WO1996023525A1

WO1996023525A1 - Marqueur de diagnostic

Info

Publication number: WO1996023525A1
Application number: PCT/JP1996/000169
Authority: WO
Inventors: Susumu Ito; Masayuki Nozawa; Masanobu Shiga; Kasumi Sasamoto; Kazuhiro Takesako; Hiroshi Takeuchi
Original assignee: Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.
Priority date: 1995-01-30
Filing date: 1996-01-30
Publication date: 1996-08-08
Also published as: NO973484L; CN1093768C; CN1180316A; EP0800831A1; NO973484D0; DE69632244T2; AU4497096A; EP0800831B1; NO308895B1; US5968479A; EP0800831B9; KR100397020B1; EP0800831A4; DE69632244D1; CA2211470A1; ATE264694T1

Description

明細書診断用マーカ一

技術分野

本発明は診断用マーカーに関する。さらに詳しくは、本発明は、組織の障害性の少な t、近赤外線ある L、は遠赤外線の照射により励起されて蛍光を発する特定の標識用化合物にガン細胞などを特異的に認識する抗体などを結合させた、生体に適用可能な診断用マーカーに関するものである。背景技術

近年、電子内視鏡の普及によって内視鏡診断が容易になり、胃ガンや大腸ガンなどが初期ガンの状態で確実に発見できるようになつている。もっとも、微小ガンの診断に関しては、電子内視鏡と通常内視鏡を用いた場合の診断能はほとんど同程度である。これは電子内視鏡の機能を活かした新しい診断方法が未だ確立されていないことを意味している。通常内視鏡では識別できない程度の微小病変でも、電子内視鏡下に検知し得る標識抗体で微小病変を標識することができれば、コンピュー夕一処理を用いて画像化することにより容易に検出することができる可能性があるが、このような方法は未だ実用化されていない。

電子内視鏡を用 L、た上記のような診断方法を確立するためには、免疫組織化学的染色法により生体組織を直接染色することが必要である。固定化標本の染色法はすでに確立された技術である。しかしながら、非固定化標本の染色法は未だ当業者に利用可能な技術ではない。例えば、非固定化標本の免疫染色法については報告があるが（四国医学雑誌， 29， 180, 1987)、近赤外線を用いた当該領域での切除新鲜標本や生体組織そのものの免疫染色法は未だ報告されていない。

一方、上記の診断方法には電子内視鏡下に検知し得る診断用マーカー（標識化された抗体など）も必要である。紫外線による励起されて紫外 ·可視光の蛍光を発する標識用化合物を抗体に結合した診断用マーカーが知られており、生体外に摘出された組織中に存在するガン細胞やガン組織の検出に汎用されている。しかしながら、紫外線により励起する蛍光性診断用マーカ一を用いる方法は、紫外線により生体組織や DNA の損傷がおきるので生体に適用することはできない。生体に直接適用できる診断用マーカーは未だ知られていない。

インドシアニングリーン（1CG) は赤外線内視鏡下で特異な吸収を示して蛍光を発することが知られている。赤外線内視鏡を用いてィンドシアニングリーンを使用した例が知られているが (Gastroenterological Endoscopy, 34, pp. 2287-2296.

1992 ; 及び Gastrointestinal Endoscopy, 40, pp. 621-2 : 628, 1994八これらはいずれも血管内に ICG を投与したものである。また、一般的に、インドシァニングリ―ンを始めとする蛍光性色素は疎水性が高く、単体で腸管内に投与された場合に速やかに吸収されるので、母核あるいは側鎖部分に親水性のスルホニル基などを導入することにより水溶性を高め、測定効率の向上と吸収後の毒性の問題を回避する試みがなされている。しかしながら、インドシアニングリーンと同程度の蛍光を発する水溶性の標識用化合物は未だ知られていない。

本発明の目的は、免疫組織化学的染色法により生体の組織を直接染色するのに有用な診断用マーカーを提供することにある。本発明の別の目的は、組織の障害性の少ない近赤外線ないし遠赤外線の照射によって蛍光を発し、生体に直接使用可能な診断用マーカーを提供することにある。すなわち、紫外線励起による生体組織や DNA の損傷の心配がなく生体にも適用可能な診断用マーカ—を提供することが本発明の課題である。このような特徴を有し、かつ水溶性に優れた診断用マーカーを提供することも本発明の目的の一つである。

また本発明は、赤外線内視鏡などを用いた準体内的な食道ガン、胃ガン、または大腸ガンなど上皮性組織における悪性新生物や感染症などの早期診断や外科手術時の病巣の特定あるいは診断に有用な、生体に適用可能な診断用マーカ—を提供することを目的としている。また、このような診断用マーカーを用いて、生体組織を免疫組織化学的染色法により直接染色する方法を提供することも本発明の他の目的である。発明の開示

本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力し、インドシアニングリーンの誘導体を種々合成することにより、近赤外線ないし遠赤外線により励起され蛍光を発するインドシアニングリーン誘導体を製造することに成功した。また、本発明者らは、上記のィンドシアニングリ一ン誘導体を標識用化合物として用いて抗ガン抗原抗体等と反応させることにより、生体に直接適用可能な診断用のマーカ一を製造することができること、並びに、そのような診断用マーカーが免疫組織化学的染色法により生体組織を直接染色するのに有用であることを見出した。

さらに、本発明者らは水溶性に優れた診断用マーカーを提供すベく鋭意研究を行つた結果、上記のィンドシァニングリ一ン誘導体のうち、分子内対ィオン（ッビッターイオン）を形成可能な化合物については、対イオンの形成により分子のィォン性が低下して水溶性が損なわれる場合があるが、該誘導体にヨウ化ナトリゥムなどを作用させると分子内で対ィオンが形成されず、分子全体のィォン性が保たれて水溶性が顕著に増大することを見い出した。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。

すなわち本発明は、（a) 検出系、及び（b) 該検出系に結合した下記の式（I ) :

(式中、 R¹及び R²はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、ァリール基、アルコキシ基、又はスルホン酸基を示し； R³はアルキル基、スルホン酸アルキル基又はアミノ置換アルキル基を示し； X " は必要に応じてァニオン種を示し Y は炭素数 1ないし 10のアルキレン基、または酸素原子、窒素原子、及び硫黄原子からなる群から選ばれる 1以上の原子を含む炭素数 1ないし 10のアルキレン基を示す）で示される蛍光性官能基とを含む診断用マーカ一を提供するものである。

また、本発明の別の態様によれば、（a) 検出系、及び（b) 該検出系に結合した下記の式（Π ) ：

(式中、 R⁴及び R⁵はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アルコキシ基、又はスルホネート基を示し； R⁶はアルキレン基を示し； M ⁺ はアル力リ金属イオンを示し； Q ― はハロゲンイオン、過塩素酸イオン、又はチォシアン酸イオンを示し； Y は炭素数 1ないし 10のアルキレン基、または酸素原子、窒素原子、及び硫黄原子からなる群から選ばれる 1以上の原子を含む炭素数 1ないし 10のアルキレン基を示す）で示される蛍光性官能基とを含む診断用マーカーが提供される。

さらに本発明の別の態様によれば、上記の診断用マーカーの製造に有用な化合物として、下記の式（I I I ) ：

(式中、 R¹及び R²はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、ァリール基、アルコキシ基、又はスルホン酸基を示し； R³はアルキル基、スルホン酸アルキル基又はアミノ置換アルキル基を示し； X ― は必要に応じてァニォン種を示し； Z は下記の式：

からなる群から選ばれる基を示し； W 及び Y はそれぞれ独立に炭素数 1ないし 10 のアルキレン基、または酸素原子、窒素原子、及び硫黄原子からなる群から選ばれる 1以上の原子を含む炭素数 1ないし 10のアルキレン基を示す）で示される化合物；並びに、下記の式（V ) ：

(式中、 R⁴及び R⁵はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アルコキシ基、又はスルホネート基を示し； R^Dはアルキレン基を示し； M ⁺ はアル力リ金属イオンを示し； Q 一はハロゲンイオン、過塩素酸イオン、又はチォシアン酸イオンを示し； Z は下記の式：

からなる群から選ばれる基を示し； ' 及び Y はそれぞれ独立に炭素数 1ないし 1 0 のアルキレン基、または酸素原子、窒素原子、及び硫黄原子からなる群から選ばれる 1以上の原子を含む炭素数 1ないし 10のアルキレン基を示す）で示される化合物が提供される。これらの化合物と検出系とを結合させる工程を含む上記診断用マーカ—の製造方法も本発明により提供される。

また、（a) 検出系、及び（b) 該検出系に結合した 600 〜800 nmの波長の励起光を照射することにより 780 nm 以上の波長の蛍光を発する蛍光性官能基とを含む診断用マーカ一が提供される。以上に加えて、上記の各診断用マーカ一の好ましい態様により、蛍光性官能基が検出系に直接結合した上記の各診断用マーカー；蛍光性官能基が検出系にリンカーあるいは蛋白を介して結合した上記の各診断用マーカー；検出系が抗体、核酸、および増幅系物質からなる群から選ばれる上記の各診断用マーカー；抗体として抗ガン抗原抗体を用いる上記の各診断用マーカー；赤外線内視鏡検査または外科手術時の病巣の特定に使用する上記の各診断用マーカー；及び、免疫組織化学的染色法により生体の組織を直接染色するために用いる上記の各診断用マーカ一が提供される。また、上記の各診断用マーカーを有効成分として含む診断薬が提供される。図面の簡単な説明

第 1図は、標識用化合物（化合物 18 ) の赤外線吸収スぺクトルを示す図である。 (A) はヨウ化ナトリウム添加により塩を形成した化合物 18の赤外線吸収スぺクトルであり、（B) は原料として用いたインドシアニングリーン- N- へキサン酸スルホコハク酸ィミドエステル（化合物 17 ) の赤外線吸収スぺクトルである。

第 2図は、標識用化合物である化合物 6と抗 EMA 抗体とを結合することにより得られた本発明の診断用マーカ一（74 ml ) の紫外 '可視吸収スぺクトルを示す図である。

第 3図は、標識用化合物である化合物 18をヒ卜 I gG に結合させた本発明の診断用マーカーの蛍光スぺクトルを示す図である。図中、実線は発光スぺクトル、破線は励起スぺクトルを示す。発明を実施するための最良の形態上記一般式（I ) 及び（π )で示される蛍光性官能基は、母核に結合した- Y-C0-基のカルボ二ル基を介して検出系と結合している。上記一般式（I ) 中、 R¹及び R²はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アルコキシ基、又はスルホン酸基（- S0₃H ) を示す。 R¹及び R²は、それぞれフヱニル基上の任意の位置に置換することができる。アルキル基としては、炭素数 1ないし 6程度の直鎖又は分技の低級アルキル基、好ましくは炭素数 1ないし 4の直鎖又は分枝の低級アルキル基を用いることができる。例えば、メチル基、ェチル基、プロピル基、イソプロピル基、 n-ブチル基、 sec-ブチル基、 tert- ブチル基などが好適である。

R¹及び R²が示すァリール基としては置換又は無置換のフヱニル基、ナフチル基、ピリジル基などを用いることができる。アルコキシ基としては、炭素数 1 ないし 6程度、好ましくは炭素数 1 ないし 4の直鎖又は分枝の低級アルコキシ基を用いることができ、より具体的には、メトキシ基、エトキン基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、 n-ブトキシ基、 sec -ブトキシ基、 tert- ブトキシ基などを用いることが好適である。スルホン酸基としては、遊離形態の -S0_oH基の他、スルホン酸基の塩基付加塩（スルホネート基）、例えば、ナ卜リゥム塩、力リゥム塩などを用いることができる。これらのうち、 R¹及び R²がそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アルコキシ基、又はスルホネート基であることが好ましい。

R^dはアルキル基、スルホン酸アルキル基又はアミノ置換アルキル基を示す。これらの基において、アルキル基としては、例えば上記のものを使用することができる。スルホン酸アルキル基のスルホン酸基あるいはァミノ置換アルキル基のァミノ基は、それぞれアルキル基上のいかなる位置に置換していてもよいが、例えば、アルキル基の末端に置換したものを用いることができる。

スルホン酸基及びアミノ基は、それぞれ塩基付加塩及び酸付加塩を形成していてもよい。例えば、スルホン酸がナトリゥム塩ゃ力リゥム塩を形成したものや、ァミノ基がアンモニゥムハライド等の塩を形成したもの、ァミノ基か 4級化されたものなども好ましい。また、ァミノ基として置換または無置換のァミノ基を用いることができる。スルホン酸アルキル基又はァミノ置換アルキル基の例として、例えば、スルホン酸メチル基（- CH₂S0₃H)、スルホン酸ェチル基、アミノメチル基、ァミノェチル基、メチルアミノェチル基、およびこれらの塩などを挙げることかできる。

式（1 ) で示される蛍光性官能基において、 X ― は必要に応じてハロゲンイオン、酢酸イオン、過塩素酸イオン、炭酸イオンなどのァニオン種を示す。 X ― で示されるこれらのァニオン種は、 Y- CO- 基が置換する母核内の窒素原子上の陽電荷を打ち消し、式 Π ) で示される蛍光性官能基を全体として中性に維持するために作用する。従って、例えば、式（で示される蛍光性官能基中の R¹, ², 及び R³のうちの一つの基がァニオン性の基である場合には、その基の陰電荷が母核内の 4級窒素原子上の陽電荷を打ち消して分子内ッビッター 'イオンが形成されるので、 X —が不要になる場合がある。一方、例えば、 R¹又はのいずれかがスルホン酸基であり、 R³ がァミノ置換アルキル基である場合には、これらの基の間で電荷が釣り合うので、 X " が必要になる場合がある。

上記一般式 Π Ι )で示される蛍光性官能基において、 R⁴及び R³はそれぞれ ¾立に水素原子、アルキル基、アルコキシ基、又はスルホネー卜基を示す。及びは、それぞれフュニル基上の任意の位置に置換することができる。アルキル基及びァルコキシ基としては上記のものを用いることができ、スルホネート基（-so₃—

M " ： M + はアル力リ金属イオンを示し、 Q ― の対イオンである M ^τ とは同一でも異なっていてもよい）としては、例えばナ卜リゥムスルホネー卜基又は力リウムスルホネート基などを用いることができる。

R⁶は直鎖又は分技鎖のアルキレン基を示し、例えば、炭素数 1〜6 程度、好ましくは炭素数 2〜5 の直鎖又は分枝鎖の低級アルキレン基、より好ましくは、トリメチレン基、テ卜ラメチレン基、又はペンタメチレン基を用いることができる。

R⁶に置換する- S0₃_ 基は、該アルキレン基の任意の位置に置換することができる力例えばアルキレン基の末端に置換したものを用いるのが好適である。より具体的にいうと、 R⁶_S0₃— としては、例えば - (CH₀),, _S0₃— (kii 2〜4 の整数を示す）で示される基などが好適である。

一はアルカリ金属ィオンを示す。アルカリ金属イオンとして、好ましくはナトリウムイオン又はカリウムイオンを用いることができる。 Q 一はハロゲンイオン、過塩素酸イオン、又はチォシアン酸イオンを示し、好ましくは、塩素イオン、臭素イオン、又はヨウ素イオンなどを用いることができる。これらのうち、ヨウ素イオンが特に好ましい。いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、上記の蛍光性官能基は、 Y-C0- 基が置換する窒素原子上の陽電荷（上記式中 N⁺ で示す）と R³- S0₃— に由来する陰電荷とを有しているが、 M 十 Q — で示されるアル力リ金属塩が共存すると、窒素原子上の陽電荷（上記式中で示す）と Q— との間、並びに R³- S0₃_ と M¹ との間で、それぞれイオン結合が形成される。この結果、分子内での対ィォン形成が阻止され、分子全体のィォン性が維持されて水溶性が顕著に増大する。

上記一般式（I) 及び（Π)において、 Y は炭素数 1ないし 10の直鎖または分枝のアルキル基、好ましくは炭素数 3〜5 の直鎖若しくは分枝鎖のアルキレン基、より好ましくは、トリメチレン基、テ卜ラメチレン基、又はペンタメチレン基を示す。または、 Y は酸素原子、窒素原子、及び硫黄原子からなる群から選ばれる 1以上の原子を含む炭素数 1ないし 10の直鎖または分枝のアルキル基を示す。 -Y- CO-で示される基としては、例えば、 - CH。- C0-; - (CH₂)₂- CO-； - (CH₀)₃-CO-； - (Cl^^-CO-； -(CHn)_r-C0-; - CH。- CO- NH- (CH₂)₅- CO-； - (CH。）。- CO- NH- (CH₂)_C- CO- ; - (CH₂)₃ - CO -NH- (CH₂) _c -CO-； - (CH₂)₄- CO- NH- (CH₂) _r -CO-； -CHg-CO-NH- (CH₂ ) _c - CO- NH - (CH₂)₂- CO- ; - (CH₀)₄- CO- (N， N'_piperadinyl)-(CH₂)₂- CO (N, N，- piperadinylは、ピぺラジンの 1-位に- 基が置換されており、 4-位に- (CH_Q)₂- Z 基が置換

されていることを示す。以下、同様である。）；または- CH₂- C0_NH-(CH₂)_c-C0- (N, Ν'- piperadinyl)- (CH<0₂- CO-などを利用することができる。

また、 -Y-C0-基のカルボニル基が、さらに炭素数 1〜10の直鎖または分枝のァルキレン基；酸素原子、窒素原子、及び硫黄原子からなる群から選ばれる 1以上の原子を含む炭素数 1〜10の直鎖または分枝のアルキレン基；または - N'H- NH-基などを介して検出系と結合していてもよい。

本発明の診断用マーカ—のうち、式（I) で示される蛍光性官能基を有する診断用マーカーの製造には、上記の式（ΙΠ) の化合物を標識用化合物として用いるのか好適である。また、式（Π)で示される蛍光性官能基を有する本発明の診断用マーカの製造には、下記の式（V) の標識用化合物を用いるのが好適である。

上記一般式（III) 及び（V) の化合物において、 Y- CO- Z で示される基として、例えば、 - CH₂- CO- Z; - (CH₂)り- CO- Z; - (CH₂)₃- CO-Z; - (CHり）₄- CO- Z; -(CH )--C0- Z; - CH₂-C0- NH- (CH₂)₅- CO- Z; - (CH₂)₂- CO- NH-(CH₂)₅- CO- Z : -(CH^g-CO-NH-CCHg) ₅ - CO- Z; - (CH₂)₄- CO-NH- (CH₂)₅- CO- Z; - CH₂- CO- NH- (CH_o)_-C0- NH- (CH₂)₂- CO - Z ; -(CH₂)₄ - CO- (N， N'- piperadinyl) -（CH₂)₂- Z;または- CH₂ - CO-NH- (CH₂)₅- CO_(N, N'- piperadinyl)- (CH₂)₀- Zなどを利用することができる。

Z で示される基において、》' としては上記 Y- C0-Zの例示中の Y に相当する基を好適に用いることができる。また、 N-スルホサクシィミジルォキシ基のスルホン酸基の対イオンの M⁺ と式（V) の標識用化合物中の Q— の対イオンのとは同一でも異なっていてもよいが、両者がナトリウムイオンであることが好ましい。上記の標識用化合物のうち式 (V) で示される化合物は、例えば、式 (V) で示される化合物において M + X ― で示されるアルカリ金属塩が存在しない対イオン型の化合物を製造した後、該化合物をジメチルスルホキシド又はジメチルホルムアミドなどの溶媒に高濃度で溶解し、その溶液にアル力リ金属塩を添加することにより容易に製造することができる。

なお、本発明の診断用マーカーの製造に好適に使用可能な本発明の化合物の製造例を実施例に具体的に説明したが、当業者には、この実施例を参照することにより、出発原料、試薬、反応条件などに適宜の修飾 ·改変を加えて本発明の化合物を容易に製造できることが理解されよう。

Z として N-サクシィミジルォキシ基および N-スルホサクシィミジルォキシ基を用いる場合、これらの基は、 Z が結合するカルボニル基とともに反応性の活性エステルを形成するので、検出系に含まれるアミノ基（H₂N- R)は、該活性エステル中の Z と置換して -Y- CO- NH- R を形成する。また、 Z として 2- (N- マレイミド） -アルキル基を用いる場合、検出系に含まれるチオール基（HS-R)が反応して、 - Y-C0-アルキル- S- Rが形成される。さらに、 Z が -NH- NH₂ である場合には、検出系に含まれる還元糖末端のアルデヒド基（0HC- R) が反応して - Y- CO- NH-NH- CO- Rが形成される。従って、標識用化合物と検出系を反応させることにより、式（111) 又は（V) で示される標識用化合物の母核、及び母核に結合しリンカ—部分に相当する- Y- CO - 部が、蛍光性の官能基として本発明の診断用マーカー中に保存される。もっとも、このような化学構造を有する本発明の診断用マ一カーは、上記の方法によって製造されたものに限定されることはなく、いかなる方法により製造されたものも本発明の範囲に包含されることはいうまでもない。

なお、上記の式（I ) 及び（I I )で示される蛍光性官能基、式（I I I ) 及び（V) で示される化合物、並びに実施例中のスキームに記載された化合物においては、便宜上、窒素原子上の陽電荷（上記式中 N⁺ で示す）を母核内の一の窒素原子上に固定して記載したが、共役二重結合を介して陽電荷がもう一つの窒素原子に移動可能であることは当業者に容易に理解される。従って、このような共役に基づく互変異性体はすべて本発明の範囲に包含されることはいうまでもない。

上記の蛍光性官能基と結合すべき検出系としては、ガンに特異性の高い抗体など各種の抗原を認識する抗体、プローブとして使用可能な核酸、あるいはビォチンーアビジンなどの増幅系に用いられる増幅系物質などを用いることができる。抗体としては、例えば、ガン細胞やガン組織、好ましくは初期ガン細胞や初期ガン組織に特異的に結合する抗ガン抗原抗体を用いることができる。例えば、 CEA, AFP, CA19-9, NSE, DU-PAN-2, CA50, SPan-1, CA72- 4, CA125, HCG, p53, STN (シァリル Tn抗原)， c-erbB-2 蛋白に特異的に反応する胃に関する抗踵瘍抗体の他、食道ガン、大腸ガン、直腸ガン、皮膚ガン、子宮ガン等の腫瘍抗原に特異的に反応する抗腫瘍抗体などが利用可能である。また、抗病原体蛋白抗体を用いてもよい。核酸としては、特定の遺伝子ないし病原体遺伝子に対するプローブとして使用可能な核酸を用いることができる。

上記の抗体や核酸を検出系として用いた場合、本発明の診断用マーカーに含まれる上記検出系はガン抗原やガン遺伝子などに特異的に結合するので、ガン細胞やガン組織などの病巣が本発明の診断用マーカーにより免疫的に染色される。その後、赤外線レーザーなどを用いて近赤外線ないし遠赤外線を照射することにより蛍光を発する病巣を確認することかできる。

本発明の診断用マーカーの別の態様は、蛍光性官能基が検出系であるアビジンまたはピオチンなどの増幅系物質に導入されたものである。例えば、従来汎用のビォチン標識化抗ガン抗原抗体などを生体に適用することにより、抗ガン抗原抗体とビォチン標識化抗体を結合させて標識を行うことができる。そのような標識を行った後、ァビジンを検出系として含む本発明の診断用マーカ一をビォチン標識化抗体に結合させることにより、ビォチン標識化抗体による標識を本発明の診断用マーカーにより増幅することができ、赤外線レーザーなどにより初期ガンを検出することが可能である。増幅系物質としては、上記のような標識の増幅を可能にするものならばいかなるものを用いてもよい。

さらに、上記の抗体又は核酸に上記の増幅系物質を結合したものを、本発明の診断用マーカーの検出系として用いてもよい。例えば、抗ガン抗原抗体にァビジンを結合させた抗体を本発明の診断用マーカ一の検出系として用いることができる。あるいは、本発明の診断用マーカーの検出系として、二次抗体を用いることも可能である。上記の説明した検出系は例示のためのものであり、本発明の診断用マーカーに用いることができる検出系は上記のものに限定されることはない。検査 ·診断の目的となる標的細胞や標的組織に実質的に特異的に結合する性質を有するものならば、いかなるものを検出系として用いてもよい。

本発明の診断用マーカーは、上記のような蛍光性官能基と検出系とが直接あるいはリンカーを介して結合したものに限定されることはなく、例えばアルブミン等の蛋白に蛍光性官能基と検出系とを導入することにより、アルブミン等の蛋白を介して蛍光性官能基と検出系を結合してもよい。アルブミン等の蛋白には、上記の蛍光性官能基を 1または 2以上、好ましくは約 10個以上導入することができ、抗体などの検出系の導入も容易なので、このような蛋白を用いた診断用マーカーは本発明の好ましい態様である。

さらに、本発明の別の態様に係る診断用マーカーは、 600 〜800 ηιτ)の波長の励起光を照射することにより 780 nm 以上、好ましくは 780〜840 nm以上の波長の蛍光を発する蛍光性官能基が結合した検出系からなるものである。このような蛍光性官能基としては、上記の式（I ) 及び式（I I ) 由来のものの他、 600 〜800 nmの波長の励起光を照射することにより 780 nm以上の波長の蛍光を発するものならば、いかなるものを用いてもよい。このような蛍光性官能基を導入するための化合物は、診断用マ一カーの使用目的や使用する励起光の種類などに応じて、当業者により適宜選択可能である。

このような蛍光性官能基を検出系に結合するために、例えば、シァニン系、フタロシアニン系、ジチオールニッケル錯体系、ナフ卜キノン ' アントラキノン系、インドフヱノール系、ァゾ系などの近赤外線吸収性の化合物を用いることができる。これらの化合物を直接あるいはリンカ一を介して検出系に結合した場合、化合物の吸収波長が長波長側に移動することがあるので、蛍光性官能基の導入に用いる化合物の励起光の波長は 600 nmを下回っても差し支えない。また、蛍光性官能基を検出系に導入するために、使用する上記化合物が上記一般式（I I I ) 又は（V) において Z で示される基を有していることが好ましい。このような基が存在しない場合には、当業者に利用可能なリンカーを介して蛍光性官能基と検出系を結合することができる。

本発明により提供される診断薬は、上記の診断用マーカ—を有効成分として含むことを特徴としている。本発明の診断薬は、近赤外線ないし遠赤外線により励起することかでき、診断にあたり生体組織や DNA の損傷を惹起することがないので有用である。また、本発明の診断薬は極めて水溶性に優れているという特徴を有している。本発明の診断薬において、 780 nmの励起光を照射した場合に 820 nm 程度より長波長の蛍光を発する診断用マーカーを含む診断薬は特に好ましい。なお、本発明の診断薬は、 1種あるいはそれ以上の診断用マーカーを含んでいてもよい。

本発明の診断薬は、例えば、上記の診断用マーカ—を種々の緩衝液などの水性媒体、好ましくは、生理食塩水ゃリン酸緩衝液などの緩衝液に溶解した溶液剤の形態、あるいは診断 ·検査に際して用時に生理食塩水ゃリン酸緩衝液などの緩衝液を添加して溶解できる微粒子状粉末や凍結乾燥粉末形態の固形剤などとして提供されるが、診断薬の形態は上記のものに限定されることはなく、当業者が使用目的などに応じて適宜選択可能である。

本発明の診断薬を製造するには、薬理学的、製剤学的に許容しうる添加物として、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング斉 IJ、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、 pH調節剤、安定化斉 lj、噴射剤、及び粘着剤等を用いることができる。例えば、ブドウ糖、乳糖、 D- マンニト一ル、デンプン、又は結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、デンプン、又はカルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードフアット等の基剤；ブドゥ糖、塩化ナトリウム、 D-マンニトール、グリセリン等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等の pH調節剤；ビタミン A、ビタミン E、コェンザィム Qなど安定化に寄与しうる薬剤等の製剤用添加物を添加してもよい。

本発明の診断用マーカ—を含む診断薬の使用方法について、例えば、赤外線内視鏡を用いた検査方法について説明すると、病巣の存在が疑われる組織に対して内視鏡的に上記診断薬（濃度 0. 1〜し 000 mg ml 程度のもの）を噴霧あるいは塗布して病変部を染色し、適宜洗浄を行って余分な診断薬を組織から除去した後、近赤外線ないし遠赤外線、より具体的には、例えば 600〜800 nm、好ましくは 780 nm程度の波長のレーザ一励起光を照射することにより、蛍光を発する病巣部を検出することができる。本発明の診断用マーカーは生体に直接適用できる点に特徴かあるが、本発明の診断用マ一力一の使用態様は生体に適用するものに限定されることはなく、パラフィン固定化標本などの固定化標本に対して適用可能であることは言うまでもない。

蛍光の検出には、例えば、赤外線内視鏡あるいは赤外線顕微鏡などの手段を用いることができ、例えば、透過特性を合わせたフィルタ—、具体的には、励起光遮断特性を有するフィルターと蛍光検出用フィルターを 1枚あるいは 2枚以上を組み合わせて用いることができる。本発明の診断用マーカーを生体に適用して内視鏡検査を行う際には、内視鏡としては倍率が 10〜1， 000 程度のものを用いることができ、例えば、顕微鏡レベルの倍率を有する赤外線内視鏡などは用いることが好ましい。また、内視鏡には、本発明の診断薬の噴霧あるいは塗布手段と、洗浄手段とが設けられていることが好ましい。

生体外に摘出した組織や標本などに本発明の診断用マーカーを適用する場合には、蛍光の検出に赤外線顕微鏡を用いることができる。また、通常光下にプレバ' ラートを観察して染色部位を確認した後に、暗室内で赤外線光源下に赤外線フィルムで撮影を行う力、、ビデオフィル厶に収録してコンビューターによる画像解析を行うことも可能である。実施例

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されることはない。

例 1 ：標識用化合物の製造

以下のスキームに従って、式（1 Π ) の化合物を本発明の診断用マーカーの製造に用いる標識用化合物として製造した。なお、以下の製造例における化合物番号はスキーム中の化合物番号に対応している。

化合物 1 (5g, 23. 9 ramol，第一化学薬品株式会社より入手したもの） /ァセト二トリル 100 ml にヨウ化工タン（2. 84 ml, 35. 5 mmol )を加えて 5時間還流した _c 反応液を減圧下濃縮し、残渣にエーテル 200 ml を加えて結晶化させた後、得られた結晶を濾過してエーテルで洗浄した後、減圧下に乾燥して化合物 2の淡赤褐色粉末を得た。収量 6.83 g (収率 78.2 ¾)。

化合物 1 (5g， 23.9 mmol)/DMF 100 mlに 6- プロモカブロン酸ェチルエステル（6.32 ml, 35.5 mmol)を加えて 80 てで 16 時間加熱した。反応液を減圧下に濃縮し、残渣にエーテル 200 ml を加えて結晶化した後、得られた結晶を濾過してエーテルで洗浄し、減圧下で乾燥した。 1 M 水酸化ナトリウム水溶液 Zメタノール = 1 Z 1混合溶液 30 mlを加えて室温で 2時間攪拌した。メタノールを減圧留去し、水溶液を 4 M塩酸水溶液で中和したのち、クロ口ホルムで 3回洗浄した。水溶液を減圧下に濃縮し、化合物 3の赤色固体を得た。収量 5.75 g (収率 74.4 ¾)。

化合物 2 (5g, 13.7 mmol)とグルタコンアルデヒドジァニル塩酸塩（3.90 g, 13.7 mmol)を無水酢酸 50 mlに懸濁し、 100 てで 1.5時間加熱した。赤色溶液を水 300 ml に注ぎ、生じた黒赤色固体を濾取した。水で洗浄したのち減圧下で乾燥して化合物 4の黒赤色粉末を得た。収量 6.02 g (収率 101 %) 。

化合物 4 (220 mg, 0.505 mmol) と化合物 3 (164 mg, 0.507 mmol) をピリジン 3 ml に溶解し、 50°Cで 1時間搜拌した。反応混合物を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラム（溶媒： 1〜20%メタノール Zクロ口ホルム）で精製して化合物 5の黒緑色固体を得た。収量 49 mg (収率 15.5 ¾)。

化合物 5 (40 mg, 64 ^mol)/DMF 1 mlに N- ヒドロキシ無水こはく酸（8.8 mg, 76/ mol)と N, N '-ジシクロへキシルカルポジイミド（DCC, 26.4 mg, 0.128 mmol) を加え 4 °Cでー晚反応させた後、反応液にエーテル 10 mlを加え、生じた残渣をさらにエーテルで 3回洗浄した。この固体をクロ口ホルム 400 1 に溶解し、 0.1 塩酸水溶液 200 / 1 を加えて攪拌した後、クロ口ホルム相を分離し、 3回水洗した。クロ口ホルム溶液を減圧下に濃縮して化合物 6 〔式（111) の標識用化合物：の黒緑色固体を得た。収量 38 mg (収率 78.5 )。 MS (FAB) m e=720(M⁺ ) ；蛍光スペクトル：ス ,=769 nm, λ _pm=820 nm (10¾ DMSO 水）

し Gill

化合物 5 (20 mg, 32 /zmol)/DMF 1 mlに N- ヒドロキシ無水こはく酸スルホン酸ナトリウム（8.3 mg， 38〃mol)と N, Ν'-ジシクロへキシルカルポジイミド（13. 2 mg, 64 mol)を加えて 4 °Cでー晚反応させた後に濾過した。濾液にエーテル 10 mlを加え、生じた残渣を更にエーテルで 3回洗浄した。この固体を DMF 400 a 1 に溶解し、 0.1 M 塩酸水溶液 200 il を加えて攪拌した後、クロ口ホルム相を分離して 3回水洗した。クロ口ホルム溶液を減圧下に濃縮して化合物 7 〔式（III) の標識用化合物〕の黑緑色固体を得た。収量 17 mg (収率 66.4 ¾)。 MS (FAB) m e=822 (M+Na) ；蛍光スぺクトル：ス _pv=769 nm, λ _pm=820 nm (10¾ DMSO 水）

し入 Clll

化合物 5 (20 rag, 32 //moD/DMF 0.5 mlに N- (2 -（Ν'-マレイミド）ェチル）ピぺラジン二塩酸塩（ΡΕΜ, 4.4 mg, 38 mol)とトリエチルァミン（TEA, 20 fil, 0.146 麵 ol)、及び DCC (10.2 mg, 49 mol)を加えて 4 °Cでー晚反応させた後、反応液にエーテル 10 mlを加え、生じた残渣を更にエーテルで 3回洗浄した。この固体をクロ口ホルム 400 : I に溶解し、 0.1 M 塩酸水溶液 200 1 を加えて攪拌した後、クロ口ホルム相を分離して 3回水洗した。クロ口ホルム溶液を減圧下に濃縮して化合物 8 〔式（III) の標識用化合物〕の黒緑色固体を得た。収量 20 mg (収率 70.5 ¾)。 MS (FAB) m e = 814(M⁺ ) ；蛍光スぺクトル：ス。、

A,.=773 nm, λし Hi -821 nm (10¾ DMSO 水）

例 2 ：標識用化合物の製造

化合物 6 (20 mg, 26.4 zmoD/DMF 0.5 mlにヒドラジン一塩酸塩（9.0 mg, 0.131 mmol) を加えて室温で一晩反応させた。反応液を濾過し、濾液を減圧濃縮した後、残渣をクロ口ホルム 0.5 ml に溶解し、クロ口ホルム溶液を 3回水洗した。クロ口ホルム相を減圧下に濃縮して、化合物 9の黒緑色固体を得た。収量 16 mg

(収率 90.0 ¾)。 MS (FAB) m e = 637(M⁺ ) ；蛍光スぺクトル：ス。

し入_v=771 nm, λ _pm

し ill

=820 nm (10¾ DMSO 水.）

化合物 10 (5.0 g, 15.1 mmol) とグルタコンアルデヒドジァニル塩酸塩（4.40 g, 15.1 mmol)を無水酢酸 20 mlと酢酸 300 ml の混合溶液に懸濁し、還流温度で 5時間加熱した。赤色溶液を減圧濃縮し、得られた残渣に酢酸ェチルと水の混合溶液 200 ml を加えて懸濁させ、黒赤色固体を濾取した。水で洗浄した後、減圧下に乾燥し、化合物 11の黒赤色粉末を得た。収量 5.33 g (収率 65.2 ¾)。

化合物 11 (167 mg, 0.308 mmol) と化合物 3 (100 mg, 0.309 mmol) をピリジン 3 ml に溶解し、 50Cで 1時間攪拌した。反応混合物を減圧下に濃縮し、得られた残渣を水 10 mlに溶解して溶液の pH を 3に合わせた後、セフアデックス LH20 カラム（溶媒：水）で精製して、化合物 12の黒緑色固体を得た。収量 51 mg (収率 23.1 ¾)。化合物 12 (30 mg, 41.8 ^mol)/ 50 v v % THF 水溶液 1 ml に N- ヒドロキシ無水こはく酸スルホン酸ナトリウム（16.8 mg, 77.4 mol)と Ν,Ν'-ジシクロへキシルカルボジィミド（25.8 mg， 0.125 ramol)を加えて 4 °Cでー晚反応させた後に濾.過し、擄、液を 20 °C以下で減圧下濃縮した。残渣に酢酸ェチル 10 mlを加え、生じた結晶を更にエーテルで 3回洗浄した。この結晶を水 200^1 に溶解し、セファデックス LH20 カラム（溶媒：水）で精製して、化合物 13 〔式 (ΠΙ) の標識用化合物〕の黒緑色固体を得た。収量 34 mg (収率 88.8 )。 MS (FAB) m e = 892(M" )

；蛍光スぺクトル： λ_ργ=771 ntn, λ = nm ( 水）

例 3 ：標識用化合物の製造

以下のスキームに従って本発明の診断用マーカーの製造に用 L、る式（V) の標識用化合物を製造した。なお、以下の製造例における化合物番号はスキーム中の化合物番号に対応している。

化合物 18 化合物 14 (5.0 g, 14.5 mraol) とグルタコンアルデヒドジァニル塩酸塩（4.23 g, 14.5 mmol)を無水酢酸 20 mlと酢酸 300 ml の混合溶液に懸濁し、還流温度で 5時間加熱した。赤色溶液を減圧濃縮し、得られた残渣に酢酸ェチルと水の混合溶液 200 ml を加えて懸濁させ、黒赤色固体を濾取した。水で洗浄した後、減圧下に乾燥し、化合物 15の黒赤色粉末を得た。収量 5. 20 g (収率 66. 1 ¾)。

化合物 15 (300 mg, 0. 553 ramol) と化合物 3 ( 179 mg, 0. 553 mmol をピリジン 5 ml に溶解し、 50°Cで 1時間撹拌した。反応混合物を減圧下に濃縮し、得られた残渣を水 10 mlに溶解して溶液の pH を 3に合わせた後、セフアデックス LH20 カラム（溶媒：メタノール）で精製して、化合物 16の黒綠色固体を得た。収量 105 rag (収率 25. 9 ¾)。

化合物 16 ( 106 mg, 0. 145 mmol ) / 50 v v ¾ THF 水溶液 3 ml に N- ヒドロキシ無水こはく酸スルホン酸ナトリウム（65. 2 mg， 0. 287 mmol )と Ν, Ν ' -ジシクロへキシルカルボジィミド（129 mg, 0. 596 mmol) を加えて 4 °Cでー晚反応させた後に濾過し、濾液を 20 °C以下で減圧下濃縮した。残渣に酢酸ェチル 10 mlを加え、生じた結晶を更にエーテルで 3回洗浄し、化合物 17の黒緑色固体を得た。収量 110 mg (収率 80. 7¾) 。 MS (FAB) m e =906 (M— ) ；蛍光スぺクトル：ス。 _v=768 nm,

レ λ

A _e_=807 nm (水）

上記の化合物 17 (100 mg, 0. 11 mmol)をメタノール 2 ml に溶かし、ヨウ化ナトリウム 1 g (6. 7 mmol) のメタノール 5 ml 溶液を加えた。メタノール溶液を 1 :2 に減圧濃縮し 4°Cで一夜冷却させた後、析出結晶を濾取した。得られた緑色結晶を減圧デシケーターで乾燥して化合物 18 〔式（V) の標識用化合物〕を得た（85 mg, 収率 72¾) 。ヨウ化ナトリウムの塩形成前（対イオン型）及び塩形成後での水溶性データおよび赤外線吸収スペクトルデータ（IR)を測定した。また、ヨウ素含量をシエー二ガー法より求めた。

ヨウ化ナトリゥムを塩として取り込んだ化合物 18と原料として用いた対イオン型のインドシアニングリーン N-へキサン酸スルホコハク酸イミドエステル（化合物 17 ) とでは、赤外吸収スぺクトルが変化しており、対イオン型化合物 17において観測された 2360 及び 1740 cnf ¹の吸収が化合物 18では消失していた（図 1参照：（a ) は化合物 18、 (b ) は化合物 17、すなわち塩形成前のものを示す）。これらの結果から、分子内対ィオンを形成している場合とヨウ化ナ卜リゥムの複塩を形成した場合とでは、結晶構造が変化していることが明らかである。例 4 ：標識用化合物の製造

例 3の方法に準じてィンドシアニングリーン- N- ブタン酸スルホコハク酸ィミドエステル（化合物 19 ) を製造した。この化合物 19 (150 mg, 0. 17 mmol)をメタノ一ル 3 ml に溶かし、ヨウ化ナトリウム 1. 5 g ( 10 mmol)のメタノール 8 ml 溶液を加えた。メタノールを 1 2 に減圧濃縮し 4°Cで一夜冷却させた後、析出結晶を濾取した。得られた緑色結晶を減圧デシケーターで乾燥し、化合物 20 〔式（V ) の標識用化合物〕を得た（117 mg, 収率 66¾) 。ヨウ化ナトリゥムの塩形成前後での水溶性データ及び赤外線吸収スぺクトルデータ（1R)を測定した。また、ヨウ素含量をシヱ一二ガー法より求めた。

例 5 ：標識用化合物の製造

例 3の方法に準じてィンドシアニングリ一ン- N- へキサン酸スルホコハク酸ィミドエステル（化合物 21 ) を製造した。この化合物 21 ( 100 mg, 0. 1 1 mmol )をメタノール 2 ml に溶かし、過塩素酸ナトリウム 0· 3 g (2. 5 ramol) のメタノール 20 ml 溶液を加えた。メタノールを 1 4 に減圧濃縮し 4°Cで一夜冷却させた後、析出結晶を濾取した。得られた緑色結晶を減圧デシケーターで乾燥して化合物 22 〔式 (V) の標識用化合物〕 23 mg を得た（収率 21%) 。過塩素酸ナトリウムの塩形成前後での水溶性データおよび I R を測定した。

表 1 標識用化合物対イオン型複塩形成型

例 3 化合物 17 化合物 18

水溶性： 1 mg/10 ml 以上 1 mg/0. 8 ml

IR (cm- ¹ ) : 2360, 1740 左記吸収が消失

I 含量： 12. 3% 例 4 化合物 19 化合物 20

水溶性： 1 mg/10 ml 以上 1 mg/0. 9 ml

IR (cm" ¹ ) : 2370, 1790 左記吸収が消失

I 含量： 13. 5¾ 例 5 化合物 21 化合物 22

水溶性： 1 mg/10 ml 以上 1 mg/5 ml IR (cm" ¹ ) : 2370, 1790 左記吸収が消失

化合物 1 8

化合物 20

化合物 22 例 6 ：標識用化合物の製造

化合物 13を例 2の方法に従ってヨウ化ナトリゥムのメタノ一ル溶液で処理して化合物 23を得た。原料として用いた化合物 13の赤外線吸収スぺクトルと標識用化合物 23の赤外線吸収スぺクトルを比較したところ、化合物 13において観測された 2360 及び 1740 cm—¹の吸収が化合物 23においては観測されなかった。

例 7 ：診断用マーカーの製造

(a) 抗体の精製 ■

抗 EMA (Epit erial Membrane Antigen) 抗体を含む培養上清液 (ダコ社製, 613 ) から MabTrap G I 1 (フアルマシア社製を用いて抗 EMA モノクローナル抗体を以下のようにして精製した。 4 mlの培養上清に結合緩衝液 4 mlを加え、予め結合緩衝液で平衡化した MabTrap GI Iカラムに付した。結合緩衝液 5 mlで洗浄した後、溶出緩衝液 3 mlを加えて ί§出緩衝液を 0. 5 ml毎に分取した。分光光度計を用いて 280 nm の吸光度が 0. 05 以上の分画を精製 I gG分画として集め、 PD- 10 カラム（フアルマシア社製）を用いて 0. 1 Mリン酸緩衝液（pH 7. 5) に緩衝液交換を行い、 SDS -PAGE (第一化学薬品株式会社製）により精製度を確認した。培養上清 4 ml から精製抗 EMAモノクローナル抗体 725 g を得た。

(b) 抗体と標識用化合物の結合

上記の精製抗体 500 g を含有する 100 mM リン酸緩衝液 0. 5 ml に ICG- OSu

(上記化合物 6 ) の DMF 溶液 0. 125 ml (0. 8 mg ml ) を加え、 30°Cで 30分間静置した。この反応混合液を予め同じ反応緩衝液で平衡化した PD- 10 カラムに付し、未反応の ICG- OSu を分離した。さらに PD- 10 カラムを用いて蛋白分画の緩衝液を 0. 1 M リン酸緩衝液— 0. 05 %アジ化ナトリウム（pH 7. 4)に交換し、標識用化合物（化合物 6 ) に抗 EMA 抗体が結合した本発明の診断用マ—カー 74 蛋白 mlを得た。その後、保存にあたって 0. 1 %の BSA を添加した。紫外 '可視吸収スぺクトルを図 2 に示す。

上記のスぺクトルの測定条件は以下のとおりである。測定機器：日立 U- 3200 分光光度計；測定溶媒： 100 mM リン酸緩衝液 (pH 7. 4)， 0. 05¾ アジ化ナトリウム；スキャン速度： 300. 0 nm min。その後、保存にあたって 0. 1 ¾の BSA を添加した。 BCA プロテイン ·アツセィ試薬（ピアス社製）により得た抗体濃度と標識用化合物の DMS0中での分子吸光係数とから求めた標識用化合物に対する抗体の結合数は、約 12 raol標識用化合物/ mol 抗体であった。

例 8 ：診断用マ一カーの製造

化合物 18 ( 1 mg) を水 0. 94 mlに溶解して 1 mM 溶液とした。ヒ卜 I gG 1 mg を pH 8. 5 の 50 mM 炭酸ナトリウムバッファー 1 ml に溶解し、この溶液に化合物 18を含む上記の溶液 0. 2 ml を加えて 30 てで 1時間反応させた。反応液をセファデックス G-25 カラムに付して本発明の診断用マーカーを分離した。分離用のパッファーとしては 50 mMリン酸バッファー（pH 7. 4)を用いた。未反応の化合物 18はセフアデックス . ゲルの上端に残り、診断用マーカーとの分離は良好であつたつ得られた診断用マーカ一を凍結乾燥して - 20 °Cで冷凍保存した。診断用マーカ一 1 mg をとり 100 mlの 50 mM リン酸パツファー（pH 7.4) に溶解して蛍光スぺクトルを測定した結果を図 3に示す。

例 9 ：診断用マーカーの製造

例 7で得た精製抗体 500 g を含有する 100 mM リン酸緩衝液 0.5 ml に化合物 18の DMF 溶液 0.125 ml (0.8 mg ml) を加え、 30°Cで 30分間静置した。この反応混合液を予め同じ反応緩衝液で平衡化した PD- 10 カラムに付し、未反応の化合物 18 を分離した。さらに PD-10 カラムを用いて蛋白分画の緩衝液を 0.1 M リン酸緩衝液一 0.05 ¾アジ化ナトリウム（pH 7.4)に交換し、化合物 18が抗 EMA 抗体に結合した本発明の診断用マーカー 74 蛋白/ mlを得た。その後、保存にあたって 0.1 ¾の BSA を添加した。

例 10：標識用化合物と蛋白の結合

BSA (和光純薬工業製） 10 mg (0.151/ raol)を HEPES緩衝液 3.0 ml に溶解して BSA 溶液とした。標識用化合物（化合物 6 ) 2.0 mg(2.64 〃mol)を DMS0 150 ^ 1 に溶解し、上記の BSA 溶液に混合して、冷蔵庫内に一晩放置した。その後、上記の方法と同様にして、 PD-10 カラムを用いてゲル濾過を行い、 BSA に標識用化合物由来の蛍光性官能基が導入された標識蛋白を得た。なお、反応終了後のゲル濾過の際には、標識用化合物由来の綠色溶液がカラムに残存しなかったことから、標識用化合物がすべて BSA と反応しており、 BSA 1分子あたり蛍光性官能基が約 17.5 分子導入されたものと考えられる。

例 11 ：診断用マーカーの製造

(a) BSA (10 mg) を含有する 100 mM リン酸緩衝液（pH 7.5) 5 mlに化合物 6の DMF 溶液 0.5 ml (4.6 mg ml) を加えて 30 てで 30 分間静置した。この反応混合液をあらかじめ同反応緩衝液で平衡化したセフアデックス G25 カラムに付し、未反応の化合物 6から標識用化合物と蛋白との結合体（標識化 BSA)を分離した。セフアデクックス G25 カラムを用いて結合体を含む画分の緩衝液を 20 mM リン酸緩衝液 - 0. 15 M NaCl (pH 7.0)に交換し、蛍光性官能基を導入した BSA 約 8 mg を得た。

(b) 抗 CEA 抗体 1.0 mg ml (0.1 クェン酸 0. M NaCl, pH 4.0) にペプシン濃度 0.004 mg mlとなるようにペプシンを添加して、 37°Cで 2時間反応させた。反応液を 20 mM リン酸緩衝液、 0. M NaCl 、 1 m EDTA であらかじめ平衡化した TSKgel G3000SWに添加し、 F(ab ' )₂ を未消化の I gG 及び消化断片から分離した（約 500 // g)。上記の F(ab ' )₂ 画分に 2-ァミノエタンチオール塩酸塩を終濃度 10 raMとなるように添加して 37 てで 90分間反応させた。反応液をセフアデックス G25 カラムに付して 2-アミノエタンチオールを除き、 Fa を含む溶液を得た。

(c) 標識化 BSA (2 mg, 20 mMリン酸緩衝液- 0. 15 M NaCl, pH 7. 0 ; PBS)に 50 u 1 の sulfo-SMCS 溶液（sulfo-EMCS，（株）同仁化学研究所， 1 mg ml, PBS )を攪拌しながら滴下し、室温にて 20分間反応させた。この反応液を予め PBS で平衡化したセフアデックス G25 カラムに付し、 sulfo- SMCSで活性化された標識化 BSA を分離した。この溶液を上記 (b) の Fab '溶液に添加し、攪拌下に室温で 2時間反応させた _c 反応終了後、反応混合液を TSKgel G3000SWを用いたゲル濾過により分離 '精製し、蛍光性官能基と Fab 'とが導入された BSA を得た。

例 12：診断用マーカ—を用いた免疫組織化学的染色

本発明の診断用マーカーとして上記例 6の診断用マーカーを用い、抗 EMA 抗体の染色性が確認された食道粘膜のパラフィン切片（面積約 10 x 10 ram, 厚さ 2. 5 ^ m) あるいは食道ガンの摘出生切片に診断用マ一カーを作用させ、 ABC 法（アビジン ' ピオチン . コンプレックス法）で発色させて、顕微鏡下および通常内視鏡下に観察して染色の程度を確認した。また、上記のようにして発色させたプレパラ一卜を赤外線内視鏡下に観察して染色部位を同定し、通常内視鏡による観察により同定された染色部位との比較を行った。さらに、診断用マーカーの濃度を倍数希釈して、通常内視鏡および赤外線内視鏡で観察し、両者の識別能を検討した。

診断用マーカ—の 5倍希釈液と 10倍希釈液を染色に用いたか、顕微鏡下での発色は良好であり、コントロールとして用いた抗 EMA 抗体（50 倍希釈）に比較しても同程度の染色性が確認できた。通常内視鏡によるプレパラートの観察では、 10倍希釈した診断用マーカーも、コントロールとほぼ同様に食道粘膜に一致して、 DAB (Diaminobenzidine) の沈着力く認められた。産業上の利用可能性

本発明の診断用マーカ一を用いることにより、例えば、赤外線内視鏡などを用いて準体内的に食道ガン、胃ガン、または大腸ガンなどの上皮性組織の悪性新生物の早期診断や、外科手術時の病巣の特定 ·診断を簡便かつ正確に行うことができる。本発明の診断用マ—カーによる検査や診断は、紫外線励起による生体組織や DNA の損傷の心配がなく、生体位のまま直接検査や診断を行うことかできるので、生体免疫組織染色法として有用である。

また、本発明の診断用マーカーに含まれる標識用化合物は極めて水溶性が高いという特徴を有しているので、本発明の診断用マ一カーは胃腸管から吸収されることかなく、極めて安全に検査や診断を行うことができるので有用である。

Claims

請求の範囲

1 . ( a) 検出系、及び（b) 該検出系に結合した下記の式

(式中、 R¹及び ^はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、ァリール基、アルコキシ基、又はスルホン酸基を示し； R³はアルキル基、スルホン酸アルキル基又はアミノ置換アルキル基を示し； X ― は必要に応じてァニオン種を示し； Y は炭素数 1ないし 10のアルキレン基、または酸素原子、窒素原子、及び硫黄原子からなる群から選ばれる 1以上の原子を含む炭素数 1ないし 10のアルキレン基を示す）で示される蛍光性官能基を含む診断用マ—力—。

2 . (a) 検出系、及び（b) 該検出系に結合した下記の式：

(式中、 R⁴及び R³はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アルコキシ基、又はスルホネート基を示し； R⁶はアルキレン基を示し； M ' はアル力リ金属ィオンを示し； Q " はハロゲンイオン、過塩素酸イオン、又はチォシアン酸イオンを示し； Y は炭素数 1ないし 10のアルキレン基、または酸素原子、窒素原子、及び硫黄原子からなる群から選ばれる 1以上の原子を含む炭素数 1ないし 10のアルキレン基を示す）で示される蛍光性官能基を含む診断用マーカ—。

3 . 蛍光性官能基が検出系に直接結合した請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の診断用マーカー。

4 . 蛍光性官能基が検出系にリンカーあるいは蛋白を介して結合した請求の範囲第 1項又は 2項に記載の診断用マ —力—。

5 . 検出系が抗体、核酸、および増幅系物質からなる群から選ばれる請求の範囲第 1項ないし第 4項のいずれか 1項に記載の診断用マーカ—。

6 . 抗体として抗ガン抗原抗体、抗細菌抗体、又は抗ウィルス抗体を用いる請求の範囲第 5項に記載の診断用マーカー。

7 . 近赤外線ないし遠赤外線の照射によって 780 nm以上の波長の蛍光を発する請求の範囲第 1項ないし第 6項のいずれか 1項に記載の診断用マーカー。

8 . 赤外線内視鏡検査または外科手術時の病巣の特定に使用する請求の範囲第 1 項ないし第 7項のいずれか 1項に記載の診断用マーカー。

9 . 免疫組織化学的染色法により生体の組織を直接染色するために用いる請求の範囲第 1項ないし第 8項のいずれか 1項に記載の診断用マーカ—。

10. 請求の範囲第 1項ないし第 9項のいずれか 1項に記載の診断用マーカーを有効成分として含む診断薬。

11. 下記の式：

(式中、 R¹及び R²はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、ァリール基、アルコキシ基、又はスルホン酸基を示し； R³はアルキル基、スルホン酸アルキル基又はアミノ置換アルキル基を示し； X は必要に応じてァニオン種を示し； Z は下記の式：

からなる群から選ばれる基を示し； W 及び Y はそれぞれ独立に炭素数 1ないし 10 のアルキレン基、または酸素原子、窒素原子、及び硫黄原子からなる群から選ばれる 1以上の原子を含む炭素数 1 ないし 10のアルキレン基を示す）で示される化合物。

12. 蛍光標識剤として用いる請求の範囲第 1 1項に記載の化合物。

13. 請求の範囲第 1 1項に記載の化合物を検出系と反応させる工程を含む請求の範囲第 1項に記載の診断用マーカーの製造方法。

14. 下記の式：

(式中、 R⁴及び R^Jはそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アルコキシ基、又はスルホネート基を示し；はアルキレン基を示し： M ^ はアル力リ金属イオンを示し； Q " はハロゲンイオン、過塩素酸イオン、又はチォシアン酸イオンを示し； Z は下記の式： H₂

からなる群から選ばれる基を示し；》' 及び Y はそれぞれ独立に炭素数 1 ないし 10 のアルキレン基、または酸素原子、窒素原子、及び硫黄原子からなる群から選ばれる 1以上の原子を含む炭素数 1ないし 10のアルキレン基を示す）で示される化合物。

15. 蛍光標識剤として用いる請求の範囲第 14項に記載の化合物。

16. 請求の範囲第 14項に記載の化合物を検出系と反応させる工程を含む請求の範囲第 2項に記載の診断用マーカ一の製造方法。

17. (a) 検出系、及び（b) 該検出系に結合しており 600 〜800 nmの波長の励起光を照射することにより 780 nm 以上の波長の蛍光を発する蛍光性官能基からなる診断用マーカー。

18. 蛍光性官能基が、シァニン系、フタロシアニン系、ジチオールニッケル錯体系、ナフトキノン . アントラキノン系、インドフエノール系、及びァゾ系からなる群から選ばれる近赤外線吸収性化合物に由来する蛍光性官能基である請求の範囲第 17項に記載の診断用マーカー。

19. 蛍光性官能基が検出系に直接結合した請求の範囲第 17項または第 18項に記載の診断用マーカ—。

20. 蛍光性官能基が検出系にリンカーあるいは蛋白を介して結合した請求の範囲第 17項または 18項に記載の診断用マーカー。

21. 検出系が抗体、核酸、および増幅系物質からなる群から選ばれる請求の範囲第 17項ないし第 20項のいずれか 1項に記載の診断用マーカー。

22. 抗体として抗ガン抗原抗体を用いる請求の範囲第 21項に記載の診断用マーカー。

23. 赤外線内視鏡検査または外科手術時の病巣の特定に使用する請求の範囲第 17 項ないし第 22項のいずれか 1項に記載の診断用マーカ一。

24. 免疫組織化学的染色法により生体の組織を直接染色するために用いる請求の範囲第 17項ないし第 24項のいずれか 1項に記載の診断用マ —力—。

25. 請求の範囲第 17項な t、し第 24項のいずれか 1項に記載の診断用マーカ—を有効成分として含む診断薬。