WO1995029184A1 - Polycationic nucleic bases and oligonucleotides containing same - Google Patents

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WO1995029184A1
WO1995029184A1 PCT/FR1995/000542 FR9500542W WO9529184A1 WO 1995029184 A1 WO1995029184 A1 WO 1995029184A1 FR 9500542 W FR9500542 W FR 9500542W WO 9529184 A1 WO9529184 A1 WO 9529184A1
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PCT/FR1995/000542
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Jean-Paul Behr
Nathalie Schmid
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Universite Louis Pasteur
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals

Definitions

  • TATA initiation protein
  • the proteins involved in these phenomena recognize a succession of nucleic bases, essentially by establishing intermolecular hydrogen bonds with them in the great groove of the double helix (Harrison, SC, Nature, 1991, 353, 715-719).
  • Biotechnology could also take advantage of molecules capable of "reading" a sequence, for example in the context of diagnostic tests or for the sequencing of large genomes, etc. More particularly, such molecules could find their use as research tool in molecular biology, in particular for the search for the presence of a gene on the genome, the practice of reverse genetics, the study of the beginning of transcription sites, the study of expression, in particular of proteins on DNA or reporter gene, site-directed mutagenesis, studies on transgenic animals, as well as in human and veterinary medicine, for diagnosis on normal or pathological DNA or for the use of DNA as a drug for gene therapy .
  • the binding of a molecule to the double helix and the recognition of a succession of nucleic bases can be done by the formation of hydrogen bridges with the sites that remain vacant in the small or large groove, by intercalation between the base pair plates or by local opening of the propeller and Crick and Watson type connections.
  • Pyrrolic oligopeptides such as netopsin and distamycin, which establish hydrogen bridges with the O2CO and N3 (A) atoms, thus leading to affinities of 106 to 108 ml depending on the particular AT sequence, are among the most selective compounds .
  • Pyrrolic polypeptides which recognize up to 16 consecutive AT base pairs have been synthesized by homologation, (Youngquist, RS; Dervan, PB, J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 7564-7566; Griffin, JH Dervan , PB, J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 6840-6842).
  • microgonotropens He, G.X. ; Browne, K.A.; Groppe, J.C.; Blasko, A.; Mei,
  • Hélène Moser, HE; Dervan, PB, Science 1987, 238, 645-650; Le Doan, T.; Perrouault, L .; Praseuth, D.; Habhoub, N.; Decout, J.; Thuong, NT; L Subscribe, J.; Hélène, C, Nucleic Acids Res. 1987, 19, 7749- 7760), based on the triple helix structure (Felsenfeld, G.; Davies, D.; Rich, A., /. Am. Chem. Soc. 1957, 79, 2023; Arnott, S.; Bond, PJ; Selsing, E.; Smith, PJC, Nucleic Acids Res. 1976, 3, 2459-2470).
  • a synthetic homopyrimide oligonucleotide is housed in the large - 3 - groove of the DNA double helix, and recognizes respectively adenine and guanine of a homopuric sequence thanks to the formation of triplets of isomorphic bases T-AT and CH + GC.
  • G GC Beal, PA; Dervan, PB, Science 1991, 257, 1360-1363
  • isoC GC Ono, A.; T ' n / a, PO; Kan, LS, J. Am. Chem. Soc. 1991, 773, 4032-4033
  • this mode of sequence targeting requires a prior conformational change of the target sequence, the DNA passing from the natural conformation B to an A conformation having a large deeper groove.
  • This process is very slow (Maher III, LJ; Dervan, PB; Wold, BJ, Biochem. 1990, 29, 8820-8826; Rougée, M.; Faucon, B.; Mergny, JL; Barcelo, F.; Giovannangeli, C.; Garestier, T.; Hélène, C, Biochem. 1992, 37, 9269-9278), and therefore the application of this technique in a biological context where the oligonucleotide must seek its target in thousands of megabases DNA seems difficult to envisage in the future.
  • this targeting mode is slow and requires the prior opening of the target duplex (Egholm, M.; Buchurdt, O .; Cluistcnsen, L.; Behrens, C.; Frcicr, SM; Driver, DA; Beig, RH; Kim, SK; Norden, B.; Nielsen, PE, Nature 1993, 365, 566-568).
  • the present invention provides a new approach to the recognition of a target DNA sequence which does not have the drawbacks mentioned above.
  • This invention is based on the structure of the complexes formed by linear polyamines with nucleic acids (Garcia, A; Giege, R.; Behr, JP, Nucleic Acids Res. 1990, 18, 89-95; Schmid, N.; Behr, JP, Biochem. 1991, 30, 4357-4361).
  • Natural polyamines such as spermine and spermidine bind strongly to DNA (1 () 4 - 108 Ml depending on the medium, Braunlin, WH; Strick, TJ; Record, MTJr., Biopolymers 1982, 27, 1301 -1314) .
  • spermine binds to the bottom of the small groove by the formation of multiple hydrogen bonds between its ammonium NH2 + groups and the 02 and N3 atoms of pyrimidines and purines. These interm ⁇ lecular bonds bridge the two strands of DNA, according to the schematic representation below, in which the view is in the plane of the nucleic bases pointing their atoms 02 and N3 (-O-) towards the NH2 + groups ( ⁇ ) of p ⁇ lyamine.
  • the covalent bond of the polyamine to the nucleic base of the oligonucleotide must lead to its placement in the small groove of the duplex. Examination of such structures shows, for example, that the position of the C2 carbon of the purines is ideal for grafting the polyamine.
  • the subject of the present invention is polycationic nucleic bases and the oligonucleotides containing them, in particular purines substituted at C2 > characterized in that they have the following structure:
  • Y can be a polyamine of general formula -NH - ((CH2) n-NH) m -H where n is between 2 and 6 inclusive, m is between 1 and 10 inclusive and n can vary between the different groups between two nitrogen atoms.
  • the polyamine is preferably spermine or spermidine or their derivatives capable of binding to DNA.
  • R is a bifunctional residue on the basis of which oligomers capable of binding DNA or TARN can be constructed.
  • This bifunctional residue can advantageously be ribose, 2'-deoxyribose and their derivatives, for example carbocyclic, halogen, amine or azide, the oligomerization being obtained via a natural phosphoric acid group or using groups promoting intracellular penetration or protecting the molecule against nucleases, such as alkylphosphates, phosphonates, phosphorothioates, methylphosphonates, carbonates and carbamates.
  • R can also be an amino acid such as those described by Nielsen et al. (Nielsen, P.E.; Egholm, M.; Berg, R.H.; Buchardt, O., Science 1991, 254, 1497-1500).
  • the subject of the invention is also a process for the preparation of bases as defined by the general formula above, characterized in that, for the synthesis of the precursor of C2-spermine-guanosine, it presents the succession of the following stages:
  • Step 15 obtaining: (2-N, 3'-0,5'-0-triacetyl) -2'-deoxyguanosine
  • Step 16 obtaining: 2-N, 3'-0,5'-0-t ⁇ _acétyl-6-0-p-nitrophényléthyl-2'-skyox
  • the triacetylated deoxyguanosine (0.7 g, 1.78 mmol) is dissolved in 40 ml of anhydrous dioxane. Then are successively added: 0.7 g of triphenylphosphine (2.67 mmol), 0.41 ml of diethylazodicarboxylate (2.67 mmol) and 0.44 mg of p-nitrophenylethanol (2.67 mmol). The mixture is left at room temperature with stirring for 24 h, then the solvent is evaporated. The residue is taken up in 50 ml of CH2Cl2 and the organic phase is washed with water (2 x 30 ml) and then dried over magnesium sulfate.
  • Step 17 obtaining: 6-0-p-nitrophenylethyl-2'-deoxyguanosine
  • step 16 The compound obtained according to step 16 (1.2 g, 2.21 mmol) is dissolved in a mixture of 25 ml of methanol and 20 ml of ammonia in 32% solution. Deprotection is monitored by CCM. The deprotection of the O-acetyl groups is very rapid, that is to say less than 2 hours, while that of the N-acetyl is carried out in several days. The solution is then subjected to evaporation under reduced pressure. The residue obtained is taken up in 100 ml of ethyl acetate and the organic phase is washed with 150 ml of water and then dried over magnesium sulfate.
  • Step 19 obtaining: 6-0-p-nitrophenylethyl-2-fluoro-5'-monomethoxytrityl-2'- deoxyinosine
  • NPE p-nitrophenylethyl oligonucleotide
  • Step 20 phosphoslation of the nucleoside:
  • CD3CN 31n NMR nuclear magnetic resonance spectrum
  • Step 21 synthesis of the oligonucleotide ATTG * AATG * TTT: The synthesis of the oligonucleotide, containing two C2-s ⁇ ermine guanosines, was carried out on a Biosearch 8600 automatic synthesizer. The standard coupling program for a synthesis of l ⁇ mol a been used (with an excess of 20 equivalents of the modified base phosphoroamidite). Only the subroutine for deprotection of the trityl group has been modified: the reaction time has been increased from 8 to 20 s and an additional cycle has been added. The last trityl group was kept to facilitate the purification of the oligonucleotide by HPLC on a column of reverse Cl 8 silica.
  • the resin (15 mg) containing the oligonucleotide is placed in 300 ⁇ 1 of a solution of spermine (1 M) in methanol for 3 days at 55 ° C.
  • the oligonucleotide is then purified by HPLC on a Millipore Nova Pak column with an increasing gradient of acetonitrile (from 5% to 40% in 40 minutes) in 100 mM triethylammonium acetate buffer pH 6.5. The retention time is 27 minutes.
  • the purified oligonucleotide is placed in 500 ⁇ 1 of 0.5 M DBU in pyridine for 24 hours at 55 ° C.
  • a chloroform / water extraction makes it possible to recover the oligonucleotide in the aqueous phase which is evaporated and then taken up in 80% acetic acid to deprotect the 5'-trityl group.
  • the completely deprotected modified oligonucleotide is again purified by HPLC (same column and gradient as above, retention time of 13 minutes).
  • the structure of the oligonucleotide is confirmed by mass spectroscopy in negative electrospray which gives a mass of 3727 ⁇ 3.
  • the oligonucleotide containing two spermines forms a more stable duplex with its complementary sequence than does the natural oligonucleotide.
  • the measurements were made in a 10 mM MES buffer at different saline concentrations, as shown in Table 1 below. The differences in stability are greater at low salt concentration and become smaller as the salt concentration is increased. Under ionic strength conditions corresponding to a physiological medium, the difference between the melting temperatures is still 15 ° C. in favor of the modified duplex. A change in pH from 6 to 7 made no difference.
  • the unmodified duplex is gradually stabilized, but it remains significantly less stable than the modified duplex having two covalently linked spermines.
  • no stabilization is observed by adding spermine.
  • Table 1 Melting temperature (in ° C) of duplexes (2 ⁇ M) in a 10 mM MES buffer, pH6
  • Table 2 Melting temperatures (in ° C) of duplexes (2 ⁇ M) in a 10 mM MES buffer, pH 6.8spermine 4 ⁇ M 20 ⁇ M 0.2 mM ImM (2 eq) (10 eq) (100 eq) (500 eq) normal duplex ATTGAATGTTT 32.5 33 35.2 36.6 TAACTTACAAA duplex with modified oligo ⁇ nucleotide ATTG * AATG * TTT 47.3 47.2 47.4 47.5 TAAC TTACAAA
  • the new nucleic bases are used for the recognition of a DNA target sequence by synthesis of an oligomer of sequence complementary to that of one of the two strands of the sequence concerned.
  • the oligomer will comprise, at one or more places in its sequence, a base modified in accordance with the invention. Thanks to the presence of these groups having a strong affinity for the small groove of DNA, the oligomer will instantly associate with DNA, in a non-selective or non-selective sequence, and travel along the acid. nucleic acid. This process promotes the search for the target and can be advantageously compared to the techniques described in the prior art. Consequently, the association is rapid and does not require prior denaturing of the targeted duplex.
  • the new nucleic bases are used for sequence recognition by the formation of triple helices according to the so-called "antigen" technique (NT Thuong and C. Hélène, Angew. Chem. Int. Ed. 1993 , 32, 666-690).
  • NT Thuong and C. Hélène Angew. Chem. Int. Ed. 1993 , 32, 666-690.
  • the presence in particular of a polycationic group can strongly stabilize the binding of these molecules to DNA in the large groove in form A (Garcia, A .; Giege, R.; Behr, JP, Nucleic Acids Res. 1990, 75, 89-95; Schmid, N.; Behr, JP, Biochem 1991, 30, 4357-4361).
  • the new nucleic bases can also be used for the recognition of messenger RNA sequences by the so-called "antisense” technique.
  • This technique is described by C. Hélène and J.J. Toulmé, in Biochim. Biophys. Acta 1990, 1049, 99-125.
  • the present invention is in no way limited to the indications and the applications described. Other indications and applications are possible, as well as modifications to the indications and applications described, without departing from the scope of protection of the invention.

Abstract

Polycationic nucleic bases and oligonucleotides containing same, particularly C2 substituted purines, characterised in that they have the structure (a), wherein X is OH or NH2 (guanine or diaminopurine series), Z is N or CH (purines or deazapurines), and Y is a molecular grouping having affinity for the minor groove of DNA, e.g. distamycin or netropsin derivatives, berenil, Hoechst dye 33258, or a cationic polypeptide such as polylysine, polyarginine, polyornithine, or a polymer such as polyethylene or polypropylene imine.

Description

Bases nucléiques polycationiques et oligonucleotides les contenant Polycationic nucleic bases and oligonucleotides containing them
La présente invention, réalisée au Laboratoire de Chimie Génétique de l'Université Louis Pasteur associé au CNRS (Unité de Recherche AssociéeThe present invention, carried out at the Laboratory of Genetic Chemistry of the Louis Pasteur University associated with the CNRS (Associated Research Unit
U.R.A. D1386 - Faculté de Pharmacie de Strasbourg), concerne des bases nucléiques poly-cationiques, les oligonucleotides les contenant, en particulier les purines substituées en C2, leur procédé de préparation et leur utilisation.U.R.A. D1386 - Faculty of Pharmacy of Strasbourg), relates to poly-cationic nucleic bases, the oligonucleotides containing them, in particular the C2-substituted purines, their process of preparation and their use.
La reconnaissance sélective de séquences d'ADN bicaténaire par des protéines permet la transcription et la transmission de l'information génétique dans tous les systèmes vivants. A l'exception d'une protéine d'initiation dénommée TATA (Kim, J.L. ; Nikolov, D.B. ; Burley, S.K., Nature 1993, 365, 520-527), les protéines impliquées dans ces phénomènes reconnaissent une succession de bases nucléiques, essentiellement en établissant avec elles des liaisons hydrogène intermoléculaires dans le grand sillon de la double hélice (Harrison, S.C., Nature, 1991, 353, 715-719).The selective recognition of double-stranded DNA sequences by proteins allows the transcription and transmission of genetic information in all living systems. With the exception of an initiation protein called TATA (Kim, JL; Nikolov, DB; Burley, SK, Nature 1993, 365, 520-527), the proteins involved in these phenomena recognize a succession of nucleic bases, essentially by establishing intermolecular hydrogen bonds with them in the great groove of the double helix (Harrison, SC, Nature, 1991, 353, 715-719).
Par interférence spécifique avec des processus d'expression ou de réplication de gènes cellulaires ou d'organismes pathogènes, la reconnaissance de séquences d'ADN par des molécules exogènes peut conduire à de nombreuses applications thérapeutiques. Les biotechnologies pourraient également mettre à profit des molécules capables de "lire" une séquence, par exemple dans le cadre de tests diagnostiques ou pour le séquençage de grands génomes, etc.. Plus particulièrement, de telles molécules pourraient trouver leur utilisation en tant qu'outil de recherche en biologie moléculaire, notamment pour la recherche de la présence d'un gène sur le génome, la pratique de la génétique inverse, l'étude du début des sites de transcription, l'étude d'expression, en particulier de protéines sur ADN ou gène reporter, la mutagénèse dirigée, les études sur les animaux transgéniques, ainsi qu'en médecine humaine et vétérinaire, pour le diagnostic sur des ADN normaux ou pathologiques ou pour l'utilisation de l'ADN comme médicament pour la thérapie génique.By specific interference with expression or replication processes of cellular genes or pathogenic organisms, the recognition of DNA sequences by exogenous molecules can lead to numerous therapeutic applications. Biotechnology could also take advantage of molecules capable of "reading" a sequence, for example in the context of diagnostic tests or for the sequencing of large genomes, etc. More particularly, such molecules could find their use as research tool in molecular biology, in particular for the search for the presence of a gene on the genome, the practice of reverse genetics, the study of the beginning of transcription sites, the study of expression, in particular of proteins on DNA or reporter gene, site-directed mutagenesis, studies on transgenic animals, as well as in human and veterinary medicine, for diagnosis on normal or pathological DNA or for the use of DNA as a drug for gene therapy .
D'un point de vue topographique, la liaison d'une molécule à la double hélice et la reconnaissance d'une succession de bases nucléiques peut se faire par formation de ponts hydrogène avec les sites restés vacants dans le petit ou le grand sillon, par intercalation entre les plateaux de paires de bases ou par ouverture locale de l'hélice et liaisons de type Crick et Watson.From a topographic point of view, the binding of a molecule to the double helix and the recognition of a succession of nucleic bases can be done by the formation of hydrogen bridges with the sites that remain vacant in the small or large groove, by intercalation between the base pair plates or by local opening of the propeller and Crick and Watson type connections.
Partant de travaux assez anciens sur l'intercalation de composés polycycliques plans présentant une sélectivité diffuse pour les paires de bases GC, d'importants efforts ont été portés depuis une quinzaine d'années sur des molécules se logeant dans le petit sillon de la double hélice (revue, Zimmer, C. ; Wâhnert, U., Prog. Biophys. Mol. Biol. 1986, 47, 31-112). Ces composés ont une préférence marquée pour les régions riches en paires de bases AT pour lesquelles le petit sillon est particulièrement étroit, ce qui permet l'établissement de nombreux contacts de Van der Waals entre le substrat et les parois du sillon. Les oligopeptides pyrroliques telles que la nétropsine et la distamycine, qui établissent des ponts hydrogène avec les atomes O2CO et N3(A), conduisant ainsi à des affinités de 106 à 108 M-l selon la séquence AT particulière, se trouvent parmi les composés les plus sélectifs. Des polypeptides pyrroliques, qui reconnaissent jusqu'à 16 paires de bases AT consécutives ont été synthétisés par homologation, (Youngquist, R.S. ; Dervan, P.B., J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 7564-7566 ; Griffin, J. H. Dervan, P.B., J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 6840-6842).Building on fairly old work on the intercalation of plane polycyclic compounds with diffuse selectivity for GC base pairs, significant efforts have been made over the past fifteen years on molecules housed in the small groove of the double helix (journal, Zimmer, C.; Wâhnert, U., Prog. Biophys. Mol. Biol. 1986, 47, 31-112). These compounds have a marked preference for regions rich in AT base pairs for which the small groove is particularly narrow, which allows the establishment of numerous Van der Waals contacts between the substrate and the walls of the groove. Pyrrolic oligopeptides such as netopsin and distamycin, which establish hydrogen bridges with the O2CO and N3 (A) atoms, thus leading to affinities of 106 to 108 ml depending on the particular AT sequence, are among the most selective compounds . Pyrrolic polypeptides, which recognize up to 16 consecutive AT base pairs have been synthesized by homologation, (Youngquist, RS; Dervan, PB, J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 7564-7566; Griffin, JH Dervan , PB, J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 6840-6842).
Récemment des dérivés hémisynthétiques, où certains noyaux pyrroles ont été remplacés par d'autres hétérocycles comme l'imidazole, ont permis de s'affranchir de la monotonie AT et d'introduire le motif GC dans la palette des séquences-cibles ("lexitropsines", Kissinger, K. ; Krowicki, K. ; Dabrowiak, J. C. ; Lown, J. W., Biochemistry 1987, 26, 5590-5595 ; Mrksich, M. ; Wade, W.S. ; Dwyer, T. J. ; Geierstanger, B.H. ; Wemmer, D.E. ; Dervan P.B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 7586-7590 ; Geierstanger, B.H. ; Dwyer, T.J. ; Bathini, Y. ; Lown, J.W. ; Wemmer, D.E., J. Am. Chem. Soc. 1993, 775, 4474-4482 ;Recently, hemisynthetic derivatives, where certain pyrrole nuclei have been replaced by other heterocycles such as imidazole, have made it possible to get rid of AT monotony and to introduce the GC motif into the palette of target sequences ("lexitropsines" , Kissinger, K.; Krowicki, K.; Dabrowiak, JC; Lown, JW, Biochemistry 1987, 26, 5590-5595; Mrksich, M.; Wade, WS; Dwyer, TJ; Geierstanger, BH; Wemmer, DE; Dervan PB, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 7586-7590; Geierstanger, BH; Dwyer, TJ; Bathini, Y.; Lown, JW; Wemmer, DE, J. Am. Chem. Soc. 1993, 775, 4474-4482;
"microgonotropens" He, G.X. ; Browne, K.A. ; Groppe, J.C. ; Blasko, A. ; Mei,"microgonotropens" He, G.X. ; Browne, K.A.; Groppe, J.C.; Blasko, A.; Mei,
H. Y. ; Bruice, T.C. /. Am Chem. Soc. 1993, 775, 7061-7071 et références citées).H. Y.; Bruice, T.C. /. Am Chem. Soc. 1993, 775, 7061-7071 and references cited).
Cependant, dès 1976, A. Rich (Seeman, N.C. ; Rosenberg, J.M. ;However, as early as 1976, A. Rich (Seeman, N.C.; Rosenberg, J.M.;
Rich, A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1976, 73, 804-808) avait dit que les quatre bases nucléiques ne pouvaient être distinguées que dans le grand sillon où elles établissent un faisceau de liaisons hydrogène différant l'une de l'autre. Par contre, dans le petit sillon, seule la guanine peut donner une liaison hydrogène, les trois autres bases présentant un site accepteur qui ne permet par leur distinction pour une molécule externe. En 1987, a été décrit simultanément par P. Dervan et C. Hélène un mode de reconnaissance de l'ADN (Moser, H.E. ; Dervan, P.B., Science 1987, 238, 645-650 ; Le Doan, T. ; Perrouault, L. ; Praseuth, D. ; Habhoub, N. ; Decout, J. ; Thuong, N.T. ; Lhomme, J. ; Hélène, C, Nucleic Acids Res. 1987, 19, 7749- 7760), basé sur la structure de triple hélice (Felsenfeld, G. ; Davies, D. ; Rich, A., /. Am. Chem. Soc. 1957, 79, 2023 ; Arnott, S. ; Bond, P.J. ; Selsing, E. ; Smith, P.J.C., Nucleic Acids Res. 1976, 3, 2459-2470). Dans ce mode de reconnaissance, un oligonucléotide homopyrimidique de synthèse vient se loger dans le grand - 3 - sillon de la double hélice d'ADN, et reconnaît respectivement l'adénine et la guanine d'une séquence homopurique grâce à la formation de triplets de bases isomorphes T-AT et CH+ GC. Diverses améliorations récentes sur la nature de la base reconnaissant la guanine ont été décrites, à savoir : G GC (Beal, P.A. ; Dervan, P.B., Science 1991, 257, 1360-1363), isoC GC (Ono, A. ; T'so, P.O. ; Kan, L.S., J. Am. Chem. Soc. 1991, 773, 4032-4033),Rich, A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1976, 73, 804-808) had said that the four nucleic bases could only be distinguished in the large groove where they established a beam of hydrogen bonds differing from each other. On the other hand, in the small groove, only guanine can give a hydrogen bond, the other three bases having an acceptor site which does not allow their distinction for an external molecule. In 1987, a mode of DNA recognition was described simultaneously by P. Dervan and C. Hélène (Moser, HE; Dervan, PB, Science 1987, 238, 645-650; Le Doan, T.; Perrouault, L .; Praseuth, D.; Habhoub, N.; Decout, J.; Thuong, NT; Lhomme, J.; Hélène, C, Nucleic Acids Res. 1987, 19, 7749- 7760), based on the triple helix structure (Felsenfeld, G.; Davies, D.; Rich, A., /. Am. Chem. Soc. 1957, 79, 2023; Arnott, S.; Bond, PJ; Selsing, E.; Smith, PJC, Nucleic Acids Res. 1976, 3, 2459-2470). In this recognition mode, a synthetic homopyrimide oligonucleotide is housed in the large - 3 - groove of the DNA double helix, and recognizes respectively adenine and guanine of a homopuric sequence thanks to the formation of triplets of isomorphic bases T-AT and CH + GC. Various recent improvements on the nature of the base recognizing guanine have been described, namely: G GC (Beal, PA; Dervan, PB, Science 1991, 257, 1360-1363), isoC GC (Ono, A.; T ' n / a, PO; Kan, LS, J. Am. Chem. Soc. 1991, 773, 4032-4033),
8-oxoadenine-GC (Young, S.L. ; Krawczyk, S.H. ; Matteuci, M.D. ; Toole, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, 88, 10023-10027 ; J.J. Jetter, M.C. ; Hobbs, F.W., Biochem. 1993, 32, 3249-3254), ou d'autres composés (Koh, J.S. ; Dervan, P.B., J. Am. Chem. Soc. 1992, 774, 1470-1478).8-oxoadenine-GC (Young, SL; Krawczyk, SH; Matteuci, MD; Toole, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, 88, 10023-10027; JJ Jetter, MC; Hobbs, FW, Biochem. 1993, 32, 3249-3254), or other compounds (Koh, JS; Dervan, PB, J. Am. Chem. Soc. 1992, 774, 1470-1478).
Ces triplets de bases permettent de s'affranchir des contraintes de pH liées à la protonation de la cytosine dans le triplet CH+ GC. Néanmoins, les triples hélices décrites à ce jour ne permettent de reconnaître que les purines, et le problème reste quasiment entier quant au développement de motifs structuraux reconnaissant les pyrimidines (Griffin, L.C. ; Kiessling, L.L. ; Beal, P.A. ; Gillespie, P. ; Dervan, P.B., J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 7976-7982 ; Huang, C.Y. ; Miller, P.S., J. Am. Chem. Soc. 1993, 775, 10456-10457). En outre, ce mode de ciblage de séquence requiert un changement conformationnel préalable de la séquence-cible, l'ADN passant de la conformation naturelle B à une conformation A possédant un grand sillon plus profond. Ce processus est très lent (Maher III, L.J.; Dervan, P.B. ; Wold, B.J., Biochem. 1990, 29, 8820-8826 ; Rougée, M. ; Faucon, B. ; Mergny, J.L. ; Barcelo, F. ; Giovannangeli, C. ; Garestier, T. ; Hélène, C, Biochem. 1992, 37, 9269-9278), et de ce fait l'application de cette technique dans un contexte biologique où l'oligonucléotide doit chercher sa cible dans des milliers de mégabases d'ADN semble difficilement envisageable à l'avenir.These base triplets make it possible to overcome the pH constraints linked to the protonation of the cytosine in the CH + GC triplet. Nevertheless, the triple helices described to date only allow the recognition of purines, and the problem remains almost entirely as for the development of structural patterns recognizing pyrimidines (Griffin, LC; Kiessling, LL; Beal, PA; Gillespie, P.; Dervan, PB, J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 7976-7982; Huang, CY; Miller, PS, J. Am. Chem. Soc. 1993, 775, 10456-10457). In addition, this mode of sequence targeting requires a prior conformational change of the target sequence, the DNA passing from the natural conformation B to an A conformation having a large deeper groove. This process is very slow (Maher III, LJ; Dervan, PB; Wold, BJ, Biochem. 1990, 29, 8820-8826; Rougée, M.; Faucon, B.; Mergny, JL; Barcelo, F.; Giovannangeli, C.; Garestier, T.; Hélène, C, Biochem. 1992, 37, 9269-9278), and therefore the application of this technique in a biological context where the oligonucleotide must seek its target in thousands of megabases DNA seems difficult to envisage in the future.
Il a également été proposé de synthétiser des acides nucléiques peptidiques où le squelette naturel ribose-phosphate est remplacé par un polyamide non chargé (Nielsen, P.E. ; Egholm, M. ; Berg, R.H. ; Buchardt, O., Science 1991, 254, 1497-1500). Ces composés forment également des hélices triples et sont capables, dans certaines conditions, de remplacer un des brins de l'ADN par hybridation avec le brin complémentaire. Contrairement aux hélices triples, ce dernier mode de ciblage est basé sur les sites de liaisons hydrogène Crick et Watson et s'applique donc à toutes les séquences. Par contre, ce mode de ciblage est lent et nécessite l'ouverture préalable du duplex-cible (Egholm, M. ; Buchurdt, O. ; Cluistcnsen, L. ; Behrens, C. ; Frcicr, S. M. ; Driver, D.A. ; Beig, R.H. ; Kim, S.K. ; Norden, B. ; Nielsen, P.E., Nature 1993, 365, 566-568).It has also been proposed to synthesize peptide nucleic acids where the natural ribose-phosphate backbone is replaced by an uncharged polyamide (Nielsen, PE; Egholm, M.; Berg, RH; Buchardt, O., Science 1991, 254, 1497 -1500). These compounds also form triple helices and are capable, under certain conditions, of replacing one of the strands of DNA by hybridization with the complementary strand. Unlike triple helices, this latter targeting mode is based on the Crick and Watson hydrogen bond sites and therefore applies to all sequences. On the other hand, this targeting mode is slow and requires the prior opening of the target duplex (Egholm, M.; Buchurdt, O .; Cluistcnsen, L.; Behrens, C.; Frcicr, SM; Driver, DA; Beig, RH; Kim, SK; Norden, B.; Nielsen, PE, Nature 1993, 365, 566-568).
On connaît également, des techniques plus anciennes de remplacement de brin, qui requièrent aussi la dénaturation préalable de l'ADN. Ces techniques mettent en oeuvre, en dehors du traitement thermique par chauffage, la dénaturation alcaline (Corey, D.R. ; Pei, D. ; Schultz, P.G., J. Am. Chem. Soc. 1989, 777, 8523-8525) ou chaotrope (Chen, C.B. ; Gorin, M.B. ; Sigman, D.S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, 4206-4210), ou encore la formation de brins triples à l'aide de la protéine RecA (Ferrin, L. ; Camerini-Otero, R. Science 1991, 254, 1494-1497) ont été décrits.There are also known, older strand replacement techniques, which also require prior denaturation of DNA. These techniques use, apart from heat treatment by heating, alkaline denaturation (Corey, DR; Pei, D.; Schultz, PG, J. Am. Chem. Soc. 1989, 777, 8523-8525) or chaotrope ( Chen, CB; Gorin, MB; Sigman, DS, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, 4206-4210), or the formation of triple strands using the RecA protein (Ferrin, L. ; Camerini-Otero, R. Science 1991, 254, 1494-1497) have been described.
La présente invention propose une nouvelle approche de la reconnaissance d'une séquence cible d'ADN qui ne présente pas les inconvénients mentionnés ci-dessus. Cette invention repose sur la structure des complexes formés par les polyamines linéaires avec les acides nucléiques (Garcia, A ; Giege, R. ; Behr, J.P., Nucleic Acids Res. 1990, 18, 89-95 ; Schmid, N. ; Behr, J.P., Biochem. 1991, 30, 4357-4361). Les polyamines naturelles comme la spermine et la spermidine se lient fortement à l'ADN (1()4 - 108 M-l selon le milieu, Braunlin, W.H. ; Strick, T.J. ; Record, M.T.Jr., Biopolymers 1982, 27, 1301 -1314). Il a été démontré que la spermine se fixait au fond du petit sillon par formation de multiples liaisons hydrogène entre ses groupements ammonium NH2+ et les atomes 02 et N3 des pyrimidines et des purines. Ces liaisons intermυléculaires pontent les deux brins de l'ADN, selon la représentation schématique ci-après, dans laquelle la vue est dans le plan des bases nucléiques pointant leurs atomes 02 et N3 (-O-) en direction des groupements NH2+ (θ) de la pυlyamine.The present invention provides a new approach to the recognition of a target DNA sequence which does not have the drawbacks mentioned above. This invention is based on the structure of the complexes formed by linear polyamines with nucleic acids (Garcia, A; Giege, R.; Behr, JP, Nucleic Acids Res. 1990, 18, 89-95; Schmid, N.; Behr, JP, Biochem. 1991, 30, 4357-4361). Natural polyamines such as spermine and spermidine bind strongly to DNA (1 () 4 - 108 Ml depending on the medium, Braunlin, WH; Strick, TJ; Record, MTJr., Biopolymers 1982, 27, 1301 -1314) . It has been shown that spermine binds to the bottom of the small groove by the formation of multiple hydrogen bonds between its ammonium NH2 + groups and the 02 and N3 atoms of pyrimidines and purines. These intermυlecular bonds bridge the two strands of DNA, according to the schematic representation below, in which the view is in the plane of the nucleic bases pointing their atoms 02 and N3 (-O-) towards the NH2 + groups (θ ) of pυlyamine.
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Représentation schématique de la spermine liée au petit sillon de l'ADN-B Par conséquent, une synthèse d'un oligonucléotide complémentaire d'une séquence-cible, sur lequel sont greffés des polyamines en due place, c'est-à- dire permettant l'établissement de ce faisceau de liaisons non covalentes, entraîne que l'appariement de cette molécule devra être bien plus fort que celui du duplex naturel. 11 s'ensuit, comme il ressort de la représentation schématique ci-après, que la molécule de synthèse -en noir- va donc envahir la double hélice au niveau de sa cible et former une hernie à cet endroit :Schematic representation of spermine linked to the small groove of DNA-B Consequently, a synthesis of an oligonucleotide complementary to a target sequence, onto which polyamines are grafted in due place, that is to say allowing the establishment of this bundle of non-covalent bonds, results in that the pairing of this molecule should be much stronger than that of the natural duplex. It follows, as appears from the diagrammatic representation below, that the synthetic molecule - in black - will therefore invade the double helix at its target and form a hernia at this location:
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La liaison covalente de la polyamine à la base nucléique de l'oligonucléotide doit conduire à son placement dans le petit sillon du duplex. L'examen précis de telles structures montre, par exemple, que la position du carbone C2 des purines est idéal pour greffer la polyamine.The covalent bond of the polyamine to the nucleic base of the oligonucleotide must lead to its placement in the small groove of the duplex. Examination of such structures shows, for example, that the position of the C2 carbon of the purines is ideal for grafting the polyamine.
La présente invention a pour objet des bases nucléiques polycationiques et les oligonucleotides les contenant, en particulier les purines substituées en C2> caractérisées en ce qu'elles présentent la structure suivante :The subject of the present invention is polycationic nucleic bases and the oligonucleotides containing them, in particular purines substituted at C2 > characterized in that they have the following structure:
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où X = OH ou NH2 (séries de la guanine ou de la diaminopurine) où Z = N ou CH (purines ou déazapurines) où Y est un groupement moléculaire ayant une affinité pour le petit sillon de l'ADN, par exemple les dérivés de la distamycine ou de la nétropsine, le bérénil, le colorant Hoechst 33258, ou un polypeptide cationique comme la polylysine, la polyarginine, la polyornithine, ou encore un polymère comme le polyethylene ou le polypropylene imine.where X = OH or NH2 (series of guanine or diaminopurine) where Z = N or CH (purines or deazapurines) where Y is a molecular group having an affinity for the small groove of DNA, for example the derivatives of distamycin or nettropsin, berenil, the dye Hoechst 33258, or a cationic polypeptide such as polylysine, polyarginine, polyornithine, or a polymer such as polyethylene or polypropylene imine.
Avantageusement, Y peut être une polyamine de formule générale -NH-((CH2)n-NH)m-H où n est compris entre 2 et 6 inclusivement, m est compris entre 1 et 10 inclusivement et n peut varier entre les différents groupes compris entre deux atomes d'azote. La polyamine est, de préférence, la spermine ou la spermidine ou leurs dérivés capables de se lier à l'ADN.Advantageously, Y can be a polyamine of general formula -NH - ((CH2) n-NH) m -H where n is between 2 and 6 inclusive, m is between 1 and 10 inclusive and n can vary between the different groups between two nitrogen atoms. The polyamine is preferably spermine or spermidine or their derivatives capable of binding to DNA.
R est un résidu bifonctionnel sur la base duquel peuvent être construits des oligomères capables de se lier à l'ADN ou à TARN. Ce résidu bifonctionnel peut avantageusement être le ribose, le 2'-désoxyribose et leurs dérivés, par exemple carbocycliques, halogènes, aminés ou azidés, l'oligomérisation étant obtenue par l'intermédiaire d'un groupement acide phosphorique naturel ou à l'aide de groupements favorisant la pénétration intracellulaire ou protégeant la molécule contre les nucléases, tels que les alkylphosphates, les phosphonates, les phosphorothioates, les méthyl- phosphonates, les carbonates et les carbamates. R peut également être un aminoacide tel que ceux décrits par Nielsen et al. (Nielsen, P.E. ; Egholm, M. ; Berg, R.H. ; Buchardt, O., Science 1991, 254, 1497-1500).R is a bifunctional residue on the basis of which oligomers capable of binding DNA or TARN can be constructed. This bifunctional residue can advantageously be ribose, 2'-deoxyribose and their derivatives, for example carbocyclic, halogen, amine or azide, the oligomerization being obtained via a natural phosphoric acid group or using groups promoting intracellular penetration or protecting the molecule against nucleases, such as alkylphosphates, phosphonates, phosphorothioates, methylphosphonates, carbonates and carbamates. R can also be an amino acid such as those described by Nielsen et al. (Nielsen, P.E.; Egholm, M.; Berg, R.H.; Buchardt, O., Science 1991, 254, 1497-1500).
L'invention a également pour objet un procédé de préparation des bases telles que définies par la formule générale ci-dessus, caractérisé en ce que, pour la synthèse du précurseur de la C2-spermine-guanosine, il présente la succession des étapes suivantes : The subject of the invention is also a process for the preparation of bases as defined by the general formula above, characterized in that, for the synthesis of the precursor of C2-spermine-guanosine, it presents the succession of the following stages:
EXEMPLE 1EXAMPLE 1
Synthèse du précurseur de la C2-spermine-puanosineSynthesis of the precursor of C2-spermine-puanosine
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Etape 15, obtention de : (2-N,3'-0,5'-0-triacétyl)-2'-désoxyguanosineStep 15, obtaining: (2-N, 3'-0,5'-0-triacetyl) -2'-deoxyguanosine
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1 g de monohydrate de désoxyguanosine (3,5 mmol) est mis en suspension dans 100 ml de pyridine anhydre. Le chlorure d'acétyle (1,5 ml,1 g of deoxyguanosine monohydrate (3.5 mmol) is suspended in 100 ml of anhydrous pyridine. Acetyl chloride (1.5 ml,
21 mmol) est rajouté goutte à goutte à une température de ϋ°C. La solution devenue limpide au bout d'une heure est laissée à température ambiante pendant 3 heures. Ensuite, de l'eau (0,5 ml) est rajoutée afin de stopper la réaction et la solution est mise à évaporer. Le dérivé triacétylé est alors purifié par chromatographie sur colonne de silice (éluant : CH2CI2, MeOH 5 % à 10 %), (1,21 g, R = 87 %)21 mmol) is added dropwise at a temperature of ϋ ° C. The solution which has become clear after one hour is left at room temperature for 3 hours. Then, water (0.5 ml) is added to stop the reaction and the solution is evaporated. The triacetylated derivative is then purified by chromatography on a silica column (eluent: CH2Cl2, MeOH 5% to 10%), (1.21 g, R = 87%)
CCM (CH2CI2, MeOH 5 %) Rf = 0,23TLC (CH2Cl2, MeOH 5%) Rf = 0.23
La structure du produit obtenu est confirmée par le spectre de résonance magnétique nucléaire RMN^H (CD3OD) et les déplacements chimiques δ(ppm) s'établissent à : 2,04 (s, 3H, O-Ac) ; 2,11 (s, 3H, O-Ac) ; 2,23 (s, 3H, N-Ac) ; 2,53-2,67 (m, IH, H2 ; 2,92-3,03 (m, IH, H2") ; 4,25-4,38 (m, 3H, H4' et H5 ; 5,39-5,48 (m, IH, H3 ; 6,33 (t, = 6,5 Hz, IH, H]-) ; 8,09 (s, IH, H_).The structure of the product obtained is confirmed by the 1 H NMR nuclear magnetic resonance spectrum (CD3OD) and the chemical shifts δ (ppm) are established at: 2.04 (s, 3H, O-Ac); 2.11 (s, 3H, O-Ac); 2.23 (s, 3H, N-Ac); 2.53-2.67 (m, 1H, H2; 2.92-3.03 (m, 1H, H2 "); 4.25-4.38 (m, 3H, H4 'and H5; 5.39 -5.48 (m, 1H, H3; 6.33 (t, = 6.5 Hz, 1H, H] -); 8.09 (s, 1H, H_).
Etape 16, obtention de : 2-N,3'-0,5'-0-tι_acétyl-6-0-p-nitrophényléthyl-2'- désoxStep 16, obtaining: 2-N, 3'-0,5'-0-tι_acétyl-6-0-p-nitrophényléthyl-2'- désox
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La désoxyguanosine triacétylée (0,7 g, 1,78 mmol) est mise en solution dans 40 ml de dioxanne anhydre. Ensuite sont rajoutés successivement : 0,7 g de triphénylphosphine (2,67 mmol), 0,41 ml de diéthylazodicarboxylate (2,67 mmol) et 0,44 mg de p-nitrophényléthanol (2,67 mmol). Le mélange est laissé à température ambiante sous agitation pendant 24 h, puis le solvant est évaporé. Le résidu est repris dans 50 ml de CH2CI2 et la phase organique est lavée à l'eau (2 x 30 ml) puis séchée sur du sulfate de magnésium. Le composé selon l'étape 16 est purifié par chromatographie sur plaque de silice 4 mm au chromatotron (éluant CH2CI2, MeOH 0 à 2 %) (0,71 g, R = 73 %). CCM (CH2CI2, MeOH 5 %) Rf = 0,44The triacetylated deoxyguanosine (0.7 g, 1.78 mmol) is dissolved in 40 ml of anhydrous dioxane. Then are successively added: 0.7 g of triphenylphosphine (2.67 mmol), 0.41 ml of diethylazodicarboxylate (2.67 mmol) and 0.44 mg of p-nitrophenylethanol (2.67 mmol). The mixture is left at room temperature with stirring for 24 h, then the solvent is evaporated. The residue is taken up in 50 ml of CH2Cl2 and the organic phase is washed with water (2 x 30 ml) and then dried over magnesium sulfate. The compound according to step 16 is purified by chromatography on a 4 mm silica plate with a chromatotron (eluent CH2Cl2, MeOH 0 to 2%) (0.71 g, R = 73%). TLC (CH2CI2, MeOH 5%) Rf = 0.44
La structure du produit obtenu est confirmée par le spectre de résonance magnétique nucléaire RMNlH (CDCI3) et les déplacements chimiques δ(ppm) s'établissent à : 2,09 (s, 3H, O-Ac) ; 2,15 (s, 3H, O-Ac) ; 2,5 (s, 3H, N- Ac) ; 2,53-2,66 (m, IH, H2 ; 2,93-3,05 (m, IH, H2") ; 3,32 (t, J = 6,6 Hz, 2H, Hb) ; 4,33-4,52 (m, 3H, H4" et H5 ; 4,79 (t, J = 6,6 Hz, 2H, Ha) ; 5,41-5,46 (m, 1H, H3 ; 6,35 (t, J = 6,3 Hz, IH, Hr) ; 7,51 (d, J = 8,7 Hz, 2H, Hc) ; 7,97 (s, IH, Hg) ; 7,99 (s, IH, HNH) ; 8, 18 (d, J = 8,7 Hz, 2H, Hd).The structure of the product obtained is confirmed by the 1 H NMR nuclear magnetic resonance spectrum (CDCI3) and the chemical shifts δ (ppm) are established at: 2.09 (s, 3H, O-Ac); 2.15 (s, 3H, O-Ac); 2.5 (s, 3H, N-Ac); 2.53-2.66 (m, 1H, H2; 2.93-3.05 (m, 1H, H2 "); 3.32 (t, J = 6.6 Hz, 2H, Hb); 4, 33-4.52 (m, 3H, H4 "and H5; 4.79 (t, J = 6.6 Hz, 2H, H a ); 5.41-5.46 (m, 1H, H3; 6.35 (t, J = 6.3 Hz, 1H, Hr); 7.51 (d, J = 8.7 Hz, 2H, H c ); 7.97 (s, 1H, Hg); 7.99 (s, 1H, H N H); 8, 18 (d, J = 8.7 Hz, 2H, H d ).
Etape 17, obtention de : 6-0-p-nitrophényléthyl-2'-désoxyguanosineStep 17, obtaining: 6-0-p-nitrophenylethyl-2'-deoxyguanosine
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Le composé obtenu suivant l'étape 16 (1,2 g, 2,21 mmol) est mis en solution dans un mélange de 25 ml de méthanol et de 20 ml d'ammoniaque en solution à 32 %. La déprotection est suivie par CCM. La déprotection des groupements O-acétyl est très rapide, à savoir inférieure à 2 heures, tandis que celle du N-acétyl s'effectue en plusieurs jours. La solution est ensuite soumise à évaporation sous pression réduite. Le résidu obtenu est repris dans 100 ml d'acétate d'éthyle et la phase organique est lavée avec 150 ml d'eau puis séchée sur du sulfate de magnésium.The compound obtained according to step 16 (1.2 g, 2.21 mmol) is dissolved in a mixture of 25 ml of methanol and 20 ml of ammonia in 32% solution. Deprotection is monitored by CCM. The deprotection of the O-acetyl groups is very rapid, that is to say less than 2 hours, while that of the N-acetyl is carried out in several days. The solution is then subjected to evaporation under reduced pressure. The residue obtained is taken up in 100 ml of ethyl acetate and the organic phase is washed with 150 ml of water and then dried over magnesium sulfate.
Le composé obtenu suivant l'étape 17 est purifié par chromatogra¬ phie sur plaque de silice 4 mm au chroma totron (éluant CH2CI2, MeOH 1 à 5 %), le brut de la réaction étant déposé sur la plaque dans le méthanol pur (0,65 g, R = 71 %).The compound obtained according to step 17 is purified by chromatography on a 4 mm silica plate with chroma totron (eluent CH2CI2, MeOH 1 to 5%), the crude of the reaction being deposited on the plate in pure methanol (0 , 65 g, R = 71%).
CCM (CH2CI2, MeOH 10 %) Rf = 0,43TLC (CH2CI2, MeOH 10%) Rf = 0.43
La structure du produit obtenu est confirmée par le spectre de résonance magnétique nucléaire RMN^H (CD3OD) et les déplacements chimiques δ(ppm) s'établissent à : 2,52-2,42 (m, IH, H2 ; 2,67-2,83 (m, IH, H2") ; 3,26 (t, J =The structure of the product obtained is confirmed by the 1 H NMR nuclear magnetic resonance spectrum (CD3OD) and the chemical shifts δ (ppm) are established at: 2.52-2.42 (m, 1H, H2; 2.67 -2.83 (m, 1H, H2 "); 3.26 (t, J =
6.6 Hz, 2H, Hb) ; 3,66-3,88 (m, 2H, H5 ; 4-4,06 (m, IH, H4 ; 4,51-4,56 (m, IH, H3 ; 4,74 (t, J = 6,6 Hz, 2H, Ha) ; 6,32 (t, J = 6,5 Hz, IH, Hj1) ; 7,57 (d, J =6.6 Hz, 2H, Hb); 3.66-3.88 (m, 2H, H5; 4-4.06 (m, 1H, H4; 4.51-4.56 (m, 1H, H3; 4.74 (t, J = 6, 6 Hz, 2H, Ha); 6.32 (t, J = 6.5 Hz, 1H, Hj 1 ); 7.57 (d, J =
8.7 Hz, 2H, Hc) ; 8,03(s, IH, Hδ) ; 8,14 (d, J = 8,7 Hz, 2H, Hd). Etape 18, obtention de : 6-0-p-nitrophényléthyl-2-fiuoro-2'-désoxyinosine8.7 Hz, 2H, H c ); 8.03 (s, 1H, Hδ); 8.14 (d, J = 8.7 Hz, 2H, Hd). Step 18, obtaining: 6-0-p-nitrophenylethyl-2-fiuoro-2'-deoxyinosine
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000012_0001
Tous les réactifs sont portés à -78°C avant d'effectuer leur mélange à cette même température. 240 mg de composé obtenu suivant l'étape 17 (0,57 mmol) sont dissous, dans un tube en téflon, dans 2,5 ml d'une solution à 65 % d'acide fluorhydrique dans la pyridine, 97 ml (0,8 mmol) de nitrite de t-butyle étant alors rajoutés sous agitation. La température de la solution est ensuite augmentée à -30°C pendant 10 minutes, pour être ramenée à -78°C. La solution obtenue est alors neutralisée avec de l'ammoniaque. La température de cette solution ne doit pas dépasser - 15°C tant que tout l'acide fluorhydrique n'a pas été neutralisé. Le composé fluoré est isolé par précipitation dans l'eau (15 ml) avec un rendement de 88 % (214 mg). CCM (CH2CI2, MeOH 5 %) Rf = 0,3All reagents are brought to -78 ° C before mixing at this same temperature. 240 mg of compound obtained according to step 17 (0.57 mmol) are dissolved, in a teflon tube, in 2.5 ml of a 65% solution of hydrofluoric acid in pyridine, 97 ml (0, 8 mmol) of t-butyl nitrite then being added with stirring. The temperature of the solution is then increased to -30 ° C for 10 minutes, to be brought back to -78 ° C. The solution obtained is then neutralized with ammonia. The temperature of this solution should not exceed - 15 ° C until all the hydrofluoric acid has been neutralized. The fluorinated compound is isolated by precipitation in water (15 ml) with a yield of 88% (214 mg). TLC (CH2CI2, MeOH 5%) Rf = 0.3
La structure du produit obtenu est confirmée par le spectre de résonance magnétique nucléaire RMN^H (CD3OD) et les déplacements chimiques δ(ppm) s'établissent à : 2,4-2,51 (m, IH, H2') ; 2,67-2,84 (m, IH, H2"). 3,29 (t, J = 6,6 Hz, 2H, Hb) ; 3,62-3,88 (m, 2H, H5 ; 3,97-4,03 (m, IH, H4 ; 4,5-4,57 (m, IH, H3 ; 4,83 (t, J = 6,6 Hz, 2H, Ha ; 6,38 (t, J = 6,5 Hz, III, Hj1); 7,57 (d, J = 8,7 Hz, 2H, Hc) ; 8,14 (d, J = 8,7 Hz, 2H, H ) ; 8,47 (s, IH, Hg).The structure of the product obtained is confirmed by the nuclear magnetic resonance spectrum 1 H NMR (CD3OD) and the chemical shifts δ (ppm) are established at: 2.4-2.51 (m, 1H, H2 '); 2.67-2.84 (m, 1H, H2 "). 3.29 (t, J = 6.6 Hz, 2H, Hb); 3.62-3.88 (m, 2H, H5; 3, 97-4.03 (m, 1H, H4; 4.5-4.57 (m, 1H, H3; 4.83 (t, J = 6.6 Hz, 2H, Ha; 6.38 (t, J = 6.5 Hz, III, Hj 1 ); 7.57 (d, J = 8.7 Hz, 2H, H c ); 8.14 (d, J = 8.7 Hz, 2H, H); 8 , 47 (s, 1H, Hg).
Etape 19, obtention de : 6-0-p-nitrophényléthyl-2-fluoro-5'-monométhoxytrityl-2'- désoxyinosineStep 19, obtaining: 6-0-p-nitrophenylethyl-2-fluoro-5'-monomethoxytrityl-2'- deoxyinosine
Figure imgf000012_0002
214 mg (0,51 mmol) de composé suivant l'étape 18 sont mis en solution dans 5 ml de pyridine anhydre. Après l'addition de 314 mg de chlorure de monométhoxytrityle (MMT-Cl) (lmmol), la solution est laissée à température ambiante, sous agitation, pendant 16 heures. La pyridine est évaporée et le résidu sec est repris dans 20 ml de chlorure de méthylène. La phase organique est alors lavée avec 20 ml d'une solution de bicarbonate de sodium à 1 %. Ensuite, le composé obtenu dans cette étape 19 est purifié par chromatographie sur plaque de silice 2 mm au chromatotron (éluant CH2CI2, MeOH 2 %) (171 mg, R = 46 %) CCM (CH2CI2, MeOH 10 %) Rf = 0,66 La structure du produit obtenu est confirmée par le spectre de résonance magnétique nucléaire RMNlH (CDCI3) et les déplacements chimiques δ(ppm) s'établissent à : 2,5-2,59 (m, IH, Hy) ; 2,75-2,86 (m, IH, H2"); 3,32 (t, J = 6,7 Hz, 2H, Hb) ; 3,36-3,5 (m, 2H, H5 ; 3,79 (s, 3H, O-Me) ; 4,08-4,15 (m, IH, H4 ; 4,62-4,72 (m, IH, H3 ; 4,83 (t, J = 6,7 Hz, 2H, Ha) ; 6,37 (t, J = 6,5 Hz, IH, Hr); 6,81 (d, 2H, J = 8,8 Hz, Htrityl en a OMe) ; 7,21-7,42 (m, 12H, Htrityl) ; 7,49 (d, J = 8,7 Hz, 2H, Hc) ; 8,03 (s, IH, Hg) ; 8,17 (d, J = 8,7 Hz, 2H, Hd).
Figure imgf000012_0002
214 mg (0.51 mmol) of compound according to step 18 are dissolved in 5 ml of anhydrous pyridine. After the addition of 314 mg of monomethoxytrityl chloride (MMT-Cl) (lmmol), the solution is left at room temperature, with stirring, for 16 hours. The pyridine is evaporated and the dry residue is taken up in 20 ml of methylene chloride. The organic phase is then washed with 20 ml of a 1% sodium bicarbonate solution. Then, the compound obtained in this step 19 is purified by chromatography on a silica plate 2 mm with a chromatotron (eluent CH2CI2, MeOH 2%) (171 mg, R = 46%) TLC (CH2CI2, MeOH 10%) Rf = 0, 66 The structure of the product obtained is confirmed by the 1 H NMR nuclear magnetic resonance spectrum (CDCI3) and the chemical shifts δ (ppm) are established at: 2.5-2.59 (m, 1H, Hy); 2.75-2.86 (m, 1H, H2 "); 3.32 (t, J = 6.7 Hz, 2H, Hb); 3.36-3.5 (m, 2H, H5; 3, 79 (s, 3H, O-Me); 4.08-4.15 (m, 1H, H4; 4.62-4.72 (m, 1H, H3; 4.83 (t, J = 6.7 Hz, 2H, H a ); 6.37 (t, J = 6.5 Hz, IH, Hr); 6.81 (d, 2H, J = 8.8 Hz, Htrityl in a OMe); 7.21 -7.42 (m, 12H, Htrityl); 7.49 (d, J = 8.7 Hz, 2H, H c ); 8.03 (s, 1H, Hg); 8.17 (d, J = 8.7 Hz, 2H, Hd).
Spectre de masse (FAB) : 692 (M+H+) (pic majoritaire à 273 de MMT+).Mass spectrum (FAB): 692 (M + H +) (majority peak at 273 of MMT +).
Pour la synthèse d'un oligonucléotide contenant deux C2-spermine- guanosines le procédé présente la succession des étapes suivantes : For the synthesis of an oligonucleotide containing two C2-spermine-guanosines the process presents the succession of the following stages:
- 12 - EXEMPLE 2- 12 - EXAMPLE 2
Synthèse d'un oligonucléotide contenant deux C2-spermine-guanosinesSynthesis of an oligonucleotide containing two C2-spermine-guanosines
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000014_0001
SynthèseSynthesis
NPE = p-nitrophényléthyl oligonucléotidiqueNPE = p-nitrophenylethyl oligonucleotide
Figure imgf000014_0002
Figure imgf000014_0002
B* = base protégéeB * = protected base
1) SperNH2 1) SperNH 2
2) DBU, pyridine 2) Acide acétique2) DBU, pyridine 2) Acetic acid
Figure imgf000014_0003
Etape 20, phosphorylation du nucléoside :
Figure imgf000014_0003
Step 20, phosphoslation of the nucleoside:
Le nucléoside (61 mg, 85 μmol) est d'abord lyophilisé dans du benzène pour éliminer toute trace d'eau, puis repris, sous argon, dans 4 ml de chlorure de méthylène anhydre. Ensuite deux équivalents de phosphorodiamidite (53 mg) et 0,6 équivalent de tétrazole (135 μl d'une solution commerciale à 0,4 M) sont rajoutés. La solution est laissée sous argon pendant 12 heures, le composé ainsi obtenu étant purifié par chromatographie sur plaque de silice 2 mm au chromatotron (éluant : CH2CI2). (34 mg, R = 43 %). CCM (CH2CI2, MeOH 5 %) Rf - 0,77 La structure du produit obtenu est confirmée par le spectre de résonance magnétique nucléaire RMN 31p (CD3CN), pic caractéristique à 149 ppm du phosphoramidite.The nucleoside (61 mg, 85 μmol) is first lyophilized in benzene to remove all traces of water, then taken up, under argon, in 4 ml of anhydrous methylene chloride. Then two equivalents of phosphorodiamidite (53 mg) and 0.6 equivalent of tetrazole (135 μl of a 0.4 M commercial solution) are added. The solution is left under argon for 12 hours, the compound thus obtained being purified by chromatography on a 2 mm silica plate with a chromatotron (eluent: CH2Cl2). (34 mg, R = 43%). TLC (CH2Cl2, MeOH 5%) Rf - 0.77 The structure of the product obtained is confirmed by the 31n NMR nuclear magnetic resonance spectrum (CD3CN), characteristic peak at 149 ppm of phosphoramidite.
Etape 21, synthèse de l'oligonucléotide ATTG*AATG*TTT : La synthèse de l'oligonucléotide, contenant deux C2-sρermine guanosines, a été faite sur un synthétiseur automatique Biosearch 8600. Le programme de couplage standard pour une synthèse de lμ mol a été utilisé (avec un excès de 20 équivalents du phosphoroamidite de la base modifiée). Seul le sous-programme pour la déprotection du groupement trityl a été modifié : le temps de réaction a été augmenté de 8 à 20 s et un cycle supplémentaire a été rajouté. Le dernier groupement trityl a été conservé pour faciliter la purification de l'oligonucléotide par HPLC sur une colonne de silice Cl 8 inverse.Step 21, synthesis of the oligonucleotide ATTG * AATG * TTT: The synthesis of the oligonucleotide, containing two C2-sρermine guanosines, was carried out on a Biosearch 8600 automatic synthesizer. The standard coupling program for a synthesis of lμ mol a been used (with an excess of 20 equivalents of the modified base phosphoroamidite). Only the subroutine for deprotection of the trityl group has been modified: the reaction time has been increased from 8 to 20 s and an additional cycle has been added. The last trityl group was kept to facilitate the purification of the oligonucleotide by HPLC on a column of reverse Cl 8 silica.
Etape 22, incorporation de la spermine, déprotection et purification de l'oligonucléotide :Step 22, incorporation of the spermine, deprotection and purification of the oligonucleotide:
La résine (15 mg) contenant l'oligonucléotide est mise dans 300 μ 1 d'une solution de spermine (1 M) dans le méthanol pendant 3 jours à 55°C. L'oligonucléotide est ensuite purifié par HPLC sur une colonne Millipore Nova Pak avec un gradient croissant en acétonitrile (de 5 % à 40 % en 40 minutes) dans du tampon acétate de triéthylammonium 100 mM pH 6,5. Le temps de rétention est de 27 minutes. Ensuite, pour déprotéger le groupement p nitrophényléthyl, l'oligonucléotide purifié est mis dans 500 μ 1 de DBU 0,5 M dans la pyridine pendant 24 heures à 55°C. Une extraction chloroforme/eau permet de récupérer l'oligonucléotide dans la phase aqueuse qui est évaporée puis reprise dans l'acide acétique à 80 % pour déprotéger le groupement 5'-trityl. L'oligonucléotide modifié complètement déprotégé est de nouveau purifié par HPLC (même colonne et gradient que précédemment, temps de rétention de 13 minutes). La structure de l'oligonucléotide est confirmée par la spectroscopie de masse en électro spray négatif qui donne une masse de 3727 ± 3.The resin (15 mg) containing the oligonucleotide is placed in 300 μ 1 of a solution of spermine (1 M) in methanol for 3 days at 55 ° C. The oligonucleotide is then purified by HPLC on a Millipore Nova Pak column with an increasing gradient of acetonitrile (from 5% to 40% in 40 minutes) in 100 mM triethylammonium acetate buffer pH 6.5. The retention time is 27 minutes. Then, to deprotect the nitrophenylethyl group p, the purified oligonucleotide is placed in 500 μ 1 of 0.5 M DBU in pyridine for 24 hours at 55 ° C. A chloroform / water extraction makes it possible to recover the oligonucleotide in the aqueous phase which is evaporated and then taken up in 80% acetic acid to deprotect the 5'-trityl group. The completely deprotected modified oligonucleotide is again purified by HPLC (same column and gradient as above, retention time of 13 minutes). The structure of the oligonucleotide is confirmed by mass spectroscopy in negative electrospray which gives a mass of 3727 ± 3.
Par mesure des températures de fusion des duplex, il a été vérifié que l'oligonucléotide contenant deux spermines forme un duplex plus stable avec sa séquence complémentaire que ne le fait l'oligonucléotide naturel. Les mesures ont été faites dans un tampon MES 10 mM à différentes concentrations salines, comme il ressort du tableau 1 ci-dessous. Les écarts de stabilité sont plus importants à faible concentration saline et se réduisent au fur et à mesure que l'on augmente la concentration en sel. Dans des conditions de force ionique correspondant à un milieu physiologique, la différence entre les températures de fusion est encore de 15°C en faveur du duplex modifié. Une variation du pH de 6 à 7 n'a entraîné aucune différence. Par un rajout de la spermine exogène (cf. tableau 2 ci-dessous), le duplex non modifié est stabilisé progressivement, mais il reste nettement moins stable que le duplex modifié possédant deux spermines liées de manière covalente. De plus, pour l'obtention d'un effet de stabilisation, il est nécessaire de rajouter plus de deux équivalents de spermine. Comme prévu, pour le duplex avec l'oligonucléotide modifié aucune stabilisation n'est observée en rajoutant de la spermine.By measuring the melting temperatures of the duplexes, it has been verified that the oligonucleotide containing two spermines forms a more stable duplex with its complementary sequence than does the natural oligonucleotide. The measurements were made in a 10 mM MES buffer at different saline concentrations, as shown in Table 1 below. The differences in stability are greater at low salt concentration and become smaller as the salt concentration is increased. Under ionic strength conditions corresponding to a physiological medium, the difference between the melting temperatures is still 15 ° C. in favor of the modified duplex. A change in pH from 6 to 7 made no difference. By adding exogenous spermine (see Table 2 below), the unmodified duplex is gradually stabilized, but it remains significantly less stable than the modified duplex having two covalently linked spermines. In addition, to obtain a stabilizing effect, it is necessary to add more than two equivalents of spermine. As expected, for the duplex with the modified oligonucleotide, no stabilization is observed by adding spermine.
Tableau 1 : Température de fusion (en °C) des duplex (2μ M) dans un tampon MES 10 mM, pH6Table 1: Melting temperature (in ° C) of duplexes (2μ M) in a 10 mM MES buffer, pH6
NaCl 20mM 50mM lOOmM 150mM duplex normal ATTGAATGTTT 17,5 24,3 29,5 32,4 TAACTTACAAA duplex avec oligonucléotide modifiéNaCl 20mM 50mM 100mM 150mM normal duplex ATTGAATGTTT 17.5 24.3 29.5 32.4 TAACTTACAAA duplex with modified oligonucleotide
ATTG*AATG*TTT 41,7 45 47 47,2ATTG * AATG * TT 41.7 45 47 47.2
TAAC TTACAAATAAC TTACAAA
Tableau 2 : Températures de fusion (en °C) des duplex (2 μ M) dans un tampon MES 10 mM, pH6,8 Spermine 4 μM 20 μM 0,2 mM ImM (2éq) (10 éq) (100 éq) (500 éq) duplex normal ATTGAATGTTT 32,5 33 35,2 36,6 TAACTTACAAA duplex avec oligo¬ nucléotide modifié ATTG*AATG*TTT 47,3 47,2 47,4 47,5 TAAC TTACAAATable 2: Melting temperatures (in ° C) of duplexes (2 μ M) in a 10 mM MES buffer, pH 6.8 Spermine 4 μM 20 μM 0.2 mM ImM (2 eq) (10 eq) (100 eq) (500 eq) normal duplex ATTGAATGTTT 32.5 33 35.2 36.6 TAACTTACAAA duplex with modified oligo¬ nucleotide ATTG * AATG * TTT 47.3 47.2 47.4 47.5 TAAC TTACAAA
Des expériences d'électrophorèse sur gels d'acrylamide 20 % ont permis de montrer que si l'oligonucléotide modifié est rajouté dans une solution contenant le duplex normal, on forme le duplex avec l'oligonucléotide modifié, ce dernier déplaçant le brin déjà apparié pour former un duplex plus stable. En effet, le duplex naturel, le duplex modifié et les oligonucleotides simple brin originels présentent des distances de migration caractéristiques : duplex normal (51 mm), duplex modifié (45 mm), oligonucléotide non modifié (62 mm), oligonucléotide modifié (37 mm). Ces expériences ont été réalisées dans un tampon MES 10 mM, pH6, NaCl 150 mM, spermine 1 mM, avec une concentration en duplex et en oligonucléotide de 2 μ M. Les mélanges ont été faits à 0°C ou à température ambiante et le résultat a été identique. Le remplacement du brin déjà apparié est très rapide, le temps de réaliser le mélange et de le déposer sur le gel étant suffisant. L'électrophorèse est réalisée à 4°C sous une tension de 80V pendant 12 heures pour l'obtention d'un gel de 15 cm de long et de 0,1 cm d'épaisseur.Electrophoresis experiments on 20% acrylamide gels have shown that if the modified oligonucleotide is added to a solution containing the normal duplex, the duplex is formed with the modified oligonucleotide, the latter displacing the strand already paired for form a more stable duplex. Indeed, the natural duplex, the modified duplex and the original single-stranded oligonucleotides exhibit characteristic migration distances: normal duplex (51 mm), modified duplex (45 mm), unmodified oligonucleotide (62 mm), modified oligonucleotide (37 mm ). These experiments were carried out in a 10 mM MES buffer, pH6, 150 mM NaCl, 1 mM spermine, with a duplex and oligonucleotide concentration of 2 μM. The mixtures were made at 0 ° C. or at room temperature and the result was identical. The replacement of the already paired strand is very fast, the time to make the mixture and deposit it on the gel being sufficient. The electrophoresis is carried out at 4 ° C under a voltage of 80V for 12 hours to obtain a gel 15 cm long and 0.1 cm thick.
Selon une caractéristique de l'invention, les nouvelles bases nucléiques sont utilisées pour la reconnaissance d'une séquence-cible d'ADN par synthèse d'un oligomère de séquence complémentaire à celle de l'un des deux brins de la séquence concernée. A cet effet, l'oligomère comportera, en un ou plusieurs endroits de sa séquence, une base modifiée conformément à l'invention. Grâce à la présence de ces groupements présentant une forte affinité pour le petit sillon de l'ADN, l'oligomère va instantanément s'associer à l'ADN, de manière peu ou non sélective de séquence, et voyager le long de l'acide nucléique. Ce processus favorise la recherche de la cible et peut être avantageusement comparé aux techniques décrites dans l'art antérieur. Par conséquent, l'association est rapide et ne nécessite pas la dénaturation préalable du duplex ciblé. En outre, cette technique est générale, car elle permet la reconnaissance des quatre bases nucléiques au sens de Crick et Watson. Enfin, l'art antérieur révèle que les polyamines favorisent grandement la pénétration de polynucléotides dans les cellules (Behr, J.P. ; Demeneux, B. ; Loeffler, J.P. ; Perez-Mutul, J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86, 6982-6986 ; FR-A-2 645 866 ; FR-A-2 646 161 et EP- A-0394 111, demande de brevet français n° 94 00159).According to a characteristic of the invention, the new nucleic bases are used for the recognition of a DNA target sequence by synthesis of an oligomer of sequence complementary to that of one of the two strands of the sequence concerned. To this end, the oligomer will comprise, at one or more places in its sequence, a base modified in accordance with the invention. Thanks to the presence of these groups having a strong affinity for the small groove of DNA, the oligomer will instantly associate with DNA, in a non-selective or non-selective sequence, and travel along the acid. nucleic acid. This process promotes the search for the target and can be advantageously compared to the techniques described in the prior art. Consequently, the association is rapid and does not require prior denaturing of the targeted duplex. In addition, this technique is general, because it allows the recognition of the four nucleic bases in the sense of Crick and Watson. Finally, the prior art reveals that polyamines greatly promote the penetration of polynucleotides into cells (Behr, JP; Demeneux, B.; Loeffler, JP; Perez-Mutul, J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989 , 86, 6982-6986; FR-A-2 645 866; FR-A-2 646 161 and EP-A-0394 111, French patent application n ° 94 00159).
Selon une autre caractéristique de l'invention, les nouvelles bases nucléiques sont utilisées pour la reconnaissance de séquence par formation d'hélices triples selon la technique dite "antigène" (N.T. Thuong et C. Hélène, Angew. Chem. Int. Ed. 1993, 32, 666-690). A l'aide des oligomères conformes à l'invention, la présence notamment d'un groupement polycationique peut stabiliser fortement la liaison de ces molécules à l'ADN dans le grand sillon sous forme A (Garcia, A.; Giege, R. ; Behr, J.P., Nucleic Acids Res. 1990, 75, 89-95 ; Schmid, N. ; Behr, J.P., Biochem 1991, 30, 4357-4361). Conformément à une autre caractéristique de l'invention, les nouvelles bases nucléiques peuvent également être utilisées pour la reconnaissance de séquences d'ARN messager par la technique dite "antisens". Cette technique est décrite par C. Hélène et J.J. Toulmé, dans Biochim. Biophys. Acta 1990, 1049, 99-125. Bien entendu, la présente invention ne se limite nullement aux indications et aux applications décrites. D'autres indications et applications sont possibles, ainsi que des modifications aux indications et aux applications décrites, sans sortir pour autant du domaine de protection de l'invention. According to another characteristic of the invention, the new nucleic bases are used for sequence recognition by the formation of triple helices according to the so-called "antigen" technique (NT Thuong and C. Hélène, Angew. Chem. Int. Ed. 1993 , 32, 666-690). With the aid of the oligomers in accordance with the invention, the presence in particular of a polycationic group can strongly stabilize the binding of these molecules to DNA in the large groove in form A (Garcia, A .; Giege, R.; Behr, JP, Nucleic Acids Res. 1990, 75, 89-95; Schmid, N.; Behr, JP, Biochem 1991, 30, 4357-4361). According to another characteristic of the invention, the new nucleic bases can also be used for the recognition of messenger RNA sequences by the so-called "antisense" technique. This technique is described by C. Hélène and J.J. Toulmé, in Biochim. Biophys. Acta 1990, 1049, 99-125. Of course, the present invention is in no way limited to the indications and the applications described. Other indications and applications are possible, as well as modifications to the indications and applications described, without departing from the scope of protection of the invention.

Claims

R E V E N D I C A T I O N S
1. Bases nucléiques polycationiques et oligonucleotides les contenant, en particulier purines substituées en C2, caractérisées en ce qu'elles présentent la structure suivante :1. Polycationic nucleic bases and oligonucleotides containing them, in particular purines substituted at C2, characterized in that they have the following structure:
Figure imgf000019_0001
où X = OH ou NH2 (séries de la guanine ou de la diaminopurine) où Z = N ou CH (purines ou déazapurines) où Y est un groupement moléculaire ayant une affinité pour le petit sillon de l'ADN, par exemple les dérivés de la distamycine ou de la nétropsine, le bérénil, le colorant Hoechst 33258, ou un polypeptide cationique comme la polylysine, la polyarginine, la polyornithine, ou encore un polymère comme le polyethylene ou le polypropylene imine.
Figure imgf000019_0001
where distamycin or netropsin, berenil, Hoechst 33258 dye, or a cationic polypeptide such as polylysine, polyarginine, polyornithine, or even a polymer such as polyethylene or polypropylene imine.
2. Bases, suivant la revendication 1, caractérisées en ce que Y est avantageusement une polyamine de formule générale -NH-((CH2)n-NH) -H où n est compris enϋe 2 et 6 inclusivement, m est compris entre 1 et 10 inclusivement et n peut varier entre les différents groupes compris entre deux atomes d'azote.2. Bases, according to claim 1, characterized in that Y is advantageously a polyamine of general formula -NH-((CH2)n-NH) -H where n is between 2 and 6 inclusive, m is between 1 and 10 inclusive and n can vary between the different groups between two nitrogen atoms.
3. Bases, suivant la revendication 2, caractérisées en ce que la polyamine est, de préférence, la spermine ou la spermidine ou leurs dérivés capables de se lier à l'ADN.3. Bases, according to claim 2, characterized in that the polyamine is, preferably, spermine or spermidine or their derivatives capable of binding to DNA.
4. Bases, suivant la revendication 1, caractérisées en ce que R est un résidu bifonctionnel sur la base duquel peuvent être construits des oligomères capables de se lier à l'ADN ou à TARN.4. Bases, according to claim 1, characterized in that R is a bifunctional residue on the basis of which oligomers capable of binding to DNA or RNA can be constructed.
5. Bases, suivant la revendication 4, caractérisées en ce que le résidu bifonctionnel est avantageusement le ribose, le 2'-désoxyribose et leurs dérivés, par exemple carbocycliques, halogènes, aminés ou azidés, l'oligomérisation étant obtenue par l'intermédiaire d'un groupement acide phosphorique naturel ou à l'aide de groupements favorisant la pénétration intracellulaire ou protégeant la molécule contre les nucléases, tels que les alkylphosphates, les phosphonates, les phosphorothioates, les méthylphosphonates, les carbonates et les carbamates.5. Bases, according to claim 4, characterized in that the bifunctional residue is advantageously ribose, 2'-deoxyribose and their derivatives, for example carbocyclic, halogen, amino or azide derivatives, the oligomerization being obtained via 'a natural phosphoric acid group or using groups promoting intracellular penetration or protecting the molecule against nucleases, such as alkylphosphates, phosphonates, phosphorothioates, methylphosphonates, carbonates and carbamates.
6. Bases, suivant la revendication 1, caractérisées en ce que R est un aminoacide. 6. Bases according to claim 1, characterized in that R is an amino acid.
7. Procédé de préparation de bases suivant la revendication 1, caractérisé en ce que, pour la synthèse du précurseur de la C2-spermine- guanosine, il présente la succession des étapes suivantes :7. Process for preparing bases according to claim 1, characterized in that, for the synthesis of the precursor of C2-spermine-guanosine, it presents the succession of the following steps:
° O HO Ny NH2 cH3CQα Ac0 ΛNHAC ° O HO N y NH2 cH3CQα Ac0 Λ NHAC
PyridinC 87% * " PyridinC 87 % * "
Figure imgf000020_0001
73% 71%
Figure imgf000020_0001
73% 71%
Figure imgf000020_0002
Figure imgf000020_0002
8. Procédé, suivant la revendication 7, caractérisé en ce que pour l'obtention de : (2-N,3'-0,5'-0-triacétyl)-2'-désoxyguanosine8. Process according to claim 7, characterized in that for obtaining: (2-N,3'-0.5'-0-triacetyl)-2'-deoxyguanosine
Figure imgf000020_0003
1 g de monohydrate de désoxyguanosine (3,5 mmol) est mis en suspension dans 100 ml de pyridine anhydre, du chlorure d'acétyle (1,5 ml, 21 mmol) est rajouté goutte à goutte à une température de 0°C, la solution devenue limpide au bout d'une heure est laissée à température ambiante pendant 3 heures, ensuite, de l'eau (0,5 ml) est rajoutée afin de stopper la réaction et la solution est mise à évaporer, le dérivé triacétylé est alors purifié par chromatographie sur colonne de silice (éluant : CH2CI2, MeOH 5 % à 10 %), (1,21 g, R = 87 %) CCM (CH2CI2, MeOH 5 %) Rf = 0,23, la structure du produit obtenu étant confirmée par le spectre de résonance magnétique nucléaire RMN^H (CD3OD) et les déplacements chimiques δ(ppm) s'établissant à : 2,04 (s, 3H, O-Ac) ; 2,1 1 (s, 3H, O-Ac) ; 2,23 (s, 311, N-Ac) ; 2,53-2,67 (m, IH, H2 ; 2,92-3,03 (m, IH, H2") ; 4,25-4,38 (m, 3H, H4' et H5 ; 5,39-5,48 (m, IH, H ) ; 6,33 (t, J = 6,5 Hz, I H, H j') ; 8,09 (s, IH, Hy).
Figure imgf000020_0003
1 g of deoxyguanosine monohydrate (3.5 mmol) is suspended in 100 ml of anhydrous pyridine, acetyl chloride (1.5 ml, 21 mmol) is added dropwise at a temperature of 0°C, the solution which becomes clear after one hour is left at room temperature for 3 hours, then water (0.5 ml) is added in order to stop the reaction and the solution is allowed to evaporate, the triacetylated derivative is then purified by chromatography on a silica column (eluent: CH2CI2, MeOH 5% to 10%), (1.21 g, R = 87%) TLC (CH2CI2, MeOH 5%) Rf = 0.23, the structure of the product obtained being confirmed by the nuclear magnetic resonance spectrum NMR^H (CD3OD) and the chemical shifts δ(ppm) being established at: 2.04 (s, 3H, O-Ac); 2.1 1 (s, 3H, O-Ac); 2.23 (s, 311, N-Ac); 2.53-2.67 (m, IH, H2; 2.92-3.03 (m, IH, H2"); 4.25-4.38 (m, 3H, H4' and H5; 5.39 -5.48 (m, IH, H); 6.33 (t, J = 6.5 Hz, IH, H j'); 8.09 (s, IH, Hy).
9. Procédé, suivant l'une quelconque des revendications 7 et 8, caractérisé en ce que pour l'obtention de : 2-N,3'-0,5'-0-triacétyl-6-0-p- nitrophényléthyl-2'-désoxyguanosine9. Process according to any one of claims 7 and 8, characterized in that for obtaining: 2-N,3'-0.5'-0-triacetyl-6-0-p-nitrophenylethyl-2 '-deoxyguanosine
Figure imgf000021_0001
la désoxyguanosine triacétylée (0,7 g, 1,78 mmol) est mise en solution dans 40 ml de dioxanne anhydre, puis sont rajoutés successivement : 0,7 g de triphénylphosphine (2,67 mmol), 0,41 ml de diéthylazodicarboxylate (2,67 mmol) et 0,44 mg de p-nitrophényléthanol (2,67 mmol), ensuite le mélange est laissé à température ambiante sous agitation pendant 24 heures, puis le solvant est évaporé, le résidu est alors repris dans 50 ml de CH2CI2 et la phase organique est lavée à l'eau (2 x 30 ml) puis séchée sur du sulfate de magnésium, le composé obtenu étant purifié par chromatographie sur plaque de silice 4 mm au chromatotron (éluant CH2CI2, MeOH 0 à 2 ) (0,71 g, R = 73 %), CCM (CH2CI2, MeOH 5 %) Rf = 0,44, la structure du produit obtenu étant confirmée par le spectre de résonance magnétique nucléaire RMNlH (CDCI3) et les déplacements chimiques δ(ppm) s'établissant à : 2,09 (s, 3H, O-Ac) ; 2,15 (s, 3H, O-Ac) ; 2,5 (s, 3H, N-Ac) ; 2,53- 2,66 (m, IH, W∑) ; 2,93-3,05 (m, IH, H2") ; 3,32 (t, J = 6,6 Hz, 2H, H ) ; 4,33-
Figure imgf000021_0001
triacetylated deoxyguanosine (0.7 g, 1.78 mmol) is dissolved in 40 ml of anhydrous dioxane, then the following are added successively: 0.7 g of triphenylphosphine (2.67 mmol), 0.41 ml of diethylazodicarboxylate ( 2.67 mmol) and 0.44 mg of p-nitrophenylethanol (2.67 mmol), then the mixture is left at room temperature with stirring for 24 hours, then the solvent is evaporated, the residue is then taken up in 50 ml of CH2CI2 and the organic phase is washed with water (2 x 30 ml) then dried over magnesium sulfate, the compound obtained being purified by chromatography on a 4 mm silica plate on a chromatotron (eluent CH2CI2, MeOH 0 to 2) ( 0.71 g, R = 73%), TLC (CH2CI2, MeOH 5%) Rf = 0.44, the structure of the product obtained being confirmed by the HNMR nuclear magnetic resonance spectrum (CDCI3) and the chemical shifts δ(ppm ) standing at: 2.09 (s, 3H, O-Ac); 2.15 (s, 3H, O-Ac); 2.5 (s, 3H, N-Ac); 2.53- 2.66 (m, HI, W∑); 2.93-3.05 (m, IH, H2"); 3.32 (t, J = 6.6 Hz, 2H, H); 4.33-
4,52 (m, 3H, H4' et H5 ; 4,79 (t, J = 6,6 Hz, 2H, U_ ; 5,41-5,46 (m, IH, H3 ;4.52 (m, 3H, H4' and H5; 4.79 (t, J = 6.6 Hz, 2H, U_; 5.41-5.46 (m, IH, H3;
6,35 (t, J = 6,3 Hz, IH, Hr) ; 7,51 (d, J = 8,7 Hz, 2H, Hc) ; 7,97 (s, IH, Hg) ; 7,996.35 (t, J = 6.3 Hz, IH, Hr); 7.51 (d, J = 8.7 Hz, 2H, H c ); 7.97 (s, HI, Hg); 7.99
(s, IH, HNH) î 8,18 (d, J = 8,7 Hz, 2H, Hd).(s, IH, HNH) î 8.18 (d, J = 8.7 Hz, 2H, Hd).
10. Procédé, suivant l'une quelconque des revendications 7 et 9, caractérisé en ce que pour l'obtention de : 6-0-p-nitrophényléthyl-2'- désoxyguanosine10. Process according to any one of claims 7 and 9, characterized in that for obtaining: 6-0-p-nitrophenylethyl-2'- deoxyguanosine
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000022_0001
le composé 2-N,3'-0,5'-0-triacétyl-6-0-p-nitrophényléthyl-2'-désoxyguanosine (1,2 g, 2,21 mmol) est mis en solution dans un mélange de 25 ml de méthanol et de 20 ml d'ammoniaque en solution à 32 %, cette déprotection étant suivie par CCM et la déprotection des groupements O-acétyl étant très rapide, à savoir inférieure à 2 heures, tandis que celle du N-acétyl s'effectue en plusieurs jours, la solution est ensuite soumise à évaporation sous pression réduite et le résidu obtenu est repris dans 100 ml d'acétate d'éthyle et la phase organique est lavée avec 150 ml d'eau puis séchée sur du sulfate de magnésium, le composé ainsi obtenu est purifié par chromatographie sur plaque de silice 4 mm au chromatotron (éluant CH2CI2, MeOH 1 à 5 %), le brut de la réaction étant déposé sur la plaque dans le méthanol pur (0,65 g, R = 71 %), CCM (CH2CI2, MeOH 10 %) Rf = 0,43, la structure du produit obtenu étant confirmée par le spectre de résonance magnétique nucléaire RM lH (CD3OD) et les déplacements chimiques δ(ppm) s'établissant à : 2,52-2,42 (m, IH, H2 ; 2,67-2,83 (m, IH, H ) ; 3,26 (t, J =the compound 2-N,3'-0.5'-0-triacetyl-6-0-p-nitrophenylethyl-2'-deoxyguanosine (1.2 g, 2.21 mmol) is dissolved in a mixture of 25 ml of methanol and 20 ml of ammonia in 32% solution, this deprotection being followed by TLC and the deprotection of the O-acetyl groups being very rapid, namely less than 2 hours, while that of the N-acetyl takes carried out over several days, the solution is then subjected to evaporation under reduced pressure and the residue obtained is taken up in 100 ml of ethyl acetate and the organic phase is washed with 150 ml of water then dried over magnesium sulfate, the compound thus obtained is purified by chromatography on a 4 mm silica plate with a chromatotron (eluent CH2CI2, MeOH 1 to 5%), the crude product of the reaction being deposited on the plate in pure methanol (0.65 g, R = 71 %), TLC (CH2CI2, MeOH 10%) Rf = 0.43, the structure of the product obtained being confirmed by the nuclear magnetic resonance spectrum RM lH (CD3OD) and the chemical shifts δ(ppm) being established at: 2 .52-2.42 (m, IH, H2; 2.67-2.83 (m, 1H, H); 3.26 (t, J =
6.6 Hz, 2H, Hb) ; 3,66-3,88 (m, 2H, H5 ; 4-4,06 (m, IH, H4 ; 4,51-4,56 (m, IH, H3 ; 4,74 (t, J = 6,6 Hz, 2H, Ha ; 6,32 (t, J = 6,5 Hz, IH, Hr) ; 7,57 (d, J =6.6 Hz, 2H, Hb); 3.66-3.88 (m, 2H, H5; 4-4.06 (m, IH, H4; 4.51-4.56 (m, IH, H3; 4.74 (t, J = 6, 6 Hz, 2H, Ha; 6.32 (t, J = 6.5 Hz, IH, Hr); 7.57 (d, J =
8.7 Hz, 2H, Hc) ; 8,03(s, IH, Hs) ; 8,14 (d, J = 8,7 Hz, 2H, Hd). 8.7 Hz, 2H, H c ); 8.03(s, IH, Hs); 8.14 (d, J = 8.7 Hz, 2H, Hd).
11. Procédé, suivant l'une quelconque des revendications 7 et 10, caractérisé en ce que pour l'obtention de : 6-0-p-nitrophényléthyl-2-fluoro-2'- désoxyinosine
Figure imgf000023_0001
11. Process according to any one of claims 7 and 10, characterized in that for obtaining: 6-0-p-nitrophenylethyl-2-fluoro-2'- deoxyinosine
Figure imgf000023_0001
tous les réactifs sont portés à -78°C avant d'effectuer leur mélange à cette même température, 240 mg de composé 6-0-p-nitrophénylétlιyl-2'-désoxyguanosine (0,57 mmol) sont dissous, dans un tube en téflon, dans 2,5 ml d'une solution à 65 % d'acide fluorhydrique dans la pyridine, 97 ml (0,8 mmol) de nitritc de t-butyle étant alors rajoutés sous agitation, la température de la solution est ensuite augmentée à -30°C pendant 10 minutes, pour être ramenée à -78°C, la solution obtenue est alors neutralisée avec de l'ammoniaque, la température de cette solution ne dépassant pas -15°C tant que tout l'acide fluorhydrique n'a pas été neutralisé, le composé fluoré est isolé par précipitation dans l'eau (15 ml) avec un rendement de 88 % (214 mg), CCM (CH2CI2, MeOH 5 %) Rf = 0,3, la structure du produit obtenu étant confirmée par le spectre de résonance magnétique nucléaire RMN^H (CD3OD) et les déplacements chimiques δ(ppm) s'établissant à : 2,4-2,51 (m, IH, H2 ; 2,67-2,84 (m, IH, H2"). 3,29 (t, J = 6,6 Hz, 2H, Hb) ; 3,62-3,88 (m, 2H, H5 ; 3,97-4,03 (m, IH, H4 ; 4,5-4,57 (m, IH, H3') ; 4,83 (t, J = 6,6 Hz, 2H, H_) ; 6,38 (t, J = 6,5 Hz, IH, Hr); 7,57 (d, J = 8,7 Hz, 2H, Hc) ; 8,14 (d, J = 8,7 Hz, 2H, Hj) ; 8,47 (s, IH, Hg).all the reagents are brought to -78°C before mixing at this same temperature, 240 mg of compound 6-0-p-nitrophenylyl-2'-deoxyguanosine (0.57 mmol) are dissolved in a tube in teflon, in 2.5 ml of a 65% solution of hydrofluoric acid in pyridine, 97 ml (0.8 mmol) of t-butyl nitritc then being added with stirring, the temperature of the solution is then increased at -30°C for 10 minutes, to be brought back to -78°C, the solution obtained is then neutralized with ammonia, the temperature of this solution not exceeding -15°C as long as all the hydrofluoric acid does not has not been neutralized, the fluorinated compound is isolated by precipitation in water (15 ml) with a yield of 88% (214 mg), TLC (CH2CI2, MeOH 5%) Rf = 0.3, the structure of the product obtained being confirmed by the nuclear magnetic resonance spectrum NMR^H (CD3OD) and the chemical shifts δ(ppm) being established at: 2.4-2.51 (m, 1H, H2; 2.67-2.84 (m, IH, H2"). 3.29 (t, J = 6.6 Hz, 2H, Hb); 3.62-3.88 (m, 2H, H5; 3.97-4.03 (m, IH, H4; 4.5-4.57 (m, IH, H3'); 4.83 (t, J = 6.6 Hz, 2H, H_); 6.38 (t, J = 6.5 Hz, IH, Hr); 7.57 (d, J = 8.7 Hz, 2H, H c ); 8 .14 (d, J = 8.7 Hz, 2H, Hj); 8.47 (s, IH, Hg).
12. Procédé, suivant l'une quelconque des revendications 7 et 11, caractérisé en ce que pour l'obtention de : 6-0-p-nitrophényléthyl-2-fluoro-5'- monométhoxytrityl-2'-désoxyinosine12. Process according to any one of claims 7 and 11, characterized in that for obtaining: 6-0-p-nitrophenylethyl-2-fluoro-5'- monomethoxytrityl-2'-deoxyinosine
Figure imgf000023_0002
214 mg (0,51 mmol) de composé 6-0-p-nitrophényléthyl-2-fluoro-2'- désoxyinosine sont mis en solution dans 5 ml de pyridine anhydre, après l'addition de 314 mg de chlorure de monométhoxytrityle (MMT-Cl) (lmmol), la solution est laissée à température ambiante, sous agitation, pendant 16 heures, puis la pyridine est évaporée et le résidu sec est repris dans 20 ml de chlorure de méthylène, la phase organique est alors lavée avec 20 ml d'une solution de bicarbonate de sodium à 1 %, ensuite, le composé ainsi obtenu est purifié par chromatographie sur plaque de silice 2 mm au chromatotron (éluant CH2CI2, MeOH 2 %) (171 mg, R = 46 %) CCM (CH2CI2, MeOH 10 % ) Rf = 0,66, la structure du produit obtenu étant confirmée par le spectre de résonance magnétique nucléaire RMNlH (CDCI3) et les déplacements chimiques δ(ppm) s'établissant à : 2,5-2,59 (m, IH, H2 ; 2,75-2,86 (m, IH, H2"); 3,32 (t, J = 6,7 Hz, 2H, Hb) ; 3,36-3,5 (m, 2H, H5 ; 3,79 (s, 3H, O-Me) ; 4,08-4,15 (m, IH, H4 ; 4,62-4,72 (m, IH, H3 ; 4,83 (t, J = 6,7 Hz, 2H, Ha) ; 6,37 (t, J = 6,5 Hz, IH, Hr); 6,81 (d, 2H, J = 8,8 Hz, Htrityl en a OMe) ; 7,21-7,42 (m, 12H, Htrityl) ; 7,49 (d, J = 8,7 Hz, 2H, Hc) ; 8,03 (s, IH, Hg) ; 8,17 (d, J = 8,7 Hz, 2H, Hd), spectre de masse (FAB) : 692 (M+H+) (pic majoritaire à 273 de MMT+).
Figure imgf000023_0002
214 mg (0.51 mmol) of compound 6-0-p-nitrophenylethyl-2-fluoro-2'-deoxyinosine are dissolved in 5 ml of anhydrous pyridine, after the addition of 314 mg of monomethoxytrityl chloride (MMT -Cl) (lmmol), the solution is left at room temperature, with stirring, for 16 hours, then the pyridine is evaporated and the dry residue is taken up in 20 ml of methylene chloride, the organic phase is then washed with 20 ml of a 1% sodium bicarbonate solution, then the compound thus obtained is purified by chromatography on a 2 mm silica plate on a chromatotron (eluent CH2CI2, MeOH 2%) (171 mg, R = 46%) TLC (CH2CI2 , MeOH 10%) Rf = 0.66, the structure of the product obtained being confirmed by the HNMR nuclear magnetic resonance spectrum (CDCI3) and the chemical shifts δ(ppm) being established at: 2.5-2.59 ( m, IH, H2; 2.75-2.86 (m, IH, H2"); 3.32 (t, J = 6.7 Hz, 2H, Hb); 3.36-3.5 (m, 2H, H5; 3.79 (s, 3H, O-Me); 4.08-4.15 (m, 1H, H4; 4.62-4.72 (m, 1H, H3; 4.83 (t, J = 6.7 Hz, 2H, Ha); 6.37 (t, J = 6.5 Hz, IH, Hr); 6.81 (d, 2H, J = 8.8 Hz, Htrityl has OMe); 7.21-7.42 (m, 12H, Htrityl); 7.49 (d, J = 8.7 Hz, 2H, H c ); 8.03 (s, 1H, Hg); 8.17 (d, J = 8.7 Hz, 2H, Hd), mass spectrum (FAB): 692 (M+H+) (majority peak at 273 of MMT+).
13. Procédé de préparation de bases suivant la revendication 1, caractérisé en ce que, pour la synthèse d'un oligonucléotide contenant deux C2- spermine-guanosines le procédé présente la succession des étapes suivantes : 13. Process for preparing bases according to claim 1, characterized in that, for the synthesis of an oligonucleotide containing two C2-spermine-guanosines, the process presents the succession of the following steps:
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000025_0001
NPE = p-nitrophényléthyl Synthèse oligonucléoridiqueNPE = p-nitrophenylethyl Oligonuclear synthesis
Figure imgf000025_0002
Figure imgf000025_0002
B* = base protégée l) SperNH2 B* = protected base l) SperNH 2
2) DBU, pyridine2) DBU, pyridine
2) Acide acétique2) Acetic acid
Figure imgf000025_0003
Figure imgf000025_0003
14. Procédé, suivant la revendication 13, caractérisé en ce que pour la phosphorylation du nucléoside, le nucléoside (61 mg, 85 μmol) est d'abord lyophilisé dans du benzène pour éliminer toute trace d'eau, puis repris, sous argon, dans 4 ml de chlorure de méthylène anhydre, ensuite deux équivalents de phosphorodiamidite (53 mg) et 0,6 équivalent de tétrazole (135 μl d'une solution commerciale à 0,4 M) sont rajoutés, la solution est laissée sous argon pendant 12 heures, le composé ainsi obtenu étant purifié par chromatographie sur plaque de silice 2 mm au chromatotron (éluant : CH2CI2). (34 mg, R = 43 %), CCM (CH2CI2, MeOH 5 %) Rf = 0.77, la structure du produit obtenu étant confirmée par le spectre de résonance magnétique nucléaire RMN 31p (CD3CN), pic caractéristique à 149 ppm du phosphoramidite.14. Method according to claim 13, characterized in that for the phosphorylation of the nucleoside, the nucleoside (61 mg, 85 μmol) is first lyophilized in benzene to eliminate all traces of water, then taken up, under argon, in 4 ml of anhydrous methylene chloride, then two equivalents of phosphorodiamidite (53 mg) and 0.6 equivalent of tetrazole (135 μl of a commercial solution at 0.4 M) are added, the solution is left under argon for 12 hours, the compound thus obtained being purified by chromatography on a 2 mm silica plate with a chromatotron (eluent: CH2CI2). (34 mg, R = 43%), TLC (CH2CI2, MeOH 5%) Rf = 0.77, the structure of the product obtained being confirmed by the 31p NMR nuclear magnetic resonance spectrum (CD3CN), characteristic peak at 149 ppm of phosphoramidite.
15. Procédé, suivant l'une quelconque des revendications 13 et 14, caractérisé en ce que la synthèse de l'oligonucléotide ATTG*AATG*TTT, contenant deux C2-spermine guanosines, est faite sur un synthétiseur automatique, avec utilisation d'un programme de couplage standard pour une synthèse de l μ mol (avec un excès de 20 équivalents du phosphoroamidite de la base modifiée), seul le sous-programme pour la déprotection du groupement trityl étant modifié : le temps de réaction étant augmenté de 8 à 20 s et un cycle supplémentaire étant rajouté, le dernier groupement trityl étant conservé pour faciliter la purification de l'oligonucléotide par HPLC sur une colonne de silice C 18 inverse.15. Method according to any one of claims 13 and 14, characterized in that the synthesis of the ATTG*AATG*TTT oligonucleotide, containing two C2-spermine guanosines, is carried out on an automatic synthesizer, with the use of a standard coupling program for a synthesis of l μ mol (with an excess of 20 equivalents of the phosphoroamidite of the modified base), only the subprogram for the deprotection of the trityl group being modified: the reaction time being increased from 8 to 20 s and an additional cycle being added, the last trityl group being retained to facilitate the purification of the oligonucleotide by HPLC on a C 18 inverse silica column.
16. Procédé, suivant l'une quelconque des revendications 13 et 15, caractérisé en ce que pour l'incorporation de la spermine, la déprotection et la purification de l'oligonucléotide, la résine (15 mg) contenant l'oligonucléotide est mise dans 300 μ 1 d'une solution de spermine (1 M) dans le méthanol pendant 3 jours à 55°C, l'oligonucléotide est ensuite purifié par HPLC sur une colonne Millipore Nova Pak avec un gradient croissant en acétonitrile (de 5 % à 40 % en 40 minutes) dans du tampon acétate de triéthylammonium 100 mM pH 6,5, le temps de rétention étant de 27 minutes, ensuite, pour déprotéger le groupement p nitrophényléthyl, l'oligonucléotide purifié est mis dans 500 μ 1 de DBU 0,5 M dans la pyridine pendant 24 heures à 55°C, une extraction chloroforme/eau permet, ensuite, de récupérer l'oligonucléotide dans la phase aqueuse qui est évaporée, puis reprise dans l'acide acétique à 80 % pour déprotéger le groupement 5'-trityl, l'oligonucléotide modifié complètement déprotégé est de nouveau purifié par HPLC (même colonne et gradient que précédemment, temps de rétention de 13 minutes), la structure de l'oligonucléotide étant confirmée par la spectroscopie de masse en électro spray négatif qui donne une masse de 3727 ± 3. 16. Method according to any one of claims 13 and 15, characterized in that for the incorporation of the spermine, the deprotection and the purification of the oligonucleotide, the resin (15 mg) containing the oligonucleotide is placed in 300 μ 1 of a solution of spermine (1 M) in methanol for 3 days at 55°C, the oligonucleotide is then purified by HPLC on a Millipore Nova Pak column with an increasing gradient in acetonitrile (from 5% to 40 % in 40 minutes) in 100 mM triethylammonium acetate buffer pH 6.5, the retention time being 27 minutes, then, to deprotect the p nitrophenylethyl group, the purified oligonucleotide is placed in 500 μ 1 of DBU 0, 5 M in pyridine for 24 hours at 55°C, a chloroform/water extraction then allows the oligonucleotide to be recovered in the aqueous phase which is evaporated, then taken up in 80% acetic acid to deprotect group 5 '-trityl, the completely deprotected modified oligonucleotide is again purified by HPLC (same column and gradient as previously, retention time of 13 minutes), the structure of the oligonucleotide being confirmed by negative electro spray mass spectroscopy which gives a mass of 3727 ± 3.
17. Utilisation des bases suivant l'une quelconque des revendications17. Use of bases according to any one of the claims
1 à 16 pour la reconnaissance d'une séquence-cible d'ADN par synthèse d'un oligomère de séquence complémentaire à celle de l'un des deux brins de la séquence concernée.1 to 16 for the recognition of a DNA target sequence by synthesis of an oligomer with a sequence complementary to that of one of the two strands of the sequence concerned.
18. Utilisation des bases suivant l'une quelconque des revendications 1 à 16 pour la reconnaissance de séquence par formation d'hélices triples selon la technique dite "antigène". - 25 - 19. Utilisation des bases suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour la reconnaissance de séquences d'ARN messager par la technique dite "antisens". 18. Use of the bases according to any one of claims 1 to 16 for sequence recognition by formation of triple helices according to the so-called "antigen" technique. - 25 - 19. Use of the bases according to any one of claims 1 to 5 for the recognition of messenger RNA sequences by the so-called “antisense” technique.
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