WO1996006623A1 - Compositions antithrombotiques et non hemorragiques a base d'heparine, procede pour leur preparation et applications therapeutiques - Google Patents

Compositions antithrombotiques et non hemorragiques a base d'heparine, procede pour leur preparation et applications therapeutiques Download PDF

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WO1996006623A1
WO1996006623A1 PCT/IB1995/000405 IB9500405W WO9606623A1 WO 1996006623 A1 WO1996006623 A1 WO 1996006623A1 IB 9500405 W IB9500405 W IB 9500405W WO 9606623 A1 WO9606623 A1 WO 9606623A1
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heparin
protamine
composition according
activity
fractions
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PCT/IB1995/000405
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Christian Raymond Doutremepuich
François Eugène Pierre Marie SAUDUBRAY
Original Assignee
Debiopharm S.A.
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/727—Heparin; Heparan
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors

Definitions

  • the present invention relates to heparin-based compositions as well as their preparation process and their therapeutic applications.
  • compositions based on heparins neutralized by protamine exhibiting antithrombotic activity but substantially devoid of hemorrhagic and anticoagulant activities.
  • Heparin has been known and used for many decades for the preparation of drugs with antithrombotic and / or anticoagulant activity intended in particular for the preventive and curative treatment of venous and arterial thromboses or also to prevent the coagulation in the extra circulation bodily.
  • heparin which are in particular contraindicated in patients predisposed to haemorrhage, patients suffering from duodenal or gastric ulcers or patients having undergone recent intervention. in which antithrombotic treatment with heparin can cause hemorrhages.
  • the treatment uses protamine sulphate which causes the heparin to neutralize in vivo.
  • the object of the invention is more precisely to eliminate as much as possible the risk of hemorrhage from heparins while retaining their main properties, in particular the antithrombotic activity.
  • the object of the present invention is to provide heparin compositions which have very advantageous pharmacological properties, in particular antithrombotic, substantially equivalent to those of the heparins used hitherto, without having the major drawback which lies in the significant bleeding risk.
  • Another object of the present invention is to provide a process for the preparation of such compositions which is simple to carry out and inexpensive, making it possible moreover to develop their therapeutic applications.
  • the invention also relates to the therapeutic applications of these compositions.
  • heparin compositions according to the invention which exhibit antithrombotic activity and are practically devoid of hemorrhagic activity. These compositions are characterized in that they essentially consist of heparin fractions as obtained by neutralization in vi- heparin by protamine.
  • heparin fraction neutralized by protamine means any fraction originating from a native or already fractionated heparin, or from a synthetic heparin, the haemorrhagic power of which has been neutralized by the action of protamine or any analog or equivalent thereof having a similar ability to reduce hemorrhagic power.
  • compositions according to the invention advantageously consist of heparin fractions as obtained by the in vitro neutralization of an unfractionated heparin or of a low molecular weight heparin with protamine.
  • the composition consists of heparin fractions of which 25% have a molecular weight of less than 2.5 kDa and 40% have a molecular weight of more than 20 kDa,
  • the composition consists only of heparin fractions having a molecular mass of less than 2.5 kDa.
  • the heparin fractions have a spectrum of molecular weights depending on the protamine neutralization modes that are used.
  • compositions according to the invention are substantially free of protamine.
  • the invention also provides a process for the preparation of the above-mentioned compositions, characterized in that it comprises a step of in vitro neutralization of hepatic rine by protamine.
  • the inventors have discovered that, surprisingly, it is possible to neutralize in vitro, in particular with the aid of protamine, the hemorrhagic activity of heparin while preserving its antithrombotic properties.
  • the method according to the invention consists in reacting, in solution, a heparin with protamine, in particular in the form of the protamine salt, according to variable heparin / protamine ratios.
  • a heparin solution is mixed with a protamine salt solution, preferably at room temperature, the mixture obtained is centrifuged and the supernatant is recovered.
  • heparin solution is meant a solution of native or already fractionated heparin, or synthetic heparin.
  • the protamine salt advantageously consists of protamine sulfate.
  • any analog or equivalent of protamine having a similar capacity, neutralizing heparin and therefore reducing hemorrhagic power, can be used.
  • the supernatant can then be lyophilized.
  • the heparin to be treated and the protamine can be used in different reports which essentially lead to the elimination of the risk of haemorrhage linked to heparins.
  • the method comprises the step of neutralizing a heparin with protamine or an equivalent, preferably in heparin / protamine proportions of 2/1 to 1/2.
  • the heparin / protamine ratio is of the order of 1/1.
  • heparin compositions are obtained comprising fractions of which at least 25% have a molecular weight of less than 2.5 kDa and at least 40% have a molecular weight of more than 20 kDa.
  • the heparin / protamine ratio is of the order of 1/2.
  • Heparin compositions are then obtained essentially comprising fractions having a molecular mass of less than 2.5 kDa,
  • heparin compositions free of protamine are obtained.
  • heparin compositions of the invention have made it possible to demonstrate, in a surprising manner, that they are practically devoid of hemorrhagic activity and at the same time retain their antithrombotic property.
  • compositions according to the invention were capable of inhibiting the hydrolytic activity of human leukocyte elastase, more effectively than unfractionated heparin.
  • the elimination of the risk of haemorrhage, in accordance with the invention makes it possible to envisage administration by the parenteral route or by bronchopulmonary aerosol, in the treatment of certain bronchopulmonary conditions which may involve an excess of leukocytic elastase, such as acute respiratory distress syndromes, cystic fibrosis, chronic obstructive pulmonary disease.
  • heparin compositions according to the invention which are stable and non-toxic, can be used for the preparation of medicaments useful in various therapeutic applications. These applications are those of heparin and its conventional derivatives, including cases where heparin is contraindicated because of the risk of bleeding that the patient presents. They can be used in particular for the preparation of medicaments for the treatment and prevention of venous or arterial thromboses or else to prevent activation of coagulation in the extracorporeal circulation.
  • the invention therefore also relates to pharmaceutical compositions comprising an amount therapeutically effective heparin composition according to the invention as described above, in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • They may, for example, be antithrombotic pharmaceutical compositions or else for the inhibition of the hydrolytic activity of human leukocyte elastase.
  • heparin fractions of these compositions can be in the form of a pharmaceutically acceptable salt according to conventional methods.
  • compositions according to the invention are advantageously injectable formulations intended in particular for administration by the parenteral route.
  • formulations suitable for administration by bronchopulmonary route are advantageously provided.
  • FIG. 1 is a comparative graph of the hemorrhagic activity of unfractionated heparin, low molecular weight heparin and non hemorrhagic heparin compositions according to the invention (S1, S2, S3);
  • FIG. 2 is a comparative graph of the antithrombotic activity of unfractionated heparin, low molecular weight heparin and heparin compositions according to the invention (S1, S2, S3).
  • the mixture thus obtained is centrifuged for 10 minutes and the supernatant is recovered which is lyophilized.
  • Example 2 The procedure is as described in Example 1 from 9 ml of a standard heparin solution (i.e. 45,000 IU, 300 mg) and 60 ml of protamine sulfate (i.e. 60,000 UAH). The heparin / protamine ratio is then 1/2, that is to say that 1 mg of heparin is neutralized with 2 mg of protamine sulfate.
  • a standard heparin solution i.e. 45,000 IU, 300 mg
  • protamine sulfate i.e. 60,000 UAH
  • a solution diluted to 1/20 has two absorption peaks at the following wavelengths:
  • each bottle contains 0.7 ml of supernatant solution. 12 identical assays were carried out to verify the reproducibility: the results are given in Table III below:
  • the assay of the proteins in the supernatants S1 and S2, respectively prepared according to Examples 1 and 2, is carried out according to the Pierce method (Pierce laboratory reagent kit).
  • T0 ligation of the vena cava
  • the supernatant S1 has no effect on blood cells.
  • the supernatant S2 obtained by neutralization according to a heparin / protamine ratio of 1/2, does not exert any hemorrhagic activity but has a reduced antithrombotic activity.
  • FIG. 2 shows that the heparin fractions obtained according to the invention exhibit an interesting antithrombotic activity.
  • SI fraction heparin / protamine ratio of 1/1
  • this activity is comparable to that of heparins which are not neutralized in accordance with the invention.
  • results obtained show that, as a preventive measure, SI exerts an antithrombotic activity comparable to that of heparin and LOVENOX, 24 hours after the induction of thrombosis.
  • the excitation time is fixed at 2 minutes and the observation time at 10 minutes.
  • Duration embolization duration between the first and the embolus embolus ernier of detaching the clot.
  • Number of emboli number of emboli coming off the clot.
  • the supernatant S1 (example 1) exerts a significant antithrombotic activity compared to the placebo group, which persists after 90 minutes (TO + 90 min). This activity is more important than that of heparin injected at the same dose, after 30 and 60 minutes (TO + 30 and TO + 60 min).
  • the observation time is fixed at 10 minutes.
  • SI exerts an antithrombotic activity comparable to that of non-neutralized heparin injected at the same dose and reduces the number of embolisms as well as the duration of embolization in a statistically significant manner, b. Study 2
  • T0 + 6h induction of the third arterial thrombosis.
  • the observation time is fixed at 10 minutes.
  • SI exerts an antithrombotic activity comparable to that of heparin which is not neutralized by protamine.
  • the studies described above show that the antithrombotic activity is observed in the three experimental thrombosis models, namely the venous model induced by stasis, the arterial thrombosis model induced by free radicals and the arterial thrombosis model induced by endothelial laser injury.
  • the fraction of heparin obtained from a low molecular weight heparin has a greater antithrombotic activity than that of the same low molecular weight heparin not treated in in vitro by protamine and also greater than that of the fractions obtained from unfractionated heparins and not treated in vitro with protamine, while no longer presenting any risk of haemorrhage.
  • the method according to the invention allows, in a simple and inexpensive manner, practically to suppress the hemorrhagic activity of heparins while retaining their antithrombotic activity.

Abstract

L'invention concerne des compositions d'héparines présentant une activité antithrombotique et pratiquement dépourvues d'activité hémorragique. Le but de l'invention est de supprimer le risque hémorragique des héparines tout en conservant leurs principales propriétés. A cette fin, les compositions de l'invention (S1, S2, S3) sont constituées de fractions d'héparine telles qu'obtenues par la neutralisation in vitro d'une héparine par la protamine. L'invention concerne également un procédé de préparation de ces compositions. Ces compositions sont utiles pour la préparation de médicaments.

Description

COMPOSITIONS ANTITHROMBOTIQUES ET NON HEMORRAGIQUES A BASE D'HEPARINE, PROCEDE POUR LEUR PREPARATION ET APPLICATIONS
THERAPEUTIQUES La présente invention concerne des compositions à base d'héparine ainsi que leur procédé de préparation et leurs applications thérapeutiques.
Elle concerne plus particulièrement des compositions à base d'héparines neutralisées par la protamine, présentant une activité antithrombotique mais sensiblement dépourvues d'activités hémorragique et anticoagulante.
Les héparines sont connues et utilisées depuis de nombreuses décennies pour la préparation de médicaments à activité antithrombotique et/ou anticoagulante destinés en particulier au traitement préventif et curatif des thromboses veineuses et artérielles ou encore pour prévenir l'actication de la coagulation dans les circulations extra-corporelles.
Depuis quelques années, on sait préparer des héparines de bas poids moléculaire, qui présentent toujours une activité antithrombotique mais dont les propriétés anticoagulantes sont réduites.
Néanmoins, qu'il s'agisse d'héparines non fractionnées ou d'héparine de bas poids moléculaire, le risque hémorragique reste la complication majeure des traitements à base d'héparine. De ce fait, il existe une limitation importante à l'utilisation d'héparine qui sont en particulier contre-indiquées chez des patients prédisposés aux hémorragies, les patients souffrant d'ulcères duodé- naux ou gastriques ou encore des patients ayant subi récemment une intervention chirurgicale chez lesquels le traitement antithrombotique par héparine peut entraîner des hémorragies.
Par suite, les propriétés avantageuses des héparines, à savoir leur activité antithrombotique ou anticoagulante, ne peuvent être correctement mises à profit en raison de leurs effets secondaires importants liés à ce risque hémorragique permanent.
Lorsque surviennent des hémorragies au cours des traitements par héparine, le traitement fait appel au sulfate de protamine qui provoque la neutralisation de l'héparine in vivo.
Bien, que la protamine soit ainsi utilisée depuis plusieurs années, on ne connaît pas bien le mécanisme de la neutralisation de l'héparine par la protamine. Une étude relativement récente a simplement montré que les héparines de bas poids moléculaire étaient neutralisées à un degré moindre par rapport aux héparines non fractionnées ("In Vitro Protamine Neutralization Profiles of Héparine Differing in Source and Molecular Weight", SEMINARS IN THROMBOSIS AND IN HEMOSTASIS, vol. 15 N°4, 1989), Le problème que vise à résoudre la présente invention est donc de réduire le risque hémorragique important exposé ci-dessus, limitant l'utilisation thérapeutique des héparines.
Le but de l'invention est plus précisément de supprimer le plus possible le risque hémorragique des héparines tout en conservant leurs principales propriétés, en particulier l'activité antithrombotique.
Aussi, le but de la présente invention est de fournir des compositions d'héparines qui présentent des propriétés pharmacologiques très intéressantes, en particulier antithrombotique, sensiblement équivalentes à celles des héparines utilisées jusqu'alors, sans en présenter l'inconvénient majeur qui réside dans le risque hémorragique important.
Un autre but de la présente invention est encore de fournir un procédé de préparation de telles compositions qui soit simple à mettre en oeuvre et peu coûteux, permettant en outre de développer leurs applications thérapeuti- ques.
L'invention vise également les applications thérapeutiques de ces compositions.
Ces buts sont atteints à l'aide des compositions d'héparines selon l'invention qui présentent une activité antithrombotique et sont pratiquement dépourvues d'activité hémorragique. Ces compositions sont caractérisées par le fait qu'elles sont constituées essentiellement de fractions d'héparine telles qu'obtenues par la neutralisation in vi- tro d'héparine par la protamine.
Par fraction d'héparine neutralisée par la protamine, on entend toute fraction provenant d'une héparine native ou déjà fractionnée, ou d'une héparine de synthèse, dont le pouvoir hémorragique a été neutralisé par l'action de la protamine ou de tout analogue ou équivalent de celle-ci ayant une capacité similaire de réduction du pouvoir hémorragique.
Les compositions selon l'invention sont avantageuse- ment constituées de fractions d'héparine telle qu'obtenues par la neutralisation in vitro d'une héparine non fractionnée ou d'une héparine de bas poids moléculaire, par la protamine.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la composition est constituée de fractions d'héparine dont 25 % présentent une masse moléculaire inférieure à 2,5 kDa et 40 % présentent une masse moléculaire supérieure à 20 kDa,
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la composition est constituée uniquement de fractions d'hépa- rine présentant une masse moléculaire inférieure à 2,5 kDa.
Dans d'autres modes de réalisation les fractions d'héparine ont un spectre de masses moléculaires dépendant des modes de neutralisation par la protamine qu'on utilise.
Les compositions conformes à l'invention sont sensi- blement exemptes de protamine.
L'invention fournit également un procédé pour la préparation des compositions précitées caractérisé par le fait qu'il comprend une étape de neutralisation in vitro d'hépa- rine par la protamine.
Les inventeurs ont découvert que, d'une manière surprenante, on pouvait neutraliser in vitro, notamment à l'aide de la protamine, l'activité hémorragique de l'héparine tout en préservant ses propriétés antithrombotiques.
D'une manière plus précise, le procédé selon l'invention consiste à faire réagir, en solution, une héparine avec la protamine, notamment sous la forme de sel de protamine, selon des rapports héparine/protamine variables.
Selon un mode de réalisation préférentiel de l'invention, on mélange une solution d'héparine avec une solution de sel de protamine, de préférence à la température ambiante, on centrifuge le mélange obtenu et on récupère le surnageant.
Selon l'invention, par solution d'héparine, on entend une solution d'héparine native ou déjà fractionnée, ou d'héparine de synthèse.
Le sel de protamine consiste avantageusement en du sulfate de protamine.
Selon l'invention, on peut utiliser tout analogue ou équivalent de la protamine ayant une capacité similaire, neutralisation de l'héparine et donc de réduction du pouvoir hémorragique.
Le surnageant peut être ensuite lyophilisé.
L'héparine à traiter et la protamine peuvent être utilisées selon différents rapports qui conduisent essentiellement à l'élimination du risque hémorragique lié aux héparines.
Le procédé comprend l'étape de neutralisation d'une héparine par la protamine ou un équivalent, de préférence dans des proportions héparine/protamine de 2/1 à 1/2.
Selon un mode de réalisation de ce procédé, le rapport héparine/protamine est de l'ordre de 1/1. Dans ce cas, on obtient des compositions d'héparine comprenant des fractions dont au moins 25 % présentent une masse moléculaire inférieure à 2,5 kDa et au moins 40 % présentent une masse moléculaire supérieure à 20 kDa.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le rapport héparine/protamine est de l'ordre de 1/2. On obtient alors des compositions d'héparines comprenant essentiellement des fractions présentant une masse moléculaire inférieure à 2,5 kDa,
Selon le procédé conforme à la présente invention, on obtient des compositions d'héparines exemptes de protamine.
L'étude pharmacologique des compositions d'héparine de l'invention a permis de mettre en évidence, d'une manière surprenante, qu'elles sont pratiquement dépourvues d'activité hémorragique et conservent parallèlement leur propriété antithrombotique.
Cette étude pharmacoloqique a également mis en évidence, d'une manière surprenante, que les fractions d'héparines obtenues par neutralisation par la protamine conformément à l'invention, exercent une activité antithrombotique qui croît avec l'administration de doses crois- santés, sans augmentation parallèle de leur activité hémorragique ou anticoagulante.
Un autre protocole expérimental a permis de montrer que les compositions selon l'invention étaient capables d'inhiber l'activité hydrolytique de l'élastase leucocytaire humaine, de manière plus efficace que l'héparine non fractionnée. La suppression du risque hémorragique, conformément à l'invention, permet d'envisager une administration par voie parentérale ou par voie broncho-pulmonaire en aérosol, dans le traitement de certaines affections broncho-pulmonaires pouvant impliquer un excès d'élastase leucocytaire, telles que les syndromes de détresse respiratoire aigϋe, la mucoviscidose, les bronchopneumopathies chroniques obstructives.
Les compositions d'héparine selon l'invention, qui sont stables et non toxiques, peuvent être employées pour la préparation de médicaments utiles dans diverses applications thérapeutiques. Ces applications sont celles de l'héparine et de ses dérivés classiques y compris les cas où l'héparine est contre-indiquée en raison du risque hémorragique que présente le patient. Elles peuvent servir en particulier à la préparation de médicaments pour le traitement et la prévention des thromboses veineuses ou artérielles ou encore pour prévenir l'activation de la coagulation dans la circulation extracorporelle, L'invention est donc également relative à des compositions pharmaceutiques comprenant une quantité thérapeutiquement efficace d'une composition d'héparine selon l'invention telle que décrite précédemment, en combinaison avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Il peut s'agir, par exemple, de compositions pharmaceutiques antithrombotiques ou encore pour l'inhibi- tion de l'activité hydrolytique de l'élastase leucocytaire humaine.
Les fractions d'héparine de ces compositions peuvent être mises sous la forme de sel pharmaceutiquement acceptable selon les procédés classiques.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont avantageusement des formulations injectables destinées en particulier à une administration par voie parentérale.
Pour d'autres applications telles que l'inhibition de l'élastase leucocytaire, on prévoit avantageusement des formulations appropriées à une administration par voie broncho-pulmonaire.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples donnés ci¬- après à titre indicatif et non limitatif, en référence aux dessins annexés dans lesquels ;
- la figure 1 est un graphe comparatif de l'activité hémorragique d'héparine non fractionnée, d'héparine de bas poids moléculaire et non hémorragique des compositions d'héparines selon l'invention (S1, S2, S3) ;
- la figure 2 est un graphe comparatif de l'activité antithrombotique d'héparine non fractionnée, d'héparine de bas poids moléculaire et de compositions d'héparines selon l'invention (S1, S2, S3).
EXEMPLES
Produits utilisés : Héparine standard (LEO), Sulfate de protamine (CHOAY) et Héparine de bas poids moléculaire, "Enoxaparine", commercialisée sous le nom "LOVENOX"
(PHARMUKA).
- EXEMPLE 1 : Préparation du surnageant SI
On prépare 14,4 ml d'une solution d'héparine standard présentant un titre de 72000 UI (480 mg) et 48 ml d'une solution de sulfate de protamine présentant un titre de 48000 UAH. On mélange ces solutions à temparature ambiante. Le rapport héparine/protamine est alors de 1/1, c'est-à-dire qu'on neutralise 1 mg d'héparine par 1 mg de sulfate de protamine.
On centrifuge le mélange ainsi obtenu pendant 10 minutes et on récupère le surnageant qu'on lyophilise.
- EXEMPLE 2 : Préparation du surnageant S2
On procède comme décrit à l'exemple 1 à partir de 9 ml d'une solution d'héparine standard (soit 45000 UI, 300 mg) et de 60 ml de sulfate de protamine (soit 60000 UAH). Le rapport héparine/protamine est alors de 1/2, c'est-à-dire qu'on neutralise 1 mg d'héparine par 2 mg de sulfate de protamine.
- EXEMPLE 3 : Préparation du surnageant S3
On procède comme décrit à l'exemple 1 à partir de
4 ml d'une solution d'héparine de bas poids moléculaire, "Enoxaparine" (LOVENOX), (soit 400 mg) et de 40 ml de sulfate de protamine (soit 40000 UAH), Le rapport hépa- rine/protamine est alors de 1/1, c'est-à-dire qu'on neutralise 1 mg d'héparine de bas poids moléculaire par 1 mg de sulfate de protamine.
CARACTERISATION BIOLOGIQUE
- Distribution des masses moléculaires
TABLEAU I
Surnageant S1 obtenu selon l'exemple 1
- Distribution des masses moléculaires exprimées en pourcentage
Figure imgf000012_0001
TABLEAU II
Surnageant S2 obtenu selon l'exemple 2
- Distribution des masses moléculaires exprimées en pourcentage
Figure imgf000013_0001
- Spectre d'absorption en ultra-violet pour le surnageant S1 (exemple 1)
Une solution diluée au 1/20 présente deux pics d'absorption aux longueurs d'onde suivantes :
212 nm : BO=3,47 et 271,5 nm : DO=2,22
- Titrage du surnageant SI (exemple 1)
Avant lyophilisation du surnageant SI préparé selon l'exemple 1, chaque flacon c1ntient 0,7 ml de solution surnageante. 12 dosages identiques ont été réalisés pour vérifier la reproductibilité : les résultats sont donnés dans le Tableau III ci-dessous :
Figure imgf000014_0001
AZURE A : Méthode de Klein M.D, et al.
A-Xa : Dosage chronométrique de l'héparine (Hépadot Laboratoire Stago)
A-lIa : Méthode amidolytique
- Dosage des protéines
Le dosage des protéines dans les surnageants S1 et S2, respectivement préparés selon les exemples 1 et 2, est effectué selon la méthode de Pierce (Coffret réactif Laboratoire Pierce).
Les résultats sont donnés dans le Tableau IV ci-dessous :
Figure imgf000014_0002
- Composition en électrolytes (mEq/l)
La composition en électrolytes des surnageants S1 et S2 est donnée dans le tableau V ci-après :
Figure imgf000015_0001
Détermination du pH
Figure imgf000015_0002
ETUDE PHARMACOLOGIQUE
A. Etudes expérimentales chez le rat dans un modèle de thrombose veineuse induite par stase et un modèle d'hémorragie provoquée :
Des études ont été menées selon la méthode décrite par C. DOUTREMEPUICH et coll., "Expérimental venous throm- bosis in rats treated with heparin and a low molecular weight heparin fraction", Haemostasis, 13, 109-112 (1983). a. Modèle curatif (injections par voie sous-cutanée deux heures après l'induction de la thrombose).
Deux études ont été réalisées selon le protocole suivant :
T0 : ligature de la veine cave
T0+2H : injection des solutions par voie sous-cutanée TO+5H30 : induction de l'hémorragie
T0+6H : prélèvements (sang et caillot)
Les résultats obtenus à l'issue de la première étude sont rassemblés dans les tableaux VII et VIII ci-dessous :
Figure imgf000016_0002
T.H.P. : Temps d'Hémorragie Provoquée
T.C.K. : Temps de Céphaline Kaolin
T.T.D. : Temps de Thrombine Diluée
* = p<0,05 (test de Mann Whitney)
Figure imgf000016_0001
Cette première étude montre que l'héparine neutralisée in vitro par la protamine dans un rapport héparine/ protamine de 1/1 conduisant au surnageant S1 exerce, à une dose de 2 mg, une activité antithrombotique assez importante qui est comparable à celle de l'héparine non neutralisée et à celle du LOVENOX (héparine de bas poids moléculaire), tandis que l'activité anticoagulante et l'activité hémorragique ne sont que faiblement augmentées.
Le surnageant S1 n'a aucun effet sur les cellules sanguines.
Par ailleurs, le surnageant S2, obtenu par neutralisation selon un rapport héparine/protamine de 1/2, n'exerce aucune activité hémorragique mais possède une activité antithrombotique réduite.
Les résultats de la seconde étude sont donnés dans le tableau IX ci-après :
Figure imgf000017_0001
P.C. : Poids du Caillot expérimental
T.H. P. : Temps d'Hémorragie Provoqué
T.C.K. : Temps de Céphaline-Kaolin
T.T.D. : Temps de Thrombine Diluée
il résulte des résultats obtenus que l'activité antithrombotique des fractions S1, S2 et S3 selon l'invention croît avec des doses administrées croissantes.
Si l'on se réfère aux courbes dose-effet, établies pour des doses allant de 2 mg/kg à 10 mg/kg, on voit, sur la figure 1, que quel que soit le type d'héparine traitée conformément à l'invention, la fraction d'héparine obtenue présente une activité hémorragique similaire à celle du groupe contrôle, même aux doses les plus élevées. L'héparine non fractionnée et l'héparine de bas poids moléculaire (LOVENOX) , non neutralisée par la protamine, selon l'invention, présentent une activité hémorragique considérable par rapport aux fractions d'héparine de l'invention.
La figure 2 montre que les fractions d'héparine ob- tenues selon l'invention présentent une activité antithrombotique intéressante. Dans le cas de la fraction SI (rapport héparine/protamine de 1/1), cette activité est comparable à celle des héparines non neutralisées conformément à l'invention.
b. Modèle préventif (administration par voie souscutanée une heure avant l'induction de la thrombose).
L'étude a été menée avec le surnageant SI (exemple 1) selon le protocole suivant : TO : injection des solutions par voie sous-cutanée TO+1 Heure : induction de la stase
TO+24 Heures : prélèvement (sang et caillot)
Les résultats obtenus sont donnés dans le Tableau X ci-dessous :
Figure imgf000019_0001
T.CK. : Temps de Céphaline Kaolin
T.T.D. : Temps de Thrombine Diluée
Ti : Temps de Titrarine (Laboratoire Stago)
* : p<0,05 (test de Mann Whitney)
Les résultats obtenus montrent, qu'à titre préventif, SI exerce une activité antithrombotique comparable à celle de l'héparine et du LOVENOX, 24 heures après l'induction de la thrombose.
B. Etude expérimentale chez le rat dans un modèle de thrombose induite par génération de radicaux libres
(référence : DOUTREMEPUICH - In prèss - Annales de Cardiologie et Angiologie)
L'étude a été menée avec S1 (exemple 1) selon le protocole suivant :
(TO : injection des solutions par voie sous-cutanée)
TO+25 min : injection de rose bengale à une dose de
5 mg/kg TO+30 min : induction des radicaux libres au niveau de la première artériole par réaction photo-chimique
TO+55 min injection de rose bengale à la même dose TO+60 min induction des radicaux libres au niveau de la deuxième artériole
TO+85 min injection de rose bengale à la même dose TO+90 min induction des radicaux libres au niveau d'une veinule
Après la dernière thrombose, on effectue un prélèvement sanguin par voie intra-cardiaque.
Le temps d'excitation est fixé à 2 minutes et le temps d'observation à 10 minutes.
On obtient les résultats donnés dans le tableau XI ci-dessous :
Figure imgf000020_0001
Durée d'embolisation : durée entre le premier embole et le dernier embole se détachant du caillot.
Nombre d'emboles : nombre d'emboles se détachant du caillot.
Dans ce modèle de thrombose induite par radicaux libres, le surnageant S1 (exemple 1) exerce une activité antithrombotique significative par rapport au groupe placebo, qui persiste après 90 minutes (TO+90 min). Cette activité est plus importante que celle de l'héparine injectée à la même dose, après 30 et 60 minutes (TO+30 et TO+60 min).
C. Etude expérimentale chez le rat dans un modèle de thrombose induite par lésion endothëliale au laser (Réf. : Vesvres, Haemostasis 1993, 23, 8-12)
a. Etude 1
L'étude a été menée selon le protocole suivant :
TO : injection de la substance à tester à une dose de 2 mg/kg par voie sous cutanée
TO+35 min : induction de la thrombose artérielle par rayon laser.
Le temps d'observation est fixé à 10 minutes.
Les résultats obtenus sont donnés dans le Tableau XII ci-dessous :
Figure imgf000021_0001
SI exerce une activité antithrombotique comparable à celle de l'héparine non neutralisée injectée à la même dose et réduit le nombre d'embols ainsi que la durée d'embolisation de manière statistiquement significative, b. Etude 2
L'étude a été menée selon le protocole suivant :
TO : injection des substances à tester à une dose de
2 mg/kg par voie sous-cutanée.
TO+1h : induction de la première thrombose artérielle
T0+3h : induction de la deuxième thrombose artérielle
T0+6h : induction de la troisième thrombose artérielle.
Le temps d'observation est fixé à 10 minutes.
Les résultats obtenus sont donnés dans le Tableau XIII ci-dessous :
Figure imgf000022_0001
SI exerce une activité antithrombotique comparable à celle de l'héparine non neutralisée par la protamine.
En conclusion, les études décrites ci-dessus montrent que l'activité antithrombotique est observée dans les trois modèles de thrombose expérimentale à savoir le modèle veineux induit par stase, le modèle de thrombose artérielle induite par radicaux libres et le modèle de thrombose artérielle induite par lésion endothëliale au laser.
Selon l'invention, la fraction d'héparine obtenue à partir d'une héparine de bas poids moléculaire, l'"Enoxaparine" (LOVENOX), présente une activité antithrombotique plus importante que celle de la même héparine de bas poids moléculaire non traitée in vitro par la protamine et plus importante également que celle des fractions obtenues à partir des héparines non fractionnées et non traitées in vitro par la protamine, tout en ne présentant plus aucun risque hémorragique.
Le procédé selon l'invention permet, d'une manière simple et peu coûteuse, pratiquement de supprimer l'activité hémorragique des héparines tout en conservant leur activité antithrombotique.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition d'héparines présentant une activité antithrombotique et pratiquement dépourvue d'activité hémorragique, caractérisée en ce qu'elle est constituée de fractions d'héparine telle qu'obtenues par la neutralisation in vitro d'une héparine par la protamine.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est constituée de fractions d'héparine telle qu'obtenues par la neutralisation in vitro d'une héparine non fractionnée par la protamine.
3. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est constituée de fractions d'héparine telle qu'obtenues par la neutralisation in vitro d'une héparine de bas poids moléculaire par la protamine.
4. Composition selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est constituée de fractions dont au moins 25 % présentent un poids moléculaire inférieur à 2,5 kDa.
5. Composition selon la revendication 4, caractéri- sée en ce qu'elle est constituée de fractions dont au moins 40 % présentent un poids moléculaire supérieur à 20 kDa.
6. Composition selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle est constituée de fractions de poids moléculaire inférieur à 2,5 kDa.
7. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'une fraction présentant la distribution des masses moléculaires données au Tableau I.
8. Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'une fraction présentant la distribution des masses moléculaires donnée au Tableau II.
9. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est sensiblement exempte de protamine.
10. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée eh ce qu'elle présente des propriétés inhibitrices de l'activité hydrolytique de l'élastase leucocytaire humaine.
11. Procédé de préparation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend la neutralisation in vitro d'une héparine par la protamine.
12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à mélanger une solution d'héparine et une solution d'un sel de protamine, à centrifuger le mélange obtenu et à récupérer le surnageant.
13. Procédé selon l'une des revendications 11 ou 12, caractérisé en ce que le sel de protamine est le sulfate de protamine.
14. Procédé selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que l'héparine et la protamine sont utilisées dans un rapport de 1 pour 1.
15. Procédé selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que l'héparine et la protamine sont utilisées dans un rapport de 1 pour 2.
16. Procédé selon l'une des revendications 11 à 15, caractérisé en ce que l'on neutralise de l'héparine non fractionnée.
17. Procédé selon l'une des revendications 11 à 16, caractérisé en ce que l'on neutralise de l'héparine de bas poids moléculaire.
18. Utilisation d'une composition d'héparine selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 pour la préparation d'un médicament présentant une activité anti- thrombotique et pratiquement dépourvue d'activité hémorragique.
19. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité efficace d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, en combinaison avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
20. Composition pharmaceutique selon la revendication 19, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme d'une solution injectable.
21. Composition pharmaceutique pour l'inhibition de l'activité hydrolytique de l'élastase leucocytaire humaine, caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principe actif, une quantité efficace d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, en combinaison avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
22. Composition pharmaceutique selon la revendication 21, caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme appropriée pour une administration par voie broncho-pulmonaire.
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