage des viskosen Systems durch die Einrichtung 1 sammelt sich am Boden des Zentrifugenröhrchens 20 die homogenisierte Lösung 30.
In der in Figur 3 gezeigten Anordnung weisen die porösen Schichten beginnend mit der Schicht 2 Porengrößen von ca. 200 μm, Schicht 3 ca. 75 μm, Schicht 4 ca. 35 μm, Schicht 5 ca. 20 μm und Schicht 6 ca. 10 μm auf. Es versteht sich, daß die Vorrichtung auch mit nur einer porösen Schicht, wie oben beschrieben, eingesetzt werden kann.
Es ist für den Fachmann selbstverständlich, daß eine ein¬ stückig ausgeformte Einrichtung, die nicht aus mehreren Lagen aufgebaut ist, als äquivalente Ausführungsform verstanden wird. Wichtig ist dann, daß die in einer einstückigen Version ausgeführte Einrichtung 1 einen Porengrößengradienten, der von einer Oberfläche der Schicht zu der gegenüberliegenden Schicht verläuft, aufweist. Die erfindungsgemäßen Verwendungen der beschriebenen Vorrich¬ tungen erlauben, daß in einfacher, kostengünstiger Weise vis¬ kose Systeme wie beispielsweise Zeil- und Gewebelysate homogenisiert werden und in Systeme geringerer Viskosität überführt werden können.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß hochmolekulare Nucleinsäuren aufgrund der Passage durch die in der erfin¬ dungsgemäß zu verwendenden Vorrichtung befindlichen Einrich¬ tung geschert wird, so daß sie für die nachfolgenden moleku¬ larbiologischen Prozessierungsschritte leichter und reprodu¬ zierbarer weiterverarbeitbar wird. Dies trifft insbesondere für die Aufarbeitung von genomischer DNA, mRNA und Gesamt- RNA/-DNA zu.
Weiterhin hat sich überraschenderweise gezeigt, daß hochmole¬ kulare Strukturen wie Polyacrylamidgele in einfacher Weise zerkleinert werden können, so daß z.B. Nucleinsäuren und/oder Proteine leicht aus einer Trennmatrix isoliert werden können.
In einer anderen Weiterbildung der erfindungsgemäßen Vor¬ richtung ist die Einrichtung 1 in einer Spritze (als zylindrischer Hohlkörper 5) angeordnet. Das zu homogeni¬ sierende viskose System wird dabei durch die Kanüle in die Spritze gezogen und passiert die in der Nähe der Verbindungs¬ stelle zwischen Kanüle und Spritze angeordnete Einrichtung 1. Ist die Probe in die Spritze gezogen, kann diese durch Herausdrücken erneut die Einrichtung 1 passieren. Gegebenen¬ falls kann dieser Vorgang mehrfach wiederholt werden, um eine hinreichende Homogenisierung, insbesondere hochviskoser Lösungen enthaltend hochmolekulare Nucleinsäuren, zu gewähr¬ leisten. Dabei kann die Schicht mit der größten Porengröße der Kanüle der Spritze zugewandt sein.
In vorteilhafter Weise können durch das erfindungsgemäße Ver¬ fahren und/oder die erfindungsgemäße Vorrichtung Nuclein¬ säuren, wie genomische DNA oder Gesamt-Nucleinsäuren aus den
BERICHTIGTES BLATT (REGEL 91) ISA/EP entsprechenden Matrices isoliert werden, die üblicherweise zur Trennung von Nucleinsäuren eingesetzt werden. Zu nennen sind hierbei insbesondere Polyacrylamidgele, die als Matrix für gelelektrophoretische Trennungen von DNA oder RNA einge¬ setzt werden. Nach der Elektrophorese werden lediglich die Banden, in welcher sich die Nucleinsäuren bestimmter Größe angereichert haben, beispielsweise durch Stanzen oder Schneiden von den übrigen Gelbestandteilen getrennt und dann durch die erfindungsgemäß zu verwendende Vorrichtung unter Anwendung des erfindungsgemäß beschriebenen Verfahrens passiert. Dabei hat sich überraschenderweise gezeigt, daß die in der homogenisierten Lösung vorhandenen Restbestände des Gels keine störenden Einflüsse auf die folgenden mole¬ kularbiologischen Prozessierungsschritte der Nucleinsäuren zeigt.
Die Erfindung beschreibt somit ein einfaches, sicheres und kostengünstiges Verfahren zur Zerkleinerung und Homogeni¬ sierung von viskosen Systemen, insbesondere Zeil- und Gewebe¬ lysaten oder hochmolekulare Nukleinsäuren enthaltenden Systemen.
Die vorliegende Erfindung wird anhand folgender Beispiele näher erläutert.
Beispiele
Zusammensetzung der in den Beispielen 1 - 3 benutzten Lösungen
OL: 4 M Guanidin-Isothiocyanat, 25 mM Na-Citrat pH 7.0, 20 mM EDTA pH 8.0 DB: 25 mM Na-Citrat pH 7.0, 0,20 EDTA pH 8.0, 0,75 %
Sarcosin OW: 150 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8.0, 10 mM Tris-HCl pH 7.5 TE: 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA pH 8.0 Beispiel 1
Homogenisierung von Zell-Lysaten und anschließende direkte Isolierung von poly A+ mRNA aus HeLa-Zellen.
HeLa-Zellen, die auf einer 10 cm Zellkulturschale bis zu kon- fluentem Wachstum (ca. I x 107 Zellen) herangezogen worden sind, wurden in 600 μm OL direkt auf der Zellkulturschale lysiert. Das Lysat wurde mit einem Zellschaber auf einer Seite der Schale gesammelt, und auf eine Vorrichtung gemäß der vorliegenden Patentanmeldung pipettiert. Im Inneren der Vorrichtung wurden zwei Schichten aus CELLPOR PE Filter¬ platten von 200 μm und 35 μm Porengröße so angeordnet, daß sich die Schicht mit der geringeren Porengröße in Richtung der Auslaßöffnung befand. Die Vorrichtung wurde in einem 2 ml Mikrozentrifugengefäß plaziert. Anschließend wurde das viskose Lysat durch die Vorrichtung 3 min bei voller Ge¬ schwindigkeit in einer herkömmlichen Tischzentrifuge (ca. 14.000 bis 18.000 g) zentrifugiert. Das so erhaltene nicht¬ viskose Lysat wurde mit 1.200 μm DB versetzt und 3 min zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Zentrifugen¬ röhrchen überführt, mit 35 μl einer Oligotex Suspension versetzt und für 10 min inkubiert. Anschließen wurden die mRNA: Oligotex Komplexe pelletiert, und zweimal in 600 μl OW durch Resuspendieren und Zentrifugieren gewaschen. Die mRNA wurde dann in Wasser von den Oligotex-Partikeln eluiert, und nach Zentrifugation und Pelletierung der Latexpartikel als gereinigte mRNA-Fraktion in ein neues Mikrozentrifugen¬ gefäß überführt.
Beispiel 2
Steigerung der Amplifikationseffizienz in der PCR-Reaktion durch Scherung der DNA
Genomische DNA mit einer durchschnittlichen Größe von 100 kb wurde aus HeLa-Zellen gemäß der Prozedur in "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel et al. , Wiley and Sons, Boston, Vol. 1, Seiten 2.2.1 bis 2.2.3) isoliert. In Parallelansätzen wurde die DNA in Tris-Puffer über eine Vorrichtung gemäß der vorliegenden Patentanmeldung mit jeweils einer Schicht aus CELLPOR PE Filterplatten von 200 μm, 50 μm, 35 μm und 5 μm Porengrδße 2 min zentrifugiert. Im PCR-Ansatz wurden anschließend jeweils 1 μg der unter¬ schiedlich gescherten DNA sowie nicht-gescherte DNA einge¬ setzt, um ein 140 bp Fragment des Globin-Gens zu amplifi- zieren. In der PCR-Reaktion wurden, bei gleicher Anzahl an Zyklen, mit gescherter DNA größere Ausbeute an Amplifikat erzielt als mit ungescherter DNA.
Beispiel 3
Isolierung von RNA aus einem Polyacrylamid-Gelstück nach Zer¬ kleinerung des Polyacrylamidgels
Auf einem denaturierenden 5 %igen Polyacrylamid-Harnstoffgel wurde in vitro transkribiert RNA aufgetragen, um das "full- length" Transkript von kürzeren Transkripten zu trennen. Nach Ethidiumbromid Färbung der RNA wurde die entsprechende, 360 Basen große Bande ausgeschnitten, und auf eine Vorrichtung gemäß der vorliegenden Patentanmeldung mit einer Schicht aus CELLPOR PE Filterplatten von 200 μm überführt. Dann wurden 500 μl TE-Puffer auf die Vorrichtung pipettiert. Anschließend wurde für 3 min bei voller Geschwindigkeit in einer herköm¬ mlichen Tischzentrifuge (ca. 14.000 bis 18.000 g) zentrifu¬ giert. Das so zerkleinerte Gelstückchen wurde erneut auf eine Vorrichtung mit einer Schicht aus einer CELLPOR PE Filter¬ platte mit 1 μm Porengröße überführt, um die kleinen Poly¬ acrylamid-Harnstoffgelstücke von der Flüssigkeit zu trennen. Die wäßrige Fraktion im Auffanggefäß wurde dann Phenol/ Chloroform extrahiert. Die obere, wäßrige Phase wurde ab- pipettiert, und die darin gelöste RNA mit LiCl (Endkonzen¬ tration 3 M) für 3 Stunden bei 20°C gefällt. Das RNA-Pellet wurde zweimal mit 70 % Alkohol gewaschen, abzentrifugiert und unter Vakuum getrocknet. Anschließend wurde die RNA in TE gelöst.
Beispiel 4
Isolierung von RNA aus Weichgewebe nach Homogenisierung des Gewebes über die erfindungsgemäße Vorrichtung.
Zusammensetzungen der in den Beispielen 4 und 5 benutzten Lösungen
Rl: 3,5 M Guanidin-Isothiocyanat, 25 mM Na-Citrat pH 7,0,
1% ß-Mercaptoethanol R2: 900 mM GTC, 25 mM Tris-HCl pH 7,5, 10% Ethanol TE: 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 80% Ethanol
20 mg Brustgewebe wurden auf eine erfindungsgemäße Vor¬ richtung gelegt und 350 μl Lysepuffer Rl dazu pipettiert. Im Inneren der Vorrichtung wurden 2 Schichten aus CELLPOR PE Filterplatten von 200 μm und 50 μm Porengröße so an¬ geordnet, daß sich die Schicht mit der geringeren Porengröße in Richtung der Auslaßöffnung befand. Die Vorrichtung wurde in einem 2 ml Mikrozentrifugengefäß plaziert. Anschließend wurde das viskose Lysat durch die Vorrichtung 3 min bei voller Geschwindigkeit in einer herkömmlichen Tischzentrifuge (ca. 14.000 bis 18.000 g) zentrifugiert. Das so erhaltene nicht-viskose Lysat wurde mit 350 μl 70% Ethanol versetzt und gemäß P 44 04 361 auf eine RNeasy Spin Säule, die in einem 2 ml Mikrozentrifugengefäß hängt, pipettiert. An¬ schließend erfolgt eine Zentrifugation bei 8.000 x g für 15 see in einer Standardtischzentrifuge. Die RNeasy Spin Säule wird in ein neues 2 ml Gefäß transferiert, und mit 700 μl Waschpuffer R2 gewaschen (15 see Zentrifugation bei 8.000 x g) . Daraufhin wird die Säule gleichermaßen zweimal mit 500 μl Waschpuffer TE gewaschen. Zur Elution der RNA wird die Säule in ein neues 1,5 ml Reaktionsgefäß gesetzt, 50 μl DEPC- behandeltes Wasser werden direkt auf die Membran der Spin- säule pipettiert, und die RNA anschließend durch 1 min Zentrifugation bei 8.000 x g aufgefangen.
Beispiel 5
Isolierung von RNA aus pflanzlichen Zellen und Geweben nach Zentrifugation über die erfindungsgemäße Vorrichtung.
100 mg Blattgewebe von Pelagonien wurden unter flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver verrieben. Anschließend wurde das Pulver in 450 μl Lysepuffer Rl lysiert und das so erhaltene Lysat auf die erfindungsgemäße Vorrichtung pi¬ pettiert. Im Inneren der Vorrichtung wurden 2 Schichten aus CELLPOR PE Filterplatten von 200 μm und 50 μm Porengröße so angeordnet, daß sich die Schicht mit der geringeren Poren¬ größe in Richtung der Auslaßöffnung befand. Die Vorrichtung wurde in einem 2 ml Mikrozentrifugengefäß plaziert. An¬ schließend wurde das viskose Lysat durch die Vorrichtung 3 min bei voller Geschwindigkeit in einer herkömmlichen Tisch¬ zentrifuge (ca. 14.000 bis 18.000 g) zentrifugiert. Das so erhaltene nicht-viskose Lysat wurde mit 225 μl 100% Ethanol versetzt und gemäß P 44 04 361 auf eine RNeasy Spin Säule, die in einem 2 ml Mikrozentrifugengefäß hängt, pipettiert. Anschließend erfolgt eine Zentrifugation bei 8.000 x g für 15 see in einer Standardtischzentrifuge. Die RNeasy Spin Säule wird in ein neues 2 ml Gefäß transferiert, und mit 700 μl Waschpuffer R2 gewaschen (15 see Zentrifugation bei 8000 x g) . Daraufhin wird die Säule gleichermaßen zweimal mit 500 μl Waschpuffer TE gewaschen. Zur Elution der RNA wird die Säule in ein neues 1,5 ml Reaktionsgefäß gesetzt, 50 μl DEPC- behandeltes Wasser werden direkt auf die Membran der Spin¬ säule pipetiert, und die RNA anschließend durch 1 min Zen¬ trifugation bei 8.000 x g aufgefangen.

Claims

A n s p r ü c h e
1. Verfahren zum Zerkleinern hochmolekularer Strukturen, ins¬ besondere hochmolekularer Nucleinsäurestrukturen in Proben, wobei die zu zerkleinernden hochmolekularen Strukturen eine Einrichtung passieren, die mit mindestens einer porösen Schicht versehen ist, deren Porengröße in Passierrichtung der zu zerkleinernden Strukturen, durch die poröse Schicht gesehen, abnimmt.
2 . Verfahren nach Anspruch 1, wobei die poröse Schicht aus mindestens zwei Schichten aufgebaut wird, deren mittlere Porengröße unterschiedlich ist, wobei die in Fließrichtung der Proben gesehene erste Schicht eine mittlere Porengröße bis zu dem 6-fachen der Porengröße der zweiten Schicht aufweisen kann und die zweite Schicht eine mittlere Poren¬ größe größer als 10 μm besitzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, wobei das zu zerklei¬ nernde System eine viskose Lösung ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die viskose Lösung ein Zell- und/oder Gewebelysat oder eine zur Trennung von Nucleinsäuren verwendete Matrix, wie Polyacrylamidgele ist.
5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Scherung von Nucleinsäuren wie genomischer DNA, zur Homo¬ genisierung genomischer DNA oder anderer hochmokulare Ver¬ bindungen enthaltender Lösungen.
6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das zu zerkleinernde System (Probe) auf der Einrichtung mit poröser Schicht angeordnet wird und auf der Probenseite mit mechanischer Einwirkung, wie Überdruck oder erhöhter Schwer¬ kraft und/oder auf der probenabgewandten Seite durch Unter¬ druck, die Schicht der Einrichtung passiert.
7. Vorrichtung mit einer Einlaß- (10) und Auslaßδffnung (15), mit mindestens einer im Lumen eines Hohlkörpers (5) angeord¬ neten Einrichtung aus einer Schicht (1) zur Zerkleinerung hochmolekularer Strukturen, wobei die mittlere Porengröße der Schicht (1) in Passierrichtung der zu zerkleinernden Strukturen, durch die poröse Schicht (1) gesehen, abnimmt.
8. Vorrichtung nach Anspruch 7, die mindestens zwei Schichten
(2, 3) mit in Richtung der Auslaßöffnung (15) abnehmender Porengröße der Schichten (2, 3) , zur Zerkleinerung hoch¬ molekularer Strukturen aufweist, wobei die erste Schicht (2) eine mittlere Porengröße von bis zum 6-fachen der Porengröße der zweiten Schicht (3) aufweist und die zweite Schicht (3) eine Porengröße > 10 μm besitzt.
9. Vorrichtung nach Anspruch 7 und/oder 8, die in einem Zen- trifugationsröhrchen (20) angeordnet ist.
10. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei die poröse(n) Schicht(en) aus anorganischen oder polymeren organischen Materialien besteht.
11. Vorrichtung nach Anspruch 10, wobei die poröse(n) Schicht(en) aus Glas- und/oder Metallfritten, zum Aufbau von Membranfil¬ tern geeigneten Materialien, wie Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol, Polytetrafluoroethylen, und/oder Filter aus Metall, Keramik jeweils in Form von Schüttungen oder als gesinterte Strukturen.
12. Verwendung der Vorrichtung nach mindestens einem der An¬ sprüche 7 bis 11 zur Zerkleinerung (Scherung) von genomischer DNA, Homogenisierung von genomischer DNA und/oder Zer¬ kleinerung von Polyacrylamidgelen.
13. Verwendung der Vorrichtung nach mindestens einem der An¬ sprüche 7 bis 11, zur Homogenisierung eines viskosen Systems wie Zeil- oder Gewebelysaten.
&RICHT1GTES BUTT (REGEL 91)
14. Verwendung der Vorrichtung nach mindestens einem der An¬ sprüche 7 bis 11 zur Probenvorbereitung für die Isolierung von mRNA und Gesamt-RNA.
15. Verwendung der Vorrichtung nach mindestens einem der An¬ sprüche 7 bis 11, und 13 zur Probenvorbereitung für die Isolierung von mRNA und Gesamt-RNA und DNA aus pflanzlichen Zeil- und Gewebelysaten.
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